MEDIOS DE CULTIVO DE CELULAS
Campo de la invención El campo de la invención está en el medio de la biología celular. Más específicamente, se refiere a un medio de cultivo de células para propagar células aisladas de tejidos humanos. En particular, está dirigida a un medio de cultivo libre de suero que contiene de preferencia fructosa como la principal fuente de energía. El medio soporta el establecimiento y crecimiento de cultivos de células humanas primarios y se puede usar para cultivo de células a largo plazo . Antecedentes de la invención El uso de sistemas de cultivo de células in vitro es crítico para el campo de la biología celular y para el entendimiento de los mecanismos de acción detrás de las enfermedades humanas. Se ha aislado una amplia variedad de tipos de células de mamífero a partir de órganos y tejidos de mamíferos, ya sea a partir de tejidos normales o de tejidos en estado de enfermedad, tales como tumores y metástasis . Diferentes tipos de células comúnmente tienen requerimientos nutricionales individuales y por lo tanto, muchos medios distintos han sido desarrollados específicamente para satisfacer el requerimiento nutricional de los diferentes tipos de células . Muchos de estos medios contienen suero como un KEF.: 170121
aditivo, tales como FBS (suero bovino fetal) , HS (suero de caballo) y CS (suero de becerro). El uso -de suero puede ser prohibitivo económicamente cuando se cultivan células a gran escala. Además, el uso de suero puede ser problemático, incluso a pequeña escala, toda vez que contiene un número de ingredientes no caracterizados que pueden variar de lote en lote. Además, el suero contiene factores inhibidores de crecimiento y de diferenciación, así como desestabiliza el material genético llevando a cambios genéticos y eventualmente a la senescencia (Loo et al., Science 236 (4798) :200-2 (Apr. 10, 1987)) de las células. El uso de un medio químicamente definido y libre de suero resuelve todos estos problemas. F-12:DME (1:1 v/v) se desarrolló originalmente para la propagación de células en un sistema libre de suero y químicamente definido (Mather et al., Experimental Cell Research 120:191-200,1979; Bottenstein et al., Methods in Enzymology 58:94-109, 1979). Estos medios pueden usarse con una amplia variedad de células en condiciones con o sin suero. El medio NCTC-135 es otro medio formulado para el cultivo de células libre de suero (Evans et al . , Experimental Cell Research 36:439-448, 1964). Tsao et al. , formularon un medio nutriente -designado MCDB 152- complementado con factores de crecimiento y hormonas específicos para el crecimiento de células epidérmicas humanas (Tsao, M C. et al., J. Cellular Physiology. 110:219-229
(1982) ) . Refinamientos adicionales de este medio llevan al desarrollo de un medio- conocido como MCDB 153 (véase Boyce, S. T. and Ham, R. 3., J Invest. Dermatol. 81:33-40 (1983)). El uso de estos medios lleva a una caracterización más precisa de los requerimientos necesarios de factores de- crecimiento, hormonas y Ca24 para la conservación de una alta eficiencia de clonación que es necesaria para mantener una programación genética adecuada en el subcultivo continuo de células madre epidérmicas básales pluripotenciales . Véase también Wille, J. J. et al., J Cellular Physiol. 121:31-44 (1984) y patente de E.U.A. 5,834,312 y los diferentes medios descritos ahí. Muchos medios para hacer crecer células en cultivo se describen en la literatura o están disponibles comercialmente . El derivar un medio óptimo para las necesidades de cultivo de células específicas puede llevar a mejoras en el crecimiento de las células incluyendo velocidades de crecimiento incrementadas, crecimiento hasta altas densidades de células, control de la etapa y cantidad de diferenciación celular, incremento en la secreción de proteínas, estabilidad fenotípica y genética incrementada y eliminación de la senescencia para muchos tipos de células. Para optimizar los medios de cultivo de células para el crecimiento, modular los niveles de glucosa puede cambiar la capacidad de las células para crecer en una condición de alta densidad celular. Los niveles de glucosa también son
importantes para la velocidad de proliferación celular. Ya que las células metabolizan en cultivo, el ácido láctico comúnmente se produce como un subproducto de la glicólisis. Esto lleva a una rápida caída en el pH, causando eventualmente la muerte celular. El uso de fructosa en medios de cultivo de células como la principal fuente de energía de . carbono teóricamente llevaría a la producción reducida de ácido láctico. Varios investigadores han comparado los efectos metabólicos de la fructosa y glucosa en el crecimiento y aspectos morfológicos de células tales como fibroblastos humanos. Otros han comparado fructosa y galactosa. Por ejemplo Delhotal et al . reportaron cuatro a cinco veces menos producción dé lactato cuando se usó fructosa en lugar de glucosa en el cultivo de células de hígado y fibroblastos de piel humana (Xn vitro 20(9): 699-706, 1984). Véase también, Delhotal et al., In Vitro Cell Dev Biol .. 23 (5) :355-60 (mayo de 1987); olfrom et al., Exp Cell Res. 149 (2) ·.535-46 (diciembre de 1983); Ba ngrover et al., J Cell Sci 78:173-89 (1985); Low et al., Dev Biol. Stand 60:73-9 (1985). Véase también Mochizuki et al., Cytotechnology 13(3): 161-73 (1993), que compara el uso de medios de cultivo de células que contienen ya sea fructosa o glucosa para la producción de anticuerpos monoclonales humanos . A pesar de estos esfuerzos de investigación, la glucosa es aún la principal fuente de energía de carbono en la mayoría de las formulaciones de cultivo de células disponibles comercialmente .
Aunque la mayoría de los estudios de cultivo de células usan líneas de células establecidas, en algunos casos es preferible el uso de un cultivo de células primario. Bastante comúnmente las líneas de células establecidas se .derivan. da.tejidos^en. estado de enfermedad tales como -tumores o células que han sufrido cambios cromosómicos . Para poder estudiar las propiedades de las células in vitro que son removidas recientemente de una situación in vivo, comúnmente se requiere un cultivo primario. Dadas las complejas interacciones entre las células en un órgano o tejido, derivar un cultivo primario de un tipo de célula específica aislado de tejidos puede ser problemático. Establecer un cultivo primario de un tipo de célula específica, sin embargo, puede lograrse a través de la optimización de los nutrientes, factores de fijación y factores de crecimiento presentes en el medio de cultivo. En consecuencia, un objetivo de esta invención es preparar un medio de cultivo que soporte el crecimiento de un cultivo de células de mamífero primario a partir de una variedad de tejidos. Otro objetivo de esta invención es proporcionar un medio de cultivo que esté libre de suero y pueda usarse tanto en cultivos de células a pequeña escala como a gran escala. Un medio de cultivo de células que sea versátil, pero definido, sería extremadamente valioso para el propósito de crear nuevas líneas de células y recursos a partir de una variedad de tejados primarios.
Breve descripción de la invención La invención proporciona medios de cultivo libres de suero que contienen de preferencia fructosa como la principal fuente de energía. Estos medios de cultivo son útiles para __5—establecer y propagar-células-d -mamífero-pr-imar-ias ais-ladas de te idos y para la propagación de líneas de células establecidas en cultivo. Los medios son particularmente adecuados para -el cultivo primario y cultivo a largo plazo de células fetales humanas. En ciertas modalidades, las células cultivadas de 10 acuerdo con los métodos de esta invención, en los medios de esta invención, son de preferencia células de ductos pancreáticos, túbulos renales o epiteliales prostéticas de fetos humanos. Un método para cultivar células de acuerdo con la 15 presente invención comprende inocular un sistema de cultivo de células con células, y mantener al sistema de cultivo de células bajo condiciones adecuadas para promover el crecimiento de células. Una población que duplique el tiempo de aproximadamente diez (10) a aproximadamente cuarenta (40) horas 20 caracteriza el crecimiento celular logrado en estos métodos. Más aún, las células pueden cultivarse en serie para lograr un número deseado de duplicaciones de población. En una modalidad preferida, el medio es ' referido en la presente como I3F y contiene una combinación seleccionada de 25 nutrientes de medio básicos, fructosa y ciertas sales
divalentes . En una modalidad particularmente preferida del medio I3F, están presentes los siguientes componentes a las concentraciones finales indicadas: cloruro de calcio a 180 mg/L, cloruro de potasio a 298 mg/L, nitrato de potasio a 0.0126 mg/L, sulfato de magnesio a 68 mg/L, cloruro de magnesio a 37 mg/L, cloruro de sodio a 6,200 mg/L, bicarbonato de sodio a 1,200 mg/L, fosfato de sodio a 43 mg/L, fosfato de sodio (dibásico) a 88 mg/L, selenita de sodio a 0.0126 mg/L, metavanadato de amonio a 3.51 x 10"4 mg/L, ácido molíbdico a 3.72 x 10"3 mg/L, sulfato cúprico a 7.5 x 10"4 mg/L, sulfato ferroso a 0.25 mg/L, sulfato de manganeso a 4.53 x 10"5 mg/L, sulfato de zinc a 0.259 mg/L, fructosa a 2,000 mg/L, HEPES a 15 mM, putrescina a 0.048 mg/L, ácido tióctico a 0.0618 mg/L, piruvato de sodio a 110.03 mg/L, ácido linoleico a 0.025 mg/L, 1-alanina a 20.173 mg/L, 1-asparagina (base libre) a 17.5 mg/L, 1-asparagina a 122.01 mg/L, ácido 1-aspártico a 24.99 mg/L, 1-cistina a 63.98 mg/L, 1-cisteína a 5.268 mg/L, ácido glutámico a 56.9 mg/L, 1-glutamina a 600 mg/L, glicina a 23.25 mg/L, 1-histidina a 35.69 mg/L, 1-isoleucina a 74.68 mg/L, leucina a 77.43. mg/L, 1-lisina a 113.16 mg/L, 1-metionina a 22.34 mg/L, 1-fenilalanina a 47.69 mg/L, 1-prolina a 38.36 mg/L, 1-serina a 32.55 mg/L, 1-treonina a 70.07 mg/L, l-triptófano a 11.81 mg/L, 1-tirosina a 75.17 mg/L, 1-valina a 69.31 mg/L, biotina a 1.13 10"2 mg/L, D-Ca-pentotenato a 2.87 mg/L, ' cloruro de colina a
6.99 mg/L, ácido fólico a 3.2 mg/L, I-inositol a 10.45 mg/L, niacinamida a 2.81 mg/L, piridoxal a 2.8 mg/L, piridoxina a 1.85 x 10"2 mg/L, riboflavina a 0.291 mg/L, tiamina a 2.9 mg/L, vitamina B12 a 4.99 x 10~2 mg/L. El pH de esta modalidad particularmente preferida es de- -7.2-. . la osmolaridad-,es de 290 mOsm. La concentración de estos componentes puede ser variada dentro de escalas adecuadas y preferibles de acuerdo con las enseñanzas de esta invención para optimizar así el crecimiento de un tipo de célula particular en cultivo. Los medios de cultivo de células de esta invención son complementados deseablemente con factores de crecimiento, y optimizados de acuerdo con el tipo celular individual que se desee cultivar. Esta complementación y optimización están dentro de la capacidad ordinaria en la técnica. En algunas modalidades preferidas, la invención es un medio de cultivo de células que puede ser complementado con cualquiera o todos los siguientes factores de crecimiento a los siguientes niveles aproximados (o dentro de un dígito significativo) : insulina a 10µg/ml, transferrina a 10 )Lig/ml, (humana recombinante o de otras fuentes y/o especies) , factor de crecimiento epidérmico a 10 ng/ml, somatotropina (porcina o de otra especie) a 0.005 Ul/ml, extracto pituitario (porcino o de otra especie) a 1 µ?/ml y aprotinina a 10 g/ml. En algunas modalidades preferidas, los medios de cultivo de células y los métodos de esta invención están
particularmente bien adaptados para establecer cultivos primarios de células fetales humanas. En modalidades particularmente preferidas y adicionales, la invención es un método en el cual el medio de cultivo se utiliza para establecer cultivos primarios de células de ductos epiteliales pancreáticos humanos aisladas de tejido pancreático, células epiteliales de próstata humana aisladas de tejido de próstata o células epiteliales de riñon humanas aisladas de tejido renal. En otras modalidades, se usan métodos similares para cultivar células aisladas de otros tejidos, tales como los del grupo que consiste en tejidos de los siguientes sistemas biológicos: Sistema nervioso central : Encéfalo - Cerebro (materia gris y blanca que contiene neuronas, glia, etc.) y Encéfalo Cerebelo, Ojo, Tallo Cerebral (protuberancia, médula, encéfalo medio) , Espina Dorsal; Endocrino: Adrenales (corteza y médula) , Ovario, Páncreas (Isletas de Langerhans y páncreas exócrino) , Paratiroides, Pituitaria (adenohipóf sis y neurohipófisis) , Testículos, Tiroides (epitelio folicular, células parafoliculares, coloides, etc.); Senos: Senos (lóbulos, ductos, células mioepiteliales, etc.); Hematopoyético: Bazo, Anginas, Timo, Médula ósea (linfocitos, monocitos/macrófagos, granulocitos, precursores eritroides, megacariocitos, células cebadas, osteoclastos, osteoblastos) , células de sangre periférica (neutrófilos, linfocitos, monocitos, basófirlos, eosinófilos, glóbulos : rojos, plaquetas) ; Respiratorio: Pulmón
(bronquios, bronquiolos, alveolos, etc.); Cardiovascular: Corazón, vasos sanguíneos (arberias, venas, etc.); Gastrointestinal: Esófago, Estómago (fondo), Intestino delgado (íleon, yeyuno o duodeno) , Colon, Hígado (tríadas portales, -Gé-lui-a-s—-hepáticas, -.etc-.-) , - Glándulas -salivares;- ^Genitourinario: Riñon, Tracto urinario, Vejiga, Uréter, Uretra, Trompas de Falopio, Vagina, Placenta, Próstata, Útero, Cerviz; Músculoesquelético: Músculo esquelético; Piel: Piel (epidermis, apéndices, dermis) ; Nervio periférico: Nervio periférico; Células mesoteliales: células de revestimiento de la pared del pecho, pared abdominal, pericardio o de la superficie de muestras gastrointestinales, cardiacas y/o pulmonares, etc. En otra modalidad preferida la invención es un medio de cultivo de células que puede ser complementado con etanolamina a una concentración final de 1 µ?, fosfoetanolamina a una concentración final de 1 M, triyododitironina a una concentración final de 5 M, selenio a una concentración final de 25 nM, hidrocortisona a una concentración de 1 nM, progesterona a una concentración final de 10 riM, forscolina a una concentración final de 1 µ? y heregulina a una concentración final de 10 nM. En otra modalidad particularmente preferida más, la invención es un medio de cultivo de células que puede ser complementado con factores de matriz extracelular tales como fibronectina o laminina.
En otra modalidad particularmente preferida, la invención comprende métodos en los cuales el medio de cultivo se utiliza en el cultivo de células de ductos epiteliales pancreáticos humanos. En 0tra modalidad -preferida-, la -invención-- es un método en el cual los medios de cultivo se utilizan para establecer cultivos primarios de células de riñon humanas, particularmente células epiteliales de riñon fetal, aisladas de tej idos de riñon fetal . En otra modalidad preferida, la invención es un método en el cual los medios de cultivo son utilizados en el cultivo y expansión (de dos a ocho pasadas) de células epiteliales de riñon fetal humano. Breve descripción de las figuras La figura 1 muestra el establecimiento y cultivo de tejido renal fetal humano en pasaje 0 (cultivo primario), 4, 6 y 7. Estas células fueron cultivadas en medio I3F con complementos de crecimiento de acuerdo con el ejemplo 1 de la presente . La figura 2 muestra las comparaciones de cultivos primarios de células de ductos epiteliales pancreáticos humanos cultivadas en tres medios diferentes. En el panel A, las células se establecen en medio CMRL 1066 durante tres días y se cultivan en medio F12-.DME (50:50 v/v) . En el. panel B, las células se establecen y cultivan en medio I3F con la adición de
15 mM de glucosa. En el panel C, las células se establecen y cultivan en medio I3F. Las figuras 3A-3C muestran los niveles de ARN mensajero (AR m) de un marcador de células de fibroblasto (vimentina) y el marcador de células epiteliales (citoqueratina 19) , y las velocidades de crecimiento de cultivos primarios de células de ductos epiteliales pancreáticos humanos . En la figura 3A, los niveles de ARNm de vimentina se miden en células que fueron establecidas en medio CMRL 1066 durante tres días y se cultivaron en medio F12:D E (50:50 v/v) , células que fueron establecidas y cultivadas en medio I3F con la adición de 15 mM de glucosa y en células que fueron establecidas y cultivadas en medio I3F. Como' un control positivo, se usó ADNc pancreático humano adulto comprado comercialmente (Ambion, Inc., Austin, Texas) y los resultados se expresan en efecto por (-) veces cuando se comparan con este control positivo. En la figura 3B, los niveles de ARNm de citoqueratina 19 (ckl9) fueron medidos en las mismas condiciones que las descritas en la figura 3A. En la figura 3C, los niveles de ARNm de insulina se midieron en las mismas condiciones que las descritas en la figura 3A. Descripción detallada de la invención Definiciones Los términos "medio de cultivo de células" y "medio de cultivo" se refieren al ambiente acuoso en el cual células de vertebrado crecen en cultivo. El medio comprende el ambiente
fisioguímico, nutricional y hormonal. Tradicionalmente el medio ha sido formulado mediante la adición de factores nutricionales y de crecimiento necesarios para el crecimiento o supervivencia de las células. _ ___ __ Un _ medicL definido" se . refiere a,_,un medio que comprende los requerimientos nutricional-es y hormonales necesarios para la supervivencia y crecimiento de las células en cultivo de tal manera que los componentes del medio se conocen. Un medio definido proporcionado por el método de esta invención establece un ambiente local para una célula particular que puede ser diferente del ambiente general del medio. La expresión "incrementar la supervivencia de una célula" se refiere al acto de incrementar la duración del marco de vida viable de una célula particular en cultivo de células. La frase "incrementar la proliferación de una célula" abarca la etapa de incrementar la velocidad y/o grado de división celular en cultivo de células en relación a una célula no tratada. Un incremento en la proliferación celular en cultivo de células puede detectarse al contar el número de células antes y después del cultivo en los medios de cultivo de células descritos en la presente. El grado de proliferación puede cuantificarse mediante examen microscópico del porcentaje y número de figuras mitóticas en el cultivo y el grado de confluencia. La proliferación celular también puede
cuantificarse por otros métodos usados comúnmente. El término "cultivo a largo plazo" se refiere a células que son capaces de supervivencia y crecimiento cuando se les pone en un medio de cultivo que contiene los nutrientes y- factores -de -crecimiento adecuados -sin- entrar en-quiescencia . En ciertas modalidades preferidas, las células se pasan en "cultivo a largo plazo" durante al menos preferiblemente 40, y muy preferiblemente 60, duplicaciones de población de cultivo de células . El término "pasaje" o "división" se refiere al sub-cultivo de células o a la transferencia o transplante de células (con o sin dilución) de un recipiente de cultivo a otro con la adición de una mezcla de nutrientes fresca. El término "cultivo primario" se refiere a células que son aisladas directamente de tejidos y disociadas unas de otras, y que son capaces de la supervivencia y/o crecimiento cuando se les pone en un medio de cultivo que contienen los nutrientes y factores de crecimiento adecuados . El término "quiescencia" se refiere a un estado en el que las células en cultivo dejan de estar en fase de crecimiento y dejan de dividirse. "Medio libre de suero" se refiere a un medio que carece de suero animal. Las hormonas, factores de crecimiento, proteínas de transporte, factores de fijación, hormonas péptidas y similares encontrados típicamente en suero que son
necesarios para la supervivencia o crecimiento de células particulares en cultivo se agregan típicamente como suplementos definidos a medios libres de suero. En cultivos de células de vertebrados, especialmente cultivos de células derivadas de humanos, la "senescencia" es la propiedad atribuible a cultivos de células finitos, llámese, su incapacidad para crecer más allá de un número finito de duplicaciones de población. El determinar las mezclas de componentes particulares y a su vez proporcionar un medio definido requerido por una célula particular se puede lograr por la persona de capacidad ordinaria en el cultivo de células. Existen varios enfoques conocidos para determinar requerimientos para una línea de células dada. El método de elección dependerá de la línea de células. Se conocen varias posibilidades, las variaciones a los métodos requiriendo sólo de la selección de una densidad de inóculos adecuada y el inicio de pruebas de varias combinaciones de componentes de medios para sus efectos promotores de crecimiento. Como alternativa, si las células producen un producto deseado y lo secretan en el medio, entonces las pruebas pueden ser de varias combinaciones de componentes de medios para sus efectos en el nivel de secreción del producto deseado. Una mezcla de nutrientes usada para cultivar células de mamífero en cultivo típicamente proporciona al menos un
componente de una o más de las siguientes categorías: una fuente de carbono o energía, normalmente en forma de un carbohidrato tal como glucosa o glutamina, u otros azúcares tales como sucrosa, galactosa, mañosa, fructosa o similares, aminoácidos "esenciales" -y "no esenciales" que - -proporcionan nitrógeno entre otras -cosas, vitaminas a bajas concentraciones que son cofactores en reacciones enzimáticas, otros compuestos orgánicos que se requieran a bajas concentraciones tales como grasas y componentes solubles en grasa incluyendo ácidos grasos y precursores de fosfolípidos, elementos residuales que se definen como compuestos inorgánicos o elementos que ocurren naturalmente requeridos a bajas concentraciones, normalmente en la escala micromolar, y sales inorgánicas. La complementación con nutrientes de los medios de cultivo de células se conoce bien en la técnica. Ejemplos de complementos comúnmente usados para cultivos libres de suero y sus concentraciones efectivas se dan en la tabla 8.2 de Mather y Roberts, Introduction to Cell And Tissue Culture (Plenum Press, 1998) . La mezcla de nutrientes de esta invención puede ser opcionalmente complementada con uno o más componentes de acuerdo con métodos conocidos, tales como de las siguientes categorías : hormonas y otros factores de crecimiento tales como, por ejemplo, insulina, testosterona, transferrina y factor de crecimiento epidérmico, nucleósidos tales como adenosina y timidina, reguladores de pH tales como HEPES (ácido
(4- [2-hidroxetil] -1-piperazin-etansulfónico) y proteínas de la matriz extracelular tales como fibronectina . El medio de cultivo puede cambiarse en varios intervalos (por ejemplo, aproximadamente cada uno a cinco días-)-,— y .--las-- células- cultivarse -. a - una,.-^-temperatura fisiológicamente aceptable de entre alrededor de 33 grados a 38 grados centígrados, de preferencia a aproximadamente 37 grados centígrados . Los sistemas de cultivo de células de la presente invención comprenden un medio de cultivo de células como el' descrito en la presente, y un substrato para las células tales como aquellos comúnmente en uso actual o identificados posteriormente, tales como aquellos que comprenden metal, plástico, polímeros tipo poliuretano, vidrio, colágeno, gel, fibras huecas, fibronectina, laminina, sulfato de heparina, proteoglucanas, microportadores compuestos de o recubiertos con cualquiera de los anteriores, o un equivalente de tejido. La selección de los sistemas de tejido de células para usarse en la presente invención se hace de acuerdo con métodos comúnmente conocidos en la técnica, tomando en consideración las fuerzas cortantes a las cuales podría ser sometido el cultivo de células, el ambiente gaseoso y los requerimientos particulares de la célula y el medio que será provisto. Los medios de cultivo de células de esta invención están par icularmente bien adaptados para usarse en cajas de
cultivo de tejidos, tubos, pocilios, biorreactores de fibras huecas, fermentadores , matraces centrífugos, botellas giratorias y similares. Se describe un medio de cultivo de células libre de suero que contiene fructosa como la principal fuente de. energía de carbono. El -desarrollo de esta invención se basa en parte en el descubrimiento de que los medios de cultivo de células son capaces de soportar el establecimiento y crecimiento de cultivos primarios derivados a partir de una variedad de tejidos humanos. En su forma más amplia, esta invención abarca un medio de cultivo de células de mamífero con fructosa como la fuente de carbono primaria y ciertos niveles de sales de calcio, magnesio y potasio. Estas sales inorgánicas y fructosa, las escalas de concentración adecuadas y las escalas de concentración preferidas en miligramos por litro (mg/L) se enlistan a continuación en la tabla 1. Tabla 1 Sales inorgánicas y fructosa Sal inorgánica Conc. adecuada. Conc. preferida (mg/L) (mg/L) Cloruro de calcio (CaCI2) 0-270 150-200 Cloruro de potasio (KCI) 150-500 250-350 Nitrato de potasio (KN03) 0.006-0.02 0.010-0.015
Sulfato de magnesio (MgS04) (anhidro) 30-110 40-90 Cloruro de magnesio 6HO 15-60 25-40 Fructosa 1000-3000 1500-2500
Por motivos de conveniencia, los ingredientes sólidos del medio pueden combinarse entre sí, y esta mezcla se puede almacenar como una sola unidad. Una variedad de sales metálicas inorgánicas, comúnmente llamadas elementos residuales, también están presentes típi-camente en esta invención a ciertos niveles de concentración. Estos elementos residuales y sus escalas de concentración adecuadas en miligramos por litro (mg/L) se listan a continuación en la tabla 2. Tabla 2 Elementos residuales
Elemento residual Conc. adecuada (mg/L) Conc. preferida (mg/L)
Selenita de sodio (NaSe035H20) 0.006-0.02- 0.010-0.015 Metavanadato de amonio 1.5 x 10^-5.3 x 10^ 2.5 x 10^x10-4
Acido molíbdico-4H2 (amonio) 1.5x10-3-5.6x10-3 2.5x10-3-4.0x10"3 Sulfato cúprico-5H20 3.75x10^-1.2x10'3 5x10^-1.0x10"3 Sulfato ferroso-7H20 0.1-0.4 0.15-0.3 Sulfato de manganeso 2x10-b7x10"¾ s.sxio ^.sxio-6 Sulfato de zinc-7H20 0.1-0.4 0.20-0.35
Por motivos de convenienei a , estos elementos residuales se preparan normalmente como una solución de abastecimiento acuosa concentrada, de preferencia alrededor de 10,000 veces más grande que la concentración final deseada cuando se añade al medio. Las concentraciones listadas en la tabla 2 son las concentraciones finales en el medio de cultivo. Todos los veinte aminoácidos esenciales y el
aminoácidos no esencial cistina, también están presentes en los medios de esta invención a ciertos niveles de concentración. Estos aminoácidos y las concentraciones adecuadas y preferidas en miligramos por litro (mg/L) se listan a continuación en la tabla" 3 . "" Tabla 3 Aminoácidos
Aminoácido Conc. adecuada Conc. preferida (mg/L) (mg/L) L-alanina 10-40 15-30 L-asparagina (base libre) 8-35 15-25 L-asparagina-H20 2-10 4-7.5 L-arginina-HCI 60-250 100-175 ácido L-aspártico 10-50 20-35 L-cistina-2HCI 30-130 45-75 L-cisteína-HCI-H20 2-15 4-9 ácido L-glutámico 20-120 45-75 L-glutamina 300-1200 500-1000
Glicina 10-50 25-40 L-histidina HCI-H20 15-75 25-45 L-isoleucina 35-150 55-100 L-leucina 35-155 55-100 L-lisina-HCI 50-230 95-150 L-metionina 10-45 15-35 L-fenilalanina 20-100 45-75 L-prolina 15-80 25-65 L-serina 15-70 25-65 L-treonina 35-145 50-100 L-triptófano 5-25 10-20 L-tirosina (sal disódica) 35-155 50-100 L-valina 30-140 60- 10
También están presentes típicamente una variedad de vitaminas en esta invención a ciertos niveles de concentración. Estas vitaminas y las concentraciones adecuadas y preferidas en miligramos por litro (mg/L) se listan a continuación en la tabla 4 . Tabla 4 Vitaminas Vitamina Conc. adecuada (mg/L) Conc. preferida (mg/L) Biotina 5.6x10"3-1.7x10 8.5x10-a-1.3x10'2 D-Ca-pantotenato 1.4-4.3 2.2-3.5 Cloruro de colina 3.4-10.5 5.5-8.0 Acido fólico 1.5-4.8 2.5-4.0 l-inositol 5-16 8-12.5 Niacinamida 1.0-4.5 2.2-3.2 Piridoxal HCI 1.0-4.5 2.2-3.2 Piridoxina-HCI 9.2x1 ?^.d ??"2 1.0x10'2-2.0x10-z Riboflavina 0.1-0.5 0.2-0.4 Tiamina-HCI 1.4-4.5 2.5-3.8 Vitamina B-12 0.02O-0.075 0.035-0.06
Otro complemento que se usa en la práctica de esta invención es regulador de pH de HEPES (ácido (4 - [2-hidroxietil] -1-piperazin-etansulfónico) a una concentración adecuada de alrededor de 5 a 50 mM, de preferencia 5 a 25 mM y muy preferiblemente a una concentración de alrededor de 10-15 mM. Se pueden usar otros reguladores de pH orgánicos comúnmente conocidos en la práctica de esta invención. Otros complementos orgánicos se usan en esta
invención a ciertos niveles de concentración. Estos complementos y sus concentraciones adecuadas y preferidas en miligramos por litro (mg/L) se listan en la tabla 5 a continuación. Tabla 5 Otros complementos Complementos mise. Conc. adecuada (mg/L) Conc. preferida (mg/L) Putrescina-2HCI 0.02-0.08 0.?3-0.065 Acido tióctico 0.03-0.10 0.05-0.08 Piruvato de sodio 55-165 90-140 Acido linoleico 0.01-0.04 0.01-0.03
Los medios de cultivos de células de esta invención pueden contener algunos o todos los componentes listados en las tablas 1 a 5. Para algunas aplicaciones, el medio de cultivo de células es complementado en forma deseable con hormonas de crecimiento tales como insulina a una concentración final de 0.1-100 Aig/ml y de preferencia 10 µg/ l, transferrina a una concentración final de 0.1-100 zg/ml y de preferencia de 10 /¿g/ml, somatotropina (porcina o de otra especie) a una concentración final de 0.0005-0.05 Ul/ml y de preferencia de 0.005 Ul/ml, extracto pituitario porcino (o de otra especie) a una concentración final de 0.1-10 /-tg/ml y de preferencia de 1 µ9/t?1 y aprotinina a una concentración final de 0.5- 100 g/ml y de preferencia de 10 µ9/t?1. Además de estos factores de
crecimientos, el medio de cultivo de células puede, para algunas aplicaciones preferidas, contener factor de crecimiento epidérmico (recomb nante humano o de otra especie o fuente) a una concentración final de 0.1-100 ng/ml y de preferencia 10 ng/ml . En otra modalidad preferida, el medio de cultivo de células es complementado en forma deseable con fibronectina a una concentración final de 0.1-50 µg/ml y de preferencia de 5 MS/ml . En otras modalidades preferidas, el medio de cultivo de células se complementa en forma deseable con etanolamina a una concentración final de 0.1 - 10 µ? y preferiblemente de 1 µ?, fosfoetanolamina a una concentración final de 0.1-10 µ? y preferiblemente de 1 µ?, triyodotironina a una concentración final de 1-25 pM y de preferencia de 5 pM, selenio a una concentración final de 0.1-100 nM y de preferencia de 25 nM, hidrocortisona a una concentración final de 0.1-50 nM y de preferencia de 1 nM, forscolina a una concentración final de 0.1-50 µ?? y de preferencia de 1 µ? y heregulina a una concentración final de 0.1-50 µ? y de preferencia de 10 nM. Los medios de cultivo de células de esta invención tienen de preferencia fructosa como su fuente de energía esencial, en combinación con una selección de al menos un componente adicional seleccionado de los sustituyentes provistos en la presente, y se diseñan para optimizar el
crecimiento de las células o líneas de células particulares deseadas . Preparación de los medios La preparación de estos medios de cultivos de células de la invención empleará métodos convencionales bien conocidos en la técnica. Siguiendo un método preferido, se enjuaga el recipiente que se usará para la preparación del medio dos veces con agua purificada y se cubre el recipiente, con papel aluminio para mantenerlo fuera de la luz. Se llena el recipiente con agua purificada hasta un volumen que sea menor que el volumen final deseado que permitirá una incorporación suficiente de sólidos y otros ingredientes. Un volumen conveniente y satisfactorio es diez a 25 por ciento (10 a 25%) menos que el volumen deseado final. Se multiplican los g/L deseados de cada componente por el número de litros necesarios para obtener la cantidad en gramos de ese componente que será agregado. Se pondera la cantidad necesaria de cada uno de los ingredientes sólidos. Los ingredientes sólidos incluidos aquí se considera que son aminoácidos, vitaminas, fructosa y sales inorgánicas tales como sales calcio, sales potasio, sales magnesio, sales sodio, sales amonio, sales cobre, sales hierro, sales manganeso y sales zinc. Por motivos de conveniencia, los sólidos pueden mezclarse y añadirse al agua purificada en una etapa. Después de la adición del bicarbonato de sodio, se deja que el medio se mezcle durante quince a veinte (15-20)
minutos . Después se revisa el pH y debe ser de entre 6.5 y 7.2. El pH debe ser entonces ajustado a 7.2-0 usando de preferencia hidróxido de sodio (NaOH) , ya sea en forma líquida (10 M) o sólida (aunque otros medios para el ajuste del pH se abarcan en esta -invención) Cuando -se- ajusta el pH, se añade el HEPÉS y se deja que el medio se mezcle quince a veinte (15-20) minutos. Se ajusta la osmolaridad (una medida de los sólidos disueltos totales en el medio, medida en el número de osmoles por litro) hasta el nivel adecuado. Una escala satisfactoria sería 290-325 mOsm. La osmoralidad puede revisarse convenientemente usando un osmómetro. Usando un osmómetro con parámetros de 100 mOsm y 500 mOsm por duplicado, se revisan tres (3) muestras del medio. Se promedian las tres (3) muestras y se calcula la cantidad de sal necesaria para llevar a la osmoralidad al nivel deseado. Ejemplo: Si la osmoralidad deseada es de 290 mOsm y el promedio de las tres lecturas es 82.33, el cálculo usado de preferencia de acuerdo con esta invención para la cantidad de sal (cloruro de sodio o cualquier otra sal adecuada) necesaria para lograr la osmoralidad deseada sería como sigue: · Se resta el promedio de las tres lecturas de la osmoralidad deseada. • Se multiplica el resultado por un multiplicador fijo, en este ejemplo, 0.031. • Se multiplica el resultado por el volumen final deseado .
• El resultado es la cantidad de sal (NaCl) en gramos que se requiere para poder lograr la osmoralidad deseada. Para un volumen final deseado de cuarenta (40) litros, el cálculo de una modalidad preferida de esta invención
290-82.33 = 207.67 x 0.031 = 6.437 g/L x 40 litros = 257.51 gramos de NaCl . Se añade la sal y se deja que el medio se mezcle durante treinta a cuarenta y cinco (30-45) minutos y, de nuevo, 10 se revisan tres (3) muestras del medio. Los medios deben estar al nivel de osmoralidad deseado. En una campana de cultivo, se filtran hasta ser estériles (de preferencia un filtro de 0.22 µt? o más fino) los medios en botellas para medios de vidrio u otro recipiente 15 adecuado para almacenamiento. Todos los medios de cultivo de células de esta invención pueden formularse y empacarse como una preparación seca o concentrada para su reconstitución antes de usar. En modalidades preferidas de esta invención, el medio se prepara 20 como un polvo seco que contiene todos o algunos de los componentes del medio. Por motivos de conveniencia, cada ingrediente puede ser ponderado en una cantidad predeterminada, y subgrupos de componentes (tales como las sales o aminoácidos, por ejemplo) pueden combinarse juntos y almacenarse como la 25 mezcla de complementos de aminoácidos . Cualquier componente
restante puede después agregarse cuando el medio seco sea reconstituido. La reconstitución puede hacerse justo antes de usar. Como alternativa, el medio puede ser reconstituido y empacado. La vida útil de este medio como un polvo seco almacenado a aproximadamente 4 grados C es de al menos varios años. El medio líquido, ya sea como se haya preparado o como se haya reconstituido a partir de los polvos secos, es menos estable, pero cuando se almacena a aproximadamente 4 grados C, de preferencia en la oscuridad, es estable durante aproximadamente seis semanas a dos meses o más. La reconstitución se puede llevar a cabo añadiendo soluciones concentradas de bicarbonato, base de otros de los componentes del medio, siempre y cuando las concentraciones relativas descritas en la presente estén presentes. Si esos componentes se agregan como sólidos, se logra la reconstitución mediante la adición de agua estéril, desionizada, purificada u otra agua grado cultivo de tejidos. El medio se esteriliza antes de usar, de acuerdo con métodos conocidos. Las etapas anteriores constituyen la preparación del medio básico de esta invención. Antibióticos, de preferencia gentamicina (a 50-150 /¿g/ml) y/o penicilina (a 5-10 U/ml) -estreptomicina (a 5-10 µg/ml) pueden añadirse si se considera necesario. Después de la filtración, complementos adicionales, incluyendo, por ejemplo, alimentos residuales o factores de crecimiento pueden añadirse a los medios. Los elementos
residuales, se preparan de preferencia como una solución de abastecimiento y se añaden para lograr la concentración final deseada. Los factores de crecimiento deben añadirse de preferencia justo antes de usar los medios hasta la concentración final deseada. En algunas modalidades, otros azúcares pueden usarse para complementar los medios de esta invención. Los azúcares incluyen comúnmente pero no están limitados a glucosa, sucrosa y galactosa. Uso de los medios, métodos y células Los medios de esta invención son particularmente útiles para el cultivo primario de células humanas de una amplia variedad de tejidos. El cultivo de preparaciones de tejidos en estos medios es adecuado para, y frecuentemente puede dar como resultado, el establecimiento de un cultivo primario que sea predominantemente células epiteliales que puedan usarse para establecer un cultivo a largo plazo. Estas células tienden a establecerse rápidamente, pueden ser subcultivadas para más pasajes, y tienen un tiempo de duplicación de población más rápido cuando se les compara con células establecidas en los medios actualmente disponibles públicamente . Las células cultivadas de acuerdo con los métodos de esta invención pueden obtenerse de fuentes de tejidos como las descritas en la presente, o pueden a su vez ser células previamente en cultivo. Las células pueden ser transformadas o
no transformadas, o inmortalizadas de acuerdo con otros métodos practicados comúnmente en la técnica. Para que las células sean producidas a partir de tejidos, las células se preparan típicamente al picar un tejido que— comprende—las —células, -obten endo de -esta- -manera una subestructura del tejido o células libres, después concentrando las subestructuras o células, resuspendiendo las subestructuras o células concentrados en un medio de cultivo de esta invención que sea capaz de soportar una división celular prolongada, incubando el cultivo y pasando el cultivo periódicamente. La presente invención proporciona además un método para preparar cepas clónales, el método comprende las etapas de preparar un cultivo de células como el descrito arriba, hacer crecer el cultivo en una capa de células confluente, disociar las células, inocular las células en otro recipiente de cultivo que contenga un medio acondicionado de esta invención para un primer plaqueo, cosechar las colonias de células individuales, inocular las colonias en otro recipiente de cultivo para un segundo plaqueo y pasar las células resultantes periódicamente. Esta invención proporciona cultivos de células expandidos que se preparan usando los métodos mostrados en la presente, y métodos para usar estos cultivos de células en ensayos de diagnóstico, en tratamientos terapéuticos y para la producción de productos de proteínas deseados. Para usarse en el cultivo de células, el medio de
esta invención se inocula típicamente con las células seleccionadas. De preferencia, el volumen del inoculo será del orden de aproximadamente un quinto (o menos) del volumen del medio, aunque alguna variación a partir de este volumen de inoculo puede hacerse de acuerdo con los métodos comúnmente conocidos . Después de la inoculación el cultivo ele células se mantiene en un ambiente adecuado, tomando en consideración factores tales como temperatura, luz, oxígeno y concentración de dióxido de carbono. El medio preparado puede usarse para el cultivo de varias células de mamífero. En el caso de cultivos primarios, los tejidos digeridos con enzimas se tratan para neutralizar las enzimas y/o se lavan extensamente para removerlas, se resuspenden en el medio y luego se colocan sobre placas de cultivo. En el caso de un cultivo de células continuo, las células se resuspenden típicamente a la concentración deseada en el medio y se remueven de la placa, se lavan y luego se colocan sobre placas de cultivo. En cierto método preferido, las placas de cultivo son pre-recubiertas con proteínas de membrana de basamento tales como fibronectina, para asegurar una adherencia adecuada. Las poblaciones de células resultantes pueden ser expandidas y cosechadas para usarse en una variedad de ensayos biológicos. Además, las células pueden cultivarse a largo plazo y, de acuerdo con la práctica de esta invención, pueden dar
como resultado una línea de células que puede ser pasada durante un periodo de tiempo deseado, con una expansión significativa de la población de células (10 a 1000 veces) . Como alternativa, el propio medio de cultivo puede ser recogido y ensayado para proteínas u otros compuestos orgánicos secretados por las células. Los medios de esta invención pueden usarse para cultivar células en una variedad de sistemas de cultivo de células como los descritos arriba. Estos sistemas se usan para cultivar células como una monocapa, o de preferencia, para cultivar las células -en suspensión. Las células pueden cultivarse como un cultivo a pequeña escala, es decir en volúmenes de aproximadamente dos (2) litros o menos. Como alternativa, y de preferencia en ciertas modalidades, las células se cultivan en grandes volúmenes tales como de hasta aproximadamente dieciséis litros en recipientes centrífugos o alrededor de 80 litros o más en termentadores diseñados para la producción comercial de compuestos biológicos a partir de células de animales. Las propias células o un compuesto biológico dentro de las células pueden ser el producto final deseado del cultivo. Si así es, pueden ser cosechadas y separadas del medio del cultivo. Las células cultivadas y recuperadas de acuerdo con las enseñanzas de esta invención son adecuadas para su suministro a un individuo que requiera el crecimiento de estas
células dentro del mismo, tal como para el recrecimiento de tejido dañado o enfermo/ o como sistemas in vivo para el suministro de un producto celular. Los métodos de esta invención también pueden usarse para incrementar la supervivencia .y¡o proliferación, .de . células ...deseadas dexivadas de un individuo, esto facilitando transplantes autólogos en el individuo. Como alternativa, una proteína u otro compuestos orgánico secretado por las células en el medio puede ser el producto final deseado del cultivo. En esta situación, el medio puede ser separado de las células, y el compuesto de interés puede purificarse después del medio. Modalidades preferidas seleccionadas En ciertas modalidades preferidas, la invención comprende una composición de medio de cultivo de células libre de suero que tiene una fuente de energía primaria que consiste esencialmente en fructosa presente a una concentración de 3,000 mg/L a 1, 000 mg/L. En otra modalidad, la composición del medio de cultivo consiste en las siguientes sales inorgánicas a la escala de concentraciones indicada: cloruro de calcio a una concentración de 270 mg/L a 0 mg/L, cloruro de potasio a una concentración de 500 mg/L a 150 mg/L, nitrato de potasio a una concentración de 0.02 mg/L a 0.006 mg/L, sulfato de magnesio (anhidro) a una concentración de 110 mg/L a 30 mg/L y cloruro de magnesio a una concentración de 60 mg/L a 15 mg/L.
En otra modalidad, la composición del medio de cultivo consiste en las siguientes sales inorgánicas a la escala de concentraciones indicada: cloruro de calcio a una concentración de 270 mg/L a 0 mg/L, cloruro de potasio a una concentración..de _500 -mg7-L_a_15-0—mg/L,—nitrato_de- potasio a una concentración de 0.02 mg/L a 0.006 mg/L, sulfato de magnesio (anhidro) a una concentración de 110 mg/L a 30 mg mg/L y cloruro de magnesio a una concentración de 60 mg/L a 15 mg/L. En ciertas de estas y otras modalidades, las composiciones de esta invención comprenden un medio de cultivo de células que consiste en las siguientes sales metálicas inorgánicas, comúnmente llamadas elementos residuales, a la escala de concentraciones indicada: selenita de sodio a una concentración de 0.02 mg/L a 0.006 mg/L, metavanadato de amonio a una concentración de 5.3 x 10"4 mg/L a 1.5xl0~4 mg/L, ácido molíbdico (amonio) a una concentración de 5.6 x 10~3 mg/L a 1.5xl0~3 mg/L, sulfato cúprico a una concentración de 1.2 x 10"3 mg/L a 3.75 x 10~4 mg/L, sulfato ferroso a una concentración de 0.4 mg/L a 0.1 mg/L, sulfato de manganeso a una concentración de 7 x 10"5 mg/L a 2 x 10"5 mg/L y sulfato de zinc a una concentración de 0.4 mg/L a 0.1 mg/L. En otras modalidades más, el medio de cultivo de esta invención consiste en los siguientes aminoácidos a la escala de concentraciones indicada: 1-alariina a una concentración de 40 mg/L a 10 mg/L, 1-asparagina (base libre) a una concentración
de 35 mg/L a 8 mg/L, l-asparagina-¾0 a una concentración de 10 mg/L a 2 mg/L, 1-arginina a una concentración de 250 mg/L a 60 mg/L, ácido 1-aspártico a una concentración de 50 mg/L a 10 mg/L, 1-cistina a una concentración de 130 mg/L a 30 mg/L, ácido 1-glutámico a una concentración de 120 mg/L a 20 mg/L, 1-glutamina a una concentración de 1200 mg/L a 300 mg/L, glicina a una concentración de 50 mg/L a 10 mg/L, 1-histidina a una concentración de 75 mg/L a 15 mg/L, 1-isoleucina a una concentración de 150 mg/L a 35 mg/L, 1-leucina a una concentración de 155 mg/L a 35 mg/L, 1-lisina a una concentración de 230 mg/L a 50 mg/L, 1-metionina a una concentración de 45 mg/L a 10 mg/L, 1-fenilalaniña a una concentración de 100 mg/L a 20 mg/L, 1-prolina a una concentración de 80 mg/L a 15 mg/L, 1-serina a una concentración de 70 mg/L a 15 mg/L, 1-treonina a una concentración de 145 mg/L a 35 mg/L, 1-triptófano a una concentración de 25 mg/L a 5 mg/L, 1-tirosina a una concentración de 155 mg/L a 35 mg/L y 1-valina a una concentración de 140 mg/L a 30 mg/L. En otras modalidades más, esta invención proporciona un medio de cultivo que consiste en las siguientes vitaminas a la escala de concentraciones indicada: biotina de 1.7 x 10"2 mg/L a 5.6 x 10"3 mg/L, D-Ca-pantotenato de 4.3 mg/L a 1.4 mg/L, cloruro de colina de 10.5 mg/L a 3.4 mg/L, ácido fólico de 4.8 mg/L a 1.5 mg/L, I-inositol de 16 mg/L a 5 mg/L, niacinamida de
4.5 mg/L a 1 mg/L, piridoxal de 4.5 mg/L a 1 mg/L, piridoxina de 2.8 x 10~2 mg/L a 9.2 x lü'3 mg/L, tiamina de 4.5 mg/L a 1.4 mg/L y vitamina B-12 de 0.075. mg/L a 0.02 mg/L. En ciertas de estas modalidades, el medio de cultivo
siguientes- componentes—misceláneos a la escala de concentraciones indicada: HEPES a lina concentración de 10-15 mL/L (v/v) , putrescina a una concentración de 0.08 mg/L a 0.02 mg/L, ácido tióctico a una concentración de 0.1 mg/L a 0.03 mg/L, piruvato de sodio a una concentración de 165 mg/L a 55
10 mg/L, ácido linoleico a una concentración de 0.04 mg/L a 0.01 mg/L y 1-cisteína a una concentración de 15 mg/L a 2 mg/L. En ciertas modalidades preferidas, el medio de cultivo consiste en los siguientes componentes a la escala concentraciones indicadas : Componente Concentración (mg/L) Sales inorgánicas:. Cloruro de calcio (CaCI2) 0-270 Cloruro de potasio (KCI) 150-500 Nitrato de potasio (KN03) 0.006-0.02 Sulfato de magnesio ( gS04) (anhidro) 30-1 0 Cloruro de magnesio -6H20 15-160 20 Cloruro de sodio (NaCI) 3100-9300 Bicarbonato de sodio (NaHC03) 600-1800 Fosfato de sodio (NaH2P04-H20) 20-70 Fosfato de sodio dibásico (Na2HP04) 40-150 Selenita de sodio (NaSe03-5H20) 0.006-0.02 Metavanadato de amonio ?.d???^-d^???"4
Componente Concentración (mg/L) Sales inorgánicas: Acido molíbdico-4H20 (amonio 1.5x 0-a-5.6x10-3
Sulfato cúprico-5H20 3.75x10 .2xW¿
Sulfato ferroso-7H20 0.1-0.4
Sulfato de manganeso 2x10-&-7x1O-°
Sulfato de zinc-7H20 0.1-0.4 Oíros componentes: Fructosa 1000-3000
HEPES 1?-15 mLJL (v/v)
Putrescina-2HCI 0.02-0.08
Acido tióctico 0.03-0.1
Piruvato de sodio 55-165
Acido linoleico 0.01-0.04 Aminoácidos: L-alanina 10-40 L-asparagina (base libre) 8-35 L-asparag¡na-H20 2-10 L-arginina-HCI 60-250
Ácido l-aspártico 10-50 L-cistina-2HCI 30-130
L-c¡steína-HCI-H20 2-15 Acido L-glutámico 20-120
L-glutamina 300-1200
Glicina 10-50 L-histidina HCI-H20 15-75 L-isoleucina 35-150
L-leucina 35-155
L-lisina-HCI 50-230
L-metionina 10-45 L-fenilalanina 20-100
L-prolina 15-80 L-serina 15-70
Componente Concentración (mg/L) L-treonina 35-145 L-triptófano 5-25 L-tirosina (sal disódica) 35-155 L-valina 30-140 Vitaminas: Biotina 5.6x 0- .7x10 D-Ca-pantotenato 1.4-4.3 Cloruro de colina 3.4-10.5 Ácido fólico 1.5-4.8 l-lnositol 5-16 Niacinamida 1.0-4.5 Piridoxal-HCI 1.0-4.5 Piridoxina-HCI 9.2x10_3-2.8x10 Riboflavina 0.10-0.5 Tiamina-HCI 1.4-4.5 Vitamina B12 0.020-0.075 PH 7.2 Osmolaridad (mOsm) 290-325
En modalidades -particularmente preferidas de esta invención, la fuente de energía primaria es fructosa y el medio de cultivo está libre de suero animal. Los siguientes ejemplos ilustran modos preferidos para llevar a la práctica esta invención, pero no deben considerarse que limitan el uso de la invención sólo a estos ejemplos. E emplos Ejemplo 1 Crecimiento de células de riñon humanas en cultivo Para obtener células de riñón humanas primarias de
tejido renal, y para cultivarlas en un cultivo de células sostenible, se describe el siguiente método ejemplar. Se preparan los medios de esta invención con o sin gentamicina y/o penicilina-estreptomicina a la concentración deseada. Se transfieren los ríñones o tejido renal de un sujeto humano o animal a este medio de lavado. Se remueven las membranas exteriores del riñon con fórceps . Los ríñones se sumergen brevemente en etanol al setenta por ciento (70%) y se transfieren a un medio de lavado fresco. Los ríñones se transfieren a una caja de Petri estéril y fresca y se pican con tijeras curvas. El tejido se resuspende en 10 mi de medio de lavado y se granula en una centrífuga a 1200 rpm durante 4 minutos. Las piezas de tejido se resuspenden deseablemente en el medio de esta invención que contiene colagenasa/dispasa (0.01-0.2%) durante la noche o durante alrededor de veinticuatro horas . Se remueve el medio de lavado y se repite esta etapa de lavado con otros 10 mi de medio de lavado fresco. Se remueve el medio de lavado y se resuspende la pella de células en siete mililitros (7 mi) del medio de esta invención complementado con insulina, transferrina, factor de crecimiento epidérmico, somatotropina, extracto de pituitaria porcino, aprotinina y gentamicina (esta modalidad particular será referida en la presente como "medio de crecimiento" ) . El medio de crecimiento se complementa además con fibronectina a una concentración de 5 Mg/ml en la colocación inicial de las
células en placas. Se distribuye la suspensión de las células en forma uniforme en cajas de cultivo estériles de 10 cm. Veinticuatro (24) horas después de la colocación en placas, se añaden tres --mxiilitros · de medio de crecimiento al cultivo-.- Se cambia el medio de crecimiento cada dos o tres días (2-3 días) por medio de crecimiento fresco. El cultivo de células primarias resultante de las células epiteliales renales puede pasarse cada 10 días (o según se requiera) sobre placas de 10 cm que estén pre-recubiertas con fibronectina a una concentración de 5 µg/ml. Este protocolo es adecuado para una variedad de tejidos renales de mamífero incluyendo, pero no limitados a, murinos, rata, cerdo, humano y feto humano. Los resultados de este protocolo llevado a cabo con ríñones fetales humanos se muestran en la figura 1. El panel superior izquierdo muestra las células en cultivo primario. El panel superior derecho muestra las células en el número de pasaje cuatro. El panel inferior izquierdo muestra las células en el número de pasaje seis. El panel inferior derecho muestra las células en el número de pasaje siete. Un gran porcentaje de células en esta etapa son quiescentes y han dejado de proliferar. Ejemplo 2 Crecimiento de células de riñon fetal humano Ríñones fetales humanos con una edad gestacional
entre 10 a 18 semanas se obtuvieron de Advanced Biosciences Research (Alameda County, California) . Los ríñones se procuraron y embarcaron al laboratorio en medio de cultivo de tejidos sobre hielo húmedo. Inmediatamente después de llegar, los ríñones fueron transferidos a medio de lavado (PBS frío que contenía penicilina/estreptomicina y gentamicina) . Se removieron las membranas exteriores con fórceps y los ríñones fueron lavados previamente en metanol al 70% y luego enjuagados dos veces en medio de lavado. Los ríñones fueron picados para crear cubos de 1 mm con tijeras quirúrgicas en una caja de cultivo seca de 100 mm. Las piezas de tejido se colocaron en 10 mi de un medio libre de suero definido y referido en la presente como Ml/3F" o "I3F" . El medio usado para este ejemplo contenía los siguientes componentes: cloruro de calcio (CaCl2) a 0.18 g/L, cloruro de potasio (KCl) a 0.298 g/L, nitrato de potasio (KN03) a 0.000012629 g/L, sulfato de magnesio (MgS0) (anhidro) a 0.068 g/L, cloruro de magnesio-€¾0 a 0.037 g/L, cloruro de' sodio (NaCl) a 6.2 g/L, bicarbonato de sodio (NaHC03) a 1.2 g/L, fosfato de sodio (NaH2P04-H20) a 0.043 g/L, fosfato de sodio dibásico (Na2HP04) a 0.088 g/L, selenita de sodio (NaSe03-5¾0) a 0.000012629 g/L, metavanadato de amonio a 0.000000351 g/L, ácido molíbdico-4H20 (amonio) a 0.00000372 g/L, sulfato cúprico-5H20 a 0.00000075 g/L, sulfato ferroso-7H20 a 0.0002502 g/L, sulfato de manganeso a 4.53E-08 g/L, sulfato de zinc-7H20
a 0.0002589 g/L, fructosa a 2 g/L, Hepes a 3.57 g/L, putrescina-2HCl a 0.0000483 g/L, ácido tióctico a 0.0000618 g/L, p ruvato de sodio a 0.11003 g/L, ácido linoleico a 0.00002523 g/L, L-alanina a 0.020173 g/L, L-asparagina (base Libre)—a 0.0-175 g/L-,- -.TL-asparagina-H20--a XL.0-Q45 jg/L., _ L-arginina-HC1 a 0.12201 g/L, ácido L-aspártico a 0.024993 g/L, L-cistina-2HC1 a 0.06398 g/L, L-ciste£na-HCl-H20 a 0.005268 g/L, ácido L-glutámico a 0.056913 g/L, L-glutamina a 0.6 g/L, glicina a 0.023253 g/L, L-histidina HC1-H20 a 0.035691 g/L, L-isoleucina a 0.074682 g/L, L-leucina a 0.077436 g/L, L-lisina-HCl a 0.113162 g/L, L-metionina a 0.022344 g/L, L-fenilalanina a 0.047688 g/L, L-prolina a 0.038359 g/L, L-serina a 0.032553 g/L, L-treonina a 0.070073 g/L, L-triptófano a 0.011812 g/L, L-tirosina (sal disódica) a 0.0751688 g/L, L-valina 0.069316 g/L, biotina a 0.000011299 g/L, D-Ca pantotenato a 0.0028714 g/L, cloruro de colina a 0.006988 g/L, ácido fólico a 0.0031972 g/L, I-inositol a 0.010446 g/L, niacinamida a 0.00281098 g/L, piridoxal HCl a 0.0028 g/L, piridoxina-HCl a 0.00001851 g/L, riboflavina a 0.00029128 g/L, tiamina HCl a 0.0029011 g/L, vitamina B12 a 0.0000499 ¦ g/L, pH a 7.2, osmolaridad a 295 mM. Las piezas de tejido se transf rieron a un tubo centrífugo de 15 mi y las piezas de tejido se centrifugaron a 1000 xg durante 5 minutos. Las piezas de tejido se r suspendieron I3F que . contenía insulina (10 ug/ml) , transferrina (10 ug/ml) , factor de crecimiento epidérmico (20
ng/ml) , somatotropina (0.005 Ul/ml) , extracto de pituitaria de cerdo (0.2%), suero de pollo (0.1%), gentamicina (100 ug/ml) , penicilina/estreptomicina (lx) y colagenasa/dispasa (0.1%) y se incubaron a 4°C durante la noche. Al día siguiente, se centrifugaron las piezas de tejido digeridas a 1000 xg durante 5 minutos y se lavaron dos veces con medio I3F. La pella se resuspendió en 10 mi de medio I3F que contenía insulina (10 ug/ml) , transferrina (10 ug/ml) , factor de crecimiento epidérmico (20 ng/ml), somatotropina (0.005 Ul/ml) , extracto de pituitaria de cerdo (0.2%) y suero de pollo (0.1%) y se cultivó en placas de 10 cm pre-recubiertas con fibronectin . Bajo estas condiciones de cultivo, las células de riñon fetal humano se fijaron a las placas de substrato recubierto y crecieron como una monocapa. Se cambió el medio de cultivo dos veces a la semana. Para cosechar las células, las monocapas de células fueron enjuagadas una vez con solución salina básica de Hank libre de calcio y magnesio, incubada en 10 mM de EDTA en solución salina básica de Hank a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Las células fueron desprendidas de la superficie de cultivo mediante pipeteo suave. La suspensión de células se granuló mediante centrifugación a 1000 xg durante 5 minutos. Se removió el sobrenadante y las células fueron resuspendidas en medio libre de suero (medio I3F) con adyuvante no desnaturalizador según fuera adecuado.
Ejemplo 3 Un método nuevo para la expansión y diferenciación de células de ductos pancreáticos humanos en células productoras de insulina - - -Uno-de—los—factores-. Limitativos, ..para,, la_ pxogrejsión del transplante de células de las isletas permanece siendo el suministro suficiente de células productoras de insulina. Se investigó un modelo de cultivo de células para mejorar la diferenciación de células ß in vitro iniciando a partir de células pancreáticas progenitoras humanas. Como se describe más completamente abajo, células de ductos epiteliales pancreáticos humanos (hPED) fueron aisladas y luego mantenidas en un "medio de ducto" libre de suero y definido (DM) . Este medio .específico permite que las células se dividan rápidamente y formen una monocapa epitelial homogénea. Sin embargo, estas condiciones definidas no soportan el crecimiento de células ß secretoras de insulina. Para promover su diferenciación en células ß, se desarrolló un segundo "medio de isletas" (IM) definido y libr-e de suero. El efecto de una transferencia de DM a IM en las células hPED fue seguido inicialmente por RT-PCR en tiempo real usando el método Ct comparativo para examinar el nivel de ARNm de insulina. En forma interesante, después de una incubación de 7 días en el medio IM, se observaron cambios en el nivel de transcriptos de insulina. Hubo un incremento significativo en el nivel de transcriptos de insulina en las células hPED
mantenidas en el IM en comparación con aquellas en el DM (aproximadamente 15-20 veces) . Adicionalmente, para extender esta observación inicial se midió la secreción de péptido C en cultivo usando un ensayo Elisa para péptido C específico humano. El nivel de proteínas de péptido C por célula fue significativamente más alto en condiciones en las que las células se cultivaron en medio IM y formaron agregados (aproximadamente 10 veces) . El estudio presentado en este ejemplo valida un proceso libre de suero de dos etapas que utiliza un medio (DM) para la expansión de la población no diferenciada y un segundo medio (IM) que promueve y soporta las células secretoras de insulina. Las células producidas de acuerdo con estos métodos usando los medios de la invención generan números significativos de células secretoras de insulina que son adecuadas para el transplante de isletas. Estas células también son útiles para facilitar el restablecimiento de normoglucemia en un individuo diabético. Se removieron todos los tejidos conectivos adicionales unidos a las pancreasas fetales humanas (gestacionales de 13-24 semanas) mediante microdisección. El tejido se picó para crear piezas de 0.5 mm3 a 1 mm3. Las piezas de páncreas picadas se sometieron después a digestión enzimática durante veinte (20) minutos a 37 grados centígrados en una mezcla de digestión que contenía los siguientes
componentes a 1 microgramo por mi ^g/ml) disueltos cada uno en solución salina de pH regulado con fosfato (PBS) : colagenasa tipo 4 (Worthington Biochemical Corporation) , inhibidor de tripsina de soya (MSTI") (Sigma) y hialuronidasa (Sigma) . Después del periodo de digestión, la mezcla de tejidos se trituró con una pipeta para lograr una suspensión uniforme de las células. Las células se lavaron después mediante centrifugación a 900 rpm durante 15 minutos a través de un gradiente de 5% de albúmina suero bovino (BSA) . Este gradiente comprendía 5% (p/v) de BSA grado cultivo de tejidos que se disuelve en cualquier medio de cultivo de tejidos disponible comercialmente y adecuado, o el medio mostrado por esta invención.' Un ejemplo adecuado de medio de cultivo de tejidos sería F12 : D E (50:50). El volumen de células y el volumen de la gradiente estuvo de preferencia a una relación de 1:1. El sobrenadante se descartó y la pella de células se resuspendió en los medios de esta invención complementados con los siguientes factores de crecimiento a las concentraciones finales indicadas: insulina humana recombinante (rhinsulina) a 10 /¿g/ml, transferrina a 10 µg/ml, factor de crecimiento epidérmico (EGF) a 5 ng/ml, etanolamina a una concentración de 1 µ?, fosfoetanolamina a una concentración de 1 µ?, triyoditironina a una concentración de 5 p , selenio a una concentración de 25 nM, hidrocortisona a una concentración de 1 nM, progesterona a una concentración de 10 nM, forscolina a una
concentración de 1 µ?, heregulina a una concentración de 10 nM, extracto de pituitaria porcina a 5 µ?/ml o 75 /¿g/ml de concentración de proteínas y aprotinina a 25 µg/ml. Las células resuspendidas se distribuyeron uniformemente en placas de cultivo de tejidos estériles de 24 pocilios y recubiertas con fibronectina . Las placas de cultivo de tejidos de 24 pocilios fueron pre-recubiertas con una solución de 5 g/ml de fibronectina diluida en el medio de esta invención. Las placas de cultivo de tejidos se pre-recubrieron al menos treinta (30) minutos antes de usar. Las células extraídas de páncreas de entre trece y dieciséis semanas de etapa gestacional se distribuyeron uniformemente en seis pocilios de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocilios. Las células extraídas de páncreas de entre diecisiete a veinticuatro semanas de etapa gestacional se distribuyeron uniformemente en doce pocilios de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocilios. Debido a que esta modalidad particularmente preferida los medios de esta invención no contiene ningún antibiótico o agente antimicótico, las células fueron colocadas en pocilios distintos para minimizar así la contaminación general de la preparación de cultivo primaria completa. Bajo las condiciones de cultivo anteriores, células de ductos pancreáticos y algunas células mesenquimá icas contaminantes unidas sobre la superficie de la placa dentro de
veinticuatro (24) horas. Las células empezaron a expandirse y a dividirse, formando finalmente un cultivo de células tipo monocapa. Los cultivos alcanzaron aproximadamente setenta y cinco por ciento (75%) de confluencia después de siete a diez días en cultivo y ahora eran adecuadas para subcultivo o pasaje a una división con una relación de 1:2. El medio se removió de las células y se apartó. Este medio será referido como medio "acondicionado" . Las células se lavaron después con PBS y se disociaron con una solución de colagenasa/dispasa, opcionalmente con STI , a 37 grados centígrados durante alrededor de 15 minutos. (En algunas modalidades, la etapa de disociación puede ser omitida) . Las células se lavaron después en una gradiente de 5% de BSA como la descrito arriba y se agruparon en un recipiente de cultivo de células más grande, tal como una caja de cultivo estéril de 100 mm. El medio de cultivo de células se cambió cada dos o tres días usando una relación 1:3 de medio "acondicionado" a medio fresco. Se recomienda pasar el medio a través de un filtro de 0.2 mieras para remover cualquier célula o materia particulada antes de su reintroducción en un cultivo de células, aunque otros métodos conocidos comúnmente para purificar o clarificar el medio pueden emplearse de acuerdo con las enseñanzas de esta invención. Los medios acondicionados y filtrados de esta invención pueden almacenarse a alrededor de cuatro a seis grados centígrados durante aproximadamente cuatro a seis a ocho
semanas antes de volverlos a usar. Las células pueden ser sub-cultivadas típicamente después de que alcancen 75% de confluencia, pero pueden ser sub-cultivadas anteriormente o posteriormente, o usarse en ensayos biológicos a cualquier confluencia deseada. Los resultados de llevar a cabo este protocolo en tres medios de cultivo diferentes se muestran en la figura 2. El primer panel muestra las células primarias de ductos pancreáticos fetales humanos establecidas en el medio disponible comercialícente C RL 1066 (Connaught Medical Research Labs) durante tres días y luego cultivadas en medio F:12-DME (50:50) complementado con los factores de crecimiento listados arriba. El segundo panel muestra la misma preparación de células cultivada en los medios de esta invención con el. complemento de factores de crecimiento y la adición de glucosa a una concentración final de 15 mtn. El tercer panel muestra la misma preparación de células cultivadas en los medios de esta invención complementados con los factores de crecimiento mostrados arriba. Morfológicamente, el tercer panel muestra una población más uniforme de células tipo epitelial. El primero y segundo panel muestran "islas" de células tipo epitelial junto con células mesenquimáticas contaminantes que son de una naturaleza tipo fibroblasto morfológicamente. Para verificar que la población de células lograda por el cultivo de las células en los medios de la invención
contuviera más células de ductos pancreáticos, se midieron los niveles de AR mensajero (ARNm) de citoqueratina 19 y vimentina. Esto se puede hacer usando cualquier método bien conocido en la técnica que pueda cuantificar los niveles de ARNm. En este ejemplo particular, el análisis de reacción en cadena de la polimerasa-transcripción inversa (RT-PCR) en tiempo real cuantitativo y relativo se llevó a cabo usando un instrumento ABI PRIS 7700 y 7000 Sequence Detection System y software como el previamente descrito en Gibson et al . {Genome Research 6 (10) : 995-1001, 1996). Los resultados del análisis de ARNm se muestran en la figura 3. En -el panel A, se muestran los resultados del análisis de ARNm de citoqueratina 19 en cultivos de células primarios preparados en (a) CMRL 1066 disponible comercialmente y luego medio F:12-D E como se describió arriba, (b) los medios de esta invención y (c) los medios de esta invención con la adición de glucosa a una concentración final de 15 mM. La citoqueratina 19 es un marcador de células epiteliales que se usa comúnmente en la técnica (véase, por ejemplo, Bouwens et al., Diabetes 43 (11) : 1279-83 (Nov. 1994)). Las células que fueron cultivadas en los medios de esta invención tuvieron un incremento de aproximadamente 24 veces en la expresión de ARNm de citoqueratina 19 en comparación con el parámetro interno. Este incremento en la expresión de ARNm es aproximadamente el doble de los niveles de expresión encontrados en células que se
cultivaron ya sea en la progresión de medio CMRL a F12-DME descrito en este ejemplo o células cultivadas en los medios de esta invención con la adición de 15 mM de glucosa. El panel B muestra los resultados del análisis de ARNm de vimentina en los cultivos primarios como los descritos arriba. La vimentina es un marcador de fibroblastos que se usa comúnmente en la técnica (véase, por ejemplo, Franke et al., Differentiation, 23(l):43-49 (1982) y Kahn et al., Cáncer 51(4):645-53 (febrero 15, 1983)). De manera consistente con los datos anteriores, las células cultivadas en los medios de esta invención expresaron aproximadamente más de la mitad de ARNm de vimentina en comparación con las células cultivadas en CMRL y luego medio F:12-DME como se describió en este ejemplo, o las células cultivadas en los medios de esta invención con la adición de 15 mM de glucosa. El panel C muestra los resultados del análisis de ARNm de insulina en los cultivos primarios como los descritos arriba. Ya que estas células son células de ductos pancreáticos primarias, su capacidad de producción de insulina debe conservarse en el cultivo. Las células de cultivo primarias en las tres condiciones de medios mostraron arriba de 25,000 veces más de ARNm de insulina cuando se les comparó con ADNc pancreático adulto comprado comercialmente. Aunque los niveles de ARNm de insulina en las células cultivadas en I3F fue el más bajo, el nivel de ARNm aún está bástente dentro de una
desviación estándar de las otras dos condiciones de medios. Además, la velocidad de crecimiento de los cultivos primarios como los listados arriba se midió durante el transcurso de 8 días en cultivo, usando un ensayo enzimático que es correlativo al número de células . Aunque en la parte inicial del cultivo la velocidad de crecimiento de las células que fueron cultivadas en los medios de esta invención fue más lenta, al final de 8 días en cultivo, el número de células fue sustancialmente idéntico al de las otras dos condiciones de medios. Además, las células cultivadas en los medios de esta invención parecieron estar en crecimiento de fase logarítmica mientras que la velocidad de crecimiento de las células en las otras dos condiciones pareció estarse nivelando, sugiriendo que las células estaban entrando en una fase quiescente. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.