KR101317358B1 - Ａｄａｍ-9 조절자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 질환 및 암-연관 항원, KID24의 동정 및 특성화를 제공한다. 본 발명은 또한 항원 KID24에 결합하는 모노클로날 항체의 패밀리를 포함한 KID24의 조절자, 및 KID24와 연관된 다양한 사람 암 및 질환을 진단하고 치료하는 방법을 제공한다.
KID24, ADAM-9, 모노클로날 항체, 조절자.

Description

ＡＤＡＭ-9 조절자{ADAM-9 MODULATORS}
본 발명은 생물학 및 면역치료 분야에 속한다. 더 구체적으로, 공지된 항원, ADAM-9, 및 그 항원에 결합하는 폴리클로날 및 모노클로날 항체 및 다른 제제에 대한 발견에 관한 것이다. 본 발명은 또한 작용제 및 길항제를 포함한 ADAM-9 조절자, 그리고 항-ADAM-9 항체를 포함한, ADAM-9에 결합하는 펩티드를 사용하여, ADAM-9과 연관된 다양한 사람 질환 및 암의 진단 및/또는 치료를 위한 방법을 더 제공한다.
진단에서 그것들의 공지된 용도뿐만 아니라, 항체는 치료제로서 유용한 것으로 나타났다. 예를 들면, 면역치료, 또는 치료적 목적의 항체의 사용은 최근에 암을 치료하는 데 사용되어왔다. 수동 면역치료는 암 치료에서 모노클로날 항체의 사용을 포함한다. 예를 들면, 문헌(Cancer: Principles and Practice of Oncology, 6판 (2001) Chapt. 20 pp. 495-508)을 참조하라. 이들 항체는 종양 세포 성장 또는 생존의 직접적 억제 및 몸의 면역계의 자연세포 살해 활성을 보충하는 그것들의 능력에 의하여 고유의 치료적 생물학적 활성을 가질 수 있다. 이 제제들을 단독으로 또는 방사선 또는 화학치료제와 병행하여 투여할 수 있다. 비-호지킨 림프종의 치료를 위하여 승인된, 리툭시맙과 트라스투주맙은 각각 이러한 치료제의 두 예이다. 대안적으로, 항체는 항체가 독성 제제와 연결되어 종양에 특이적으로 결합함으로써 그 제제를 종양에 안내하는 항체 콘쥬게이트를 만드는 데 사용될 수 있다. 겜투주맙 오조가미신은 백혈병의 치료에 사용되는 승인된 항체 콘쥬게이트의 예이다. 암세포에 결합하며 진단 및 치료를 위한 잠재적 용도를 가진 모노클로날 항체는 출판되어 개시되었다. 예를 들면, 특히 표적 단백질의 일부 분자량을 개시하는 다음 특허출원을 참조하라: 미국특허 제6,054,561호(200 kD c-erbB-2 (Her2) 및 크기가 40-200 KD인 다른 미공지된 항원) 및 미국특허 제5,656,444호(50 kD 및 55 kD 종양태아성 단백질). 임상적 시험 및/또는 고체 종양의 치료를 위하여 승인된 항체의 예는 트라스투주맙(항원: 180 kD, HER2/neu), 에드레콜로맙(항원: 40-50 kD, Ep- CAM), 항-사람 유지구(HMFG1)(항원>200 kD, HMW 뮤신), 세툭시맙(항원: 150 kD 및 170 kD, EGF 수용체), 알렘투주맙(항원: 21-28 kD, CD52), 및 리툭시맙(항원: 35 kD, CD20)을 포함한다.
유방암을 치료하는 데 사용되는 트라스투주맙(Her-2 수용체) 및 일부 암의 치료를 위하여 임상 시험 중에 있는 세툭시맙(EGF 수용체)의 항원 표적은 피부, 결장, 폐, 난소, 간, 및 췌장을 포함한 대다수의 정상 사람 성체 조직에서 검출가능한 수준으로 존재한다. 이들 치료제를 사용하는 데 있어서 안전 마진은 아마도 이들 부위에서 항체의 발현수준 또는 근접성 또는 활성의 차이에 의하여 제공된다.
암 표적뿐만 아니라, 항체 치료제는 또한 만성 염증 및 다른 면역장애에 대하여 효과적인 것으로 나타났다. 면역장애의 치료를 위하여 승인된 항체 치료의 예는 인플릭시맙(항원:TNFα)이다.
다른 유형의 면역치료는 항원의 발현을 안내하고 그 다음 개체에서 면역반응을 유발시켜 즉 그 자신의 암에 대한 항체를 활발하게 생성하도록 유도하는 특정 암(들) 또는 DNA 구성체에 존재하는 항원을 통한 활성 면역치료, 또는 백신접종이다. 활성 면역화는 수동 면역치료 또는 면역독소와 마찬가지로 자주 사용될 수 있다.
질환(암 포함)이 진행하는 몇 가지 모델이 제시되어왔다. 이론의 범위는 단일 전염성/형질전환 이벤트에 의한 원인으로부터 궁극적으로 완전 병원성 또는 악성 능력을 가진 것으로 유도하는 증가하는 "질환 유사" 또는 "암 유사" 조직 유형의 진화까지 이른다. 일부는 암의 경우 예를 들면 단일 돌연변이 이벤트가 악성을 야기하는 데 충분하다고 주장하는 반면, 다른 이들은 계속적 변화가 또한 필요하다고 주장한다. 일부 다른 이들은 증가하는 돌연변이 부담 및 종양 정도가 세포 수준에서 연속적인 돌연변이-선택 이벤트를 통하여 종양형성의 진행뿐만 아니라 시작 모두에 필요하다고 제안하였다. 일부 암 표적은 종양 조직에서만 발견되지만, 다른 것들은 정상 조직에 있고 종양 조직에서 상향조절 및/또는 과발현된다. 이러한 상황에서, 일부 연구자들은 과발현이 악성의 인식과 연관된다고 제안하지만, 다른 이들은 과발현이 증가하는 질환상태로 이어지는 경로로 향하는 경향성의 단순한 마커라고 제안한다.
이상적인 진단 및/또는 치료 항체는 다수의 암에 존재하는 항원에 특이적이지만, 어떤 정상 조직에서 부재하거나 낮은 수준으로만 존재한다. 암(들)과 특이적으로 연관된 신규 항원의 발견, 특성화, 및 분리는 많은 면에서 유용할 것이다. 첫 째, 항원은 항원에 대한 모노클로날 항체를 만드는 데 사용될 수 있다. 항체는 이상적으로 암세포에 대한 생물학적 활성을 가지고 외래 항원에 대한 면역계의 반응을 보충할 수 있다. 항체는 치료제 단독으로 또는 최신 치료법과 조합하여 투여될 수 있거나 독성 제제에 연결된 면역콘쥬게이트를 제조하는 데 사용될 수 있다. 또한 동일한 특이성을 갖지만 단독으로 투여했을 때 낮거나 생물학적 활성이 없는 항체는 항체가 독소를 항원 함유 세포로 안내하는 항체에 의하여 생물학적으로 활성인 콘쥬게이트된 형태로 방사성동위원소, 독소, 또는 화학치료제 또는 화학치료제를 함유한 리포솜과의 면역콘쥬게이트를 제조하는 데 사용될 수 있다.
이상적인 진단 및/또는 치료 항체를 위한 한 양태는 다양한 암과 연관된 항원의 발견 및 특성화이다. 비-암 세포에서의 발현을 제한하는 많은 유형의 암(예를 들면, "전(pan)-암" 항원)에서 발현되는 항원은 거의 없다. 항원은 또한 약물개발(예를 들면, 소분자) 및 세포 조절, 성장, 및 분화의 추가 특성화에 유용하다.
ADAM(디스인테그린 및 메탈로프로테아제 도메인)은 세포 고정, 세포 융합 및 단백질분해와 같은 생물학적 과정의 넓은 범위에서 중요하다고 생각되는 단백질의 패밀리이다. 일반적으로, 그것은 기저막 성분을 퇴화시키는 능력을 가지고 인테그린에 결합하여, 세포-기질 상호작용을 파괴하는 뱀독 단백질과 상동성을 가진 막관통 단백질이다. 기능면에서 뱀독 단백질과의 유사성 때문에, ADAM은 MDC 단백질(메탈로프로테아제 유사, 디스인테그린, 시스테인 풍부)이라고도 알려져 있다.
MDC9 또는 ADAM-9(메트린 γ)는 ADAM/MDC 단백질 패밀리의 구성원이다. 단백질 서열은 미국특허출원 제20040091473호 및 제20020042368호에 기술되었다. ADAM- 9 발현은 래트 신장에서 발견되었으며 또한 단백질 마이크로어레이를 사용했을 때 간세포 암종에서 상향조절되는 것으로 나타났으나, 암 진행에서의 이 발견의 의미는 분명하지 않다. ADAM-9은 또한 아밀로이드 전구체 단백질의 가공에서 헤파린-결합 표피 성장인자(HB-EGF)의 흘림(shedding)에 그리고 일부 인테그린의 리간드로서 관여하는 것으로 나타났다. 마우스, 사람, 및 제노푸스(Xenopus) 간에 고도로 보존되어 있고, 다른 조직에서 넓게 발현된다 하더라도, ADAM9 결핍 녹아웃 마우스는 명백한 병리학적 이상을 나타내지 않는다. ADAM-9에 대한 폴리클로날 및 모노클로날 항체는 단백질 어레이에서 간세포 암종과 연관된 신규 단백질의 동정(Tannapfel et el., J of Pathology 2003; 201: 238-49) 및 ADAM-9 발현을 분석하기 위하여 정맥 혈관 평활근 세포(VSMC)를 사용하는 아테롬성 동맥경화증 모델에서 사용되었으나(Al Fakhri et al. J Cellular Biochem (2003)89: 808-823), 마커로서 ADAM-9의 의미는 불분명하다. 이 선행기술은 ADAM-9 항체를 치료제로서나, ADAM-9의 발현이 암에서 원인 효과로 작용한다고 교시하거나 제안하지 않는다.
필요한 것은 세포 표면 표적을 특이적으로 인식하는 항체 및 다른 제제로 이러한 질환 및/또는 암을 진단하고 치료하는 데 사용할 수 있는 병든 세포 및/또는 암세포의 표면상의 신규 표적이다. 본원에 개시된 발견에 기초하여, ADAM-9의 질환 촉진 활성을 감소시키거나 증대시킴으로써 조절할 수 있는 세포의 표면상의 표적을 특이적으로 인식하는 신규 항체 및 다른 제제의 추가적 필요가 있다. 그것의 질환 연관 활성을 억제할 수 있는 사람 ADAM-9의 길항제를 동정하는 것이 본 발명의 목적이다. ADAM-9의 분석에 사용하고 면역원으로서 또는 항-사람 ADAM-9 항체를 선택 하는 데 사용하기 위한 신규 화합물을 제공하는 것이 다른 목적이다.
아래에 더 상세하게 설명하겠지만, 본 발명은 신규 길항제의 항원 표적, 조절자 및 본원에 제공된 항체로 동정된, 본원에서 KID24로 지칭하는 공지된 폴리펩티드 ADAM-9에 관하여 발견하였다.
본원에 개시된 모든 참고문헌, 간행물 및 특허출원은 본원에 전부 참고문헌으로 포함된다.
발명의 개요
본원에 개시된 발명은 본원에 나타낸 공지된 폴리펩티드 ADAM-9(본원에서 KID24라고도 언급됨)는 다양한 1차 및 사람 전이암에 존재하며, 항-KID24 항체가 이러한 암을 치료하는 데 사용될 수 있다는 발견에 관한 것이다. 본 발명은 KID24 길항제, 조절자 및 다양한 사람 암에서 발현되는 KID24에 결합하는 모노클로날 항체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 KID24에 결합하는 모노클로날 항체의 패밀리이다. 다른 양태에서, 본 발명은 PTA # 5174의 특허기탁지정기관인 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2003년 5월 2일 기탁된 숙주 세포주 KIDNEY.5.3F2.2G8에 의하여 생성된 모노클로날 항체 항-KID24이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 숙주 포유동물을 면역원으로 면역화하는 단계; (b) 포유동물로부터 림프구를 얻는 단계; (c) 림프구 (b)를 골수종 세포주와 융합하여 하이브리도마를 생성하는 단계; (d) (c)의 하이브리도마를 배양하여 모노클로날 항체를 생성하는 단계; 및 (e) 병든 세포 및/또는 암 세포 또는 세포주에 결합하지만 비-암 세포 또는 정상 세포 또는 세포주에는 결합하지 않거나, 더 낮은 수준으로 또는 다른 방식으로 정상 세포에 결합하는 항체들만을 선택하는 단계를 포함하는 병든 세포 및/또는 암 세포와 반응하는 모노클로날 항체 항-KID24를 생성하는 방법이다.
다른 양태에서, 본 발명은 항체의 생산을 허용하는 조건 하에서 이러한 항체를 코딩하는 숙주세포 또는 그것의 자손을 배양하는 단계, 및 항-KID24 항체를 정제하는 단계를 포함한, 항-KID24 항체를 생성하는 방법이다.
다른 양태에서, 본 발명은 적합한 세포에서 항체(단일 경쇄 또는 중쇄로 분리되어 발현될 수 있거나, 경쇄 및 중쇄 모두 한 벡터로부터 발현된다)를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 발현하고, 일반적으로 이어서 관심있는 항체 또는 폴리펩티드를 회수 및/또는 분리함으로써 본원에 설명된 항체(또는 폴리펩티드) 중 어떤 것을 생산하는 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 KID24에 대한 항-KID24 항체의 우선적 결합을 경쟁적으로 억제하는 항-KID24 항체 또는 폴리펩티드(항체이거나 항체가 아닐 수 있다)이다. 일부 구체예에서, 본 발명은 KID24 상에 다른 항-KID24 항체와 동일한 또는 다른 에피토프(들)에 우선적으로 결합하는 항체 또는 폴리펩티드(항체이거나 항체가 아닐 수 있다)이다.
다른 양태에서, 본 발명은 KID24에 대한 항-KID24 항체의 우선적 결합을 경쟁적으로 억제하는 KID24 조절자이다(폴리펩티드이거나 폴리펩티드가 아닐 수 있다). 일부 구체예에서, 본 발명은 KID24 상에 다른 항-KID24 항체와 동일한 또는 다른 에피토프(들)에 우선적으로 결합하는 소분자 또는 화학적 화합물일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 KID24의 에피토프에 특이적인 항체로 결합된 KID24를 포함하는 조성물이다. 한 구체예에서, 항체는 항-KID24이다. 다른 양태에서, KID24의 두 개 이상의 다른 에피토프를 맵핑하는 두 개 이상의 항-KID24 항체를 투여한다. 일부 구체예에서, 항-KID24 항체를 치료제 또는 검출가능한 표지에 연결한다.
다른 양태에서, 본 발명은 항-KID24 항체의 단편 또는 영역을 포함한 항체이다. 한 구체예에서, 단편은 항체의 경쇄이다. 다른 구체예에서, 단편은 항체의 중쇄이다. 또 다른 양태에서, 단편은 항체의 경쇄 및/또는 경쇄의 가변부를 함유한다. 또 다른 구체예에서, 단편은 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 경쇄 또는 중쇄의 하나 이상의 CDR(또는 그것의 단편); (b) 경쇄의 세 CDR; (c) 중쇄의 세 CDR; (d) 경쇄의 세 CDR 및 중쇄의 세 CDR; (e) 경쇄 가변부; (f) 항-KID24 항체의 중쇄 가변부 중 어떤 것을 포함한 폴리펩티드(항체일 수도 아닐 수도 있다)를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 사람화 항체이다. 일부 구체예에서, 사람화 항체는 비-사람 항-KID24 항체의 하나 이상의 CDR을 포함한다. 일부 구체예에서, 사람화 항체는 다른 항-KID24 항체와 동일하거나 다른 에피토프(들)에 결합한다. 일반적으로, 본 발명의 사람화 항체는 본래의 비-사람 항-KID24 항체의 CDR(들)과 동일하고/하거나 그것에서 유래된 하나 이상(한 개, 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 여섯 개 또는 그것의 단편)의 CDR을 포함한다. 일부 구체예에서, 사람 항체는 다른 항-KID24 항체와 동일하거나 다른 에피토프(들)에 결합한다. 다른 양태에서, 본 발명은 비-사람 항-KID24 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변부에서 유래된 가변부 및 사람 항체의 중쇄 및 경쇄의 불변부에서 유래된 불변부를 포함하는 키메라 항체이다.
다른 양태에서, 본 발명은 기탁번호 ATCC PTA #5174의 숙주세포, 또는 그것의 자손에 의하여 생성된 항체 mu-항-KID24를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드이다. 본 발명은 상기 열거된 항체 중 어떤 것의 고유의 결합 또는 생물학적 활성을 가진 항체 폴리펩티드를 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 설명된 어떤 다른 폴리펩티드뿐만 아니라 항체(항체 단편을 포함한)의 어떤 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명은 본원에 설명된 폴리펩티드(본원에 설명된 항체 중 어떤 것을 포함한) 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한 약학적 조성물, 예를 들면 화학치료제에 연결된 항-KID24 항체, 항-KID 항체의 단편을 포함한 항체, 비-사람 KID24 항체의 사람화 항체, 비-사람 항-KID24 항체의 가변부에서 유래된 가변부 및 사람 항체에서 유래된 불변부를 포함한 키메라 항체, 또는 비-사람 항-KID24 항체, 또는 화학치료제(예를 들면 방사성 부분), 및 약학적으로 허용가능한 첨가제에 결합된 본원에 설명된 항-KID24 항체의 하나 이상의 특징을 가진 사람 항체를 포함한 조성물이다.
한 양태에서, 본 발명은 병든 세포 또는 암세포에 존재하는 KID24에 결합하는 항-KID24 항체를 포함하는 조성물이다. 바람직한 구체예에서, 암세포는 신장, 난소, 폐, 전립선, 췌장, 결장, 및 유방 암세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 암세포는 생물학적 샘플에 있다. 일반적으로, 생물학적 샘플은 사람과 같은 개체에서 취한다.
다른 양태에서, 본 발명은 개체의 세포에서 KID24를 검출함으로써 개체의 질환, 특히 개체에서의 염증성 또는 자가면역 반응과 연관된 질환 또는 장애를 진단하는 방법이다. 본 발명의 다른 양태에서, 개체에서 염증성 또는 자가면역 반응을 조절하는 방법들이 제공된다. 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 치료할 수 있는 염증 및 자가면역 장애로부터 발생한 질환 또는 병소는, 한정하는 것이 아니라 실례를 위하여, 다발성경화증, 수막염, 뇌염, 뇌졸증, 다른 뇌 외상, 궤양성 대장염 및 크론씨병을 포함한 염증성 장 질환, 중증근무력증, 낭창, 류마티스관절염, 천식, 급성 청소년 발병 당뇨병, AIDS 치매, 아테롬성동맥경화증, 신염, 망막염, 아토피성 피부염, 건선, 심근 허혈 및 급성 백혈구 매개 폐 손상을 포함한다.
본 발명의 항체 및 다른 치료제의 치료적 사용의 또 다른 지시물은 기관의 위험 또는 이식 거부시에 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 최근 수년에 걸쳐, 조직 및 기관, 예를 들면 피부, 신장, 간, 심장, 폐, 췌장 및 골수를 이식하기 위한 수술 기술의 효율성에 상당한 발전이 있었다. 아마도, 주된 미해결 문제는 이식된 동종이식편 또는 기관에 대하여 수용체에서 면역관용을 유도하기 위한 충분제의 결핍이다. 동종이계 세포 또는 기관이 숙주(즉, 공여자 및 수용자는 동일한 종과 다른 개체이다)에 이식될 때, 숙주 면역계는 이식된 조직의 파괴를 야기하는 이식(이식편대숙주병)에서 외래 항원 대하여 면역 반응을 일으켜 이식된 조직의 파괴를 야기하는 것 같다.
다른 양태에서, 본 발명은 개체의 선택된 세포에 KID24의 발현이 있는 지의 여부를 결정하는 단계를 포함한, 개체가 암이 있는지를 진단하기 위한 방법인데, 상기 세포에서의 KID24의 발현은 상기 암을 나타낸다. 일부 구체예에서, KID24의 발현은 항-KID24 항체를 사용하여 결정한다. 일부 구체예에서, 방법은 세포에서 KID24 발현의 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "검출"은 대조군과 관련되거나 관련되지 않은 정성적 및/또는 정량적 검출(측정 수준)을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개체의 세포로부터 방출된 KID24를 검출함으로써 개체에서 암을 진단하는 방법인데, 암은, 한정하는 것은 아니지만, 부신종양, AIDS 연관 암, 폐포 연화부 육종, 성상세포종양, 방광암(편평상피세포 암종 및 이행세포 암종), 골 암(에나멜상피종, 동맥류성골낭, 골연골종, 골육종), 뇌 및 척수 암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥체 종양, 경부암, 연골육종, 척색종, 혐색소성 신세포암종, 투명세포암, 결장암, 직장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결핵 소원세포 종양, 상의세포종, 유잉 종양, 뼈외 점액양 연골육종, 섬유화 부전, 골의 섬유성 이형성증, 담낭 및 담관암, 임신성 융모성 질환, 생식세포종, 두경부암, 도세포 종양, 카포시 육종, 신장암(신아세포종, 유두상 신세포암종), 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암(간모세포종, 간세포 암종), 림프종, 폐암(소세포 암종, 선암, 편평상피암, 대세포 암종 등), 수모세포종, 흑색종, 수막종, 다발성 내분비 종양, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경아세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아암, 말초신경초종, 갈색세포종, 뇌하수체종양, 전립선암, 뒤 포도막 흑색종, 희귀 혈액 장애, 신장 전이성 암, 횡문양종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포암, 위암, 활막육종, 고환암, 흉선암, 흉선종, 갑상선 전이성 암, 및 자궁암(자궁경부암, 자궁내막암, 및 평활근종)로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 양태에서, 본 발명은 개체의 생물학적 샘플에서의 KID24의 발현을 결정하는 단계를 포함한 개체에서 암(예를 들면, 한정하는 것은 아니지만, 신장, 난소, 폐, 전립선, 췌장, 결장, 또는 유방암)의 진단을 돕는 방법이다. 일부 구체예에서, KID24의 발현은 항-KID24 항체를 사용하여 결정한다. 일부 구체예에서, 방법은 세포로부터 KID24 발현의 수준을 검출한다. 암으로부터 방출된 KID24는 체액(예를 들면, 혈액, 침 또는 장 점액성 분비)에서 검출할 수 있는 KID24 또는 그것의 부분의 상승된 수준에 기여할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 암 세포의 성장을 감소시키에 충분한 KID24에 결합하는 항체의 유효량을 투여함으로써 암을 치료하는 방법이다. 일부 구체예에서, 항체는 항-KID24 항체이다. 어떤 구체예에서, 암세포는, 한정하는 것은 아니지만, 부신종양, AIDS 연관 암, 폐포 연화부 육종, 성상세포종양, 방광암(편평상피세포 암종 및 이행세포 암종), 골 암(에나멜상피종, 동맥류성골낭, 골연골종, 골육종), 뇌 및 척수 암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥체 종양, 경부암, 연골육종, 척색종, 혐색소성 신세포암종, 투명세포암, 결장암, 직장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결핵 소원세포 종양, 상의세포종, 유잉 종양, 뼈외 점액양 연골육종, 섬유화 부전, 골의 섬유성 이형성증, 담낭 및 담관암, 임신성 융모성 질환, 생식세포종, 두경부암, 도세포 종양, 카포시 육종, 신장암(신아세포종, 유두상 신세포암종), 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암(간모세포종, 간세포 암종), 림프종, 폐암(소세포 암종, 선암, 편평상피암, 대세포 암종 등), 수모세포종, 흑색종, 수막종, 다발성 내분비 종양, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경아세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아암, 말초신경초종, 갈색세포종, 뇌하수체종양, 전립선암, 뒤 포도막 흑색종, 희귀 혈액 장애, 신장 전이성 암, 횡문양종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포암, 위암, 활막육종, 고환암, 흉선암, 흉선종, 갑상선 전이성 암, 및 자궁암(자궁경부암, 자궁내막암, 및 평활근종)로 구성된 군으로부터 선택된다. 어떤 바람직한 구체예에서, 암세포는, 한정하는 것은 아니지만, 유방암, 결장암, 전립선암, 폐암, 육종, 신장 전이성 암, 갑상선 전이성 암, 및 투명세포 암종을 포함한 고형 종양의 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 KID24 조절자의 유효량을 투여하는 단계를 포함한, 1차 종양을 가지거나 가졌던 개체에서 전이의 진행을 예방하거나 지연시키는 방법이다. 이 조절자는 단독으로 또는 다른 치료법, 예를 들면 방사선, 화학치료, 또는 수술과 병행하여 공급될 수 있다. 어떤 바람직한 구체예에서, 1차 종양은 KID24 조절자의 투여 전에 적어도 한 번의 수술, 방사선, 및/또는 화학치료를 받았다. 다른 구체예에서, 수술, 방사선, 및/또는 화학치료를 통한 개체의 치료 전 또는 그것과 병행하여 KID24 조절자를 투여한다. 어떤 특히 바람직한 구체예에서, KID24 조절자는 적어도 하나의 항-KID24 항체이다.
다른 양태에서, 본 발명은 세포 배양물 또는 샘플, 또는 개체에게 화학치료제와 연관된(연결된 것을 포함한) 항-KID24 항체를 포함한 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한 시험관내에서 또는 개체에서 암세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 방법이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 KID24에 특이적으로 결합하는 항체의 패밀리의 적어도 한 구성원의 유효량을 개체에게 투여함으로써 개체의 암세포에 치료제를 전달하는 방법이다. 다른 구체예에서, 항-KID24 항체를 다른 치료제와 조합하여(연결된 것을 포함) 개체에게 전달한다.
일부 구체예에서, 항-KID24 항체는 본원에 명명된 항체로부터 전달된 사람화 항체이다(일반적으로, 반드시 그럴 필요는 없지만, 항체의 하나 이상의 부분적 또는 무결 CDR을 포함하는). 일부 구체예에서, 항-KID24 항체는 명명된 항체의 하나 이상의 특성을 가진 사람 항체이다. 일부 구체예에서, 화학치료제(예를 들면, 독소 또는 방사성 물질)를 암 세포에 전달한다(내재화한다). 일부 구체예에서, 제제는 사포린이다.
다른 양태에서, 본 발명은 치료제와 연관된(연결된 것을 포함한) 항-KID24 항체를 포함한 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한 개체에서 암을 치료하는 방법이다.
본 발명은 KID24와 세포질 신호화 파트너의 결합을 증대시키거나 감소시킴으로써 조절하는 방법을 더 제공한다. KID24와 세포질 신호화 파트너의 결합은 세포 표면상에 존재하는 KID24 분자를 KID24에 대한 신호 파트너의 결합을 조절하는 제제와 접촉시킴으로써 충격을 받을 수 있다. KID24의 결합 및/또는 신호화 파트너와의 결합을 차단하거나 감소시키는 제제는 KID24-매개 염증 또는 면역 반응에 관련된 생물학적 및 병리학적 과정을 조절하는 데 사용될 수 있다. 이 작용에 관련된 병리학적 과정은 종양 연관 세포 성장을 포함한다.
KID24와 결합 파트너, 예를 들면 항-KID24 항체와의 결합을 차단, 감소, 증대시키거나 그렇지 않으면 조절하는 그것의 능력에 대하여 제제를 시험할 수 있다. 구체적으로, KID24 상호작용 부위를 포함한 펩티드를 결합 파트너 및 시험 제제와 인큐베이션하고, 시험 제제가 결합 파트너와 KID24 펩티드의 결합을 감소 또는 증대시키는지 여부를 결정함으로써 이러한 상호작용을 조절하는 능력에 대하여 제제를 시험할 수 있다.
KID24 기능의 작용제, 길항제, 및 다른 조절자는 특별히 본 발명의 범주 내에 포함된다. 이들 작용제, 길항제 및 조절자는 하나 이상의 KID24의 항원성 결정소를 포함하거나, 이러한 부위의 하나 이상의 단편, 이러한 부위의 변이체, 또는 이러한 부위의 유사펩티드를 포함하는 폴리펩티드이다. 이들 작용성, 길항성, 및 KID 조절성 화합물은 선형 도는 환형으로 제공되며, 선택적으로 자연에서 보통 발견되지 않는 적어도 하나의 아미노산 잔기 또는 적어도 하나의 아미드 이소스티어를 포함한다. 이들 화합물은 글리코실화될 수 있다. 본 발명의 KID24 기능의 작용제, 길항제, 및 다른 조절자는 바람직하게는 항체와 관련하여 전술한 모든 구체예 및 방법에 사용된다.
본 발명의 다른 양태는 ADAM-9라고 동정되었으며 본원에 KID24라고 언급되는 항원에 관한 것이다. 이 항원은 면역원으로서의 사용 및 다양한 연구, 진단 및 치료 목적을 위하여 적합하다.
어떤 양태에서, 본 발명은 (i) 개체로부터 얻은 혈액 또는 조직 샘플에서 KID24의 존재를 분석하는 단계; (ii) 상기 샘플이 정상(병에 걸리지 않은) 혈액 또는 조직 샘플에 비해서 KID24 마커의 증가된 양을 가지는지 여부를 검출하는 단계; 및 (iii) 상기 마커의 증가된 양을 양성 진단에 대비하거나 상기 마커의 증가된 양의 부재를 질환의 음성 진단에 대비하는 단계를 포함하는, 개체에서 질환의 진단을 돕기위한 방법이다. 어떤 구체예에서, 항-KID24 항체를 사용하여 마커를 검출한다. 어떤 구체예에서, 상기 방법은 방사성핵종 영상법, 유세포측정법, 및 면역조직화학법으로 구성된 군으로부터 선택된 기술의 영향을 받는다.
도 1은 신장 암종 세포주, A498의 세포 용해물에서 mu-항-KID24를 사용한 면역침전(ippt)과 이어서 mu-항-KID24 항체를 통한 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 화살표는 mu-항-KID24 ippt 샘플에서 ~75kDa 특정 밴드를 지시한다. 도 1은 또한 A498 세포 용해물에서 상업적 ADAM9 항체를 사용한 면역침전(ippt)과 이어서 mu-항-KID24 항체를 통한 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. "PG"로 표지된 레인은 단백질 G 사전승인 대조군 조건의 샘플을 나타낸다. "IgG"로 표지된 레인은 대조군 IgG 항체로 면역침전된 샘플을 나타낸다. "KID24"로 표지된 레인은 mu-항-KID24 항체로 면역침전된 샘플을 나타낸다.
도 2는 mu-항-KID24 및 Mab-ZAP(사포린에 콘쥬게이트된 항-IgG 항체)이 사람 난소 암종 세포주, ES-2, 및 사람 췌장 암종 세포주, HPAF-II의 성장에 미치는 효과의 그래프 결과를 도시한다. 도 2는 mu-항-KID24 및 Mab-ZAP가 ES-2 세포의 성장에 미치는 효과의 그래프 결과를 도시하고, 도 2B는 mu-항-KID24 및 Mab-ZAP가 HPAF-II 세포의 성장에 미치는 효과의 그래프 결과를 도시한다.
도 3은 누드 마우스의 신장피막하에 이식된 머켈 세포의 대표적 종양을 나타낸다. 마우스를 종양 이식 후 21일에 시작하여 3 주 동안 주 2회 PBS 대주군 또는 50 mg/kg mu-항-KID24 항체로 처리하였다.
도 4는 신장피막하에 머켈 세포 종양으로 이식한 누드 마우스로부터 절개한 대표적 장막을 나타낸다. 마우스를 종양 이식 후 21일에 시작하여 3 주 동안 주 2회 PBS 대주군 또는 50 mg/kg mu-항-KID24 항체로 처리하였다. 도 4A는 PBS 대조군 처리된 마우스로부터 절개한 장막을 나타낸다. 화살표/화살표머리는 장막에 존재하는 전이를 지시한다. 도 4B는 mu-항-KID24 처리된 마우스의 절개된 장막을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은, 한정하는 것은 아니지만, 췌장, 결장, 폐, 및 전립선암을 포함한 다양한 조직 유형의 암 세포에서 발현되는 항원, ADAM-9(KID24)를 제공한다. 나아가, 본 발명은 KID24에 결합하는 모노클로날 항체와 폴리펩티드 및, 한정하는 것은 아니지만, KID24의 발현 및/또는 과발현과 연관된 사람 암을 포함한 다양한 질환을 진단하고 치료하기 위하여 이들 항체와 폴리펩티드를 제조하고 사용하는 방법을 제공한다.
I. 일반 기술
본 발명의 수행은 달리 지시하지 않는 한 기술분야 내에 있는 분자생물학(재조합기술을 포함), 미생물, 세포생물학, 생화학 및 면역학의 종래 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌, 예를 들면 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판 (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and CC. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J-M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); hmnunobiology (CA. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); 및 Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et ah, eds., J.B. Lippincott Company, 1993)에서 자세히 설명한다.
II. 정의
"KID24"는 본 발명의 항체가 유도된 약 75kDa(환원 조건 하에서)의 분자량을 가진 신규 폴리펩티드 항원을 지칭한다. KID24 항원은 항-KID24 항체에 의하여 결합되는 세포 표면 단백질이고 췌장 및 몇 가지 유형의 암종에 존재한다. 이 항원은 하나 이상의 다른 에피토프를 가질 수 있고, 본 발명의 일부 구체예는 KID24 항원의 2개 이상의 특이적 에피토프 중 하나에 대하여 유도된 KID24 조절자를 포함한다. 현재 KID24는 그것들의 정상 조직 대응물과 비교하여 어떤 암세포에서 과발현될 수 있다고 생각된다.
KID24 기능의 작용제, 길항제, 및 다른 조절자는 KID24에서 하나 이상의 항원성 결정소 부위를 포함하거나 이러한 부위의 하나 이상의 단편, 이러한 부위의 변이체, 또는 이러한 부위의 유사펩티드를 포함하는 폴리펩티드이다. 이들 작용성, 길항성, 및 KID24 조절성 화합물은 선형 또는 환형으로 제공되며, 선택적으로 자연에 통상 발견되지 않는 적어도 하나의 아미노산 또는 적어도 하나의 아미드 이소스 티어를 포함한다. 이들 화합물은 글리코실화될 수 있다.
더 구체적으로, 본원에 사용된 용어 "KID24 조절자"는 (1) 사람 KID24와 그것의 천연 리간드 또는 항-KID24 항체 간의 상호작용을 중단 또는 차단할 수 있고; (2) 사람 KID24와 그것의 천연 리간드 또는 항-KID24 항체에 결합할 수 있으며; (3) 사람 KID24와 그것의 천연 리간드 또는 항-KID24 항체에 결합할 수 있는 항체의 유도에 사용될 수 있는 항원성 부위를 함유하고; (4) 사람 KID24와 그것의 천연 리간드 또는 항-KID24 항체에 결합할 수 항체의 스크리닝에 사용될 수 있는 항원성 부위를 함유하며; (5) 사람 KID24와 그것의 천연 리간드 또는 항-KID24 항체 간의 상호작용을 중단 또는 차단할 수 있는 항체의 유도에 사용되는 항원성 부위를 포함하고; (6) 사람 KID24와 그것의 천연 리간드 또는 항-KID24 항체 간의 상호작용을 중단 또는 차단할 수 있는 항체의 스크리닝에 사용될 수 있는 항원성 부위를 함유하는 어떤 화합물로 정의한다. KID24 조절자는 그 활성이 정상 KID24의 생물학적 활성을 각각 증대하는지 또는 억제하는지 여부에 따라 "KID24 작용제" 또는 "KID24 길항제"일 수 있다.
KID24 작용제, 길항제 및 조절자는 KID24 변이체, KID24 펩티드 길항제, 유사펩티드, 및 소분자, 항-KID24 항체 및 면역글로불린 변이체, 아미노산 치환, 결실, 및 첨가 변이체, 또는 그것들의 어떤 조합을 포함한 사람 KID24의 아미노산 변이체, 및 키메라 면역글로불린을 포함한다. 본 발명의 KID24 작용제, 길항제 및 조절자는 사람 KID24와 그것의 천연 리간드 또는 항-KID24 항체의 결합에 관련된 KID24 도메인의 발명자의 동정에 기초한다. 따라서, 본 발명은 사람 KID24의 하나 이상의 항-KID24 결합 도메인을 복제하거나 모방하는 분자 구조를 가진 KID24 작용제, 길항제 및 조절자를 제공한다.
본원에 사용된 용어 "KID24 변이체"는 아미노산 치환, 결실, 및 첨가 변이체, 또는 그것들의 어떤 조합을 포함한, 사람 KID24의 어떤 아미노산 변이체를 나타낸다. 이 정의는 사람 KID24/비-사람 키메라와 다른 하이브리드 분자와 같은 키메라 분자를 포함한다. 분자의 변이체 또는 하이브리드 영역(들)을 포함한 KID24 변이체 분자의 어떤 단편 역시 이 정의에 포함된다.
"항체"는 면역글로불린 분자의 가변부에 위치한 적어도 하나의 항원 인식부위를 통하여 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등과 같은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에 사용되는 용어는 무결 폴리클로날 또는 모노클로날 항체뿐만 아니라 그것의 단편(예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단쇄(ScFv), 그것의 돌연변이체, 자연적으로 발생하는 변이체, 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 가진 항체 부분을 포함한 융합 단백질, 사람화 항체, 키메라 항체, 및 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 어떤 다른 변형된 형태의 면역글로불린 분자를 포함한다.
"모노클로날 항체"는 모노클로날 항체가 항원의 선택적 결합에 관여하는 아미노산(자연적으로 발생하는 그리고 비-자연적으로 발생하는)으로 구성된 동종 항체 집단을 지칭한다. 모노클로날 항체는 단일 항원성 부위에 대하여 유도되어, 고도로 특이적이다. 용어 "모노클로날 항체"는 무결 모노클로날 항체 및 전체-길이 모노클로날 항체뿐만 아니라 그것의 단편(예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단쇄(ScFv), 그것의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 사람화 모노클로날 항체, 키메라 모노클로날 항체, 및 필요한 특이성과 항원에 결합하는 능력의 항원 인식 부위를 포함하는 어떤 다른 변형된 형태의 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체의 공급원 또는 그것이 만들어지는 방식(예를 들면, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 형질전환 동물 등)에 대하여 한정되는 것을 의도하지 않는다. 이 용어는 전체 면역글로불린뿐만 아니라 "항체"의 정의로 전술한 단편 등을 포함한다.
"사람화" 항체는 비-사람 종의 면역글로불린에서 유래된 항원 결합 부위와 사람 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초한 분자의 남은 면역글로불린 구조를 가진, 일반적으로 재조합 기술을 사용하여 제조한, 키메라 분자를 지칭한다. 항원-결합 부위는 불변 도메인에 융합된 완전한 가변 도메인이나 가변 도메인에서 적합한 틀 영역에 이식된 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 항원 결합 부위는 야생형이거나 하나 이상의 아미노산 치환에 의하여 변형될 수 있다. 이것은 사람 개체에서 면역원인 불변부를 제거하지만, 외래 가변부에 대한 면역반응의 가능성은 남아있다(LoBuglio, A. F. et al., (1989) Proc Natl Acad Sd USA 86:4220-4224). 다른 접근법은 사람 유래 불변부를 제공하는 것뿐만 아니라 그것들을 사람 형태에 가능한 한 가깝게 재형성하기 위하여 가변부를 변형하는 것에 초점을 맞춘다. 중쇄 및 경쇄의 가변부는 문제의 항원에 다양하게 반응하고 결합 능력을 결정 하는 세 상보성 결정 부위(CDR)를 함유하고, 주어진 종들에서 상대적으로 보존되고 CDR의 스캐폴딩을 후보로 제공하는 4 개의 틀 영역(FR)의 양측면에 인접해 있다고 알려져 있다. 비-사람 항체가 특정 항원에 관하여 제조되면, 가변부는 비-사람 항체에서 유래된 CDR을 변형된 사람 항체에 존재하는 FR에 이식함으로써 "재형성" 또는 "사람화"될 수 있다. 다양한 항체에 대한 이 접근법의 사용은 문헌(Sato, K., et al., (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L., et al., (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen, M., et al., (1988) Science 239:1534-1536; Kettleborough, C.A., et al., (1991) Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H., et al, (1991) Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D., et al., (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:4181-4185; Tempest, P. R., et al., (1991) Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S., et al., (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873; Carter, P., et al., (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289; 및 Co, M. S. et al., (1992) J Immunol 148:1149-1154)에 보고되었다. 일부 구체예에서, 사람화 항체는 모든 CDR 서열을 보존한다(예를 들면, 마우스 항체의 6개의 모든 CDR을 함유하는 사람화 마우스 항체). 다른 구체예에서, 사람화 항체는 원래의 항체에 관하여 변형된 하나 이상의 CDR(한 개, 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 여섯 개)을 가지며, 이것을 또한 원래 항체의 하나 이상의 CDR"로부터 유래된" 하나 이상의 CDR이라고 명명한다.
항체 또는 폴리펩티드에 "특이적으로 경합"하거나 "우선적으로 결합하는"(본원에서 호환가능하게 사용된다) 에피토프는 당업계에서 잘 이해하는 용어이며, 이 러한 특이적 또는 우선적 결합을 결정하는 방법 또한 당업계에 잘 공지되어 있다. 분자는 그것이 다른 세포 또는 물질과 반응하는 것보다 특정 세포 또는 물질과 더 자주, 더 빠르게, 더 오랜 기간 및/또는 더 큰 친화력으로 반응하거나 결합하면 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타낸다고 말한다. 항체는 그것이 다른 물질과 결합하는 것보다 더 큰 친화력, 결합력, 더 용이하게, 및/또는 더 오랜 기간 결합하면 표적에 "특이적으로 결합"하거나 "우선적으로 결합한다". 예를 들면, KID24 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는 그것이 다른 KID24 에피토프 또는 비-KID24 에피토프에 결합하는 것보다 더 큰 친화력, 결합력으로, 더 용이하게, 및/또는 더 오랜 기간 이 KID24 에피토프와 결합하는 항체이다. 또한, 이 정의에 따르면 예를 들면 첫 번째 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체(또는 부분 또는 에피토프)는 두 번째 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 없다고 이해된다. 이와 같이, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 반드시 배타적 결합일 필요는 없다(포함할 수는 있지만). 일반적으로, 반드시 그러한 것은 아니지만, 결합에 대한 언급은 우선적 결합을 의미한다.
"면역학적으로 활성이 있는" 에피토프와 관련한 용어 "면역학적으로 활성"은 다른 조건 하, 예를 들면 에피토프가 감소하고 변성하는 상태에 놓인 후 에피토프에 결합하는 항체의 능력을 지칭한다.
다른 생물학적 기능은, 한정하는 것은 아니지만, (한정하는 것은 아니지만, 췌장, 결장, 폐 또는 전립선 암세포를 포함한 암세포 상의 KID24를 포함한) KID24에 결합하는 능력; 시험관내 또는 생체내에서 살아있는 세포(특히 암세포)의 표면 에 노출된 KID24의 부분에 결합하는 능력; KID24를 발현하는 암세포(예를 들면 췌장, 결장, 폐 또는 전립선 암세포)에 화학치료제를 전달하는 능력; KID24를 발현하는 암세포에 치료제 또는 검출가능한 마커를 전달하는 능력을 포함한, 항-KID24 항체와 연관된다. 본원에 논의한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드(항체를 포함한) 하나 이상의 이러한 특징을 가질 수 있다.
"항-KID24 등가 항체" 또는 "항-KID24 등가 폴리펩티드"는 항-KID24 항체와 연관된 하나 이상의 생물학적 기능, 예를 들면 결합 특이성을 가진 항체 또는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "제제"는 생물학적, 약학적, 또는 화학적 화합물을 지칭한다. 무한정 예는 단순 또는 복합 유기 또는 무기 분자, 펩티드, 단백질, 올리고뉴크레오티드, 항체, 항체 유도체, 항체 단편, 비타민 유도체, 탄수화물, 독소, 또는 화학치료 화합물을 포함한다. 다양한 화합물 즉 소분자 및 올리고머(예를 들면, 올리고펩티드 및 올리고뉴클레오티드), 및 다양한 중심 구조에 기반한 합성 유기 화합물은 합성될 수 있다. 게다가, 다양한 천연 공급원은 식물 또는 동물 추출물 등과 같은 스크리닝을 위한 화합물을 제공할 수 있다. 당업자는 본 발명의 제제의 구조적 성질에 관하여 제한이 없다고 용이하게 인식할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 제제는 무작위로 선택되거나 합리적으로 선택되거나 설계할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 제제가 KID24와 그것의 천연 결합 파트너 또는 공지된 항체와의 결합과 관련된 특정 서열을 고려하지 않고 무작위로 선택될 때 제제가 무작위로 선택되었다고 말한다. 무작위로 선택된 제제의 예는 화학적 라이브러리 또는 펩티드 조합 라이브러리의 사용이다.
본원에 사용된 바와 같이, 제제가 표적 부위의 서열 및/또는 제제의 작용과 연계된 그것의 입체형태를 고려하는 비-무작위 기초로 선택될 때 제제는 합리적으로 선택되거나 설계되었다고 말한다. 항-KID24 제제와 관련하여, 현재 항체가 유도될 수 있는 KID24 상의 적어도 세 에피토프가 있으며, 따라서 KID24/항-KID24 상호작용을 차단하는 제제의 적어도 세 작용 부위가 있다고 믿어진다. 본 발명은 또한 현재 알려져 있든지 나중에 동정되든지 간에 다른 리간드 및 그것들의 활성 KID24-상호작용 부위가 또한 본 발명의 범주 내에 포함되더라도, KID24와 그것의 천연 결합 파트너 간의 상호작용 부위에 작용하는 제제를 포함한다. 제제는 수용체/리간드 및/또는 KID24/항-KID24 항체 복합체의 접촉 부위를 구성하는 펩티드 서열을 이용함으로써 합리적으로 선택되거나 합리적으로 설계될 수 있다. 예를 들면, 합리적으로 선택되는 펩티드 제제는 그것이 그것의 천연 환경에서 살아있는 세포의 표면에 노출될 때 아미노산 서열이 KID24에 나타난 에피토프와 일치하는 펩티드일 수 있다. 이러한 제제는 원하는 경우 항-KID24 항체 또는 천연 리간드에 결합함으로써 항-KID24 항체와 KID24의 결합, 또는 KID24와 그것의 천연 리간드의 결합을 감소 또는 차단할 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 항체와 관련된 용어 "표지된"은 검출가능한 물질, 예를 들면 방사성 제제 또는 형광물질(예를 들면, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 또는 피코에리트린(PE))을 항체에 결합시킴으로서 항체의 직접적 표지뿐만 아니라 검출가능한 물질과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접적 표 지를 포함하는 것을 의도한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 항체와 관련된 용어 "결합"은 제제와의 공유 및 비공유 부착 또는 결합을 포함한다. 항체는 통상의 플랫폼에 대한 부착을 통하여 직접 결합 또는 간접 결합에 의하여 제제(예를 들면, 화학치료제)와 결합할 수 있어서, 항체는 항체가 결합하는 암세포에 제제의 국소화를 유도하고, 항체와 제제는 생리학적 조건 하에서 실질적으로 분리되지 않아서, 제제는 항체가 결합하는 동일한 암세포에 표적화되지 않거나 제제의 효능은 감소하지 않는다.
"생물학적 샘플"은 개체로부터 얻은 다양한 샘플 유형을 포함하고 진단 또는 모니터 분석에 사용될 수 있다. 이 정의는 침, 혈액 및 생물학적 기원의 다른 액체 샘플, 생검 표본 또는 조직 배양물 또는 그것으로부터 유래된 세포와 같은 고체 조직 샘플, 및 그것의 자손, 예를 들면 난소, 폐, 전립선, 췌장, 결장, 및 유방조직의 바람직한 구체예에서 암이 있는 것으로 의심되는 개체에서 수집한 조직 샘플에서 얻은 세포를 포함한다. 이 정의는 또한 획득한 후 어떤 방식으로, 예를 들면 시약을 통한 처리, 가용화 또는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 어떤 성분의 농축, 또는 절단 목적을 위하여 반고체 또는 고체 기질에 끼워넣기로 조작된 샘플을 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 임상 샘플을 포함하고, 또한 배양물, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생물학적 유체, 및 조직 샘플 중의 세포를 포함한다.
"숙주세포"는 폴리뉴클레오티드 삽입체의 혼입을 위한 벡터(들)의 수용체일 수 있거나 이었던 각각의 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주세포는 단일 숙 주세포의 자손을 포함하며, 그 자손은 자연적, 우연적, 또는 계획적 돌연변이 때문에 원래의 모세포와 완전히 동일(형태 또는 유전체 DNA 보체에서)할 필요는 없다. 숙주세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)로 생체내에서 트랜스팩션된 세포를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "전이(들)의 진행을 방지 또는 지연시키는 것"은 전이의 진행을 중지, 지연, 방해, 둔화, 지체, 안정화, 및/또는 연기를 의미한다. 이 지연은 암 및/또는 치료받는 개체의 병력에 따라서 다양한 길이의 시간일 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 충분한 또는 유의한 지연은 사실상 개체가 전이를 진행하지 않는 방지를 포함한다.
한 구체예에서, 약학적 조성물의 "유효량"은, 한정하는 것은 아니지만, (예를 들면, 유방 또는 전립선암과 같은 암에서) 종양의 크기를 줄어들게 하는 것과 같은 임상 결과, 암세포 성장의 지체, 전이의 진행의 지연, 질환에서 유래한 증상의 감소, 질환으로 고생하는 자들의 생활의 질의 증가, 질환을 치료하는 데 필요한 다른 의약의 투여량의 감소, 표적화 및/또는 내재화를 통하여 다른 의약의 효과의 개선, 질환의 진행의 지연, 및/또는 개체 생존의 연장을 포함한 유리한 또는 원하는 결과에 영향을 미치기에 충분한 양이다. 유효량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적상, 약물, 화합물, 또는 약학적 조성물의 유효량은 암세포의 증식을 감소(또는 암세포를 파괴)시키고 직접 또는 간접적으로 암세포의 전이의 진행, 또는 성장의 감소 및/또는 지연시키기에 충분한 양이다. 일부 구체예에서, 약물, 화합물, 또는 약학적 조성물의 유효량은 다른 약물, 화합물, 또는 약학적 조 성물과 함께 얻을 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 따라서, "유효량"은 하나 이상의 화학치료제를 투여하는 의미로 고려될 수 있으며, 단일 제제는 하나 이상의 다른 제제와 함께 원하는 결과가 얻어질 수 있거나 얻어진다면, 유효량으로 제공된 것으로 고려될 수 있다. 개체의 필요량은 다양하지만, 각 성분의 유효량의 최적의 범위를 결정하는 것은 당업계의 기술범위 내에 있다. 전형적인 투여량은 0.1 내지 100 mg/kg/체중을 포함한다. 바람직한 투여량은 1 내지 100 mg/kg/체중을 포함한다. 바람직한 투여량은 10 내지 20 mg/kg/체중 및 10 내지 100 mg/kg/체중을 포함하고, 가장 바람직한 투여량은 약 1 내지 10 mg/kg/체중을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산 분자 또는 제제, 항체, 조성물 또는 세포 등은 핵산 분자 또는 제제, 항체, 조성물 또는 세포 등이 그것의 원래 공급원으로부터의 오염 핵산 분자 또는 제제, 항체, 조성물 또는 세포로부터 실질적으로 분리될 때 "분리되었다"고 말한다.
"개체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 사람이다. 포유동물은, 한정하는 것은 아니지만, 가축, 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 마우스 및 래트를 포함한다.
용어 "폴리펩티드", "올리고펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 어떤 길이의 아미노산의 폴리머를 지칭하는 것으로 본원에서 혼환하여 사용한다. 폴리머는 선형이거나 측쇄가 있을 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산이 개입될 수 있다. 이 용어는 또한 자연적으로 또는 개입에 의하여, 예를 들면 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 어떤 다른 조작 또는 변형, 예를 들면 표지화 성분과의 콘쥬게이션으로 변형된 아미노산 폴리머를 포함한다. 또한, 예를 들면 하나 이상의 아미노산 유사체(예를 들면 비천연형의 아미노산 등을 포함)를 함유한 폴리펩티드뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형들이 이 정의에 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체에 기초하기 때문에, 폴리펩티드는 단일 사슬 또는 결합 사슬로 발생할 수 있는 것으로 이해된다.
항체의 "가변부"는 항체 경쇄의 가변부 또는 항체 중쇄의 가변부를 단독으로 또는 합하여 지칭한다.
항체의 "불변부"는 항체 경쇄의 불변부 또는 항체 중쇄의 불변부를 단독으로 또는 합하여 지칭한다.
본원에 설명된 KID24 펩티드 작용제, 길항제 및 조절자(항-KID24 항체 포함)의 펩티드모방체는 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 이러한 펩티드모방체는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 자연에서 통상 발견되지 않은 아미노산 잔기, 예를 들면 아미노산의 D 이성질체 또는 아미노산의 N-알킬화된 종으로 치환된 펩티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 펩티드모방체는 KID24 펩티드 작용제, 길항제 또는 조절자 중의 적어도 한 아미드 결합(--C(.dbd.O)--NH--)을 아미드 이소스테르로 대체함으로써 구성된다. 적합한 아미드 이소스테레는 --CH.sub.2--NH--, --CH.sub.2--S--, --CH.sub.2--S(O).sub.n--(n은 1 또는 2), -CH.sub.2--CH.sub.2--, --CH.dbd.CH--(E 또는 Z), --C(.dbd:O)--CH.sub.2--, --CH(CN)-NH--, --C(OH)-CH.sub.2--, 및 --O--C(.dbd.O)--NH--를 포함한다. 아미드 이소스테르로 치환하기 위한 적합한 후보물질인 KID24 펩티드 작용제, 길항제 또는 조절자의 아미드 결합 은 KID24 펩티드 작용제, 길항제 또는 조절자 처리의 의도하는 피험체의 내생 에스테라제 또는 프로테아제에 의하여 가수분해가능한 결합을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수한(즉, 오염물질이 없는), 더 바람직하게는 적어도 90% 순수한, 더 바람직하게는 적어도 95% 순수한, 더 바람직하게는 적어도 98% 순수한, 더 바람직하게는 적어도 99% 순수한, 또는 더 순수한 물질을 지칭한다.
"독소"는 세포 내의 역반응에 영향을 미치는 어떤 물질을 지칭한다. 예를 들면, 암세포로 향하는 독소는 암세포에 역, 가끔은 유해 효과를 가진다. 독소의 예는, 한정하는 것은 아니지만, 방사성동위원소, 칼리케아미신, 및 메이탄시노이드를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "치료"는 이로운 또는 원하는 결과 그리고 바람직하게는 임상 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적상, 이로운 또는 원하는 임상 결과는, 한정하는 것은 아니지만, 다음 중 하나 이상을 포함한다: 암세포 또는 다른 병든 세포의 증식(또는 파괴)의 감소, 암에서 발견되는 암세포의 전이의 감소, 종양의 크기의 축소, 질환에서 기인하는 증상의 감소, 질환으로 고생하는 자들의 생활의 질 증가, 질환을 치료하는 데 필요한 다른 의약의 투여량의 감소, 질환의 진행의 지연, 및/또는 개체의 생존의 연장.
본원에 사용되는 바와 같이, "치료제"는 항-종양 약물, 독소 또는 세포독소, 세포독소 제제, 및 방사성 제제를 포함한 치료(여기에서는, 일반적으로 암의 경우에)에 유용한 어떤 제제를 의미한다.
"활성 면역반응"은 정맥내, 근육내, 피하, 또는 첨가제와 함께 또는 없이 투여하는 다른 방식으로 항원, 또는 항원을 코딩하는 DNA 벡터를 숙주 포유동물에 투여한 것에 반응하여 항원에 대하여 유도된 생체내에서 항체의 발생 및 지속적 생산을 지칭한다. 활성 면역반응은 또한 면역반응의 다른 양태, 예를 들면 세포 면역반응을 포함할 수 있다.
III. 항체 및 폴리펩티드를 제조하는 방법
모노클노날 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 사용할 수 있는 한 방법은 Kohler 및 Milstein의 방법, Nature 256:495-497 (1975) 또는 그것의 변형이다. 전형적으로, 모노클로날 항체는 비-사람 종, 예를 들면 마우스에서 발생한다. 일반적으로, 마우스 또는 래트가 면역화에 사용되지만 다른 동물들도 사용될 수 있다. 항체는 마우스를 면역원성 양의 세포, 세포 추출물, 또는 사람 KID24를 함유한 단백질 제제로 면역화함으로써 생산된다. 면역원은, 한정하는 것은 아니지만, 1차 세포, 배양된 세포주, 암세포, 핵산, 또는 조직일 수 있다. 한 구체예에서, 사람 태아 신장 상피 세포를 사용한다. 다른 구체예에서, 사람 방광 또는 췌장 전구세포를 사용한다. 사람 태아 신장세포를 분리하고 배양하기 위한 방법은 실시예 1에서 상세히 설명한다. 면역화에 사용되는 세포, 예를 들면 사람 태아 신장세포는 그것들을 면역원으로 사용하기 잔에 일정 시간 동안(적어도 24 시간) 배양될 수 있다. 세포(예를 들면, 사람 태아 신장세포)는 단독 또는 리비(Ribi)와 같은 비-변성 첨가제와 조합하여 면역원으로 사용될 수 있다. 대체로, 세포는 면역원으로 사용될 때 무결한 상태 그리고 바람직하게는 살아있어야 한다. 무결한 세포는 항원 이 면역화된 동물에 의하여 파열된 세포보다 더 잘 검출될 수 있게 할 수 있다. 변성 또는 거친 첨가제, 예를 프로인트 첨가제의 사용은 사람 태아 신장 또는 다른 세포를 파열할 수 있으며 따라서 방해된다. 면역원은 주기적 간격으로, 예를 들면 2주 또는 1주 마다 복수회 투여될 수 있거나 동물(예를 들면, 재조합 조직)의 생존능력을 유지하는 방식으로 투여될 수 있다. 실시예 2는 항-KID24 항체를 발생시키는 데 사용되는 방법을 설명하며 KID24에 결합하는 다른 모노클로날 항체를 발생시키는 데 사용될 수 있다.
한 구체예에서, KID24에 결합하는 모노클로날 항체는 면역원으로서 KID24를 과발현하는 숙주세포를 사용함으로써 얻어진다. 이러한 세포는, 한정하는 것이 아니라 예시의 방법으로, 사람 태아 신장세포 및 사람 췌장 암세포를 포함한다.
항체 반응을 모니터하기 위하여, 작은 생물학적 샘플(예를 들면, 혈액)을 동물에서 얻어서 면역원에 대한 항체가를 시험할 수 있다. 비장 및/또는 일부 큰 림프절을 제거하여 단일 세포로 떼어놓을 수 있다. 원한다면, 세포 현탁액을 항원으로 코팅된 플레이트 또는 웰에 옮겨 스크린할 수 있다(비-특이적으로 부착된 세포의 제거 후). 항원에 특이적인 B 세포 발현 막-결합 면역글로불린은 플레이트에 결합할 것이고 나머지 현탁액으로 세척되지 않는다. 그 다음, 결과의 B 세포, 또는 모든 분리된 비장 세포는 골수종 세포와 융합될 수 있다(예를 들면, X63-Ag8.653 및 Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, CA로부터 얻은 세포들). 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 비장 또는 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 형성하는 데 사용될 수 있다. 그 다음, 하이브리도마를 선택 배지(예를 들 면, 히포크산틴, 아미노프테린, 티미딘 배지, 달리 말하면 "HAT 배지"로 공지된)에 배양한다. 그 다음, 하이브리도마를 희석을 제한하여 플레이팅하고, FACS 또는 면역조직화학법(IHC 스크리닝)을 사용하여 면역원(예를 들면, 사람 태아 신장 세포의 표면, 암세포주의 표면, Ag-KID24 등)에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 분석한다. 그 다음, 선택된 모노클로날 항체-분비 하이브리도마를 시험관내에서(예를 들면, 조직 배양 용기 또는 실관 반응기에서) 또는 생체내에서(예를 들면, 마우스의 복수) 배양한다. 실시예 3은 항-KID24 항체를 획득하고 스크린하기 위하여 사용되는 방법에 대한 상세한 내용을 더 제공한다.
세포 융합 기술에 대한 다른 대안으로서, EBV 불멸화된 B 세포는 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 데 사용될 수 있다. 하이브리도마를 증량하고 원하는 경우 서브클로닝하고, 상청액을 종래 과정(예를 들면, FACS, IHC, 방사능면역분석, 효소 면역분석, 형광면역분석 등)으로 항-면역원 활성에 대하여 분석한다.
다른 대안에서, 모노클로날 항체 항-KID24 및 어떤 다른 등가 항체를 서브시퀀싱하여 당업계에 공지된 어떤 수단(예를 들면, 사람화, 완전한 사람 항체를 생산하기 위한 형질전환 마우스의 사용, 파지 디스플레이 기술 등)으로 재조합 생산할 수 있다. 한 구체예에서, 항-KID24 모노클로날 항체를 시퀀싱하고 그 후 발현 또는 증식을 위한 벡터에 그 폴리뉴클레오티드 서열을 클로닝한다. 관심있는 항체를 코딩하는 서열은 숙주세포 중의 벡터에 유지할 수 있고, 그 후 숙주세포를 증량하고 향수 사용을 위하여 동결한다.
모노클로날 항체 항-KID24 및 어떤 다른 등가 항체의 폴리뉴클레오티드 항체 는 "사람화" 항체를 생성하고, 친화도, 도는 항체의 다른 특성들을 개선하는 데 사용될 수 있다. 항체를 사람화하는 일반적 원리는 항체의 비 사람 잔여체를 사람 항체 서열과 교환하는 동안 항체의 항원-결합 부위의 기본 서열을 보유하는 것을 포함한다. 모노클로날 항체를 사람화하는 4 가지 일반 단계가 있다: (1) 시작하는 항체 경쇄 및 중쇄 가변부의 뉴클레오티드 및 예상되는 아미노산 서열을 결정하는 단계, (2) 사람화 항체를 설계하는 단계, 즉 사람화 과정 중에 어떤 항체 틀 영역을 사용할지 결정하는 단계, (3) 실질적 사람화 방법/기술 및 (4) 사람화 항체의 트랜스팩션 및 발현. 예를 들면, 미국특허 제4,816,567호; 제5,807,715호; 제5,866,692호; 및 제6,331,415호 참조.
사람 불변부에 융합된 설치류 또는 변형된 설치류 V 영역 및 그것들과 연관된 상보성 결정 영역(CDR)을 가진 키메라 항체를 포함한, 비-사람 면역글로불린에서 유래된 항원-결합 부위를 포함한 많은 "사람화" 항체 분자가 설명되었다. 예를 들면, 문헌(Winter et al. Nature 349:293-299 (1991), Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sd. USA 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. J Immunol 138:4534-4538 (1987), 및 Brown et al. Cancer Res. 47:3577-3583 (1987)) 참조. 다른 참고문헌은 적합한 사람 항체 불변부와 융합하기 전에 사람 지지 틀 영역(FR)에 이식된 설치류 CDR을 설명한다. 예를 들면, 문헌(Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988), Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988), 및 Jones et al. Nature 321:522-525 (1986))을 설명하라. 다른 참고문헌은 재조합으로 붙인 설치류 틀 영역에 의하여 지지되는 설치류 CDR을 설명한다. 예를 들면, 유럽특허공보 제519,596 호 참조. 이들 "사람화" 분자는 사람 수용체에서 이들 부분의 치료적 용도의 지속성과 효율성을 제한하는 설치류 항-사람 항체 분자에 대한 원하지 않는 면역반응을 최소화하도록 설계된다. 사용할 수 있는 다른 사람화 항체 방법은 문헌(Daugherty et al., Nucl. Acids Res., 19:2471-2476 (1991) 및 미국특허 제6,180,377호; 제6,054,297호; 제5,997,867호; 및 제5,866,692호)에 설명된다.
본 발명은 또한 이 발명의 항체의 단쇄 가변부 단편("scFv"), 예를 들면 mu-항-KID24를 포함한다. 단쇄 가변부 단편은 짧은 연결 펩티드를 사용하여 경쇄 및/또는 중쇄 가변부를 연결하여 만든다. 문헌(Bird et al. (1988) Science 242: 423-426)은 한 가변부의 카르복시 말단과 다른 가변부의 아미노 말단 사이의 약 3.5 nm의 교량 역할을 하는 연결 펩티드의 예를 설명한다. 다른 서열의 링커를 설계하여 사용하였다. Bird et al. (1988). 링커는 추가 기능, 예를 들면 약물의 부착 또는 고체 지지체의 부착을 위하여 번갈아 변형될 수 있다. 단쇄 변이체는 재조합으로 또는 합성하여 생산할 수 있다. scFv의 합성 생산의 경우, 자동화 합성기를 사용할 수 있다. scFv의 재조합 합성의 경우, scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유한 적합한 플라스미드를 적합한 숙주세포, 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포와 같은 진핵세포, 또는 대장균과 같은 원핵세포에 도입할 수 있다. 관심있는 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 리게이션과 같은 일반적인 조작으로 만들 수 있다. 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 결과의 scFv를 분리할 수 있다.
본 발명은 그것들의 특성에 유효하게 영향을 미치지 않는 기능적으로 등가 항체 및 폴리펩티드 및 증가된 또는 감소된 활성을 가진 변이체를 포함한, KID24 작용제, 길항제, 조절자 및 항체의 변형을 포함한다. 폴리펩티드의 변형은 기술분야에서 일상적으로 실행되므로 본원에서 상세하게 설명할 필요는 없다. 변형된 폴리펩티드의 예는 아미노산 잔기의 보존적 치환, 기능적 활성을 현저히 해롭게 변화시키지 않는 아미노산의 하나 이상의 결실 또는 첨가, 또는 화학물질 유사체의 사용을 가진 폴리펩티드를 포함한다. 서로서로 상보적으로 치환될 수 있는 아미노산 잔기는, 한정하는 것은 아니지만, 글리신/알라닌; 발린/이소류신/류신; 아스파라긴/글루타민; 아스파르트산/글루탐산; 세린/트레오닌; 리신/아르기닌; 및 페닐알라닌/티로신을 포함한다. 이들 폴리펩티드는 또한 다른 번역후 변형, 예를 들면 다른 당과의 글리코실화, 아세틸화, 및 인산화가 된 폴리펩티드뿐만 아니라 글리코실화된 그리고 비-글리코실화된 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 아미노산 치환은 보존적인데, 즉 치환된 아미노산은 원래의 아미노산의 것과 유사한 화학적 특성을 가진다. 이러한 보존적 치환은 당업계에 공지되어 있으며, 예들은 상기에 제공하였다. 아미노산 변형은 하나 이상의 아미노산을 변화 또는 변형시키는 것에서부터 가변부와 같은 영역을 완전히 재설계하는 것까지 다양할 수 있다. 가변부에서의 변화는 결합 친화도 및/또는 특이성을 변경할 수 있다. 변형의 다른 방법은, 한정하는 것은 아니지만, 효소적 수단, 산화적 치환 및 킬레이션을 포함한, 당업계에 공지된 결합 기술을 사용하는 것을 포함한다. 예를 들면 면역분석을 위한 표지의 부착, 예를 들면 면역분석을 위한 방사능활성 부분의 부착에 대한 변형들을 사용할 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 당업계에 확립된 과정을 사용하여 만들며 당업계에 공지된 표준 분석을 사용하여 스크린할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 및 항체의 하나 이상의 단편 또는 영역을 포함한 융합 단백질을 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄 가변부의 적어도 10 연속 아미노산 및 중쇄 가변부의 적어도 10 아미노산을 포함한 융합 단백질을 제공한다. 다른 구체예에서, 융합 폴리펩티드는 이종 면역글로불린 불변부를 함유한다. 다른 구체예에서, 융합 폴리펩티드는 본원에 설명된 바와 같이 ATCC에 기탁된 하이브리도마에서 생산된 항체의 경쇄 가변부 및 중쇄 가변부를 함유한다. 본 발명의 목적상, 항체 융합 단백질은 하나 이상의 항-KID24 폴리펩티드 및 천연분자에서 그것이 부착되지 않는 다른 아미노산 서열, 예를 들면 이종 서열 또는 다른 영역으로부터의 상동 서열을 함유한다.
항-KID24 폴리펩티드, 및 다른 KID24 작용제, 길항제 및 조절자는 당업계에 공지된 방법에 의하여 예를 들면 합성하여 또는 재조합으로 제조할 수 있다. KID24 작용제, 길항제 및 조절자를 생산하기 위한 한 방법은 폴리펩티드의 화학적 합성과 이어서 천연 입체형태를 얻기에 적합한 산화 조건 하에서 처리, 즉 정확한 이황화 결합을 포함한다. 이것은 당업자에게 잘 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. (Kelley, R. F. & Winkler, M. E. Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow, J. K., ed., Plenum Press, N. Y., vol. 12, pp 1-19 (1990); Stewart, J. M. & Young, J. D. Solid Phase Peptide Synthesis Pierce Chemical Co. Rockford, IU. (1984) 참조; 또한 미국특허 제4,105,603호; 제3,972,859호; 제3,842,067호; 및 제3,862,925호 참조).
본 발명의 폴리펩티드는 고체상 펩티드 합성을 사용하여 편리하게 제조할 수 있다(Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149 (1964); Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5132 (1985)).
또 다른 대안에서, 특이적 사람 면역글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 상업적으로 구입가능한 마우스를 사용하여 완전한 사람 항체를 얻을 수 있다. 또한, 더 바람직한(예를 들면, 완전한 사람 항체) 또는 더 설치류 면역반응을 일으키도록 설계된 형질전환 동물은 사람화 또는 사람 항체의 발생에 사용할 수 있다. 이러한 기술의 예는 Abgenix, Inc. (Fremont, CA)의 XenomouseTM 및 Medarex, Inc. (Princeton, NJ)의 HuMAb-Mouse® 과 TC MouseTM이다.
대안으로서, 항체를 재조합으로 만들어 당업계에 공지된 어떤 방법을 사용하여 발현시킬 수 있다. 먼저 숙주동물에서 만들어진 항체를 분리하고, 유전자 서열을 얻고, 그 유전자 서열을 사용하여 숙주세포(예를 들면, CHO 세포)에서 재조합으로 항체를 발현시킴으로써 항체를 재조합으로 제조할 수 있다. 사용할 수 있는 다른 방법은 식물(예를 들면, 담배) 또는 형질전환 우유에서 항체 서열을 발현시키는 것이다. 식물 또는 우유에서 재조합으로 항체를 발현하기 위한 방법이 개시되었다. 예를 들면, 문헌(Peeters, et al. (2001) Vaccine 19:2756; Lonberg, N. and D. Huszar (1995) Int.Rev.Immunol 13:65; 및 Pollock, et al.(1999) J Immunol Methods 231:147)을 참조하라. 항체의 유사체, 예를 들면 사람화, 단쇄 등을 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,565,332호; 제5,580;717호; 제5,733,743호; 제6,265,150호; 및 Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994)를 참조하라.
관심있는 항체 또는 단백질은 당업자에게 잘 공지된 에드먼 분해법으로 시퀀싱할 수 있다. 질량분석법 또는 에드먼 분해법으로부터 생성된 펩티드 정보는 관심있는 단백질을 클로닝하는 데 사용되는 프로브 또는 프라이머를 설계하는 데 사용될 수 있다.
관심있는 단백질을 클로닝하는 대안적 방법은 관심있는 항체 또는 단백질을 발현하는 세포를 위하여 정제된 KID24 또는 그것의 일부를 사용하여 "패닝(panning)"하는 것이다. "패닝" 과정은 관심있는 항체 또는 단백질을 발현하는 조직 또는 세포로부터 cDNA 라이브러리를 얻은 과정, 2차 세포 유형에서 cDNA를 과발현하는 과정, 및 KID24에 특이적으로 결합하는 2차 세포 유형의 트랜스팩션된 세포를 스크리닝하는 단계로 수행된다. "패닝"에 의하여 세포 표면 단백질을 코딩하는 포유동물 유전자를 클로닝하는 데 사용되는 방법의 상세한 설명은 당업계에서 확인할 수 있다. 예를 들면, 문헌(Aruffo, A. and Seed, B. Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 84, 8573-8577 (1987) 및 Stephan, J. et al., Endocrinology 140: 5841-5854 (1999))을 참조하라.
항-KID24 항체, 및 다른 KID24 펩티드 작용제, 길항제 및 조절자를 코딩하는 cDNA는 당업계의 표준방법에 따라서 특정 세포 유형의 mRNA를 역전사함으로써 얻을 수 있다. 구체적으로, 문헌(Sambrook, et al. 상기 참조)에 나타낸 과정에 따라서 다양한 용해 효소 또는 화학 용액을 사용하여 mRNA를 분리할 수 있고, 또는 제조업 자가 제공하는 동봉한 설명서를 따라서 상업적으로 구입할 수 있는 핵산-결합 수지로 추출할 수 있다(예를 들면, Qiagen, Invitrogen, Promega). 그 다음, 합성된 cDNA를 발현 벡터에 도입하여 두 번째 유형의 세포에 관심있는 항체 또는 단백질을 생산한다. 이것은 발현 벡터는 에피솜 또는 염색체 DNA의 구성부분으로서 숙주세포에서 복제가능하여야 한다는 것을 의미한다. 적합한 발현 벡터는, 한정하는 것은 아니지만, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스, 및 코스미드를 포함한 플라스미드, 바이러스 벡터를 포함한다.
관심있는 폴리뉴클레오티드를 함유한 벡터를 일렉트로포레이션, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 다른 물질을 사용하는 트랜스팩션; 미세발사체 충격; 리포펙션; 및 감염(예를 들면, 벡터가 백시니아 바이러스와 같은 감염제인 경우)을 포함한 많은 적합한 수단 중 어떤 것으로 숙주세포에 도입할 수 있다. 도입 벡터 또는 폴리뉴클레오티드의 선택은 흔히 숙주세포의 특징에 달려있을 것이다.
이종 DNA를 과발현할 수 있는 어떤 숙주세포를 관심있는 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 분리하기 위하여 사용할 수 있다. 포유동물 숙주세포의 무한정한 예는, 한정하는 것은 아니지만, COS, HeLa, 및 CHO 세포를 포함한다. 바람직하게는, 숙주세포는 존재한다면 숙주세포에서 대응하는 내생 항체 또는 단백질의 것보다 약 5배, 더 바람직하게는 10배, 보다 더 바람직하게는 20배 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. KID24에 특이적으로 결합하는 숙주세포를 스크리닝하는 것은 면역분석법 또는 FACS로 이루어진다. 관심있는 항체 또는 단백질을 과발 현하는 세포를 동정할 수 있다.
모 KID24 펩티드 작용제, 길항제 또는 조절자 분자에 비해서 결과 단백질의 아미노산 서열에서 첨가, 결실, 또는 변화를 코딩하는 돌연변이체 KID24 펩티드 작용제, 길항제, 및 조절자를 생산하기 위하여 현재 사용할 수 있는 다양한 기술들이 또한 사용가능하다.
본 발명은 본 발명의 항체의 아미노산 서열을 포함한 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 당업계에 공지된 과정으로 제조할 수 있다. 폴리펩티드는 항체의 단백질가수분해 또는 다른 분해로, 전술한 재조합 방법(즉, 단일 또는 융합 폴리펩티드)으로, 또는 화학합성으로 생산할 수 있다. 항체의 폴리펩티드, 특히 약 50 아미노산의 짧은 폴리펩티드는 화학합성으로 간편하게 제조한다. 화학합성 방법은 당업계에 공지되어 있으며 상업적으로 구입가능하다. 예를 들면, 항-KID24 폴리펩티드는 고체상 방법을 상요한 자동 폴리펩티드 합성기로 제조할 수 있다.
IV, 폴리펩티드 및 모노클로날 항체를 스크리닝하기 위한 방법
KID24에 결합하는 폴리펩티드 및 모노크로날 항체를 스크린하기 위하여 여러 방법을 사용할 수 있다. "결합"은 생물학적으로 또는 면역학적으로 관련된 결합, 즉 면역글로불린 분자가 코딩하는, 또는 폴리펩티드가 향하는 유일한 항원에 특이적인 결합을 지칭하는 것으로 이해된다. 그것은 면역글로불린이 비-특이적 표적에 대하여 매우 높은 농도로 사용될 때 발생할 수 있는 비-특이적 결합을 지칭하지 않는다. 한 구체예에서, 표준 스크리닝 기술을 사용하여 모노클로날 항체를 KID24와 의 결합에 대하여 스크리닝한다. 이 방식으로, 항-KID24 모노클로날 항체를 얻었다. 부다페스트 조약에 따라서, 항-KID24 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 특허기탁 지정번호 PTA #5174로 2003년 5월2일에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁하였다.
KID24와 결합하는 모노클노날 항체를 암조직 및 비-암세포와의 결합에 대하여 스크린한다. 한 구체예에서, KID24와 결합하고, 또한 사람 암 세포 또는 조직과 교차반응하지만, 정상 세포 또는 조직과는 동일한 정도로 교차반응하지 않는 모노클로날 항체를 선택한다. 스크리닝을 위하여 사용할 수 있는 한 방법은 면역조직화학(IHC)이다. 표준 면역조직화학 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Animal Cell Culture, Methods (J.P. Mather and D. Barnes, eds., Academic Press, Vol. 57, Ch. 18 및 19, pp. 314-350, 1998)을 참조하라. 생물학적 샘플(예를 들면, 조직)을 생검, 부검, 또는 검시로부터 얻을 수 있다. KID24가 암세포에만 존재하는 지를 확인하기 위하여, 암으로 고생하는 개체의 다른 비-암 조직 또는 암이 업는 개체의 조직을 대조군으로 사용하면서, 암이 있는 개체의 조직에 KID24의 존재를 검출하는 데 항-KID24 항체를 사용할 수 있다. 조직을 동결하는 동안 손상을 방지하는 고체 또는 반고체 물질(예를 들면, 아가로스 겔 또는 OCT)에 포매한 후 염색하기 위해 절단할 수 있다. 다른 기관 및 다른 등급의 암을 사용하여 모노클로날 항체를 스크린할 수 있다. 스크리닝 목적에 사용할 수 있는 조직의 예는, 한정하는 것은 아니지만, 난소, 유방, 폐, 전립선, 결장, 신장, 피부, 갑상선, 뇌, 심장, 간, 위, 신경, 혈관, 뼈, 상부 소화관, 및 췌장을 포함한다. 스크리닝 목적 에 사용할 수 있는 다른 암 유형의 예는, 한정하는 것은 아니지만, 암종, 선종, 육종, 선육종, 림프종, 및 백혈병을 포함한다.
또 다른 대안에서, 암조직에 특이적인 모노클로날 항체를 스크린하는 데 사용할 수 있다. 암세포, 예를 들면 BT474 (ATCC # HTB-20), MCF7 (ATCC # HTB-22), ES-2 (ATCC # CRL-1978), SKOV3 (ATCC # HTB-77), SKMES-1 (ATCC # HTB-58), CA130 (갈가마귀 전유 폐 선종 세포주), CaLu3 (ATCC # HTB-55), 9926 (갈가마귀 전유 췌장 선종 세포주, AsPC-1 (ATCC # CRL-1682), Hs700T (ATCC # HTB-147), Colo205 (ATCC # CCL-222), HT-29 (HTB-38), Cos7 (ATCC # CRL-1651), RL-65 (ATCC # CRL-10345), A204 (ATCC # HTB-82), G292 (ATCC # CRL-1423), HT1080 (ATCC # CCL-121), MG63 (ATCC # CRL-1427), RD (ATCC # CCL-136), RD-ES (ATCC # HTB-166), SKES-1 (ATCC # HTB-86), SKLMS-1 (ATCC # HTB-88), SKUT-I (ATCC # HTB-114), SW684 (ATCC # HTB-91), SW872 (ATCC # HTB-92), 786-O (ATCC # CRL-1932), A498 (ATCC # HTB-44), Caki-2 (ATCC # HTB-47), 22RV1 (ATCC # CRL-2505), DU145 (ATCC # HTB-81), LNCaP (ATCC # CRL-1740), HMEC (BioWhittaker CC-2251), HuVEC (1차 상피세포), MDA-MB-175-VII (ATCC # HB-25), MDA-MB-361 (ATCC # HB-27), SK-BR-3 (ATTC # HTB-30), 9979 (갈가마귀 전유 폐암 세포주), A549 (ATCC # CCL-185), SW480 (ATCC # CCL-228), SW948 (ATCC # CCL-237), 293 (ATCC # CRL-1573), PC3 (ATCC # CRL-1435), TDH-I (갈가마귀 전유 전립선암 세포주), Hs746T (ATCC # HTB-135), NCI-N87 (ATCC # CRL-5822) 및 각 조직으로부터의 정상 세포를 암조직에 특이적인 모노클로날 항체를 스크린하는 데 사용할 수 있다. 한정하는 것은 아니지 만, 신장, 난소, 유방, 폐, 전립선, 결장, 신장, 피부, 갑상선, 대동맥 평활근을 포함한 다른 기관의 정상 조직으로부터 유래된 1차, 또는 낮은 계대, 세포 배양물을 음성 대조군으로 사용할 수 있다. 암 또는 비-암 세포를 WO 01/43869에 설명된 바와 같이 유리슬라이드 또는 커버슬립, 또는 플라스틱 표면에 성장시킬 수 있거나, CellArrayTM로 제조할 수 있으며, 조직에 대하여 전술한 IHC를 사용하여 항체의 결합을 스크린할 수 있다. 대안적으로, 비-단백질분해 수단을 사용하여 세포를 성장 표면으로부터 제거할 수 있고, 펠렛으로 회전시킨 후, 전술한 IHC 분석을 위하여 포매하고 처리할 수 있다. 세포를 면역결핍 동물에 접종하여 종양이 자라게 한 후, 이 종양을 수확하여, 포매하고 IHC 분석을 위한 조직 공급원으로 사용할 수 있다. 다른 대안에서, 단일 세포를 1차 항체, 형광 분자에 연결된 2차 "리포터" 항체와 인큐베이션하여 스크린하고, 그 다음 형광 활성화 세포-분류(FACS) 기계를 사용하여 분석할 수 있다. 또 다른 대안에서, 살아있는 세포 ELISA를 사용하여 암 세포주(예를 들면 상기에 나열한 것) 및 각각의 조직의 정상 세포에 특이적인 항체를 스크린할 수 있다. 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅한 후 컨플루언시하게 성장시킬 수 있다. 그 다음, 성장 배지를 제거하고 세포를 차단 완충액으로 차단한다. 1차 항체를 첨가한 후 플레이트를 세척할 수 있고, 2차 항체를 첨가하고 기질을 첨가하여 플레이트를 현상할 수 있으며, 플레이트 판독기를 사용하여 색깔 변화를 검출할 수 있다.
몇몇 다른 검출 시스템을 사용하여 조직 절편에 대한 항체의 결합을 검출할 수 있다. 전형적으로, 면역조직화학은 조직에 대한 1차 항체의 결합을 포함하고, 그 다음 1차 항체의 종에 대하여 반응하는 2차 항체를 발생시켜 검출가능한 마커(예를 들면, 양고추냉이 페록시다제, HRP, 또는 디아미노벤제딘, DAB)에 콘쥬게이트하였다. 사용할 수 있는 한 대안적 방법은 폴리클로날 거울상 상보적 항체 또는 폴리MICA이다. D.C. Mangham and P.G. Isaacson (Histopathology (1999) 35(2):129-33)가 설명한 폴리MICA(폴리클로날 거울상 상보적 항체) 기술은 정상 조직 및 암 조직에 대한 1차 항체(예를 들면, 항-KID24 항체)의 결합을 시험하는 데 사용할 수 있다. 몇몇 종류의 폴리MICATM 검출 키트는 더 바인딩 사이트 리미티드(The Binding Site Limited; P.O. Box 4073 Birmingham B29 6AT England)에서 상업적으로 구입할 수 있다. 제품번호 HK004.D는 DAB 크로마젠을 사용하는 폴리MICATM 검출 키트이다. 제품번호 HK004.A는 AEC 크로마젠을 사용하는 폴리MICATM 검출 키트이다. 대안적으로, 1차 항체를 검출가능한 마커로 직접 표지할 수 있다.
적합한 항체를 선택하는 IHC 스크리닝에서의 제 1 단계는 하나 이상의 면역원(예를 들면, 세포 또는 조직 샘플)에 대한 마우스에서 유도된 1차 항체(예를 들면, 항-KID24 항체)의 결합이다. 한 구체예에서, 조직 샘플은 다른 기관의 동결 조직의 절편이다. 세포 또는 조직 샘플은 암이거나 비-암일 수 있다.
동결 조직을 준비하여, 고정하거나 고정하지 않은 채 절단할 수 있고, 당업자에게 공지된 많은 방법 중 어떤 것으로 IHC를 수행하였다. 예를 들면, 문헌(Stephan et al. Dev. Biol. 212: 264-277 (1999), 및 Stephan et al. Endocrinology 140: 5841-54 (1999))을 참조하라.
V. 항-KID24 항체를 특성화하는 방법
몇 가지 방법을 사용하여 항-KID24 항체를 특성화할 수 있다. 한 방법은 그것이 결합하는 에피토프를 확인하는 것이다. 에피토프 맵핑은 다양한 공급원, 예를 들면 Pepscan Systems(Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, The Netherlands)로부터 상업적으로 구입가능하다. 에피토프 맵핑을 사용하여 항-KID24 항체가 결합하는 서열을 결정할 수 있다. 에피토프는 즉 아미노산의 단일 신장에 함유된 선형 에피토프, 또는 단일 신장에 반드시 함유될 필요없는 아미노산의 3차원 상호작용으로 형성된 입체형태의 에피토프일 수 있다. 다양한 길이(예, 적어도 4-6 아미노산 길이)의 펩티드를 분리 또는 합성하여 항-KID24 항체와의 결합 분석에 사용할 수 있다. 세포외 서열에서 유래된 오버랩핑 펩티드를 사용하고 항-KID24 항체에 의한 결합을 결정하여 전체적 스크리닝으로 항-KID24 항체가 결합하는 에피토프를 결정할 수 있다.
항-KID24 항체를 특성화하는 데 사용할 수 있는 또 다른 방법은 항-KID24 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 지를 결정하기 위하여 동일한 항원에 결합하는 것으로 알려진 다른 항체, 즉 KID24와의 경쟁 분석을 사용하는 것이다. KID24에 대한 상업적으로 사용가능한 항체의 예를 사용할 수 있으며 본원에 교시된 결합 분석을 사용하여 확인할 수 있다. 경쟁분석은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 이러한 과정 및 예시적 데이터는 실시예에 더 상세하게 설명한다. 항-KID24 항체를 그것이 결합하는 조직, 암 유형 또는 종양 유형으로 특성화할 수 있 다.
항-KID24 항체를 특성화하는 다른 방법은 그것이 결합하는 항원에 의한다. 다양한 사람 암의 세포 용해물의 웨스턴 블롯에 항-KID24 항체를 사용하였다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 웨스턴 블롯팅은 세포 용해물 및/또는 세포 분획을 변성 또는 비-변성 겔에 러닝하는 단계, 단백질을 니트로셀룰로스 종이에 옮기는 단계, 그 다음 어떤 단배질이 항체와 결합했는지를 확인하기 위하여 항체(예를 들면, 항-KID24 항체)로 블롯을 프로빙하는 단계를 포함할 수 있다. 이 과정은 실시예 4에서 더 상세하게 설명한다. KID24는, 한정하는 것은 아니지만, 결장, 유방, 난소, 췌장 및 폐를 포함한 다른 조직의 다양한 사람 암과 연관된다. KID24의 추가 설명은 실시예 6과 7에 제공된다.
VI. 항-KID24 항체 및 KID24 조절자를 사용하여 암을 진단하는 방법
본원에 개시된 방법으로 제조된 KID24에 대한 모노클로날 항체는, 한정하는 것은 아니지만, 진단 목적상 난소, 유방, 폐, 전립선, 결장, 신장, 췌장, 피부, 갑상선, 뇌, 심장, 간, 위, 신경, 혈관, 뼈, 및 상부 소화관을 포함한 다양한 조직에서 암세포의 존재 또는 부재를 확인하는 데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 방법으로 제조된 KID24에 대한 모노클로날 항체는 또한 고형 종양으로부터 분비된 후 혈액에서 순환하는 암세포의 존재 또는 부재, 또는 그것들의 수준을 확인하는 데 사용될 수 있다. 이러한 순환하는 항원은 본원에 교시된 방법에 따라서 검출되는 능력을 보유하는 무결한 KID24 항원, 또는 그것의 단편일 수 있다. 이러한 검출은 당업계에서 통상적으로 사용하는 표준 방법을 사용하는 FACS 분석으로 이루어질 수 있다.
이들 용도는 KID24와 KID24에 특이적으로 결합하는 항체 간의 복합체의 형성을 포함할 수 있다. 이러한 항체의 예는, 한정하는 것은 아니지만, 지정번호 PTA # 5174로 ATCC에 기탁된 하이브리도마에 의하여 생산된 항-KID24 모노클로날 항체를 포함한다. 이러한 복합체의 형성은 시험관내 또는 생체내일 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 모노클로날 항체 항-KID24는 KID24의 세포외 도메인을 통하여 KID24에 결합할 수 있으며, 그 후 내재화될 수 있다.
본 발명의 진단방법의 바람직한 구체예에서, 항체는 검출가능한 표지를 가진다. 사용할 수 있는 표지의 예는 방사능 제제 또는 형광물질, 예를 들면 플루오로이소티오시아네이트 또는 피코에리트린을 포함한다.
진단 및 치료 목적을 위하여 상업적으로 사용되는 다른 공지된 항체의 경우, 본 발명의 표적 항원은 정상 조직에서 넓게 발현된다. 또한 일부 종양에서 상향조절된다. 따라서, 진단 또는 치료제로 사용되는 본 발명의 항체의 특정 투여량 및 전달 경로는 치료받는 특정 개체뿐만 아니라 특정 종양 또는 질환 상태에 맞출 것이다.
진단하기 위하여 항체를 사용하는 한 방법은 항체를 방사성 또는 방사선비투과성 제제에 연결하고, 항체를 개체에 투여하고, X선 또는 다른 영상화 기계를 사용하여 항원을 발현하는 암세포의 표면에 표지된 항체의 위치를 시각화하는 생체내 종양 영상화이다. 항체를 생리학적 조건에서 결합을 촉진하는 농도로 투여한다.
KID24의 검출을 위한 시험관내 기술은 당업계에서 일반적이며, 효소결합 면 역흡수 분석법(ELISA), 면역침전, 면역형광, 효소 면역분석(EIA), 방사성면역분석(RIA), 및 웨스턴 블롯 분석을 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 종양 또는 신생물을 방사선영상화 또는 방사능표지된 항체로 처리하는 방법의 효율을 측정하는 방법은 본 발명의 수행 후 개체에 방사능표지된 종양-특이적 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 방사능표지된 항체는 바람직하게는 테크네튬-99m, 인듐-111, 요오드-131, 레늄-186, 레늄-188, 사마륨-153, 루테튬-177, 구리-64, 스칸듐-47, 이트륨-90으로 구성된 군으로부터 선택된 방사능표지를 포함한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 항체의 면역바응성을 약화시키지 않고 생체내에서 파괴되지 않는 요오드-131, 레늄-188, 홀뮴-166, 사마륨-153 및 스칸듐-47과 같은 치료용 방사성핵종으로 표지된 모노클로날 항체가 특히 바람직하다. 당업자는 다른 방사성동위원소가 공지되어 있으며 특정 용도에 적합할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 방사선영상화는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT), 양전자 방출 단층촬영(PET), 컴퓨터 단층촬영(CT) 또는 자기공명영상(MRI)을 사용하여 수행할 수 있다. 방사선면역영상화로 위치확인된 전이의 위치의 더 큰 해부학적 해상력을 허용하는 상관적 영상화가 또한 고려된다.
다른 방법에서, 암세포를 제거하고 당업계에 잘 공지된 방법(예를 들어, 동결 화합물에 포매, 고정과 함께 또는 고정 없이 동결 및 절단; 고정 및 항원 회복 및 대조염색의 다양한 방법으로 또는 그러한 방법들 없이 고정 및 파라핀 포매)에 의한 면역조직화학을 위하여 조직을 준비한다. 또한 모노클로날 항체를 사용하여 다른 단계의 발생에서 암세포를 확인할 수 있다. 또한 항체를 사용하여 어떤 개체 의 종양이 사전 결정된 수준에서 그것들의 표면에서 항원을 발현하는지 그리고 따라서 상기 항원에 대하여 유도된 항체를 사용하는 면역치료의 후보물질인지를 결정할 수 있다. 항체는 신장, 난소, 전립선 및 췌장의 1차 및 전이암과 KID24를 발현하는 폐의 1차 암을 모두 인식할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 검출은 정성적 및/또는 정량적 검출을 포함할 수 있고 측정 수준을 암세포에서 KID24의 발현의 증가된 수준에 대하여 정상 세포와 비교하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 KID24에 결합하는 항체를 사용하여 개체에서 암(예를 들면, 췌장, 결장, 폐, 또는 전립선 암)의 진단을 돕는 방법 및 KID24 발현의 수준을 결정하는 데 사용될 수 있는 어떤 다른 방법을 제공한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "진단을 돕기" 위한 방법은 암의 분류, 또는 성질에 관한 임상적 결정을 하는 것을 돕는 방법을 의미하고, 최종적 진단과 관련하여 결정적일 수도 아닐 수도 있다. 따라서, 암 진단을 돕는 방법은 개체로부터 생물학적 샘플 중의 KID24의 수준을 검출하는 단계 및/또는 샘플 중의 KID24 발현의 수준을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 항원 또는 그것의 일부를 인식하는 항체는 또한, 한정하는 것은 아니지만, 혈액, 침, 오줌, 폐액, 또는 복수를 포함한 체액 중의 살아있거나 죽은 암세포로부터 방출되거나 분비되는 항원을 검출하기 위한 진단용 면역분석법을 만드는 데 사용될 수 있다.
관심있는 특정 종양의 모든 세포가 KID24를 발현하지는 않으며 다른 조직의 암세포가 KID24를 발현할 수 있으므로, 따라서 개체에서 면역요법의 유용성을 결정하기 위하여 암세포 상의 KID24의 존재 또는 부재에 대하여 개체를 스크린하여야 한다. 본원에 개시된 방법으로 제조된 항-KID24 항체는 암으로 진단된 개체가 KID24에 대하여 유도된 항체를 사용하는 면역요법의 후보자가 될 수 있는 지를 결정하는 데 사용될 수 있다. 한 구체예에서, KID24에 대하여 유도된 항체를 사용하여 암 종양 또는 생검 샘플을 KID24의 발현에 대하여 시험할 수 있다. KID24를 발현하는 암세포가 있는 개체는 KID24에 대하여 유도된 항체를 사용하는 면역요법의 적합한 후보자이다. 또한, 항-KID24 항체를 통한 염색을 사용하여 암 조직을 정상 조직과 구별할 수 있다.
진단 목적을 위하여 항-KID24 항체를 사용하는 방법은 어떤 종양이 제공된 치료에 반응할 가능성이 가장 높은 지, 암에 걸린 개체의 예후, 전이성 질환의 종양 하위유형 또는 기원, 및 치료에 대한 질환 또는 반응의 진행을 결정하는 어떤 형태의 항암 치료, 예를 들면 화학치료 또는 방사선 치료의 전과 후에 유용하다.
또한, 본 발명의 조성물은 다른 질병에 걸린(비-암) 세포에 사용시 상기에 일반적으로 설명한 방법을 사용하여, 암 이외의 질환 상태의 진단에 적합하다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 질환 상태는, 한정하는 것은 아니지만, 개체에서 염증성 또는 자가면역 반응과 연관된 질환 또는 장애를 포함한다. 전술한 방법은 개체에서 염증성 또는 자가면역 반응을 조절하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하는 진단 및/또는 치료를 받을 수 있는 염증 및 자가면역 장애로부터 발생한 질환 및 병소는, 제한하는 것이 아니라 설명의 방법으로서, 다발성 경화증, 수막염, 뇌염, 발작, 다른 뇌 외상, 궤양성 대장염 및 크론병을 포함한 염증성 장 질환, 중증근무력증, 낭창, 류마티스 관절염, 천식, 급성 연소자형 당뇨 병, AIDS 치매, 아테롬성 동맥경화증, 신장염, 망막염, 아토피성 피부염, 건선, 심근허혈 및 급성 백혈구-매개 폐 손상을 포함한다.
본 발명의 항체 및 다른 치료제의 진단 및/또는 치료적 사용의 또 다른 조치는 기관 또는 이식 거부의 위험에 처한 개체에 투여하는 것을 포함한다. 최근 수년에 걸쳐, 피부, 신장, 간, 심장, 폐, 췌장 및 골수와 같은 조직 및 기관을 이식하는 수술 기술의 효율성의 상당한 진보가 있었다. 아마도, 주된 미해결 과제는 이식된 동종이식편 또는 기관에 대하여 수용체의 면역내성을 유도하기 위한 만족할만한 제제의 결핍이다. 동종이계 세포 또는 기관을 숙주에 이식하는 경우(즉, 공여체와 수용체가 동일한 종과 상이한 개체이다), 숙주 면역계는 이식된 조직의 파괴를 야기하는 이식된 외래 항원에 대한 면역반응(이식편대숙주병)을 일으키기 쉽다.
또한, 항-KID24 항체의 사용을 인용하는 본 출원에서 설명하는 사용은 본원에서 설명하는 다른 KID24 작용제, 길항제 및 조절자의 사용을 포함한다. 이러한 구체예에서, KID24 작용제, 길항제 또는 다른 비-항체 조절자는 설명한 단계에서 KID24 항체 대신에 치환되며, 보통으로 숙련된 기술자의 범주 내에서 변형을 가하여 방법을 치환된 KID24 조절 조성물에 맞춘다.
VII. 본 발명의 조성물
본 발명은 또한 힝-KID24 항체, 항-KID24 항체에서 유래된 폴리펩티드, 항-KID24 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 설명된 다른 제제를 포함한, 약학적 조성물을 포함한 조성물을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 조성물은 KID24, KID24 작용제, 길항제, 조절자에 결합하는 하나 이상의 항 체, 폴리펩티드 및/또는 단백질, 및/또는 KID24에 결합하는 하나 이상의 항체, 폴리펩티드 및 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 더 포함한다.
본 발명은 어떤 KID24 펩티드 작용제, 길항제 또는 조절자, 및 특정 KID24 펩티드 작용제, 길항제 또는 조절자의 의도하는 기능 또는 기능들을 지지하는 추가 화학적 구조를 더 제공한다. 이들 콘쥬게이트는 본원에 논의되는 진단, 스크리닝 또는 정제 과정에 사용되는 어떤 불용성, 고체 지지 매트릭스와 같은 거대분자에 공유결합하는 KID24 펩티드 작용제, 길항제 또는 조절자를 포함한다. 적합한 기질 물질은 화학적으로 비활성이고, 높은 공극률을 가지며, 펩티드 리간드와 공유결합을 형성할 수 있는 다수의 작용기를 가진 어떤 물질을 포함한다. 기질 물질의 예 및 기질-리간드 콘쥬게이트의 제조과정은 문헌(Dean et al. (eds) Affinity Chromatography: A Practical Approach, IRL Press (1985); Lowe, "An Introduction to Affinity Chromatography", in Work et al. (eds) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 7, Part II, North-Holland (1979); Porath et al., "Biospecific Affinity Chromatography", in Neurath et al. (eds), The Proteins, 3판 Vol. 1, pp. 95-178 (1975); 및 Schott, Affinity Chromatography, Dekker (1984))에 설명된다.
본원에 논의되는 진단 과정에 사용되는 KID24 펩티드 작용제, 길항제 또는 조절자와 어떤 리포터 부분의 콘쥬게이트가 본원에서 또한 제공된다.
항-KID24 항체를 포함한, 본 발명의 KID24 펩티드 작용제, 길항제 또는 조절 자 제제는 다음 기준 중 어떤 것(하나 이상)으로 더 확인되고 특성화된다: (a) KID24에 결합하는 능력(한정하는 것은 아니지만, 췌장, 결장, 폐 또는 전립선 암세포를 포함한 암세포 상의 KID24를 포함한); (b) 원래의 항체가 우선적으로 결합하는 동일한 KID24 에피토프에 우선적으로 결합하는 능력을 포함하는, 공지된 항-KID24 항체가 KID24에 우선적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 방해하는 능력; (c) 시험관내 또는 생체내에서 살아있는 세포의 표면에 노출된 KID24의 일부에 결합하는 능력; (d) 한정하는 것은 아니지만, 난소, 전립선, 췌장, 폐, 결장, 또는 유방 암세포와 같은 살아있는 암세포의 표면에 노출된 KID24의 일부에 결합하는 능력; (e) KID24를 발현하는 암세포에 화학치료제 또는 검출가능한 마커를 전달하는 능력(예를 들면, 한정하는 것은 아니지만, 난소, 전립선, 췌장, 폐, 결장, 또는 유방 암세포); (f) KID24를 발현하는 암세포(예를 들면, 한정하는 것은 아니지만, 폐암세포)에 치료제를 전달하는 능력.
일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 기탁번호 ATCC NO. PTA # 5174의 숙주세포, 또는 그것의 자손에 의하여 생산된 항체이다. 본 발명은 또한 이들 기탁된 하이브리도마 및 등가 항체 또는 폴리펩티드 단편(예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 키메라 항체, 단쇄(ScFv), 그것의 돌연변이체, 항체 부분을 포함한 융합 단백질, 사람화 항체, 및 항원(KID24), 필요한 특이성의 인식부위를 포함하는 이들 또는 등가 항체 중 어떤 것의 어떤 다른 변형된 형태를 포함한다. 본 발명은 또한 항-KID24 패밀리 구성원의 하나 이상의 생물학적 특성을 나타내는 사람 항체 를 제공한다. 항-KID24 패밀리의 등가 항체(사람화 항체 및 사람 항체를 포함), 폴리펩티드 단편, 및 이들 단편들 증 어떤 것을 포함한 폴리펩티드는 전술한 5가지 기준 중 어떤 것으로 확인되며 특성화된다.
일부 구체예에서, KID24에 결합하는 본 발명의 항체, 폴리펩티드 및 단백질은 본원에 상술한 항-KID24 항체가 KID24에 우선적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 항체, 폴리펩티드 및 단백질이다. 일부 구체예에서, 항체, 폴리펩티드 및 단백질은 항체 mu-항-KID24가 우선적으로 결합하는 KID24의 동일한 에피토프에 우선적으로 결합한다.
따라서, 본 발명은 다음 중 어떤 것(또는 다음 중 어떤 것을 포함한, 약학적 조성물을 포함한 조성물)을 제공한다: (a) 상기에 확인된 기탁번호의 숙주세포 또는 그것의 자손에 의하여 생산된 항체; (b) 이러한 항체의 사람화 형태; (c) 이러한 항체의 하나 이상의 경쇄 및/또는 중쇄 가변부를 포함한 항체; (d) 이러한 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변부와 상동인 또는 유래된 가변부, 및 사람 항체의 중쇄 및 경쇄의 불변부와 상동인 또는 유래된 불변부를 포함하는 키메라 항체; (e) 이러한 항체의 하나 이상의 경쇄 및/또는 중쇄 CDR(적어도 한 개, 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 또는 여섯 개)을 포함하는 항체; (f) 이러한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 항체; (g) 이러한 항체와 등가인 사람 항체. 항체의 사람화 형태는 원래의 항체, 또는 전술한 기탁번호의 숙주세포에 의하여 생산된 항체와 동일한 CDR을 가질 수도 갖지 않을 수도 있다. CDR 영역의 결정은 당업계의 기술 내에 있다. 일부 구체예에서, 본 발명은 상기에서 확인한 기탁된 하이브리도마 중 하나에 의하여 생산된 항체의 적어도 하나의 CDR, 적어도 두 개, 적어도 세 개, 적어도 네 개, 적어도 다섯 개의 CDR에 실질적으로 상동인 적어도 하나의 CDR을 포함하는 항체를 제공한다(또는 일부 구체예에서, 이들 항체 중 하나의 6개 모든 CDR과 실질적으로 상동인, 또는 이들 항체 중 하나에서 유래된). 다른 구체예는 본원에서 동정한 기탁된 하이브리도마로부터 생산된, 또는 이러한 항체로부터 유래된 항체의 적어도 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 또는 여섯 개의 CDR(들)에 실질적으로 상동인 적어도 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 또는 여섯 개의 CDR(들)을 가진 항체를 포함한다. 본 발명의 목적을 위하여, 활성의 범위가 기탁된 하이브리도마에 의하여 생산된 항체에 비해서 다양할 수 있지만(더 클 수도 더 작을 수도 있다), 결합 특이성 및/또는 전체 활성(암세포의 성장 및/또는 증식을 감소하고, 암세포에서 아포프토시스 세포사멸을 유도하고, 전이의 진행을 지연시키고/시키거나 완화하여 처치하기 위하여 화학치료제를 암세포에 또는 그 안에 전달하는 측면일 수 있다)을 일반적으로 보유한다. 본 발명은 또한 이들 항체 중 어떤 것을 제조하는 방법을 제공한다. 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며 본원에서 설명한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체의 아미노산 서열을 포함한 폴리펩티드를 제공한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 항체의 하나 이상의 경쇄 및/또는 중쇄 가변부를 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 항체의 하나 이상의 경쇄 및/또는 중쇄 CDR을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 세 개의 CDR을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 다음 중 어떤 것을 가진 항체의 아미노산 서열을 포함한다: 원 항체 서열의 적어도 5개의 연속 아미노 산, 적어도 8개의 연속 아미노산, 적어도 약 10개의 연속 아미노산, 적어도 약 15개의 연속 아미노산, 적어도 약 20개의 연속 아미노산, 적어도 약 25개의 연속 아미노산, 적어도 약 30개의 연속 아미노산, 여기서 아미노산 중 3 개는 항체의 가변부에서 온다. 한 구체예에서, 가변부는 원 항체의 경쇄에서 온다. 다른 구체예에서, 가변부는 항체의 중쇄에서 온다. 다른 구체예에서, 5 개(또는 그 이상)의 연속 아미노산은 항체의 상보성-결정 영역(CDR)에서 온다.
본 발명의 일부 구체예에서, KID24, 항-KID24 항체 또는 본 발명의 다른 KID24-결합 폴리펩티드를 발현하는 본 발명의 세포를 개체에 직접 투여하여 개체의 내생 생체내 KID24 생물학적 활성을 조절한다.
VIII. 치료적 목적을 위한 KID24 조절자 및 항-KID24 항체의 사용방법
KID24에 대한 모노클로날 항체는 암 또는 다른 질환이 있는 개체에서 치료적 목적으로 사용될 수 있다. 항-KID24 항체를 통한 치료는 전술한 바와 같이 시험관내 및 생체내 모두에서 복합체의 형성을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 모노클로날 항체 항-KID24는 암세포에 결합하여 암세포의 증식을 감소시킬 수 있다. 생리학적(예를 들면, 생체내) 조건에서 결합을 촉진하는 농도로 항체를 투여하는 것으로 이해된다. 다른 구체예에서, KID24에 대한 모노클로날 항체는 췌장, 결장, 폐 또는 전립선과 같은 다른 조직의 암세포 및 다른 유형의 암, 예를 들면 육종에 대한 면역요법에 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 모노클로날 항체 항-KID24는 단독으로 암세포에 결합하여 세포분열을 감소시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 모노클로날 항체 항-KID24는 암세포와 결합하여 전이의 진행을 지연시킬 수 있다. 또 다른 구체 예에서, 암에 걸린 개체는 항-KID24 항체로 완화 치료를 받는다. 암에 걸린 개체의 완화 치료는 질환의 유해 증상, 또는 암의 진행에 직접적으로 영향을 미치지 않고 질환에 제공된 다른 치료에서 초래된 의원성(醫原性) 증상을 치료하거나 경감하는 것을 포함한다. 이것은 고통의 완화, 영양 공급, 성적인 문제, 심리적 불안, 우울, 피로, 정신적 장애, 구역질, 구토 등의 치료를 포함한다.
이러한 상황에서, 항-KID24 항체는 항체-의존성 세포의 세포독성(ADCC)을 강화하는 제제와 같은 개체 자신의 면역반응을 향상하거나 유도하는 제제와 함께 투여될 수 있다.
다른 구체예에서, 항-KID24 항체에 존재하는 적어도 하나의 푸코스 잔기를 항체의 올리고당에서 제거하여 ADCC를 증대하도록 변형한다. 유사한 구체예에서, 항-KID24 항체에 존재하는 푸코스 잔기는 원래의 변형되지 않은 항체에 비해서 ADCC를 증대하는 데 필요한 범위로 그 조성물을 변형하기 위해서 변형된다.
또 다른 구체예에서, 방사성 분자, 독소(예를 들면, 칼리케아미신), 화학치료분자, 리포솜 또는 화학치료 화합물을 함유한 다른 소체와 콘쥬게이트되거나 또는 결합된 항-KID24 항체를 이러한 치료가 필요한 개체에 투여하여 항체에 의하여 인식되는 항원을 함유한 암세포로 이들 화합물을 표적화하고 이렇게 암 또는 병에 걸린 세포를 제거한다. 특정 이론에 제한되지 않고, 항-KID24 항체는 그것의 표면에 KID24를 지니는 세포에 의하여 내재화되며, 따라서 콘쥬게이트된 부분을 세포에 전달하여 치료효과를 유도한다. 또 다른 구체예에서, 항체는 전이의 진행을 지연시키기 위하여 항원을 발현하는 암의 수술 제거시에 보조제 치료로서 사용될 수 있 다. 또한 종양의 크기를 감소시켜 수술을 가능케 또는 단순화하고, 수술하는 동안 조직을 아끼고/거나 결과로 발생하는 외관손상을 감소시키기 위하여 항원을 발현하는 종양이 있는 개체에 수술 전에 항체를 투여할 수 있다(수술전 보조요법).
본 발명의 실행시 세포 주기 투여를 고려한다. 이러한 구체예에서, 사전결정된 단계에 종양 또는 다른 표적의 병든 세포의 세포 주기와 동시에 일어나도록 화학치료제를 사용한다. 이어서, 본 발명의 항-KID24 항체(단독 또는 추가 치료 부분과 함께)를 투여한다. 대안적 구체예에서, 세포주기와 동시에 일어나고 두 번째 치료의 투여 전에 세포분열을 감소시키도록 항-KID24 항체를 사용하며, 두 번째는 항-KID24 항체 및/또는 추가 치료 부분의 투여일 수 있다.
화학치료제는 방사성 분자, 암세포, 암 인자, 및 리포솜 또는 화학치료 화합물을 함유한 다른 소체의 생존능력에 해로운 어떤 제제를 포함한, 세포독소 또는 세포독성 제제로 지칭하기도 하는 독소를 포함한다. 적합한 화학치료제의 예는, 한정하는 것은 아니지만, 1-디히드로테스테스테론, 5-플루오로우라실 디카르바진, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 악티노마이신 D, 아드리아마이신, 알데스류킨, 알킬화제, 알로퓨리놀나트륨, 알트레타민, 아미포스틴, 아나스트로졸, 안트라마이신(AMC), 세포분열저지성 제제, 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 디아미노 디클로로 백금, 안트라사이클린, 항생제, 대사길항물질, 아스파라기나제, 생 BCG(방광내), 베타메타손 인산나트륨 및 베타메타손 아세트산염, 비칼루타미드, 플레오마이신 황산염, 부설판, 칼슘 류쿠오린, 칼리케미신, 캡사이타빈, 카르보플라틴, 로무스틴 (CCNU), 카무스틴 (BSNU), 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 콜히친, 콘쥬게이트된 에스트로겐, 사이클로포스파미드, 사이클로토스파미드, 시타라빈, 사이토칼라신 B, 사이톡산, 디카바진, 닥티노마이신, 닥티노마이신(이전의 악티노마이신), 다우니루비신 HCL, 다우노루비신 시트르산염, 디프티톡스, 덱스라족산, 디브로모만니톨, 디히드록시 안트라신 디온, 도세탁셀, 돌라세트론 메실레이트, 독소루비신 HCL, 드로나비놀, 대장균 L-아스파라기나제, 에메틴, 에포틴 알파, 에르베니아 L-아스파라기나제, 에스테르화된 에스트로겐, 에스트라디올, 에스트라무스틴 인산나트륨, 브롬화에티디움, 에티닐 에스트라디올, 에티드로네이트, 에토포사이드 시트로로룸 인자, 에토포사이드 인산염, 필그라스팀, 플록수리딘, 플루코나졸, 플루다라빈 인산염, 플루오로우라실, 플루타미드, 폴린산, 겜시타빈 HCL, 글루코코르티코이드, 고세렐린 아세테이트, 그라미시딘 D, 그라니세트론 HCL, 히드록시우리아, 이다루비신 HCL, 이포스파미드, 인터페론 알파-2b, 이리노테칸 HCL, 레트로졸, 류코보린칼슘, 류프롤리드 아세테이트, 레바미솔 HCL, 리도카인, 루무스틴, 마이탄시노이드, 메클로레타민 HCL, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 멜팔란 HCL, 머캅티퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 메틸테스테스토스테론, 미트라마이신, 미토마이신 C, 미토탄, 미톡산트론, 닐루타미드, 옥트레오티드 아세테이트, 온단세트론 HCL, 파클탁셀, 파미드론산이나트륨, 펜토스타틴, 필로카르핀 HCL, 플리마이신, 카무스틴 이식을 통한 폴리페프로산 20, 포르피머 나트륨, 프로카인, 프로카르바진 HCL, 프로프라놀롤, 리툭시맙, 사그라모스팀, 스트렙토조토신, 타목시펜, 탁솔, 테니포시드, 테노포시드, 테스토락톤, 테트라카인, 티오에파, 클로람부실, 티오구아닌, 티오테파, 토포테칸 HCL, 토레미펜 시트레이 트, 트라스투주맙, 트레티노인, 발루비신, 빈블라스틴 황산염, 빈크리스틴 황산염, 및 비노렐빈 타르타르산염을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 세포독소는 분열하는 또는 빠르게 분열하는 세포에서 특히 효과적이어서, 비-분열 세포는 상대적으로 독성 효과를 면하게 된다.
본 발명의 항체는 그것이 결합하는 병든 세포 또는 암종 세포 내에 내재할 수 있어서 치료적 용도, 예를 들면 그것의 유해 활성을 위하여 내재화할 필요가 있는 독소를 세포 내로 전달하는 데 특히 유용하다. 이러한 독소의 예는, 한정하는 것은 아니지만, 사포린, 칼리케아미신, 마이탄시노이드를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 방사성 분자, 독소, 또는 다른 치료제, 또는 리포솜 또는 공유적 또는 비-공유적으로, 직접적 또는 간접적으로 치료제를 함유한 다른 소체에 결합(콘쥬게이트 또는 연결을 포함)될 수 있다. 항체가 그것의 표적 KID24에 결합할 수 있는 한, 항체는 항체의 어떤 위치에서든지 방사성 분자, 독소, 또는 화학치료 분자에 연결될 수 있다.
독소 또는 화학치료제는 직접적 또는 간접적으로(예를 들면, 연결기를 통하여 또는 대안적으로 미국특허 제5,552,391호에 설명된 플랫폼 분자와 같은 적합한 부착 부위를 가진 연결 분자를 통하여) 적합한 모노클로날 항체에 결합(예를 들면, 공유결합)될 수 있다. 본 발명의 독소 및 화학치료제는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 특정 표적 단백질에 직접적으로 결합될 수 있다. 예를 들어, 제제와 항체 간의 직접 반응은 각각이 다른 것과 반응할 수 있는 치환체를 가질 때 가능하다. 예를 들어, 한 쪽에 친핵체기, 예를 들어 아미노 또는 설퍼히드릴기는 다른 쪽에 무수물 또는 할로겐산과 같은 카르보닐-함유기 또는 좋은 이탈기(예를 들면, 할로겐)를 함유한 알킬기와 반응할 수 있다.
항체 또는 폴리펩티드는 또한 미세담체를 통하여 화학치료제에 연결될 수 있다. 미립담체는 물에 불용성이며, 약 150, 120 또는 100 mm 미만, 더 통상적으로는 약 50-60 um 미만, 바람직하게는 약 10, 5, 2.5, 2, 또는 1.5 um 미만의 크기를 가진 생분해가능한 또는 생분해가능하지 않은 입자를 지칭한다. 미립담체는 약 1 um 미만, 바람직하게는 약 500 nm 미만의 크기를 가진 미립담체인 "나노담체"를 포함한다. 이러한 입자는 당업계에 공지되어 있다. 고체상 미립담체는 당업계에 공지된 다른 생분해가능한 물질뿐만 아니라 아가로스 또는 교차결합된 아가로스에서 형성된 미립담체를 포함하거나 배제할 수 있는 생체적합성 자연 발생의 폴리머, 합성 폴리머 또는 합성 코폴리머로부터 형성된 입자일 수 있다. 생분해가능한 고체상 미립담체는 포유동물의 생리적 조건 하에서 분해가능(예를 들면, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산) 및 그것들의 코폴리머)하거나 먹을 수 있는(예를 들면, 폴리(오르토 에스테르, 예를 들면 3,9-디에틸리덴-2,4,8,10-테트라옥사스피로[5.5]우데칸(DETOSU) 또는 폴리(무수물), 예를 들면 세바식산의 폴리(무수물))로부터 형성될 수 있다. 미립담체는 또한 액체상(예를 들면, 오일 또는 지질 기반), 즉 액체상 미립담체가 생분해가능하다면, 유중수 또는 수중유에서 발견되는 항원 또는 액적 또는 미셀이 없는 리포솜, 이스콤(콜레스테롤, 및 인지질, 보조제-활성 사포닌의 안정한 복합체인 면역-자극 복합체)일 수 있다. 생분해가능한 액체상 미립담체는 전형적으로 생분해가능한 오일을 포함하는데, 스쿠알렌 및 식물성 오일을 포함한, 많 은 것들이 당업계에 공지되어 있다. 미립담체는 전형적으로 모양이 구형이지만, 구형 모양에서 벗어난 미립자 또한 허용된다(예를 들면, 타원체, 막대기 모양 등). (물과 관련한) 그것의 불용성 성질 때문에, 미립담체는 물과 물-기재(수성) 용액에서 여과가능하다.
본 발명의 항체 또는 폴리펩티드 콘쥬게이트는 독성제 또는 화학치료제에 결합할 수 있는 기와 항체에 결합할 수 있는 기를 모두 함유하는 이작용기성 연결기를 포함할 수 있다. 연결기는 결합 능력을 가진 간섭을 피하기 위하여 항체를 제제로부터 간격을 두는 스페이서로 작용할 수 있다. 연결기는 절단가능할 수도 절단가능하지 않을 수도 있다. 연결기는 또한 제제 또는 항체에서 치환체의 화학적 반응성을 증가시켜서, 결합 효율을 증가시키는 역할을 할 수 있다. 화학 반응성의 증가는 제제 또는 제제의 기능기의 사용을 촉진할 수 있으며, 다른 경우에는 가능하지 않다. 이작용기성 연결기는 당업계에 공지된 수단에 의하여 항체에 결합될 수 있다. 예를 들어, N-히드록시숙신이미드 에스테르와 같은 활성 에스테르 부분을 함유한 연결기는 아미드 결합을 통하여 항체의 리신 잔기에 결합하는 데 사용될 수 있다. 다른 예에서, 친핵성 아민 또는 히드라진 잔기를 함유한 연결기는 항체 탄수화물 잔기의 글리콜 산화에 의하여 생성된 알데히드기에 결합될 수 있다. 이러한 결합의 직접적 방법뿐만 아니라, 연결기는 아미노덱스트란과 같은 중간 담체에 의하여 간접적으로 항체게 결합될 수 있다. 이들 구체예에서, 변형된 결합은 리신, 탄수화물, 또는 중간 담체를 통하여 이루어진다. 한 구체예에서, 연결기는 단백질에 있는 자유 티올 잔기에 부위-선택적으로 결합된다. 단백질 상의 티올기에 선택적 결합하기에 적합한 부분은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예로는 이황화 화합물, α-할로카르보닐 및 α-할로카르복실 화합물, 및 말레이미드를 포함한다. 친핵성 아민 기능이 α-할로카르보닐 및 할로카르복실기와 동일한 분자에 존재할 때, 포텐셜은 아민의 분자내 알킬화를 통하여 발생하는 고리화를 위하여 존재한다. 이 문제를 방지하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있는데, 예를 들면, 아민 및 α-할로 기능이 입체화학적으로 바람직하지 않은 원하지 않는 고리화를 만드는 불변기, 예를 들면 아릴기 또는 트랜스-알켄에 의하여 분리되는 분자의 제조가 있다. 예를 들면, 이황화 부분을 통하여 마이탄시노이드와 항체의 콘쥬게이트의 제조에 대한 미국특허 제 6,441,163호를 참조하라.
항체-약물 콘쥬게이트의 제조에 사용할 수 있는 절단가능한 연결기 중 하나는 수용체 매개 엔도시토시스 과정 중 만나게 되는 엔도솜 및 리소좀과 같은 다른 세포내 부분의 산성 환경을 이용하는 시스-아코니트산에 기초한 산-반응성 연결기이다. 예를 들면, 문헌(다우노루비신과 거대분자 담체의 콘쥬게이트의 제조에 관한 Shen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 102:1048-1054 (1981); 다우노루비신과 항-멜라노마 항체의 콘쥬게이트의 제조에 관한 Yang et al., J. Natl. Cane. Inst. 80:1154-1159 (1988); 다우노루비신과 항-T 세포 항체의 콘쥬게이트를 제조하는 유사한 방식으로 산-반응성 연결기를 사용하는 것에 관한 Dillman et al., Cancer Res. 48:6097-6102 (1988); 펩티드 스페이서 팔을 통하여 다우노루비신을 항체에 연결하는 것에 관한 Trouet et al., Proc. Natl. Acad. Sd. 79:626-629 (1982))을 참조하라.
본 발명의 항체(또는 폴리펩티드)를 당업계에 공지된 어떤 방법에 의하여 방사성 분자에 콘쥬게이트(연결)할 수 있다. 방사능표지 항체에 대한 방법의 논의는, 문헌("Cancer Therapy with Monoclonal AntibodiesT", D. M. Goldenberg ed. (CRC Press, Boca Raton, 1995))을 참조하라.
대안적으로, 항체는 2차 항체와 콘쥬게이트하여 미국특허 제4,676,980호에서 Segal이 설명한 항체 헤테로콘쥬게이트를 형성할 수 있다. 교차결합된 항체의 형성은 특정 유형의 세포, 예를 들면 KID24를 발현하는 암 또는 병든 세포로 면역계를 표적화할 수 있다.
본 발명은 또한 항-KID24 항체 또는 다른 KID24 조절자를 투여함으로써 1차 종양(한정하는 것은 아니지만, 췌장, 결장, 폐, 또는 전립선 암을 포함한)을 가지거나 가졌던 개체에서 전이의 진행을 방지 또는 지연시키는 방법을 제공한다. 이 조절자는 단독으로 또는 다른 치료법, 예를 들면 방사선, 화학치료, 또는 수술과 함께 제공될 수 있다. 어떤 바람직한 구체예에서, 1차 종양은 KIDF24 조절자의 투여 전 적어도 한 차례의 수술, 방사선, 및/또는 화학치료를 받았다. 어떤 환경에서, 1차 종양은 선행 치료에 의하여 완전히 제거된 것처럼 보일 수 있다. 다른 구체예에서, KID24 조절자를 수술, 방사선, 및/또는 화학치료로 개체를 치료하기 전, 또는 이와 동시에 투여한다. 어떤 구체예에서, 암에 걸리거나 걸렸던 개체에서 전이의 진행을 방지하거나 지연시키는 이들 방법은 검출가능한 마커 또는 화학치료제와 같은 다른 치료 부분과 결합된(또는 연결된) KID24 조절자(예를 들면 KID24에 결합하는 항체)의 투여를 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 비-사람 항-KID24 항 체의 사람화 또는 키메라 형태이다.
또 다른 구체예에서, 전이의 진행을 지연시키기 위해서 항원을 발현하는 암의 수술 제거시에 항체를 보조요법으로 사용할 수 있다. 또한, 종양의 크기를 감소시켜 수술을 가능케 하거나 단순화하고, 수술 과정 중 조직을 아끼고/거나 결과로 발생하는 용모손상을 감소시키기 위하여 항원을 발현하는 종양을 가진 개체를 수술 전에 항체 또는 화학치료제와 결합된 항체를 투여할 수 있으며(수술전 보조요법).
다른 구체예에서, 전이의 진행을 지연 또는 방지하기 위하여 KID24 조절자 중 어떤 것, 예를 들면 항-KID24 항체를 1차 종양의 치료(수술, 방사선요법, 화학요법적 치료) 후 치료법으로 사용할 수 있다. KID24 조절자를 단독으로 또는 화학치료제와 결합하여 투여할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 비-사람 항-KID24 항체의 사람화 또는 키메라 형태이다.
또 다른 구체예에서, 본원에 설명한 KID24 결합 구체예 중 어떤 것은 KID24-발현 암세포에 결합하고 KID24를 발현하는 암세포에 대한 활성 면역반응을 유도할 수 있다. 어떤 경우, 활성 면역반응은 암세포의 사멸(예를 들면, 아포프토시스 세포사멸을 유도하는 암세포에 결합하는 항체)을 야기하거나, 암세포의 성장(예를 들면, 세포주기 진행을 차단)할 수 있다. 다른 경우, 본원에 설명한 신규 항체 중 어떤 것은 암세포에 결합할 수 있으며 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC)은 항-KID24가 결합하는 암세포를 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 설명한 조성물 중 어떤 것을 투여하는 단계를 포함하는 면역반응을 자극하는 방법을 제공한다.
어떤 경우, 항체 결합은 또한 세포성 및 체액성 면역반응을 활성화하여 개체의 면역계를 더 활성화하여 암세포를 파괴하는 더 많은 자연살해세포 또는 사이토카인(예를 들면, IL-2, IFN-g, IL-12, TNF-a, TNF-b 등)을 모집할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 항-KID24 항체는 암세포에 결합할 수 있고, 대식세포 또는 다른 식세포는 암세포를 옵소닌화할 수 있다.
항-KID24 항체 또는 그것의 단편의 다양한 제형을 투여에 사용할 수 있다. 일부 구체예에서, 항-KID24 항체 또는 그것의 단편을 순수하게 투여할 수 있다. 약학적 활성제뿐만 아니라, 본 발명의 조성물은 당업계에 공지되어 있으며 약학적으로 효과적인 물질의 투여를 촉진하거나 작용부위에 전달하기 위하여 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 활성 화합물의 가공을 촉진하는 상대적으로 비활성 물질인 첨가제 및 보조제를 포함하는 적합한 약학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 예를 들어, 첨가제는 형태 또는 농도를 부여하거나, 희석제로 작용할 수 있다. 적합한 첨가제는, 한정하는 것은 아니지만, 안정제, 습윤제 및 유화제, 다양한 삼투압을 위한 염, 캡슐화제, 완충액, 및 피부침투 인핸서를 포함한다.
비경구 투여를 위한 적합한 제형은 수용성 형태, 예를 들면 수용성 염 중의 활성화합물의 수용액을 포함한다. 게다가, 유성 주사에 적합한 활성화합물의 현탁액을 투여할 수 있다. 적합한 지용성 용매 또는 비히클은 지방오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들면 에틸올리에트 또는 트리글리세리드를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점성을 증가시키는 물질을 함유할 수 있고, 예를 들면 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 및/또는 덱스트란을 포함할 수 있다. 선택적으 로, 현탁액은 또한 안정제를 함유할 수 있다. 리포솜은 또한 세포에 전달하기 위한 제제를 캡슐화하는 데 사용될 수 있다.
본 발명에 따라서 전신 투여를 위한 약학적 제형은 장관계, 비경구 또는 국소 투여를 위하여 제조될 수 있다. 실제로, 세 가지 모든 유형의 제형을 동시에 사용하여 활성 성분의 전신 투여를 할 수 있다. 비경구 및 경구 약물전달을 위한 제형뿐만 아니라 첨가제는 문헌(Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20판 Mack Publishing (2000))에 나타난다.
경구 투여를 위한 적합한 제형은 경성 또는 연성 젤라틴 캡슐, 알약, 코팅된 정제를 포함한 정제, 엘릭시르, 현탁액, 시럽 또는 흡입 및 그것의 통제된 방출 형태를 포함한다.
일반적으로, 이들 제제는 다른 형태의 투여(예를 들면, 경구, 점막 등)도 사용할 수 있지만 주사(예를 들면, 복막내, 정맥내, 피하, 근육내 등)로 투여하도록 제조된다. 따라서, 항-KID24 항체를 바람직하게는 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액 등과 같은 약학적으로 허용되는 비히클과 조합한다.
특정 투여 양생법, 즉 투여량, 시간 및 반복은 특정 개체 및 개체의 병력에 따를 것이다. 일반적으로, 적어도 약 100 μg/체중kg, 더 바람직하게는 적어도 약 250 μg/체중kg, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 750 μg/체중kg, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 3 mg/체중kg, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 5 mg/체중kg, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 10 mg/체중kg의 투여량을 투여한다.
경험적인 고려, 예를 들면 반감기는 일반적으로 투여량의 결정에 기여할 것 이다. 사람의 면역계에 적합한 항체, 예를 들면 사람화 항체 또는 완전 사람 항체는 항체의 반감기를 연장하고 숙주 면역계에 의하여 공격받는 항체를 방지하는 데 사용될 수 있다. 투여 빈도는 치료 과정 중에 결정하고 조절할 수 있으며, 암세포의 수의 감소, 암세포의 감소의 유지, 암세포의 증식의 감소, 또는 전이 진행의 지연에 기초한다. 대안적으로, 항-KID24 항체의 지속적 연속분비 제형이 적합할 수 있다. 지속적 분비를 얻기를 위한 다양한 제형 및 장치는 당업계에 공지되어 있다.
한 구체예에서, 항-KID24 항체의 투여량은 한 번 이상 투여(들)받은 개체에서 경험적으로 결정할 수 있다. 개체는 항-KID24 항체의 증분 투여량을 공급받는다. 항-KID24 항체의 효능을 평가하기 위하여, 특정 암질환 상태의 마커를 수반할 수 있다. 이들은 촉진 또는 시각적 관찰을 통한 종양 크기의 측정, X선 또는 다른 영상화 기술에 의한 종양 크기의 간접적 측정; 직접적 종양 생검 및 종양 샘플의 현미경 검사에 의하여 평가되는 개선; 간접적 종양 마커(예를 들면, 전립선암의 경우 PSA)의 측정, 통증 또는 마비의 감소; 개선된 말, 시각, 호흡 또는 종양과 연관된 다른 장애; 증가된 식욕; 허용된 테스트에 의하여 측정한 생활의 질의 증가 또는 생존의 연장을 포함한다. 투여량은 개체, 암 유형, 암의 단계, 암이 개체에서 다른 위치로 전이하기 시작했는지 여부, 및 사용된 과거와 동시 치료에 따라서 다양할 것이라는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
다른 제형은, 한정하는 것은 아니지만, 리포솜과 같은 담체를 포함한, 당업계에 공지된 적합한 전달형태를 포함한다. 예를 들면, 문헌(Mahato et al. (1997) Pharm. Res. 14:853-859)을 참조하라. 리포솜 제제는, 한정하는 것은 아니지만, 사 이토펙틴, 다층다멜라 소체 및 단층라멜라 소체를 포함한다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 항체가 존재할 수 있다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 이러한 조성물은 암종, 선암, 육종, 또는 선육종에 반응성이 있는 적어도 한 개, 적어도 두 개, 적어도 세 개, 적어도 네 개, 적어도 다섯 개의 다른 항체를 함유할 수 있다. 항-KID24 항체를, 한정하는 것은 아니지만, 난소, 유방, 폐, 전립선, 결장, 신장, 피부, 갑상선, 뼈, 상부 소화관, 및 췌장을 포함한 기관에서 암종, 선암, 육종, 또는 선육종에 대하여 반응성이 있는 하나 이상의 항체와 혼합할 수 있다. 한 구체예에서, 다른 항-KID24 항체의 혼합물을 사용한다. 항체의 혼합물은 그것들이 당업계에 자주 나타나는 바와 같이 넓은 범위의 개체의 집단을 치료하는 데 특히 사용될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 한정하는 것은 아니라 설명하기 위하여 제공된다.
실시예 1. 면역원으로서 사람 신장세포의 제조
10주 내지 18주 사이의 회태 연령의 사람 태아 신장을 캘리포니아 알라메다주에 있는 어드밴스드 바이오사이언스 리서치(Advanced Biosciences Research)에서 얻었다. 신장을 입수하여 젖은 얼음 상에 조직배양 배지 안에 있는 랩에 옮겼다. 도착하자마자 즉시, 신장을 세척 배지에 옮겼다(페니실린/스트렙토마이신 및 젠타마이신을 함유한 차가운 PBS). 외부막을 포셉으로 제거하고 신장을 70% 에탄올에서 간단히 세척한 후 세척 배지에서 2회 헹구었다. 10 mm 건조된 배양접시에서 수술가위로 신장을 잘게 썰어 1 mm 큐브에 넣는다. 조직의 조각을 본원에서 I/3F라고 지 칭하는 10 ml의 한정된 무혈청 배지에 플레이팅한다. 이 배지는 미국특허출원 60/504,674에서 설명하며, 이 출원의 개시는 본원에 참고문헌으로 포함된다. 통상적으로 사용하는 다양한 세포배양 배지는 본 발명의 실행에서 사용할 수 있지만, 현재 바람직한 구체예는 무혈청, 과당-기재 세포배양 배지를 사용한다.
조직의 조각을 15 ml 원심분리 튜브에 옮겨 조직의 조각을 1000xg에서 5 분 동안 원심분리하였다. 조직의 조각을 인슐린(10 μg/ml), 트랜스페린 (10 μg /ml), 표피성장인자 (20 ng/ml), 소마토트로핀 (0.005 IU /ml), 돼지 뇌하수체 추출물 (0.2%), 닭 혈청 (0.1%), 젠타마이신 (100 μg/ml), 페니실린/스트렙토마이신 (1x) 및 콜라게나제/디스파제 (0.1%)를 함유한 I/3F 배지에 재현탁하고, 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음날, 분해된 조직의 조각을 1000xg에서 5 분 동안 원심분리하고 I/3F 배지로 2회 세척하였다. 펠렛을 인슐린 (10 μg/ml), 트랜스페린 (10 μg/ml), 표피성장인자 (20 ng/ml), 소마토트로핀 (0.005 IU/ml), 돼지 뇌하수체 추출물 (0.2%) 및 닭 혈청 (0.1%)을 함유한 10 ml I/3F 배지에 재현탁하고, 피브로넥틴-사전코팅된 10 cm 플레이트에 배양하였다.
이 배양 조건 하에서, 사람 태아 신장세포를 기질 코팅된 플레이트에 부착하고 단일층으로 성장시켰다. 배양배지를 주 2회 교체하였다.
세포를 수확하기 위하여, 세포 단일층을 칼슘 및 마그네슘이 없는 행크스 식염수용액으로 1회 헹구고, 37℃에서 15분 동안 행크스 식염수 용액 중의 10 mM EDTA에 인큐베이션하였다. 세포를 부드럽게 피펫팅하여 배양물 표면으로부터 떨어뜨렸다. 세포 현탁액을 1000 xg에서 5 분 동안 원심분리하여 펠렛을 만들었다. 상 청액을 제거하고 세포를 적합한 비-변성 첨가제가 있는 무혈청 배지(I/3F 배지)에 재현탁하였다.
실시예 2. 모노클로날 항체의 발생
비-변성 첨가제(Ribi, R730, Corixa, Hamilton MT)를 2 ml 인산염으로 완충한 식염수에 다시 수화(水化)하였다. 그 다음, 다시 수화된 이 100 ㎕의 첨가제를 실시예 1의 세포 펠렛의 일부와 부드럽게 혼합하여 면역화에 사용하였다. 마우스당 약 106 사람 태아 신장세포를 약 주 1회 또는 2회 발을 통하여 Balb/c 마우스에 주사하였다. 정확한 면역화 스케쥴은 다음과 같다: 1일, 면역화 + Ribi. 3일, 면역화 + Ribi. 7일, 면역화 + Ribi. 24일, 면역화 - Ribi. 29일, 면역화 - Ribi. 32일, 면역화 - Ribi. 36일, 면역화 - Ribi. 44일, 면역화 - Ribi. 51일, 면역화 - Ribi. 69일, 역가 테스트를 위한 출혈. 71일. 면역화 + Ribi. 74일, 면역화 + Ribi. 81일, 면역화 + Ribi. 91일, 예비융합 추가접종 (Ribi 없음). 104일, 융합을 위한 수확 노드.
69일에, 한 방울의 혈액을 각 면역화된 동물의 꼬리에서 취하고 FACS 분석을 사용하여 사람 태아 신장세포에 대한 항체의 역가를 테스트하였다. 역가가 적어도 1:2000에 이를 때, 마우스를 CO2와 이어서 경추 탈골을 사용하여 희생시켰다. 하이브리도마 제조를 위하여 림프절을 수확하였다.
마우스의 림프구를 35% 폴리에틸렌 글리콜 4000을 사용하여 골수종 세포주 X63-Ag8.653과 융합하였다. 융합 후 10일에, 하이브리도마 상청액을 형광 활성화 세포 분류(FACS)로 사람 태아 신장세포-특이적 모노클로날 항체의 존재에 대하여 스크린하였다. 각 하이브리도마의 적응용배지를 사람 태아 신장세포의 분취액과 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포 샘플을 세척하고, 0.1 ml 희석액에 재현탁하고, 염소 항-마우스 IgG의 FITC 콘쥬게이트된 F(ab')2 단편의 1 μg/ml과 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 0.2 ml FACS 희석액에 재현탁하고, FACS 세포 분석기(Becton Dickinson; San Jose, CA)를 사용하여 분석하였다. 추가 증량, 클로닝, 및 FACS에 의한 사람 태아 신장세포의 표면에 대한 그것들의 결합에 기초한 특성화를 위하여 하이브리도마 클론을 선탁하였다. 항원으로 지정된 KID24와 결합하는, 모노클로날 항체로 지정된 mu-항-KID24를 만드는 하이브리도마를 선택하였다. mu-항-KID24 항체를 만드는 하이브리도마를 하이브리도마 성장의 유지 및 항체 정제에 적합한 성장 배지에서 더 증량하였다.
실시예 3. mu -항- KID24 를 포함하는, 항- KID24 항체의 정제
사람 태아 신장 세포를 10.0 mM EDTA의 존재 하에 조직배양 플라스크에서 떼어내 1400 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고 1% BSA 및 2 mM EDTA(FACS 희석액)을 함유한 PBS에 재현탁하였다. 세포를 계수하여 107 세포/ml로 조절하였다. 약 0.1 ml의 세포를 37℃에서 30 분 동안 100 ㎕ FACS와 인큐베이션하였다. 사람 태아 신장세포에 결합하는 모노클로날 항체를 단백질-G 친화성 크로마토그래피를 사용하여 조직배양 상청액으로부터 정제하였다. 원한다면 상청액에서 초과 소 IgG를 제거하기 위하여 먼저 조직배양 상청액을 소 IgG 칼럼에 통과시킬 수 있다. 다음 물질을 항체 정제과정에 사용하였다: 하이브리도마 조직배양 상청액, 면역순수(G) IgG 결합 완충액(Pierce #21011 Rockford, IL), 면역순수 IgG 용리 완충액 (Pierce #21009), 농축된 HCl (pH 조절용), Corning 1 리터 PES (폴리에테르 술폰), 0.22 um 여과기 (Corning #431098, Corning, NY), Amersham Pharmacia AKTA 익스폴로러 시스템 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), 단백질-G 세파로스 4 고속 유속 (Amersham Biosciences #17-0618-03), 3M 티오시안산카륨/50 mM 트리스 pH 7.8과 PBS(인산염 완충된 식염수)로 구성된 스트립핑 완충액, 3M 트리스 pH 9.0.
본원에서 mu-항-KID24이라 지칭하는 마우스 항-사람 KID24 항체를 정제하기 위하여, 상청액의 부피를 측정하여 동일한 부피의 결합 완충액을 상청액에 첨가하였다. 혼합물을 실온까지 평형을 유지하였다. 상청액을 0.22 um 여과기에 통과시켜 정화시켰다. 상청액을 AKTA 익스플로러 시스템(Amersham Biosciences)을 사용하여 단백질-G 세파로스 칼럼에 로딩한 후 5-10 칼럼 부피의 결합 완충액으로 세척하였다. 용리 완충액으로 모노클로날 항체를 용리하고, 분획을 수집하였다. 용리하자 마자 빈 튜브에 3 M 트리스, pH 9.0을 첨가하여 분획을 중화하였다(분획의 1/60 부피). 모노클로날 항체를 함유한 피크 분획의 풀을 만들었다. 풀 샘플을 사전-습윤식 슬리디얼라이저(slidealyzer) 카세트(10,000 MW 컷오프; Pierce #66810)에 주사하고 4℃ 1x PBS에서 투석하였다(교환마다 적어도 4시간의 투석의 3번의 완충액 교환). 정제된 모노클로날 항체를 멸균 여과하고(0.2 um Acrodisc) 2-8 ℃에 저장하였다. UV 흡수(A280) 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 농도 의 결정을 위하여 정제된 항체 샘플을 취하였다. 분자량 분석을 위한 비-환원 및 환원 조건, 모노클로날 항체의 전형적인 밴드 패턴의 확인 및 순도의 평가 하에 SDS-PAGE를 러닝하였다.
하이브리도마 상청액으로부터 mu-항-KID24 모노클로날 항체의 정제 후, 사람 태아 신장세포에 결합에 대하여 재시험하였다. 세포 샘플을 전술한 바와 같이 준비하여 다양한 농도로 정제된 항체와 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후, 세포를 세척하고, 0.1 ml 희석액에 재현탁하고 4℃에서 30분 동안 염소 항-마우스 IgG의 FITC 콘쥬게이트된 F(ab)'2 단편 1 μg과 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 0.5 ml FACS 희석액에 재현탁하고, FACS캔 세포 분류기((Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 분석하였다. FACS캔 막대그래프에서 우측으로의 이동은 정제된 항체가 여전히 사람 태아 신장세포에 결합돼 있다는 것을 나타낸다.
다른 실험에서, KID24에 대한 mu-항-KID24 항체의 결합은 살아있는 세포 ELISA를 사용하여 테스트하였다. 기술분야에 통상적으로 알려진 다른 방법을 사용할 수 있겠지만, 다음 방법을 사용하였다. 세포(HT-29, SKOV3, SKMES-1, SW480, SKBR-3, 및 HPAFII)를 조직배양 처리된 96-웰 플레이트(Falcon) 상에 컨플루언시할 때까지 배지를 함유한 10% 태아 소 혈청(FBS)에서 성장시켰다. 세포를 PBS로 세척한 후, 실온에서 1 시간 동안 1% BSA 및 0.1% 아지드화나트륨을 함유한 행크의 균형맞춘 염용액에서 원하는 항체 50 ㎕와 원하는 농도로 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 실온에서 30 분 동안 양고추냉이 페록시다제(HRP) 2차 항체(HBSS로 희석된 웰마다 50 ㎕)와 인큐베이션하기 전에 HBSS의 웰 당 100 ㎕로 3회 세척하였다. 세포를 마지막으로 HBSS로 3 회 세척하고 색깔 변화 기질(TMB 기질, KPL)을 웰 당 100 ㎕로 각 웰에 첨가하였다. 웰 당 100 ㎕의 1 M 포스포린산을 첨가하여 색깔변화 반응을 중지하였다. 결과는 아래 표 4에서 요약한다.
실시예 4. 암세포주 A498에서 KID24 발현의 면역침전 분석
신장 암종 세포주 A498을 175 cm2 배양접시에 컨플루언트하게 성장시켰다. 세포를 PBS로 헹군 후 용해 완충액(2% 트리톤 X-100이 있는 HBSS+, 2mM PMSF, 0.1% 아지드화나트륨, 및 EDTA가 없는 완전 미니-프로테아제 칵테일(Roche Molecular Biochemicals)의 5 ml 용해 완충액 당 1정)으로 스크랩하고 용해물을 수집하였다. 용해물을 4℃에서 1 시간 동안 14,000xg로 원심분리하였다. 그 후, 정화된 용해물을 5 ㎕의 사람 IgG 콘쥬게이트된(1 mg/ml) CNBr 4MB 세파로스 비드(Amersham Pharmacia)로 4℃에서 2 시간 동안 사전 제거하였다. 사람 IgG 비드를 원심분리하여 제거한 후, 사전 제거한 용해물을 4℃에서 2 시간 동안 CNBr 4MB 세파로스 비드(1 mg/ml에 콘쥬게이트된)에 콘쥬게이트된 모노클로날 항체 mu-항-KID24와 인큐베이션하였다. mu-항-KID24 비드를 원심분리하여 2 시간 인큐베이션한 후 제거하였다. 사람 IgG 및 mu-항-KID24 비드를 각각 1 ml 용해 완충액으로 3회 세척한 후 1 ml HBSS+로 3회 세척하였다. 세척한 비드를 30 ㎕의 SDS-PAGE 샘플 완충액을 첨가 하고 99℃에서 5 분 동안 끓여서 용리하였다.
그 후, 샘플을 4-20% Novex 구배 겔(Invitrogen)에 용해시켜 0.2 um 니트로 셀룰로스 멤브레인(Invitrogen) 상에 옮기고 mu-항-KID24 5 μg/블롯 또는 염소-항-ADAM-9 항체 5 μg/블롯으로 웨스턴 블롯팅하여 시각화하였다.
HRP 콘쥬게이트된 스트렙타비딘으로 검출하기 위하여, 먼저 니트로셀룰로스를 1 시간 동안 차단 완충액(0.05% 트윈-20 (TBST, Sigma Chemicals)을 함유한 트리스 완충 식염수 중의 5% 탈지분유)으로 차단하였다. HRP 콘쥬게이트된 스트렙타비딘을 1 μg/ml의 PBST에 희석하고 실온에서 30분 동안 니트로셀룰로스에 노출하였다. 그 후, ECL로 시각화하기 전에 니트로셀룰로스를 3회 세척하였다.
이 프로토콜 및 mu-항-KID24 항체를 사용한 결과는 환원 조건 하에 약 75 kDa에서 특정 분자량의 밴드를 나타낸다. 염소-항-ADAM-9 항체를 사용했을 때, 동일한 분자량의 특정 밴드가 또한 존재하였다. 이 실험 결과는 도 1에 도시하였다.
실시예 5. 이중질량분석기( MS / MS )를 사용한 mu -항- KID24 가 결합하는 항원의 특성화
mu-항-KID24가 결합하는 항원을 분리하여 Kane et al., J Bio Chem. 2002 June 21; 277(25):22115-8의 방법에 따라서 이중질량분석을 하였다. 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고, 겔을 콜로이드 쿠마시 블루 시약(Invitrogen)으로 염색하였다. 관심있는 단백질을 겔에서 트립신으로 분해하였다. 문헌(Wu et al., Nature 405: 477-82 (2000))에 설명된 바와 같이, 트립신에 의해 생긴 펩티드를 이온 트랩 질량분석기(Thermo-Finnigan LCDQ DECA XP) 상에서 모세관 액체 크로마토그래피 MS/MS로 시퀀싱하였다. 대안적으로, 질량분석법의 다른 보통의 공지된 방법, 예를 들면 MALDI 질량분석법을 본 발명의 실행시 사용할 수 있다.
실시예 6. 면역조직화학 방법
암 환자의 동결한 조직 샘플을 OCT 화합물에 포매하고 이소펜탄에서 드라이아이스로 급속냉동시켰다. 동결절편을 Leica 3050 CM 마이크로톰으로 두께 8-10 um으로 절단하여 수퍼프로스트 플러스 슬라이드(VWR #48311-703)에 해동 탑재하였다. 절편을 10℃에서 75% 아세톤/25% 에탄올로 고정하고 실온에서 2-4 시간 공기 건조하였다. 고정된 절편을 사용할 때까지 -80℃에 저장하였다.
면역조직화학을 위하여, 조직 절편을 회수하여 트리스 완충 0.05% 트윈(TB-T)에서 세척하고 실온에서 30분 동안 차단 완충액(TB-T7 5% 정상 염소 혈청 및 100 μg/ml 아비딘)으로 차단하였다. 그 후, 실온에서 60-90분 동안 차단 완충액(1 μg/ml)에서 희석된 mu-항-KID24 및 대조군 모노클로날 항체와 인큐베이션하였다. 그 후, 절편을 차단 완충액으로 3회 세척하였다. 결합한 모노클로날 항체를 염소 항-마우스 IgG+ IgM(H+L)F(ab')-페록시다제 콘쥬게이트 및 0.1 M 아세트산나트륨 완충액 pH 5.05 중의 페록시다제 기질 디아미노벤지딘(1 mg/ml, Sigma cat. No. D5637) 및 0.003% 과산화수소(Sigma cat. No. H1009)로 검출하였다.
어떤 경우에, 적합한 항원 회수 방법을 사용한 후 파라핀 포매된 포름알데히드로 고정한 조직을 면역조직화학에 사용할 수 있다. 이러한 항원 회수 방법은 문헌(Mangham and Isaacson, Histopathology 35:129-33 (1999))에서 설명한다. 당업자는 항원 회수 및/또는 검출의 다른 방법들을 사용할 수 있다. 동결된 조직, 또는 적합한 경우 고정된 조직을 사용하여 항원 회수 및 폴리MICA 검출을 수행하였다. 다양한 정상 조직과 암 조직에 대한 항-KID24 항체의 결합을 평가하였다. 모든 경 우에, 대조군 고정된 조직에 결합한 항체는 동결된 조직의 그것과 상호연관이 있었다. 두 개가 대조군에서 맞지 않은 경우에만 동결된 조직의 결과물을 사용하였다.
편의상, 다른 공급원의 동결된 수술 조직을 사용한 몇몇 실험의 조합된 결과의 요약을 아래 표 1, 표 2, 및 표 3에 나타낸다.
정상 사람 조직에서 KID24의 분포
조직 유형 결과
피부 1+ 땀샘 및 +/- 기저 표피
간 음성
신장 1+ 세뇨관
폐 음성
췌장 음성(1+일부 췌관세포에 염색)
사람 종양 조직에서 KID24의 분포
조직 유형 결과
결장 5/5 종양에 1+ 내지 2+ 염색
유방 4/4 종양에 음성
췌장 4/4 종양에 +/- 내지 2+ 염색
전립선 3/4 종양에 1+ 내지 2+ 염색; 1/4 종양에 음성
신장 4/5 종양에 음성; 1/5 종양에 +/- 염색
폐 6/7 종양에 +/- 내지 3+ 염색; 1/7 종양에서 음성
난소 4/4 종양에 음성
IHC 분석에 의한 종양 조직에서의 KID24 과발현
유방암 결장암 폐암 췌장암 전립선암
종양 공급원:
임상체학
7/13
12/12
9/12
9/13
5/12
종양 공급원:
수명
3/4
4/4
5/8
4/4
4/4
실시예 7. 면역세포화학 결과
모노클로날 항체 mu-항-KID24를 사용하여 다른 유형의 조직의 다양한 세포주와의 반응성을 시험하였다. 그 결과를 낮은 양성 염색은 '+', 중간 양성 염색은 '++', 강한 양성 염색은 '+++' 그리고 음성 염색은 '-'로 기록하였다.
WO 01/43869에 설명된 바와 같이 CellArrayTM 기술을 사용하여 역조직화학 결과를 얻었다. 프로테아제를 사용하여 다른 확립된 세포주의 세포를 성장 표면에서 제거하고, OCT 화합물에 넣어 포매하였다. 세포를 동결하고 절단한 후, 표준 IHC 프로토콜을 사용하여 염색하였다.
다양한 확립된 사람 정상 및 종양 세포주에 대한 mu-항-KID24 항체의 결합의 결과를 편의상 표 4에 만들었다. 표 4에 나타낸 실험은 본원에서 설명하는 방법을 사용하는 살아있는 세포 ELIS 및 CellArrayTM 결합 실험을 포함한다.
Figure 112007059396137-pct00001
Figure 112007059396137-pct00002
Figure 112007059396137-pct00003
추가 정상 사람 및 종양 세포주를 기술분야에 잘 공지된 표준 유세포측정 프로토콜을 사용하여 mu-항-KID24 결합에 대하여 시험하였다. 그 결과를 아래 표 5에 요약한다.
Figure 112007059396137-pct00004
실시예 8. mu -항- KID24 는 고정된 사람 ADAM -9에 결합한다.
표준 ELISA 과정 및 정제된 사람 ADAM-9를 사용하여 mu-항-KID24의 추가 특성화를 수행하였다. 간단히 말해서, 정제된 사람 ADAM-9를 포화 농도로 96-웰 플레이트에 코팅하였다. mu-항-KID24의 투여량 곡선이 결합(0-150 ng/웰)하도록 허용하였고 표준 ELISA 프로토콜을 사용하여 ADAM-9에 결합한 mu-항-KID24 항체를 시각화하였다. 그 결과는 mu-항-KID24는 정제된 사람 ADAM-9에 투여량 반응 방식으로 결합한다는 것을 나타냈다. 이들 결과는 mu-항-KID24가 항-ADAM-9 특이적 밴드를 면역침전시킬 수 있다는 것을 나타낸 이전의 웨스턴 블롯 결과(상기 실시예 4 참조)와 일치한다.
실시예 9. mu -항- KID24 는 시험관내에서 ADAM -9 효소 활성을 차단할 수 있다.
재조합 사람 ADAM-9 세포외 도메인(ECD) 및 mu-항-KID24 항체를 사용하여 시험관내 효소 활성 분석을 수행하였다. ADAM-9 ECD는 시험관내에서 아연의 존재하에 펩티드 기질(R&D 시스템 #E S003)을 절단할 수 있다. 절단되면, 펩티드는 320 nm의 여기 파장(및 405 nm의 여기 파장)에서 형광판 판독기를 사용하여 검출할 수 있는 형광 신호를 방출한다. 제조업자의 프로토콜에 따라서 시험관내 효소 분석을 수행하였다. 간단히 말하면, 200 ng/반응의 rhADAM-9 ECD (R&D 시스템 #939-AD-020)을 pH 9.0에서 25 mM 트리스 2.5 uM ZnC12, 및 0.005% Brij 35에 첨가하였다. 또한, 다양한 농도의 mu-항-KID24를 첨가하여, 이 반응물을 천천히 교반하면서 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 10 μM 형광 펩티드 기질(R&D 시스템 #ES003)을 첨가하여 최종 부피가 100 ㎕/웰이 되게 하였다. 반응물을 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후, O.D. 405 nm에서 플레이트를 형광 플레이트 판독기에서 판독하였다. ADAM-9 ECM이 없는 대조군 조건(효소 없음)은 형광을 나타내지 않았는데, 이것은 기질이 절단된 경우에만 형광감응성이 있기 때문이다. mu-항-KID24가 없는 양성 대조군 조건은 최대 형광을 나타내었다. mu-항-KID 24는 투여량 의존적 방식으로 ADAM-9 ECM 활성을 차단할 수 있다. 그 결과는 mu-항-KID24가 시험관내에서 ADAM-9 효소 활성을 차단할 수 있다는 것을 나타냈다.
실시예 10. mu -항- KID24 는 결장 종양 세포주 HCT116 , SW620 및 HT29 를 통한 연성 아가 콜로니 형성을 억제할 수 있다.
mu-항-KID24의 시험관내 효과를 세 결장 종양 세포주, HCT116, SW620 및 HT29에서 시험하였다. 당업계에 잘 공지된 연성 아가 콜로니 형성에 대한 표준 프로토콜을 사용하였다. mu-항-KID24는 최종 농도 1 μg/ml에서 HCT116 세포의 연성 아가 콜로니 형성을 대조군에 비해서 약 60% 억제할 수 있다. 유사한 결과를 SW620 세포(대조군에 비해서 14% 억제) 및 HT29 세포(대조군에 비해서 22% 억제)에서 확인하였다.
실시예 11. mu -항- KID24 및 독소- 콘쥬게이트된 항-마우스 IgG 의 내재화.
Mab-ZAP (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA)은 단백질 합성을 억제하는 독소인 사포린에 콘쥬게이트된 항-마우스 IgG이다. 이 독소는 세포막을 투과할 수 없다. 모노클로날 항체가 내재화할 수 있는 세포 표면 항원에 결합하면, 독소-콘쥬게이트는 결합된 모노클로날과 결합하여 내재화될 수 있으며, 결국 세포를 죽일 수 있다. 독성활성의 증거에 대한 내재화에 의존하여, Mab-ZAP는 주어진 표면 항원이 세포독성 효과를 발현하기 위하여 내재화에 의존하는 어떤 독소의 적합한 표적으로 작용할 것인지 여부를 평가하는 역할을 할 수 있다. 이와 같이, Mab-ZAP은 마이탄시노이드 및 칼리케아미신과 같은 내재화-의존성 독소의 모델로 작용한다.
종양세포에 의한 mu-항-KID24 및 사포린 콘쥬게이트된 항-마우스 IgG의 내재화 및 사포린의 내재화 후 종양세포를 죽이는 효과를 시험하기 위하여, 사라 난소 종양 세포주 ES-2 및 사람 췌장 선암 세포주 HPAF-II를 10 mM EDTA로 원액 플라스크에서 제거하고 원심분리하였다. 세포를 적합한 성장배지에 50,000 세포/ml로 재현탁하고 96-웰 플레이트에 웰 마다 100 ㎕를 플레이팅하였다. 항체 mu-항-KID24를 적합한 웰에 10x 농도로 즉시 첨가하여 최종 농도 10 μg/ml을 만들었다. 실온에서 15분 후, Mab-ZAP(Cat. # IT-04)을 적합한 웰에 10x 농도로 첨가하여 최종 농도 0.001 nM 내지 10 nM로 만들었다. 성장 4일 후, MTT를 37℃에 4 시간 동안 첨가하였다(PBS 중의 원액 5 mg/ml, 웰 당 1:10 희석). 그 다음, 배지를 모든 웰에서 제거하고 100 ㎕/웰 DMSO를 첨가하였다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 블루 MTT 침전물을 용해시키고 플레이트를 O.D. 540 nm에서 플레이트 판독기에서 판독하였다.
Mab-ZAP을 0.01 nM 첨가했을 때 mu-항-KID24의 부재시의 염색과 비교하여 mu-항-KID24의 존재시에 ES-2 및 HPAF-II 세포에서 MTT 염색의 감소가 있었는데, 이는 사람 암세포 ES-2 및 HPAF-II의 성장이 mu-항-KID24 및 Mab-ZAP의 존재시에 억제되고 mu-항-KID24 및 독소 콘쥬게이트된 항-마우스 IgG가 내재화되었다는 것을 나타낸다. 이 실시예의 방법에 따른 내재화 실험의 결과는 mu-항-KID24가 내재화된다는 것을 나타낸 도 2에 나타낸다.
실시예 12. 사람 종양의 피하 옆구리 모델에서 mu -항- KID24 항체의 항-종양 효능
이 연구는 D54 세포(신경교종 세포주)로 구성된 사람 종양을 사용한 피하 옆구리 모델에서 항-KID24 항체의 투여량-반응성 항-종양 활성을 시험하기 위하여 설계되었다.
배양된 D54 세포를 Matrigel(페놀 레드 없음, Becton Dickinson Biosciences Discovery Labware) 및 PBS (1:1) 용액에 5 x 105 세포의 밀도로 현탁하고 피하주사를 통하여 누드 마우스의 옆구리에 이식하였다. 접종 후 19일에, 결과의 이종이식은 약 100 mm3이었고, 마우스를 무작위로 그룹핑하여, 무게를 재고 100mg/kg mu-항-KID24 항체 또는 MAb 대조군으로 처리하였다. 항체를 주 3회 IP주사로 투여하였다. 투여로 생긴 스트레스를 균등화하기 위해서 대조군에 비히클의 샴 주사를 공급하였다. 처리하는 동안 매일 동물을 조사하였고 평균 종양부피(MTV)를 주 3회 평가하였다. 체중 및 사망률의 변화를 결정함으로써 동물의 독성을 평가하였다.
mu-항-KID24로 처리한 마우스는 연구의 마지막에(접종 후 42일) 비히클 및 대조군 항체로 처리한 마우스에 비해서 현저히 더 작은 종양크기를 가졌다(약 45% 더 작음, p<0.02). 또한 mu-항-KID24 항체의 60 mg/kg 투여량에서 유사한 경향이 관찰되었다.
또한, 사람 섬유육종 세포, HT1080를 사용하는 추가 실험을 SCID-Beige 마우스에서 수행하였다. 5x105 세포를 PBS에 현탁하고 동일한 부피의 Matrigel(페놀레드 없음, Becton Dickinson Biosciences Discovery Labware)과 혼합하고 SCID-Beige 마우스의 옆구리에 접종하였다. 접종 후 5일에, 마우스를 비히클(PBS), 100 mg/kg 대조군 항체 또는 100 mg/kg mu-항-KID24 항체의 IP 주사로 처리하였다. 종양 부피는 평균±SEM, n=10 동물/그룹으로 표현된다. 종양 크기로 측정된 종양 성장의 억제 %를 연구의 마지막에 결정하였다(접종 후 16일).
mu-항-KID24로 처리한 마우스는 비히클 및 대조군 항체로 처리한 마우스에 비해서 현저히 더 작은 종양 크기(19% 더 작음, p<0.05)를 가진다.
실시예 13. 신장피막하 종양 모델에서 mu -항- KID24 항체의 항-종양 및 항-전이 효능.
이 연구는 머켈 세포암종(피부의 신경내분비암)에서 배양된 머켈 세포를 사용하여 신장피막하 종양 모델에서 항-KID24 항체의 투여량-반응성 항-종양 활성을 시험하기 위하여 설계되었다.
I형 래트-꼬리를 표준방법에 의하여 준비하였다. 간단히 말해서, 성숙한 번식 래트로부터 꼬리를 제거하여 힘줄을 제거하여 무게를 쟀다. 1 g의 힘줄은 100 ml의 콜라겐 용액을 생산하고, 각각의 꼬리는 약 1 내지 1.5 g의 힘줄을 산출한다. 콜라겐을 추출하기 위하여, 힘줄을 페니실린, 스트렙토마이신 및 펀지존을 함유한 희석된 아세트산 용액(100 ml 물에 힘줄의 g 당 200 ㎕의 빙초산)에 넣고 적어도 1 주일 동안 4℃에서 부드럽게 교반하였다. 그 다음, 용액을 원심분리하고 콜라겐 상청액을 사용할 때까지 4℃에 보관하였다.
이 연구를 위하여, 얼스 균형잡힌 염 용액(Earle's Balanced Salt Solution; EBSS), NaOH 및 NaHCO3을 함유한 세팅 용액에서 래트-꼬리 콜라겐을 중합하여 50 ㎕의 콜라겐 버튼을 준비하였다. 중합화 후, 콜라겐 버튼 당 5 x 105 머켈 세포를 첨가하였다. 이식하기 전에 세포를 37℃에서 밤새 콜라겐에 접종하였다.
신장피막하에 세포의 이식을 위하여, 마우스를 트리브로모에탄올로 완전히 마취시켰다. 세포를 위치시키기 위하여 신장 캡슐에 주머니를 만들었는데, 이는 우측 및/또는 좌측 신장에 대한 허리주위 수술 접근법을 통하여 이루어졌다. 어떤 연구에서, 두 신장은 이종이식을 받았다. 수술 후, 가열된 표면에서 동물을 회복시키고 마취에서 완전히 회복될 때까지 관찰하였다. 수술 후 10일에 상처 클립을 제거하였다.
각 처리 투여 군에서, mu-항-KID24를 PBS에 적합한 농도로 희석하여 0.01 ml/체중g을 투여하였다. 대조군에는 PBS를 투여하였다(0.01 ml/체중 g). 이식 후 2일에 투여를 개시하고, mu-항-KID24 및 PBS 대조군의 투여량을 복강내에 단일 고속 주사로 3 주 동안 주 2회 투여하였다.
투여 기간의 마지막에, 동물을 안락사시키고 종양 및 인접 조직을 제거하여 PCR 분석하는 동안 밤새 프로테이나제 K(1.45 mg/ml) 및 RN아제 A(0.07 mg/ml)를 함유한 소화 완충액에 접종하였다.
PCR 분석을 위한 주형을 발생시키기 위하여, 제조업자의 지시에 따라서 Wizard SV 유전체 정제시스템(Promega)을 사용하여 유전체 DNA를 종양에서 분리하였다. 각 DNA 샘플을 최종 부피 200 ㎕에 재현탁하였다.
사람 리보솜 유전자 RPL19에 특이적인 프라이머 및 프로브로 Applied Biosystems SDS7000 시스템에서 리얼타임 PCR을 사용하여 종양에서 사람 DNA의 양을 정량하였다.
먼저 각 샘플을 BstX1으로 분해하여 효율적인 증폭을 확인하였다. 각 반응 혼합물은 5 ㎕의 주형 DNA, 5 ㎕ Taqman Gold 10x 반응 완충액(Applied Biosystems), 5 유닛 BstX1, 4 mM MgCl2, 2.5 mM 각각의 디옥시뉴클레오티드 믹스, 250 mM 각각의 프라이머, 150 nM 프로브, 1.5 유닛 Taqgold (Applied Biosystems) 및 최종 부피 50 ㎕의 물을 함유하였다. 사용된 열 순환 조건은 BstX1 분해를 위하여 45℃에서 30분, BstX1 비활성화 및 Taq 핫 스타트를 위하여 95℃에서 10분, 이어서 95℃에서 20초(변성) 및 60℃에서 1분(연장)의 40 순환이었다.
400 내지 0.09 ng DNA/반응 범위의 사람 유전체 DNA(BD Biosciences Clonetech)의 4배 순차적 희석을 사용하여 표준곡선을 만들었다. 샘플 DNA 농도를 표준곡선으로부터 삽입하였다. 각 종양 샘플을 3배 PCR 반응에서 분석하여 평균 DNA 농도를 결정하였다. 이 실험들로부터, 50 mg/kg 농도의 mu-항-KID24로 처리한 머켈세포 종양은 대조군 PBS로 한 종양과 비교할 때 사람 DNA의 양에서 50% 감소를 나타냈다.
확립된 머켈세포 종양에서 유사한 신장피막하 실험을 수행하였다. 머켈세포를 전술한 바와 같이 처리하고 종양을 전술한 바와 같이 이식하였다. 항체 투여 전에 종양을 21일 동안 성장시켰다. 종양 이식 후 21일에, 마우스를 50 mg/kg mu-항-KID24 또는 PBS 대조군으로 3 주 동안 주 2회 투여하였다. 연구 마지막에, 마우스를 희생시키고 종양을 제거하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, mu-항-KID24로 처리한 마우스의 종양은 PBS로 처리한 마우스에서 발견된 종양보다 현저히 더 작다. 전이는 PBS로 처리한 마우스의 장막, 횡격막, 비장, 난소 및 폐에서 확인할 수 있다. mu-항-KID24로 처리한 마우스에서는 아무런 전이도 확인하지 못했다. 도 4A는 PBS로 처리한 마우스의 장막을 나타낸다. 화살표/화살표머리는 조직에서 발견될 수 있는 전이를 지시한다. 도 4B는 mu-항-KID24로 처리한 마우스의 장막을 나타낸다. 어떤 전이도 그 조직에서 볼 수 없다(해부현미경 하에서).
본원에 설명한 실시예 및 구체예는 오로지 설명하기 위한 목적이고 그것에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제시될 것이며 이 출원서의 사상과 범위 내에 포함되는 것으로 이해해야 한다. 본원에 인용된 모든 문헌, 특허 및 특허출원은 각각의 문헌, 특허 또는 특허출원이 참고문헌으로 포함되도록 구체적으로 그리고 개별적으로 지시된 것과 동일한 범위로 모든 목적을 위해서 전부 참고문헌으로 본원에 포함된다.

Claims (28)

  1. 정제된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로서,
    상기 항원 결합 단편은 상기 정제된 항체의 결합 특이성을 보유하는 것이고,
    상기 정제된 항체 및 상기 항원-결합 단편은, KID24에 특이적으로 결합하며, ATCC No. PTA # 5174의 기탁 번호를 갖는 하이프리도마로부터 생산되는 항체의 중쇄로부터의 세 개의 상보성 결정 영역과 경쇄로부터의 세 개의 상보성 결정 영역을 포함하고,
    적어도 하나 이상의 다음의 특징을 가지는 정제된 항체 및 그것의 항원-결합 단편:
    a. 암세포에서 KID24에 결합하는 능력;
    b. 시험관내 또는 생체내에서 살아있는 암세포의 표면에 노출된 KID24의 일부에 결합하는 능력;
    c. 치료제 또는 검출가능한 마커를 KID24를 발현하는 암세포에 전달하는 능력; 및
    d. 치료제 또는 검출가능한 마커를 KID24를 발현하는 암세포 안에 전달하는 능력.
  2. 제1항에 있어서, 상기 암세포는 유방암, 결장암, 대장암, 신장암, 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위암 및 골암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정제된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 사람화된 것을 특징으로 하는 정제된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 키메라화된 것을 특징으로 하는 정제된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
  5. 제1항에 따른 정제된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 생산하는 방법으로서,
    a. 상기 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이 발현되는 조건 하에서 하이브리도마를 성장시키는 단계; 및
    b. 발현된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 수확하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 하이브리도마는 기탁번호 ATCC No. PTA # 5174를 가지는 것을 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 유방암, 결장암, 대장암, 신장암, 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위암 및 골암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암을 치료하기 위한 약학적 조성물로서, 약학적으로 허용되는 담체와 함께 청구항 1에 따른 정제된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 포함하는 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 정제된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 사람화된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 정제된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 키메라화된 것을 특징으로 하는 정제된 약학적 조성물.
  11. 기탁 번호 ATCC No. PTA # 5174를 가지는 분리된 세포주.
  12. 제11항에 따른 세포주에 의하여 생산되는 항체.
  13. 화학치료제와 연관된 청구항 1에 따른 정제된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 포함하는 화학치료제를 암세포에 전달하기 위한 약학적 조성물로서, 상기 암세포는 유방암, 결장암, 대장암, 신장암, 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위암 및 골암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 정제된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 사람화된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 정제된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 키메라화된 것을 특징으로 하는 정제된 약학적 조성물.
  16. 유방암, 결장암, 대장암, 신장암, 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위암 및 골암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암세포에 검출가능한 마커를 전달하기 위한 약학적 조성물로서, 약학적으로 허용되는 담체와 함께 청구항 1에 따른 정제된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 포함하는 약학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 정제된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 사람화된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 상기 정제된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 키메라화된 것을 특징으로 하는 정제된 약학적 조성물.
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