PT780469E - Linhas imortalizadas de celulas derivadas de tecidos cutaneos humanos normais e meios de cultura sem soro adaptados a sua cultura - Google Patents

Linhas imortalizadas de celulas derivadas de tecidos cutaneos humanos normais e meios de cultura sem soro adaptados a sua cultura Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO "LINHAS IMORTALIZADAS DE CÉLULAS DERIVADAS DE TECIDOS CUTÂNEOS HUMANOS NORMAIS E MEIOS DE CULTURA SEM SORO, ADAPTADOS À SUA CULTURA" A presente invenção tem por objectivo linhas celulares imortalizadas inovadoras, derivadas de tecidos cutâneos humanos, normais, um novo método para a produção destas linhas, bem como um novo meio sem soro, adaptado para isolar, produzir e manter as células derivadas de tecidos cutâneos humanos.
Estado da técnica A produção de linhas celulares imortalizadas derivadas de tecidos cutâneos humanos foi descrita anteriormente. Em geral, os processos utilizados para este fim compreendem a transfecção ou a transformação de células cutâneas humanas, por exemplo de queranócitos e de melanócitos, cultivados in vitro com agentes que conferem a propriedade de imortalização. A imortalização refere-se à produção de células que podem ser cultivadas durante tempos prolongados in vitro, teoricamente indefinidamente. Estas células são igualmente designadas pelo nome de linhas celulares continuas. Pelo contrário, as células não imortalizadas são apenas capazes de se multiplicar durante um número definido de divisões celulares in vitro. As células imortalizadas são extremamente vantajosas, pois fornecem uma fonte estável, potencialmente infinita, de células com características definidas. Os agentes clássicos para a produção de linhas celulares imortalizadas e de linhas; celulares cutâneas humanas, imortalizadas, compreendem, em particular, por exemplo, vírus, virus recombinantes e e<7 plasmideos que contêm as sequências de ADN que conferem a propriedade de imortalização. O processo mais usual para a produção de linhas celulares humanas imortalizadas compreende provavelmente a utilização de sequências de SV40 e, mais especificamente, o ADN do antigénio T volumoso de SV40 como agente de imortalização. Por exemplo, Steinberg et al. J. Cell Phys, 123:117-125 (1985); US4885238 (Reddel et al.); US4707448 (Major); Stoner et al. Câncer Res., 51:355-371 (1991); Chopra et al., In vitro Cell Dev. Biol., 30A:539-546 (1994); Chopra et al., In vitro Cell Dev. Biol., 27A: 763-765 (1991); Christian et al., Câncer Res, 47:6066-6073 (1987); Rhim et al., Science, 227:1250-1252 (1985); e Grubman et al., Gastrointest. Liver Physiol, 29:G1060-G1070 (1994) descrevem a utilização de vectores de SV40 e de vectores que contêm a sequência do antigénio T volumoso de SV40, para a produção de linhas celulares humanas imortalizadas. A introdução destas sequências é geralmente efectuada por infecção por meio do virus SV40 ou de um vírus híbrido adenovírus-12/SV40 ou por transfecção de células com um plasmídeo recombinante que contém o terminal de repetição longo do vírus de sarcoma de Rous e a região precoce Ori-SV40 para co-precipitação na presença de fosfato de estrôncio (veja-se Brash et al., Mol. Cell Biol, 7:2031-2034 (1987)).
Um outro processo conhecido para a produção de linhas celulares imortalizadas, e em particular de queranócitos humanos imortalizados, compreende a transfecção ou infecção de células com as sequências de ADN do vírus de papiloma humano. Por exemplo, a US5376542 (Schlegel) descreve a imortalização de células epiteliais humanas com os genes de E6 e E7, isolados de HPV-16, 18, 31, 33 ou 35, ou com o gene E7 apenas, para a produção de linhas celulares imortalizadas, não tumorigénicas. Por outro lado, Barbosa et al., Oncogene, 4:1529-1532 (1989); e Munger et al., J. virol, 63(10):4417-4421 (1989) descrevem a utilização de genes E6 e E7 de HPV-16 2 e HPV-18 para a produção de queranócitos humanos imortalizados.
No entanto, apesar de vários grupos terem descrito linhas celulares de queranócitos imortalizados e sua utilização em testes in vitro, as linhas de queranócitos e as linhas de melanócitos imortalizadas, anteriores apresentam habitualmente uma ou mais propriedades que tornam a sua utilização desvantajosa. Por exemplo, os queranócitos imortalizados descritos anteriormente apresentam uma ou mais das caracteristicas seguintes: (i) redução ou perda de expressão de marcadores de diferenciação, por exemplo de proteínas que são expressas pelos queranócitos diferenciados normais, e (ii) caracteristicas de cruzamento modificadas em cultura de tecidos.
Por exemplo, Jetten et ai., J. Invest. Dermatol., 92:203-209 (1989) descrevem queranócitos imortalizados por meio do vírus SV40, obtidos após um grande número de passagens (mais de 12 passagens) por meio do vector NHEK-SV40-T8-1 que são incapazes de se diferenciar. De modo semelhante, Bernard et al.. Câncer Res. 45:1707-1716 (1985) descrevem o isolamento de uma linha de queranócitos imortalizados, designada pelo nome de SVK14 que, como é referido, é, praticamente, totalmente incapaz de se diferenciar. Além disso, esta linha celular não apresenta nenhuma expressão de queratinas Kl/10 (>53 kD) e da queratina de 50 kD (queratina K14), proteínas que são normalmente expressas pelos queranócitos diferenciados.
Além disso, Steinberg et al., J. Cell Physiol. 123:117-125 (1985) descrevem queranócitos transformados com o vírus SV40, que perdem proqressivamente a aptidão para exprimir as queratinas caracteristicas do citoesqueleto de queratina normal. Esta perda de expressão da queratina normal produz-se após cerca de 10 a 15 passagens. Além disso, Hronis et al., Câncer Res., 44:5797-5804 descrevem queranócitos imortalizados com o ADN de 3V40, que perderam a aptidão para produzir as
queratinas K5, Κβ, Κ14/15, Κ16 e Κ17 e a involucrina, proteínas que são caracteri3tica3 dc queranócitos diferenciados normais. Por outro lado, Morris et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:8498-8502 (1985) descrevem queranócitos imortalizados com o vírus SV40 que após um grande número de passagens (mais de 14 passagens) apresentam uma expressão fortemente reduzida de queratinas de categoria II e de categoria I. Por exemplo, estes queranócitos não apresentam praticamente nenhuma expressão de K13 (idem).
Além disso, Banks-Schlegel et al., J. Cell Biol., 96:330-337 (1983), descrevem queranócitos imortalizados com o virus SV40, que apresentam características de cruzamento modificadas em cultura de tecidos. Por exemplo, ao contrário dos queranócitos normais, as células imortalizadas requerem uma camada de células alimentadoras 3T3 para o seu crescimento.
Os processos descritos anteriormente, para a produção de queranócitos e melanócitos humanos imortalizados, utilizam habitualmente a técnica que utiliza células alimentadoras (na qual os fibroblastos desempenham habitualmente o papel de células "alimentadoras") e realizam geralmente a cultura de células num meio que contém soro. Por exemplo Sexton et al., "Stable transfection of human keranocytes: HPV imortalization", Keranocyte Methods, eds, Leigh, I.M. et al., University Press, 179-180, (1994); Garlick, "Retroviral Vectors", Keranocyte Methods (eds. Leigh I.M. et al., Cambridge University Press, 181-183 (1994)) descrevem a utilização de um meio que contém soro fetal de bovino e células alimentadoras, para o isolamento e produção de queranócitos imortalizados. A utilização de um meio sem soro durante o isolamento e a produção de células epiteliais imortalizadas e especificamente de queranócitos humanos, foi descrita anteriormente. Por exemplo, Barbosa et al. Oncoqene 4:1529-1532 (1989) descrevem a cultura inicial de queranócitos humanos transfectados por 4
electroporação, ou lipofecção num meio sem soro, com baixo teor de cálcio, até à confluência.
Pfeifer et ai. descrevem no Methods in Cell Science 17 (1995), 83-89, um método para imortalizar hepatócitos. Para este fim, utiliza-se um meio que contém soro. 0 documento Mayo Clinic 61 (1986), 771-777 descreve uma técnica para a obtenção de queranócitos in vitro, para utilização em enxertos cutâneos. A referida técnica compreende duas fases. Na primeira fase da cultura, as células são cultivadas num meio sem soro e durante a fase seguinte as células obtidas na primeira fase são cultivadas num meio com soro.
No entanto, apesar das descrições anteriores, existe ainda uma necessidade importante na prática de se obterem queranócitos e melanócitos humanos imortalizados que possuam propriedades melhoradas, em particular que conservem o potencial de diferenciação dos queranócitos e melanócitos normais e que exprimam proteínas de diferenciação características dos melanócitos e queranócitos diferenciados, mesmo após uma taxa elevada de passagens. Estas células serão extremamente vantajosas para numerosas utilizações, em particular nas análises que requerem células cutâneas diferenciadas. Existe uma outra necessidade na prática, de meios de cultura aperfeiçoados que permitam manter os queranócitos e melanócitos primários e imortalizados, bem como de processos de cultura aperfeiçoados, que não necessitem da utilização de células alimentadoras.
Sumário da invenção
Para este fim, um objectivo da presente invenção consiste na produção de linhas celulares contínuas (imortalizadas) aperfeiçoadas, derivadas de tecido cutâneo humano normal, e em particular de linhas celulares continuas da queranócitos e/ou 5
melanócitos (imortalizadas), derivadas a partir de tecido cutâneo humano normal, que conocrvam a aptidão para a diferenciação e para a expressão de proteínas de diferenciação, mesmo após uma taxa elevada de passagens. Mais precisamente, um objectivo da presente invenção consiste assim na obtenção de queranócitos imortalizados que conservem a aptidão para exprimir queratinas, citocromos, bem como outras proteínas de diferenciação, por exemplo a involucrina, a filagrina e a loricrina, que não são expressas, ou que são pouco expressas pelas linhas de queranócitos imortalizadas, clássicas. Um outro objectivo da presente invenção consiste na obtenção de queranócitos e melanócitos imortalizados, que exprimam enzimas que são expressas normalmente pelos queranócitos e melanócitos diferenciados, como por exemplo, enzimas de fase II, tais como as glutationo-S-transferases, bem como enzimas e/ou proteínas que estão implicadas na oxidação celular e nas respostas inflamatórias.
Um outro objectivo da presente invenção consiste em propor novos meios de cultura de tecidos, adaptados para fazer a cultura, produzir e manter linhas de melanócito e/ou queranócitos normais, ou contínuas. Estes meios são também particularmente adaptados para isolar, estabelecer e imortalizar células cutâneas humanas. Um objectivo específico da presente invenção consiste assim em propor meios de cultura totalmente definidos (sem agentes de suplementação desconhecidos ou mal definidos) para a cultura de queranócitos na ausência de células alimentadoras, em que os referidos meios contêm epinefrina, que se verificou, de forma inesperada, ser um potenciador potente do crescimento de queranócitos num meio sem soro.
Um outro objectivo da presente invenção consiste em propor um novo processo para a produção de linhas de melanócitos e queranócitos imortalizados, derivados de tecidos cutâneos normais, que utilizam um meio sem soro, par licularmente um meio de acordo com a invenção e um 6
"cocktail" de fixação celular que contém fibronectina, SAB e COlagénio do tipo I, na ausência de "células alimentadoras" (por exemplo fibroblastos).
Um outro objectivo da presente invenção consiste na utilização de queranócitos e melanócitos primários, cultivados no meio sem soro de acordo com a invenção e na presença do "cocktail" de fixação celular, para um enxerto de pele e na terapia genética ex vivo.
Um our.ro objectivo da presente invenção consiste em propor processos de utilização destas linhas de queranócitos e melanócitos de acordo com a invenção, por exemplo para análises imunológicas, farmacológicas, foto- e quimiotoxicológicas de reacção cutânea e para a expressão de genes heterólogos.
Descrição das figuras - A Figura 1 compara o crescimento (em termos de número de células) de queranócitos não imortalizados DKO-NR, em três meios diferentes, ou seja o meio NR-3, o meio MCDB 153 modificado, suplementado com epinefrina e o meio MCDB 153 ao fim de 6 dias. - A Figura 2a representa a construção derivada do retrovirus SV40, a saber o plasmideo pLXSHD+SV40 (#328) que é utilizado de preferência para imortalizar os melanócitos e/ou queranócitos da presente invenção. - A Figura 2b representa a construção derivada do retrovirus do virus de papiloma 16, a saber o plasmideo pLXSHD+E6/E7, que pode ser utilizado para imortalizar os melanócitos e/ou os queranócitos da presente invenção. 7
Descrição pormenorizada da invenção A presente invenção propõe linhas celulares contínuas (imortalizadas) derivadas de tecidos cutâneos humanos normais, ou seja, de queranócitos ou melanócitos imortalizados, que podem obtidas de acordo com um processo que compreende as etapas seguintes: (i) obtenção de uma amostra de tecido cutâneo humano; (ii) preparação da referida amostra cutânea para a cultura in vitro; (iii) obtenção de queranócitos e/ou melanócitos a partir da referida amostra de tecido cutâneo, preparada, e sementeira dos referidos queranócitos e/ou melanócitos num meio de crescimento desprovido de soro, em placas de cultura providas de um revestimento que compreende fibronectina, colagénio do tipo I e SAB, que facilitam a fixação e crescimento das células; (iv) substituição do meio do modo necessário para se obter um crescimento confluente, óptimo, das células em cultura, mantendo sempre de forma contínua o revestimento das placas de cultura; (v) transferência dos queranócitios ou melanócitos para um meio sem soro, adaptado para seleccionar de entre os queranócitos ou os melanócitos, em placas de culturas previamente revestidas, de modo semelhante; (vi) infecçâo dos queranócitos ou melanócitos com uma construção retroviral; (vii) transferência dos queranócitos ou melanócitos imortalizados resultantes para um meio de proliferação sem soro, adequado para a proliferação de queranócitos ou melanócitos .imortalizados, em placas de cultura previamente revestidas, de modo semelhante; e (viii) transferência dos queranócitos resultantes que proliferaram para um meio de diferenciação sem soro, que contém um teor elevado em cálcio em frascos de cultura previamente revestidos, de modo semelhante. 8 Α3 célula3 conservam a capacidade de expressão de proteínas de diferenciação que são expressas pelos queranócitos ou melanócitos normais, mesmo após uma taxa elevada de passagens. A expressão "taxa elevada de passagens" significa pelo menos 10 passagens em cultura, com vantagem pelo menos 20 a 30 passagens, de preferência, pelo menos 50 passagens e teoricamente, um número infinito de passagens. Por exemplo, os queranócitos imortalizados produzidos de acordo com a presente invenção exprimem as proteínas de diferenciação que consistem de queratina Kl/10, queratina K14, involucrina, filagrina e loricrina, mesmo após uma taxa elevada de passagens em cultura de tecidos. Este facto é contrário aos queranócitos imortalizados descritos anteriormente, que não exprimem estas proteínas de diferenciação, ou exprimem de forma medíocre estas proteínas de diferenciação.
Além disso, a presente invenção propõe queranócitos e melanócitos primários produzidos na ausência de soro e na ausência de células alimentadoras, que conservam a capacidade de diferenciação e de expressão, de proteínas características de melanócitos e queranócitos diferenciados.
Os queranócitos imortalizados da presente invenção têm um perfil de citocromo p450 (CYP450) que é semelhante, senão idêntico, ao dos queranócitos normais. Por exemplo, as células da presente invenção exprimem o CYP450 3A5 e não o CYP450 3A4. Além disso, os queranócitos imortalizados da presente invenção exprimem enzimas de fase II, por exemplo a glutationò-S-transferase (GST) e mais especificamente a GSTa, a ΟεΤμ e a GSTn, de um modo comparável ao dos queranócitos normais não imortalizados.
Além disso, os queranócitos imortalizados da presente invenção exprimem proteínas e enzimas implicadas na oxidação celular e nas respostas inflamatórias, por exemplo a superóxido dismutase (SOD) c α colagenase do tipo I e o factor 9 f\ i ’
de necrose tumoral alfa (TNFa), após o tratamento com ésteres dc forbol, de um modo semelhante ou idêntico ao dos queranócitos normais diferenciados. Possuindo estas caracteristicas, estas linhas celulares fornecem uma fonte reprodutível, extremamente estável, de células, para estudos imunológicos, farmacológicos, de inflamação, foto- e quimiotoxicológicos de reacções cutâneas.
Adicionalmente, os melanócitos imortalizados de acordo com a invenção exprimem naturalmente melanina e/ou proteínas associadas à expressão de melanina (vejam-se os exemplos 14-15 a seguir).
Além disso, as linhas de queranócitos e as linhas de melanócitos imortalizadas da presente invenção, quando são cultivadas em cultura organotípica, formam um epitélio extremamente estratificado e polarizado, compreendendo camadas superficiais queratinizadas (stratum corneum). Isto apenas tinha sido conseguido anteriormente em condições clássicas de cultura, isto é por meio de uma técnica que utiliza um meio contendo soro e uma camada de células alimentadoras (veja-se, por exemplo, Lechner et al., Viroloqy, 185:536-571 (1991)).
Os queranócitos e melanócitos imortalizados da presente invenção são obtidos a partir de pele normal na ausência de soro e sem utilizar quaisquer células alimentadoras. Em geral, os queranócitos e melanócitos imortalizados da presente invenção podem ser obtidos pelo processo seguinte: (i) obtenção de uma amostra de tecido cutâneo humano; (ii) preparaçao da referida amostra cutânea para a cultura in vitro; (iii) obtenção de queranócitos e/ou melanócitos a partir da referida amostra de tecido cutâneo, preparada, e sementeira dos referidos queranócitos e/ou melanócitos num meio de crescimento desprovido de soro, em placas de cultura providas de um revestimento que compreende f ibronectina, colagénio do 10
tipo 1 e SAB, que facilitam a fixação e crescimentp das células; (iv) substituição do meio, do modo necessário para se obter um crescimento confluente, óptimo, das células em cultura, mantendo de forma continua o revestimento das placas de cultura; (v) transferência dos queranócitios ou melanócitos para um meio sem soro, adaptado para seleccionar de entre os queranócitos ou os melanócitos em placas de culturas previamente revestidas, de modo semelhante; (vi) infecção dos queranócitos ou melanócitos com uma construção retroviral; (vii) transferência dos queranócitos ou melanócitos imortalizados resultantes num meio de proliferação sem soro, adequado para a proliferação de queranócitos ou melanócitos imortalizados, em placas de cultura previamente revestidas, de modo semelhante; e (viii) transferência dos queranócitos resultantes que proliferaram, para um meio de diferenciação sem soro, que contém um teor elevado em cálcio em frascos de cultura previamente revestidos, de modo semelhante.
Mais precisamente, a etapa (i) compreende habitualmente a obtenção de amostras de tecido cutâneo humano a partir de dadores humanos normais, por exemplo de amostras obtidas no decorrer de uma intervenção cirúrgica, ou de uma intervenção em pediatria. A imortalização de uma amostra de células cutâneas única, isto é de uma amostra de células cutâneas autólogas, permite a produção de linhas definidas, por exemplo um perfil de receptor particular, caracteristico de um dador particular. A amostra de tecido cutâneo é em seguida preparada na etapa (ii), de modo a estar apta para cultura in vitro. Esta preparação é realizada de preferência lavando inicialmente a amostra de tecido cutâneo, por exemplo utilizando o meio que é Utilizado para a cultura. De preferência, eota operação é 11
realizada num meio NR-2, que é um meio sem soro, em que a (jumposição exacta é descrita a seguir, que revelou acr vantajoso para a cultura de queranócitos e melanócitos normais. Após a lavagem, a amostra de tecido cutâneo é de preferência nivelada, por exemplo por meio de um dermatoma, e em seguida cortada em pequenos pedaços.
As secções cutâneas resultantes são em seguida de preferência separadas em derme e epiderme. Isto pode ser realizado por um meio físico e/ou um meio enzimático. Por exemplo, isto pode ser realizado por tratamento com tripsina, por exemplo fazendo flutuar amostras de tecido cutâneo numa solução de tripsina (por exemplo a cerca de 0,5%) contendo EDTA (por exemplo a cerca de 0,1%) durante um tempo suficiente para provocar a separação das células, por exemplo durante um tempo de cerca de 30 a 60 minutos, a uma temperatrura de 37 °C, ou durante a noite a 4 °C. A derme é separada (para isolar os fibroblastos, veja-se exemplo 2) e a epiderme é em seguida colocada num meio de suspensão. De preferência, o meio de suspensão contém uma solução de inibidor de tripsina de soja (SBTI) e é posto em contacto com as células durante um tempo suficiente, habitualmente de cerca de 5 minutos, a fim de inactivar a tripsina e provocar a libertação das células. Em seguida adiciona-se um meio de cultura de tecidos, de preferência o meio NR-2 desprovido de soro (descrito a seguir) e um filtro (por exemplo um filtro de 100 mm) , para se obterem as células desejadas, isto é queranócitos e/ou melanócitos.
Os queranócitos e/ou melanócitos primários resultantes, obtidos na etapa (ii) são em seguida utilizados para semear um meio sem soro, de preferência no meio NR-3 (descrito em pormenor a seguir), a uma concentração celular conveniente, de preferência de cerca de 1,2 x 104 células/cm2, em placas de cultura previamente revestidas. No entanto, é possível fazer variar esta concentração de células em grande3 limites. As 12 placas de cultura são de preferência munidas de um revestimento continuo, constituído por uma composição que se verificou, de forma inesperada, aumentar a fixação e crescimento dos queranócitos e melanócitos, mais precisamente uma solução de fibronectina, de SAB e de colagénio do tipo I. Esta composição de revestimento celular foi descrita anteriormente para utilização com células brônquicas (Lechner et al., J. Tissue Cult. Meth. 9:43-48 (1985)) aqui descrita a título de referência.
Na etapa (iv), o meio de cultura é substituído tantas vezes quanto o necessário para se obter um crescimento celular óptimo. De preferência, o meio é substituído em cada dois dias. No entanto, isto poderá variar em função da amostra de tecido cutâneo particular. Após se atingir uma confluência praticamente total, por exemplo cerca de 90% de confluência, o que se produz habitualmente após um tempo de cerca de 10 a 14 dias, os queranócitos e melanócitos são separados. Isto pode ser realizado por qualquer meio que permita uma separação adequada das células, sem efeitos nefastos para os melanócitos e/ou queranócitos. Por exemplo, isto pode ser realizado por meio de um tratamento diferencial com tripsina. De preferência, os melanócitos ou queranócitos são tratados com uma solução de tripsina/EDTA e em seguida são transferidos para o meio de selecção. No caso dos queranócitos, as células são de preferência tratadas durante um tempo de cerca de 5 a 10 minutos com uma solução de tripsina/EDTA (Om,025%/0,01%) e são em seguida utilizadas na etapa (v) para semear no meio NR-3 em placas previamente revestidas. No caso dos melanócitos, as células são de preferência tratadas durante um tempo de cerca de 2 a 4 minutos com uma solução de tripsina/EDTA (0,025%/0,01 %), e são em seguida utilizadas na etapa (v) para semear num meio NR-4, nas placas de cultura previamente revestidas, de modo semelhante.
Estas células são em seguida tratadas com o agente de imortalizaçào. As células podem também ser congeladas até à 13 f\
imortalização, por exemplo em azoto liquido. A infecção e imortalização são realizadas dc preferencia utilizando uma construção retroviral baseada no vírus SV40, ou no vírus do papiloma humano 16, tal como o vector retroviral pLXSHD+SV40 (#328) que está representado na figura 2a e que foi descrito por Stockshlaeder et al. (GeneBank n° de concessão M64753; Stockshlaeder et al.. Human Gen Therapy, 2, 33-39, 1991) ou (2) o vector retroviral pLXSHD+E6/E7, que está repreentado na figura 2b. 0 vector retroviral pLXSHD+SV40 (#328) contém a sequência T-Ag de SV40, as sequências de terminal de repetição longa 5' e 3' de SV40, as sequências de pBR322 que permitem a replicação de E. coli, um ciclo de clonagem múltiplo, uma sequência de poliadenilação de SV40, entre outras sequências. 0 vector pLXSHD+E6/E7 contém, em vez do gene que codifica para o antigénio T, o fragmento NcoI/CfoI do gene E6/E7 proveniente do vírus 16 do papiloma humano. A construção deste plasmídeo é descrita por Dtirst et al., na Oncogene, 1:251-256, 1987.
Após a imortalização, as células são em seguida submetidas ao número de passagens necessárias no decorrer da cultura e as células imortalizadas resultantes são em seguida transferidas para um meio de proliferação, na etapa (vii) . No caso dos queranócitos, esta transferência é realizada de preferência na segunda passagem.
Na etapa (viii), as células imortalizadas são multiplicadas num meio de proliferação para os queranócitos ou melanócitos imortalizados, que compreende um meio sem soro e que compreende, de preferência, o meio NR-2 ou NR-3 e o meio M2 para melanócitos (descrito a seguir) . As células imortalizadas são de novo cultivadas em placas de cultura previamente revestidas de modo contínuo, em que o revestimento compreende novamente uma solução de fibronectina, de SAB e de colagénio do tipo 1.
Após a multiplicação das células imortalizadas no meio de proliferação, os queranócitos são transferidos na etapa (viii) 14
para um meio que provoca a diferenciação de queranócitos normais e imortalizados. Dc preferência, este meio compreende o meio NR-2 ou MCDB 153 modificado com um teor elevado em cálcio, de preferência com um teor em cálcio de cerca de 1,5 mM, sendo a cultura de novo efectuada em placas de cultura revestidas de forma continua, com uma solução de fibronectina, de SAB e de colagénio do tipo I.
Do modo acima citado, verificou-se, de forma inesperada, que as linhas de queranócitos e melanócitos imortalizadas produzidas de acordo com o processo da presente invenção conservam a capacidade de diferenciação e de expressão das proteínas de diferenciação que são características dos queranócitos e melanócitos diferenciados normais, mesmo após uma taxa elevada de passagens em cultura de tecidos, ou seja após pelo menos 10 passagens. Por exemplo, os queranócitos imortalizados da presente invenção exprimem queratinas, bem como outras proteínas, por exemplo involucrina, filagrina e loricrina após uma taxa elevada de passagens, que não são expressas, ou são pouco expressas pelos queranócitos imortalizados com SV40, anteriormente descritos.
Mais concretamente, várias linhas de queranócitos imortalizadas produzidas de acordo com a presente invenção, DK2-NR, DK3-NR e FK2-NR (veja-se as tabelas 7 e 8 a seguir), exprimem as proteínas de diferenciação que consistem de queratina Kl/10, queratina K14, involucrina, filagrina e loricrina, mesmo após uma taxa elevada de passagens (> 30 passagens).
Além disso, os queranócitos imortalizados produzidos de acordo com a presente invenção têm um perfil de CYP450 que é semelhante, senão idêntico, ao dos queranócitos humanos normais. Por exemplo, os queranócitos imortalizados da presente invenção exprimem os CYP450 1A1, 2C, 2E1 e 3A5, mas não exprimem o CYP450 1A2, 2A6, 2B6 e 2D6, o que é cdidcLer í stico do perfil em citocromos 450 dos queranócitos 15
Ne normais. É a primeira vez que foi possível demonstrar que os queranócitos humanos normaÍ3 c imortalizados exprimem CYP450 3A5 e não CYP450 3A4.
Além disso, as linhas de queranócitos imortalizados da presente invenção exprimem enzimas de fase-II, por exemplo as glutationo-S-transferases (GST), de um modo comparável ao dos queranócitos diferenciados, normais. Mais precisamente, as linhas de queranócitos imortalizadas da presente invenção exprimem GSTa, ΰ5Τμ e GSTn de um modo comparável ao dos queranócitos normais.
Além disso, os queranócitos imortalizados da presente invenção exprimem enzimas e outras proteínas que estão implicadas na oxidação celular e nas respostas inflamatórias, de um modo comparável ao dos queranócitos normais. Por exemplo, os queranócitos imortalizados produzidos de acordo com a presente invenção exprimem a superóxido-dismutase (SOD) . Além disso, em resposta aos ésteres de forbol, os queranócitos imortalizados produzidos de acordo com a presente invenção exprimem a colagenase do tipo I (um mediador da inflamação) e o factor TNF-α (factor de necrose tumoral a) .
Além disso, quando as linhas celulares imortalizadas da presente invenção são cultivadas em cultura organotípica, formam um epitélio altamente estratificado e polarizado, com camadas superficiais queratinizadas (stratum corneum) . Este facto foi apenas descrito anteriormente para as linhas de queranócitos imortalizadas, estabelecidas em condições clássicas de cultura, por exemplo com um meio que contém soro e utilizando uma camada de células alimentadoras.
As linhas de células imortalizadas da presente invenção são obtidas de forma inesperada na ausência total de soro, sem utilizar quaisquer camadas de células alimentadoras ao longo da cultura. 16 - '~V~r
Além disso, da forma descrita em maior pormenor a seguir, verificou-se, de forma inesperada que a epinefrina c um factor potente de crescimento dos queranócitos normais, quando é utilizada num meio sem soro. Mais especificamente, o meio NR-3 descrito a seguir contém epinefrina, que se verificou amplificar o crescimento de queranócitos normais (veja-se figura 1) . Este facto era de todo inesperado, atendendo a que a epinefrina foi anteriormente descrita como um factor inibitório do crescimento dos queranócitos (Halprin, J. Invest. Dermatol, 81-553-557 (1983)), como um factor com apenas um efeito moderado no crescimento dos queranócitos (Koizumi et al., J. Invest. Dermatol., 96:234-237 (1991).
Além disso, verificou-se, de forma inesperada, que o revestimento continuo de frascos ou placas de cultura utilizados para a cultura de queranócitos e/ou melanócitos primários e imortalizados, em particular com um revestimento ou "cocktail" contendo fibronectina, SAB e colagénio do tipo I, melhora a fixação de queranócitos e melanócitos às placas de cultura, ou frascos de cultura e aumenta igualmente o crescimento das células. A utilização de uma substância de revestimento deste tipo não foi descrita anteriormente para a sua utilização com queranócitos e/ou melanócitos imortalizados.
Do modo descrito, a presente invenção propõe, por outro lado, especificamente um meio inovador sem soro, designado por meio NR-3. Este meio permite, de forma inesperada, cultivar e isolar os queranócitos e/ou melanócitos normais provenientes do tecido cutâneo humano, na ausência de soro, sem utilizar uma camada de células alimentadoras. Verificou-se que este meio melhora o crescimento dos queranócitos normais e permite estabelecer culturas de queranócitos normais, sem nenhum contacto com o soro, ou células alimentadoras. A composição exacta do meio NR-3 está descrita na tabela II. Este meio contém vários aminoácidos, sai3 inorgânicos sob 17
a forma de sais de oligoelementos, vitaminas, factores de crescimento e outros sub3tituinteo. Por exemplo, este meio contém como factores de crescimento o factor de crescimento epidérmico (EGF recombinante), insulina, hidrocortisona, transferrina (humana), extracto de hipófise bovina e epinefrina. Do modo indicado, verificou-se, de forma inesperada que a epinefrina aumenta o crescimento dos queranócitos primários em cultura de tecidos.
No que respeita aos aminoácidos, o meio contém L-alanina, L-arginina-HCl, L-asparagina-H20, ácido L-aspártico, L-cisteína-HCl-H20, ácido L-glutâmico, glutamina, glicina, L-histidina-HCl-H20, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina-HCl, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina e L-valina.
Os sais inorgânicos presentes no meio são o metavanadato de amónio, o molibdato de amónio, o cloreto de cálcio, o sulfato de cobre, o sulfato de ferro, o cloreto de magnésio, o cloreto de manganésio, o sulfato de níquel, o cloreto de potássio, o acetato de sódio, o bicarbonato de sódio, o cloreto de sódio, o fosfato dibásico de sódio, o piruvato de sódio, o selenito de sódio, o silicato de sódio, o cloreto de estanho e o sulfato de zinco.
As vitaminas presentes no meio NR-3 são a d-biotina, o d-pantotenato de cálcio, o cloreto de colina, a cianocobalamina, o ácido fólico, o i-inositol, a nicotinamida, a piridoxina e a riboflavina. 0 meio contém além da adenina, a etanolamina, a fosfoetanolamina, o sal de sódio de vermelho de fenol, a putrescina.2HCl, a tiamina.HCl, o ácido tióctico, a timidina, a glucose, o HEPES e antibióticos (fungozona, penicilina e estreptomicina). 18 t
A composição de NR-3 preferida é descrita com a tabela 11. No entanto, pode-3C variar dentro dc grandes limites a concentração de substituintes presentes no meio NR-3. Mais particularmente, contempla-se poder variar as quantidades de diversos substituintes de um valor de +50 a + 0,1%, de preferência de + 10 a + 1%, com referência às concentrações descritas na tabela 12. Além disso, prevê-se poder suprimir um ou mais substituintes indicados e poder adicionar outros substituintes, com a reserva de que estes substituintes não tenham um efeito nefasto, marcado, no isolamento e estabelecimento das culturas de queranócitos ou melanócitos primários e nas linhas celulares imortalizadas. Isto pode ser determinado pelo perito na arte, por análises por aproximações sucessivas.
Do modo indicado, um substituinte importante do meio NR-3 sem soro, da presente invenção, é a epinefrina. Verificou-se que a epinefrina tem uma actividade forte de activação do crescimento nos queranócitos humanos primários. A razão pela qual a epinefrina aumenta a proliferação dos queranócitos não está totalmente estabelecida. Foi referido que os queranócitos humanos exprimem enzimas para a sintese da epinefrina e exprimem igualmente em grande quantidade, os beta 2-adrenoreceptores (Schallreuther et ai., "Production of catecholamines in human epidermis", Biochem & Biophys Res. Commun., 189:72-78 (1992)). Estas enzimas estão implicadas no processo de biosintese das catecolaminas, em particular a feniletanolamina-N-metiltransferase e a tirosina-hidroxilase, com dependência da biopterina. Pelo contrário, esta actividade enzimática não pode ser detectada nos melanócitos e nos fibroblastos. Como consequência, esta actividade enzimática e/ou expressão de receptores pode explicar a capacidade da epinefrina modular a proliferação dos queranócitos.
Os requerentes propõem a hipótese de o meio NR-3 melhorar u isolamento e estabelecimento dao culturas de células 19 t=*l primárias e de linhas celulares, pois suprime a diferenciação celular que conduz a um enriquecimento cm células que conservam a sua capacidade de diferenciação e de expressão de proteínas e enzimas expressas pelos queranócitos e melanócitos diferenciados normais.
Mais especificamente, considera-se que o crescimento dos queranócitos e melanócitos num meio que contém soro favorece a diferenciação desde a primeira passagem. No entanto, isto é desvantajoso (ao longo do período de cultura inicial) pois as células diferenciadas não se multiplicam de forma conveniente. Daqui resulta, portanto, um crescimento excessivo e uma selecção de células cutâneas proliferativas que possuem apenas uma capacidade fraca de diferenciação. Como consequência, o número de células que possuem uma forte capacidade de diferenciação é reduzido quando se adiciona soro ao meio, antes da imortalização.
Pelo contrário, na presente invenção, os queranócitos e melanócitos são cultivados num meio sem soro e em condições que inibem a diferenciação dos melanócitos e queranócitos. Na presente invenção, utiliza-se, de preferência, um meio sem soro ao longo de todo o período de cultura, antes e durante a imortalização, bem como durante a proliferação e a diferenciação.
Do modo indicado, o meio de cultura sem soro, NR-3, da presente invenção, inibe a diferenciação dos queranócitos e permite assim um isolamento melhorado das culturas de queranócitos primárias e de linhas celulares imortalizadas destas derivadas. Além disso, este meio sem soro contém concentrações fracas de cálcio, que inibem selectivamente o crescimento de fibroblastos isolados conjuntamente. Daqui resulta um meio de crescimento altamente selectivo, que favorece a produção de culturas que contêm predominantemente melanócitos e queranócitos. Como consequência, o meio NR-3 sem soro da presente invenção é vantajooo, pois inibe a 20
diferenciação dos queranócitos e inibe igualmente o crescimento dos f ibroblastos .
Do modo descrito, uma suspensão celular produzida a partir de uma só amostra de tecido cutâneo que contém melanócitos, queranócitos e fibroblastos dissociados é, de preferência, cultivada no meio NR-3 da presente invenção. Esta cultura é realizada semeando com estas células, frascos de cultura que são revestidos de forma continua com uma composição que facilita a fixação destas células. De preferência, este revestimento compreende uma mistura de fibronectina, de albumina de soro bovino e de colagénio do tipo 1. Este revestimento, ou revestimento "cocktail" foi descrito anteriormente para as células brónquicas (Lechner et al., J. Tiss. Cult. Meth., 9:43-49 (1985)). Este cocktail aumenta igualmente a fixação de queranócitos e melanócitos aos frascos de cultura de material plástico. Além disso, verificou-se de forma inesperada, que o referido revestimento continuo das placas de cultura que são utilizadas para a cultura de queranócitos primários e queranócitos imortalizados melhora, com vantagem, o crescimento das células. 0 revestimento continuo das placas de cultura não foi descrito anteriormente para os queranócitos ou melanócitos imortalizados.
Ao longo da cultura, as culturas de células primárias são de preferência divididas assim que atingem praticamente a confluência, em seguida são multiplicadas noutros frascos de cultura revestidos. Habitualmente, as culturas celulares são divididas aproximadamente todos os 10 a 14 dias.
Após a cultura e multiplicação dos melanócitos e/ou queranócitos primários no número de células desejado, num meio NR-3 sem soro por meio de frascos de cultura revestidos descritos, as células são imortalizadas. De preferência, os melanócitos e queranócitios que apresentam o melhor crescimento são imurLalizados. No entanto, como alternativa, 21
os melanócitos e queranócitos primários multiplicados podem ser utilizados antes da imortalização, por exemplo em análises, num enxerto de pele ou em terapia genética. Δ imortalização dos melanócitos e queranócitos pode ser realizada com um vector que permite a expressão do antigénio T de SV40, ou a expressão do gene E6/E7 do vírus 16 do papiloma humano (HPV16) . De preferência, a imortalização é realizada por infecção dos melanócitos ou queranócitos com um produto de construção retroviral, que provoca a expressão do antigénio T de SV40, ou do gene E6/SE7 de HPV16. A infecção celular com T-Ag foi realizada de acordo com o protocolo de Pfeiffer et al., Meth. Cell Sei, 17:83-89, 1995 (com a excepção de que o vírus foi recolhido após encapsidação numa linha celular desenvolvida no meio DMEM com 10% de soro fetal de bovino) . Ao longo da infecção, pode-se utilizar um meio contendo soro. No entanto, prefere-se um meio sem soro para os melanócitos e queranócitos, consistindo este meio de preferência do meio PC-1 descrito no artigo de Pfeiffer et al., Meth. Cell. Sei., 14, 83-89 (1995) que é citado a título de referência na presente invenção. De preferência, a imortalização é realizada utilizando o produto de construção retroviral designado pelo nome pLXSHD-SV4 0 (#328) representado na Figura 2a e descritio por Pfeiffer et al., e Stockshlaeder et al. (GeneBank, n° de concessão M64753), ou o produto de construção retroviral designado por pLXSHD+E6/E7, representado na Figura 2b e descrito por Dúrst et al. 1987, Oncogene 1, 251-256.
Após a imortalização, as linhas celulares imortalizadas são transferidas para um meio de proliferação que consiste de preferência de meio NR-2 ou NR-3 ou M2 (para os melanócitos), utilizando frascos de cultura previamente revestidos. Após a proliferação das células até ao número de células desejado, as células são transferidas para um meio de diferenciação conveniente, para a cultura dc queranócitos normais θ 22
A
imortalizados. De preferência, este meio compreende um meio NR-2 ou MCDB modificado 153, com um alto teor em cálcio (1,5 mM) , ou M2 (para os melanócitos) , utilizando placas de cultura previamente revestidas (o mesmo revestimento de SAB, colagénio do tipo I e fibronectina) .
Do modo acima descrito, as linhas de queranócitos e melanócitos diferenciadas, imortalizadas, produzidas de acordo com a presente invenção, manifestam propriedades melhoradas que tornam estas linhas celulares perfeitamente aptas para uma utilização em análises que necessitem de células cutâneas humanas diferenciadas. Em particular, verificou-se que estas linhas celulares exprimem proteínas características de melanócitos e queranócitos normais diferenciados, mesmo após uma taxa elevada de passagens.
Por exemplo, quando os queranócitos imortalizados produzidos de acordo com a presente invenção são analisados por transferência de manchas pelo método Western e reacção em cadeia com polimerase de ADN, à temperatura ambiente, eles possuem um perfil de citocromo p450 (CYP450) semelhante, senão idêntico, ao dos queranócitos normais. Mais precisamente, os queranócitos imortalizados produzidos de acordo com a presente invenção exprimem os CYP450 1A1, 2C, 2E1, 3A5 e não exprimem os CYP450 1A2, 2A6, 2B6 e 2D6. Este perfil de CYP450 está de acordo com o dos queranócitos normais. Um perfil metabólico deste tipo não foi descrito anteriormente para os queranócitos imortalizados. De facto, é a primeira vez que foi possível demonstrar que os queranócitos normais e imortalizados exprimem o CYP450 3A5 e não o CYP450 3A4. Além disso, verificou-se que os queranócitos imortalizados, produzidos de acordo com a presente invenção, durante a sua análise por meio de anticorpos específicos de marcadores de diferenciação, exprimem outras proteínas de diferenciação, mesmo após uma taxa elevada de passagens. Mais particularmente, as linhas celulares da presente invenção exprimem as proteínas de diferenciação Kl/10, queratina K14, involucrina, filagrina e 23
loricrina, mesmo após uma taxa elevada de passagens, isto é após um número igual ou muito 3uperior α 10 paosagons.
Os queranócitos e melanócitos imortalizados da presente invenção absorvem igualmente os ácidos gordos essenciais (AGE) exógenos e apresentam uma desnaturação e um alongamento de cadeia dos AGE, perfeitamente em acordo com os dos melanócitos e queranócitos normais.
Além disso, do modo descrito em maior pormenor a seguir, os queranócitos imortalizados da presente invenção exprimem o TNFa e o mediador de inflamação que consiste de colagénio do tipo I, aquando do seu tratamento com ésteres de forbol, de um modo comparável ao dos queranócitos normais. Além disso, os queranócitos imortalizados da presente invenção exprimem a superóxido dismutase, que é uma enzima implicada na oxidação celular, de um modo semelhante ao dos queranócitos normais diferenciados.
Além disso, os melanócitos imortalizados produzidos de acordo com a presente invenção tratados com inductores de melanogénese (por exemplo a teofilina e a tirosina) e os inibidores de melanogénese (ácido cójico) apresentam uma resposta semelhante à dos melanócitos normais.
Tendo em conta estas propriedades, os queranócitos e melanócitos imortalizados da presente invenção estão perfeitamente aptos para estudos imunológicos, farmacológicos, foto- e quimiotoxicológicos de reacções cutâneas.
Por exemplo, as linhas de queranócitos e melanócitos imortalizadas, da presente invenção e os melanócitos e queranócitos primários podem ser utilizados nas análises que necessitam de células cutâneas diferenciadas, por exemplo, estudos de função de barreira (queratinização) de um tecido cutâneo reconstruído, estudos do metabolismo dos queranócitos diferenciados (metabolismo do3 ácidoo gordos, metabolismo 24
anti-oxidante), estudos referentes aos efeitos dos raios ultra-violeta nas células cutâneas, estudos referentes aos efeitos irritantes e sensibilizantes cutâneos, potenciais, sobre as células cutâneas, análises que medem os efeitos de compostos na produção de melanina, estudos do metabolismo do lipidos, tratamento tópico com agentes xenobióticos (por exemplo óleos cosméticos, seleccionando compostos protectores eventuais, por exemplo fotoprotectores), estudos de inflamação e de irritação cutânea, etc.
Além disso, as linhas de queranócitos e melanócitos imortalizados e os melanócitos e queranócitos primários, produzidos de acordo com a presente invenção, são utilizados para seleccionar compostos anti-cancerosos potenciais e compostos potenciais para o tratamento de doenças cutâneas. Isto comporta habitualmente o contacto da linha celular ou das células primárias com esses compostos, durante um tempo determinado e a determinação da indução eventual de alguns efeitos nefastos, por exemplo uma genotoxicidade, uma formação de um produto de adição de ADN, uma mutagenecidade, uma transformação celular, ou uma citotoxicidade.
Além disso, as linhas de melanócitos e queranócitos da presente invenção estão aptas para a expressão de proteínas recombinantes, por exemplo proteínas e polipéptidos humanos, bem como para a produção de ARN e ADN.
Além disso, as linhas celulares imortalizadas da presente invenção têm uma utilidade potencial para uma terapia genética ex vivo. As linhas celulares da presente invenção deverão fornecer uma ferramenta útil para um direccionamento para um alvo genético e para a elaboração de células geneticamente modificadas, que exprimem os produtos genéticos desejados, por exemplo para uma aplicação terapêutica, para estudos de toxicidade/mutagenicidade celular. Além disso, tendo em conta o facto de as linhas celulares da presente invenção mlmetizareiu com rigor as célulae cutâneas normais, elas 25
deverão ser perfeitamente aptas para ensaios de biosensibilidade.
Além disso, os queranócitos e melanócitos primários produzidos de acordo com a presnete invenção, tendo em conta que são produzidos na ausência de soro, podem ser úteis em terapia genética. Essencialmente, devido à não exposição destas células ao soro, por exemplo a soro bovino, ou a soro de um outro animal (salvo durante uma infecção virai e durante o armazenamento em azoto liquido), estas células deverão ser menos sensíveis a uma contaminação potencial por vírus ou outros agentes patogénicos. Como consequência, isso deverá reduzir ao mínimo o risco de transmissão de factores patogénicos ou infecciosos para estas células, durante uma terapia genética. Uma terapia genética deste tipo, ex vivo, oferece um potencial de tratamento de afecções como a epidermólise bulhosa (afecção resultante de uma mutação da queratina), vitiligo (uma afecção que implica genes de síntese de melanoma), carcinomas e melanomas, afecções alérgicas e problemas referentes à inflamação. No que respeita ao tratamento terapêutico, a única fonte potencial de contaminação consiste de extracto de hipófise de bovino, insulina de bovino, colagénio de bovino, albumina de soro de bovinó ou de fibronetina humana e transferrina humana.
Além disso, as linhas de melanócitos e queranócitos imortalizadas da presente invenção e os melanócitos e queranócitos primários têm utilidade em testes de mutagénese de ADN, testes de selecção de agentes mutagénicos cutâneos, testes de identificação de agentes de alteração de cromossomas, estudos de transformação maligna, estudos de bioquímica celular (por exemplo testes de activação de CYP450), selecção de compostos e de composições, por exemplo de cocktails de ácidos gordos essenciais que estão implicados nas reacções inflamatórias e alérgicas, testes de activação de colagenase (em relação à inflamação), que implicam o TNFa e a detecçao de inLerleucina. Uma aplicação potencial importante 26
dos queranócitos ou melanócitos primários produzidos de acordo com a presente invenção, tendo em conta a sua disponibilidade e o seu processo de produção, refere-se a enxertos cutâneos. Estes queranócitos e melanócitos primários sendo produzidos na ausência de soro, deverão apresentar um risco mínimo de contaminação por agentes patogénicos (por exemplo vírus) e agentes infecciosos. Além disso, os melanócitos e queranócitos da presente invenção podem ser derivados a partir de um hospedeiro autólogo, ou seja de um paciente que apresenta uma lesão importante, o que deverá reduzir ao mínimo, ou suprimir, o risco de rejeição do enxerto cutâneo ou uma outra reacção imunológica nefasta, o que deverá reduzir igualmente ao mínimo o risco de infecção.
Exemplos de linhas de queranócitos imortalizados específicos, produzidos de acordo com a presente invenção, são as linhas FK-2-NR, DK2-NR e DK3-NR que foram depositadas em 5 de Outubro na DSM-Deutsche Sammlung von Mikrorganismen Und Zellkulturen GmbH, cuja morada é Mascheroder Weg lb D-18124 Braunschweig, Alemanha e às quais foram atribuídos, respectivamente, os números de depósito DSM ACC2240, DSM ACC2238 e DSM ACC2239. Além disso, um exemplo de uma linha de melanócitos imortalizada, produzida de acordo com a presente invenção é a linha DM2-NR que foi depositada em 11 de Dezembro de 1996 no Instituto Pasteur, cuja morada é 25 rue de Docteur Roux 75724 Paris, França e à qual foi atribuído o número de depósito CNCM 1-1796. Estes depósitos foram efectuados de acordo com o tratado de Budapeste. Todas as restrições referentes à biodisponibilidade destas linhas celulares serão irrevogavelmente levantadas aquando da emissão de uma patente correspondente ao presente pedido, ou de um outro pedido que reivindique o benefício de prioridade sobre este pedido.
Outras características da presente invenção serão evidentes ao longo das descrições seguintes de exemplos de formas de concretização que são fornecidas para fins 27
ilustrativos da presente invenção e não pretendem ser limitativas. EXEMPLO 1; Características das células cutâneas utilizadas 0 quadro 1 enumera todas as amostras de tecido cutâneo que foram tratadas por infecção virai. Utilizaram-se para a imortalizaçào os queranócitos isolados que apresentam o melhor cruzamento celular. QUADRO 1 tecido cutâneo utilizado para o isolameto de células no meio NR-3
Origem do Nome da Idade Sexo Crescimento1 tecido linhagem coxa OS1 36 f ++ coxa OS2 68 f - coxa OS3 51 f + pálpebra ELI 46 f + pálpebra EL2 49 f + abdómen Thorl 58 f - prepúcio FK1-NR 5 m +++ prepúcio FKO-NR 13 m ++++ abdómen GKO-NR 26 f +++ seio DKO-NR 29 f +++ 1 Procedimento: as células foram recolhidas numa solução de tripsina/EDTA (0,05%/0,01%) e foram contabilizadas utilizando um hemocitómetro, sendo os resultados a média de três contayens.
Os fibroblastos humanos foram isolados a partir de amostras de tecido cutâneo FKO-N, GKO-NR, DKO-NR. Após a separação do compartimento dérmico e do compartimento epidérmico, a derme foi cortada em pequenos fragmentos de 0,2 28
χ 0,2 mm e foi fixada sobre uma placa de cultura de 6 cm com soro. Adicionou-se meio mínimo essencial da Dulbecco (DMEM, 10% de soro fetal de vitela) ao fim de 2 a 4 horas. Esta cultura de explante foi em seguida incubada, até ser visível o crescimento excessivo de fibroblastos. As culturas de fibroblastos confluentes foram separadas e multiplicadas para se obterem culturas de reserva congeladas. EXEMPLO 2: 1) Caracterização do crescimento dos queranócitos: as culturas de células primárias foram cultivadas no meio MCDB 153 modificado [Boyce et al., J. Tissue Culture Meth., 9:83-93 (1985) e Pittlekow et al., J. Invest. Dermatol. 86:410-417, 1986] e meio NR-3. O melhor crescimento celular foi observado em meio NR-3 (figura 1) . Observou-se um crescimento celular melhorado em meio NR-3 totalmente definido (meio NR-3 sem extracto hipofisário bovino, EHB), em comparação com o meio MCDB 153 modificado, desprovido de EHB. A Figura 1 representa o crescimento celular em meio NR-3 e o meio MCDB 153 modificado suplementado com epinefrina (meio de crescimento dos queranócitos), ao fim de 6 dias. O meio MCDB 153 modificado consiste de meio MCDB 153 modificado [Boyce et al., J. Tissue Cult. Meth., 9:83-93 (1985); e
Pittlekow et al., J. Invest. Dermatol, 86:410-417, 1986]. Os queranócitos foram recolhidos numa solução de tripsina/EDTA (0,051/0,01%) e foram contados por meio de um hemocitómetro. Os resultados apresentados na Figura 1 são a média de três contagens. 2) Efeito do revestimento das placas de cultura no crescimento e ligação dos queranócitos: constatou-se que o revestimento das placas de cultura melhora a fixação das células e o crescimento celular dos queranócitos normais. Em particular, os resultados apresentados na tabela 2 comparam o crescimento dos queranócitos em placas de cultura revestidas e em placas 29
de cultura não revestidas. Utilizaram-se 100 000 queranócitos para ocmcar placas de 3,5 cm contendo meio NR-3. QUADRO 2
Efeito do revestimento de superfície na fixação das células células fixadas 24 horas após o semeio1 número de células após 4 dias2 % não revestida % revestida não revestida revestidas DKO-NR após isolamento 21,4 68,2 44 600 143 800 DKO-NR segunda passagem 73,8 86,8 175 500 282 300 1 Número de células fixadas dividido pelo número de células de sementeira. As células fixadas foram recolhidas numa solução de tripsina/EDTA (0,05%/0,01%) e contadas por meio de um hemocitómetro. 2 As células foram recolhidas numa solução de tripsina/EDTA (0,05%/0,01%) e foram contadas por meio de um hemocitómetro; os resultados são a média de três contagens. EXEMPLO 3; 1
Imortalização dos queranócitos: uma suspensão celular produzida a partir das amostras de tecido cutâneo descritas no exemplo 1, que contêm melanócitos, queranócitos e fibroblastos dissociados, é cultivada em meio NR-3 (veja-se a seguir). Esta cultura é realizada, semeando com as células, frascos de cultura que são revestidos de forma contínua com um revestimento "cocktail", anteriormente descrito para as células brônquicas (Lechner et al.f J. Tiss. Cult. Meth., 2 9:43-49 (1985)). Após se obter uitict confluência praticamente 30 Λ total, por exemplo cerca de 90% de confluência, o que se obtém habitualmente após um tempo dc cerca dc 10 a 14 dias, os queranócitos e melanócitos são separados. Para isso, a cultura é tratada com uma solução de tripsina/EDTA (0,025%/0,01%) durante 5 min, em seguida recolhem-se os melanócitos que se separam antes dos queranócitos. Os queranócitos primários são em seguida cultivados no número de células desejado em meio NR-3 sem soro, utilizando frascos de cultura revestidos descritos (o meio NR-3 favorece o crescimento dos queranócitos, em relação aos melanócitos), em seguida as células são imortalizadas com o vector pLXSHD+SV40 (#328) seguindo o protocolo de Pfeiffer et al., Meth. Cell Sei., 17:83-89, 1995 (excepto que o virus foi recolhido após encapsidaçâo numa linha celular que se desenvolve em meio DMEM com 10% de soro fetal de bovino) . Durante a infecção, utiliza-se o meio sem soro PC-1 descrito no artigo de Pfeiffer et al., Meth. Cell. Sei., 14, 83-89 (1995). Após a imortalização, os queranócitos imortalizados são transferidos para o meio de proliferação NR-2 ou NR-3 utilizando frascos de cultura previamente revestidos. Após a proliferação das células até ao número de células desejado, as células são transferidas para um meio de diferenciação conveniente para a cultura de queranócitos normais e imortalizados (NR-2) 2) Crescimento de queranócitos imortalizados após taxas elevadas de passagens: foi demonstrado que os queranócitos imortalizados apresentam um crescimento celular melhorado com taxas de passagem mais elevadas. Isto é indicado no quadro 3 a seguir. Este facto foi demonstrado por estimativa do tempo de duplicação da população (TDP: tempo para se obter a duplicação da população celular ao longo da fase logarítmica de crescimento). Procedimento: recolheram-se os queranócitos numa solução de tripsina/EDTA (0,05%/0,01%) e contaram-se por meio de um hemocitómetro, os resultados são a média de três contagens. 31
QUADRO 3
Tempo de duplicação da população (TDP) das linhas de queranócitos cultivadas em meio NR-3
Queranócitos Número de PDT (h) crise* após a passagens passagem FK2-NR 15 48.00 16-18 FK2-NR 39 21.16 DK1-NR 12 23.20 25-30 DK1-NR 15 31.05 DKl-NR 31 32.99 DK2-NR 15 22.26 20-21 DK3-NR 40 24.34 - *Crise: crescimento celular com uma taxa de proliferação reduzida. 3) Expressão do citocromo p450 (CYP450) em linhas de queranócitos humanos imortalizados: a expressão de CYP450 1A1, 1A2, 3A5, 2E1, 2B6, 2A6 e 2D6 foi analisada em células cutâneas que consistem de queranócitos normais e imortalizados, por transferência de manchas pelo método Western (expressão de proteínas) e por reacção em cadeia com polimerase de ADN, à temperatura ambiente (expressão de ARNm, veja-se tabela 4) . 0 CYP450 expresso nos queranócitos imortalizados é semelhante ao dos queranócitos normais. A taxa de expressão é ligeiramente reduzida. No entanto, a linha DK2-NR apresenta uma taxa de expressão praticamente normal, de CYP450. Procedimento: RT-PCR (reacção em cadeia com uma polimerase-transcriptase inversa) com iniciadores de síntese específicos para CYP450. 32
QUADRO 4
Expressão de ARNm de CYP em queranócitos humanos
Queranócitos Número de 1A1* 2Q* * 2E1 3A5 1A2,2A6, passagens 2B6,2D6 FKO-NR 44 + + + + - FK2-NR 36 + + + + - DKO-NR 33 + + + + - DK1-NR 31 + + + + - DK2-NR 13 + + + - * A expressão de ARNm 1A1 nas linhas celulares imortalizadas foi aumentada após indução com o benz (a) pireno (1,5 mM; Amersham Inc.). 0 aumento foi comparável ao das células normais. **2C17/19 e 2C18 4) Resposta aos indutores de CYP450: As linhas celulares respondem ao indutor de CYP450, que consiste de benz(a)pireno, como as células não imortalizadas, mesmo com taxas elevadas de passagens (veja-se tabela 5). Esta indução não é descrita para os queranócitos imortalizados com T-Ag. 33
QUADRO 5
Actividade de 7-etoxiresorufina-O-desetilase (EROD; Sigma Inc.) em queranócitos humanos após indução com o benz (a) pireno (B(a)P)*
Queranócitos Número de passagens EROD (pmol/mg de proteina) FKO-NR 2 não detectado FKO-NR + B(a)P 2 0,58 FK2-NR 37 0,01 FK2-NR + B(a)P 37 1,05 DKO-NR 1 0,02 DKO-NR + B (a)P 1 1,03 DK1-NR 32 o o DKl-NR + B(a)P 32 1,78 DK2-NR 14 0,02 DK2-NR + B(a)P 14 0,69 DK3-NR 39 0,01 DK3-NR + B(a)P 39 1,86 * Os queranócitos foram incubados durante 24 h com o B(a)P (1,5 mM) . A actividade EROD foi medida após incubação a 37 °C para detecção da fluorescência do produto que consiste de resofurina (excitação a 560 nm, emissão a 586 nm) . 5) Diferenciação celular: os marcadores de diferenciação foram analisados por meio de anticorpos específicos. Os anticorpos específicos utilizados estão identificados na tabela 6. Foi possível demonstrar a capacidade mais forte de diferenciação nos clones DK2-NR e DK1-NR (quadro 7,8). 34
QUADRO 6
Anticorpos utilizados para a detecção de proteínas específicas de queranócitos
Especificidade Nome do anticorpo Firma/referência T-Ag Ab-2 Oncogene, Manhassat, NY Involucrina BTI BT-576 bti, Stoughton, MA Filagrina Filaggrin Paesel + Lorei, Frankfurt, Alemanha Loricrina aAg 73 Magnaldo et al. 1992 Vimentina V9 Dako, Glostrup, Dinamarca Queratina K4 6310 Sigma, St. Louis, USA Queratina, K7 LDS-68 Sigma, St. Louis, USA Queratina K8 M20 Sigma, St. Louis, USA Queratina K10/1 K8.60 Sigma, St. Louis, USA Queratina K13 KS-1A3 Sigma, St. Louis, USA Queratina K14 CKB1 Sigma, St. Louis, USA Queratina K17 CK-E3 Sigma, St. Louis, USA Queratina K18 CY-90 Sigma, St. Louis, USA Queratina K19 A53-B/A2 Sigma, St. Louis, USA QUADRO 7
Detecção da proteína T-Ag e de produtos de diferenciação de queranócitos epidérmicos
Queranócitos Número de T-Ag Involucrina Filagrina Loricrina Vimentina passagens FKO-NR 22 - +++ ++ + ++ FK2-NR 25 +++ ++ ++ + ++ DKO-NR 22 - +++ +++ ++ +++ DK1-NR 13 + + + +++ ++ ++ ++ DK1-NR 30 + +++ + ++++ ++++ ++ ++++ DK2-NR 11 +++ +++ +++ + + +++ DK3-NR 36 + + + ++ ++ + ++ 35 QUADRO 8
Detecção de queratinas (K) nos queranócitos
Queranócitos Número de passaqens K4 K7 K8 K10/1 Kl 3 K14 K17 K18 Kl 9 FKO-NR 2 ++ _ ++ ++ +++ ++ + + -I- + FK2-NR 25 + + + _ ++ ++ +++ ++ ++ + + DKO-NR 2 + + _ _ +++ +++ +++ +++ - + DK1-NR 13 + + - ++ +++ +++ ++ ++ + + DK1-NR 30 + _ ++ ++ + + ++ + + + + DK2-NR 11 ++ + _ +++ +++ + + + +++ + + + + + + ++ DK3-NR 36 + - +++ +++ + + + +++ +++ +++ ++
Procedimento (quadros 7 e 8) : os queranócitos cultivados em lâminas de câmaras de contagem foram corados após fixação em metanol puro por meio dos anticorpos enumerados na tabela 6. +++: concentração mais forte de proteína, quantificada por meio de um microscópio de fluorescência, nenhuma expressão de proteína. 6) Expressão da qlutationo-S-transferase pelos queranócitos imortalizados: a enzima de fase II, que consiste de glutationo-S-transferase (GST) foi analisada pela técnica de transferência de manchas pelo método de Western-Blot e Northern-Blot). Todas as linhas de queranócitos exprimem fortemente os ARN mensageiros para GSTa, ΰΒΤμ, e GSTít. 0 perfil de exposição de GSTa, ΰετμ, e GSTn nas linhas celulares é semelhante ao dos queranócitos normais (tabela 9: Método: transferência de manchas pelo método Western). QUADRO 9
Expressão da proteína GST
Queranócitos GSTa ϋΞΤμ GSTx FK2-NR - - +++ DKO-NR - - +++ DKl-NR — - +++ DK2-NR - - +++ DK3-NR - - +++ 7) Metabolismo dos ácidos gordos essenciais (AGE): para analisar e comparar a des-saturação e alongamento dos AGE adicionados aos queranócitos, trataram-se os queranócitos imortalizados (DK1-NR, FK2-NR) e os queranócitos normais com ácido linoleico (LA, 15 μΜ) e ácido a-linolénico (LN, 15 μΜ) . Para estas experiências, utilizou-se o meio NR-2 (Biofluids Inc.) deficiente em AEG. As culturas celulares foram tratadas após se atingir a confluência e foram passadas do meio para um meio NR-2, com alto teor em cálcio (1,5 mM) . As células foram tratadas durante 4 dias com os AGE (renovados ao fim de 2 dias). A análise dos AGE foi realizada por extracção e separação dos fosfolípidos por CCM (cromatografia em camada fina) e quantificação dos ésteres metílicos de ácidos gordos por CGL (cromatografia gás-líquido). Foi possível demonstrar a formação da des-saturação e de produtos de alongamento de LA (20: 4n-6 e 22:4n-6) e de LN (20:5n-3, 22:5n-3 e 22:6n-3). Este perfil metabólico está de acordo com o observado nos queranócitos normais. 8) Estabelecimento do cariótipo: todas as linhas celulares eram hipodiplóides, sendo a maioria das contagens de cromossomas no intervalo de células diplóides (à excepção de DK2-NR, com contagem de cromossomas no intervalo de células hipotetraplóides) . Não se detectaram outras células nas 37 c
Λ culturas, para além das linhas celulares analisadas. Este resultado cunliunà a pureza das linhas celulares e a auocncia de contaminação celular por outras fontes. 9) Caracterização in vivo: a tumorigenicidade dos queranócitos imortalizados foi determinada por injecçâo sub-cutânea (1-2 mio de queranócitos) em ratos nús. As linhas de queranócitos testadas DK2-NR, DK3, NR5, FK2-NR não são tumorigénicas nos ratos nús (4 meses de incubação). A DK3-NR é, no entanto, fracamente tumorigénico em 6 animais de um total de 19, após 5 meses de incubação. 10) Resposta a irritantes cutâneos; a indução do "gene do stress" TNFa (factor de necrose tumoral alfa) após o tratamento com irritantes cutâneos, consistindo de PMA (12-miristato-13-actato de forbol), SDS (duodecilsulfato de sódio), DMSO (dimetilsulfóxido), IL-1 b (interleucina 1 beta) e UV-B (raios ultravioleta B) , foi analisada pelo método de transferência de manchas Northern e por testes biológicos (quadro 10). As linhas celulares DK1-NR e DK2-NR respondem ao PMA e aos UV-B e exprimem a proteína TNFa, mesmo a taxas elevadas de passagens
Após o tratamento de queranócitos imortalizados com ésteres de forbol (PMA), observou-se um aumento da expressão de colagenase (do tipo I). QUADRO 10
Secreção de TNFa nos queranócitos após indução com irritantes cutâneos
Análise de actividade: incorporação de 3H-timidina em células sensíveis ao TNF-a* 38
Secreção de TNFa após indução com Queranócitos Número de passagens PMA SDS DMSO Ι1-1β UV-B DKO-NR 3 + - - nt + DK1-NR 20-22 + + - + + DK1-NR 32 + - - nt + DK2-NR 16 + - - - + DK2-NR 31 + - - nt + nt:não testado *:células sensíveis: linha de células de fibrosarcoma de rato WEHI 164, clone 1,14 (ATCC) 11) Culturas orqanotípicas: fez-se igualmente a cultura de queranócitos humanos em condições organotípicas (cultura de queranócitos com exposição ao ar, num gel de colagénio com células alimentadoras). Todas as linhas de queranócitos apresentavam uma morfologia hiperproliferativa, em relação aos queranócitos normais. Estes estudos foram realizados num meio de cultura com soro. 0 crescimento proliferativo das células é reduzido em condições sem soro (NR-2 com um teor elevado em cálcio (1,5 mM) em frascos de cultura de plástico sem colagénio e células alimentadoras) . EXEMPLO 4: 1) Imortalização de melanócitos: faz-se a cultura de uma suspensão celular produzida a partir da amostra de tecido cutâneo DKO-NR descrita no exemplo 1, que contém melanócitos, queranócitos e fibroblastos dissociados, em meio NR-3 (veja-se a seguir) . Esta cultura é realizada semeando com as células frascos de cultura que são revestidos de forma contínua com um revestimento "cocktail", descrito anteriormente para as células brônquicas (Lechner et al., J. Tiss. Cult. Meth, 9:43-49 (1985)). Após se obter uma confluência praticamente total, por exemplo cerca de 90% de confluência, o que se produz habitualmente após um tempo de cerca de 10 a 14 dias, os queranócitos e melanócitos são separados. Fara isso, a cultura 39
é tratada com uma solução de tripsina/EDTA (0,025%/0,01%) durante 5 min, em 3eguida rccolhcm-se os melanócitos, que se separam primeiro que os queranócitos. Os melanócitos primários são em seguida cultivados no número de células desejado em meio NR-4 sem soro em frascos de cultura revestidos, descritos (o meio NR-4 inibe o crescimento dos queranócitos), em seguida as células são imortalizadas com o vector pLXSHD+SV40 (#328) de acordo com o protocolo de Pfeiffer et al.,. Meth. Cell Sei, 17:83-89, 1995 (excepto que o vírus foi recolhido após encapsidação numa linha celular que se desenvolve em meio DMEM, com 101 de soro fetal de bovino) . Ao longo da infecção, utiliza-se o meio sem soro PC-1 descrito no artigo de Pfeiffer et al., Meth. Cell. Sei., 14, 83-89 (1995). Após imortalização, os melanócitos imortalizados são transferidos para o meio de proliferação e de diferenciação M2, utilizando frascos de cultura previamente revestidos (M2=meio DMEM/F12 disponível na Biofluids, Nol48 e Olssen Inc., Uppsala, Suécia). 2) Caracterização de melanócitos que exprimem o T-Aq: a expressão de proteínas associadas à melanina por melanócitos imortalizados produzidos de acordo com a presente invenção (em particular a linha DM2-NR) foi comparada com a de melanócitos normais. Demonstrou-se que as células imortalizadas exprimem proteínas associadas à melanina, um antigénio associado ao melanoma (AAM) e HMB4 5, de um modo semelhante ao das células normais, se bem que com muma taxa de expressão menor. 2) Indução da síntese de melanina: a melanogénese de linhas de melanócitos que exprimem a T-Ag (em particular a linha DM2-NR) foi comparada com a de melanócitos normais. Os melanócitos foram tratados com indutores de melanogénese, que consistem de tirosina e teofilina e inibidor de melanogénese consistindo de ácido cójico. As linhas de melanócitos, em particular a linha DM2-NR, respondem ao modulador de melanogénese de um modo semelhante ao das células normais. Demonstrou-se igualmente que a iudução/inibição da melanogénese c dependente da dose. 40
EXEMPLO 5:
Imortalizou-se uma estirpe de queranócito, proveniente do tecido DKO-NR descrito no exemplo 1, como descrito no exemplo 3, com a construção retroviral pLXSHD+E6/E7 que se baseia no vírus de papiloma humano 16 (HPV16) e que está descrito na figura 2b. Seleccionaram-se assim várias linhas de queranócitos imortalizadas. Os resultados da análise destas linhas, em termos de produtos de diferenciação (citoqueratinas, GST, TNFa, Involucrina, Filagrina, Loricrina, Vimentina, etc.) são semelhantes aos obtidos para as linhas DK2-NR e DK3-NR. EXEMPLO 6:
As composições do meio NR-3 inovador da presente invenção e de vários outros meios sem soro da presente invenção, designadamente NR-1, NR-2 e NR-4, são comparadas a seguir. QUADRO 11
Composição do meio NR-1 NR-1
Aminoácidos L-alanina L-arginina Asparagina, H20 Ácido L-aspártico L-cisteína, HC1, H20 Ácido L-glutâmico Glutamina Glicina L-histidina, HC1, H20 L-isoleucina L-leucina L-lisina, HC1 L-metionina L-Ienilalanina [miligramas/litro] 9.0000 316.0000 15.0000 4.0000 42.0000 14.8000 877.0000 7.60000 50.4000 98.4000 131.2000 36.6000 13.4000 14.9000 41
Aminoácidos L-prolina L-serina L-treonina L-triptofano L-tirosina L-valina
Sais inorgânicos
Metavanadato de amónio [NH4VO3] Molibdato de amónio [ (NH4) 6M07O244H2O Cloreto de cálcio [CaCl22H20]
Sulfato de cobre [CUSO4.5H2O]
Sulfato de ferro [FeS04.7H20]
Cloreto de magnésio [MgCl2.6H20]
Cloreto de manganésio [MnCl2.4H20] Sulfato de níquel [NÍSO4.6H20]
Cloreto de potássio [KC1]
Acetato de sódio Bicarbonato de sódio [NaHCOs]
Cloreto de sódio [NaCl]
Fosfato diácido de sódio [Na2HPC>3.7H20] Piruvato de sódio Selenito de sódio [Na2Se03]
Silicato de sódio [Na2Si03.9H2O]
Cloreto de estanho [SnCl2.2H20]
Sulfato de zinco [ZnS04.7H20]
Vitaminas d-biotina d-pantotenato de cálcio Cloreto de colina Cianocobalamina (B12) Ácido fólico i-inositol Nicotinamida (B3)
Piridoxina (B6.H2O)
Ribuflavina(B2) NR-1 [miligramas/litro] 34.6000 126.2000 23.8000 9.2000 13.6000 70.2000 0,0006 0,0010 16.2000 0,0025 1.4000 122.0000 0,0002 0,0003 112.0000 301.5000 1088.0000 5200.0000 536.0000 55.5000 0,0050 0,1420 0,0001 0,5100 0,0200 0,2600 28,0000 0,4100 0,7900 18,0000 0,0400 0,0600 0,0400 42
V -V-·'
Aminoácxdos Outros constituintes
Adenina
Factor de cresciemtno epidérmico recombinante humano)
Etanolamina
Glucose
HEPES
Hidrocortisona Insulina (bovino)
Vermelho de fenol Fosfoetanolamina Putrescina.2HC1 tiamina.HC1 Ácido tióctico timidina
Transferrina (humana)
Osmolaridade NR-1 [miligramas/litro] 27.3000 (EGF, 0,0010 0,0310 1080,0000 6000.0000 0,5000 5.0000 1.2000 0,0710 0,1600 0,3400 0,2100 0,7300 10,0000 280-285 mOsm/kg 1) Composição do meio NR-2: o meio NR-2 é idêntico ao meio NR-1, mas é suplementado com um extracto de hipófise bovina (Biolfuid Inc.) a 35 mg/1 e contém antibióticos (Gibco BRL, Life Technologies Inc.) que consistem de fungizona (0,25 mg/1), penicilina (10 000 Unidades/1) e estreptomicina (10 mg/1). 2) Composição do meio NR-3: inclui os mesmos substituintes que o meio NR-2, mas é suplementado com epinefrina (Biolfuid Inc.) a 250 μg/l 3) Composição do meio NR-4: inclui os mesmos substituintes que o meio NR-2, mas c suplementado com PFGF (3 μg/l) (factor de 43 crescimento de fibroblastos básico obtido da Sigma Inc.) e 12-mir istato-13-acetato de forbol (10 \i.q/±) (PMA) (C. Inc.). com C.R.
Lisboa, 28 de Março de 2001
44

Claims (27)

  1. /*\
    REIVINDICAÇÕES 1. Processo modificado para imortalizar células cutâneas humanas, a fim de se obterem queranócitos e melanócitos imortalizados, caracterizado por compreender as etapas seguintes: (i) obtenção de uma amostra de tecido cutâneo humano; (ii) preparação da referida amostra cutânea para a cultura in vitro; (iii) obtenção de queranócitos e/ou melanócitos a partir da referida amostra de tecido cutâneo, preparada, e sementeira dos referidos queranócitos e/ou melanócitos num meio de crescimento desprovido de soro, em placas de cultura providas de um revestimento que compreende fibronectina, colagénio do tipo 1 e SAB, que facilitam a fixação e crescimento das células; (iv) substituição do meio, do modo necessário para se obter um crescimento confluente, óptimo, das células em cultura, mantendo de forma continua o revestimento das placas de cultura; (v) transferência dos queranócitos ou melanócitos para um meio sem soro, adaptado para seleccionar de entre os queranócitos ou os melanócitos em placas de culturas previamente revestidas, de modo semelhante; (vi) infecção dos queranócitos ou melanócitos com uma construção retroviral; (vii) transferência dos queranócitos ou melanócitos imortalizados resultantes num meio de proliferação sem soro, adequado para a proliferação de queranócitos ou melanócitos imortalizados, em placas de cultura previamente revestidas, de modo semelhante; e (viii) transferência dos queranócitos resultantes que proliferaram, para um meio de diferenciação sem soro, que contém um teor elevado em cálcio em frascos de cultura previamente revestidos, de modo semelhante. 1 2.
    Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a construção retroviral ser o vector pLXSHD+SV40 (#328) , baseado no vírus SV40, ou o vector pLXSHD+E6/E7 baseado no vírus de papiloma humano 16 (HPV16).
  2. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o meio sem soro na etapa (iii) ser meio NR-3, compreendendo os compostos indicados no quadro 11 e um extracto de hipófise de bovino (35 mg/ml), fungizona (0,25 mg/1) , penicilina (10000 unidades/1) e estreptomicina (10 mg/1) e ser suplementado com epinefrina (250 μg/l).
  3. 4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o meio da etapa (v) ser o meio NR-3 de acordo com a reivindicação 3, ou o meio NR-4, que compreende os compostos indicados no quadro 11 e um extracto de hipófise bovina (35 mg/ml), fungizona (0,25 mg/1), penicilina (10000 unidades/1) e estreptomicina (10 mg/1) e ser suplementado com PFGF (3 μg/l) e 12-miristato-13-acetato de forbol (10 μg/l).
  4. 5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o meio de proliferação da etapa (vii) ser o meio NR-2 que compreende os compostos indicados no quadro 11 e um extracto de hipófise de bovino (35 mg/ml), fungizona (0,25 mg/1), penicilina (10000 unidades/1) e estreptomicina (10 mg/1) ou o meio NR-3 de acordo com a reivindicação 3 e o meio M2 para os melanócitos.
  5. 6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o meio de diferenciação da etapa (viii) ser o meio NR-2, ou o meio MCDB 153 modificado, que tem um teor em cálcio de pelo menos 1,5 mM. 2
  6. 7. Linha celular imortalizada de queranócitos ou de melanócitos humanos, que pode 3cr obtida de acordo com o processo reivindicado nas reivindicações 1-6.
  7. 8. Linha de queranócitos imortalizados de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por exprimir proteínas do tipo da queratina de acordo praticamente com o mesmo esquema dos queranócitos diferenciados normais.
    Linha de queranócitos imortalizados de acordo com a reivindicação 8, na qual as proteínas do tipo da queratina compreendem a queratina Kl/10, a queratina K14 e outras proteínas que compreendem a involucrina, a filagrina e a loricrina.
  8. 10. Linha de queranócitos imortalizados de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por apresentar um perfil de CYP450 que é idêntico ou praticamente idêntico ao dos queranócitos diferenciados normais.
  9. 11. Linha de queranócitos imortalizados de acordo com a reivindicação 10, que exprime os CYP450, 1A1, 2C, 2E1 e 3A5 mas que não exprime os CYP450, 1A2, 2A6, 2B6 e 2D6.
  10. 12. Linha de células de pele humana seleccionada de entre o grupo formado pelas linhas de queranócitos DK2-NR (DSM ACC2238), DK3-NR (DSM ACC2239) e FK2-NR (DSM ACC2240) e a linha de melanócitos DM2-NR (CNCM-1796) .
  11. 13. Linha de queranócitos imortalizados, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por exprimir um ARNm que codifica para a glutationo-S-transferase GST-a, GST-μ e GST-π.
  12. 14. Linha de queranócitos imortalizados de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por, quando cultivada em culLura organotípica, formar um cpitélio altamente 3
    estratificado e polarizado, com camadas superficiais qucrotinizadas, na ausência de soro ou de células alimentadoras.
  13. 15. Linha de queranócitos imortalizados de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por exprimir a colagenase do tipo 1 e o TNF-α quando tratada com ésteres de torbol.
  14. 16. Linha de queranócitos imortalizados de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por exprimir uma proteína escolhida de entre o grupo constituído por involucrina, filagrina e liricrina, de acordo praticamente com o mesmo esquema que os queranócitos normais.
  15. 17. Meio de cultura modificado sem soro, apto para o isolamento e produção de queranócitos e melanócitos humanos de acordo com as reivindicações 1-6, caracterizado por compreender: aminoácidos ou sais de aminoácidos; sais inorgânicos, vitaminas, adenina, etanolamina, glucose, HEPES, vermelho de fenol, putrescina.2HCl, tiamina.HCl, timidina, factor de crescimento epidérmico; insulina, hidrocortisona, fosfoetanolamina, e extracto de hidrohipóf ise bovina, caracterizado por conter ácido tióctico e transferrina num teor suficiente para isolar e produzir os queranócitos ou melanócitos humanos, de acordo com as reivindicações 7-16.
  16. 18. Meio de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por conter adicionalmente epinefrina.
  17. 19. Meio de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a concentração de epinefrina ser suficiente para aumentar o crescimento dos queranócitos.
  18. 20. Meio de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por os aminoácidos presentes no meio serem escolhidos de entre o grupo constituído por L-alanina, L-arginina-HCl, 4 * »
    asparagina-H20, ácido L-aspártico, L-cisteína-HCl-H20, ácido-L-glutâmico, glutamina, glicina, L-histidina-HCl-H20, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina-HCl, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, L-valina e os seus sais.
  19. 21. Meio de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por os sais inorgânicos serem escolhidos de entre o grupo constitui do por metavanadato de amónio, molibdato de amónio, cloreto de cálcio, sulfato cúprico, sulfato férrico, cloreto de magnésio, cloreto de manganésio, sulfato de níquel, cloreto de potássio, acetato de sódio, bicarbonato de sódio, cloreto de sódio, fosfato diácido de sódio, piruvato de sódio, selenito de sódio, silicato de sódio, cloreto de estanho e sulfato de zinco.
  20. 22. Meio de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por as vitaminas serem escolhidas de entre o grupo constituído por d-biotina, d-pantotenato de cálcio, cloreto de colina, cianocobalamina, ácido fólico, i-inositol, nicotinamida, piridoxina e riboflavina.
  21. 23. Meio modificado sem soro, para isolar, produzir e/ou manter os queranócitos e/ou melanócitos imortalizados, caracterizado por ser escolhido de entre o grupo constituído pelo meio NR-2, meio NR-3 e meio NR-4, de acordo com uma das reivindicações 4 ou 5.
  22. 24. Análise modificada que utiliza queranócitos e/ou melanócitos diferenciados, caracterizada por a modificação compreender a utilização de queranócitos e/ou melanócitos imortalizados de acordo com a reivindicação 7.
  23. 25. Análise de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por as células serem escolhidas de entre o grupo constituído pelas células DK2-NR (DSM AC2238), DK3-NR (DSM ACC2239), DM2-NR (CNCM 1-1796) e FK2-NR (DSM ACC2240). 5
  24. 26. Análise de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por consistir de uma análise de reacção de inflamação.
  25. 27. Análise modificada, que utiliza melanócitos ou queranócitos primários, caracterizada por a modificação compreender a utilização de melanócitos ou queranócitos primários obtidos de acordo com a reivindicação 1 (iii) .
  26. 28. Análise de acordo com a reivindicação 27, caracterizada por consistir de uma análise de reacção de inflamação.
  27. 29. Processo modificado de enxerto cutâneo, caracterizado por o aperfeiçoamento compreender a utilização como tecido cutâneo enxertado, de queranócitos ou melanócitos primários produzidos de acordo com a reivindicação 1 (iii)· Lisboa, 28 de Março de 2001 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL
    6
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