PT1565489E - Anticorpos internalizantes específicos para o alvo de superfície celular raag10 - Google Patents

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PT1565489E
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Jennie P Mather
Rong-Hao Li
Zhuangyu Pan
Penelope E Roberts
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Description

ΕΡ 1 565 489/ΡΤ DESCRIÇÃO "Anticorpos internalizantes específicos para o alvo de superfície celular RAAG10"
CAMPO TÉCNICO
Este invento situa-se nos campos da biologia e da imunoterapia. Mais especificamente, ele refere-se a um novo antigénio associado ao cancro e à doença, RAAG10 (também designado por B7-H3L), e a uma família de anticorpos monoclonais que se ligam a RAAG10. O invento proporciona ainda o diagnóstico e/ou tratamento de uma variedade de doenças e cancros humanos associados a RAAG10, utilizando os anticorpos da família anti-RAAGlO.
ANTECEDENTES DO INVENTO
Além das suas utilizações conhecidas em diagnóstico, os anticorpos têm-se revelado úteis como agentes terapêuticos. Consultar, por exemplo, WOOl/14577, que descreve anticorpos para B7-4, e Chapoval et al., Nature Immunology 2001; 2(3) 269-274, que descreve anticorpos policlonais para B7-H3 (forma 2lg). Como outro exemplo, a imunoterapia, ou a utilização de anticorpos para fins terapêuticos, tem sido usada em anos recentes para tratar o cancro. A imunoterapia passiva envolve a utilização de anticorpos monoclonais nos tratamentos do cancro. Consultar, por exemplo, Câncer: Principies and Practice of Oncology, 6 Edition (2001) Chapt. 20, pp. 495-508. Estes anticorpos podem ter uma actividade biológica terapêutica inerente tanto através da inibição directa do crescimento ou da sobrevivência das células tumorais, como por meio da sua capacidade de recrutamento da actividade natural de morte celular do sistema imunitário do corpo. Estes agentes podem ser administrados sozinhos ou juntamente com a radiação ou agentes quimioterapêuticos. O Rituximab e o Trastuzumab, aprovados para o tratamento do linfoma não-Hodgkin e do cancro da mama, respectivamente, são dois exemplos de terapêuticas deste tipo. Em alternativa, os anticorpos podem ser utilizados para preparar conjugados de anticorpos, em que o anticorpo é ligado a um agente tóxico e dirige esse agente até ao tumor ao ligar-se especificamente 2 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ ao tumor. Gemtuzumab ozogamicina é um exemplo de um conjugado de anticorpo aprovado, utilizado para o tratamento da leucemia. Anticorpos monoclonais que se ligam a células cancerosas e apresentam usos potenciais em diagnóstico e terapia têm sido descritos em publicações. Consultar, por exemplo, os seguintes pedidos de patente que referem, entre outros aspectos, alguns pesos moleculares de proteinas-alvo: Patente U.S. N.° 6,054,561 (200 kD c-erbB-2 (Her2) e outros antigénios desconhecidos com um tamanho de 40-200 KD) e Patente U.S. N.° 5,656,444 (50 kD e 55 kD, proteina oncofetal). Os exemplos de anticorpos em ensaios clínicos e/ou aprovados para o tratamento de tumores sólidos incluem: Trastuzumab (antigénio: 180 kD, HER2/neu), Edrecolomab (antigénio: 40-50 kD, Ep-CAM), anticorpo anti-glóbulos da gordura do leite humano (HMFG1) (antigénio >200 kD, mucina de elevado peso molecular), Cetuximab (antigénios: 150 kD e 170 kD, receptor EGF), Alemtuzumab (antigénio: 21-28 kD, CD52) e Rituximab (antigénio: 35 kD, CD20).
Os alvos antigénicos de Trastuzumab (receptor Her-2), que é utilizado para tratar o cancro da mama, e de Cetuximab (receptor EGF), que se encontra em ensaios clínicos para o tratamento de vários cancros, estão presentes em nível detectável num grande número de tecidos humanos adultos normais, incluindo a pele, o cólon, os pulmões, os ovários, o fígado e o pâncreas. A margem de segurança na utilização destas terapêuticas é possivelmente fornecida pela diferença no nível de expressão ou no acesso ou actividade do anticorpo nestes locais.
Outro tipo de imunoterapia é a imunoterapia activa, ou vacinação, utilizando um antigénio presente num cancro(s) específico(s) ou uma construção de ADN que dirige a expressão do antigénio, que depois suscita a resposta imunitária no indivíduo, isto é, para induzir o indivíduo a produzir activamente anticorpos contra o seu próprio cancro. A imunização activa não tem sido utilizada tão frequentemente quanto a imunoterapia passiva ou as imunotoxinas. Têm sido sugeridos vários modelos de progressão da doença (incluindo o cancro). As teorias vão desde a causação por um único evento infeccioso/transformante até à evolução 3 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ de um tipo de tecido cada vez mais "similar a doença" ou "similar a cancro" que conduz, no final, a um tecido com uma capacidade totalmente patogénica ou maligna. Alguns investigadores argumentam que com o cancro, por exemplo, é suficiente um único evento mutacional para causar malignidade, ao passo que outros argumentam que são também necessárias alterações subsequentes. Outros autores ainda sugeriram a necessidade de uma carga mutacional e um grau de diferenciação do tumor crescentes tanto para o inicio como para a progressão da neoplasia via um continuo de eventos de mutação-selecção ao nivel celular. Alguns alvos do cancro são encontrados apenas em tecidos tumorais, ao passo que outros estão presentes em tecidos normais e são regulados positivamente e/ou sobreexpressos em tecidos tumorais. Nestas situações, alguns investigadores sugeriram que a sobreexpressão está ligada à aquisição de malignidade, enquanto outros sugerem que a sobreexpressão é apenas um marcador de uma tendência ao longo de um caminho para um estado de doença crescente. 0 que é necessário são novos alvos na superfície de células doentes e/ou cancerosas que possam ser utilizados para tratar estas doenças e/ou cancros com anticorpos e outros agentes que reconhecem especificamente os alvos na superfície celular. Existe uma necessidade adicional, com base nas constatações aqui descritas, de dispor de novos anticorpos e outros agentes que reconhecem especificamente os alvos na superfície das células, que possam modular, seja por redução ou por reforço, as actividades promotoras de doença de RAAG10.
Como descrito em mais pormenor abaixo, estes inventores encontraram um novo antigénio, que designamos aqui por RAAG10 e, às vezes, por B7-H3L, que foi identificado como o alvo antigénico dos novos anticorpos aqui disponibilizados. Polipéptidos similares são conhecidos. Consultar, por exemplo, Sun et al., J. Immunol. 2002, 168: 6294-6297, que descreve a identificação de um homólogo de B7-H3 de ratinho e caracteriza o gene B7-H3 humano como sendo um mediador da proliferação das células T e da produção de IFN-gama. 4 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
SUMÁRIO DO INVENTO O invento descreve anticorpos monoclonais que se ligam a RAAG10 (B7-H3L), o qual é expresso numa variedade de cancros humanos. Em um aspecto, o invento disponibiliza um polipéptido de imunoglobulina substancialmente purificado ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, que se liga a uma porção de B7-H3L que está exposta na superfície de uma célula viva in vitro ou in vivo e pode ser internalizado para entregar um agente terapêutico ou marcador detectável em uma célula cancerosa que expressa a referida porção exposta de B7-H3L. 0 invento também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma dose terapeuticamente eficaz da imunoglobulina purificada ou do fragmento de ligação ao antigénio do invento, juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.
Em uma concretização, a célula cancerosa é uma célula cancerosa de um tumor das glândulas supra-renais, um cancro associado à SIDA, um sarcoma alveolar de partes moles, um tumor astrocítico, um cancro da bexiga, um cancro dos ossos, um cancro do cérebro e da medula espinal, um tumor metastático do cérebro, um cancro da mama, um tumor do corpo carotídeo, um cancro cervical, um condrossarcoma, um cordoma, um carcinoma de células renais cromofóbicas, um carcinoma de células claras, um cancro do cólon, um cancro colorrectal, um histiocitoma fibroso benigno cutâneo, um tumor desmoplásico de células pequenas e redondas, um ependimoma, um tumor de Ewing, um condrossarcoma mixóide extra-esquelético, uma fibrogénese óssea imperfeita, uma displasia fibrosa do osso, um cancro da vesícula biliar e do dueto biliar, uma doença trofoblástica gestacional, um tumor de células germinativas, um tumor da cabeça e pescoço, um tumor dos ilhéus de Langerhans, um sarcoma de Kaposi, um cancro dos rins, uma leucemia, um lipoma/tumor lipomatoso benigno, um lipossarcoma/tumor lipomatoso maligno, um cancro do fígado, um linfoma, um cancro do pulmão, um meduloblastoma, um melanoma, um meningioma, uma neoplasia endócrina múltipla, um mieloma múltiplo, uma síndrome mielodisplásica, um neuroblastoma, um tumor neuroendócrino, um cancro dos ovários, um cancro pancreático, um carcinoma papilar da tiróide, um tumor da paratiróide, um cancro pediátrico, um 5 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ tumor das bainhas nervosas periféricas, um feocromocitoma, um tumor pituitário, um cancro da próstata, um melanoma uveal posterior, uma perturbação hematológica rara, um cancro renal metastático, um tumor rabdóide, um rabdomiossarcoma, um sarcoma, um cancro da pele, um sarcoma de tecidos moles, um cancro de células escamosas, um cancro do estômago, um sarcoma sinovial, um cancro do testículo, um carcinoma timico, um timoma, um cancro metastático da tiróide e um cancro do útero. 0 invento também disponibiliza uma sequência de ácido nucleico isolada, que codifica o polipéptido de imunoglobulina ou o seu fragmento de ligação ao antigénio, expressa por uma linha celular, em que a linha celular é um hibridoma seleccionado entre ATCC N.° PTA-4217, ATCC N.° PTA-4218, ATCC N.° PTA-4244 e ATCC N.° PTA-4245. Em uma concretização, o ácido nucleico do invento está ligado de modo funcional a um promotor. Preferencialmente, o promotor e o ácido nucleico estão compreendidos num vector de expressão. 0 invento também proporciona uma linha celular isolada seleccionada entre ATCC N.° PTA-4217, ATCC N.° PTA-4218, ATCC N.° PTA-4244 e ATCC No. PTA-4245, ou a sua progenitura. 0 invento disponibiliza igualmente um método de produção de um polipéptido de imunoglobulina substancialmente purificado, ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio, consistindo em: (a) crescer uma linha celular transformada com o ácido nucleico de qualquer um do invento, em condições em que o polipéptido de imunoglobulina ou o fragmento de ligação ao antigénio é expresso; e (b) colher o polipéptido de imunoglobulina ou o fragmento expresso. 0 invento também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma dose terapeuticamente eficaz da imunoglobulina purificada ou do fragmento de ligação ao antigénio do invento, juntamente com um veiculo farmaceuticamente aceitável. 0 invento também fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma dose terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal ou de um 6 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ seu fragmento de ligação ao antigénio, que se liga a uma porção de B7-H3L que está exposta na superfície de uma célula viva in vitro ou in vivo e pode ser internalizado para entregar um agente terapêutico ou marcador detectável em uma célula cancerosa que expressa a referida porção exposta de B7-H3L; juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma concretização, a composição compreende um fragmento terapêutico suplementar. 0 invento também fornece um método para entregar um agente quimioterapêutico a uma célula cancerosa in vitro, que consiste em administrar às referidas células uma composição compreendendo um anticorpo anti-B7-H3L associado ao agente quimioterapêutico, em que a referida célula cancerosa expressa B7-H3L, e uma porção do referido B7-H3L está exposta na superfície da referida célula; o referido anticorpo anti-B7-H3L liga-se à referida porção de B7-H3L que está exposta na superfície da referida célula e pode ser internalizado para entregar o referido agente quimioterapêutico na referida célula cancerosa; e a referida célula cancerosa é uma célula cancerosa de qualquer um dos cancros ou tumores referidos acima. 0 invento também disponibiliza um anticorpo anti-B7-H3L associado a um agente quimioterapêutico para inibir o crescimento de uma célula cancerosa num indivíduo, em que a referida célula cancerosa expressa B7-H3L, e uma porção do referido B7-H3L está exposta na superfície da referida célula; o referido anticorpo anti-B7-H3L liga-se à referida porção de B7-H3L que está exposta na superfície da referida célula e tem a capacidade de entregar o referido agente quimioterapêutico na referida célula cancerosa; e a referida célula cancerosa é uma célula cancerosa de qualquer um dos cancros ou tumores referidos acima. 0 invento proporciona igualmente um método para detectar a presença ou ausência de uma célula cancerosa num indivíduo, que consiste em contactar as células do indivíduo com um anticorpo anti-B7-H3L in vitro, e detectar um complexo de B7-H3L a partir das células e do anticorpo, caso ele exista, em que a referida célula cancerosa expressa B7-H3L, e uma porção do referido B7-H3L está exposta na superfície da referida 7 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ célula; ο referido anticorpo anti-B7-H3L liga-se à referida porção de B7-H3L que está exposta na superfície da referida célula e tem a capacidade de entregar o referido anticorpo na referida célula cancerosa; e a referida célula cancerosa é uma célula cancerosa de qualquer um dos cancros ou tumores referidos acima.
Em outro aspecto, o invento descreve um anticorpo monoclonal anti-RAAGlO que é produzido por qualquer uma das linhas celulares hospedeiras depositadas, em 9 de Abril de 2002 e em 23 de Abril de 2003, junto da American Type Culture Collection, com as designações de depósito de patente PTA-4217, PTA-4218, PTA-4244 e PTA-4245.
Em outro aspecto ainda, o invento descreve um método para gerar um anticorpo monoclonal anti-RAAGlO reactivo com células doentes e/ou cancerosas, que compreende as etapas de: (a) imunizar um mamífero hospedeiro com um imunogénio; (b) obter linfócitos a partir do mamífero; (c) fundir os linfócitos (b) com uma linha celular de mieloma para produzir um hibridoma; (d) cultivar o hibridoma de (c) para produzir anticorpos monoclonais; e (e) efectuar o rastreio dos anticorpos para seleccionar apenas aqueles anticorpos que se ligam a células ou linhas celulares doentes e/ou cancerosas, mas não se ligam a células ou linhas celulares não cancerosas ou normais, ou se ligam a células normais a um nível inferior ou de uma forma diferente.
Encontra-se aqui descrito um método para gerar um anticorpo da família anti-RAAGlO, que compreende cultivar uma célula hospedeira codificando esse anticorpo, ou a sua progenitura, em condições que permitem a produção do anticorpo, e purificar o anticorpo anti-RAAGlO.
Encontram-se aqui descritos métodos para gerar qualquer um dos anticorpos (ou polipéptidos) aqui descritos, mediante a expressão de um ou mais polinucleótidos que codificam o anticorpo (que poderá ser expresso separadamente como uma única cadeia leve ou pesada, ou uma cadeia leve e uma cadeia pesada são ambas expressas a partir de um vector) numa célula 8 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ adequada, geralmente seguida de recuperação e/ou isolamento do anticorpo ou polipéptidos de interesse.
Encontra-se aqui descrito um anticorpo anti-RAAGlO ou um polipéptido (que poderá ou não ser um anticorpo) que inibe competitivamente a ligação preferencial de um anticorpo anti-RAAG10 a RAAG10. Em algumas concretizações, o invento é um anticorpo ou um polipéptido (que poderá ou não ser um anticorpo) que se liga preferencialmente ao mesmo ou a diferentes epitopos em RAAG10 que outros anticorpos anti-RAAG10.
Encontra-se aqui descrita uma composição que compreende RAAG10 ligado por um anticorpo especifico para um epitopo de RAAG10. Em uma concretização, o anticorpo é anti-RAAGlO. Em outras concretizações, administram-se dois ou mais anticorpos anti-RAAGlO, em que estes anticorpos mapeiam para dois ou mais epitopos diferentes de RAAG10. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-RAAGlO está unido a um agente terapêutico ou um marcador detectável.
Encontra-se aqui descrito um anticorpo que compreende um fragmento ou uma região de um anticorpo anti-RAAGlO. Em uma concretização, o fragmento é uma cadeia leve do anticorpo. Em outra concretização, o fragmento é uma cadeia pesada do anticorpo. Em outra concretização ainda, o fragmento contém uma ou mais regiões variáveis de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anticorpo. Ainda em outra concretização, o fragmento contém uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR de "Complementarity Determining Regions") de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anticorpo.
Encontram-se aqui descritos polipéptidos (que poderão ou não ser anticorpos) que compreendem qualquer uma das seguintes entidades: a) uma ou mais CDR (ou seus fragmentos) da cadeia leve ou pesada; b) três CDR da cadeia leve; c) três CDR da cadeia pesada; d) três CDR da cadeia leve e três CDR da cadeia pesada; e) a região variável da cadeia leve; f) a região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-RAAGlO. 9 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Encontra-se aqui descrito um anticorpo humanizado. Em algumas concretizações, o anticorpo humanizado compreende uma ou mais CDR de um anticorpo anti-RAAGlO não humano. Em algumas concretizações, o anticorpo humanizado liga-se ao mesmo ou a diferente(s) epitopo(s) que outros anticorpos anti-RAAGlO. Em geral, um anticorpo humanizado do invento compreende uma ou mais (uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou seus fragmentos) CDR, que são as mesmas e/ou derivam da(s) CDR do anticorpo anti-RAAGlO não humano original. Em algumas concretizações, o anticorpo humano liga-se ao mesmo ou a diferente (s) epitopo(s) que outros anticorpos anti-RAAGlO. 0 anticorpo poderá ser um anticorpo quimérico compreendendo regiões variáveis derivadas das regiões variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo anti-RAAGlO não humano e regiões constantes derivadas das regiões constantes de uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo humano.
Encontra-se aqui descrito um polinucleótido isolado que codifica qualquer um dos anticorpos LUCA1, BLA8, PA20 ou SKIN2 que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito da ATCC N.° PTA-4217, PTA-4218, PTA-4244 ou PTA-4245, respectivamente, ou pela sua progenitura. Encontram-se também descritos polipéptidos de anticorpos que possuem as actividades de ligação ou biológicas inerentes de qualquer um dos anticorpos acima especificados. Em outro aspecto, polinucleótidos que codificam qualquer um dos anticorpos (incluindo fragmentos de anticorpos), bem como quaisquer outros polipéptidos estão aqui descritos.
Encontra-se aqui descrita uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos polipéptidos (incluindo qualquer um dos anticorpos aqui descritos) ou dos polinucleótidos aqui descritos, tais como as composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo anti-RAAGlO ligado a um agente quimioterapêutico, um anticorpo compreendendo um fragmento de um anticorpo anti-RAAGlO, um anticorpo humanizado de um anticorpo anti-RAAGlO não humano, um anticorpo quimérico compreendendo regiões variáveis derivadas das regiões variáveis de um anticorpo anti-RAAGlO não humano e regiões constantes derivadas das regiões constantes de um anticorpo humano, ou um anticorpo humano com uma ou mais 10 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ propriedades de um anticorpo anti-RAAGlO não humano, ou qualquer um dos anticorpos anti-RAAGlO aqui descritos ligado a um agente quimioterapêutico (por exemplo, um grupo radioactivo), e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Encontra-se aqui descrita uma composição que compreende um anticorpo anti-RAAGlO ligado a RAAG10 presente numa célula doente ou cancerosa. Em concretizações preferidas, a célula cancerosa é seleccionada entre o grupo que consiste em células de cancro dos ovários, pulmão, próstata, pâncreas, cólon e mama. Em algumas concretizações, a célula cancerosa está isolada. Em algumas concretizações, a célula cancerosa está numa amostra biológica. Geralmente, a amostra biológica é de um indivíduo, por exemplo, um ser humano.
Encontra-se aqui descrito um método de diagnóstico de uma doença num indivíduo mediante a detecção de RAAG10 em células do indivíduo, particularmente doenças ou perturbações associadas a respostas inflamatórias ou autoimunes nos indivíduos. Encontram-se também descritos métodos para a modulação das respostas inflamatórias ou autoimunes nos indivíduos. As doenças e condições resultantes de perturbações inflamatórias e autoimunes que poderão ser submetidas a tratamento utilizando as composições e métodos do invento incluem, a título ilustrativo e não limitativo, a esclerose múltipla, a meningite, a encefalite, o acidente vascular cerebral, outros traumas cerebrais, a doença inflamatória do intestino incluindo a colite ulcerosa e a doença de Crohn, a miastenia grave, o lúpus, a artrite reumatóide, a asma, a diabetes de tipo 1 aguda, a demência associada à SIDA, a aterosclerose, a nefrite, a retinite, a dermatite atópica, a psoríase, a isquemia miocárdica e a lesão pulmonar aguda mediada por leucócitos.
Outras indicações ainda para a utilização terapêutica dos anticorpos e outros agentes terapêuticos aqui descritos incluem a administração a indivíduos em risco de rejeição de órgãos ou enxertos. Nos últimos anos, tem-se verificado uma melhoria considerável da eficiência das técnicas cirúrgicas para o transplante de tecidos e órgãos, tais como a pele, o rim, o fígado, o coração, o pulmão, o pâncreas e a medula óssea. Talvez o principal problema pendente seja a falta de 11 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ agentes satisfatórios para induzir imunotolerância no receptor ao aloenxerto ou órgão transplantado. Quando células ou órgãos alogénicos são transplantados para um hospedeiro (isto é, o dador e o receptor são indivíduos diferentes da mesma espécie), é provável que o sistema imunitário do hospedeiro desencadeie uma resposta imunitária contra os antigénios estranhos presentes no transplante (doença do enxerto contra o hospedeiro), conduzindo à destruição do tecido transplantado.
Encontra-se aqui descrito um método para diagnosticar se um indivíduo tem cancro, que compreende determinar a existência ou não de expressão de RAAG10 em células seleccionadas do indivíduo, em que a expressão de RAAG10 nas referidas células é indicativa do referido cancro. Em algumas concretizações, a expressão de RAAG10 é determinada utilizando um anticorpo anti-RAAGlO. Em algumas concretizações, o método envolve a detecção do nível de expressão de RAAG10 a partir das células. 0 termo "detecção", tal como aqui utilizado, inclui a detecção qualitativa e/ou quantitativa (medição dos níveis) em referência, ou não, a um controlo.
Encontra-se aqui descrito um método de diagnóstico do cancro num indivíduo através da detecção de RAAG10 presente em ou libertado a partir de células do indivíduo, em que o cancro é seleccionado entre o grupo que inclui, mas não está limitado a, tumores das glândulas supra-renais, cancros associados à SIDA, sarcoma alveolar de partes moles, tumores astrocíticos, cancro da bexiga (carcinoma de células escamosas e carcinoma de células de transição), cancro dos ossos (adamantinoma, quistos ósseos aneurismáticos, osteocondroma, osteossarcoma), cancros do cérebro e da medula espinal, tumores metastáticos do cérebro, cancro da mama, tumores do corpo carotídeo, cancro cervical, condrossarcoma, cordoma, carcinoma de células renais cromofóbicas, carcinoma de células claras, cancro do cólon, cancro colorrectal, histiocitomas fibrosos benignos cutâneos, tumores desmoplásicos de células pequenas e redondas, ependimomas, tumores de Ewing, condrossarcoma mixóide extra-esquelético, fibrogénese óssea imperfeita, displasia fibrosa do osso, cancros da vesícula biliar e do dueto biliar, doença 12 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ trofoblástica gestacional, tumores de células germinativas, cancros da cabeça e pescoço, tumores dos ilhéus de Langerhans, sarcoma de Kaposi, cancro dos rins (nefroblastoma, carcinoma papilar de células renais), leucemias, lipoma/tumores lipomatosos benignos, lipossarcoma/tumores lipomatosos malignos, cancro do figado (hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular), linfomas, cancro do pulmão, meduloblastoma, melanoma, meningiomas, neoplasia endócrina múltipla, mieloma múltiplo, sindrome mielodisplásica, neuroblastoma, tumores neuroendócrinos, cancro dos ovários, cancros pancreáticos, carcinomas papilares da tiróide, tumores da paratiróide, cancros pediátricos, tumores das bainhas nervosas periféricas, feocromocitoma, tumores pituitários, cancro da próstata, melanoma uveal posterior, perturbações hematológicas raras, cancro renal metastático, tumor rabdóide, rabdomiossarcoma, sarcomas, cancro da pele, sarcomas de tecidos moles, cancro de células escamosas, cancro do estômago, sarcoma sinovial, cancro do testículo, carcinoma timico, timoma, cancro metastático da tiróide e cancros do útero (carcinoma cervical, carcinoma do endométrio e leiomioma).
Encontra-se aqui descrito um método para ajudar no diagnóstico do cancro (tal como, embora não limitado ao, cancro dos ovários, do pulmão, da próstata, do pâncreas, do cólon ou da mama) num indivíduo, que compreende determinar a expressão de RAAG10 numa amostra biológica do indivíduo. Em algumas concretizações, a expressão de RAAG10 é determinada utilizando um anticorpo anti-RAAGlO. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-RAAGlO é um membro da família aqui especificamente nomeada. Em algumas concretizações, o método consiste na detecção do nível de expressão de RAAG10 a partir das células.
Encontra-se aqui descrito um método de tratamento do cancro mediante a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga a RAAG10 de forma suficiente para reduzir o crescimento das células cancerosas. Em algumas concretizações, o anticorpo é um anticorpo anti-RAAGlO. Em determinadas concretizações, as células cancerosas são seleccionadas entre o grupo que inclui, mas não está limitado a, tumores das glândulas supra-renais, cancros associados à 13 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ SIDA, sarcoma alveolar de partes moles, tumores astrocíticos, cancro da bexiga (carcinoma de células escamosas e carcinoma de células de transição), cancro dos ossos (adamantinoma, quistos ósseos aneurismáticos, osteocondroma, osteossarcoma), cancros do cérebro e da medula espinal, tumores metastáticos do cérebro, cancro da mama, tumores do corpo carotideo, cancro cervical, condrossarcoma, cordoma, carcinoma de células renais cromofóbicas, carcinoma de células claras, cancro do cólon, cancro colorrectal, histiocitomas fibrosos benignos cutâneos, tumores desmoplásicos de células pequenas e redondas, ependimomas, tumores de Ewing, condrossarcoma mixóide extra-esquelético, fibrogénese óssea imperfeita, displasia fibrosa do osso, cancros da vesícula biliar e do dueto biliar, doença trofoblástica gestacional, tumores de células germinativas, cancros da cabeça e pescoço, tumores dos ilhéus de Langerhans, sarcoma de Kaposi, cancro dos rins (nefroblastoma, carcinoma papilar de células renais), leucemias, lipoma/tumores lipomatosos benignos, lipossarcoma/tumores lipomatosos malignos, cancro do fígado (hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular), linfomas, cancro do pulmão, meduloblastoma, melanoma, meningiomas, neoplasia endócrina múltipla, mieloma múltiplo, síndrome mielodisplásica, neuroblastoma, tumores neuroendócrinos, cancro dos ovários, cancros pancreáticos, carcinomas papilares da tiróide, tumores da paratiróide, cancros pediátricos, tumores das bainhas nervosas periféricas, feocromocitoma, tumores pituitários, cancro da próstata, melanoma uveal posterior, perturbações hematológicas raras, cancro renal metastático, tumor rabdóide, rabdomiossarcoma, sarcomas, cancro da pele, sarcomas de tecidos moles, cancro de células escamosas, cancro do estômago, sarcoma sinovial, cancro do testículo, carcinoma tímico, timoma, cancro metastático da tiróide e cancros do útero (carcinoma cervical, carcinoma do endométrio e leiomioma). Em determinadas concretizações preferidas, as células cancerosas são seleccionadas entre o grupo de tumores sólidos que incluem, mas não estão limitados ao, cancro da mama, cancro do cólon, cancro da próstata, cancro do pulmão, sarcoma, cancro renal metastático, cancro metastático da tiróide e carcinoma de células claras. 14 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Encontra-se aqui descrito um método para atrasar o desenvolvimento da metástase num indivíduo que tem cancro, que compreende administrar uma quantidade eficaz de pelo menos um de uma família de anticorpos que se ligam especificamente a RAAG10. Em uma concretização, o anticorpo é um anticorpo anti-RAAGlO. Em outro aspecto, o invento consiste num método de inibição do crescimento e/ou proliferação das células cancerosas in vitro ou num indivíduo, que compreende administrar uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo anti-RAAGlO associado a (incluindo ligado a) um agente quimioterapêutico à cultura ou amostra de células ou ao indivíduo.
Encontra-se aqui descrito um método de entrega de um agente terapêutico a uma célula cancerosa num indivíduo, através da administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de pelo menos um membro de uma família de anticorpos que se ligam especificamente a RAAG10. Em outras concretizações, um anticorpo anti-RAAGlO é administrado a um indivíduo em combinação com (incluindo ligado a) outro agente terapêutico.
Em algumas concretizações, o anticorpo anti-RAAGlO é um anticorpo humanizado derivado de um membro identificado da família de anticorpos aqui referida (geralmente, mas não necessariamente, compreendendo uma ou mais CDR parciais ou intactas do anticorpo). Em algumas concretizações, o anticorpo anti-RAAGlO é um anticorpo humano com uma ou mais propriedades do membro identificado da família de anticorpos aqui referida. Em algumas concretizações, o agente quimioterapêutico (por exemplo, uma toxina ou uma molécula radioactiva) é entregue nas células cancerosas (é internalizado). Em algumas concretizações, o agente é a saporina.
Encontra-se aqui descrito um método de tratamento do cancro num indivíduo, que compreende administrar uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo anti-RAAGlO associado a (incluindo ligado a) um agente quimioterapêutico ao indivíduo. 15 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Encontram-se aqui descritos métodos para modular, seja por reforço ou por redução, a associação de RAAG10 a um parceiro de sinalização citoplasmático. A associação de RAAG10 a um parceiro de sinalização citoplasmático pode ser influenciada pelo contacto de uma molécula RAAG10, presente numa superfície celular, com um agente que modula a ligação do parceiro de sinalização a RAAG10. Os agentes que bloqueiam ou reduzem a associação de RAAG10 aos seus parceiros de ligação e/ou sinalização podem ser utilizados para modular os processos biológicos e patológicos que estão envolvidos nas respostas inflamatórias ou imunes mediadas por RAAG10. Os processos patológicos envolvendo esta acção incluem o crescimento celular associado aos tumores.
Os agentes podem ser testados quanto à sua capacidade para bloquear, reduzir, aumentar ou modular de outro modo a associação de RAAG10 a um parceiro de ligação, como seja um anticorpo anti-RAAGlO. Especificamente, um agente pode ser testado quanto à sua capacidade para modular uma interacção deste tipo, através da incubação de um péptido compreendendo o local de interacção de RAAG10 (tipicamente na sua conformação nativa tal como existe nas células vivas intactas) com um parceiro de ligação e um agente de teste, e determinação se o agente de teste reduz ou reforça a ligação do parceiro de ligação ao péptido RAAG10. Agonistas, antagonistas e outros moduladores estão expressamente contemplados.
Outros aspectos aqui descritos referem-se ao novo antigénio aqui identificado e designado por RAAG10. Este antigénio é apropriado para utilização como imunogénio e para uma variedade de fins de pesquisa, diagnóstico e terapêuticos.
Encontra-se aqui também descrito um método para ajudar no diagnóstico de uma doença num indivíduo, que compreende as etapas de (i) ensaiar a presença de RAAG10 numa amostra de sangue ou de tecido obtida de um indivíduo; (ii) detectar se a referida amostra possui uma quantidade acrescida de um marcador RAAG10 em relação a uma amostra de sangue ou de tecido normal (sem doença); e (iii) correlacionar uma quantidade acrescida do referido marcador com um diagnóstico 16 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ positivo ou correlacionar a ausência de uma quantidade acrescida do referido marcador com um diagnóstico negativo para a doença. Em determinadas concretizações, o marcador é detectado utilizando um anticorpo anti-RAAGlO. Em determinadas concretizações, o método é efectuado por meio de uma técnica seleccionada entre o grupo que consiste em imagiologia com radionuclidos, citometria de fluxo e imuno-histoquímica.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIGURA 1 ilustra os resultados de estudos de internalização de anticorpos com o anticorpo LUCAl. A divergência das linhas às concentrações mais elevadas de MabZAP indica que LUCAl foi internalizado. A FIGURA 2 apresenta uma representação diagramática de B7H3 e dos seus mutantes.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO 0 invento disponibiliza um novo antigénio, RAAG10 (B7-H3L), que é expresso em células cancerosas de vários tipos de tecido, incluindo, embora não limitado a, cancros da mama, cólon, pulmão e próstata. Adicionalmente, o invento proporciona anticorpos monoclonais e polipéptidos que se ligam a RAAG10, e métodos de produção e utilização destes anticorpos e polipéptidos para diagnosticar e tratar várias doenças e cancros humanos associados à expressão e/ou sobreexpressão de RAAG10. I. Técnicas gerais A prática do presente invento empregará, excepto indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão dentro da pericia da arte. Estas técnicas estão explicadas na integra na literatura, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; 17 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.l. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths & D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway & P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies : a practical approach (P. Shepherd & C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow & D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti & J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); e Câncer: Principies and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993). II. Definições "RAAG10" e "B7-H3L" referem-se a esse novo antigénio de polipéptido com um peso molecular glicosilado de aproximadamente 100 kD, contra o qual os anticorpos do presente invento são dirigidos. Como aqui descrito em mais pormenor, este antigénio possui mais de um epitopo diferente. Algumas das concretizações preferidas de anticorpos deste invento são dirigidas contra um dos três epitopos específicos do antigénio RAAG10. Actualmente, crê-se que RAAG10 é sobreexpresso em determinadas células cancerosas em comparação com as suas homólogas de tecidos normais.
Um "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina capaz de ligar-se especificamente a um alvo, tal como um hidrato de carbono, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., através de pelo menos um local de reconhecimento de antigénio, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. 18 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Tal como aqui utilizado, o termo engloba não só os anticorpos policlonais ou monoclonais intactos, como também os seus fragmentos (como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), a cadeia simples (ScFv), os seus mutantes, as variantes de ocorrência natural, as proteínas de fusão que compreendem uma porção do anticorpo com um local de reconhecimento de antigénio com a especificidade necessária, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um local de reconhecimento de antigénio com a especificidade necessária.
Um "anticorpo monoclonal" refere-se a uma população homogénea de anticorpos, em que o anticorpo monoclonal é constituído por aminoácidos (de ocorrência natural e não natural) que estão envolvidos na ligação selectiva de um antigénio. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigénico. 0 termo "anticorpo monoclonal" engloba não só anticorpos monoclonais intactos e anticorpos monoclonais de sequência completa, como também os seus fragmentos (como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), a cadeia simples (ScFv), os seus mutantes, proteínas de fusão compreendendo uma porção do anticorpo, anticorpos monoclonais humanizados, anticorpos monoclonais quiméricos e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um local de reconhecimento de antigénio com a especificidade necessária e a capacidade de se ligar a um antigénio. Não se pretende que exista alguma limitação quanto à origem do anticorpo ou à maneira como ele é preparado (por exemplo, por hibridoma, selecção de fagos, expressão recombinante, animais transgénicos, etc.). 0 termo inclui imunoglobulinas completas, assim como os fragmentos, etc. descritos acima sob a definição de "anticorpo".
Os anticorpos "humanizados" referem-se a uma molécula quimérica, geralmente preparada utilizando técnicas recombinantes, que possui um local de ligação de antigénio derivado de uma imunoglobulina de uma espécie não humana, e a restante estrutura de imunoglobulina da molécula baseada na estrutura e/ou sequência de uma imunoglobulina humana. 0 local de ligação de antigénio poderá compreender domínios variáveis completos fundidos sobre domínios constantes ou 19 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ apenas as regiões determinantes de complementaridade (CDR) enxertadas sobre regiões de estrutura ("framework") apropriadas nos domínios variáveis. Os locais de ligação de antigénio poderão ser de tipo selvagem ou modificados por uma ou mais substituições de aminoácidos. Isto elimina a região constante como imunogénio em sujeitos humanos, mas a possibilidade de uma resposta imunitária à região variável estranha permanece (LoBuglio, A.F. et al., (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86:4220-4224). Outra abordagem centra-se não só em fornecer regiões constantes derivadas de uma fonte humana, como também em modificar as regiões variáveis de forma a moldá-las o mais próximo possível da forma humana. É sabido que as regiões variáveis de ambas as cadeias leve e pesada contêm três regiões determinantes de complementaridade (CDR) que variam em resposta aos antigénios em questão e que determinam a capacidade de ligação, flanqueadas por quatro regiões de estrutura (FR de "framework") que são relativamente conservadas numa dada espécie e que fornecem putativamente uma armação para as CDR. Quando se preparam anticorpos não humanos para um antigénio particular, as regiões variáveis podem ser "remodeladas" ou "humanizadas" por meio do enxerto de CDR derivadas de um anticorpo não humano nas regiões FR presentes no anticorpo humano que se pretende modificar. A aplicação desta abordagem a vários anticorpos foi referida por Sato, K. et al., (1993) Câncer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al., (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al., (1988) Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al., (1991) Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al., (1991) Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al., (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88:4181-4185; Tempest, P. R. et al., (1991) Bio/Technology 9:266-271; Co, M.S. et al., (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88:2869-2873; Cárter, P. et al., (1992) Proc Natl Acad Sei USA 89:4285-4289; e Co, M.S. et al. (1992) J Immunol 148:1149-1154. Em algumas concretizações, os anticorpos humanizados conservam todas as sequências CDR (por exemplo, um anticorpo de ratinho humanizado que contém a totalidade das seis CDR dos anticorpos de ratinho). Em outras concretizações, os anticorpos humanizados possuem uma ou mais CDR (uma, duas, três, quatro, cinco, seis) que estão alteradas em relação ao anticorpo original, que são também 20 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ designadas por uma ou mais CDR "derivadas de" uma ou mais CDR do anticorpo original.
Um epitopo que se "liga especificamente" ou "liga preferencialmente" (aqui utilizados indistintamente) a um anticorpo ou um polipéptido é um termo bem compreendido na arte, e os métodos para determinar esta ligação especifica ou preferencial também são bem conhecidos na arte. Diz-se que uma molécula exibe uma "ligação especifica" ou "ligação preferencial" caso reaja ou se associe mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade a uma célula ou substância particular do que o faz a células ou substâncias alternativas. Um anticorpo "liga-se especificamente" ou "liga-se preferencialmente" a um alvo caso se ligue com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que o faz a outras substâncias. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente ou preferencialmente a um epitopo de RAAG10 é um anticorpo que se liga a este epitopo de RAAG10 com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a outros epitopos de RAAG10 ou a epitopos que não são de RAAG10. Entende-se também ao ler esta definição que, por exemplo, um anticorpo (ou fragmento ou epitopo) que se liga especificamente ou preferencialmente a um primeiro alvo poderá ou não ligar-se especifica ou preferencialmente a um segundo alvo. Como tal, "ligação especifica" ou "ligação preferencial" não requer necessariamente (embora possa incluir) uma ligação exclusiva. Geralmente, mas não necessariamente, uma referência a ligação significa uma ligação preferencial. O termo "imunologicamente activo" em referência a um epitopo que é ou "permanece imunologicamente activo" refere-se à capacidade de um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-RAAGlO) para se ligar ao epitopo em condições diferentes, por exemplo, após o epitopo ter sido submetido a condições redutoras e desnaturantes.
Os anticorpos anti-RAAGlO possuem diferentes funções biológicas associadas que incluem, embora não estejam limitadas às seguintes: a capacidade de se ligar a RAAG10 (incluindo RAAG10 em células cancerosas, as quais incluem, 21 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ mas não estão limitadas a, células cancerosas de ovário, próstata, pâncreas, pulmão, cólon ou mama); a capacidade de se ligar a uma porção de RAAG10 que está exposta na superfície de uma célula viva in vitro ou in vivo; a capacidade de entregar um agente quimioterapêutico a células cancerosas (como sejam as células de cancro de ovário, próstata, pâncreas, pulmão, cólon ou mama) que expressam RAAG10; a capacidade de entregar um agente terapêutico ou um marcador detectável em células cancerosas que expressam RAAG10. Como aqui discutido, os polipéptidos (incluindo os anticorpos) do invento poderão ter qualquer uma ou mais de uma destas características.
Um "anticorpo anti-RAAGlO equivalente" ou "polipéptido anti-RAAGlO equivalente" refere-se a um anticorpo ou um polipéptido que possui uma ou mais funções biológicas associadas a um anticorpo anti-RAAGlO, tal como, por exemplo, a especificidade de ligação.
Tal como aqui utilizado, "agente" refere-se a um composto biológico, farmacêutico ou químico. Os exemplos não limitativos incluem uma molécula simples ou complexa, orgânica ou inorgânica, um péptido, uma proteína, um oligonucleótido, um anticorpo, um derivado de anticorpo, um fragmento de anticorpo, um derivado de vitamina, um hidrato de carbono, uma toxina ou um composto quimioterapêutico. É possível sintetizar vários compostos, por exemplo, pequenas moléculas e oligómeros (por exemplo, oligopéptidos e oligonucleótidos) e compostos orgânicos sintéticos baseados em várias estruturas nucleares. Além disso, várias fontes naturais podem fornecer compostos para rastreio, tais como extractos de plantas ou animais e similares. Um perito pode reconhecer facilmente que não há qualquer limite quanto à natureza estrutural dos agentes do presente invento.
Os agentes que são empregues nos métodos deste invento podem ser seleccionados aleatoriamente, ou seleccionados ou concebidos racionalmente. Tal como o termo é aqui utilizado, diz-se que um agente é seleccionado aleatoriamente quando o agente é escolhido aleatoriamente sem considerar as sequências específicas envolvidas na associação de RAAG10 aos seus parceiros de ligação nativos ou anticorpos conhecidos. 22 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Um exemplo de agentes seleccionados aleatoriamente é a utilização de uma biblioteca química ou uma biblioteca combinatória de péptidos.
Tal como o termo é aqui utilizado, diz-se que um agente é seleccionado ou concebido racionalmente quando o agente é escolhido numa base não aleatória que tem em consideração a sequência do local alvo e/ou a sua conformação em relação à acção do agente. Relativamente aos agentes anti-RAAGlO, crê-se que há pelo menos três epitopos em RAAG10 contra os quais os anticorpos podem ser produzidos e, por conseguinte, pelo menos três locais de acção para os agentes que bloqueiam a interacção RAAGlO/anti-RAAGlO. Este invento também compreende os agentes que actuam nos locais de interacção entre RAAG10 e o seu parceiro de ligação nativo, embora outros ligandos e os seus locais activos de interacção com RAAG10 também estejam incluídos no âmbito deste invento, sejam eles actualmente conhecidos ou posteriormente identificados. Os agentes podem ser racionalmente seleccionados ou racionalmente concebidos mediante a utilização de sequências peptídicas que constituem os locais de contacto do complexo receptor/ligando e/ou RAAG10/anticorpo anti-RAAGlO. Por exemplo, um agente peptídico seleccionado racionalmente pode ser um péptido cuja sequência de aminoácidos é idêntica a um epitopo que surge em RAAG10 à medida que ele é exposto na superfície de uma célula viva no seu ambiente nativo. Este agente reduzirá ou bloqueará a associação do anticorpo anti-RAAGlO a RAAG10, ou a associação de RAAGIO ao seu ligando nativo, conforme desejado, ao ligar-se ao anticorpo anti-RAAGlO ou ao ligando nativo.
Tal como aqui utilizado, o termo "marcado", em relação ao anticorpo, pretende abranger a marcação directa do anticorpo por acoplamento (isto é, ligação física) de uma substância detectável, como seja um agente radioactivo ou um fluoróforo (por exemplo, o isotiocianato de fluoresceína (FITC) ou a ficoeritrina (PE)), ao anticorpo, assim como a marcação indirecta da sonda ou anticorpo por reactividade com uma substância detectável.
Tal como aqui utilizado, o termo "associação", em relação ao anticorpo, inclui a união ou ligação covalente e 23 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ não covalente a um agente (por exemplo, um agente quimioterapêutico). 0 anticorpo pode associar-se a um agente (por exemplo, um agente quimioterapêutico) por ligação directa ou ligação indirecta por meio de uma plataforma comum, de tal modo que o anticorpo dirige a localização do agente até à célula cancerosa a que o anticorpo se liga, e em que o anticorpo e o agente não se dissociam substancialmente em condições fisiológicas de forma que o agente não seja direccionado para a mesma célula cancerosa a que o anticorpo se liga ou de forma que a potência do agente não seja diminuída.
Uma "amostra biológica" compreende uma variedade de tipos de amostras obtidas de um indivíduo e pode ser utilizada num ensaio de diagnóstico ou de monitorização. A definição engloba o sangue e outras amostras líquidas de origem biológica, amostras de tecidos sólidas tais como um espécime para biopsia, culturas de tecidos ou células derivadas destas, e a sua progenitura, por exemplo, as células obtidas de uma amostra de tecido recolhida de um indivíduo suspeito de ter cancro, em concretizações preferidas de tecido de ovário, pulmão, próstata, pâncreas, cólon e mama. A definição também inclui amostras que foram manipuladas de alguma forma após a sua obtenção, por exemplo, por tratamento com reagentes, solubilização ou enriquecimento em determinados componentes, tais como proteínas ou polinucleótidos, ou integração numa matriz semi-sólida ou sólida para fins de seccionamento. 0 termo "amostra biológica" inclui uma amostra clínica e também inclui células em cultura, sobrenadantes de células, lisados de células, o soro, o plasma, um fluido biológico e amostras de tecido.
Uma "célula hospedeira" inclui uma célula individual ou uma cultura de células que pode ser ou foi um receptor para vector(es) para incorporação de inserções polinucleotídicas. As células hospedeiras incluem a progenitura de uma única célula hospedeira, e a progenitura poderá não ser necessariamente completamente idêntica (em morfologia ou em complemento do ADN genómico) à célula parental original devido a mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui as células transfectadas in vivo com (um) polinucleótido(s) deste invento. 24 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Tal como ο termo é aqui utilizado, "atrasar o desenvolvimento da metástase" significa adiar, impedir, abrandar, retardar, estabilizar e/ou postergar o desenvolvimento da metástase. Este atraso pode ser de períodos variáveis de tempo dependendo do historial do cancro e/ou do indivíduo em tratamento. Como será evidente para um perito na arte, um atraso suficiente ou significativo pode, de facto, englobar a prevenção, na medida em que o indivíduo não desenvolve a metástase.
Uma "quantidade eficaz" de uma composição farmacêutica é, numa concretização, uma quantidade suficiente para proporcionar resultados benéficos ou desejados incluindo, sem limitação, resultados clínicos como a diminuição do tamanho do tumor (no contexto do cancro, por exemplo, o cancro da mama ou da próstata), o retardamento do crescimento das células cancerosas, o atraso do desenvolvimento da metástase, a diminuição dos sintomas resultantes da doença, o aumento da qualidade de vida daqueles que sofrem da doença, a diminuição da dose de outros medicamentos necessários para tratar a doença, o reforço do efeito de outro medicamento, por exemplo, via direccionamento e/ou internalização, o atraso da progressão da doença e/ou o prolongamento da sobrevivência dos indivíduos. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para efeitos deste invento, uma quantidade eficaz de fármaco, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para reduzir a proliferação de (ou destruir as) células cancerosas e reduzir e/ou atrasar o desenvolvimento, ou crescimento, de metástases de células cancerosas, quer directa quer indirectamente. Em algumas concretizações, uma quantidade eficaz de um fármaco, composto ou composição farmacêutica poderá ou não ser obtida em conjunção com outro fármaco, composto ou composição farmacêutica. Assim, uma "quantidade eficaz" poderá ser considerada no contexto da administração de um ou mais agentes quimioterapêuticos, e um agente único poderá ser administrado numa quantidade eficaz se, em conjunção com um ou mais outros agentes, puder ser obtido ou for obtido um resultado desejável. Embora as necessidades individuais variem, a determinação dos intervalos óptimos de quantidades eficazes de cada componente encontra-se no âmbito da perícia na arte. As doses típicas compreendem 0,1 a 100 mg/kg de peso 25 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ corporal. As doses preferidas compreendem 1 a 100 mg/kg de peso corporal. As doses mais preferidas compreendem 10 a 100 mg/kg de peso corporal.
Tal como o termo é aqui utilizado, diz-se que uma molécula de ácido nucleico ou agente, anticorpo, composição, célula, etc. é "isolado" quando essa molécula de ácido nucleico, agente, anticorpo, composição, célula, etc. está substancialmente separado de moléculas de ácido nucleico, anticorpos, agentes, composições, células, etc. contaminantes da sua fonte original.
Um "indivíduo" é um vertebrado, preferencialmente um mamífero, mais preferencialmente um ser humano. Os mamíferos incluem, embora não estejam limitados a estes exemplos, animais de quinta, animais desportivos, animais domésticos, primatas, ratinhos e ratos.
Os termos "polipéptido", "oligopéptido", "péptido" e "proteína" são aqui utilizados indistintamente para designar polímeros de aminoácidos com qualquer comprimento. O polímero poderá ser linear ou ramificado, poderá compreender aminoácidos modificados e poderá estar interrompido por entidades que não são aminoácidos. Os termos também incluem um polímero de aminoácidos que foi modificado naturalmente ou por meio de uma intervenção; por exemplo, formação de ligações dissulfureto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, como a conjugação com um componente de marcação. Estão também incluídos na definição, por exemplo, os polipéptidos que contêm um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), assim como outras modificações conhecidas na arte. Compreende-se que, dado que os polipéptidos deste invento se baseiam num anticorpo, os polipéptidos podem ocorrer como cadeias simples ou cadeias associadas.
Tal como aqui utilizado, o termo "substancialmente puro" refere-se a material que é pelo menos 50% puro (isto é, isento de contaminantes), mais preferencialmente pelo menos 90% puro, mais preferencialmente pelo menos 95% puro, mais 26 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ preferencialmente pelo menos 98%, mais preferencialmente pelo menos 99% puro ou mais puro. "Toxina" refere-se a qualquer substância que causa uma resposta adversa numa célula. Por exemplo, uma toxina dirigida contra uma célula cancerosa teria um efeito adverso, por vezes prejudicial, sobre a célula cancerosa. Os exemplos de toxinas incluem, mas não estão limitados a, radioisótopos, caliqueamicina e maitansinóides.
Tal como aqui utilizado, "tratamento" ou "tratar" é uma abordagem para obter resultados benéficos ou desejados, incluindo, e preferencialmente, resultados clínicos. Para os objectivos deste invento, os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, embora não estejam limitados a estes exemplos, um ou mais dos seguintes: redução da proliferação (ou destruição) de células cancerosas ou outras células doentes, redução da metástase de células cancerosas encontradas em cancros, diminuição do tamanho do tumor, diminuição dos sintomas resultantes da doença, aumento da qualidade de vida daqueles que sofrem da doença, diminuição da dose de outros medicamentos necessários para tratar a doença, atraso da progressão da doença e/ou prolongamento da sobrevivência dos indivíduos. III. Métodos de produção de anticorpos
Os métodos de produção de anticorpos monoclonais são conhecidos na arte. Um método que poderá ser utilizado é o método de Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975) ou uma sua modificação. Tipicamente, os anticorpos monoclonais são desenvolvidos em espécies não humanas, tais como os ratinhos. Em geral, utiliza-se um ratinho ou um rato para a imunização, embora também possam ser utilizados outros animais. Os anticorpos são produzidos através da imunização de ratinhos com uma quantidade imunogénica de células, extractos celulares ou preparações de proteínas que contêm RAAG10 humano. 0 imunogénio pode ser, embora não esteja limitado a estes exemplos, células primárias, linhas celulares cultivadas, células cancerosas, ácidos nucleicos ou tecido. Em uma concretização, utilizam-se células de bexiga de feto humano. Em outra concretização, utilizam-se células 27 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ progenitoras pancreáticas humanas. Os métodos para o isolamento e cultura das células de bexiga de feto humano e das células progenitoras pancreáticas humanas estão detalhados no Exemplo 1. As células utilizadas para o imunogénio, por exemplo, as células de bexiga de feto humano ou as células progenitoras pancreáticas humanas, poderão ser cultivadas durante um período de tempo (pelo menos 24 horas) antes da sua utilização como imunogénio. As células (por exemplo, as células de bexiga de feto humano ou as células progenitoras pancreáticas humanas) poderão ser utilizadas como imunogénios isoladamente ou em combinação com um adjuvante não desnaturante, como Ribi. Em geral, as células deverão ser mantidas intactas e preferencialmente viáveis quando são utilizadas como imunogénios. As células intactas poderão permitir uma melhor detecção dos antigénios por parte do animal imunizado do que as células fragmentadas. A utilização de adjuvantes desnaturantes ou rigorosos, por exemplo, o adjuvante de Freund, poderá romper as células de bexiga de feto humano ou as células progenitoras pancreáticas humanas e, por conseguinte, é desencorajada. 0 imunogénio poderá ser administrado múltiplas vezes em intervalos periódicos, como bissemanalmente ou semanalmente, ou poderá ser administrado de forma a manter a sua viabilidade no animal (por exemplo, num recombinante de tecido). 0 Exemplo 2 descreve os métodos utilizados para gerar anticorpos anti-RAAG10 e pode utilizar-se para gerar outros anticorpos monoclonais, que se ligam a RAAG10.
Em uma concretização, os anticorpos monoclonais, que se ligam a RAAG10, são obtidos mediante a utilização de células hospedeiras que sobreexpressam RAAG10 como imunogénio.
Para monitorizar a resposta de anticorpos, uma pequena amostra biológica (por exemplo, sangue) poderá ser obtida do animal e testada quanto ao titulo de anticorpos contra o imunogénio. 0 baço e/ou vários gânglios linfáticos grandes podem ser removidos e dissociados em células individuais. Se desejado, as células do baço poderão ser pesquisadas (após remoção das células não especificamente aderentes) por aplicação de uma suspensão celular a uma placa ou um poço revestido com o antigénio. As células B, que expressam uma imunoglobulina ligada à membrana especifica para o antigénio, 28 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ ligar-se-ão à placa e não são enxaguadas com o resto da suspensão. As células B resultantes, ou todas as células dissociadas do baço, podem depois ser fundidas com células de mieloma (por exemplo, X63-Ag8.653 e aquelas do Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia). 0 polietilenoglicol (PEG) poderá ser utilizado para fundir o baço ou os linfócitos com as células de mieloma para formar um hibridoma. 0 hibridoma é depois cultivado num meio selectivo (por exemplo, meio hipoxantina, aminopterina, timidina, também conhecido como "meio HAT"). Os hibridomas resultantes são seguidamente plaqueados por diluição limite e analisados quanto à produção de anticorpos que se ligam especificamente ao imunogénio (por exemplo, superfície das células HFB, superfície de linhas celulares de cancro, secções da bexiga de feto, etc.), utilizando FACS ou imuno-histoquímica (rastreio IHQ). Os hibridomas secretores do anticorpo monoclonal seleccionado são depois cultivados quer in vitro (por exemplo, em frascos de cultura de tecidos ou reactores de fibras ocas) quer in vivo (por exemplo, como ascite em ratinhos). 0 Exemplo 3 fornece detalhes adicionais sobre os métodos utilizados para obter e rastrear um anticorpo anti-RAAGlO.
Como outra alternativa à técnica de fusão celular, células B imortalizadas com o VEB poderão ser utilizadas para produzir os anticorpos monoclonais deste invento. Os hibridomas são expandidos e subclonados, se desejado, e os sobrenadantes são analisados quanto à actividade anti-imunogénio por procedimentos de ensaio convencionais (por exemplo, FACS, IHQ, radioimunoensaio, imunoensaio enzimático, imunoensaio de fluorescência, etc.).
Em outra alternativa, o anticorpo monoclonal anti-RAAGlO e quaisquer outros anticorpos equivalentes podem ser sequenciados e produzidos recombinantemente por qualquer meio conhecido na arte (por exemplo, humanização, utilização de ratinhos transgénicos para produzir anticorpos totalmente humanos, tecnologia de apresentação em fagos, etc.). Em uma concretização, o anticorpo monoclonal anti-RAAGlO é sequenciado, e a sequência polinucleotídica é depois clonada num vector para expressão ou propagação. A sequência que codifica o anticorpo de interesse poderá ser mantida num 29 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ vector numa célula hospedeira, e a célula hospedeira pode depois ser expandida e congelada para utilização futura. A sequência polinucleotidica do anticorpo monoclonal anti-RAAGlO ou de quaisquer outros anticorpos equivalentes poderá ser utilizada para manipulação genética destinada a gerar um anticorpo "humanizado", de forma a melhorar a afinidade ou outras caracteristicas do anticorpo. 0 principio geral na humanização de um anticorpo envolve a retenção da sequência básica da porção de ligação ao antigénio do anticorpo, ao mesmo tempo que se troca a restante porção não humana do anticorpo por sequências de um anticorpo humano. Há quatro etapas gerais para humanizar um anticorpo monoclonal. Estas são: (1) determinação da sequência nucleotidica e da sequência prevista de aminoácidos dos domínios variáveis da cadeia leve e pesada do anticorpo de partida, (2) concepção do anticorpo humanizado, isto é, decidir qual o anticorpo cuja região de estrutura será utilizada durante o processo de humanização, (3) as metodologias/técnicas de humanização efectivas e (4) a transfecção e a expressão do anticorpo humanizado. Consultar, por exemplo, as patentes U.S. n.os 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692 e 6,331,415.
Foram descritas várias moléculas de anticorpos "humanizados" compreendendo um local de ligação ao antigénio derivado de uma imunoglobulina não humana, incluindo anticorpos quiméricos que possuem as regiões V, ou as regiões v modificadas, de roedor e as suas regiões determinantes de complementaridade (CDR) associadas fundidas com domínios constantes humanos. Consultar, por exemplo, Winter et al. Nature 349:293-299 (1991), Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sei. USA 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. J Immunol. 138:4534-4538 (1987) e Brown et al. Câncer Res. 47:3577-3583 (1987). Outras referências descrevem regiões CDR de roedor que foram enxertadas numa região de estrutura (FR) de suporte humana, antes da fusão com o domínio constante de um anticorpo humano apropriado. Consultar, por exemplo,
Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988), Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988) e Jones et al. Nature 321:522- 525 (1986). Outra referência descreve regiões CDR de roedor que são sustentadas por regiões de estrutura de roedor que foram disfarçadas de modo recombinante. Consultar, por 30 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ exemplo, a publicação de patente europeia n.° 519,596. Estas moléculas "humanizadas" são concebidas para minimizar a resposta imunológica indesejada contra as moléculas de anticorpo de roedor anti-humano, que limita a duração e a eficácia das aplicações terapêuticas destes fragmentos em receptores humanos. Outros métodos de humanização de anticorpos que também poderão ser utilizados são descritos por Daugherty et al., Nucl. Acids Res., 19:2471-2476 (1991) e nas patentes U.S. n.os 6,180,377; 6,054,297; 5,997,867; e 5,866,692. O invento também compreende fragmentos de região variável de cadeia simples ("scFv") dos anticorpos deste invento, tal como mKID2. Os fragmentos de região variável de cadeia simples são preparados por ligação de regiões variáveis da cadeia leve e/ou pesada, mediante a utilização de um péptido de ligação curto. Bird et al. (1988) Science 242: 423-426 descreve um exemplo de péptidos de ligação que estabelecem uma ponte de aproximadamente 3,5 nm entre a extremidade carboxi de uma região variável e a extremidade amino da outra região variável. Foram também concebidas e utilizadas moléculas de ligação de outras sequências; Bird et al. (1988). As moléculas de ligação podem, como consequência, ser modificadas para desempenhar funções adicionais, tais como a ligação de fármacos ou a ligação a suportes sólidos. As variantes de cadeia simples podem ser produzidas recombinante ou sinteticamente. Para a produção sintética de scFv, é possível utilizar um sintetizador automatizado. Para a produção recombinante de scFv, um plasmídeo adequado contendo um polinucleótido que codifica a scFv pode ser introduzido numa célula hospedeira adequada, quer eucariótica, como sejam as células de levedura, planta, insecto ou mamífero, quer procariótica, como E. coli. Os polinucleótidos que codificam a scFv de interesse podem ser preparados por manipulações de rotina, como seja a ligação de polinucleótidos. A scFv resultante pode ser isolada utilizando técnicas comuns de purificação de proteínas conhecidas na arte. O invento compreende modificações dos anticorpos, incluindo anticorpos e polipéptidos funcionalmente equivalentes, que não afectam significativamente as suas 31 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ propriedades e variantes que possuem uma actividade reforçada ou diminuída. A modificação de polipéptidos é prática de rotina na arte e não precisa de ser aqui descrita em detalhe. Os exemplos de polipéptidos modificados incluem polipéptidos com substituições conservativas de resíduos de aminoácidos, uma ou mais deleções ou adições de aminoácidos que não alteram significativa e prejudicialmente a actividade funcional ou a utilização de análogos químicos. Os resíduos de aminoácidos que podem ser substituídos conservativamente uns pelos outros incluem, mas não estão limitados a: glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/ glutamina; ácido aspártico/ácido glutâmico; serina/treonina; lisina/arginina e fenilalanina/tirosina. Estes polipéptidos também incluem polipéptidos glicosilados e não glicosilados, assim como polipéptidos com outras modificações pós-tradução, tais como, por exemplo, a glicosilação com diferentes açúcares, a acetilação e a fosforilação. Preferencialmente, as substituições de aminoácidos são conservativas, isto é, o aminoácido substituído possui propriedades químicas similares às do aminoácido original. Estas substituições conservativas são conhecidas na arte e exemplos delas foram fornecidos acima. As modificações de aminoácidos podem ir desde a alteração ou modificação de um ou mais aminoácidos até ao redesign completo de uma região, como seja a região variável. As modificações na região variável podem alterar a afinidade e/ou a especificidade de ligação. Outros métodos de modificação incluem a utilização de técnicas de acoplamento conhecidas na arte, incluindo, entre outras, meios enzimáticos, a substituição oxidativa e a quelação. As modificações podem ser usadas, por exemplo, para a ligação de marcadores destinados a imunoensaios, como a ligação de fragmentos radioactivos para radioimunoensaio. Os polipéptidos modificados são preparados utilizando procedimentos estabelecidos na arte e podem ser rastreados utilizando ensaios padrão conhecidos na arte. 0 invento também inclui proteínas de fusão compreendendo um ou mais fragmentos ou regiões dos anticorpos deste invento. Em uma concretização, é disponibilizado um polipéptido de fusão que compreende pelo menos 10 aminoácidos contíguos da região variável da cadeia leve e pelo menos 10 aminoácidos da região variável da cadeia pesada. Em outra 32 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ concretização, ο polipéptido de fusão contém a região constante de uma imunoglobulina heteróloga. Em outra concretização, o polipéptido de fusão contém uma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada de um anticorpo produzido a partir de um hibridoma depositado junto da ATCC como agui descrito. Para os objectivos deste invento, uma proteína de fusão do anticorpo contém um ou mais polipéptidos anti-RAAGlO e outra sequência de aminoácidos à qual não está ligado na molécula nativa, por exemplo, uma sequência heteróloga ou uma sequência homóloga de outra região. Um polipéptido anti-RAAGlO pode ser criado por métodos conhecidos na arte, por exemplo, por via sintética ou recombinante.
Ainda em outra alternativa, é possível obter anticorpos totalmente humanos mediante a utilização de ratinhos comercialmente disponíveis que foram manipulados para expressar proteínas de imunoglobulina humana especificas. Os animais transgénicos que são concebidos para produzir uma resposta imunitária mais desejável (por exemplo, anticorpos totalmente humanos) ou mais robusta poderão também ser utilizados para a geração de anticorpos humanizados ou humanos. Os exemplos desta tecnologia são Xenomouse™ de Abgenix, Inc. (Fremont, CA) e HuMAb-Mouse® e TC Mouse™ de Medarex, Inc. (Princeton, NJ).
Numa alternativa, os anticorpos poderão ser preparados de forma recombinante e expressos utilizando qualquer método conhecido na arte. Os anticorpos poderão ser preparados de modo recombinante através, primeiro, de isolamento dos anticorpos produzidos a partir de animais hospedeiros, obtenção da sequência génica e utilização da sequência génica para expressar o anticorpo por via recombinante em células hospedeiras (por exemplo, células CHO) . Outro método que poderá ser empregue consiste em expressar a sequência do anticorpo em plantas (por exemplo, tabaco) ou em leite transgénico. Métodos para expressar anticorpos de forma recombinante em plantas ou em leite já foram descritos. Consultar, por exemplo, Peeters et al. (2001) Vaccine 19:2756; Lonberg, N. and D. Huszar (1995) Int. Rev. Immunol 13:65; e Pollock et al.(1999) J Immunol Methods 231:147. Os métodos para preparar derivados de anticorpos, por exemplo, 33 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ humanizados, cadeia simples, etc. são conhecidos na arte. Em outra alternativa, os anticorpos poderão ser preparados de forma recombinante por tecnologia de apresentação em fagos. Consultar, por exemplo, as patentes U.S. n.os 5,565,332; 5,580,717; 5, 733,743; 6,265,150; e Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994).
Os anticorpos ou a proteína de interesse poderão ser submetidos a sequenciação por degradação de Edman, que é bem conhecida pelos peritos na arte. A informação sobre o péptido gerada a partir de espectrometria de massa ou da degradação de Edman pode ser usada para conceber sondas ou iniciadores que são utilizados para clonar a proteína de interesse.
Um método alternativo de clonagem da proteína de interesse é por "panning" (método de aderência a plástico), utilizando ALCAM para as células que expressam o anticorpo ou a proteína de interesse. O procedimento de "panning" é realizado mediante obtenção de uma biblioteca de ADNc a partir dos tecidos e células que expressam o anticorpo ou a proteína de interesse, sobreexpressão dos ADNc num segundo tipo de célula e rastreio das células transfectadas do segundo tipo celular quanto a uma ligação específica a ALCAM. Descrições detalhadas dos métodos utilizados na clonagem de genes de mamíferos que codificam proteínas de superfície celular por "panning" podem encontrar-se na arte. Consultar, por exemplo, Aruffo, A. & Seed, B. Proc. Natl. Acad Sei. USA, 84, 8573-8577 (1987) e Stephan, J. et al., Endocrinology 140: 5841-5854 (1999).
Os ADNc podem ser obtidos por transcrição reversa dos ARNm provenientes de um tipo particular de célula de acordo com métodos padrão da arte. Especificamente, o ARNm pode ser isolado utilizando várias enzimas líticas ou soluções químicas de acordo com os procedimentos apresentados em Sambrook et al., acima, ou extraído por meio de resinas de ligação de ácidos nucleicos comercialmente disponíveis, seguindo as instruções fornecidas pelos fabricantes (por exemplo, Qiagen, Invitrogen, Promega). Os ADNc sintetizados são depois introduzidos num vector de expressão para produzir o anticorpo ou proteína de interesse em células de um segundo tipo. Está implícito que um vector de expressão tem que ser 34 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ replicável nas células hospedeiras, seja como epissomas ou como uma parte integral do ADN cromossómico. Os vectores de expressão adequados incluem, embora não estejam limitados a estes, plasmideos, vectores virais, incluindo adenovirus, vírus adenoassociados e retrovírus, e cosmídeos.
Os vectores contendo os polinucleótidos de interesse podem ser introduzidos na célula hospedeira por qualquer um de uma série de meios apropriados, incluindo a electroporação, a transfecção empregando cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano ou outras substâncias; o bombardeamento com microprojécteis; a lipofecção; e a infecção (por exemplo, em que o vector é um agente infeccioso tal como o vírus vaccinia). A decisão de introduzir vectores ou polinucleótidos dependerá frequentemente de características da célula hospedeira.
Quaisquer células hospedeiras capazes de sobreexpressar ADN heterólogos podem ser utilizadas com o objectivo de isolar os genes que codificam o anticorpo, polipéptido ou proteína de interesse. Os exemplos não limitativos de células hospedeiras de mamíferos incluem, embora não estejam limitados a estes, células COS, HeLa e CHO. Preferencialmente, as células hospedeiras expressam os ADNc a um nivel cerca de 5x superior, mais preferencialmente cerca de lOx superior, ainda mais preferencialmente 20x superior ao do anticorpo ou proteína de interesse endógeno correspondente, se presente, nas células hospedeiras. 0 rastreio das células hospedeiras quanto a uma ligação especifica a RAAG10 é realizado por meio de um imunoensaio ou de FACS. É possível identificar uma célula que sobreexpressa o anticorpo ou proteína de interesse. 0 invento inclui polipéptidos que compreendem uma sequência de aminoácidos dos anticorpos deste invento. Os polipéptidos deste invento podem ser preparados por procedimentos conhecidos na arte. Os polipéptidos podem ser produzidos por degradação proteolítica ou outra degradação dos anticorpos, por métodos recombinantes (isto é, polipéptidos individuais ou de fusão) como descrito acima ou por síntese química. Os polipéptidos dos anticorpos, especialmente os polipéptidos mais curtos até cerca de 35 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ 50 aminoácidos, são convenientemente produzidos por síntese química. Os métodos de síntese química são conhecidos na arte e estão disponíveis comercialmente. Por exemplo, um polipéptido anti-RAAGlO poderia ser produzido por meio de um sintetizador automatizado de polipéptidos empregando o método em fase sólida. IV. Métodos de rastreio de anticorpos monoclonais É possível utilizar vários métodos para pesquisar os anticorpos monoclonais que se ligam a RAAG10. Entender-se-á que "ligação" se refere a uma ligação imunologicamente relevante, isto é, uma ligação que é específica para o antigénio único para o qual a molécula de imunoglobulina é codificada. Não se refere à ligação não específica que poderá ocorrer quando se utiliza uma imunoglobulina numa concentração muito elevada contra um alvo não específico. Em uma concretização, os anticorpos monoclonais são rastreados quanto à ligação a RAAG10 utilizando técnicas de rastreio padrão. Obteve-se, desta maneira, o anticorpo monoclonal anti-RAAGlO. Em conformidade com o Tratado de Budapeste, os hibridomas que produzem anticorpos monoclonais anti-RAAGlO foram depositados junto da American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas VA 20110-2209, em 9 de Abril de 2002, com uma designação de depósito de patente PTA-4217, PTA-4218, PTA-4244 e PTA-4245.
Os anticorpos monoclonais que se ligam a RAAG10 são rastreados quanto à ligação a tecidos cancerosos e a células não cancerosas. Em uma concretização, os anticorpos monoclonais que se ligam a RAAG10 e que também reagem de forma cruzada com células ou tecidos cancerosos humanos, mas não com células ou tecidos normais ao mesmo nível, são seleccionados. Um método que poderá ser empregue para o rastreio é a imuno-histoquímica (IHQ). As técnicas de imuno-histoquímica padrão são conhecidas pelos peritos na arte. Consultar, por exemplo, Animal Cell Culture Methods (J.P. Mather and D. Barnes, eds., Academic Press, Vol. 57, Ch. 18 and 19, pp. 314-350, 1998). As amostras biológicas (por exemplo, tecidos) poderão ser obtidas de biopsias, autópsias ou necropsias. Para determinar se RAAG10 está presente apenas em células cancerosas, anticorpos anti-RAAGlO poderão ser 36 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ utilizados para detectar a presença de RAAG10 em tecidos de indivíduos com cancro, enquanto outros tecidos não cancerosos do indivíduo que sofre de cancro ou tecidos de indivíduos sem cancro são utilizados como controlo. 0 tecido pode ser incorporado numa substância sólida ou semi-sólida que evita danos durante a congelação (por exemplo, gel de agarose ou OCT) e depois seccionado para coloração. Os cancros de diferentes órgãos e em diferentes graus de diferenciação podem ser utilizados para efectuar o rastreio dos anticorpos monoclonais. Os exemplos de tecidos que poderão ser utilizados para fins de rastreio incluem, mas não estão limitados aos seguintes, ovários, mama, pulmão, próstata, cólon, rim, pele, tiróide, cérebro, coração, fígado, estômago, nervo, vasos sanguíneos, osso, tubo digestivo superior e pâncreas. Os exemplos de diferentes tipos de cancro que poderão ser utilizados para fins de rastreio incluem, mas não estão limitados a, carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas, adenossarcomas, linfomas e leucemias.
Ainda em outra alternativa, as linhas celulares de cancro como SK-0v-3 (ATCC n.° HTB 77), LnCap (ATCC n.° CRL-1740), A549 (ATCC n.° CCL 185), PANC-1 (ATCC n.° CRL
1469), SK-BR-3 (ATCC n.° HTB 30), SK-MES-1 (ATCC n.° HTB 58), HT-29 (HTB-38), SW 480 (ATCC n.° CCL 228), AsPC-1 (ATCC n.° CRL 1682), Capan-1 (ATCC n.° HTB 79), CFPAC-1 (ATCC n.° CRL 1918), HPAF-II (ATCC n.° CRL-1997), Hs-700T (ATCC n.° HTB 147), ES-2 (ATCC n.° CRL-1978), PC-3 (ATCC n.° CRL 1435), Du-145 (ATCC n.° HTB-81), Calu3 (ATCC n.° HTB-55), A498 (ATCC n.° CRL-7908), Caki-2 (ATCC n.° HTB-47), 786-0 (ATCC n.° CRL-1932), Hs 766T (ATCC n.° HTB-134), MCF7 (ATCC n.° HTB-22), BT-474 (ATCC n.° HTB-20), Rav CA130 (linha de cancro do pulmão registada, desenvolvida por Raven Biotechnologies, Inc.), Rav9926 (linha celular de cancro pancreático registada, desenvolvida por Raven) e 22Rvl (ATCC n.° CRL-2505) e células normais dos respectivos tecidos poderão ser utilizadas para efectuar o rastreio de anticorpos monoclonais que são específicos para o tecido canceroso. As culturas de células primárias, ou de baixa passagem, derivadas de tecidos normais de diferentes órgãos, incluindo, mas não limitados a, ovários, mama, pulmão, próstata, cólon, rim, pele, tiróide, musculo liso aórtico e células 37 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ endoteliais, podem ser utilizadas como controlos negativos. As células cancerosas ou não cancerosas podem ser crescidas em lâminas ou lamelas de vidro ou em superfícies de plástico, ou preparadas num CellArray™, como descrito em WO 01/43869, e rastreadas quanto à ligação do anticorpo utilizando IHQ como descrito acima para os tecidos. Em alternativa, as células poderão ser removidas da superfície de crescimento utilizando meios não proteolíticos e centrifugadas para obtenção de um depósito, que é depois incorporado e tratado como os tecidos para a análise IHQ descrita acima. Em outra alternativa, podem rastrear-se células individuais por incubação do anticorpo primário com um anticorpo "repórter" secundário ligado a uma molécula fluorescente, analisando-as depois por meio de um aparelho de separação de células activadas por fluorescência (FACS de "Fluorescent Activated Cell Sorting"). Vários sistemas de detecção diferentes poderão ser utilizados para detectar a ligação de anticorpos a uma secção de tecido. Tipicamente, a imuno-histoquímica envolve a ligação de um anticorpo primário ao tecido e depois um anticorpo secundário, que é reactivo contra a espécie do anticorpo primário, é gerado e conjugado com um marcador detectável (por exemplo, a peroxidase de rábano (HRP) ou a diaminobenzidina (DAB)). Um método alternativo que poderá ser utilizado consiste em anticorpos polyMICA. A técnica polyMlCA ("polyclonal Mirror Image Complementary Antibodies"), descrita por D.C. Mangham e P.G. Isaacson (Histopathology (1999) 35(2):129-33), pode ser utilizada para testar a ligação de anticorpos primários (por exemplo, anticorpos anti-RAAGlO) a tecidos normais e cancerosos. Estão disponíveis comercialmente vários tipos de kits de detecção polyMICA™ através de The Binding Site Limited (P.O. Box 4073 Birmingham B29 6AT, Inglaterra). O produto n.° HK004.D é um kit de detecção polyMICA™ que utiliza o cromogénio DAB. O produto n.° HK004.A é um kit de detecção polyMICA™ que utiliza o cromogénio AEC. Em alternativa, o anticorpo primário poderá ser marcado directamente com o marcador detectável. O primeiro passo no rastreio por IHQ para seleccionar um anticorpo apropriado é a ligação dos anticorpos primários produzidos em ratinhos (por exemplo, os anticorpos anti- 38 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ RAAG10) a um ou mais imunogénios (por exemplo, células ou amostras de tecido). Em uma concretização, a amostra de tecido consiste em secções de tecido congelado de diferentes órgãos. As células ou as amostras de tecido podem ser cancerosas ou não cancerosas.
Os tecidos congelados podem ser preparados, seccionados, com ou sem fixação, e a IHQ efectuada por meio de um de vários métodos conhecidos por um perito na arte. Consultar, por exemplo, Stephan et al., Dev. Biol. 212:264-277 (1999) e Stephan et al., Endocrinology 140:5841-54 (1999).
V. Métodos de caracterização de anticorpos anti-RAAGlO É possível utilizar vários métodos para caracterizar os anticorpos anti-RAAGlO. Um método consiste em identificar o epitopo ao qual o anticorpo se liga. O mapeamento de epitopos está disponível comercialmente a partir de várias fontes, por exemplo, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Holanda). O mapeamento de epitopos pode ser utilizado para determinar a sequência à qual um anticorpo anti-RAAGlO se liga. O epitopo pode ser um epitopo linear, isto é, contido num único trecho de aminoácidos, ou um epitopo conformacional formado por uma interacção tridimensional de aminoácidos que poderão não estar necessariamente contidos num trecho único. Péptidos de comprimento variável (por exemplo, com pelo menos 4-6 aminoácidos de comprimento) podem ser isolados ou sintetizados (por exemplo, por via recombinante) e utilizados para ensaios de ligação com o anticorpo anti-RAGGlO. O epitopo ao qual o anticorpo anti-RAAGlO se liga pode ser determinado num rastreio sistemático, mediante utilização de péptidos sobreponíveis derivados da sequência extracelular e determinação da ligação pelo anticorpo anti-RAAGlO. 0 mapeamento de epitopos de RAAG10 está detalhado nos Exemplos. Determinámos que existe mais de um epitopo em RAAG10, com os nossos anticorpos KID 13, LUCAl e GB8 a ligarem-se a um epitopo, os nossos anticorpos SKIN2, PA20 e KIDl a ligarem-se a um segundo epitopo e o nosso anticorpo BLA8 a ligar-se a um terceiro epitopo. Estes anticorpos são meramente representativos dos grupos de novos anticorpos com características biológicas e de ligação inerentes similares, em que todos eles estão especificamente incluídos no âmbito deste invento. 39 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Outro método ainda que pode ser utilizado para caracterizar um anticorpo anti-RAAGlO consiste em utilizar ensaios de competição com outros anticorpos conhecidos por se ligarem ao mesmo antigénio, isto é, RAAG10, para determinar se os anticorpos anti-RAAGlO se ligam ao mesmo epitopo que outros anticorpos. Exemplos de anticorpos dirigidos para RAAG10 poderão estar comercialmente disponíveis e poderão ser identificados utilizando os ensaios de ligação aqui descritos. Os ensaios de competição são bem conhecidos pelos peritos na arte, e estes procedimentos e dados ilustrativos estão mais pormenorizados nos Exemplos. Os anticorpos anti-RAAG10 podem ser adicionalmente caracterizados pelos tecidos, tipo de cancro ou tipo de tumor a que se ligam.
Outro método de caracterização dos anticorpos anti-RAAG10 é por meio do antigénio a que se ligam. Utilizaram-se anticorpos anti-RAAGlO em transferências de Western com lisados celulares de vários cancros humanos. Como é do conhecimento dos peritos, a transferência de Western pode envolver correr lisados celulares e/ou fracções celulares num gel desnaturante ou não desnaturante, transferir as proteínas para papel de nitrocelulose e depois pesquisar a transferência utilizando um anticorpo como sonda (por exemplo, um anticorpo anti-RAAGlO) para ver quais as proteínas que são ligadas pelo anticorpo. Este procedimento está mais detalhado no Exemplo 4. A banda à qual o anticorpo anti-RAAGlO se ligou foi isolada e subsequentemente analisada por espectrometria de massa, como descrito nos Exemplos 5 e 6. Verificou-se que o antigénio a que o anticorpo anti-RAAGlO se liga é RAAG10. 0 antigénio RAAG10 está associado a vários cancros humanos de diferentes tecidos, incluindo, entre outros, cólon, pulmão, mama, próstata, ovários, pâncreas e rim, bem como outros tipos de cancro como o sarcoma. Uma descrição adicional de RAAG10 é fornecida nos Exemplos 6 e 7.
VI. Métodos de diagnóstico do cancro utilizando anticorpos anti-RAAGlO
Os anticorpos monoclonais para RAAG10 preparados pelos métodos aqui descritos poderão ser utilizados para identificar a presença ou ausência de células cancerosas numa variedade de tecidos, que incluem, mas não estão limitados a, 40 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ ovários, mama, pulmão, próstata, cólon, rim, pâncreas, pele, tiróide, cérebro, coração, figado, estômago, nervo, vasos sanguíneos, osso e tubo digestivo superior, para fins de diagnóstico. Os anticorpos monoclonais para RAAG10 preparados pelos métodos aqui descritos também poderão ser utilizados para identificar a presença ou ausência de células cancerosas, ou o nivel das mesmas, que estão em circulação no sangue após a sua libertação de um tumor sólido. Este antigénio circulante poderá ser um antigénio RAAG10 intacto, ou um seu fragmento que conserva a capacidade de ser detectado de acordo com os métodos aqui descritos. Esta detecção poderá ser realizada por análise FACS, utilizando os métodos padrão habitualmente usados na arte.
Estas utilizações podem envolver a formação de um complexo entre RAAG10 e um anticorpo que se liga especificamente a RAAG10. Os exemplos destes anticorpos incluem, mas não estão limitados, aqueles anticorpos monoclonais anti-RAAGlO produzidos pelos hibridomas depositados junto da ATCC com as designações PTA-4217, PTA-4218, PTA-4244 e PTA-4245. A formação de um complexo deste tipo pode dar-se in vitro ou in vivo. Sem se ficar limitado pela teoria, o anticorpo monoclonal anti-RAAGlO poderá ligar-se a RAAG10 através do domínio extracelular de RAAG10 e depois ser internalizado.
Em uma concretização preferida dos métodos de diagnóstico deste invento, o anticorpo transporta um marcador detectável. Os exemplos de marcadores que poderão ser utilizados incluem um agente radioactivo ou um fluoróforo, tal como o fluoroisotiocianato ou a ficoeritrina.
Tal como acontece com outros anticorpos conhecidos que são utilizados comercialmente para fins terapêuticos e de diagnóstico, o antigénio-alvo deste invento é amplamente expresso no tecido normal. Ele é também regulado positivamente em alguns tumores. Por conseguinte, as doses e vias de entrega particulares dos anticorpos deste invento, conforme usados na qualidade de agentes terapêuticos e de diagnóstico, serão adaptadas para o tumor ou estado de doença particulares, bem como para o indivíduo particular em tratamento. 41 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Um método de utilização dos anticorpos para fins de diagnóstico consiste na imagiologia dos tumores in vivo por ligação do anticorpo a um agente radioactivo ou radiopaco, administração do anticorpo ao indivíduo e utilização de um aparelho de raios X ou de outro equipamento de imagiologia para visualizar a localização do anticorpo marcado na superfície das células cancerosas que expressam o antigénio. 0 anticorpo é administrado numa concentração que promove a ligação em condições fisiológicas.
As técnicas in vitro para a detecção de RAAG10 são rotina na arte e incluem os ensaios imunossorventes ligados a enzima (ELISA), as imunoprecipitações, a imunofluorescência, o imunoensaio enzimático (EIA), o radioimunoensaio (RIA) e a análise por transferência de Western.
Em aspectos deste invento, os métodos de radioimagiologia de tumores ou neoplasmas, ou de medição da eficácia de um método de tratamento com um anticorpo radiomarcado, compreendem o passo de administração de um anticorpo radiomarcado e específico para o tumor a um indivíduo, de acordo com a prática deste invento. 0 anticorpo radiomarcado poderá ser um anticorpo monoclonal ou policlonal compreendendo um marcador radioactivo, preferencialmente seleccionado entre o grupo que consiste em Tecnécio-99m, índio-111, Iodo-131, Rénio-186, Rénio-188, Samário-153, Lutécio-177, Cobre-64, Escândio-47 e ítrio-90. Os anticorpos monoclonais marcados com radionuclidos terapêuticos como Iodo-131, Rénio-188, Hólmio-166, Samário-153 e Escândio-47, que não comprometem a imunorreactividade dos anticorpos e não são degradados in vivo, são especialmente preferidos. Um perito na arte compreenderá que outros isótopos radioactivos são conhecidos e poderão ser adequados para aplicações específicas. A radioimagiologia poderá ser conduzida utilizando a tomografia computorizada por emissão de fotão único (SPECT), a tomografia por emissão de positrões (PET), a tomografia computorizada (CT) ou as imagens por ressonância magnética (MRI). A imagiologia correlativa, que permite uma maior definição anatómica da localização das metástases localizadas por radioimunoimagiologia, também está contemplada. 42 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Em outros métodos, as células cancerosas são removidas e o tecido é preparado para imuno-histoquímica por métodos bem conhecidos na arte (por exemplo, incorporação num composto para congelação, congelação e seccionamento, com ou sem fixação; fixação e incorporação em parafina, com ou sem vários métodos de recuperação e coloração de contraste do antigénio). Os anticorpos monoclonais também poderão ser utilizados para identificar células cancerosas em diferentes fases de desenvolvimento. Os anticorpos também poderão ser utilizados para determinar quais os tumores dos indivíduos que expressam o antigénio na sua superfície a um nível predeterminado e são, por conseguinte, candidatos para imunoterapia utilizando anticorpos dirigidos contra o referido antigénio. Os anticorpos poderão reconhecer cancros primários e metastizados dos ovários, próstata e pâncreas e cancros primários do pulmão que expressam RAAG10. Tal como o termo é aqui utilizado, a detecção poderá incluir a detecção qualitativa e/ou quantitativa e poderá incluir a comparação do nível medido com o nível de uma célula normal para confirmar um maior nível de expressão de RAAG10 nas células cancerosas. 0 invento também disponibiliza métodos para ajudar no diagnóstico do cancro (como seja o cancro dos ovários, pulmão, pâncreas, próstata, cólon ou mama) num indivíduo utilizando qualquer anticorpo que se liga a RAAG10, e quaisquer outros métodos que possam ser utilizados para determinar o nível de expressão de RAAG10. Tal como o termo é aqui utilizado, métodos para "ajudar no diagnóstico" significa que estes métodos ajudam a fazer uma determinação clínica relativamente à classificação, ou natureza, do cancro e poderão ou não ser conclusivos quanto ao diagnóstico definitivo. Por conseguinte, um método para ajudar no diagnóstico do cancro pode compreender o passo de detecção do nível de RAAG10 numa amostra biológica do indivíduo e/ou a determinação do nível de expressão de RAAG10 na amostra. Os anticorpos que reconhecem o antigénio também poderão ser utilizados na criação de imunoensaios de diagnóstico, para detectar o antigénio libertado ou segregado a partir de células cancerosas vivas ou mortas em fluidos corporais, que 43 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ incluem, mas não estão limitados a, sangue, saliva, urina, fluido pulmonar ou fluido ascitico.
Nem todas as células num tumor de interesse particular expressarão RAAG10, e as células cancerosas em outros tecidos poderão também expressar RAAG10, pelo que um indivíduo deverá ser testado quanto à presença ou ausência de RAAG10 nas suas células cancerosas para determinar a utilidade da imunoterapia nesse indivíduo. Os anticorpos anti-RAAGlO preparados pelos métodos aqui descritos poderão ser utilizados para determinar se um indivíduo diagnosticado com cancro poderá ser considerado um candidato para imunoterapia utilizando os anticorpos dirigidos contra RAAG10. Em uma concretização, um tumor canceroso ou uma amostra para biopsia poderão ser testados quanto à expressão de RAAG10, utilizando anticorpos dirigidos contra RAAG10. Os indivíduos com células cancerosas que expressam RAAG10 são candidatos adequados para imunoterapia utilizando os anticorpos dirigidos contra RAAG10. A coloração com anticorpo anti-RAAGlO também poderá ser utilizada para distinguir os tecidos cancerosos de tecidos normais.
Os métodos de utilização de anticorpos anti-RAAGlO para fins de diagnóstico são úteis antes e após qualquer forma de tratamento anticancro, por exemplo, a quimioterapia ou a radioterapia, para determinar quais os tumores mais susceptíveis de responder a um dado tratamento, o prognóstico para o indivíduo com cancro, o subtipo do tumor ou a origem da doença metastática e a progressão da doença ou a resposta ao tratamento.
As composições deste invento também são adequadas para o diagnóstico de estados de doença diferentes de cancro, utilizando os métodos descritos acima aplicados a outras células doentes (não cancerosas). Os estados de doença adequados para utilização nos métodos deste invento incluem, embora não estejam limitados a estes, doenças ou perturbações associadas a respostas inflamatórias ou autoimunes nos indivíduos. Os métodos descritos acima poderão ser utilizados para modular as respostas inflamatórias ou autoimunes nos indivíduos. As doenças e condições resultantes de perturbações inflamatórias e autoimunes que poderão ser 44 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ submetidas a diagnóstico e/ou tratamento utilizando as composições e métodos do invento incluem, a título ilustrativo e não limitativo, a esclerose múltipla, a meningite, a encefalite, o acidente vascular cerebral, outros traumas cerebrais, a doença inflamatória do intestino incluindo a colite ulcerosa e a doença de Crohn, a miastenia grave, o lúpus, a artrite reumatóide, a asma, a diabetes de tipo 1 aguda, a demência associada à SIDA, a aterosclerose, a nefrite, a retinite, a dermatite atópica, a psoríase, a isquemia miocárdica e a lesão pulmonar aguda mediada por leucócitos.
Outras indicações ainda para a utilização terapêutica e/ou de diagnóstico dos anticorpos e outros agentes terapêuticos do invento incluem a administração a indivíduos em risco de rejeição de órgãos ou enxertos. Nos últimos anos, tem-se verificado uma melhoria considerável da eficiência das técnicas cirúrgicas para o transplante de tecidos e órgãos, tais como a pele, o rim, o fígado, o coração, o pulmão, o pâncreas e a medula óssea. Talvez o principal problema pendente seja a falta de agentes satisfatórios para induzir imunotolerância no receptor ao aloenxerto ou órgão transplantado. Quando células ou órgãos alogénicos são transplantados para um hospedeiro (isto é, o dador e o receptor são indivíduos diferentes da mesma espécie), é provável que o sistema imunitário do hospedeiro desencadeie uma resposta imunitária contra os antigénios estranhos presentes no transplante (doença do enxerto contra o hospedeiro), conduzindo à destruição do tecido transplantado. VII. Composições deste invento
Este invento também abrange composições, incluindo composições farmacêuticas, que compreendem anticorpos anti-RAAG10, polipéptidos derivados de anticorpos anti-RAAGlO, polinucleótidos compreendendo sequências que codificam anticorpos anti-RAAGlO e outros agentes conforme aqui descritos. Tal como o termo é aqui utilizado, as composições compreendem ainda um ou mais anticorpos, polipéptidos e/ou proteínas que se ligam a RAAG10 e/ou um ou mais polinucleótidos compreendendo sequências que codificam um ou 45 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ mais anticorpos, polipéptidos e proteínas que se ligam a RAAG10.
Os anticorpos, agentes, polipéptidos e proteínas deste invento são adicionalmente identificados e caracterizados por qualquer (um ou mais) dos seguintes critérios: (a) capacidade de ligação a RAAG10 (incluindo RAAG10 em células cancerosas, incluindo, embora não limitadas a, células de cancro de ovários, próstata, pâncreas, pulmão, cólon ou mama); (b) capacidade para inibir competitivamente a ligação preferencial de um anticorpo anti-RAAGlO conhecido a RAAG10, incluindo a capacidade para se ligar preferencialmente ao mesmo epitopo de RAAG10 a que o anticorpo original preferencialmente se liga; (c) capacidade de ligação a uma porção de RAAG10 que está exposta na superfície de uma célula viva in vítro ou in vivo; (d) capacidade de ligação a uma porção de RAAG10 que está exposta na superfície de células cancerosas vivas, tais como, embora não limitadas a, células de cancro de ovários, próstata, pâncreas, pulmão, cólon ou mama; (e) capacidade para entregar um agente quimioterapêutico ou um marcador detectável a células cancerosas (tais como, mas não limitadas a, células de cancro de ovários, próstata, pâncreas, pulmão, cólon ou mama) que expressam ALCAM; (f) capacidade para entregar um agente terapêutico em células cancerosas (tais como, embora não limitadas a, células de cancro de ovários) que expressam RAAG10.
Em algumas concretizações, o anticorpo do invento é um anticorpo que é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito seleccionado entre qualquer um dos n.os ATCC PTA-4217, 4218, 4244 ou 4245, ou a sua progenitura. 0 presente invento também inclui várias formulações de anticorpos produzidos por estes hibridomas depositados e anticorpos ou fragmentos polipeptídicos equivalentes (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2^ Fv, Fc, etc.), anticorpos quiméricos, cadeia simples (ScFv), seus mutantes, proteínas de fusão compreendendo uma porção do anticorpo, anticorpos humanizados e qualquer outra configuração modificada de qualquer um destes anticorpos ou anticorpos equivalentes que compreende um local de reconhecimento de antigénio (RAAG10) com a especificidade requerida. 0 invento também 46 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ disponibiliza anticorpos humanos que apresentam uma ou mais das características biológicas de um membro da família anti-RAAG10. Os anticorpos equivalentes da família anti-RAAGlO (incluindo anticorpos humanizados e anticorpos humanos), os fragmentos polipeptídicos e os polipéptidos que compreendem qualquer um destes fragmentos são identificados e caracterizados por qualquer (um ou mais) dos cinco critérios descritos acima.
Em algumas concretizações, os anticorpos, polipéptidos e proteínas do invento que se ligam a RAAG10 são anticorpos, polipéptidos e proteínas que inibem competitivamente a ligação preferencial de um anticorpo anti-RAAGlO aqui especificado a RAAG10. Em algumas concretizações, os anticorpos, os polipéptidos e as proteínas ligam-se preferencialmente ao mesmo epitopo em RAAG10 a que um dos anticorpos LUCAl, BLA8, PA20 e SKIN2 preferencialmente se liga.
Por conseguinte, o invento disponibiliza qualquer uma das seguintes entidades (ou composições, incluindo composições farmacêuticas, que compreendem qualquer uma das seguintes entidades): (a) um anticorpo produzido pela célula hospedeira com um número de depósito identificado acima ou a sua progenitura; (b) uma forma humanizada de um anticorpo destes; (c) um anticorpo compreendendo uma ou mais das regiões variáveis da cadeia leve e/ou da cadeia pesada de um anticorpo destes; (d) um anticorpo quimérico compreendendo regiões variáveis homólogas ou derivadas de regiões variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo destes, e regiões constantes homólogas ou derivadas de regiões constantes de uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo humano; (e) um anticorpo compreendendo uma ou mais (pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis) das CDR da cadeia leve e/ou cadeia pesada de um anticorpo destes; (f) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve de um anticorpo destes; (g) um anticorpo humano que é equivalente a um anticorpo destes. Uma forma humanizada do anticorpo poderá ou não ter CDR idênticas a esse anticorpo original, ou ao anticorpo produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito identificado acima. A determinação das regiões CDR está dentro da perícia na arte. Em algumas 47 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ concretizações, ο invento proporciona um anticorpo que compreende pelo menos uma CDR que é substancialmente homóloga de pelo menos uma CDR, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos 5 CDR de um anticorpo produzido por um dos hibridomas depositados identificados acima (ou, em algumas concretizações, substancialmente homóloga de todas as 6 CDR de um destes anticorpos, ou derivada de um destes anticorpos), ou um anticorpo produzido pela célula hospedeira com um número de depósito identificado acima. Outras concretizações incluem anticorpos que possuem pelo menos duas, três, quatro, cinco ou seis CDR que são substancialmente homólogas de pelo menos duas, três, quatro, cinco ou seis CDR de um anticorpo produzido a partir de um hibridoma depositado da forma aqui identificada, ou derivadas de um anticorpo destes. Entende-se, para fins do invento, que a especificidade de ligação e/ou a actividade global (que poderá ser em termos de entregar um agente quimioterapêutico a ou em células cancerosas para reduzir o crescimento e/ou a proliferação das células cancerosas, para induzir a morte celular apoptótica na célula cancerosa, para atrasar o desenvolvimento da metástase e/ou para tratar de forma paliativa) é de um modo geral retida, embora a extensão da actividade possa variar em comparação com um anticorpo produzido por um hibridoma depositado (poderá ser maior ou menor). 0 invento também disponibiliza métodos para preparar qualquer um destes anticorpos. Os métodos de preparação de anticorpos são conhecidos na arte e estão aqui descritos. 0 invento também disponibiliza polipéptidos que compreendem uma sequência de aminoácidos dos anticorpos do invento. Em algumas concretizações, o polipéptido compreende uma ou mais das regiões variáveis da cadeia leve e/ou cadeia pesada do anticorpo. Em algumas concretizações, o polipéptido compreende uma ou mais das CDR da cadeia leve e/ou cadeia pesada do anticorpo. Em algumas concretizações, o polipéptido compreende três CDR da cadeia leve e/ou cadeia pesada do anticorpo. Em algumas concretizações, o polipéptido compreende uma sequência de aminoácidos do anticorpo que possui qualquer uma das seguintes situações: pelo menos 5 aminoácidos contíguos de uma sequência do anticorpo original, pelo menos 8 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 10 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 48 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ 15 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 20 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 25 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 30 aminoácidos contíguos, em que pelo menos 3 dos aminoácidos são de uma região variável do anticorpo. Em uma concretização, a região variável é de uma cadeia leve do anticorpo original. Em outra concretização, a região variável é de uma cadeia pesada do anticorpo. Em outra concretização, os 5 (ou mais) aminoácidos contíguos são de uma região determinante de complementaridade (CDR) do anticorpo. VIII. Métodos de utilização de anticorpos anti-RAAGlO para fins terapêuticos
Os anticorpos monoclonais para RAAG10 poderão ser utilizados para fins terapêuticos em indivíduos com cancro ou outras doenças. A terapia com anticorpos anti-RAAGlO pode envolver a formação de complexos in vitro e in vivo como descrito acima. Em uma concretização, o anticorpo monoclonal anti-RAAGlO pode ligar-se a células cancerosas e reduzir a sua proliferação. Entende-se que o anticorpo é administrado numa concentração que promove a ligação em condições fisiológicas (por exemplo, in vivo). Em outra concretização, os anticorpos monoclonais para RAAG10 podem ser utilizados para imunoterapia dirigida contra as células cancerosas de diferentes tecidos, como o cólon, pulmão, mama, próstata, ovário, pâncreas, rim, e outros tipos de cancro como o sarcoma. Em outra concretização, o anticorpo monoclonal anti-RAAG10 sozinho pode ligar-se à célula cancerosa e induzir morte celular apoptótica. Em outra concretização, o anticorpo monoclonal anti-RAAGlO pode ligar-se a células cancerosas e retardar o desenvolvimento da metástase. Ainda em outra concretização, um indivíduo com cancro recebe um tratamento paliativo com anticorpo anti-RAAGlO. O tratamento paliativo de um indivíduo com cancro envolve o tratamento ou a mitigação dos sintomas adversos da doença, ou dos sintomas iatrogénicos resultantes de outros tratamentos administrados para a doença, sem afectar directamente a progressão do cancro. Isto inclui tratamentos para aliviar a dor, suporte nutricional, problemas sexuais, angústia psicológica, depressão, fadiga, perturbações psiquiátricas, náuseas, vómitos, etc. 49 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Nestas situações, ο anticorpo anti-RAAG10 poderá ser administrado juntamente com agentes que reforçam ou dirigem a própria resposta imunitária de um indivíduo, como seja um agente que reforça a ADCC (citotoxidade celular dependente de anticorpos).
Ainda em outra concretização, o anticorpo anti-RAAGlO pode ser conjugado ou associado a uma molécula radioactiva, uma toxina (por exemplo, a caliqueamicina), uma molécula quimioterapêutica, lipossomas ou outras vesículas contendo compostos quimioterapêuticos, e administrado a um indivíduo necessitado desse tratamento, para direccionar estes compostos até à célula cancerosa que contém o antigénio reconhecido pelo anticorpo e, deste modo, eliminar as células cancerosas ou doentes. Sem se ser limitado por qualquer teoria particular, o anticorpo anti-RAAGlO é internalizado pela célula que possui RAAG10 na sua superfície, entregando, assim, o fragmento conjugado à célula para induzir o efeito terapêutico. Ainda em outra concretização, o anticorpo pode ser empregue como terapia adjuvante no momento da remoção cirúrgica de um cancro que expressa o antigénio, de modo a atrasar o desenvolvimento da metástase. 0 anticorpo também pode ser administrado antes da cirurgia (terapia neo-adjuvante) a um indivíduo com um tumor que expressa o antigénio, de forma a diminuir o tamanho do tumor e, assim, permitir ou simplificar a cirurgia, poupar tecido durante a cirurgia e/ou diminuir a desfiguração resultante.
Os agentes quimioterapêuticos incluem moléculas radioactivas, toxinas, também designadas por citotoxinas ou agentes citotóxicos, o que inclui qualquer agente prejudicial para a viabilidade das células cancerosas, agentes e lipossomas ou outras vesículas contendo compostos quimioterapêuticos. Os exemplos de agentes quimioterapêuticos adequados incluem, embora não estejam limitados a estes, 1-desidrotestosterona, 5-fluorouracilo, decarbazina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, actinomicina D, adriamicina, aldesleucina, agentes alquilantes, alopurinol sódico, altretamina, amifostina, anastrozol, antramicina (AMC), agentes antimitóticos, cis-diaminodicloroplatina (II) (DDP) (cisplatina), diaminodicloroplatina, antraciclinas, antibióticos, antimetabolitos, asparaginase, BCG viva 50 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ (intravesical), fosfato sódico de betametasona e acetato de betametasona, bicalutamida, sulfato de bleomicina, busulfan, leucovorin (cálcio), caliqueamicina, capecitabina, carboplatina, lomustina (CCNU), carmustina (BSNU), Clorambucil, Cisplatina, Cladribina, Colchicina, estrogénios conjugados, Ciclofosfamida, Ciclotosfamida, Citarabina, Citarabina, citocalasina B, Cytoxan, Dacarbazina, Dactinomicina, dactinomicina (antigamente actinomicina), daunorrubicina HC1, citrato de daunorrubicina, denileucina diftitox, Dexrazoxano, Dibromomanitol, di-hidroxi-antracina-diona, Docetaxel, mesilato de dolasetron, doxorrubicina HC1, dronabinol, L-asparaginase de E. coli , emetina, epoetina-alfa, L-asparaginase de Erwinia, estrogénios esterifiçados, estradiol, fosfato sódico de estramustina, brometo de etídio, etinilestradiol, etidronato, etoposido, factor citrororum, fosfato de etoposido, filgrastim, floxuridina, fluconazol, fosfato de fludarabina, fluorouracilo, flutamida, ácido folínico, gemcitabina HC1, glucocorticóides, acetato de goserelina, gramicidina D, granisetron HC1, hidroxiureia, idarrubicina HC1, ifosfamida, interferão-alfa-2b, irinotecano HC1, letrozol, leucovorin de cálcio, acetato de leuprolide, levamisol HC1, lidocaína, lomustina, maitansinóide, mecloretamina HC1, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, melfalan HC1, mercaptopurina, mesna, metotrexato, metiltestosterona, mitramicina, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, nilutamida, acetato de octreotide, ondansetron HC1, paclitaxel, pamidronato dissódico, pentostatina, pilocarpina HC1, plimycin, polifeprosan 20 com implantes de carmustina, porfimero sódico, procaina, procarbazina HC1, propranolol, rituximab, sargramostim, estreptozotocina, tamoxifeno, taxol, teniposido, tenoposido, testolactona, tetracaína, tiotepa clorambucil, tioguanina, tiotepa, topotecano HC1, citrato de toremifeno, trastuzumab, tretinoína, valrubicina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina e tartarato de vinorelbina.
Numa concretização preferida, a citotoxina é especialmente eficaz em células em divisão ou divisão rápida, pelo que as células que não estão em divisão são relativamente poupadas aos efeitos tóxicos. 51 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Os anticorpos do invento podem ser internalizados nas células doentes ou de carcinoma às quais se ligam e são, por conseguinte, particularmente úteis para aplicações terapêuticas, por exemplo, a entrega nas células de toxinas que precisam de ser internalizadas para desempenhar a sua actividade adversa. Os exemplos destas toxinas incluem, mas não estão limitados a, saporina, caliqueamicina, auristatina e maitansinóide.
Os anticorpos ou polipéptidos do invento podem estar associados (incluindo conjugados ou ligados) a uma molécula radioactiva, uma toxina ou outros agentes terapêuticos, ou a lipossomas ou outras vesículas contendo agentes terapêuticos, de forma covalente ou não covalente, directa ou indirectamente. 0 anticorpo poderá estar ligado à molécula radioactiva, à toxina ou à molécula quimioterapêutica em qualquer local ao longo de si, desde que o anticorpo seja capaz de se ligar ao seu alvo RAAG10.
Uma toxina ou um agente quimioterapêutico poderão ser acoplados (por exemplo, ligados covalentemente) a um anticorpo monoclonal adequado quer directa quer indirectamente (por exemplo, via um grupo de ligação ou, em alternativa, via uma molécula de ligação com locais de união apropriados, como seja uma molécula de plataforma descrita na patente U.S. 5,552,391). A toxina e o agente quimioterapêutico do presente invento podem ser acoplados directamente às proteínas de direccionamento particulares, utilizando métodos conhecidos na arte. Por exemplo, é possível uma reacção directa entre um agente e um anticorpo quando cada um deles possui um substituinte capaz de reagir com o outro. Por exemplo, um grupo nucleofilico, tal como um grupo amino ou sulfidrilo, num deles poderá ser capaz de reagir com um grupo contendo um carbonilo, como seja um anidrido ou um halogeneto de ácido, ou com um grupo alquilo contendo um bom grupo sainte (por exemplo, um halogeneto) no outro.
Os anticorpos ou polipéptidos também podem ser ligados a um agente quimioterapêutico via um microssuporte. 0 termo microssuporte refere-se a uma partícula biodegradável ou não biodegradável que é insolúvel em água e possui um tamanho 52 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ inferior a cerca de 150, 120 ou 100 μιη, mais habitualmente inferior a cerca de 50-60 μιη, preferencialmente inferior a cerca de 10, 5, 2,5; 2 ou 1,5 μπι. Os microssuportes incluem "nanossuportes", que são microssuportes com um tamanho inferior a cerca de 1 μιη, preferencialmente inferior a cerca de 500 nm. Estas partículas são conhecidas na arte. Os microssuportes em fase sólida poderão ser partículas formadas a partir de polímeros de ocorrência natural, polímeros sintéticos ou copolímeros sintéticos biocompatíveis, os quais poderão incluir ou excluir os microssuportes formados a partir de agarose ou de agarose reticulada, assim como outros materiais biodegradáveis conhecidos na arte. Os microssuportes biodegradáveis em fase sólida poderão ser formados a partir de polímeros que são degradáveis (por exemplo, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) e seus copolímeros) ou erodíveis (por exemplo, poli(ortoésteres) como 3,9-dietilideno-2,4,8,10-tetraoxaspiro[5.5]undecano (DETOSU), ou poli(anidridos) como poli(anidridos) do ácido sebácico) nas condições fisiológicas dos mamíferos. Os microssuportes também poderão ser em fase líquida (por exemplo, numa base oleosa ou lipídica), como lipossomas, "iscoms" (complexos imunoestimulantes, que são complexos estáveis de colesterol, fosfolípido e saponina activa no adjuvante) sem antigénio, ou gotículas ou micelas encontradas em emulsões óleo em água ou água em óleo, desde que os microssuportes em fase líquida sejam biodegradáveis. Os microssuportes biodegradáveis em fase líquida incorporam tipicamente um óleo biodegradável, vários dos quais são conhecidos na arte, incluindo o esqualeno e os óleos vegetais. Os microssuportes têm tipicamente uma forma esférica, embora os microssuportes que se desviam da forma esférica também sejam aceitáveis (por exemplo, elipsóide, em forma de bastão, etc.). Devido à sua natureza insolúvel (em relação à água), os microssuportes são filtráveis a partir da água e de soluções aquosas.
Os conjugados de anticorpo ou polipéptido do presente invento poderão incluir uma molécula de ligação bifuncional que contém um grupo capaz de acoplar-se a um agente tóxico ou agente quimioterapêutico e um grupo capaz de acoplar-se ao anticorpo. Uma molécula de ligação pode funcionar como um espaçador para distanciar um anticorpo de um agente, de modo 53 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ a evitar interferências com as capacidades de ligação. Uma molécula de ligação pode ser clivável ou não clivável. Uma molécula de ligação pode também servir para aumentar a reactividade quimica de um substituinte num agente ou num anticorpo e, deste modo, aumentar a eficiência de acoplamento. Um aumento da reactividade quimica poderá também facilitar a utilização de agentes, ou de grupos funcionais em agentes, que de outro modo não seria possível. A molécula de ligação bifuncional pode ser acoplada ao anticorpo por meios que são conhecidos na arte. Por exemplo, uma molécula de ligação contendo um grupo éster activo, como um éster de N-hidroxisuccínimida, pode ser utilizada para efectuar o acoplamento a resíduos de lisina do anticorpo via uma ligação amida. Em outro exemplo, uma molécula de ligação contendo um resíduo de hidrazina ou amina nucleofílico pode ser acoplada aos grupos aldeído produzidos pela oxidação glicolítica de residuos de hidrato de carbono do anticorpo. Além destes métodos directos de acoplamento, a molécula de ligação pode ser acoplada indirectamente ao anticorpo através de um suporte intermediário, tal como um aminodextrano. Nestas concretizações, a ligação modificada dá-se via lisina, hidrato de carbono ou um suporte intermediário. Em uma concretização, a molécula de ligação é acoplada via locais selectivos a residuos tiol livres presentes na proteína. Os grupos funcionais que são adequados para o acoplamento selectivo a grupos tiol presentes nas proteínas são bem conhecidos na arte. Os exemplos incluem compostos dissulfureto, compostos oc-halocarbonilo e α-halocarboxilo e maleimidas. Quando está presente uma função amina nucleofílica na mesma molécula que um grupo a-halocarbonilo ou carboxilo, existe potencial para a ocorrência de ciclização via alquilação intramolecular da amina. Os métodos para evitar este problema são bem conhecidos pelos peritos na arte, por exemplo, a preparação de moléculas nas quais as funções amina e α-halo estão separadas por grupos inflexíveis, tais como os grupos arilo ou os trans-alcenos, que tornam a ciclização indesejada estereoquimicamente desfavorável. Consultar, por exemplo, a patente U.S. n.° 6,441,163 para a preparação de conjugados de maitansinóides e anticorpo via um grupo funcional dissulfureto. 54 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Uma das moléculas de ligação cliváveis que pode ser utilizada para a preparação de conjugados anticorpo-fármaco é uma molécula de ligação lábil em meio ácido e baseada no ácido cis-aconitico, que tira partido do ambiente acidico de diferentes compartimentos intracelulares, tais como os endossomas encontrados durante a endocitose mediada por receptores e os lisossomas. Consultar, por exemplo, Shen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 102:1048-1054 (1981) relativamente à preparação de conjugados de daunorrubicina com vectores macromoleculares; Yang et al., J. Natl. Canc. Inst. 80:1154-1159 (1988) relativamente à preparação de conjugados de daunorrubicina com um anticorpo antimelanoma; Dillman et al., Câncer Res. 48:6097-6102 (1988) relativamente à utilização similar de uma molécula de ligação lábil em meio ácido para preparar conjugados de daunorrubicina com um anticorpo anti-células T; Trouet et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 79:626-629 (1982) relativamente à ligação de daunorrubicina a um anticorpo via um braço espaçador peptídico.
Um anticorpo (ou polipéptido) deste invento poderá ser conjugado (ligado) a uma molécula radioactiva através de qualquer método conhecido na arte. Para consultar uma discussão sobre os métodos de radiomarcação de anticorpos, ver "Câncer Therapy with Monoclonal AntibodiesT", D.M. Goldenberg ed. (CRC Press, Boca Raton, 1995).
Em alternativa, um anticorpo pode ser conjugado com um segundo anticorpo para formar um heteroconjugado de anticorpo, conforme descrito por Segai na patente U.S. n.° 4,676,980. A formação de anticorpos reticulados pode dirigir o sistema imunitário para tipos específicos de células, por exemplo, células cancerosas ou células doentes que expressam RAAG10.
Este invento também disponibiliza métodos para atrasar o desenvolvimento da metástase num indivíduo com cancro (incluindo, embora não limitado a, cancro da próstata, pulmão, mama, ovários, pâncreas ou cólon), utilizando um anticorpo anti-RAAGlO ou outras concretizações que se ligam a RAAG10 unidos a um agente quimioterapêutico. Em algumas 55 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ concretizações, ο anticorpo é uma forma humanizada ou quimérica de um anticorpo anti-RAAGlO não humano.
Ainda em outra concretização, o anticorpo pode ser empregue como terapia adjuvante no momento da remoção cirúrgica de um cancro que expressa o antigénio, de modo a atrasar o desenvolvimento da metástase. 0 anticorpo ou anticorpo associado a um agente quimioterapêutico também pode ser administrado antes da cirurgia (terapia neo-adjuvante) a um indivíduo com um tumor que expressa o antigénio, de modo a diminuir o tamanho do tumor e, assim, permitir ou simplificar a cirurgia, poupar tecido durante a cirurgia e/ou diminuir a desfiguração resultante.
Ainda em outra concretização, qualquer uma das concretizações que se ligam a RAAG10 aqui descritas pode ligar-se a células cancerosas que expressam RAAG10 e induzir uma resposta imunitária activa contra as células cancerosas que expressam RAAG10. Em alguns casos, a resposta imunitária activa pode causar a morte das células cancerosas (por exemplo, a ligação do anticorpo às células cancerosas induz morte celular apoptótica) ou inibir o crescimento (por exemplo, bloqueio da progressão do ciclo celular) das células cancerosas. Em outros casos, qualquer um dos novos anticorpos aqui descritos pode ligar-se a células cancerosas, e a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) pode eliminar as células cancerosas às quais o anticorpo anti-RAAG10 se liga. Por conseguinte, o invento disponibiliza métodos para estimular uma resposta imunitária que compreendem a administração de qualquer uma das composições aqui descritas.
Em alguns casos, a ligação do anticorpo também pode activar as respostas imunitárias tanto celular como humoral e recrutar mais células "killer" naturais ou aumentar a produção de citocinas (por exemplo, IL-2, IFN-γ, IL-12, TNF-a, TNF-β, etc.) que activam adicionalmente o sistema imunitário de um indivíduo para destruir as células cancerosas. Ainda em outra concretização, mKID2 pode ligar-se a células cancerosas, e os macrófagos ou outra célula fagocitária podem opsonizar as células cancerosas. 56 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ Várias formulações de anticorpos anti-RAAGlO ou seus fragmentos poderão ser utilizadas para administração. Em algumas concretizações, os anticorpos anti-RAAGlO ou seus fragmentos poderão ser administrados puros. Além do agente farmacologicamente activo, as composições do presente invento poderão conter veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados constituídos por excipientes e auxiliares, que são bem conhecidos na arte e consistem em substâncias relativamente inertes que facilitam a administração de uma substância farmacologicamente eficaz ou facilitam o processamento dos compostos activos em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente para entrega no local de acção. Por exemplo, um excipiente pode dar forma ou consistência ou pode actuar como um diluente. Os excipientes adequados incluem, mas não estão limitados a, agentes de estabilização, agentes emulsionantes e molhantes, sais para variar a osmolaridade, agentes encapsulantes, tampões e agentes de reforço da penetração através da pele.
As formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções aquosas dos compostos activos numa forma solúvel em água, por exemplo, sais solúveis em água.
Adicionalmente, poderão administrar-se suspensões dos compostos activos, como sejam as suspensões oleosas apropriadas para injecção. Os solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos gordos, por exemplo, o óleo de sésamo, ou ésteres de ácidos gordos sintéticos, por exemplo, o oleato de etilo ou os triglicéridos. As suspensões aquosas para injecção poderão conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão e incluem, por exemplo, a carboximetilcelulose de sódio, o sorbitol e/ou o dextrano. Opcionalmente, a suspensão também poderá conter agentes de estabilização. Os lipossomas podem ser igualmente utilizados para encapsular o agente para entrega na célula. A formulação farmacêutica para administração sistémica de acordo com o invento poderá ser formulada para administração entérica, parentérica ou tópica. Na realidade, os três tipos de formulação poderão ser utilizados simultaneamente para obter uma administração sistémica do ingrediente activo. Os excipientes, assim como as formulações para entrega parentérica e não parentérica de fármacos estão 57 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ apresentados em Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000) .
As formulações adequadas para administração oral incluem cápsulas de gelatina dura ou mole, pílulas, comprimidos, incluindo comprimidos revestidos, elixires, suspensões, xaropes ou inalações, e formas de libertação controlada destas formulações.
Geralmente, estes agentes são formulados para administração por injecção (por exemplo, intraperitonealmente, intravenosamente, subcutaneamente, intramuscularmente, etc.) embora outras formas de administração (por exemplo, oral, através das mucosas, etc.) também possam ser utilizadas. Por conseguinte, os anticorpos anti-RAAGlO são preferencialmente combinados com veículos farmaceuticamente aceitáveis, como soro fisiológico, solução de Ringer, solução de dextrose e similares. O regime posológico particular, isto é, dose, horário e repetição, dependerá do indivíduo particular e do historial médico desse indivíduo. Geralmente, administra-se uma dose de pelo menos cerca de 100 μρ/]<:ρ de peso corporal, mais preferencialmente pelo menos cerca de 250 μρ/]ζρ de peso corporal, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 750 μρ/kg de peso corporal, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 3 mg/kg de peso corporal, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 5 mg/kg de peso corporal, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 10 mg/kg de peso corporal.
Considerações empíricas, como a semivida, contribuirão geralmente para a determinação da posologia. Os anticorpos, que são compatíveis com o sistema imunitário humano, como os anticorpos humanizados ou os anticorpos totalmente humanos, poderão ser utilizados para prolongar a semivida do anticorpo e evitar que ele seja atacado pelo sistema imunitário do hospedeiro. A frequência de administração poderá ser determinada e ajustada durante o curso da terapia e baseia-se na redução do número de células cancerosas, manutenção da redução das células cancerosas, redução da proliferação das células cancerosas ou atraso do desenvolvimento da metástase. 58 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Em alternativa, as formulações de libertação contínua e prolongada de anticorpos anti-RAAGlO poderão ser apropriadas. São conhecidas na arte várias formulações e dispositivos para obter uma libertação prolongada.
Em uma concretização, as posologias dos anticorpos anti-RAAG10 poderão ser determinadas empiricamente em indivíduos que receberam uma ou mais administrações. Os indivíduos recebem doses incrementais de um anticorpo anti-RAAGlO. Para avaliar a eficácia dos anticorpos anti-RAAGlO, pode seguir-se um marcador do estado da doença cancerosa específica. Estes incluem medições directas do tamanho do tumor via palpação ou observação visual, a medição indirecta do tamanho do tumor por raios X ou outras técnicas de imagiologia; uma melhoria conforme avaliada por biopsia directa do tumor e exame microscópico da amostra do tumor; a medição de um marcador indirecto do tumor (por exemplo, o antigénio PSA para o cancro da próstata), uma diminuição da dor ou da paralisia; fala, visão, respiração ou outra deficiência associada ao tumor melhorada; aumento do apetite; ou um aumento da qualidade de vida conforme medido por testes aceites ou prolongamento da sobrevivência. Será evidente para um perito na arte que a posologia variará dependendo do indivíduo, do tipo de cancro, da fase do cancro, do facto de o cancro ter ou não começado a metastizar para outro local no indivíduo e dos tratamentos passados e concomitantes em uso.
Outras formulações incluem formas de entrega adequadas conhecidas na arte que incluem, embora não estejam limitadas a estas, vectores como os lipossomas. Consultar, por exemplo, Mahato et al. (1997) Pharm. Res. 14:853-859. As preparações lipossómicas incluem, mas não estão limitadas a, citofectinas, vesículas multilamelares e vesículas unilamelares.
Em algumas concretizações, poderá estar presente mais de um anticorpo. Os anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais. Estas composições poderão conter pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco anticorpos diferentes que são reactivos contra carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas ou adenossarcomas. 0 anticorpo anti-RAAGlO pode ser combinado com um ou mais 59 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ anticorpos reactivos contra carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas ou adenossarcomas em órgãos que incluem, mas não estão limitados a, ovários, mama, pulmão, próstata, cólon, rim, pele, tiróide, osso, tubo digestivo superior e pâncreas. Em uma concretização, utiliza-se uma mistura de diferentes anticorpos anti-RAAGlO. Uma mistura de anticorpos, como são frequentemente designadas na arte, poderá ser particularmente útil no tratamento de uma gama mais ampla da população de indivíduos.
Os exemplos seguintes são disponibilizados para ilustrar, mas não limitar, o invento.
EXEMPLOS
Exemplo 1. Preparação de células de bexiga de feto humano e de células pancreáticas humanas (hPED) como imunogénios.
Para preparar células de bexiga de feto humano destinadas a utilização como imunogénio, usaram-se os métodos que se seguem. Obtiveram-se bexigas de feto humano com uma idade gestacional entre 14 e 21 semanas de Advanced Bioscience Research em Alameda County, Califórnia. As bexigas foram obtidas e enviadas para o laboratório em meio de cultura de tecidos conservado em gelo húmido. Imediatamente à chegada, lavaram-se as bexigas três vezes com 20 ml de PBS frio. Sob o microscópio de dissecção, as bexigas foram limpas de tecidos adicionais circundantes e lavadas mais duas vezes com PBS frio. As bexigas foram picadas em cubos de 1 mm com uma lâmina de barbear, numa placa de cultura de 100 mm. Adicionaram-se dez ml de meio Opti-MEM (GIBCO BRL N.° catálogo 22600). Os pedaços de tecido foram transferidos para um tubo de centrífuga de 15 ml com uma pipeta de 5 ml, que foi previamente revestida com BSA a 5% em PBS. Os pedaços de tecido foram depois centrifugados a 1.000 xg durante 5 minutos. Ressuspendeu-se o depósito em 6 ml de meio Opti-MEM. O tecido foi cultivado numa placa de 6 poços com 3 ml de meio Opti-MEM por poço, que continha os seguintes factores de crescimento (concentração final em cada mililitro de meio): insulina 10 pg/ml, transferrina 10 pg/ml, vitamina Ξ 5 pg/ml, aprotinina 25 pg/ml, progesterona 3 ng/ml, KGF 10 ng/ml, heregulina 5 nM, gentamicina 100 pg/ml (adicionada nos 60 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ primeiros dois dias de cultura celular). Nestas condições, as células epiteliais emigraram para formar colónias de células epiteliais. Observou-se um crescimento limitado das células de fibroblasto na cultura inicial, mas aquelas células foram removidas por breve tripsinização. A tripsina (GIBCO BRL N.° catálogo 25300-054), numa concentração final de 0,05%, foi adicionada para eliminar as células de fibroblasto três dias antes da injecção.
Em outras concretizações, a fonte de tecido é uma linha de células progenitoras humanas derivada de tecido fetal humano, expandida e recombinada com mesênquima de rato ou de ratinho seleccionado para promover a diferenciação e a maturação das células progenitoras em um ou mais tipos de células humanas maduras, de modo a formar um recombinante de tecido humano/roedor. Por exemplo, estes recombinantes de tecido podem ser células progenitoras pancreáticas humanas (hPED) isoladas e crescidas conforme descrito na patente U.S. n.° 6,436,704, células progenitoras Mullerianas humanas isoladas e crescidas conforme descrito na patente U.S. n.° 6,416,999, células progenitoras de ovário humano isoladas e crescidas conforme descrito em WO 01/77303 ou células progenitoras de bexiga humana (hBLA) conforme descrito no pedido de patente pendente PCT/US03/04547, cujos ensinamentos estão todos aqui especificamente incorporados por meio de referência.
Para colher as células, estas foram lavadas uma vez com solução salina de Hanks isenta de cálcio e magnésio e incubadas em EDTA a 0,02% em solução salina de Hanks, a 37°C durante 15 minutos. As células foram separadas da superfície de cultura por meio de pancadas leves. A suspensão celular foi precipitada por centrifugação a 1.000 rpm durante 10 minutos. Removeu-se o sobrenadante, e as células foram ressuspensas em meio isento de soro (Opti-MEM) contendo adjuvante não desnaturante apropriado.
Para preparar as células progenitoras pancreáticas humanas para uso como imunogénio, utilizaram-se os métodos que se seguem. Estes métodos estão descritos na patente U.S. 6,436,704 referida acima. O pâncreas fetal (idade gestacional de 14-22 semanas) foi mecanicamente separado por 61 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ microdissecção sob um microscópio estéreo, antes da dissociação enzimática. 0 tratamento enzimático consistiu em colocar o tecido parcialmente dissociado em 1 ml de meio F12/DMEM contendo colagenase/dispase 5 mg/ml, inibidor de tripsina de soja 20 pg/ml e ADNase 50 pg/ml durante 15 minutos a 37°C.
Os agregados celulares foram dispostos em camada sobre um gradiente de 5% de BSA (em volume) e lavados por centrifugação durante 6 minutos a 900 rpm. As células depositadas, que ainda estavam na forma agregada, foram ressuspensas em meio de crescimento que consistiu em meio nutriente CMRL 1066 contendo os seguintes factores:
Insulina 10 pg/ml Transferrina 10 pg/ml Factor de crescimento epidérmico 5 ng/ml Etanolamina IO-6 M F osfoetanolamina 10“6 M Selénio 2,5 x 10~8 M Triiodotironina 10~12 M Progesterona 10~9 M Hidrocortisona 10~9 M Forscolina 1 μΜ Heregulina 10 nM Aprotinina 25 pg/ml Extracto da pituitária de bovino 75 pg/ml Gentamicina 100 pg/ml
Os agregados de células ressuspensos foram transferidos em alíquotas para (6-12) poços revestidos com fibronectina de uma placa de 24 poços e incubados a 37°C, num incubador humidificado com 5% CO2, durante 72 horas. Após 72 horas, as células epiteliais formaram estruturas esféricas suspensas e as células mesenquimatosas e estromais estavam presas à superfície do poço. As células foram subcultivadas a uma 62 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ diluição de 1:2 a cada 4 dias, em meio F12/DMEM (50:50) contendo bicarbonato 1,2 g/1 e tampão Hepes 10mM suplementado com as hormonas apresentadas acima, e plaqueadas em placas revestidas com fibronectina (12 poços, depois 6 poços, depois placas de 60 mm, depois placas de 100 mm à medida que a população cresceu).
Utilizaram-se vários outros tipos de células como imunogénios na prática deste invento, de acordo com os métodos descritos acima, para gerar e encontrar os novos anticorpos monoclonais anti-RAAGlO deste invento.
Exemplo 2. Geração de anticorpos monoclonais
Utilizaram-se células de bexiga de feto humano (HFB) com 11 a 16 dias de cultura para gerar os anticorpos monoclonais. As células progenitoras pancreáticas humanas (hPED) foram utilizadas para injecção como imunogénio e rastreio de anticorpos, principalmente entre as passagens 3 e 5. Aproximadamente 106 células HFB ou células progenitoras pancreáticas humanas por ratinho foram injectadas em ratinhos Balb/c via a almofada da pata, uma vez por semana. Utilizaram-se adjuvantes não desnaturantes (por exemplo, Ribi). Após 6 semanas de injecção semanal, recolheu-se uma gota de sangue da cauda de cada animal humanizado para testar o título de anticorpos contra HFB, utilizando a análise FACS. Quando o título atingiu pelo menos 1:2.000, os ratinhos foram sacrificados numa câmara de CO2, seguido de deslocamento cervical. Os gânglios linfáticos foram colhidos para a preparação dos hibridomas.
Os linfócitos dos ratinhos com o título mais elevado foram fundidos com a linha de mieloma de ratinho X63-Ag8.653, utilizando polietilenoglicol 4000 a 35%. No dia 10 após a fusão, os sobrenadantes dos hibridomas foram pesquisados quanto à presença de anticorpos monoclonais específicos para as células HFB ou para as células progenitoras pancreáticas humanas, por separação de células activadas por fluorescência (FACS). O meio condicionado proveniente de cada hibridoma foi incubado durante 30 minutos com uma alíquota de células HFB ou de células progenitoras pancreáticas humanas. Após a incubação, as amostras celulares foram lavadas, ressuspensas 63 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ em 0,1 ml de diluente e incubadas com fragmento F(ab')2 de cabra anti-IgG ratinho conjugado com FITC a uma concentração de 1 μg/ml, durante 30 min a 4°C. As células foram lavadas, ressuspensas em 0,5 ml de diluente para FACS e analisadas utilizando um separador de células FACScan (Becton Dickinson, San Jose, Califórnia). Os clones dos hibridomas foram seleccionados para expansão adicional, clonagem e caracterização com base na sua ligação à superfície das células HFB ou das células progenitoras pancreáticas humanas, conforme determinado por FACS. Obtiveram-se cem clones de hibridomas positivos neste rastreio primário.
Os hibridomas positivos foram adicionalmente rastreados quanto à sua reacção perante secções de tecido normal. Os clones dos hibridomas negativos em secções de tecido de rim, pulmão e pele foram recolhidos. Estes hibridomas que produzem os anticorpos monoclonais denominados anticorpos da família anti-RAAGlO foram seleccionados.
Exemplo 3. Purificação dos anticorpos monoclonais da família anti-RAAGl0
Anticorpos da família anti-RAAGlO, o volume de sobrenadante foi medido e adicionou-se um volume igual de tampão de ligação ao sobrenadante. Permitiu-se que a mistura atingisse o equilíbrio à temperatura ambiente. O sobrenadante foi clarificado por passagem através de um filtro de 0,22 μιη. O sobrenadante foi carregado numa coluna de proteína G, utilizando o sistema GradiFrac. Lavou-se a coluna com 5-10 volumes de coluna de tampão de ligação. Os anticorpos monoclonais foram eluídos com o tampão de eluição, tendo-se recolhido fracções de 2 ml. Obteve-se uma leitura da DO280 das fracções, e as fracções contendo os anticorpos monoclonais foram combinadas. As fracções de anticorpo monoclonal eluído foram neutralizadas por adição de um volume 1/20 de Tris 3M. A amostra foi dialisada em PBS IX a 4°C (com 3 trocas de tampão e pelo menos 3 horas entre trocas). Os anticorpos monoclonais purificados foram filtrados em condições de esterilidade (0,2 μιη) e armazenados a 2-8°C.
Após a purificação dos anticorpos monoclonais da família anti-RAAGlO a partir do sobrenadante do hibridoma, eles foram 64 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ novamente testados quanto à ligação às células HFB ou hPED. As amostras das células foram preparadas da forma descrita acima no Exemplo 4 e incubadas com o anticorpo purificado em várias concentrações. Após a incubação, as células foram lavadas, ressuspensas em 0,1 ml de diluente e incubadas com 1 μς do fragmento F(ab')2 de cabra anti-IgG ratinho conjugado com FITC, durante 30 min a 4°C. As células foram lavadas, ressuspensas em 0,5 ml de diluente para FACS e analisadas utilizando um separador de células FACScan (Becton Dickinson, San Jose, Califórnia). Um desvio para a direita no histograma do separador FACScan indicou que o anticorpo purificado ainda se ligou às células HFB ou hPED.
Purificaram-se quatro anticorpos monoclonais, que foram aqui designados por BLA8, LUCAl, PA20 e SKIN2. Os hibridomas que produzem estes respectivos anticorpos possuem as designações ATCC PTA-4218, PTA-4217, PTA-4244 e PTA-4245, respectivamente. Subsequentemente, purificaram-se cinco anticorpos monoclonais adicionais, aqui designados por LUCAl, GB8, KIDl, KID13 e OVCA22.
Exemplo 4. Identificação e caracterização do antigénio a que os anticorpos da família anti-RAAGlO se ligam.
Anticorpo BLA8: Para identificar o antigénio face ao qual BLA8 foi reactivo, efectuou-se uma experiência de imunoprecipitação. Para a imunoprecipitação, lisaram-se 10 ml de células LnCap empacotadas com 40 ml de tampão de lise. O tampão de lise consistiu em solução salina equilibrada de Hanks (HBSS+) fortificada com Triton X-100 a 2%, cocktail de inibidores de proteases (1 pastilha por 5 ml de tampão de lise de Complete Mini EDTA-free Protease Cocktail de Roche Molecular Biochemicals), azida de sódio a 0,1% e PMSF 2mM. O lisado celular foi clarificado a 24.000 xg durante 30 minutos a 4°C, antes de ser passado por uma coluna de esferas de sepharose 6MB activada com CNBr e conjugada (2 mg/ml) com IgG de ratinho, sendo o lisado agora considerado pré-purifiçado. O lisado LnCap pré-purifiçado foi depois passado por uma coluna de sepharose 6MB activada com CNBr e conjugada com BLA8. A coluna de BLA8 foi conjugada utilizando 3 mg de BLA8 por ml de esferas de sepharose 6MB activada com CNBr intumescidas. As esferas (tanto de IgG de ratinho como de 65 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ BLA8) foram depois lavadas três vezes com tampão de lise, antes da eluição com glicina 0,1M, pH 2,5. Os eluatos foram recolhidos em fracções com o volume de 1 coluna e neutralizados com uma concentração final de Tris 0,1M; pH 8,0; resultando num pH final de -1,2. As fracções neutralizadas foram depois concentradas para 10% do volume da fracção com microconcentradores (Centricon 10 de Millipore). 10% do eluato concentrado foi, em seguida, resolvido por SDS-PAGE e transferência de Western. Ao mesmo tempo, 30% do eluato foi adicionalmente concentrado para um volume compatível com SDS-PAGE e resolvido através de coloração com azul de Commassie.
Efectuando a transferência de Western do eluato alquilado de BLA8 e igG de ratinho contra BLA8, observou-se um tripleto de proteínas fortemente glicosiladas exclusivo do eluato de BLA (>223 kDa, -200 kDA e 100 kDa), em que a banda de 100 kDa é a mais proeminente. Devido à linearidade das três bandas (isto é, 200 kDa é um duplicado de 100 kDa, e a banda >223 kDa poderá ser um triplicado da banda de 100 kDa), colocou-se a hipótese de as três bandas consistirem em uma forma monomérica, dimérica e trimérica do antigénio de BLA8. O efeito de empilhamento do antigénio purificado indica que o antigénio poderá dimerizar-se no estado nativo, mas a concentração está a forçar uma interacção artificial das proteínas umas com as outras a uma frequência mais elevada. Por coloração com azul de Commassie, observou-se a existência de um dupleto exclusivo de BLA8 a 100 kDa e -200 kDa. Observou-se uma terceira banda fraca >223 kDa. Para confirmar a nossa hipótese, ambas as bandas de 100 kDa e -200 kDa foram cortadas e identificadas como LO (100 kDa) e Hl (-200 kDa) . Estas duas bandas foram depois enviadas para análise por espectrometria de massa.
Utilizaram-se métodos similares para identificar e caracterizar os antigénios a que os anticorpos monoclonais LUCA1, PA20 e SKIN2 se ligam e obtiveram-se resultados similares.
Para determinar o peso molecular do antigénio-alvo dos AcM BLA8, LUCAl, PA20 e SKIN2 mediante análises de transferência de Western, obtiveram-se várias linhas 66 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ celulares de cancro humano disponíveis comercialmente através de American Type Culture Collection, tais como Colo 205, HPAF-II, LnCAP, Panc-1, SK-OV-3, SK-MES, SK-OV-3. Estas linhas celulares foram crescidas numa mistura 1:1 de meio F12 (GibcoBRL, N.° catálogo 21700-091) e meio DMEM (GibcoBRL, N.° catálogo 12100-061) contendo L-glutamina e soro fetal de bovino a 10%. As células foram crescidas até à confluência num incubador a 37°C com 5% C02. Colheram-se aproximadamente trinta a cinquenta frascos Ti75 confluentes de cada linha celular, utilizando edta 10 mM em solução salina tamponada com fosfato. As células colhidas foram centrifugadas durante 5 minutos a 1200 rpm em uma centrífuga de bancada GS-6KR da Beckman. Os sobrenadantes foram eliminados, e os depósitos celulares foram ressuspensos em 0,5 ml de água desionizada e 10 μΐ de cocktail de inibidores de proteases por frasco T125 (Sigma, N.° catálogo P8340). As suspensões celulares foram congeladas a -80°C e depois descongeladas. Repetiu-se este ciclo de congelação/descongelação um total de cinco vezes, de modo a desfazer as membranas celulares.
As membranas celulares desfeitas foram depois recolhidas por centrifugação numa microcentrífuga Biofuge (Haereus) à velocidade máxima, durante 15 minutos a 4°C. Os sobrenadantes contêm as proteínas citoplasmáticas e nucleares. Os sobrenadantes foram removidos e conservados para análise subsequente. Os depósitos, contendo os fragmentos das membranas celulares, foram ressuspensos e solubilizados em aproximadamente 4 ml de solução salina equilibrada de Hank (HBSS, GibcoBRL, N.° catálogo 14175-079) contendo Empigen BB a 2% (Calbiochem, N.° catálogo 324690) e 100 μΐ do cocktail de inibidores de proteases, pH 7,0. As proteínas solúveis da membrana celular foram incubadas num agitador orbital a 4°C durante a noite.
Os extractos proteicos da membrana celular foram centrifugados numa microcentrífuga Biofuge à velocidade máxima, durante 15 minutos a 4°C, de modo a remover quaisquer detritos celulares insolúveis. Os sobrenadantes contêm as proteínas da membrana celular extraídas. Os sobrenadantes foram recolhidos e armazenados a -80°C, até serem utilizados nas análises de transferência de Western. 67 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Os extractos proteicos da membrana celular foram separados por electroforese, utilizando géis NuPAGE a 4-12% pré-moldados (Invitrogen, N.° catálogo NP0322). Os extractos foram diluidos lOx em tampão de amostra LDS (Invitrogen, N.° catálogo NP007), aquecidos a 70°C durante 10 minutos e depois centrifugados numa microcentrifuga e colocados no Vortex para misturar. Carregou-se um total de 3,0 μΐ de extracto proteico por pista no gel. Incluiram-se também padrões de peso molecular previamente corados (BioRad, N.° catálogo 161-0372) . Em seguida, efectuou-se a electroforese de acordo com as instruções do fabricante. Após a electroforese, os géis foram transferidos para membranas de nitrocelulose (Invitrogen, N.° catálogo LC2000), também de acordo com as instruções do fabricante. As proteínas transferidas foram ligadas às membranas mediante aquecimento da nitrocelulose em PBS num forno de microondas, durante três minutos a potência elevada. As membranas foram depois incubadas em tampão de bloqueio durante 30 minutos para reduzir a ligação não especifica. Em seguida, utilizaram-se os anticorpos monoclonais purificados via proteina G para pesquisar as membranas de nitrocelulose. Os AcM BLA8 (lote 080-06), LUCA1 (lote 102-06), PA20 (lote 102-10) e SKIN2 (lote 083-95) foram diluidos para uma concentração de aproximadamente 4 pg/ml em tampão de bloqueio. As membranas de nitrocelulose foram incubadas com 8 ml dos AcM diluídos, durante uma hora à temperatura ambiente, num oscilador. Recorreu-se a um kit de transferência de Western Western Breeze (Invitrogen, N.° catálogo WB7103) para desenvolver as transferências de Western de acordo com as instruções do fabricante. Utilizando a metodologia acima, observou-se uma banda de proteína glicosilada a um peso molecular aproximado de 85-90 kD para cada um dos anticorpos monoclonais. A intensidade e o padrão de ligação aos vários extractos proteicos da membrana celular foram consistentes entre todos os anticorpos desta família.
Efectuaram-se também análises de transferência de Western em extractos proteicos da membrana celular e em homogenatos de secções de tecido reduzidos. Recolheram-se secções de tecido normal congelado de mama, rim, pulmão e pele humanos em tubos Eppendorf. As secções foram lavadas com PBS, e as amostras foram centrifugadas a 16.000 rpm numa microcentrífuga de tubos Eppendorf, a 4°C durante 15 minutos. 68 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Os depósitos de tecido foram solubilizados em 100 μΐ de Empigen BB a 2% em HBSS contendo 20 μΐ de cocktail de inibidores de proteases, utilizando um aparelho ultra-sónico Branson 250, durante 30 segundos em gelo.
Os extractos de tecido foram centrifugados a 16 000 rpm numa microcentrifuga de tubos Eppendorf, a 4°C durante 15 minutos, de modo a remover quaisquer detritos celulares insolúveis. Os sobrenadantes contêm as proteínas extraídas dos tecidos. Os sobrenadantes foram recolhidos e armazenados a -80°C, até serem utilizados nas análises de transferência de Western.
Os extractos de tecido, extractos proteicos da membrana celular seleccionados e o antigénio purificado por afinidade para o anticorpo monoclonal BLA8 foram separados por electroforese, utilizando géis NuPAGE a 4-12% pré-moldados. Os extractos foram diluídos em tampão de amostra LDS (Invitrogen, N.° catálogo NP007) contendo o agente redutor DTT (Invitrogen N.° catálogo NP0004), aquecidos a 70°C durante 10 minutos e depois centrifugados numa microcentrifuga e colocados no Vortex para misturar. Carregou-se um total de 6,0 μΐ de extracto proteico, extracto de tecido ou de antigénio purificado por pista no gel. Incluíram-se também padrões de peso molecular previamente corados (BioRad, N.° catálogo 161-0372). Em seguida, efectuou-se a electroforese de acordo com as instruções do fabricante, incluindo a adição de antioxidante (Invitrogen N.° catálogo NP0005) ao tampão de desenvolvimento. Após a electroforese, os géis foram transferidos para membranas de nitrocelulose (Invitrogen, N.° catálogo LC2000), também de acordo com as instruções do fabricante. As proteínas transferidas foram ligadas às membranas mediante aquecimento da nitrocelulose em PBS num forno de microondas, durante três minutos a potência elevada. As membranas foram depois incubadas em tampão de bloqueio durante 30 minutos para reduzir a ligação não especifica. Em seguida, utilizaram-se os anticorpos monoclonais purificados via proteína G para pesquisar as membranas de nitrocelulose. Os AcM BLA8 (lote 080-06), LUCAl (lote 102-06), PA20 (lote 102-10) e SKIN2 (lote 083-95) foram diluidos para uma concentração de aproximadamente 4 pg/ml em tampão de bloqueio. As membranas 69 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ de nitrocelulose foram incubadas com 8 ml dos AcM diluídos, durante uma hora à temperatura ambiente, num oscilador. Recorreu-se a um kit de transferência de Western Western Breeze (Invitrogen, N.° catálogo WB7103) para desenvolver as transferências de Western de acordo com as instruções do fabricante. Utilizando a metodologia acima, observou-se uma banda de proteína glicosilada a um peso molecular aproximado de 85-90 kD para cada um dos anticorpos monoclonais. Embora a intensidade da ligação à banda de proteína reduzida seja menor do que quando a proteína não estava reduzida, a banda ainda foi reconhecida pelos quatro AcM. Este efeito é mais evidente nos extractos proteicos da membrana celular do que no antigénio de BLA8 purificado, o que revela uma ligação forte para cada um dos AcM. Não se observou nenhum antigénio nas amostras de tecido normal. A IgG murina foi utilizada como controlo em ambas as transferências de Western reduzida e não reduzida. Utilizou-se a mesma concentração de IgG murina quando as IgG murinas foram utilizadas como sondas de anticorpo monoclonal. Estes controlos mostram que há, de facto, artefactos de imunoglobulina presentes como bandas de ~25 e 50 kD nas transferências de Western. Estes devem-se à presença de cadeias leves e pesadas derivadas de IgG endógena existente nas secções de tecido ou em consequência da purificação por afinidade do antigénio de BLA8.
Exemplo 5. isolamento do antigénio do anticorpo anti-RAAGlO para análise por espectrometria de massa. O anticorpo purificado anti-RAAGlO foi acoplado covalentemente a resina de sepharose 4B activada com brometo de cianogénio (CNBr) (Amersham Pharmacia Biotech, N.° catálogo 17-0430-01) de acordo com as instruções do fabricante, a uma concentração de 2 mg de AcM BLA8 por ml de volume de esferas de sepharose intumescidas. As células LNCap acabadas de crescer foram colhidas a partir de 30 frascos de cultura T-125 confluentes. As células foram depositadas por centrifugação e ressuspensas em tampão de lise (solução salina equilibrada de Hank (HBSS+) contendo Triton X-100 a 2%, inibidores de proteases e azida de sódio a 0,1%) a uma razão de 500 μΐ de tampão de lise por 1 frasco T175. As 70 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ células foram removidas por raspagem com um raspador de células. A suspensão de células/tampão de lise foi colocada no Vortex para ser misturada e depois foi clarificada por centrifugação a 24.000 xg, durante 45 minutos a 4°C. O lisado clarificado foi removido e pré-purifiçado contra sepharose activada com CNBr e conjugada com IgG de ratinho durante 2 horas a 4°C. O lisado pré-purifiçado foi depois passado através da matriz de sepharose activada com CNBr e conjugada com BLA8. As esferas BLA8 foram, em seguida, extensamente lavadas com o tampão de lise (pelo menos 10 volumes de coluna) antes da eluição com glicina 0,1M; pH 2,5. A matriz foi eluida com um total de 5 volumes de coluna de tampão de eluição. O eluato foi recolhido em fracções de um volume de coluna. Cada fracção foi independentemente concentrada num concentrador Centricon-10 (Millipore, #4206) até o volume atingir ~60 μΐ. 10% do eluato foi resolvido por SDS-PAGE e analisado por transferência de Western. Os restantes 90% foram carregados numa única pista e resolvidos por SDS-PAGE e coloração com azul de Commassie. Observaram-se três bandas típicas de glicoproteínas a e à volta de 100, 200 e 250+ kDa por coloração com azul de Commassie, em que a banda mais forte foi a banda de 100 kDa, seguida da banda de 200 kDa; a banda de 250+ kDa foi a mais fraca em termos de coloração. Estas bandas corresponderam às bandas observadas por transferência de Western e teorizou-se que representassem as formas monomérica (100 kDa), homodimérica (200 kDa) e homotrimérica (250+ kDa) de uma única proteína. As bandas a 100 kDa e 200 kDa foram cortadas e enviadas para análise por espectrofotometria de massa.
Exemplo 6. Espectrometrla de massa MALDI. O antigénio a que o anticorpo anti-RAAGlO se liga é isolado da forma descrita nos Exemplos 4 e 5 e submetido a espectroscopia de massa maldi. Os eluatos da coluna de imunoafinidade são separados por SDS-PAGE, e as bandas são cortadas e extraídas. A fatia de gel é digerida com tripsina "em gel" (Gharahdaghi, F., Weinberg, C.R., Meagher, D. A., Imai, B.S. & Mische, S.M. (1999) Electrophoresis 20, 601 — 605). Os péptidos extraídos são analisados por espectrometria de massa de ionização/dessorção a laser assistida por matriz-análise por tempo de voo (MALDI-TOF de "Matrix-Assisted Laser 71 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Desorption/Ionization Time-Of-Flight mass spectrometry") num espectrómetro AXIMA CFR de Kratos. As massas dos péptidos são determinadas com um limite de detecção de 100 ppm e utiliza-se um filtro iónico temporizado com um reflector de campo curvo para isolamento dos péptidos e fragmentação via decaimento pós-fonte (PSD - "Post-Source-Decay") . As pesquisas são conduzidas com os programas prospectores de proteínas (Clauser K.R., Baker P.R. & Burlingame A.L., Analytical Chemistry, Vol. 71, 14, 2871-(1999)) MSFit e MSTag.
Identificaram-se cinco picos principais de péptidos, às massas de 1173,6016 (Péptido 1); 1601,7634 (Péptido 2); 1686,9179 (Péptido 3); 1991,0310 (Péptido 4) e 2620,3834 (Péptido 5) . As pesquisas nas bases de dados de proteínas humanas indicaram que os péptidos 2 e 3 poderiam ter sido gerados a partir de uma proteína denominada "b7 homolog 3" (homólogo 3 de B7) (NCBI, N.° de acesso 13376852). A análise de decaimento pós-fonte de péptidos seleccionados confirmou a identidade destes péptidos como tendo a sequência correcta. Uma pesquisa adicional em sequências de proteínas hipotéticas de bases de dados de EST ("Expressed Sequence Tag"; marca de sequência expressa) identificou uma proteína adicional que continha a totalidade dos 5 péptidos (com a identidade confirmada por decaimento pós-fonte). Esta proteína vem de uma EST humana e é designada da seguinte forma: 602309922F1 NIH_MGC_88 Homo sapiens cDNA clone IMAGE: 4401173 5'. A totalidade das cinco massas e a análise PSD coincidiram com as sequências nesta proteína hipotética. As comparações de sequência do ADN e da proteína derivada tanto da EST como da sequência do homólogo 3 de B7 indicaram que partes importantes das sequências se sobrepõem. As sequências não idênticas começaram na área da extremidade amino do homólogo 3 de B7, pouco após a sequência sinal. Isto indica que a EST é na verdade proveniente de um clone de ADNc de uma variante de excisão-reparação alternativa ("alternative splice") do homólogo 3 de B7, em que a região codificante se prolonga uma quantidade desconhecida na direcção 5'. Uma vez que o antigénio purificado desglicosilado possui um peso molecular de aproximadamente 60.000 Daltons (e aquele do homólogo 3 de B7 possui um peso molecular de aproximadamente 72 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ 30.000 Daltons), os dados da proteína são consistentes com o facto de a proteína efectiva conter uma sequência codificante adicional além daquela conhecida para o homólogo 3 de B7.
Uma vez que um dos péptidos (Péptido 4) é muito homólogo de uma sequência existente no homólogo 3 de B7 imediatamente antes de uma área hidrofóbica (o domínio transmembranar putativo), e sem intenção de ficar preso a qualquer teoria ou mecanismo, é possível que o antigénio RAAG10 tenha surgido a partir de uma duplicação dos domínios extracelulares do homólogo 3 de B7 (que consistem em dois domínios de tipo Ig), gerando uma proteína putativa constituída por 4 domínios de tipo Ig, o domínio transmembranar e uma "cauda" citoplasmática. A determinação da estrutura exacta do antigénio RAAG10 será efectuada utilizando a informação de sequência existente para a EST e para o homólogo 3 de B7, recorrendo a técnicas padrão para prolongar a sequência de ADNc na direcção 5' até o codão de iniciação AUG ser identificado. Qualquer uma das linhas celulares descritas em outros locais deste documento pode ser utilizada como fonte das bibliotecas de ADNc para este trabalho.
Exemplo 7. Caracterização do antigénio de BLA8.
Para identificar o antigénio face ao qual BLA8 foi reactivo, efectuou-se uma experiência de imunoprecipitação. Para a imunoprecipitação, lisaram-se 10 ml de células LnCap empacotadas com 40 ml de tampão de lise. O tampão de lise consistiu em solução salina equilibrada de Hanks (HBSS+) fortificada com Triton X-100 a 2%, cocktail de inibidores de proteases (1 pastilha por 5 ml de tampão de lise de Complete Mini EDTA-free Protease Cocktail de Roche Molecular Biochemicals), azida de sódio a 0,1% e PMSF 2mM. O lisado celular foi clarificado a 24.000 xg durante 30 minutos a 4°C, antes de ser passado por uma coluna de esferas de sepharose 6MB activada com CNBr e conjugada (2 mg/ml) com igG de ratinho, sendo o lisado agora considerado pré-purifiçado. O lisado LnCap pré-purifiçado foi depois passado por uma coluna de sepharose 6MB activada com CNBr e conjugada com BLA8. A coluna de BLA8 foi conjugada utilizando 3 mg de BLA8 por ml 73 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ de esferas de sepharose 6MB activada com CNBr intumescidas. As esferas (tanto de IgG de ratinho como de BLA8) foram depois lavadas três vezes com tampão de lise, antes da eluição com glicina 0,1M, pH 2,5. Os eluatos foram recolhidos em fracções com o volume de 1 coluna e neutralizados com uma concentração final de Tris 0,1M; pH 8,0; resultando num pH final de -7,2. As fracções neutralizadas foram depois concentradas para 10% do volume da fracção com microconcentradores (Centricon 10 de Millipore). 10% do eluato concentrado foi, em seguida, resolvido por SDS-page e transferência de Western. Ao mesmo tempo, 30% do eluato foi adicionalmente concentrado para um volume compatível com SDS-PAGE e resolvido através de coloração com azul de Commassie.
Efectuando a transferência de Western do eluato alquilado de BLA8 e IgG de ratinho contra BLA8, observou-se um tripleto de proteínas fortemente glicosiladas exclusivo do eluato de BLA (>223 kDa, -200 kDA e 100 kDa), em que a banda de 100 kDa é a mais proeminente. Devido à linearidade das três bandas (isto é, 200 kDa é um duplicado de 100 kDa, e a banda >223 kDa poderá ser um triplicado da banda de 100 kDa), colocou-se a hipótese de as três bandas consistirem em uma forma monomérica, dimérica e trimérica do antigénio de BLA8. O efeito de empilhamento do antigénio purificado indica que o antigénio poderá dimerizar-se no estado nativo, mas a concentração está a forçar uma interacção artificial das proteínas umas com as outras a uma frequência mais elevada. Por coloração com azul de Commassie, observou-se a existência de um dupleto exclusivo de BLA8 a 100 kDa e -200 kDa. Observou-se uma terceira banda fraca >223 kDa. Para confirmar a nossa hipótese, ambas as bandas de 100 kDa e -200 kDa foram cortadas e identificadas como LO (100 kDa) e Hl (-200 kDa) . Estas duas bandas foram depois enviadas para análise por espectrometria de massa.
Através de análise por espectrometria de massa, as duas bandas (Hl e LO) originaram picos peptídicos idênticos, indicando que as duas bandas consistiram em antigénio idêntico e confirmando a nossa hipótese de que as bandas observadas por transferência de Western e SDS-PAGE eram, de facto, polímeros do antigénio, que possui um peso molecular glicosilado de -100 kDa. Também por espectrometria de massa, 74 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ efectuou-se uma identificação do antigénio de BLA8. A sequência peptídica do antigénio de BLA8 correspondeu a duas sequências existentes em bancos de sequências, em que a primeira é uma proteína B7-H3 recentemente identificada e a segunda é uma sequência EST que partilha uma homologia >90% com a sequência do domínio extracelular de B7-H3, mas que codifica uma sequência muito maior. Constatámos que BLA8 se liga a um novo antigénio que é similar a B7-H3. Designamos este antigénio por B7-H3L.
Exemplo 8. Os anticorpos LUCA1, SKIN2, PA20 e BLA8 são todos dirigidos para o mesmo antigénio.
Para confirmar os resultados das transferências de Western que demonstram que os anticorpos LUCA1, SKIN2, PA20 e BLA8 aparentemente transferem todos para o mesmo antigénio, realizou-se um ensaio ELISA em fase sólida utilizando antigénio de BLA8 purificado a partir de células LnCap. O antigénio purificado foi ligado a placas Maxisorb de NUNC (vwr) , a uma diluição de 1:25 (50 μΐ por poço) em solução salina equilibrada de Hank (HBSS+), durante 2 horas à temperatura ambiente. A placa ligada foi depois bloqueada durante 30 minutos com 200 μΐ por poço de HBSS+ contendo BSA a 1%. Após o bloqueio, os anticorpos LUCAl, SKIN2, PA20 e BLA8 (todos a 0,5 pg/poço, diluídos no tampão de bloqueio) foram adicionados à placa Maxisorb e deixados a interagir durante 1 hora à temperatura ambiente. Utilizou-se IgG de ratinho e um anticorpo irrelevante que é reactivo contra as células LnCap, à mesma concentração por poço, como controlo negativo. As placas foram muito bem lavadas com HBSS+. O anticorpo secundário, anticorpo de burro anti-IgG de ratinho (específico para a cadeia leve e pesada) conjugado com peroxidase de rábano (HRP), utilizado a 0,04 pg/poço, foi depois adicionado aos poços, permitindo-se que incubasse durante 30 minutos à temperatura ambiente. As placas foram muito bem lavadas com HBSS+ e, em seguida, foram expostas ao substrato TMB para uma reacção de mudança de cor baseada em HRP. A reacção foi parada pela adição (1:1 em relação ao substrato) de ácido fosfórico 1M. As DO450 das reacções foram depois lidas. Por meio deste ensaio ELISA, todos os anticorpos LUCAl, SKIN2, PA20 e BLA8 reagiram fortemente contra o antigénio de BLA8 (um aumento de pelo menos 2x da 75 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ DO450 face aos controlos negativos), ao passo que os controlos negativos apresentaram pouca ou nenhuma reactividade.
Ao mesmo tempo, efectuou-se um ensaio ELISA com células vivas utilizando os quatro anticorpos. Verificou-se que os quatro anticorpos apresentaram todos as mesmas reactividades celulares. Adicionalmente, LUCAl, PA20, SKIN2 e BLA8 foram utilizados em transferência de Western contra o antigénio de BLA8 purificado. Todos os quatro anticorpos reagiram fortemente com o antigénio de BLA8 purificado. A partir das duas experiências efectuadas, concluiu-se que os anticorpos LUCAl, PA20, SKIN2 e BLA8 reagem todos com o mesmo antigénio.
Exemplo 9. Família BLA8 e competição por epitopos.
Dado que haviam sido gerados múltiplos anticorpos para um único antigénio, realizaram-se experiências para determinar se havia diferenças epitópicas entre quatro dos anticorpos da família BLA8 de AcM (LUCAl, PA20, SKIN2 e BLA8). Devido a limitações quantitativas, apenas os anticorpos LUCAl, PA20 e BLA8 foram biotinilados. Para a biotinilação, incubaram-se 250 μρ de cada anticorpo, a uma concentração de 2 mg/ml, com sulfo-NHS-LC-biotina, a uma razão de 200 μρ de biotina/mg de anticorpo, em PBS durante 2 horas à temperatura ambiente. A biotinilação foi parada pela adição de Tris 1M, pH 8,0, para uma concentração final de 100 mM. Permitiu-se que a reacção de paragem incubasse durante mais 20 minutos à temperatura ambiente. O anticorpo biotinilado foi depois transferido para PBS. O antigénio de BLA8 purificado foi imobilizado em placas Maxisorb de NUNC via uma incubação de duas horas, a uma concentração de 2 μΐ por poço utilizando uma diluição de 1:25 em solução salina equilibrada de Hank (HBSS+) . A placa revestida foi depois bloqueada durante 30 minutos à temperatura ambiente com HBSS+ contendo BSA a 1%. O tampão de bloqueio foi, em seguida, removido da placa, e o anticorpo competidor, LUCAl, PA20, SKIN2 ou BLA8 não biotinilado, a uma titulação inicial de 2 μρ/poço até 3,8 ng/poço (50 μΐ/poço) diluido em tampão de bloqueio, foi adicionado aos poços 76 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ durante 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação de 30 minutos, o anticorpo biotinilado (LUCAl, PA20 ou BLA8) foi introduzido nos poços contendo anticorpo competidor a 50 μΐ/poço. Os anticorpos biotinilados foram adicionados numa concentração de 500 ng/ml. Permitiu-se que o cocktail de anticorpo competidor e anticorpo biotinilado incubasse durante mais 1 hora à temperatura ambiente. A placa foi depois muito bem lavada com HBSS+. Em seguida, permitiu-se que estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano (HRP), diluída em HBSS+, incubasse durante 30 minutos à temperatura ambiente a 50 μΐ/poço. A placa foi subsequentemente lavada com HBSS+ e incubada com o substrato TMB para um desenvolvimento de cor baseado em HRP. A reacção foi parada pela adição de ácido fosfórico 1M, e a DO450 da placa foi lida. A partir do ensaio de competição, compreendeu-se que PA20 e SKIN2 competiram de forma cruzada, indicando que partilham o mesmo epitopo. LUCAl e BLA8, por outro lado, sofreram competição apenas por eles próprios, indicando que se ligam a epitopos distintos. Deste modo, na família BLA8 de anticorpos, PA20, KID1 e SKIN2 ligam-se a um epitopo que designamos por epitopo A; LUCAl, KID13 e GB8 ligam-se ao epitopo que designamos por epitopo B; e BLA8 liga-se ao epitopo que designamos por epitopo C.
Exemplo 10. Clonagem de RAAG10.
Clonagem do ADN complementar de sequência completa de B7H3. Uma biblioteca de ADNc de células de cancro de ovário humano SKOV3, construída no vector Gateway™ pCMV· SPORT6 (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia), foi transfectada em células de ovário de hamster chinês (CHO) utilizando um protocolo padrão. Os transfectantes que expressam o antigénio de BLA8 na superfície celular foram enriquecidos por "panning" (método de aderência a plástico) duas vezes em anticorpo BLA8. Após o enriquecimento, as células foram lisadas para libertar o ADN. O lisado em bruto foi utilizado como molde para a clonagem de B7H3 por meio da reacção da polimerase em cadeia (PCR de "Polymerase Chain Reaction"). Resumidamente, um par de iniciadores específicos para B7H3 (senso: 5'-AGCCGCCTCACAGGAAGATGCT-3' e anti-senso: 5'- 77 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ CCCTGGTCCTCATGGTCAGGCTAT-3') foi concebido para flanquear a grelha de leitura aberta (ORF) de B7H3 com base nas sequências EST disponíveis no GeneBank. A reacção de PCR foi efectuada por combinação de 1,5 μΐ do lisado celular com 50 pmol de cada um dos iniciadores específicos de B7H3, H20 isenta de nucleases, tampão de PCR IX, cada um dos dNTP numa concentração de 200 μΜ e 2,5 U de ADN-polimerase Taq Platinum High-Fidelity (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia). A mistura reaccional foi incubada a 94°C durante 2 minutos, seguindo-se 28 ciclos de desnaturação do molde a 94°C durante 10 segundos e hibridação/extensão dos iniciadores a 68°C durante 3 minutos, e uma extensão final a 68°C durante 10 minutos. Uma alíquota do produto de PCR foi resolvida num gel de agarose a 1,2% e visualizada por coloração com brometo de etídio. Identificou-se uma banda predominante a cerca de 1,6 kb, que foi purificada a partir do gel e clonada no vector de expressão mamífero pTargeT™ (Promega, Madison, Wisconsin). Os transformantes foram caracterizados por análise de fragmentos de restrição utilizando HindIII, e a orientação da inserção de ADNc foi determinada por PCR. Os clones com padrões de restrição similares e uma orientação correcta foram seleccionados para sequenciação nucleotídica. Encontrou-se uma ORF de 1605 pb a partir de sete destes clones, e todos eles se sobrepuseram às sequências EST de B7H3 disponíveis no GeneBank. A autenticidade destes clones de ADNc foi adicionalmente confirmada mediante a sua expressão em células CHO, seguida de coloração com o anticorpo BLA8.
Construção e caracterização de mutantes de B7H3. Para determinar que domínio(s) de B7H3 foram responsáveis pela ligação de cada membro da família de anticorpos BLA8, uma série de mutantes de B7H3 foi construída, expressa em células CHO e caracterizada por vários métodos. Resumidamente, seleccionou-se um clone de ADNc pTargeT/B7H3 possuindo a coloração mais intensa pelo anticorpo BLA8 e submeteu-se a digestão com diferentes combinações de enzimas de restrição que ou flanqueavam (BamHi e NotI) ou estavam localizadas no (Eco47III) ADNc de B7H3. Após as ligações, criou-se uma série de mutantes conforme resumido na Tabela 1. A autenticidade de cada mutante foi verificada por PCR e digestão com a enzima de restrição HindIII. Pelo menos três clones de cada mutante 78 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ foram transfectados em células CHO, utilizando um protocolo padrão. Aquelas células CHO transfectadas com os mutantes de B7H3 foram depois seleccionadas em G418 1 mg/ml durante 2 semanas. Utilizaram-se vários métodos para analisar o conteúdo de B7H3 em diferentes compartimentos da célula: 1) a imuno-histoquimica (IHQ) foi utilizada para a localização de B7H3 imunorreactivo na superfície ou dentro dos transfectantes; 2) a reacção da polimerase em cadeia- transcrição reversa (RT-PCR) foi utilizada para a detecção da expressão do ARNm nos transf ectantes; 3) o ensaio elisa sanduíche foi utilizado para a detecção de B7H3 segregado no sobrenadante de cultura. Os resultados obtidos para cada método foram de pelo menos três experiências independentes.
Coloração_imuno-histoquimica de_células_CHO transfectadas com mutantes de B7H3. A presença de B7H3 imunorreactivo nos transfectantes foi revelada por IHQ. Para determinar se B7H3 foi ou não expresso na superfície das células CHO, efectuou-se uma análise IHQ em células vivas. Resumidamente, as células foram incubadas com a família de anticorpos BLA8 (BLA8, LUCA1 ou PA20) a uma concentração de 10 pg/ml, a 37°C durante lh. As células foram lavadas três vezes numa mistura nutriente de F12 de Ham isento de soro e meio de Eagle modificado por Dulbecco (F12/DMEM, 1:1, v/v), fixadas em 100% de etanol gelado durante 15 minutos e depois totalmente secas ao ar. A actividade de peroxidase endógena foi parada mediante incubação das células com H2O2 a 2% em PBS gelado durante 15 minutos. Após enxaguamento com PBS, as células foram bloqueadas durante lh com soro de cabra normal a 5% em PBS e depois incubadas com fragmento F(ab'h de cabra AffiniPure anti-lgG+lgM (H+L) de ratinho conjugado com peroxidase (Jackson Immunoresearch Labs, West Grove, Pensilvânia), a uma concentração de 2 pg/ml, em tampão de bloqueio durante lh. Após as lavagens, ο B7H3 imunorreactivo na superfície das células foi visualizado mediante incubação das células com tampão acetato de sódio (pH 5,0) contendo 3,3'-diaminobenzidina (DAB) e H2O2. Para a detecção de B7H3 imunorreactivo no interior das células CHO, efectuou-se uma IHQ em células fixadas utilizando um procedimento similar ao descrito acima. As células foram primeiro fixadas em 100% de etanol gelado e totalmente secas ao ar. Após paragem da actividade de peroxidase endógena, as células foram lavadas, 79 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ bloqueadas e depois incubadas com a família de anticorpos BLA8 a uma concentração de 10 pg/ml, a 37°C durante lh. Após as lavagens, as células foram incubadas com o mesmo anticorpo conjugado com peroxidase. O sinal da coloração foi desenvolvido após as lavagens. O controlo negativo foi obtido por coloração das células CHO transfectadas com tampão Tris com a família de anticorpos BLA8. A coloração foi avaliada sob um microscópio invertido, e os resultados estão resumidos na Tabela 3 nas colunas IHQ. Os resultados foram classificados como '+' para uma coloração positiva, para uma coloração fracamente positiva ou para uma coloração negativa.
Detecção da expressão do ARNm de B7H3 por RT-PCR. A reacção de RT-PCR foi utilizada para determinar se o ARNm de B7H3 era de facto expresso nos transfectantes. O ARN total foi isolado de células CHO transfectadas com mutantes de B7H3 por meio do regente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia), de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de arn foi quantificada por leitura da absorvância a 260 nm. Aproximadamente 2-3 pg do ARN total foram sujeitos a transcrição reversa com 0,5 pg de oligo-dTis, utilizando o sistema de transcrição reversa Superscript II RNase H~ (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) de acordo com o protocolo do fabricante. A reacção de PCR foi efectuada por combinação de 1 pl do produto da reacção de transcrição reversa com 50 pmoles de cada um dos iniciadores de B7H3 (para obter pormenores, consultar Tabela 2), h20 isenta de nucleases, tampão de PCR IX, cada um dos dNTP a uma concentração de 200 pM e 2,5 U de ADN-polimerase Taq Platinum (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia), em condições de ciclo similares às descritas acima. O produto de PCR resultante foi resolvido num gel de agarose a 1,2% e visualizado por coloração com brometo de etídio. Os resultados estão resumidos na Tabela 3 na coluna "RT-PCR" e foram classificados como '+' para os mutantes com o amplicão correcto detectado ou para nenhum amplicão detectado.
Detecção de B7H3 imunorreactivo no sobrenadante de cultura por ELISA. Para explorar a possibilidade de algum do B7H3 ser segregado em vez de ancorado na superfície das células, desenvolveu-se um ensaio ELISA sanduíche para 80 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ analisar ο teor de Β7Η3 imunorreactivo no sobrenadante de cultura. Resumidamente, uma placa de ELISA de 96 poços foi revestida com anticorpo BLA8 a uma concentração de 4 pg/ml em tampão carbonato (pH 9,0), a 4°C durante a noite. A placa foi lavada com Tween 20 a 0,05% em PBS e bloqueada com BSA a 3% em PBS durante lh. Prepararam-se duplicados dos sobrenadantes de cultura (diluição lOx quatro vezes, partindo de puro até 1/1.000) e de padrão do antigénio de BLA8 (diluição 2x oito vezes, partindo de 16 pg/ml até 125 ng/ml) em PBS contendo BSA a 3% e Tween 20 a 0,05%, permitindo-se que incubassem durante lh. Após as lavagens, a placa foi incubada com anticorpo LUCAl biotinilado a uma concentração de 4 pg/ml em BSA a 3% em PBS durante lh. A placa foi lavada e incubada com reagente Vectastain Elite ABC (Vector Labs, Burlingame, Califórnia) durante outra hora. Após as lavagens, ο B7H3 ligado foi visualizado por desenvolvimento da cor em tampão citrato-fosfato contendo o-fenilenodiamina e H2O2. A intensidade de cor desejada foi obtida por adição de H2S04 2,5N. A absorvância a 490 nm foi determinada num leitor de placas de ELISA Emax de Molecular Devices (Molecular Devices, Sunnyvale, Califórnia) com software SOFTmax Pro (Molecular Devices, Sunnyvale, Califórnia). Os brancos foram obtidos por utilização do sobrenadante de células CHO transfectadas com tampão Tris. Os resultados estão resumidos na Tabela 3 na coluna ELISA e foram classificados como '+' quando a leitura da absorvância foi superior aos brancos ou quando a leitura da absorvância foi igual ou inferior aos brancos.
Tabela 1. Mutagénese de B7H3 por enzimas de restrição Nome do mutante Enzima(s) de restrição utilizadas Resíduos de aminoácidos em relação a B7H3 de sequência completa B7H3 de sequência completa Nenhuma 1-534 AC £co47III Δ132-349 C £co47III 132-349 Δ5' BamHI & Eco47III 350-534 Δ5' s BamHI & Eco 471II 132-534 Δ3 ' Eco47lII & Notl 1-131 Δ3' s Eco47III & Notl 1-349 81 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Tabela 2. Iniciadores utilizados na detecção do transcrito do ARNm de B7H3 por RT-PCR Trans- fectante iniciadores utilizados Tamanho aproximado amplicão B7H3 de sequência completa senso: 5'-AGCCGCCTCACAGGAAGATGCT-3' anti-senso: 5'-AGCGGCCACCTGCAGGCTGACGGCA-3' 440 bp & 1,1 kb AC senso: 5'-AGCCGCCTCACAGGAAGATGCT-3' anti-senso: 5'-GGGGAATGTCATAGGCTGCCCTGTGAT-3' 760 bp C senso: 5'-CCCTACTCGAAGCCCAGCATGACCCT-3' anti-senso: 5'-CACGGCTCCTGTGGGGCTTCTCT-3' 330 bp Δ5 ' senso: 5'-CCAGAGGCCCTGTGGGTGACCGT-3' anti-senso: 5'-CCCTGGTCCTCATGGTCAGGCTAT-3' 220 bp Δ5 ' s senso: 5'-CCAGAGGCCCTGTGGGTGACCGT-3' anti-senso: 5'- CCCTGGTCCTCATGGTCAGGCTAT-3' 220 bp Δ3 ' senso: 5'-AGCCGCCTCACAGGAAGATGCT-3' anti-senso: 5'-CAGGGCTCCTGTGAGGCAGAACCA-3' 110 bp Δ3 ' s senso: 5'-AGCCGCCTCACAGGAAGATGCT-3' anti-senso: 5'-CACGGCTCCTGTGGGGCTTCTCT-3' 770 bp
Tabela 3. Caracterização dos mutantes de B7H3 por vários métodos Transfectante IHQ BLA8 IHQ LUCA1 IHQ ΡΆ20 RT- PCR ELISA B7H3 de sequência completa (1-534 aa) + + + + - Células CHO transfectadas com tampão Tris - - - - - AC (Δ132-349 aa) + + - + - C (132-349aa) - - - + - Δ5'(350-534 aa) - - - + - Δ5's (132-534 aa) - - - + - Δ3' (1-131 aa) - - - + - Δ3's (1-349 aa) + /- + /- + /- + + 1 1 A concentração de B7H3 imunorreactivo no sobrenadante do 'Mutante Δ3's' foi de aproximadamente 2,148 + 0,48 pg/ml. 82 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Uma representação diagramática de B7H3 e dos seus mutantes está ilustrada na Figura 2.
Exemplo 11. Imuno-histoquimica para a ligação de anticorpos da família anti-RAAGlO a tecidos com tumor.
Amostras de tecido congelado foram incluídas em composto OCT e congeladas rapidamente em isopentano utilizando gelo seco. Cortaram-se criossecções de 5 pm de espessura com um micrótomo Leica CM3050 e montaram-se ("thaw-mounting") em lâminas de vidro. As secções foram fixadas em etanol a -20°C e deixadas secar ao ar durante a noite à temperatura ambiente. As secções fixadas foram armazenadas a -80°C até à sua utilização. Para a imuno-histoquímica, as secções de tecido foram recuperadas, inicialmente incubadas em tampão de bloqueio (PBS contendo soro normal de cabra a 5%) durante 30 minutos à temperatura ambiente, e depois incubadas com o anticorpo anti-RAAGlO e anticorpos monoclonais de controlo diluídos em tampão de bloqueio (5 pg/ml) durante a noite. Em seguida, lavaram-se as secções três vezes com tampão de bloqueio. Os anticorpos monoclonais ligados foram detectados com um conjugado de F(ab')2 de cabra anti-lgG+lgM (H+L) de ratinho-peroxidase e com o substrato da peroxidase diaminobenzidina (1 mg/ml, Sigma N.° catálogo D5637) em tampão acetato de sódio 0,1M; pH 5,05; e peróxido de hidrogénio a 0,003% (Sigma, N.° catálogo H1009). As lâminas coradas foram sujeitas a coloração de contraste com hematoxilina e examinadas sob um microscópio Nikon.
Em alguns casos, utilizaram-se tecidos fixados em formaldeído e incluídos em parafina para o ensaio de imuno-histoquímica, após o uso de métodos apropriados de recuperação de antigénio. Um destes métodos de recuperação de antigénio está descrito em Mangham & Isaacson, Histopathology 35:129-33 (1999). Um perito na arte poderá recorrer a outros métodos de recuperação e/ou detecção de antigénio. Obtiveram-se resultados de experiências similares efectuadas utilizando tecidos congelados ou, quando apropriado, tecido fixado com recuperação de antigénio e detecção polyMICA. Avaliou-se a ligação do anticorpo anti-RAAGlO a uma variedade de tecidos normais e cancerosos. Em todos os casos, a ligação do 83 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ anticorpo em tecidos fixados de controlo foi correlacionada com a ligação em tecidos congelados. Os resultados dos tecidos congelados só foram utilizados se os dois não coincidiram nos controlos. Por questões de conveniência, a Tabela 4 mostra os resultados combinados da coloração de 5 tipos principais de tumores com anticorpo anti-RAAGlO, utilizando tecidos tumorais congelados provenientes de 5 fontes diferentes. Para cada tipo de tumor, está indicado o número de tumores que testaram positivo para o antigénio do anticorpo anti-RAAGlO, ou seja, RAAG10, e o número total de tumores testado (+/total). A percentagem de tumores que ligam o anticorpo anti-RAAGlO também está indicada.
Tabela 4. Resumo da incidência da ligação do anticorpo anti-RAAG10 a RAAG10 em tipos de tumores principais Cólon 3/6 Pulmão 6/6 Mama 2/2 Próstata 3/4 Sarcoma 1/1 Total 78,94% (15/19) A Tabela 5 apresenta os resultados combinados da coloração de 5 tipos de tumores metastáticos com anticorpo anti-RAAGlO, utilizando tecidos tumorais fixados ou congelados. Para cada tipo de tumor, está indicado o número de tumores que testaram positivo para o antigénio do anticorpo anti-RAAGlO e o número total de tumores testado (+/total). A percentagem de tumores que ligam o anticorpo anti-RAAGlO também está indicada. Como indicado na Tabela 5, o anticorpo anti-RAAGlO ligou-se a cerca de 94% dos tipos de tumores metastáticos testados. 84 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Tabela 5. Resumo da incidência da ligação do anticorpo anti-RAAG10 a RAAG10 em tipos de tumores metastáticos Metástase da mama 9/9 Carcinoma brônquico metastático 0/1 Metástase renal 5/5 Metástase da tiróide 1/1 Carcinoma de células claras metastático 1/1 Total 94,1% (16/17)
Exemplo 12. Resultado de Imunocltoquímlca de CellArray™.
Utilizou-se anticorpo monoclonal anti-RAAGlO para testar a reactividade com várias linhas celulares de diferentes tipos de tecidos. As células de diferentes linhas celulares estabelecidas foram removidas da superfície de crescimento sem recurso a proteases, empacotadas e incluídas em composto OCT. As células foram congeladas e seccionadas e, em seguida, foram coradas utilizando um protocolo de IHQ padrão. A tecnologia CellArray™ está descrita em WO 01/43869. Os resultados foram classificados como '+' para uma coloração positiva fraca, '++' para uma coloração positiva moderada, '+++' para uma coloração positiva forte e para uma coloração negativa. Os resultados das experiências de ligação CellArray, que mostram a ligação de anticorpo anti-RAAGlO a várias linhas celulares (incluindo linhas celulares de cancro), estão resumidos na Tabela 6. 85 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Tabela 6: Ligação de anticorpos a linhas celulares Nome da célula N. 2 ATCC Órgão Tipo de célula BLA8 LUCA1 PA20 SKIN2 HMEC CC-2551* Mama Células epiteliais mamárias humanas + + + + + + WI-38 CCL-75 Pulmão Fibroblastos de pulmão de feto humano + + + f c+ + + £c+ RL-6 5 CRL-10354 Pulmão Célula Clara de rato - - - - COS 7 CRL-1651 Rim Macaco verde africano + + + nc + fc+ SK-BR-3 HTB-30 Mama Adenocarcinoma + nc + +/- BT-474 HTB-20 Mama Carcinoma da glândula mamária, mama, ductal + + + + + + + + + + + + MCF7 HTB-22 Mama Adenocarcinoma + + + + + + + + + + + + HT29 HTB-38 Cólon Adenocarcinoma colorrectal + + + + + + + + SW480 CCL-228 Cólon Adenocarcinoma colorrectal + + +/- + /- +/- ES-2 CRL-1978 + + + + + + SK-OV-3 HTB-77 Ovário Adenocarcinoma + + + + + + + + + + + 9926 RAVEN Pâncreas Linha de cancro pancreático desenvolvida por Raven + + + +/- PANC-1 CRL-1469 Pâncreas Carcinoma ductal epitelióide + + +/++ + + AsPC-l CRL-1682 Pâncreas Adenocarcinoma + + + + + + + Capan-1 HTB-79 Pâncreas Adenocarcinoma + + +/- + + 293 CRL-1573 Rim + + + + + + + + + + + CFPAC-1 CRL-1918 Pâncreas Adenocarcinoma ductal do pâncreas, fibrose cística + + + + + + + + + + HPAF-II CRL-1997 Pâncreas Adenocarcinoma + + +/- + + Hs 700T HTB-147 Metástase para a pélvis Adenocarcinoma + + + + + + + + + + + + Ηξ 766T HTB-134 Pâncreas Carcinoma + + + + + 786-0 CRL-1932 Rim Adenocarcinoma de células renais + + + + + + + + + + + + Caki-2 HTB-47 Rim Carcinoma de células claras + + + + + + + + + + + + A4 98 CRL-7908 Rim Carcinoma + + + + + + + + + + + BHK-21 CCL-10 Rim Rim normal de hamster sírio dourado _ _ _ _ LNCaP CRL-1740 Próstata Carcinoma + + + + + + + + + + + + PC3 CRL-1435 Próstata Adenocarcinoma + + + + /- +/- 22RV1 CRL-2505 Próstata Carcinoma + + + + + + + + + DU145 HTB-81 Próstata Carcinoma + + + ++/+++ + + + + + + A549 CCL-185 Pulmão Carcinoma + + + /- +/- Cal30 RAVEN Pulmão Linha de cancro do pulmão registada por Raven + + + + + + + + SK-MES-1 HTB-58 Pulmão Carcinoma de células escamosas + + + + + + + + + + + + Caiu 3 HTB-55 Pulmão Adenocarcinoma + + + + + + + + + +
Concentração de AcM = 5 pg/ml, Protocolo Padrão *CC-2551 -Biowhittaker 86 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Exemplo 13. Ligação de anticorpo anti-RAAGlO a tecidos normais e tumorais.
Tecidos normais e tecidos tumorais obtidos por ressecção cirúrgica foram congelados e montados. Cortaram-se criossecções de 5 pm de espessura com um micrótomo Leica CM3050 e montaram-se ("thaw-mounting") em lâminas revestidas com Vectabond. As secções foram fixadas em etanol a -20°C e deixadas secar ao ar durante a noite à temperatura ambiente. 0 anticorpo primário anti-RAAGlO foi utilizado a uma diluição de 1 para 100 (concentração final de 1 pg/ml). As secções de tecido foram recuperadas, inicialmente incubadas em tampão de bloqueio (PBS contendo soro normal de cabra a 5%) durante 30 minutos à temperatura ambiente, e depois incubadas com o anticorpo anti-RAAGlO e anticorpos monoclonais de controlo diluídos em tampão de bloqueio (5 pg/ml) durante a noite. Em seguida, lavaram-se as secções três vezes com tampão de bloqueio. Os anticorpos monoclonais ligados foram detectados com um conjugado de F(ab')2 de cabra anti-IgG+IgM (H+L) de ratinho-peroxidase e com o substrato da peroxidase diaminobenzidina (1 mg/ml, Sigma N.° catálogo D5637) em tampão acetato de sódio 0,1M; pH 5,05; e peróxido de hidrogénio a 0,003% (Sigma, N.° catálogo H1009). As lâminas coradas foram sujeitas a coloração de contraste com hematoxilina e examinadas sob um microscópio Nikon. O kit de detecção PolyMICA™ foi utilizado para determinar a ligação do anticorpo anti-RAAGlO.
Os resultados foram classificados como '+' para uma coloração positiva fraca, '++' para uma coloração positiva moderada, '+++' para uma coloração positiva forte e para uma coloração negativa. A Tabela 7 apresenta a ligação do anticorpo anti-RAAGlO a amostras de tecidos tumorais. Os resultados da coloração de tecidos normais com anticorpo anti-RAAGlO estão ilustrados na Tabela 8.
Os resultados utilizando um protocolo relativamente mais sensível (ABC ou Dako Envision) revelaram coloração em tecidos normais de útero, supra-renal, pele, pulmão, rim, pâncreas, fígado e próstata. Observou-se uma coloração estromal (tecido conjuntivo) em tecidos normais de mama, cólon, duodeno, coração, pulmão, ovários, próstata, músculo 87 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ esquelético, pele, estômago e útero. 0 tecido cerebral normal foi negativo.
Tabela 7: Ligação de anticorpos anti-RAAGlO a tecidos tumorais Protocolo padrão, Concentração dos Ac = 5 pg/ml Número colónia BLA8 SKIN2 LUCA1 PA20 Mama Número tumor tumor Estroma tumor Estroma tumor Estroma tumor Estroma 6AB3 + + - + - + * - + * - 805A + / + + + + + + + + + + + + + + + + Cólon Número tumor tumor Estroma tumor Estroma tumor Estroma tumor Estroma 1C62 - + + + - + + - + + - + + 13FB + + + + - + + + + + + + + + 27FD + + + + + + + + + - + + - + + 4ECD - + + - + - + - - 689F - + + + - + + - + + - + + Pulmão Número tumor tumor Estroma tumor Estroma tumor Estroma tumor Estroma 273 + / + + + + + + * + + + - + - + + 3 4B + + * + + + - + + - + + - + + 425 + * + + + - + - + + - + + E27 + + + + + + + + + / + + * + + + * + + 380E + + + + + + + + / + + + + + + + 1495 + + + + + + + + * + + - + + Próstata Número tumor tumor Estroma tumor Estroma tumor Estroma tumor Estroma 1886 - - - - - - - - 209 + + + — + + — + + / + + + — + + — 470 + + - + + - + + + + - 1D2C + / + + - + + - + + - ++/+++ - * = Coloração focal 88 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ
Tabela 8. Ligação de anticorpos da família anti-RAAGlO a tecidos normais Protocolo padrão (Concentração do Ac = 5 pg/ml) BLA8 LOCAI PA20 SKIN2 Pele Epiderme basal - Fraco + - Fraco + Vasos + /- + /- + /- + /- Glândulas sudoríparas — — Estroma + /- + /- + /- + /- Pulmão Alvéolos Fraco + + /- -/ + -/ + Epitélio brônquico - - - - Fígado Hepatócitos -/ + -/ + -/ + -/ + Células de Kupffer + + + + /- Vasos - - - - Pâncreas Ácinos -/ + -/+ Fraco + Fraco + Duetos - - - - Ilhéus -/ + -/+ + /- + /- Estroma + /- + /- + /- + /- Rim Vasos - - - - Estroma + /- - - - Glomérulos - + /- - -
Exemplo 14. internalizaçao de um anticorpo anti-RAAGlO e de anticorpo anti-IgG de ratinho conjugado com toxina. MAb-ZAP (Advanced Targeting Systems, San Diego, Califórnia) é um anticorpo anti-IgG de ratinho conjugado com saporina, uma toxina que inibe a sintese proteica. Esta toxina é impermeável à membrana celular. Se um anticorpo monoclonal estiver ligado a um antigénio de superfície celular que é internalizável, o conjugado da toxina pode ligar-se ao anticorpo monoclonal preso e ser internalizado, eventualmente matando a célula. Como está dependente da 89 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ internalização para demonstrar a sua actividade tóxica, o MAb-ZAP pode servir para avaliar se um dado antigénio de superfície será ou não um alvo adequado para qualquer toxina que esteja dependente da internalização para expressar os seus efeitos tóxicos nas células. Deste modo, o conjugado MAb-ZAP serve de modelo para este tipo de toxinas dependentes de internalização, como sejam os maitansinóides e as caliqueamicinas.
Para testar a internalização de um anticorpo anti-RAAGlO e do anticorpo anti-IgG de ratinho conjugado com saporina, e o efeito de inibição do crescimento de células tumorais após a internalização do inibidor da síntese proteica saporina, utilizou-se o anticorpo monoclonal anti-RAAGlO de ratinho LUCAl no ensaio. Células de carcinoma pulmonar humano de células escamosas, SK-MES-1, foram removidas de frascos-stock com EDTA 10 mM e centrifugadas. As células foram ressuspensas numa quantidade de 50.000/ml em meio apropriado e plaquearam-se 100 μΐ por poço em placas de 96 poços. O anticorpo LUCAl foi imediatamente adicionado aos poços apropriados como um concentrado lOx, para proporcionar uma concentração final de 10 μg/ml. Após 15 minutos à temperatura ambiente, adicionou-se MAb-ZAP (N.° catálogo IT-04, Advanced Targeting Systems, San Diego, Califórnia) aos poços apropriados como um concentrado lOx, para preparar concentrações finais compreendidas entre 0,001 pM e 104 pM. Depois de 4 dias de crescimento, adicionou-se MTT (solução-stock 5 mg/ml em PBS, diluição de 1:10 no poço) durante 4h a 37°C. O meio foi, em seguida, removido de todos os poços e adicionaram-se 100 μΐ/poço de DMSO. As placas foram suavemente agitadas para solubilizar o precipitado azul de MTT, sendo depois lidas num leitor de placas a 540 nm. A medição da DO do corante de tetrazólio MTT reduzido é um substituto do número de células.
Como ilustrado na Fig. 1, verificou-se uma diminuição da coloração de MTT nas células SK-MES-1 na presença (linha contínua) do anticorpo monoclonal LUCAl em comparação com a coloração na ausência (linha ponteada) de LUCAl quando MAb-ZAP foi adicionado, indicando que o crescimento das células de carcinoma pulmonar humano de células escamosas SK-MES-1 foi inibido na presença do anticorpo monoclonal LUCAl e de MAb-ZAP (anticorpo anti-IgG de ratinho conjugado com o 90 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ inibidor de síntese proteica saporina). A divergência das linhas às concentrações mais elevadas de Mab-ZAP indica que LUCAl é internalizado. Efectuaram-se experiências similares com LUCAl nas linhas celulares tumorais SK-OV-3 e LNCaP. Obtiveram-se também resultados similares de internalização nestas três linhas celulares com os anticorpos monoclonais BLA8 e KID2, que são dois outros anticorpos anti-RAAGlO dirigidos para epitopos diferentes daquele para o qual LUCAl é dirigido.
Os exemplos e as concretizações aqui descritos têm apenas fins ilustrativos, e as várias modificações ou alterações que ocorrerão aos peritos na arte em face deles estão incluídas no espírito e âmbito deste pedido. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados estão pela presente incorporados na íntegra através de referência, para todos os efeitos na mesma medida como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual estivesse específica e individualmente indicado como estando assim incorporado através de referência.
Lisboa, 2011-02-16

Claims (18)

  1. ΕΡ 1 565 489/ΡΤ 1/7 REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido de imunoglobulina substancialmente purificado ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, que se liga a uma porção de B7-H3L que está exposta na superfície de uma célula viva in vitro ou in vivo; e pode ser internalizado em uma célula cancerosa que expressa a referida porção exposta de B7-H3L.
  2. 2. Polipéptido de imunoglobulina purificado ou fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 1, em que a referida célula cancerosa é seleccionada entre um tumor das glândulas supra-renais, um cancro associado à SIDA, um sarcoma alveolar de partes moles, um tumor astrocítico, um cancro da bexiga, um cancro dos ossos, um cancro do cérebro e da medula espinal, um tumor metastático do cérebro, um cancro da mama, um tumor do corpo carotídeo, um cancro cervical, um condrossarcoma, um cordoma, um carcinoma de células renais cromofóbicas, um carcinoma de células claras, um cancro do cólon, um cancro colorrectal, um histiocitoma fibroso benigno cutâneo, um tumor desmoplásico de células pequenas e redondas, um ependimoma, um tumor de Ewing, um condrossarcoma mixóide extra-esquelético, uma fibrogénese óssea imperfeita, uma displasia fibrosa do osso, um cancro da vesícula biliar e do dueto biliar, uma doença trofoblástica gestacional, um tumor de células germinativas, um tumor da cabeça e pescoço, um tumor dos ilhéus de Langerhans, um sarcoma de Kaposi, um cancro dos rins, uma leucemia, um lipoma/tumor lipomatoso benigno, um lipossarcoma/tumor lipomatoso maligno, um cancro do fígado, um linfoma, um cancro do pulmão, um meduloblastoma, um melanoma, um meningioma, uma neoplasia endócrina múltipla, um mieloma múltiplo, uma síndrome mielodisplásica, um neuroblastoma, um tumor neuroendócrino, um cancro dos ovários, um cancro pancreático, um carcinoma papilar da tiróide, um tumor da paratiróide, um cancro pediátrico, um tumor das bainhas nervosas periféricas, um feocromocitoma, um tumor pituitário, um cancro da próstata, um melanoma uveal posterior, uma perturbação hematológica rara, um cancro renal metastático, um tumor rabdóide, um rabdomiossarcoma, um sarcoma, um cancro da pele, um sarcoma de tecidos moles, um cancro de células escamosas, um cancro do estômago, um ΕΡ 1 565 489/ΡΤ 2/7 sarcoma sinovial, um cancro do testículo, um carcinoma tímico, um timoma, um cancro metastático da tiróide e um cancro do útero.
  3. 3. Sequência de ácido nucleico isolada que codifica o polipéptido de imunoglobulina ou um seu fragmento de ligação ao antigénio expresso por uma linha celular, em que a linha celular é um hibridoma seleccionado entre ATCC n.° PTA-4217, ATCC n.° PTA-4218, ATCC n.° PTA-4244 e ATCC n.° PTA-4245.
  4. 4. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3, em que o ácido nucleico está ligado funcionalmente a um promotor.
  5. 5. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 4, em que o promotor e o ácido nucleico estão contidos em um vector de expressão.
  6. 6. Linha celular transfectada, transformada ou infectada com um vector contendo um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3 ou 4.
  7. 7. Método de produção de um polipéptido de imunoglobulina substancialmente purificado, ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio, consistindo em: (a) crescer uma linha celular transformada com o ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, em condições em que o polipéptido de imunoglobulina ou o fragmento de ligação ao antigénio é expresso; e (b) colher o polipéptido de imunoglobulina ou o fragmento expresso.
  8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que a linha celular é um hibridoma.
  9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o hibridoma é seleccionado entre o grupo que consiste em ATCC n.° PTA-4217, ATCC n.° PTA-4218, ATCC n.° PTA-4244 e ATCC n.° PTA-4245. ΕΡ 1 565 489/ΡΤ 3/7
  10. 10. Composição farmacêutica compreendendo uma dose terapeuticamente eficaz da imunoglobulina purificada ou do fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 1 ou 2, juntamente com um veiculo farmaceuticamente aceitável.
  11. 11. Composição farmacêutica compreendendo uma dose terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio, que se liga a uma porção de B7-H3L que está exposta na superfície de uma célula viva in vitro ou in vivo·, e pode ser internalizado em uma célula cancerosa que expressa a referida porção exposta de B7-H3L, juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.
  12. 12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que a composição compreende um fragmento terapêutico adicional.
  13. 13. Linha celular isolada seleccionada entre ATCC n.° PTA-4217, ATCC n.° PTA-4218, ATCC n.° PTA-4244 e ATCC n.° PTA-4245, ou a sua progenitura.
  14. 14. Método para entregar um agente quimioterapêutico a uma célula cancerosa in vitro, consistindo em administrar às referidas células uma composição compreendendo um anticorpo anti-B7-H3L associado ao agente quimioterapêutico, em que a referida célula cancerosa expressa B7-H3L, e uma porção do referido B7-H3L está exposta na superfície da referida célula; o referido anticorpo anti-B7-H3L liga-se à referida porção de B7-H3L que está exposta na superfície da referida célula e pode ser internalizado na referida célula cancerosa; e a referida célula cancerosa é uma célula cancerosa entre um tumor das glândulas supra-renais, um cancro associado à SIDA, um sarcoma alveolar de partes moles, um tumor astrocítico, um cancro da bexiga, um cancro dos ossos, um cancro do cérebro e da medula espinal, um tumor metastático do cérebro, um cancro da mama, um tumor do corpo carotídeo, um cancro cervical, um condrossarcoma, um cordoma, um carcinoma de células renais cromofóbicas, um carcinoma de células claras, um cancro do ΕΡ 1 565 489/ΡΤ 4/7 cólon, um cancro colorrectal, um histiocitoma fibroso benigno cutâneo, um tumor desmoplásico de células pequenas e redondas, um ependimoma, um tumor de Ewing, um condrossarcoma mixóide extra-esquelético, uma fibrogénese óssea imperfeita, uma displasia fibrosa do osso, um cancro da vesícula biliar e do dueto biliar, uma doença trofoblástica gestacional, um tumor de células germinativas, um tumor da cabeça e pescoço, um tumor dos ilhéus de Langerhans, um sarcoma de Kaposi, um cancro dos rins, uma leucemia, um lipoma/tumor lipomatoso benigno, um lipossarcoma/tumor lipomatoso maligno, um cancro do fígado, um linfoma, um cancro do pulmão, um meduloblastoma, um melanoma, um meningioma, uma neoplasia endócrina múltipla, um mieloma múltiplo, uma síndrome mielodisplásica, um neuroblastoma, um tumor neuroendócrino, um cancro dos ovários, um cancro pancreático, um carcinoma papilar da tiróide, um tumor da paratiróide, um cancro pediátrico, um tumor das bainhas nervosas periféricas, um feocromocitoma, um tumor pituitário, um cancro da próstata, um melanoma uveal posterior, uma perturbação hematológica rara, um cancro renal metastático, um tumor rabdóide, um rabdomiossarcoma, um sarcoma, um cancro da pele, um sarcoma de tecidos moles, um cancro de células escamosas, um cancro do estômago, um sarcoma sinovial, um cancro do testículo, um carcinoma tímico, um timoma, um cancro metastático da tiróide e um cancro do útero.
  15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o anticorpo anti-B7-H3L é derivado de um hibridoma seleccionado entre ATCC n.° PTA-4217, ATCC n.° PTA-4218, ATCC n.° PTA-4244 e ATCC n.° PTA-4245, ou a sua progenitura.
  16. 16. Anticorpo anti-B7-H3L associado a um agente quimioterapêutico para inibir o crescimento de células cancerosas em um indivíduo, em que a referida célula cancerosa expressa B7-H3L, e uma porção do referido B7-H3L está exposta na superfície da referida célula; o referido anticorpo anti-B7-H3L liga-se à referida porção de B7-H3L que está exposta na superfície da referida célula e pode ser internalizado na referida célula cancerosa; e ΕΡ 1 565 489/ΡΤ 5/7 a referida célula cancerosa é uma célula cancerosa entre um tumor das glândulas supra-renais, um cancro associado à SIDA, um sarcoma alveolar de partes moles, um tumor astrocitico, um cancro da bexiga, um cancro dos ossos, um cancro do cérebro e da medula espinal, um tumor metastático do cérebro, um cancro da mama, um tumor do corpo carotideo, um cancro cervical, um condrossarcoma, um cordoma, um carcinoma de células renais cromofóbicas, um carcinoma de células claras, um cancro do cólon, um cancro colorrectal, um histiocitoma fibroso benigno cutâneo, um tumor desmoplásico de células pequenas e redondas, um ependimoma, um tumor de Ewing, um condrossarcoma mixóide extra-esquelético, uma fibrogénese óssea imperfeita, uma displasia fibrosa do osso, um cancro da vesícula biliar e do dueto biliar, uma doença trofoblástica gestacional, um tumor de células germinativas, um tumor da cabeça e pescoço, um tumor dos ilhéus de Langerhans, um sarcoma de Kaposi, um cancro dos rins, uma leucemia, um lipoma/tumor lipomatoso benigno, um lipossarcoma/tumor lipomatoso maligno, um cancro do fígado, um linfoma, um cancro do pulmão, um meduloblastoma, um melanoma, um meningioma, uma neoplasia endócrina múltipla, um mieloma múltiplo, uma síndrome mielodisplásica, um neuroblastoma, um tumor neuroendócrino, um cancro dos ovários, um cancro pancreático, um carcinoma papilar da tiróide, um tumor da paratiróide, um cancro pediátrico, um tumor das bainhas nervosas periféricas, um feocromocitoma, um tumor pituitário, um cancro da próstata, um melanoma uveal posterior, uma perturbação hematológica rara, um cancro renal metastático, um tumor rabdóide, um rabdomiossarcoma, um sarcoma, um cancro da pele, um sarcoma de tecidos moles, um cancro de células escamosas, um cancro do estômago, um sarcoma sinovial, um cancro do testículo, um carcinoma tímico, um timoma, um cancro metastático da tiróide e um cancro do útero.
  17. 17. Anticorpo anti-B7-H3L de acordo com a reivindicação 16, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal expresso por uma linha celular, em que a linha celular é um hibridoma seleccionado entre ATCC n.° pta-4217, ATCC n.° PTA-4218, ATCC n.° PTA-4244 e ATCC n.° PTA-4245, ou a sua progenitura. ΕΡ 1 565 489/ΡΤ 6/7
  18. 18. Método para detectar a presença ou ausência de uma célula cancerosa em um indivíduo, consistindo em colocar células do indivíduo em contacto com um anticorpo anti-B7-H3L in vítro, e detectar um complexo de B7-H3L a partir das células e do anticorpo, caso ele exista, em que a referida célula cancerosa expressa B7-H3L, e uma porção de B7-H3L que está exposta na superfície da referida célula e pode ser internalizado na referida célula; o referido anticorpo anti-B7-H3L liga-se à referida porção de B7-H3L que está exposta na superfície da referida célula e pode ser internalizado na referida célula cancerosa; e a referida célula cancerosa é uma célula cancerosa entre um tumor das glândulas supra-renais, um cancro associado à SIDA, um sarcoma alveolar de partes moles, um tumor astrocítico, um cancro da bexiga, um cancro dos ossos, um cancro do cérebro e da medula espinal, um tumor metastático do cérebro, um cancro da mama, um tumor do corpo carotídeo, um cancro cervical, um condrossarcoma, um cordoma, um carcinoma de células renais cromofóbicas, um carcinoma de células claras, um cancro do cólon, um cancro colorrectal, um histiocitoma fibroso benigno cutâneo, um tumor desmoplásico de células pequenas e redondas, um ependimoma, um tumor de Ewing, um condrossarcoma mixóide extra-esquelético, uma fibrogénese óssea imperfeita, uma displasia fibrosa do osso, um cancro da vesícula biliar e do dueto biliar, uma doença trofoblástica gestacional, um tumor de células germinativas, um tumor da cabeça e pescoço, um tumor dos ilhéus de Langerhans, um sarcoma de Kaposi, um cancro dos rins, uma leucemia, um lipoma/tumor lipomatoso benigno, um lipossarcoma/tumor lipomatoso maligno, um cancro do fígado, um linfoma, um cancro do pulmão, um meduloblastoma, um melanoma, um meningioma, uma neoplasia endócrina múltipla, um mieloma múltiplo, uma síndrome mielodisplásica, um neuroblastoma, um tumor neuroendócrino, um cancro dos ovários, um cancro pancreático, um carcinoma papilar da tiróide, um tumor da paratiróide, um cancro pediátrico, um tumor das bainhas nervosas periféricas, um feocromocitoma, um tumor pituitário, um cancro da próstata, um melanoma uveal posterior, uma perturbação hematológica rara, um cancro renal metastático, um tumor rabdóide, um rabdomiossarcoma, um sarcoma, um cancro da pele, um sarcoma de tecidos moles, um cancro de células escamosas, um cancro ΕΡ 1 565 489/ΡΤ 7/7 do estômago, um sarcoma sinovial, um cancro do testículo, um carcinoma tímico, um timoma, um cancro metastático da tiróide e um cancro do útero. Lisboa, 2011-02-16 ΕΡ 1 565 489/ΡΤ 1/2
    ΕΡ 1 565 489/ΡΤ 2/2 Notl BamHl Eco47III Eco47lll Eco47m BamHl Δ5' (350-534)
    c 1Ϊ TM iVodiL Β7Η3 (1-534) s V . c; V Φγ TM T Notl C •v; Ci TM T Eco47Ul Eco47lll A5'S J/\f (132-534) Notl
    BamHl Eco47III Δ3' Jj (1-131) BamHl Eco47Hl Eco47lll £c<?¥7IH £¢^7111 Mrtl AC (Δ132-349)
    A3'S (1-349) s. V c v Eco47lll Notl
    £co47III c J/\ (132-349) FIGURA 2
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EP1846767B1 (en) Kid31 and antibodies that bind thereto
WO2006084078A2 (en) Jam-3 and antibodies that bind thereto