WO2014142038A1 - ヒト角膜上皮シートの製造法 - Google Patents

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medium
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human corneal
cell
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究 今川
前田　謙一
勇喜 細田
修一 横山
直毅 奥村
範子 小泉
木下　茂
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Ｊｃｒファーマ株式会社
京都府公立大学法人
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Definitions

  • the present invention relates to a human corneal epithelial sheet for transplantation, and more particularly to a method for producing a human corneal epithelial sheet using human corneal epithelial-derived cells obtained by culturing human corneal epithelial cells.
  • the cornea is a transparent tissue consisting of five cell layers, the corneal epithelium, Bowman's membrane, corneal stroma, Descemet's membrane, and corneal endothelium, from outside to inside, and there are no blood vessels but nerves are distributed. .
  • the corneal epithelium is a non-keratinized stratified squamous epithelium with a thickness of about 50 ⁇ m, which constitutes part of the surface of the eye, a barrier that restricts the penetration of substances and prevents the invasion of bacteria and fungi into the cornea Function as. Tight junctions existing between the outermost cells play an important role in maintaining the barrier function of the corneal epithelium.
  • the corneal epithelium is regenerative, and even if the epithelium is damaged, corneal epithelial cells are supplied from corneal epithelial stem cells to repair the damage, and tight junctions between cells are also regenerated to restore and maintain the barrier function.
  • corneal transplantation is widely used as an effective treatment.
  • Corneal transplantation is broadly divided into full-thickness corneal transplantation for transplanting the entire cornea layer and transplantation of a portion of corneal tissue. Since full-thickness corneal transplantation has problems such as fragility of the eyeball caused by full-thickness corneal incision, in recent years, a technique for transplanting a part of corneal tissue is becoming widespread.
  • corneal tissue As a technique for transplanting a part of such corneal tissue, there are a superficial corneal transplantation in which a part of the corneal stroma and a corneal epithelium are transplanted simultaneously and a corneal epithelial transplantation in which only the corneal epithelium is transplanted. It has already been established in clinical settings for patients with corneal dystrophy.
  • Corneal epithelial stem cells having the ability to differentiate into corneal epithelial cells are present at the base of the limbal tissue. Therefore, when the corneal limbal tissue is damaged, corneal epithelial stem cells for repairing corneal epithelial cells are not supplied. In addition, when the corneal epithelium is damaged extensively, it takes time to supply an amount of corneal epithelial cells necessary for repairing the damage from the corneal epithelial stem cells. In addition, when the Bowman membrane, which is the extracellular matrix of corneal epithelial cells, is damaged, the corneal epithelial cells cause poor adhesion, and sufficient cells cannot be supplied to the corneal epithelium.
  • corneal epithelial stem cell exhaustion a disease that occurs due to the inability or decline of the supply of corneal epithelial stem cells. Corneal epithelial transplantation to the cornea inflamed by corneal epithelial stem cell exhaustion has a low engraftment rate due to rejection.
  • corneal epithelial transplantation also has a problem of insufficient donors because a corneal epithelium for transplantation that satisfies the demand cannot be obtained.
  • a method has been considered in which corneal epithelial cells are cultured in vitro to produce a cell sheet, and this sheet is transplanted to the damaged site of the corneal epithelium.
  • inflammation of the transplanted site becomes a problem.
  • a method for transplanting a human corneal epithelial sheet while suppressing inflammation a method has been attempted in which a human corneal epithelial sheet is formed on the amniotic membrane to produce a human corneal epithelial sheet having an amniotic layer and transplanted. Yes.
  • Non-patent Document 1 As a method of forming a cell sheet on the amniotic membrane, a corneal epithelial ring segment of a healthy white rabbit is seeded on a human matrix amniotic membrane (amniotic membrane from which the amniotic epithelial cells have been removed) and together with supporting cells (NIH-3T3 cells) A method of culturing has been reported (Non-patent Document 1). It has been confirmed that the human corneal epithelial sheet obtained here has a layer structure morphologically similar to that of a living corneal epithelium. A human corneal epithelial sheet was prepared by a similar method using healthy human corneal epithelial ring pieces and transplanted to a patient with refractory ocular surface disease. Has been shown to be effective as a means for restoring eye function (Non-patent Documents 2 and 3).
  • a healthy white rabbit or human corneal epithelial ring piece is enzymatically treated to suspend the corneal epithelial cells, which are then separated from the human matrix amniotic membrane (the amniotic epithelial cells are detached).
  • a method of seeding on a removed amniotic membrane) and culturing with supporting cells has been reported (Patent Document 1, Non-Patent Document 4). It has been confirmed that the human corneal epithelial sheet obtained here also has a morphologically similar layer structure to that of the living corneal epithelium. In addition, it has been confirmed that expression of tight junction-related proteins is induced by culturing human corneal epithelial sheets by exposing the surface of cultured cells to the gas phase (air-lifting).
  • an object of the present invention is to provide a method for producing a human corneal epithelial sheet which is efficient and stable in quality.
  • the present inventors used cells derived from human corneal epithelial cells as ROC inhibitors, phosphodiesterase inhibitors, MAP kinase inhibitors and TGF using human mesenchymal stem cells as supporting cells.
  • -A human corneal epithelial cell sheet can be efficiently produced by culturing in a medium containing various combinations of ⁇ -receptor inhibitors, and further culturing human corneal epithelial cells obtained by the culture on human amniotic membrane.
  • the present invention was completed by finding that it can be manufactured well. That is, the present invention provides the following.
  • a method for producing cells derived from human corneal epithelial cells A supporting cell is added to the first chamber of a culture vessel partitioned into a first chamber and a second chamber by a membrane having micropores that do not allow cells to pass through, and human corneal epithelial cells are added to the second chamber. Culturing the human corneal epithelial cell using a first medium containing a ROCK inhibitor and a phosphodiesterase inhibitor, and then culturing the human corneal epithelial cell, and then containing a phosphodiesterase inhibitor, a MAP kinase inhibitor, and a TGF- ⁇ receptor inhibitor.
  • a production method comprising culturing the human corneal epithelial cell using the medium of 2.
  • the ROCK inhibitor contained in the first medium is Y27632
  • the phosphodiesterase inhibitor contained in the first and second mediums is 3-isobutyl-1-methylxanthine
  • the MAP kinase inhibitor contained in the second medium is selected from SB203580, SB239063, or a combination thereof
  • the TGF- ⁇ receptor inhibitor contained in the second medium is SB431542.
  • LY364947, A83-01, or a combination thereof The production method according to any one of (1) to (4) above.
  • the ROCK inhibitor contained in the first medium is Y27632
  • the phosphodiesterase inhibitor contained in the first and second mediums is 3-isobutyl-1-methylxanthine, Any of (1) to (4) above, wherein the MAP kinase inhibitor contained in the second medium is SB203580, and the TGF- ⁇ receptor inhibitor contained in the second medium is SB431542.
  • the manufacturing method of crab is (7)
  • the concentration of Y27632 contained in the first medium is 1 to 20 ⁇ M
  • the concentration of 3-isobutyl-1-methylxanthine contained in the first and second medium is 50 to 150 ⁇ M.
  • the concentration of Y27632 contained in the first medium is about 10 ⁇ M
  • the concentration of 3-isobutyl-1-methylxanthine contained in the first and second medium is about 100 ⁇ M
  • the production method according to (6) above, wherein the concentration of SB203580 contained in the second medium is about 1 ⁇ M and the concentration of SB431542 is about 1 ⁇ M.
  • a production method further comprising the step of suspending the cells obtained by the production method according to any one of (1) to (9) above in a cell freezing solution and freezing to form frozen cells.
  • (11) A cell derived from a human corneal epithelial cell obtained by the production method according to any one of (1) to (10) above.
  • (12) A cell derived from a frozen human corneal epithelial cell obtained by the production method according to (10) above.
  • (13) A method for producing a human corneal epithelial sheet, In the cell derived from the human corneal epithelial cell according to (11) above, after thawing, the cell derived from the human corneal epithelial cell according to (11) or (12) is cultured with a support cell.
  • a cell derived from the human corneal epithelial cell on the substrate amniotic membrane and then cultured on a fourth medium containing a MAP kinase inhibitor and a TGF- ⁇ receptor inhibitor. And a step of culturing using the fourth medium in a state where all or a part of the surface of the cell layer is not covered with the medium.
  • the ROCK inhibitor contained in the third medium is Y27632
  • the MAP kinase inhibitor contained in the fourth medium is SB203580
  • TGF- contained in the fourth medium The production method according to (13) or (14) above, wherein the ⁇ receptor inhibitor is SB431542.
  • the concentration of Y27632 contained in the third medium is 1 to 20 ⁇ M
  • the concentration of SB203580 contained in the fourth medium is 0.2 to 2 ⁇ M
  • the concentration of Y27632 contained in the third medium is about 10 ⁇ M
  • the concentration of SB203580 contained in the fourth medium is about 1 ⁇ M
  • the concentration of SB431542 is about 1 ⁇ M
  • the supporting cells are human mesenchymal stem cells.
  • a human corneal epithelial sheet comprising the matrix amniotic membrane and cells derived from the human corneal epithelial cells, obtained by the production method according to any one of (13) to (18).
  • 99.5% or more of the surface of the matrix amniotic membrane is covered with a cell layer formed by cells derived from human corneal epithelial cells, and 98% or more of the cells are positive for cytokeratin AE1 / AE3 More than 80% of the cells are cytokeratin 12 positive, more than 95% of the cell layer has a multi-layered structure consisting of four or more cell layers, and more than 90% of the surface of the cell layer is flat
  • a stable human corneal epithelial sheet that can be transplanted to patients with corneal diseases such as recurrent corneal dystrophy can be stably supplied, thereby eliminating the shortage of donors for corneal epithelial transplantation. Can do.
  • A is a flat cell on the surface
  • B is a cell layer formed from cells derived from human corneal epithelial cells
  • C is a matrix amniotic membrane.
  • (A) shows the control
  • (B) shows the fluorescence intensity of the cells stained with the anti-cytokeratin AE1 / AE3 antibody.
  • (2) The figure which detected the cytokeratin 12 positive cell by FACS is shown.
  • the vertical axis represents the number of cells, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity derived from Alexa Fluor (registered trademark) 647 dye.
  • (C) shows control
  • (D) shows fluorescence intensity of cells stained with anti-cytokeratin 12 antibody.
  • A is a flat cell on the surface
  • B is a cell layer formed from cells derived from human corneal epithelial cells
  • C is a matrix amniotic membrane.
  • the figure which shows the proliferation promotion effect of the human corneal epithelial cell of the combination of various MAP kinase inhibitors and a TGF-beta receptor inhibitor at the time of culture
  • the vertical axis shows the relative value (%) of the absorbance of each group when the absorbance (OD450) of the control group (NA) is 100%. Error bars indicate standard deviation.
  • the human corneal epithelial cells used for producing the cells are human corneal ring parts or tissue slices containing human corneal epithelial tissues and corneal ring parts as proteins. Obtained by treatment with degrading enzymes.
  • the corneal limbus is a portion that transitions from the sclera to the cornea and includes stem cells that have the ability to differentiate into corneal epithelial cells.
  • the proteolytic enzyme used at this time is preferably dispase.
  • a tissue section is first treated with dispase, and cells (or cell masses) are released from the surface of the tissue section to form a suspension.
  • the dispase solution used at this time is preferably PBS containing dispase at a concentration of 0.5 to 2.0 ⁇ U / mL or a primary culture basic medium described later.
  • the treatment with dispase is performed by gently shaking at 37 ° C. for 1 hour, or by allowing the cells to stand at 4 ° C. for 12 to 18 hours.
  • the treatment with dispase is preferably allowed to stand at 4 ° C. for 12 to 18 hours and then at 37 ° C. for 40 to 40 ° C. Leave the cells for 80 minutes, more preferably at 4 ° C for 14-16 hours, then at 37 ° C for 50-70 minutes, more preferably at 4 ° C for 15-20 hours, and then leave the cells at 37 ° C for 60 minutes.
  • CnT-20 (CELLEnTEC) is preferably used as the primary culture basic medium at this time.
  • the human corneal epithelial cell obtained by the treatment with the above-mentioned proteolytic enzyme is a culture vessel partitioned into a first chamber and a second chamber by a membrane (support membrane) having a micropore that does not allow passage of the cell.
  • a culture vessel with support cells added to the first chamber, cultured in the second chamber with a first medium containing ROCK inhibitor, and then phosphodiesterase inhibitor, MAP kinase Culture is performed using a second medium containing an inhibitor and a TGF- ⁇ receptor inhibitor.
  • this series of cultures is referred to as primary culture (P0 culture) of human corneal epithelial cells.
  • the human corneal epithelial cell obtained by the treatment with the above-mentioned proteolytic enzyme is preferably a membrane (support membrane) having micropores that do not allow cells to pass through in a culture vessel containing support cells.
  • a second medium containing a phosphodiesterase inhibitor, a MAP kinase inhibitor and a TGF- ⁇ receptor inhibitor As described above, this series of cultures is referred to as primary culture (P0 culture) of human corneal epithelial cells.
  • the culture vessel used for culturing human corneal epithelial cells and supporting cells is not particularly limited as long as it can cultivate mammalian cells, but is preferably capable of culturing with cells fixed.
  • the culture vessel is partitioned into a first chamber and a second chamber by a membrane having micropores that do not allow cells to be described in detail later. Since the membrane does not allow cells to pass through, human corneal epithelial cells and supporting cells do not come into direct contact in the culture vessel, and these cells do not mix.
  • the membrane may be provided vertically on the bottom of the flat bottom, or may be provided horizontally.
  • both human corneal epithelial cells and supporting cells are cultured on the bottom surface of the culture vessel.
  • the membrane is provided horizontally on the bottom surface of the flat bottom, one of human corneal epithelial cells and supporting cells is cultured on the bottom surface of the culture vessel and the other is cultured on the membrane.
  • the culture container having a flat bottom culture container examples include a commercially available cell culture plate (24-well plate, 12-well plate, 6-well plate, etc.).
  • the bottom of the culture vessel has cell adhesion glycoproteins such as fibronectin, collagen (collagen type I, type IV, etc.), laminin, or cell adhesion active sites of these cell adhesion glycoproteins so that the cells can be easily fixed. It is preferably coated with a peptide containing (RGD sequence).
  • NIH3T3 cells or human mesenchymal stem cells used as feeder cells are cultured on such a culture vessel, the feeder cells adhere to the bottom surface of the vessel.
  • the inside of the culture vessel is attached with a membrane (support membrane) that has micropores and does not allow supporting cells to pass through, and is partitioned into two chambers by this membrane.
  • the membrane is attached to the inside of the culture vessel so that a culture space for supporting cells can be secured below the bottom surface of the culture vessel and the lower side surface does not come into contact with the supporting cells.
  • the material for the support film polyethylene terephthalate and polycarbonate are preferable, and polyethylene terephthalate is particularly preferable.
  • the micropores of this membrane are of a pore size that prevents the passage of feeder cells (and also human corneal epithelial cells) but allows liquid components contained as solutes in the medium to pass through.
  • the pore diameter of the fine holes is preferably 0.1 to 1.5 ⁇ m, more preferably 0.2 to 1.2 ⁇ m, and still more preferably 0.4 to 1.0 ⁇ m.
  • Supporting cells and human corneal epithelial cells are much larger than these pore sizes, so even if there are floating cells, they cannot pass through the supporting membrane, but the medium and liquids such as growth factors secreted from the supporting cells sexual components can pass through the support membrane. Therefore, corneal epithelial cells and supporting cells are not in direct contact in the culture vessel.
  • the support membrane is pre-coated with cell adhesion glycoproteins such as fibronectin, collagen (collagen type I, type IV, etc.), laminin, or peptides containing cell adhesion active sites (RGD sequences) of these cell adhesion glycoproteins. It is preferable that
  • FIG. 4 schematically shows an example of the setting of the culture vessel in the primary culture of human corneal epithelial cells according to the present invention in accordance with the examples.
  • the culture vessel (6-well companion plate) is divided into a lower chamber (first chamber) and an upper chamber (second chamber) vertically by a membrane having fine holes.
  • Human mesenchymal stem cells are added as supporting cells to the first chamber
  • human corneal epithelial cells are added to the second chamber
  • human mesenchymal stem cells are cultured at the bottom of the culture vessel in the first chamber.
  • human corneal epithelial cells are cultured on a membrane having micropores. Cells cannot pass through membranes with micropores, but liquid components such as growth factors secreted from the media and supporting cells can pass through the micropores.
  • the term “supporting cell” refers to human corneal epithelial cells (or human corneal epithelial cells derived from human corneal epithelial cells) in primary culture or production of corneal epithelial sheets.
  • Cell used to promote the growth of cells.
  • Supporting cells have a function of promoting cell proliferation by supplementing nutrients and special growth factors that are deficient in the medium.
  • the cells that can be used as feeder cells are not particularly limited as long as they can promote the proliferation of human corneal epithelial cells (or cells derived from human corneal epithelial cells), but are not limited to NIH3T3 cells, BALB / 3T3 cells, Swiss3T3, Mesenchymal stem cells are preferred, and mesenchymal stem cells are particularly preferred.
  • the supporting cells are more preferably human-derived cells from the viewpoint of preventing contamination with heterologous proteins.
  • mesenchymal stem cell refers to a stem cell derived from mesenchyme or a progenitor cell thereof that can proliferate in an undifferentiated state and differentiate into at least two types of cells.
  • Cells that are induced to differentiate from mesenchymal stem cells are, for example, osteoblasts, chondroblasts, and lipoblasts.
  • MSC can be obtained from various tissues such as bone marrow, adipose tissue, dental pulp, umbilical cord blood, placenta, and amniotic membrane.
  • any MSC can be used regardless of the tissue from which the material is obtained.
  • bone marrow-derived MSC is preferable.
  • the MSC used in the present invention is preferably a human mesenchymal stem cell (hMSC).
  • hMSC can be obtained by various methods, for example, in the case of bone marrow-derived hMSC, it can be obtained by the method described in the patent document (Japanese Patent Publication No. 7-500001).
  • the hMSC used in the present invention can be further specified by the expression pattern of the surface antigen.
  • CD29, CD44 and CD105 are preferably positive, and CD34 and CD45 is negative, more preferably CD29, CD44, CD73, CD90 and CD105 are positive, CD34 and CD45 are negative, more preferably CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 and CD166 are positive Yes, CD34 and CD45 are negative, even more preferably, CD29, CD44, CD49a, CD49e, CD73, CD90, CD105 and CD166 are positive and CD34 and CD45 are negative.
  • the primary culture of human corneal epithelial cells is preferably performed by adding human corneal epithelial cells obtained by treatment with the above-mentioned proteolytic enzyme onto the support membrane, and placing human corneal epithelial cells (or human) on the upper side across the support membrane. Cells derived from corneal epithelial cells) and supporting cells (but not in contact with the membrane) on the lower side.
  • the medium is added to the container so that the human corneal epithelial cells added on the support film are completely covered with the medium.
  • supporting cells are cultured on the bottom surface of the culture vessel, and human corneal epithelial cells are cultured on a membrane (supporting membrane) having micropores.
  • the lower side of the supporting membrane with supporting cells becomes the first chamber of the culture vessel
  • the upper side with human corneal epithelial cells becomes the second chamber of the culturing vessel.
  • components such as growth factors derived from the support cells are also supplied to the upper side of the support membrane through the micropores of the support membrane.
  • the human corneal epithelial cells are cultured on the support membrane while adhering to the surface of the support membrane.
  • primary culture of human corneal epithelial cells can be performed in a state where human corneal epithelial cells (or cells derived from human corneal epithelial cells) are present on the lower side and supporting cells are present on the upper side across the supporting membrane. .
  • supporting cells are cultured on a membrane having micropores, and human corneal epithelial cells are cultured on the bottom surface of the culture vessel.
  • it is preferable that the human corneal epithelial cells are fixed and cultured on the bottom surface of the culture vessel.
  • the upper side of the support membrane with the support cells becomes the first chamber of the culture vessel, and the lower side with the human corneal epithelial cells becomes the second chamber of the culture vessel.
  • human corneal epithelial cells on the bottom or support film of the culture vessel preferably 1X10 4 ⁇ 1X10 5 cells / cm 2, and more preferably 4X10 4 ⁇ 6X10 4 cells / cm 2 , More preferably, it is added to the culture vessel so as to be about 5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • the term “cell” means a cell that broadly encompasses all mammalian cells, and particularly a cell that combines a support cell and a human corneal epithelial cell (or a cell derived from a human corneal epithelial cell).
  • human corneal epithelial cells are cultured using a first medium containing a ROCK inhibitor, and then a phosphodiesterase inhibitor, a MAP kinase inhibitor, and a TGF- ⁇ receptor inhibitor are added. Culturing is carried out using the second medium that is contained.
  • the basic medium primary culture basic medium
  • the basic medium for both the first medium and the second medium in the primary culture contains amino acids, vitamins, inorganic salts, and other components.
  • the type and concentration of amino acids contained in the primary culture basic medium can be appropriately selected from those shown in Table 1.
  • the type and concentration of vitamins contained in the primary culture basic medium can be appropriately selected from those shown in Table 2.
  • the kind and concentration of inorganic salts contained in the primary culture basic medium can be appropriately selected from those shown in Table 3.
  • inorganic salts such as sodium selenite, ammonium molybdate, manganese chloride, nickel sulfate, tin chloride, and sodium silicate can be added to the medium as appropriate.
  • sodium selenite Na 2 SeO 3
  • the concentration is preferably 0.003 to 0.02 mg / L, more preferably about 0.005 mg / L.
  • ammonium molybdate [(NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 ⁇ 4H 2 O] is added to the medium, the concentration is preferably 0.0005 to 0.002 mg / L, more preferably about 0.001 mg / L .
  • the concentration is preferably 0.0001 to 0.0004 mg / L, more preferably about 0.0002 mg / L.
  • nickel sulfate [NiSO 4 ⁇ 6H 2 O] is added to the medium, the concentration is preferably 0.0001 to 0.0005 mg / L, more preferably about 0.0003 mg / L.
  • tin chloride [SnCl 2 ⁇ 2H 2 O] is added to the medium, the concentration is preferably 0.00005 to 0.0002 mg / L, more preferably about 0.0001 mg / L.
  • sodium silicate [Na 2 SiO 3 .9H 2 O] is added to the medium, the concentration is preferably 0.0001 to 0.2 mg / L, more preferably about 0.14 mg / L.
  • the types and concentrations of other components contained in the primary culture basic medium can be appropriately selected from those shown in Table 4.
  • Primary culture medium includes epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), growth factors such as insulin and transferrin, adenine, L-ethanolamine, hydrocortisone, D, L-lipoic acid, pyruvin
  • EGF epidermal growth factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • growth factors such as insulin and transferrin, adenine, L-ethanolamine, hydrocortisone, D, L-lipoic acid, pyruvin
  • EGF epidermal growth factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • growth factors such as insulin and transferrin, adenine, L-ethanolamine, hydrocortisone, D, L-lipoic acid, pyruvin
  • the concentration is preferably 1 to 200 ⁇ g / mL, more preferably 2 to 100 ⁇ g / mL.
  • the concentration is preferably 1 to 200 ⁇ g / mL, more preferably 2 to 20 ⁇ g / mL.
  • the concentration is preferably 15 to 35 mg / L, more preferably 20 to 30 mg / L.
  • L-ethanolamine is added to the medium, the concentration is preferably 2.5 to 4 mg / L, more preferably 3 to 3.5 mg / L.
  • hydrocortisone is added to the medium, the concentration is preferably 0.1 to 1.0 mg / L, more preferably 0.3 to 0.7 mg / L.
  • the concentration is preferably 20 to 40 mg / L, more preferably 25 to 30 mg / L.
  • the concentration is preferably 40 to 65 mg / L, more preferably 50 to 60 mg / L.
  • phosphorylethanolamine is added to the medium, the concentration is preferably 0.02 to 0.12 mg / L, more preferably 0.05 to 0.10 mg / L.
  • the concentration is preferably 1 to 570 IU / L, and when adrenaline is added to the medium, the concentration is preferably 0.1 to 2 ⁇ M.
  • the primary culture basic medium a CnT-20 medium (CELLEnTEC), which is a serum-free medium for passage of human corneal epithelium, can be suitably used.
  • the primary culture basic medium can also be appropriately prepared based on the medium composition disclosed in patent documents such as JP 2000-506374 and JP 2000-517188.
  • the first medium in the primary culture is obtained by adding a ROCK inhibitor and a phosphodiesterase inhibitor to the primary culture basic medium.
  • the ROCK inhibitor that can be added to the primary culture basic medium is not particularly limited, but Y27632 represented by the following chemical formula (I) can be preferably used, and a suitable concentration in the medium is 1 ⁇ 20 ⁇ M, especially about 10 ⁇ M.
  • the phosphodiesterase inhibitor that can be added to the primary culture basic medium is not particularly limited, but 3-isobutyl-1-methylxanthine is preferably used, and the preferable concentration in the medium is 50 to 150 ⁇ M. Especially about 100 ⁇ M.
  • two or more ROCK inhibitors can be used in combination, and two or more phosphodiesterase inhibitors can be used in combination.
  • the second medium in the primary culture is obtained by adding a phosphodiesterase inhibitor, a MAP kinase inhibitor, and a TGF- ⁇ receptor inhibitor to the primary culture basic medium.
  • the phosphodiesterase inhibitor that can be added to the primary culture basic medium is not particularly limited, but 3-isobutyl-1-methylxanthine is preferably used, and the preferable concentration in the medium is 50 to 150 ⁇ M. , Especially about 100 ⁇ M. Also, two or more phosphodiesterase inhibitors can be used in combination.
  • the MAP kinase inhibitor that can be added to the primary culture basic medium is not particularly limited, but SB203580 represented by the following chemical formula (II) or SB239063 represented by the following chemical formula (III) is preferably used.
  • SB203580 represented by the following chemical formula (II) or SB239063 represented by the following chemical formula (III) is preferably used.
  • the preferred concentration in the medium is 0.2-2 ⁇ M, especially about 1.0 ⁇ M.
  • two or more MAP kinase inhibitors can be used in combination.
  • the TGF- ⁇ receptor inhibitor that can be added to the primary culture basic medium is not particularly limited, but SB431542 represented by the following chemical formula (IV), LY364947 represented by the following chemical formula (V), or the following A83-01 represented by the chemical formula (VI) is preferably used, and SB431542 or LY364947 is particularly preferably used.
  • SB431542 represented by the following chemical formula (IV)
  • LY364947 represented by the following chemical formula (V)
  • A83-01 represented by the chemical formula (VI) is particularly preferably used.
  • SB431542 or LY364947 is particularly preferably used.
  • the preferred concentration in the medium is 0.2-2 ⁇ M, especially about 1.0 ⁇ M.
  • Two or more TGF- ⁇ receptor inhibitors can also be used in combination.
  • cells obtained by culturing and proliferating human corneal epithelial cells are referred to as cells derived from human corneal epithelial cells (human corneal epithelial derived cells). is there.
  • Primary culture of human corneal epithelial cells is performed until human corneal epithelial-derived cells preferably occupy 70% or more of the support membrane surface, more preferably 85% or more, and even more preferably 90% or more .
  • Cells obtained by primary culture of human corneal epithelial cells can be used for production of human corneal epithelial sheets.
  • Human corneal epithelium-derived cells obtained by primary culture can be frozen and stored.
  • human corneal epithelium-derived cells are washed with PBS on a culture vessel or membrane, then treated with proteolytic enzyme to detach the cells from the culture vessel or membrane, and the detached cells are stored in a cell cryopreservation solution.
  • proteolytic enzyme used at this time is preferably collagenase A.
  • Cell cryopreservation solutions used for cryopreservation of human corneal epithelial cells include, for example, dimethyl sulfoxide (DMSO), fetal calf serum (FCS), natural polymer compounds or organic synthetic polymer compounds, monosaccharides or disaccharides, and buffers.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • FCS fetal calf serum
  • An aqueous solution containing a liquid a natural polymer compound or an organic synthetic polymer compound is an arbitrary component and is appropriately added depending on the state of the cell.
  • the concentration of DMSO contained in the cell cryopreservation solution is preferably 5 to 15% (v / v).
  • the concentration of fetal calf serum contained in the cell cryopreservation solution is preferably 50 to 90% (v / v).
  • the natural polymer compound contained in the cell cryopreservation solution is preferably dextran, glycogen, methylcellulose or carboxymethylcellulose, and its concentration is preferably 0.1 to 1.0% (v / v).
  • the organic synthetic polymer compound contained in the cell cryopreservation solution is preferably polyethylene glycol or polyvinylpyrrolidone, and its concentration is preferably 1 to 10% (v / v).
  • the monosaccharide contained in the cell cryopreservation solution is preferably glucose, and its concentration is preferably 1 to 10% (w / v).
  • the disaccharide contained in the cell cryopreservation solution is preferably sucrose, and its concentration is preferably 1 to 10% (w / v).
  • As the buffer solution a carbonate buffer solution, a phosphate buffer solution, HEPES, or the like can be suitably used.
  • Preferred cell cryopreservation solution compositions include, for example, 75% (v / v) fetal calf serum, 10% (v / v) DMSO, 3% (w / v) glucose, 0.08% (w / v) sodium bicarbonate , 0.036% (w / v) HEPES, An aqueous solution containing 0.1575% (w / v) RPMI1640 powder medium (powder) can be mentioned.
  • Cell bankers Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.
  • CELLnTEC CnT-CRYO-50
  • the concentration in the human corneal epithelium-derived cell freezing solution of cells is preferably 0.5X10 5 ⁇ 1.5X10 6 cells / mL, more preferably 1X10 5 ⁇ 1X10 6 cells / mL.
  • human corneal epithelium-derived cells that have been frozen and stored can be thawed and used to produce a human corneal epithelial sheet. Therefore, by freezing human corneal epithelial-derived cells and storing them in large quantities, when producing human corneal epithelial sheets, they can be thawed and used as necessary. A corneal epithelial sheet can be supplied.
  • the production of the human corneal epithelial sheet is carried out by finely preventing cells (human corneal epithelium-derived cells) obtained by primary culture of human corneal epithelial cells from passing through the support cells in a culture vessel.
  • human corneal epithelium-derived cells can be used not only by freezing and thawing by the above-described method, but also without freezing.
  • human corneal epithelium-derived cells are used without freezing, the cells are detached from the support membrane with proteolytic enzyme after the primary culture is complete, and suspended in a medium before use.
  • the proteolytic enzyme used at this time is preferably collagenase A.
  • the human corneal epithelial-derived cells have micropores attached to the inside of the culture container and are on a membrane (support membrane) that can prevent the support cells from passing through. Incubate on the placed substrate amniotic membrane.
  • the support membrane used at this time is attached to the inside of the culture vessel so that the culture space for the support cells can be secured below the bottom surface of the culture vessel and the lower side surface does not come into contact with the support cells.
  • the material for the support film polyethylene terephthalate and polycarbonate are preferable, and polyethylene terephthalate is particularly preferable.
  • the micropores of the support membrane have a pore size that prevents support cells (and moreover human corneal epithelial cells) from passing through, but allows liquid components contained as solutes in the medium to pass through.
  • the pore diameter of the fine holes is preferably 0.1 to 1.5 ⁇ m, more preferably 0.2 to 1.2 ⁇ m, and still more preferably 0.4 to 1.0 ⁇ m.
  • Supporting cells (and human corneal epithelial cells) are much larger than these pore sizes, so even if there are floating cells, they cannot pass through the supporting membrane, but the medium and liquids such as growth factors secreted from the supporting cells Sexual components pass through the support membrane.
  • the support membrane is preferably coated with fibronectin, collagen (collagen type I, type IV, etc.), laminin or the like in advance.
  • the substrate amniotic membrane used at this time is one in which the epithelium of the amniotic membrane is detached from the amniotic membrane.
  • the substrate amnion is separated from the epithelium with the surface on the upper side facing up to cover the entire support membrane, dried, and then fixed to the support membrane. Therefore, the substrate amniotic membrane is placed in the culture vessel on the supporting membrane with the side from which the amniotic epithelium has been peeled facing upward.
  • the amniotic membrane used at this time is preferably human amniotic membrane.
  • the amniotic membrane can be dried by air drying or the like.
  • human corneal epithelial cells are suspended on a substrate amniotic membrane fixed to a supporting membrane so that the cell density is preferably 1 ⁇ 10 4 to 2 ⁇ 10 4 cells / cm 2 after being suspended in a medium. Sowing.
  • the medium is added to the container so that the human corneal epithelial cells added on the matrix amniotic membrane are completely covered with the medium. That is, culturing is performed in a state where supporting cells (but not in contact with the membrane) are present on the lower side of the membrane and matrix amniotic membrane and human corneal epithelium-derived cells are present on the upper side.
  • components such as growth factors derived from supporting cells are also supplied to the upper side of the membrane through the micropores of the membrane.
  • the culture of the human corneal epithelium-derived cells seeded on the matrix amniotic membrane is started using a third medium supplemented with a ROCK inhibitor and a phosphodiesterase inhibitor.
  • the medium (basic medium for producing human corneal epithelial sheet) that is the basis of the third medium contains amino acids, vitamins, inorganic salts, and other components.
  • the type and concentration of amino acids contained in the basic medium for producing a human corneal epithelial sheet can be appropriately selected from those shown in Table 5.
  • the types and concentrations of vitamins contained in the basic medium for producing a human corneal epithelial sheet can be appropriately selected from those shown in Table 6.
  • the kind and concentration of inorganic salts contained in the basic culture for producing a human corneal epithelial sheet can be appropriately selected from those shown in Table 7.
  • inorganic salts such as sodium selenite, ammonium molybdate, manganese chloride, nickel sulfate, tin chloride, sodium silicate and the like can be appropriately added to the medium.
  • sodium selenite Na 2 SeO 3
  • the concentration is preferably 0.003 to 0.02 mg / L, more preferably about 0.005 mg / L.
  • ammonium molybdate [(NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 ⁇ 4H 2 O] is added to the medium, the concentration is preferably 0.0005 to 0.002 mg / L, more preferably about 0.001 mg / L .
  • the concentration is preferably 0.0001 to 0.0004 mg / L, more preferably about 0.0002 mg / L.
  • nickel sulfate [NiSO 4 ⁇ 6H 2 O] is added to the medium, the concentration is preferably 0.0001 to 0.0005 mg / L, more preferably about 0.0003 mg / L.
  • tin chloride [SnCl 2 ⁇ 2H 2 O] is added to the medium, the concentration is preferably 0.00005 to 0.0002 mg / L, more preferably about 0.0001 mg / L.
  • sodium silicate [Na 2 SiO 3 .9H 2 O] is added to the medium, the concentration is preferably 0.0001 to 0.2 mg / L, more preferably about 0.14 mg / L.
  • the types and concentrations of other components contained in the basic medium for producing a human corneal epithelial sheet can be appropriately selected from those shown in Table 8.
  • the basic medium for producing a human corneal epithelial sheet preferably further contains transferrin, hydrocortisone, adrenaline, insulin, epidermal growth factor (EGF) and the like.
  • the concentration is preferably 1 to 200 ⁇ g / mL, more preferably 3 to 5 ⁇ g / mL.
  • the medium contains hydrocortisone its concentration is preferably 0.8 to 1.4 mg / L, more preferably 1.0 to 1.2 mg / L.
  • the concentration is preferably 0.1 to 2 ⁇ M, more preferably 0.5 to 0.8 ⁇ M.
  • the concentration is preferably 1 to 200 ⁇ g / mL, more preferably 3 to 7 ⁇ g / mL.
  • the concentration is preferably 1 to 50 ng / mL, more preferably 5 to 40 ng / mL.
  • Basic medium for production of human corneal epithelial sheet includes growth factors such as basic fibroblast growth factor (bFGF), adenine, L-ethanolamine, D, L-lipoic acid, sodium pyruvate, phosphorylethanolamine, heparin, etc.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • the concentration is preferably 1 to 20 ng / mL, more preferably 3 to 7 ng / mL.
  • concentration is preferably 15 to 35 mg / L, more preferably 20 to 30 mg / L.
  • the concentration is preferably 2.5 to 4 mg / L, more preferably 3 to 3.5 mg / L.
  • D L-lipoic acid is added to the medium
  • the concentration is preferably 20 to 40 mg / L, more preferably 25 to 30 mg / L.
  • sodium pyruvate is added to the medium
  • the concentration is preferably 40 to 65 mg / L, more preferably 50 to 60 mg / L.
  • phosphorylethanolamine is added to the medium, the concentration is preferably 0.02 to 0.12 mg / L, more preferably 0.05 to 0.10 mg / L.
  • the concentration is preferably 1 to 570 IU / L.
  • a medium in which SHEM medium and KB medium are mixed at a ratio of 1: 2 can be suitably used.
  • fetal calf serum (FCS) can also be added to the basic medium for producing a human corneal epithelial sheet.
  • FCS fetal calf serum
  • the concentration is preferably 2 to 10%, more preferably 4 to 6%.
  • the third medium used in the production of the human corneal epithelial sheet is obtained by adding a ROCK inhibitor to the basic medium for producing the human corneal epithelial sheet.
  • a ROCK inhibitor that can be added to the basic medium for human corneal epithelial sheet production at this time, but Y27632 can be preferably used, and the preferable concentration in the medium is 1 to 20 ⁇ M, Especially about 10 ⁇ M.
  • the culture period of the cells in the culture using the third medium is preferably 2 to 4 days, more preferably 2 to 3 days.
  • the human corneal epithelium-derived cells are obtained using a fourth medium obtained by adding a MAP kinase inhibitor and a TGF- ⁇ receptor inhibitor to a basic medium for producing a human corneal epithelial sheet. Incubate.
  • the MAP kinase inhibitor that can be added to the basic medium for producing the human corneal epithelial sheet is not particularly limited, but SB203580 is preferably used.
  • SB203580 is preferably used.
  • the preferred concentration in the medium is 0.2-2 ⁇ M, especially about 1.0 ⁇ M.
  • TGF- ⁇ receptor inhibitor that can be added to the basic medium for producing a human corneal epithelial sheet
  • SB431542 is preferably used.
  • the preferred concentration in the medium is 0.2-2 ⁇ M, especially about 1.0 ⁇ M.
  • the culture period of the cells in the culture using the fourth medium in the production of the human corneal epithelial sheet is preferably 7 to 14 days. During this period, it is preferable to change the medium every 2 days for 4 to 6 days from the start of the culture, and then change the medium every day for 7 to 14 days. After the medium is finally changed, the medium is changed when the lactic acid concentration is preferably 7 to 11 mM, more preferably 8 to 10 mM, while measuring the lactic acid concentration.
  • the lactic acid concentration is preferably 7 to 11 mM, more preferably 8 to 10 mM, while measuring the lactic acid concentration.
  • the human corneal epithelial-derived cells are immersed on the bottom surface of the matrix amniotic membrane, while the surface of the cell layer composed of cells derived from human corneal epithelial-derived cells formed on the matrix amniotic membrane.
  • Culturing is preferably performed for 2 to 5 days, more preferably 3 days, in a state where all or part of the culture medium is not covered with the medium (exposed to the gas phase in the incubator).
  • Such a method of culturing by exposing the surface of cultured cells to the gas phase is generally called air-lifting culture.
  • a medium that can be used in air-lifting culture is a medium obtained by adding a MAP kinase inhibitor and a TGF- ⁇ receptor inhibitor to a basic medium for producing a human corneal epithelial sheet, and the fourth medium can be suitably used.
  • the medium is preferably changed every 10-24 hours, more preferably every 12 hours.
  • a human corneal epithelial sheet in which a cell layer composed of cells derived from human corneal epithelium is formed on the surface of the matrix amniotic membrane is obtained.
  • the term “human corneal epithelial sheet” refers to a sheet in which the surface of the matrix amniotic membrane from which the amniotic epithelium has been peeled (the surface of the matrix amniotic membrane) is covered with a cell layer formed by human corneal epithelial cells.
  • the human corneal epithelial sheet is preferably 95% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99.5% or more, and even more preferably 99.8% or more of the surface of the matrix amniotic membrane is composed of cells derived from human corneal epithelium.
  • the cell layer is covered with a cell layer, and preferably 90% or more, more preferably 98% or more of the cell layer composed of human corneal epithelium-derived cells has a multi-layered structure composed of two or more layers. is there. Further, preferably 95% or more of the cell layer composed of cells derived from human corneal epithelium has a multilayer structure composed of three or more layers of cells. Further, preferably 95% or more of the cell layer composed of cells derived from human corneal epithelium has a multilayer structure composed of four or more layers of cells.
  • the human corneal epithelial sheet is such that preferably 90% or more, more preferably 98% or more of the surface of the cell layer composed of cells derived from human corneal epithelium is covered with flat cells.
  • the ratio of fibroblasts in the cell layer composed of human corneal epithelial cells formed on the surface of the matrix amniotic membrane is preferably less than 0.1%, more preferably less than 0.02%.
  • the human corneal epithelium-derived cells constituting the human corneal epithelial sheet are preferably 98% or more positive for cytokeratin AE1 / AE3, 80% or more positive for cytokeratin 12 and more preferably 99% or higher.
  • cytokeratin AE1 / AE3 80% or more positive for cytokeratin 12
  • cytokeratin 12 preferably 98% or more positive for cytokeratin AE1 / AE3
  • 80% or more positive for cytokeratin 12 are preferably 99% or higher.
  • the human corneal epithelial sheet produced in the present invention can be used in place of conventional corneal transplantation for the treatment of patients with corneal diseases.
  • the corneal disease to be treated with the human corneal epithelial sheet is not particularly limited as long as it is a disease in which the function of the corneal epithelium such as the barrier function is impaired.
  • the disease in which the function of the corneal epithelium such as the barrier function is irreversibly impaired. Recurrent corneal dystrophy, Stevens-Johnson syndrome, chemical trauma and corneal epithelial stem cell exhaustion.
  • hMSC Human mesenchymal stem cells
  • hMSC corneal epithelial cell culture medium
  • CELLEnTEC corneal epithelial cell culture medium
  • the tissue section was transferred to a 35 mm petri dish (Prime Surface, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), and then observed under a stereomicroscope, using a human corneal epithelium from the tissue section using an insidious ingot The cells were scraped to obtain a cell suspension, which was transferred to an Eppendorf tube (Proteofry, Sumitomo Bakelite), centrifuged, and after removing the supernatant, CnT-20 medium was added to the pellet.
  • Eppendorf tube Proteofry, Sumitomo Bakelite
  • the cells were collected by centrifugation, and 10 ⁇ M Y27632 (ROCK inhibitor) (Sigma) and 100 ⁇ M 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, phosphodiesterase inhibitor) (Sigma) were collected. Contain CnT-20 medium suspended in (first medium in the embodiment) 6 mL.
  • 6-well cell culture insert (pore size 0.4 ⁇ m, made of polyethylene terephthalate, BD Falcon Cell Culture Insert, BD Biosciences) coated with FNC Coating Mix (AthenaES) as a support membrane on the above-mentioned support cell-added 6-well companion plate. Then, add 0.5 mL of the collected human corneal epithelial cell suspension (1/12 volume of cells prepared from 1 eye) to each well of this 6-well cell culture insert, and start culturing. did.
  • 6-well cell culture insert contains 10 ⁇ M Y27632 (ROCK inhibitor) (Sigma) and 100 ⁇ M 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, phosphodiesterase inhibitor) (Sigma) 0.5 mL of CnT-20 medium to be added was added and further cultured for 2-3 days.
  • the medium was then treated with 100 ⁇ M 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, phosphodiesterase inhibitor) (Sigma), 1 ⁇ M SB203580 (MAP kinase inhibitor) (Sigma) and 1 ⁇ M SB431542 (TGF- ⁇ receptor inhibition)
  • IBMX 3-isobutyl-1-methylxanthine
  • SB203580 MAP kinase inhibitor
  • 1 ⁇ M SB431542 TGF- ⁇ receptor inhibition
  • the medium was replaced with CnT-20 medium (second medium in Examples) containing (agent) (Sigma), and the cells were cultured while changing the medium every 2-3 days. During this time, if changes in the bottom well support cells are noticeably detached from the bottom well, a new 6-well companion plate with support cells fixed to the bottom of the bottom well is prepared. The 6-well cell culture insert was transferred and the culture was continued.
  • FIG. 4 The setting of the culture vessel in the primary culture of human corneal epithelial cells is schematically shown in FIG.
  • a 6-well companion plate (culture vessel) is divided into a lower chamber (first chamber) and an upper chamber (second chamber) vertically by a membrane having fine holes.
  • Human mesenchymal stem cells are added as supporting cells to the first chamber, and human corneal epithelial cells are added to the second chamber.
  • Human mesenchymal stem cells adhere to the bottom of the culture vessel in the first chamber, and human corneal epithelial cells are cultured on the membrane having micropores in the second chamber.
  • cell bunker 1 Nakko Honsen Pharmaceutical Co., Ltd.
  • cell bunker 1 Nakko Honsen Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the amniotic membrane After thawing the amniotic membrane, it was transferred to a 10 cm petri dish, washed twice with G-PBS to remove the amniotic membrane preservation solution, 0.02% EDTA / PBS was added, and the treatment was performed at 37 ° C. for 2 hours or more. After washing twice with G-PBS, the epithelium of the amniotic membrane was detached using a cell scraper under observation with a stereomicroscope. The amniotic membrane (substrate amniotic membrane) from which the epithelium had been detached was immersed in a G-PBS solution and stored at 4 ° C.
  • Human mesenchymal stem cells that had been cryopreserved were quickly thawed in a 37 ° C constant temperature bath, suspended by adding DMEM / 10% FBS medium, and centrifuged to precipitate the cells and collect them. The collected cells were suspended in DMEM / 10% FBS medium, and the number of viable cells was measured. The cells were seeded in the bottom well of a 6-well companion plate (Corning) at a cell density of 1.5 ⁇ 10 4 to 2.5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 and cultured in DMEM / 10% FBS medium for 1 to 3 days.
  • KB + SHEM medium refers to a medium in which KB medium and SHEM medium shown in the following preparation method are mixed at a ratio of 2: 1.
  • KB medium consists of 6 additional factors (0.2%) excluding bovine pituitary extract (BPE) among the 7 additional factors attached to serum-free liquid medium (LIFELINE Cell Technology) for normal human corneal epithelial cell proliferation (v / v) OcuFactor Lifefactor, 5 ⁇ g / mL transferrin, 0.18 ⁇ g / mL hydrocortisone, 1 ⁇ M adrenaline, 6 mM L-glutamine, 5.0 ⁇ g / mL recombinant human insulin), and gentamicin to a concentration of 10 ⁇ g / mL Is
  • SHEM medium consists of DMEM / F-12 (Gibco) with 5 ⁇ g / mL recombinant human insulin, 10 ng / mL recombinant human EGF (Gibco), 10% FBS (Hyclone), and a concentration of 10 ⁇ g / mL. This is a medium prepared by adding
  • the cryopreserved corneal epithelium-derived cells were quickly thawed in a 37 ° C. constant temperature bath, suspended by adding KB + SHEM medium, and then centrifuged to precipitate the cells and collect them.
  • the collected cells were suspended in a KB + SHEM medium containing 10 ⁇ M Y27632 (ROCK inhibitor) (Sigma) to form a cell suspension, and the number of viable cells was measured.
  • the suspended corneal epithelium-derived cell suspension was added to the substrate amniotic membrane placed in a 6-well cell culture insert so that the number of viable cells was 1 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or more, and the culture was started.
  • the upper limit of the amount of cell suspension added at this time was 0.5 mL.
  • the 6-well cell culture insert and the bottom well medium are discarded, and the medium is KB + SHEM medium containing 1 ⁇ M SB203580 (Sigma) and 1 ⁇ M SB431542 (Sigma). 4), and the cells were cultured for 4 to 6 days while the medium (KB + SHEM culture medium) was changed every 2 days. Subsequently, the cells were cultured for 7 to 14 days while changing the medium (KB + SHEM culture medium) every day. During this time, if changes in the bottom well support cells are noticeably detached from the bottom well, a new 6-well companion plate with support cells fixed to the bottom of the bottom well is prepared. The culture was continued by transferring the 6-well cell culture insert, and the cells were grown on the matrix amniotic membrane to form a cell layer composed of cells derived from human corneal epithelial cells on the matrix amniotic membrane.
  • the measurement of the lactic acid concentration in the culture supernatant is started 24 hours after the last medium change, and the 6-well cell culture insert and bottom well medium are discarded when the lactic acid concentration exceeds 8 to 10 mM.
  • 1.4 mL of medium (KB + SHEM culture medium) is added to the bottom well, and the bottom of the substrate amniotic membrane placed on the 6-well cell culture insert is immersed in the medium, while the substrate amniotic membrane in the 6-well cell culture insert is placed on the substrate amniotic membrane.
  • HE staining and FACS analysis were performed on the 6-well cell culture insert consisting of the matrix amniotic membrane and the cell layer of human corneal epithelium-derived cells formed on the matrix amniotic membrane as a human corneal epithelial sheet. The quality evaluation was conducted.
  • the cell sheet After confirming that the cytoplasm is stained with the eosin Y solution, the cell sheet is peeled off from the supporting membrane on a slide glass, and sealed with a cover glass using PBS, and this is used to create a human corneal epithelial sheet.
  • the surface of each cell was observed under a microscope, and the range of the cell layer (cultured cell layer) of human corneal epithelium-derived cells formed on the surface of the substrate amniotic membrane and the presence or absence of fibroblasts were observed under the microscope.
  • one quarter sheet after the division is Tissue-Tek (registered trademark) They were embedded and sliced in OCTCompound (Sakura Finetech Japan), and the sections were pasted on glass slides.
  • the slide glass with the section attached was immersed in a slide-stained vat with Superfix (Kurabo) for 10 minutes to fix the cells, and then washed with tap water for 10 minutes. Next, it was immersed for 45 seconds in a slide-stained vat containing a Mayer's hematoxylin solution and washed with tap water for 10 minutes.
  • the cells were stained with eosin Y solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) diluted 5-fold with PBS for 10 seconds and washed with tap water for 10 minutes. After confirming that the cytoplasm is stained with eosin Y solution, immerse each slide-stained vat in the order of 70, 80, 90, and 95% ethanol for 1 to 10 seconds. Soaked for 10 minutes. Finally, after taking out the slide glass and air-drying it, the one enclosed with a cover glass using Oykit (O. Kindler GmbH) was created, and using this, the cross section of the human corneal epithelial sheet was observed under a microscope, The degree of stratification and flat cell formation was observed.
  • Oykit O. Kindler GmbH
  • Phosphate buffer saline pH 7.4 contains BSA, powder (Sigma) dissolved in pure water, passed through 0.22 ⁇ m filter, 2% BSA (0.138M sodium chloride, 0.0027M potassium chloride, 2% (w / v) 0.01 M phosphate buffered saline (pH 7.4) containing bovine serum albumin was prepared. Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries) was added to the prepared 2% BSA to a concentration of 0.1%, and this was designated as BSA-T.
  • Antibody dilutions were prepared as follows. 10 ⁇ L of mouse IgG antibody solution (DAKO) and 5 ⁇ L of rabbit IgG antibody solution (DAKO) were added to 485 ⁇ L of BSA-T, and this was used as a primary antibody dilution for isotype control. In addition, 10 ⁇ L of mouse anti-cytokeratin AE1 / AE3 antibody solution (DAKO) was added to 486 ⁇ L of BSA-T, and this was used as a primary antibody dilution for detection of cytokeratin AE1AE3.
  • Alexa Fluor registered trademark 647-labeled goat anti-rabbit IgG antibody solution (Life Technologies Japan) was added to 998 ⁇ L of BSA-T to obtain a secondary antibody dilution for cytokeratin 12 detection.
  • the cells were then suspended in 4 mL of BSA-T, then divided into 4 tubes of 1 mL each, centrifuged to precipitate the cells, and BSA-T was removed.
  • the isotype control tubes two are the isotype control tubes, one is the cytokeratin AE1AE3 detection tube, and one is the cytokeratin 12 detection tube.
  • 500 ⁇ L each of the primary antibody dilution for keratin AE1AE3 detection and the primary antibody dilution for cytokeratin 12 detection were added and suspended, and reacted at room temperature for 30 minutes. After the primary antibody reaction, the cells were precipitated by centrifugation, and each primary antibody dilution was removed.
  • each of the secondary antibody dilutions for cytokeratin AE1AE3 detection and the secondary antibody dilutions for cytokeratin 12 detection were added to each of the two isotype control tubes and suspended, and the control tubes for cytokeratin AE1AE3 detection and A control tube for detection of cytokeratin 12 was used and allowed to react at room temperature for 30 minutes (light-shielded).
  • the cells were precipitated by centrifugation, and the secondary antibody dilution was removed.
  • 1 mL of BSA-T was added to suspend the cells, and then the cells were precipitated by centrifugation to remove BSA-T. This washing operation was repeated three times.
  • 500 ⁇ L of a solution obtained by diluting Propidium iodide solution (Sigma Aldrich) 500 times with BSA-T was added to each tube and suspended.
  • cytokeratin AE1AE3 detection tube and cytokeratin AE1AE3 detection tube Pass the cell suspension of cytokeratin AE1AE3 detection tube and cytokeratin AE1AE3 detection tube through a cell strainer, and use BD FACS Canto (registered trademark) (BD) to obtain fluorescence intensity derived from both Alexa Fluor 488 dyes. The ratio of cytokeratin AE1AE3-positive cells was measured.
  • the cell suspension of cytokeratin 12 detection tube and cytokeratin 12 detection control tube is passed through a cell strainer and derived from both Alexa Fluor 647 dyes using BD FACS Canto (registered trademark) (BD) The ratio of cytokeratin 12 positive cells was measured by comparing the fluorescence intensity.
  • the human corneal epithelial sheet produced by the above method is similar to the corneal epithelial tissue consisting of non-keratinized squamous epithelium that does not have the presence of fibroblasts and has a barrier function. From its shape, it was found that it was suitable as a corneal epithelial sheet for transplantation.
  • the primary culture (P0 culture) of human corneal epithelial cells was carried out by the following method (another method was adopted instead of the method described above.
  • Human corneal tissue for research two eyes, manufactured by SightLife, tissue preservation) CnT-20 medium was used as the solution), and the sclera and conjunctiva were cut off using a scalpel for scissors and scissors for cornea under a stereomicroscope, and tissue sections including corneal epithelial tissue and limbus were excised.
  • a dispase solution (CnT-20 medium (CELLEnTEC) containing 1.2 U / mL dispase (Sanko Junyaku) was added and allowed to stand at 4 ° C. for 15 to 20 hours. After standing at °C for 1 hour, the enzyme reaction was stopped with PBS containing 0.02% EDTA, and the tissue section was transferred to a 35 mm petri dish (Prime Surface, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.).
  • a human corneal epithelial cell is scraped using a sputum fertilizer Transfer the cell suspension to an Eppendorf tube (Proteofry, Sumitomo Bakelite), centrifuge, add the CnT-20 medium to the pellet after removing the supernatant, and centrifuge again.
  • CnT-20 medium containing 10 ⁇ M Y27632 (ROCK inhibitor) (Sigma) and 100 ⁇ M 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, phosphodiesterase inhibitor) (Sigma) (implemented)
  • the first medium in the example was suspended in 1 mL, a portion of the cell suspension was taken, diluted 10-fold with Trypan Blue Stain (Life Technologies), and the cells were stained and counted. Later, CnT-20 medium was added to the cell suspension to adjust the cell concentration to 2 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • the feeder cells added 6-well companion plate above, FNC Coating Mix (AthenaES Co.) coated 6-well cell culture inserts (pore size 0.4 ⁇ m, the culture area of about 4.2 cm 2, polyethylene terephthalate, BD Falcon Cell Culture Insert, BD Biosciences Then, 1.05 mL each of the collected human corneal epithelial cell suspension (2 ⁇ 10 5 cells per well) was added to each well of the 6-well cell culture insert, and the culture was started. .
  • FNC Coating Mix AlignaES Co.
  • 6-well cell culture insert contains 10 ⁇ M Y27632 (ROCK inhibitor) (Sigma) and 100 ⁇ M 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, phosphodiesterase inhibitor) (Sigma) 0.5 mL of CnT-20 medium to be added was added and further cultured for 2-3 days.
  • the medium was then treated with 100 ⁇ M 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, phosphodiesterase inhibitor) (Sigma), 1 ⁇ M SB203580 (MAP kinase inhibitor) (Sigma) and 1 ⁇ M SB431542 (TGF- ⁇ receptor inhibition)
  • IBMX 3-isobutyl-1-methylxanthine
  • SB203580 MAP kinase inhibitor
  • 1 ⁇ M SB431542 TGF- ⁇ receptor inhibition
  • the medium was replaced with CnT-20 medium (second medium in Examples) containing (agent) (Sigma), and the cells were cultured while changing the medium every 2-3 days. During this time, if changes in the bottom well support cells are noticeably detached from the bottom well, a new 6-well companion plate with support cells fixed to the bottom of the bottom well is prepared. The 6-well cell culture insert was transferred and the culture was continued.
  • FIG. 4 The setting of the culture vessel in the primary culture of human corneal epithelial cells is schematically shown in FIG.
  • a 6-well companion plate (culture vessel) is divided into a lower chamber (first chamber) and an upper chamber (second chamber) vertically by a membrane having fine holes.
  • Human mesenchymal stem cells are added as supporting cells to the first chamber, and human corneal epithelial cells are added to the second chamber.
  • Human mesenchymal stem cells adhere to the bottom of the culture vessel in the first chamber, and human corneal epithelial cells are cultured on the membrane having micropores in the second chamber.
  • the human corneal epithelial sheet produced by the above method was stained with HE, and the surface was observed under a microscope. As a result, no fibroblasts were observed. (FIG. 5). Since there were at least 1000 cells in the microscopic field, the ratio of fibroblasts in human corneal epithelial cells was less than 0.1%. In the microscopic field, 99.5% or more of the total area of the surface of the substrate amniotic membrane is covered with the cultured cell layer, and 95% or more of the cultured cell layer has a multi-layered structure of four or more layers. (B, FIG. 6).
  • the structure of the cultured cell layer including the flat cells was similar to that of corneal epithelial tissue consisting of non-keratinized stratified squamous epithelium with a barrier function.
  • a MAP kinase inhibitor and a TGF- ⁇ receptor inhibitor were added to these wells in the combinations and concentrations of groups (1) to (6) shown in Table 9. That is, the combination of MAP kinase inhibitor and TGF- ⁇ receptor inhibitor in each group and the concentration in the medium were (1) SB203580 (1 ⁇ M) + SB431542 (1 ⁇ M), (2) SB203580 (1 ⁇ M) + A83-01 (10 ⁇ M), (3) SB203580 (1 ⁇ M) + LY364947 (10 ⁇ M), (4) SB239063 (10 ⁇ M) + SB431542 (1 ⁇ M), (5) SB239063 (10 ⁇ M) + A83-01 (10 ⁇ M), (6) SB239063 ( 10 ⁇ M) + LY364947 (10 ⁇ M).
  • a control was prepared by adding neither a MAP kinase inhibitor nor a TGF- ⁇ receptor inhibitor to the medium.
  • Five days after the start of culture 10 ⁇ L of Cell Counting Kit-8 (CCK-8) solution containing water-soluble tetrazolium salt WST-8 as a coloring reagent was added to the medium, and after 1 hour, the absorbance at a wavelength of 450 nm (OD450) was measured with a plate reader. ) was measured.
  • the measurement was carried out in 4 wells for each combination, and the average value of the measurement values of the control was taken as 100%, and the measurement value of each group was obtained by comparison with the control. It is known that the number of living cells is approximately proportional to the absorbance thus obtained.
  • the measured values exceeded 100% in all groups (1) to (6) compared to the control (NA), and a combination of a MAP kinase inhibitor and a TGF- ⁇ receptor inhibitor was added to the medium. It was shown that the proliferation of human corneal epithelial cells is promoted (FIG. 7).
  • SB203580 (1 ⁇ M) + SB431542 (1 ⁇ M) in the group has a measured value of about 130%
  • SB239063 (10 ⁇ M) + SB431542 (1 ⁇ M) in the group has a measured value exceeding 140%.
  • a stable human corneal epithelial sheet that can be transplanted to patients with corneal diseases such as recurrent corneal dystrophy can be stably supplied.

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Abstract

【課題】角膜疾患患者への移植用のヒト角膜上皮シートを製造するための方法であって、ヒト角膜上皮細胞を培養して得られたヒト角膜上皮由来細胞を基質羊膜上で培養するための方法を提供すること。 【解決手段】ヒト間葉系幹細胞を支持細胞として使用するヒト角膜上皮細胞の培養法、及びROCK阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ－β受容体阻害剤を種々組合わせて添加した培地を使用するヒト角膜上皮細胞の培養法。

Description

ヒト角膜上皮シートの製造法
　本発明は，移植用のヒト角膜上皮シートに関し，詳しくは，ヒト角膜上皮細胞を培養して得られたヒト角膜上皮由来細胞を用いたヒト角膜上皮シートの製造法に関する。
　角膜は，外側から内側に向かって，角膜上皮，ボーマン膜，角膜実質層，デスメ膜，角膜内皮の５層の細胞層から成る透明な組織であり，血管は存在しないが神経は分布している。角膜上皮は，厚さ約50μｍの非角化重層扁平上皮で，眼表面の一部を構成しており，物質の透過を制限し，且つ細菌，真菌等の角膜内部への侵入を防止するバリアーとして機能する。角膜上皮のバリアー機能の維持には，最表層の細胞間に存在するタイトジャンクションが重要な役割を果たしている。
　角膜上皮は再生能力があり，上皮に傷がついても，角膜上皮幹細胞から損傷を修復するための角膜上皮細胞が供給され，更に細胞間のタイトジャンクションも再生されて，バリアー機能が回復，維持される。
　角膜上皮のバリアー機能が不可逆的に損なわれる角膜疾患に対しては，角膜移植が有効な治療法として普及している。角膜移植には大きく分けて，角膜全層を移植する全層角膜移植と，角膜組織の一部を移植するものがある。全層角膜移植には，角膜全層切開に起因する眼球の脆弱性等の問題があるので，近年は，角膜組織の一部を移植する手法が普及しつつある。このような角膜組織の一部を移植する手法として，角膜実質の一部と角膜上皮とを同時に移植する表層角膜移植及び角膜上皮のみを移植する角膜上皮移植があり，これらの手法は，再発性の角膜ジストロフィー患者等を対象に，既に臨床の場において確立されている。
　角膜輪部組織の基底部には，角膜上皮細胞への分化能を有する角膜上皮幹細胞が存在する。従って，角膜輪部組織が障害を受けると，角膜上皮細胞を修復するための角膜上皮幹細胞が供給されなくなる。また，角膜上皮が広範囲に障害を受けた場合には，角膜上皮幹細胞から損傷を修復するために必要な量の角膜上皮細胞が供給されるまでに時間がかかる。また角膜上皮細胞の細胞外基質であるボーマン膜が障害を受けている場合には，角膜上皮細胞が接着不良を起こし，角膜上皮に十分な細胞が供給できない。このようにして，角膜上皮が数週間以上に亘って修復されず，そのバリアー機能が損なわれた状態が継続すると，眼表面が細菌により感染され易くなる。一旦眼表面に感染が起こると，結膜上皮が血管新生を伴って眼表面を覆い，また，免疫細胞の遊走により，炎症が発生する。更には，細菌が分泌する酵素によって角膜組織が破壊され，失明に至る場合もある。このように，角膜上皮幹細胞の供給の不能又は低下により発生する疾患を角膜上皮幹細胞疲弊症という。角膜上皮幹細胞疲弊症により炎症を起こした角膜に対する角膜上皮移植は，拒絶反応により生着率が低い。
　また，角膜上皮移植には，需要を満たす移植用の角膜上皮が得られないというドナー不足の問題もある。このドナー不足に対しては，角膜上皮細胞をin vitroで培養して細胞シートを作製し，このシートを角膜上皮の損傷部位へ移植する方法が考えられている。このようなヒト角膜上皮シートを損傷部位へ移植する場合も，移植部位の炎症が問題となる。そこで，炎症を抑制してヒト角膜上皮シートを移植する方法として，ヒト角膜上皮シートを羊膜上に形成させて，羊膜層を有するヒト角膜上皮シートを作製し，これを移植する方法が試みられている。
羊膜上に細胞シートを形成させる手法として，健常な白色家兎の角膜上皮輪部片をヒト基質羊膜（羊膜上皮細胞を剥離除去した羊膜）上に播種し，支持細胞（NIH-3T3細胞）と共に培養する方法が報告されている（非特許文献１）。ここで得られたヒト角膜上皮シートは，形態学的にも生体角膜上皮に類似した層構造を有することが確認されている。健常なヒト角膜上皮輪部片を用いて同様の手法によりヒト角膜上皮シートを作製し，これを難治性眼表面疾患患者に移植する臨床試験が行われ，かかる手法により得られたヒト角膜上皮シートの移植が，眼機能回復手段として有効であることが示されている（非特許文献２，非特許文献３）。
また，羊膜上に細胞シートを形成させる手法として，健常な白色家兎又はヒトの角膜上皮輪部片を酵素処理して角膜上皮細胞を懸濁させ，これをヒト基質羊膜（羊膜上皮細胞を剥離除去した羊膜）上に播種し，支持細胞（NIH-3T3細胞）と共に培養する方法が報告されている（特許文献１，非特許文献４）。ここで得られたヒト角膜上皮シートも，形態学的にも生体角膜上皮に類似した層構造を有することが確認されている。また，ヒト角膜上皮シートの培養過程で，培養細胞の表面を気相に暴露させて培養することにより（air-lifting），タイトジャンクション関連蛋白質の発現が誘導されることが確認されている。
ＷＯ２００４／０７８２２５
Koizumi N. et al., Cornea, 19, 65-71 (2000) Koizumi N. et al., Archives of Ophthalmology, 119, 298-300 (2001) Koizumi N. et al., The American Academy of Ophthalmology, 108, 1569-74 (2001) Koizumi N. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci, 43, 2114-21 (2002)
　上記背景の下で，本発明の目的は，効率良く品質の安定したヒト角膜上皮シートを製造する方法を提供することである。
　上記目的に向けた研究において，本発明者らは，ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞を，支持細胞としてヒト間葉系幹細胞を用いて，ROCK阻害剤，ホスホジエステラーゼ阻害剤，ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ－β受容体阻害剤を種々組合わせて加えた培地中で培養できること，更には，該培養で得られたヒト角膜上皮細胞を，ヒト羊膜上で培養することにより，ヒト角膜上皮細胞シートを効率良く製造できることを見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を提供する。
（１）ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞の製造方法であって，
　細胞を通過させない微細孔を有する膜により第１の室と第２の室に仕切られた培養容器の，該第１の室に支持細胞を加え，該第２の室にヒト角膜上皮細胞を加えて，ROCK阻害剤及びホスホジエステラーゼ阻害剤を含有する第１の培地を用いて該ヒト角膜上皮細胞を培養し，次いで，ホスホジエステラーゼ阻害剤，ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ－β受容体阻害剤を含有する第２の培地を用いて該ヒト角膜上皮細胞を培養することを含む，製造方法。
（２）該培養容器が，該微細孔を有する膜により，上側の室と下側の室の，上下に２室に仕切られたものである，上記（１）に記載の製造方法。
（３）該下側の室が該第１の室であり，該上側の室が該第２の室であり，該ヒト角膜上皮細胞を，該微細孔を有する膜の上で培養するものである，上記（２）に記載の製造方法。
（４）ヒト角膜上皮細胞を，該細胞を通過させない微細孔を有する膜であって該培養容器内に支持されたものである膜の上で，該支持細胞と直接接触させることなく，培養するものである，上記（３）に記載の製造方法。
（５）該第１の培地に含有される該ROCK阻害剤がY27632であり，該第１及び該第２の培地に含有される該ホスホジエステラーゼ阻害剤が3-イソブチル-1-メチルキサンチンであり，該第２の培地に含有されるＭＡＰキナーゼ阻害剤がSB203580，若しくはSB239063，又はこれらの組合せから選択されるものであり，該第２の培地に含有されるＴＧＦ－β受容体阻害剤が，SB431542，LY364947，若しくはA83-01，又はこれらの組合せから選択されるものである，上記（１）～（４）の何れかに記載の製造方法。
（６）該第１の培地に含有される該ROCK阻害剤がY27632であり，該第１及び該第２の培地に含有される該ホスホジエステラーゼ阻害剤が3-イソブチル-1-メチルキサンチンであり，該第２の培地に含有されるＭＡＰキナーゼ阻害剤がSB203580であり，該第２の培地に含有されるＴＧＦ－β受容体阻害剤が，SB431542である，上記（１）～（４）のいずれかに記載の製造方法。
（７）該第１の培地に含有されるY27632の濃度が1～20μMであり，該第１及び該第２の培地に含有される3-イソブチル-1-メチルキサンチンの濃度が50～150μMであり，該第２の培地に含有されるSB203580の濃度が0.2～2μMであり，SB431542の濃度が0.2～2μMである，上記（６）に記載の製造方法。
（８）該第１の培地に含有されるY27632の濃度が約10μMであり，該第１及び該第２の培地に含有される3-イソブチル-1-メチルキサンチンの濃度が約100μMであり，該第２の培地に含有されるSB203580の濃度が約1μMであり，SB431542の濃度が約1μMである，上記（６）に記載の製造方法。
（９）該支持細胞が，ヒト間葉系幹細胞である，上記（１）～（８）の何れかに記載の製造方法。
（１０）上記（１）～（９）の何れかに記載の製造方法で得られた細胞を，細胞凍結液に懸濁して凍結し，凍結細胞とする工程を更に含む，製造方法。
（１１）上記（１）～（１０）の何れかに記載の製造方法で得られるヒト角膜上皮細胞に由来する細胞。
（１２）上記（１０）に記載の製造方法で得られる凍結されたヒト角膜上皮細胞に由来する細胞。
（１３）ヒト角膜上皮シートの製造方法であって，
　上記（１１）に記載のヒト角膜上皮細胞に由来する細胞にあってはその解凍後に，上記（１１）又は（１２）に記載のヒト角膜上皮細胞に由来する細胞を，支持細胞を含んだ培養容器中で，該支持細胞を通過させない微細孔を有する膜であって該培養容器内に支持されたものである膜の上に置かれた基質羊膜上で，ROCK阻害剤を含有する第３の培地を用いて培養し，次いで，ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ－β受容体阻害剤を含有する第４の培地を用いて培養して，該基質羊膜上で該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞からなる細胞層を形成させるステップと，次いで，該細胞層の表面の全部又は一部が培地に覆われない状態で，該第４の培地を用いて培養するステップとを含む，製造方法。
（１４）該基質羊膜が，羊膜上皮を剥離した側を上に向けて該培養容器中に置かれるものである，上記（１３）に記載の製造方法。
（１５）該第３の培地に含有される該ROCK阻害剤がY27632であり，該第４の培地に含有されるＭＡＰキナーゼ阻害剤がSB203580であり，該第４の培地に含有されるＴＧＦ－β受容体阻害剤がSB431542である，上記（１３）又は（１４）に記載の製造方法。
（１６）該第３の培地に含有されるY27632の濃度が1～20μMであり，該第４の培地に含有されるSB203580の濃度が0.2～2μMであり，該第４の培地に含有されるSB431542の濃度が0.2～2μMである，上記（１５）に記載の製造方法。
（１７）該第３の培地に含有されるY27632の濃度が約10μMであり，該第４の培地に含有されるSB203580の濃度が約1μMであり，SB431542の濃度が約1μMである，上記（１５）に記載の製造方法。
（１８）該支持細胞が，ヒト間葉系幹細胞である，上記（１３）～（１７）の何れかに記載の製造方法。
（１９）上記（１３）～（１８）の何れかに記載の製造方法で得られる，該基質羊膜と該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞とからなるヒト角膜上皮シート。
（２０）該基質羊膜の羊膜上皮を剥離した側の面積の95％以上が，該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞により形成された細胞層で覆われているものである，上記（１９）に記載のヒト角膜上皮シート。
（２１）該細胞層の90％以上が二層以上の細胞層からなる重層構造を有する，上記（２０）に記載のヒト角膜上皮シート。
（２２）該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞の98％以上がサイトケラチンAE1/AE3陽性であり，80％以上がサイトケラチン12陽性である，上記（１９）～（２１）に記載の何れかのヒト角膜上皮シート。
（２３）該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞の99％以上がサイトケラチンAE1/AE3陽性であり，85％以上がサイトケラチン12陽性である，上記（１９）～（２１）に記載の何れかのヒト角膜上皮シート。
（２４）角膜疾患の治療用の上記（１９）～（２３）に記載のヒト角膜上皮シート。
（２５）該角膜疾患が，角膜上皮のバリアー機能が不可逆的に損なわれる疾患である，上記（２４）に記載のヒト角膜上皮シート。
（２６）該角膜疾患が，角膜ジストロフィー，スティーブンス・ジョンソン症候群，化学外傷及び角膜上皮幹細胞疲弊症からなる群から選択されるものである，上記（２４）に記載のヒト角膜上皮シート。
（２７）基質羊膜の表面の99.5％以上が，ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞により形成された細胞層で覆われているものであり，該細胞の98％以上がサイトケラチンAE1/AE3陽性であり，該細胞の80％以上がサイトケラチン12陽性であり，該細胞層の95％以上が四層以上の細胞層からなる重層構造を有し，該細胞層の表面の90％以上が扁平な細胞で覆われており，該細胞層内における線維芽細胞の比率が0.1％未満である，ヒト角膜上皮シート。
　本発明によれば，再発性の角膜ジストロフィー等の角膜疾患の患者に移植し得る，品質の安定したヒト角膜上皮シートを，安定して供給することができるので，角膜上皮移植のドナー不足を解消し得る。
HE染色したヒト角膜上皮シートの表面の拡大図である（観察倍率100倍）。 HE染色したヒト角膜上皮シートの断面の拡大図である（観察倍率200倍）。Ａは表層の扁平な細胞，Ｂはヒト角膜上皮細胞に由来する細胞から形成された細胞層，Ｃは基質羊膜をそれぞれ示す。 （１）サイトケラチンAE1/AE3陽性細胞をFACSで検出した図を示す。縦軸は細胞数，横軸はAlexa Fluor（登録商標） 488色素に由来する蛍光強度を示す。（Ａ）はコントール，（Ｂ）は抗サイトケラチンAE1/AE3抗体で染色した細胞の蛍光強度をそれぞれ示す。（２）サイトケラチン12陽性細胞をFACSで検出した図を示す。縦軸は細胞数，横軸はAlexa Fluor（登録商標） 647色素に由来する蛍光強度を示す。（Ｃ）はコントール，（Ｄ）は抗サイトケラチン12抗体で染色した細胞の蛍光強度をそれぞれ示す。 実施例におけるヒト角膜上皮細胞の初代培養（P0培養）における培養容器のセッティングを模式的に示す図。 別法によって得たヒト角膜上皮由来細胞を用いて製造したヒト角膜上皮シートの表面をHE染色した拡大図である（観察倍率100倍）。 別法によって得たヒト角膜上皮由来細胞を用いて製造したヒト角膜上皮シートの断面をHE染色した拡大図である（観察倍率200倍）。Ａは表層の扁平な細胞，Ｂはヒト角膜上皮細胞に由来する細胞から形成された細胞層，Ｃは基質羊膜をそれぞれ示す。 ヒト角膜上皮細胞の培養時における，各種ＭＡＰキナーゼ阻害剤とＴＧＦ－β受容体阻害剤の組合せのヒト角膜上皮細胞の増殖促進効果を示す図。縦軸は，コントロール群（NA）の吸光度（OD450）を100%としたときの，各群の吸光度の相対値（%）を示す。エラーバーは標準偏差を示す。
　本発明におけるヒト角膜上皮細胞に由来する細胞の製造方法において，当該細胞を製造するために用いるヒト角膜上皮細胞は，ヒト角膜輪部又は，ヒト角膜上皮組織及び角膜輪部を含む組織切片を蛋白質分解酵素で処理して得られる。角膜輪部は，強膜から角膜へ移行する部分であり，角膜上皮細胞への分化能を有する幹細胞を含む。このときに用いられる蛋白質分解酵素は，好ましくは，ディスパーゼである。蛋白質分解酵素による処理は，好ましくは，まず組織切片をディスパーゼで処理し，組織切片の表面から細胞（又は細胞塊）を遊離させて懸濁液とする。このとき用いるディスパーゼ溶液は，好ましくは0.5～2.0 U/mLの濃度のディスパーゼを含有するPBS又は後述する初代培養基本培地である。
　また，ディスパーゼでの処理は，37℃で1時間振とう機で緩やかに振とうさせるか，又は4℃で12～18時間，細胞を静置して行われる。特に，ディスパーゼ溶液として0.5～2.0 U/mLの濃度のディスパーゼを含有する初代培養基本培地を用いる場合，ディスパーゼでの処理は，好ましくは4℃で12～18時間静置した後37℃で40～80分間，より好ましくは4℃で14～16時間静置した後37℃で50～70分間，更に好ましくは4℃で15～20時間静置した後37℃で60分間細胞を静置して行われる。また，このときの初代培養基本培地としてはCnT-20（CELLEnTEC社）が好適に用いられる。
　本発明において，上記蛋白質分解酵素による処理で得られたヒト角膜上皮細胞は，細胞を通過をさせない微細孔を有する膜（支持膜）により第１の室と第２の室に仕切られた培養容器であって，該第１の室に支持細胞を加えた培養容器の，該第２の室において， ROCK阻害剤を含有する第１の培地を用いて培養され，次いで，ホスホジエステラーゼ阻害剤，ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ－β受容体阻害剤を含有する第２の培地を用いて培養される。本発明において，この一連の培養を，ヒト角膜上皮細胞の初代培養（P0培養）という。
　本発明の一実施形態において，上記蛋白質分解酵素による処理で得られたヒト角膜上皮細胞は，好ましくは，支持細胞を含んだ培養容器中で，細胞を通過させない微細孔を有する膜（支持膜）であって下側面が該支持細胞と接触しないように該培養容器内に支持されたものである膜の上で，該支持細胞と直接接触させることなく，ROCK阻害剤を含有する第１の培地を用いて培養され，次いで，ホスホジエステラーゼ阻害剤，ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ－β受容体阻害剤を含有する第２の培地を用いて培養される。上記と同様に，この一連の培養を，ヒト角膜上皮細胞の初代培養（P0培養）という。
　本発明において，ヒト角膜上皮細胞及び支持細胞を培養するために用いられる培養容器は，哺乳動物細胞を培養できるものである限り特に制限はないが，細胞を固着させて培養できるものが好ましい。培養容器は，後に詳述する細胞を通過させない微細孔を有する膜により，第１の室と第２の室に仕切られる。当該膜は，細胞を通過させることがないので，培養容器中で，ヒト角膜上皮細胞と支持細胞が直接接触することはなく，これらの細胞が混じり合うことはない。当該膜は，培養容器の形状が平底のものである場合，平底の底面に垂直に設けてもよく，また，水平に設けてもよい。当該膜が平底の底面に垂直に設けられた場合，ヒト角膜上皮細胞と支持細胞は，共に培養容器の底面上で培養される。当該膜が平底の底面に水平に設けられた場合，ヒト角膜上皮細胞と支持細胞は，何れか一方が培養容器の底面上で，他の一方が当該膜上で培養される。
培養容器の形状が平底の培養容器としては，例えば，市販のセルカルチャープレート（２４ウェルプレート，１２ウェルプレート，６ウェルプレート等）がある。また，培養容器の底面は，細胞が固着し易いように，フィブロネクチン，コラーゲン（コラーゲンI型，IV型等），ラミニン等の細胞接着性糖タンパク質，又はこれら細胞接着性糖タンパク質の細胞接着活性部位（ＲＧＤ配列）を含むペプチドでコーティングされていることが好ましい。支持細胞として用いられるＮＩＨ３Ｔ３細胞又はヒト間葉系幹細胞をこのような培養容器上で培養すると，支持細胞は，当該容器の底面に固着する。
上述したとおり培養容器の内部は，微細孔を有し且つ支持細胞を通過させない膜（支持膜）が取り付けられ，この膜により２室に仕切られている。好ましい態様では，この膜は，培養容器の内部に，培養容器の底面と概ね水平に，その下側に支持細胞の培養スペースを確保でき且つその下側面が支持細胞と接触しないように取り付けられる。支持膜の材質としては，ポリエチレンテレフタレート及びポリカーボネートが好適であり，ポリエチレンテレフタレートが特に好適である。この膜が有する微細孔は，支持細胞の（及び更にヒト角膜上皮細胞の）通過は阻止するが，培地に溶質として含まれる液性成分は通過することができる孔径のものである。微細孔の孔径は，好ましくは，0.1～1.5μｍ，より好ましくは0.2～1.2μｍ，更に好ましくは0.4～1.0μｍである。支持細胞は（及びヒト角膜上皮細胞も）これらの孔径を大きく超えるサイズであるため，浮遊するものがあっても支持膜を通過できないが，培地，及び支持細胞から分泌される成長因子等の液性成分は，支持膜を通過できる。従って，培養容器中で角膜上皮細胞と支持細胞が直接接触することはない。また，支持膜は，予めフィブロネクチン，コラーゲン（コラーゲンI型，IV型等），ラミニン等の細胞接着性糖タンパク質，又はこれら細胞接着性糖タンパク質の細胞接着活性部位（ＲＧＤ配列）を含むペプチドでコーティングされていることが好ましい。
実施例に則して，本発明におけるヒト角膜上皮細胞の初代培養における培養容器のセッティングの一例を模式的に図４に示した。図４において，培養容器（６ウェルコンパニオンプレート）は，微細孔を有する膜により，下側の室(第１の室)と上側の室(第２の室)の，上下に仕切られている。第１の室には支持細胞としてヒト間葉系幹細胞が加えられ，第２の室にはヒト角膜上皮細胞が加えられ，ヒト間葉系幹細胞は第１の室中で培養容器の底面で培養され，ヒト角膜上皮細胞は第２の室中で微細孔を有する膜上で培養されている。細胞は，微細孔を有する膜を通過できないが，培地，及び支持細胞から分泌される成長因子等の液性成分は，微細孔を通過することができる。
　本発明において，支持細胞というときは，ヒト角膜上皮細胞（又はヒト角膜上皮細胞に由来する細胞）の初代培養又は角膜上皮シートの製造の際に，ヒト角膜上皮細胞（又はヒト角膜上皮細胞に由来する細胞）の増殖を促進するために用いられる細胞のことをいう。支持細胞は，培地中に不足する栄養分や特殊な成長因子を補給等することにより，細胞の増殖を促進する機能を有する。支持細胞として使用できる細胞としては，ヒト角膜上皮細胞（又はヒト角膜上皮細胞に由来する細胞）の増殖を促進できるものである限り，特に制限はないが，ＮＩＨ３Ｔ３細胞，ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞，Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３，間葉系幹細胞等が好適であり，間葉系幹細胞が特に好適である。支持細胞は，異種蛋白質の混入を防止する観点から，ヒト由来の細胞がより好ましい。
　なお，本発明において，間葉系幹細胞（MSC）というときは，未分化の状態で増殖し，少なくとも2種類の細胞へ分化することが可能な，間葉に由来する幹細胞又はその前駆細胞のことをいう。間葉系幹細胞から分化誘導される細胞は，例えば骨芽細胞，軟骨芽細胞，脂肪芽細胞である。
MSCは，骨髄，脂肪組織，歯髄，臍帯血，胎盤，羊膜等，種々の組織から取得できることが知られている。本発明において使用するMSCは，これら取得先の組織に関わらず，いずれのものでも使用できるが，好ましくは，骨髄由来のMSCである。また，本発明において使用するMSCは, 好ましくはヒト間葉系幹細胞（hMSC）である。hMSCは，種々の方法により取得できるが，例えば骨髄由来のhMSCの場合，特許文献（特表平7-500001）等に記載の手法で取得することができる。
本発明において用いられるhMSCは，表面抗原の発現パターンにより更に特定することができ，特異的抗体を用いたフローサイトメトリー解析をした場合，好ましくは，CD29，CD44及びCD105が陽性であり，CD34及びCD45が陰性であり，より好ましくは，CD29，CD44，CD73，CD90及びCD105が陽性であり，CD34及びCD45が陰性であり，更に好ましくは，CD29，CD44，CD73，CD90，CD105及びCD166が陽性であり，CD34及びCD45が陰性であり，更により好ましくは，CD29，CD44，CD49a，CD49e，CD73，CD90，CD105及びCD166が陽性であり，CD34及びCD45が陰性である。
　ヒト角膜上皮細胞の初代培養は，好ましくは，支持膜上に上記の蛋白質分解酵素による処理で得られたヒト角膜上皮細胞を添加して，支持膜を挟んで上側にヒト角膜上皮細胞（又はヒト角膜上皮細胞に由来する細胞），下側に支持細胞（但し，膜とは非接触である）が存在する状態で行われる。培養時には，支持膜上に添加されたヒト角膜上皮細胞が培地に完全に覆われるように培地が容器に加えられる。この場合，支持細胞は培養容器の底面で培養され，ヒト角膜上皮細胞は微細孔を有する膜（支持膜）上で培養される。このとき，支持細胞のある支持膜の下側が培養容器の第１の室となり，ヒト角膜上皮細胞のある上側が培養容器の第２の室となる。培養中，支持細胞に由来する成長因子等の成分が，支持膜の微細孔を通して，支持膜の上側にも供給される。このとき，ヒト角膜上皮細胞は，支持膜上で支持膜の表面に固着して培養されることが好ましい。
　本発明において，ヒト角膜上皮細胞の初代培養は，支持膜を挟んで下側にヒト角膜上皮細胞（又はヒト角膜上皮細胞に由来する細胞），上側に支持細胞が存在する状態で行うこともできる。この場合，支持細胞は微細孔を有する膜上で培養され，ヒト角膜上皮細胞は培養容器の底面で培養される。このとき，ヒト角膜上皮細胞は，培養容器の底面に固着して培養されることが好ましい。またこのとき，支持細胞のある支持膜の上側が培養容器の第１の室となり，ヒト角膜上皮細胞のある下側が培養容器の第２の室となる。
　初代培養（P0培養）の開始時において，ヒト角膜上皮細胞は，培養容器の底面又は支持膜上で，好ましくは1X104～1X105個/cm2，より好ましくは4X104～6X104個/cm2，更に好ましくは約5X104個/cm2となるように培養容器中に加えられる。
本発明において，単に細胞というときは，広く哺乳動物細胞全般を包含するものを意味し，特に支持細胞及びヒト角膜上皮細胞（又はヒト角膜上皮細胞に由来する細胞）を合わせたものを意味する。
ヒト角膜上皮細胞の初代培養において，ヒト角膜上皮細胞は，ROCK阻害剤を含有する第１の培地を用いて培養し，次いで，ホスホジエステラーゼ阻害剤，ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ－β受容体阻害剤を含有する第２の培地を用いて培養される。初代培養における第１の培地，第２の培地とも，基本となる培地（初代培養基本培地）は，アミノ酸，ビタミン，無機塩類，及びその他の成分を含有する。初代培養基本培地に含まれるアミノ酸の種類及び濃度は，表１で示したものから適宜選択することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
初代培養基本培地に含まれるビタミンの種類及び濃度は，表２で示したものから適宜選択することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
初代培養基本培地に含まれる無機塩類の種類及び濃度は，表３で示したものから適宜選択することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示したものに加えて，培地には，適宜，亜セレン酸ナトリウム，モリブデン酸アンモニウム，塩化マンガン，硫酸ニッケル，塩化スズ，ケイ酸ナトリウム等の無機塩類を添加することができる。培地に亜セレン酸ナトリウム[Na2SeO3］を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.003～0.02mg/Lであり，より好ましくは約0.005mg/Lである。培地にモリブデン酸アンモニウム[(NH4)6Mo7O24・4H2O]を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.0005～0.002mg/Lであり，より好ましくは約0.001mg/Lである。培地に塩化マンガン[MnCl2・4H2O]を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.0001～0.0004mg/Lであり，より好ましくは約0.0002mg/Lである。培地に硫酸ニッケル[NiSO4・6H2O]を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.0001～0.0005mg/Lであり，より好ましくは約0.0003mg/Lである。培地に塩化スズ[SnCl2・2H2O]を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.00005～0.0002 mg/Lであり，より好ましくは約0.0001mg/Lである。培地にケイ酸ナトリウム[Na2SiO3・9H2O] を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.0001～0.2mg/Lであり，より好ましくは約0.14 mg/Lである。
初代培養基本培地に含まれるその他の成分の種類及び濃度は，表４で示したものから適宜選択することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　初代培養基本培地には，上皮増殖因子（EGF），塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF），インスリン，トランスフェリン等の成長因子，アデニン，L-エタノールアミン，ヒドロコルチゾン，D,L-リポ酸，ピルビン酸ナトリウム，ホスホリルエタノールアミン，ヘパリン，アドレナリン等から選択されるその他の成分を，一種又はニ種以上，適宜添加することもできる。培地にEGFを添加する場合，その濃度は，好ましくは1～50ng/mLであり，より好ましくは5～40ng/mLである。培地にbFGFを添加する場合，その濃度は，好ましくは1～20ng/mLであり，より好ましくは3～7ng/mLである。培地にインスリンを添加する場合，その濃度は，好ましくは1～200μg/mLであり，より好ましくは2～100μg/mLである。トランスフェリンを添加する場合，その濃度は，好ましくは1～200μg/mLであり，より好ましくは2～20μg/mLである。培地にアデニンを添加する場合，その濃度は，好ましくは15～35mg/Lであり，より好ましくは20～30mg/Lである。培地にL-エタノールアミンを添加する場合，その濃度は，好ましくは2.5～4mg/Lであり，より好ましくは3～3.5mg/Lである。培地にヒドロコルチゾンを添加する場合，その濃度は，好ましくは0.1～1.0mg/Lであり，より好ましくは0.3～0.7mg/Lである。培地にD,L-リポ酸を添加する場合，その濃度は，好ましくは20～40mg/Lであり，より好ましくは25～30mg/Lである。培地にピルビン酸ナトリウムを添加する場合，その濃度は，好ましくは40～65mg/Lであり，より好ましくは50～60 mg/Lである。培地にホスホリルエタノールアミンを添加する場合，その濃度は，好ましくは0.02～0.12 mg/Lであり，より好ましくは0.05～0.10mg/Lである。培地にヘパリンを添加する場合，その濃度は，好ましくは１～570 IU/Lであり，培地にアドレナリンを添加する場合，その濃度は，好ましくは0.1～2μMである。
　初代培養基本培地として，ヒト角膜上皮継代用無血清培地であるCnT-20培地（CELLEnTEC社）を好適に使用することができる。また，初代培養基本培地は，特表2000-506374，特表2000-517188等の特許文献に開示された培地組成に基づいて，適宜作製することもできる。
　初代培養における第１の培地は，初代培養基本培地にROCK阻害剤及びホスホジエステラーゼ阻害剤を添加したものである。このとき初代培養基本培地に添加することのできるROCK阻害剤に特に限定はないが，下記の化学式（I）で示されるY27632を好適に用いることができ，その培地中における好適な濃度は，1～20μMであり，特に約10μMである。また，このとき初代培養基本培地に添加することのできるホスホジエステラーゼ阻害剤に特に限定はないが，3-イソブチル-1-メチルキサンチンが好適に用いられ，その培地中における好適な濃度は，50～150μMであり，特に約100μMである。また，２又はそれ以上のROCK阻害剤を組合わせて用いることもでき，２又はそれ以上のホスホジエステラーゼ阻害剤を組合わせて用いることもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （I）
　初代培養における第２の培地は，初代培養基本培地にホスホジエステラーゼ阻害剤，ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ－β受容体阻害剤を添加したものである。このとき初代培養基本培地に添加することのできるホスホジエステラーゼ阻害剤に特に限定はないが，3-イソブチル-1-メチルキサンチンが好適に用いられ，その培地中における好適な濃度は，50～150μMであり，特に約100μMである。また，２又はそれ以上のホスホジエステラーゼ阻害剤を組合わせて用いることもできる。
また，初代培養基本培地に添加することのできるＭＡＰキナーゼ阻害剤に特に限定はないが，下記の化学式（II）で示されるSB203580，又は下記の化学式（III）で示されるSB239063が好適に用いられる。SB203580を用いるとき，その培地中における好適な濃度は，0.2～2μMであり，特に約1.0μMである。また，２又はそれ以上のＭＡＰキナーゼ阻害剤を組合わせて用いることもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （II）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （III）
また，初代培養基本培地に添加することのできるＴＧＦ－β受容体阻害剤に特に限定はないが，下記の化学式（IＶ）で示されるSB431542，下記の化学式（Ｖ）で示されるLY364947，又は下記の化学式（ＶI）で示されるA83-01が好適に用いられ，特にSB431542又はLY364947が好適に用いられる。SB431542を用いるとき，その培地中における好適な濃度は，0.2～2μMであり，特に約1.0μMである。また，２又はそれ以上のＴＧＦ－β受容体阻害剤を組合わせて用いることもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （IＶ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （Ｖ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （ＶI）
本発明において，ヒト角膜上皮細胞を培養し増殖させて得られた細胞を，ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞（ヒト角膜上皮由来細胞）というが，便宜上，これを単にヒト角膜上皮細胞というときもある。ヒト角膜上皮細胞の初代培養は，ヒト角膜上皮由来細胞が，好ましくは支持膜表面の70%以上を占めるまで，より好ましくは85%以上を占めるまで，更に好ましくは90%以上を占めるまで行われる。ヒト角膜上皮細胞の初代培養で得られた細胞は，ヒト角膜上皮シートの製造に用いることができる。
　初代培養により得られたヒト角膜上皮由来細胞は，凍結して保存することができる。凍結に際しては，ヒト角膜上皮由来細胞を培養容器又は膜上でPBSを用いて洗浄し，次いで蛋白質分解酵素で処理して細胞を培養容器又は膜から剥離し，剥離させた細胞を細胞凍結保存液に懸濁して細胞懸濁液とする。この細胞懸濁液を液体窒素中で凍結状態で保存する。このとき用いられる蛋白質分解酵素は，好ましくはコラゲナーゼＡである。
　ヒト角膜上皮由来細胞の凍結保存に用いる細胞凍結保存液は，例えば，ジメチルスルホキシド（DMSO），ウシ胎児血清（FCS），天然高分子化合物又は有機合成高分子化合物，単糖又は二糖，及び緩衝液を含有する水溶液である。但し，天然高分子化合物又は有機合成高分子化合物は任意の成分であり，細胞の状態により，適宜添加される。細胞凍結保存液に含まれるDMSOの濃度は，好ましくは5～15%（v/v）である。細胞凍結保存液に含まれるウシ胎児血清の濃度は，好ましくは50～90%（v/v）である。細胞凍結保存液に含まれる天然高分子化合物は，好ましくはデキストラン，グリコーゲン，メチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースであり，その濃度は，好ましくは0.1～1.0%（v/v）である。細胞凍結保存液に含まれる有機合成高分子化合物は，好ましくはポリエチレングリコール，ポリビニルピロリドンであり，その濃度は，好ましくは1～10%（v/v）である。細胞凍結保存液に含まれる単糖は，好ましくはグルコースであり，その濃度は，好ましくは1～10%（w/v）である。細胞凍結保存液に含まれるニ糖は，好ましくはショ糖であり，その濃度は，好ましくは1～10%（w/v）である。緩衝液としては，炭酸緩衝液，リン酸緩衝液，HEPES等を好適に用いることができる。
好ましい細胞凍結保存液の組成として，例えば，75%（v/v）ウシ胎児血清，10%（v/v）DMSO，3%（w/v）グルコース，0.08%（w/v）炭酸水素ナトリウム，0.036%（w/v）HEPES，
0.1575%（w/v）RPMI1640粉末培地（粉末）を含有する水溶液が挙げられる。市販の細胞凍結保存液であるセルバンカー（日本全薬工業社），又はCnT-CRYO-50（CELLnTEC社）は，ヒト角膜上皮由来細胞の凍結保存に好適に用いることができる。
　また，ヒト角膜上皮由来細胞の細胞凍結液中における濃度は，好ましくは0.5X105～1.5X106個/mLであり，より好ましくは1X105～1X106個/mLである。
　本発明において，凍結して保存したヒト角膜上皮由来細胞は，解凍してヒト角膜上皮シートの製造に用いることができる。従って，ヒト角膜上皮由来細胞を凍結して大量に保存しておくことにより，ヒト角膜上皮シートを製造する際に，必要に応じてこれを解凍して使用することができるので，安定してヒト角膜上皮シートを供給することが可能となる。
　本発明において，ヒト角膜上皮シートの製造は，ヒト角膜上皮細胞の初代培養で得られた細胞（ヒト角膜上皮由来細胞）を，支持細胞を含んだ培養容器中で，該支持細胞を通過させない微細孔を有する膜であって下側面が該支持細胞と接触しないように該培養容器内に支持されたものである膜の上に置かれた基質羊膜上で，ROCK阻害剤を含有する第３の培地を用いて培養し，次いで，ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ－β受容体阻害剤を含有する第４の培地を用いて培養することにより行われる。
　ヒト角膜上皮シートの製造において，ヒト角膜上皮由来細胞は，上記手法により一旦凍結してから解凍して使用することができるだけでなく，凍結せずに使用することもできる。ヒト角膜上皮由来細胞を凍結せず使用するときは，初代培養終了後に細胞を支持膜上から蛋白質分解酵素で剥離し，これを培地に懸濁して使用する。このとき用いられる蛋白質分解酵素は，好ましくはコラゲナーゼＡである。
　本発明のヒト角膜上皮シートの製造において，ヒト角膜上皮由来細胞は，培養容器の内部に取り付けられた微細孔を有し且つ支持細胞の通過を阻止することができる膜（支持膜）の上に置かれた基質羊膜上で培養される。このとき用いる支持膜は，培養容器の内部に，培養容器の底面と概ね水平に，その下側に支持細胞の培養スペースを確保でき且つその下側面が支持細胞と接触しないように取り付けられる。支持膜の材質としては，ポリエチレンテレフタレート及びポリカーボネートが好適であり，ポリエチレンテレフタレートが特に好適である。支持膜が有する微細孔は，支持細胞の（及び更にヒト角膜上皮細胞の）通過は阻止するが，培地に溶質として含まれる液性成分は通過することができる孔径のものである。微細孔の孔径は，好ましくは，0.1～1.5μｍ，より好ましくは0.2～1.2μｍ，更に好ましくは0.4～1.0μｍである。支持細胞は（及びヒト角膜上皮細胞も）これらの孔径を大きく超えるサイズであるため，浮遊するものがあっても支持膜を通過できないが，培地，及び支持細胞から分泌される成長因子等の液性成分は，支持膜を通過する。また，支持膜は，予めフィブロネクチン，コラーゲン（コラーゲンI型，IV型等），ラミニン等でコートしておくことが好ましい。
　また，このとき用いる基質羊膜とは，羊膜から羊膜の上皮を剥離させたものである。この基質羊膜の上皮を剥離した側の面を上側にして支持膜の全体を覆うようにして広げ，乾燥させた後，支持膜に対して固定する。従って，基質羊膜は羊膜上皮を剥離した側を上に向けて，支持膜上に培養容器中に置かれる。このとき用いる羊膜は好ましくはヒト羊膜である。また，羊膜の乾燥は風乾等の手法で行うことができる。
　ヒト角膜上皮シートの製造において，ヒト角膜上皮由来細胞は，培地で懸濁させてから，好ましくは1X104～2X104個/cm2の密度となるように支持膜に固定された基質羊膜上に播種される。培養時には，基質羊膜上に添加されたヒト角膜上皮細胞が培地に完全に覆われるように培地が容器に加えられる。すなわち，当該膜を挟んで下側に支持細胞（但し，膜とは非接触である），上側に基質羊膜とヒト角膜上皮由来細胞が存在する状態で培養が行われる。培養中，支持細胞に由来する成長因子等の成分が，膜の微細孔を通して，膜の上側にも供給される。
　ヒト角膜上皮シートの製造において，基質羊膜上に播種されたヒト角膜上皮由来細胞の培養は，ROCK阻害剤及びホスホジエステラーゼ阻害剤を添加した第３の培地を用いて開始される。この第３の培地の基本となる培地（ヒト角膜上皮シート製造用基本培地）は，アミノ酸，ビタミン，無機塩類，及びその他の成分を含有する。ヒト角膜上皮シート製造用基本培地に含まれるアミノ酸の種類及び濃度は，表５で示したものから適宜選択することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
ヒト角膜上皮シート製造用基本培地に含まれるビタミンの種類及び濃度は，表６で示したものから適宜選択することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
ヒト角膜上皮シート製造用基本培に含まれる無機塩類の種類及び濃度は，表７で示したものから適宜選択することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表７に示したものに加えて，培地には，適宜，亜セレン酸ナトリウム，モリブデン酸アンモニウム，塩化マンガン，硫酸ニッケル，塩化スズ，ケイ酸ナトリウム等の無機塩類を添加することができる。培地に亜セレン酸ナトリウム[Na2SeO3］を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.003～0.02mg/Lであり，より好ましくは約0.005mg/Lである。培地にモリブデン酸アンモニウム[(NH4)6Mo7O24・4H2O]を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.0005～0.002mg/Lであり，より好ましくは約0.001mg/Lである。培地に塩化マンガン[MnCl2・4H2O]を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.0001～0.0004 mg/Lであり，より好ましくは約0.0002mg/Lである。培地に硫酸ニッケル[NiSO4・6H2O]を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.0001～0.0005mg/Lであり，より好ましくは約0.0003mg/Lである。培地に塩化スズ[SnCl2・2H2O]を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.00005～0.0002 mg/Lであり，より好ましくは約0.0001mg/Lである。培地にケイ酸ナトリウム[Na2SiO3・9H2O] を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.0001～0.2mg/Lであり，より好ましくは約0.14mg/Lである。
ヒト角膜上皮シート製造用基本培地に含まれるその他の成分の種類及び濃度は，表８で示したものから適宜選択することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　ヒト角膜上皮シート製造用基本培地は，好ましくはトランスフェリン，ヒドロコルチゾン，アドレナリン，インスリン，上皮増殖因子（EGF）等を更に含む。培地がトランスフェリンを含有する場合，その濃度は，好ましくは1～200μg/mLであり，より好ましくは3～5μg/mLである。培地がヒドロコルチゾンを含有する場合，その濃度は，好ましくは0.8～1.4 mg/Lであり，より好ましくは1.0～1.2mg/Lである。培地がアドレナリンを含有する場合，その濃度は，好ましくは0.1～2μMであり，より好ましくは0.5～0.8μMである。培地がインスリンを含有する場合，その濃度は，好ましくは1～200μg/mLであり，より好ましくは3～7μg/mLである。培地がEGFを含有する場合，その濃度は，好ましくは1～50ng/mLであり，より好ましくは5～40ng/mLである。
ヒト角膜上皮シート製造用基本培地には，塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）等の成長因子，アデニン，L-エタノールアミン，D,L-リポ酸，ピルビン酸ナトリウム，ホスホリルエタノールアミン，ヘパリン等から選択されるその他の成分を，一種又はニ種以上，適宜添加することもできる。培地にbFGFを添加する場合，その濃度は，好ましくは1～20ng/mLであり，より好ましくは3～7ng/mLである。培地にアデニンを添加する場合，その濃度は，好ましくは15～35mg/Lであり，より好ましくは20～30mg/Lである。培地にL-エタノールアミンを添加する場合，その濃度は，好ましくは2.5～4mg/Lであり，より好ましくは3～3.5 mg/Lである。培地にD,L-リポ酸を添加する場合，その濃度は，好ましくは20～40mg/Lであり，より好ましくは25～30mg/Lである。培地にピルビン酸ナトリウムを添加する場合，その濃度は，好ましくは40～65mg/Lであり，より好ましくは50～60mg/Lである。培地にホスホリルエタノールアミンを添加する場合，その濃度は，好ましくは0.02～0.12mg/Lであり，より好ましくは0.05～0.10mg/Lである。培地にヘパリンを添加する場合，その濃度は，好ましくは１～570 IU/Lである。
　ヒト角膜上皮シート製造用基本培地として，SHEM培地とKB培地とを，１：２の割合で混ぜた培地を好適に使用することができる。また，ヒト角膜上皮シート製造用基本培地には，ウシ胎児血清（FCS）を添加することもできる。培地にウシ胎児血清を添加する場合，その濃度は，好ましくは2～10%であり，より好ましくは4～6%である。
ヒト角膜上皮シートの製造において使用する第３の培地は，ヒト角膜上皮シート製造用基本培地にROCK阻害剤を添加したものである。このときヒト角膜上皮シート製造用基本培地に添加することのできるROCK阻害剤に特に限定はないが，Y27632を好適に用いることができ，その培地中における好適な濃度は，1～20μMであり，特に約10μMである。
ヒト角膜上皮シートの製造において，第３の培地を用いた培養における細胞の培養期間は，好ましくは2～4日間，より好ましくは2～3日間である。
第３の培地を用いた培養に引き続いて，ヒト角膜上皮由来細胞は，ヒト角膜上皮シート製造用基本培地にＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ－β受容体阻害剤を添加した第４の培地を用いて培養される。このときヒト角膜上皮シート製造用基本培地に添加することのできるＭＡＰキナーゼ阻害剤に特に限定はないが，SB203580が好適に用いられる。SB203580を用いるとき，その培地中における好適な濃度は，0.2～2μMであり，特に約1.0μMである。また，ヒト角膜上皮シート製造用基本培地に添加することのできるＴＧＦ－β受容体阻害剤に特に限定はないが，SB431542が好適に用いられる。SB431542を用いるとき，その培地中における好適な濃度は，0.2～2μMであり，特に約1.0μMである。
ヒト角膜上皮シートの製造における第４の培地を用いた培養における，細胞の培養期間は，好ましくは7～14日間である。この間，培養開始から4～6日間は2日毎に培地を交換し，次いで7～14日間は1日毎に培地を交換することが好ましい。最後に培地を交換した後，乳酸濃度を測定しながら，乳酸濃度が，好ましくは7～11mM，より好ましくは8～10mMとなった時点で培地を交換する。第３の培地及び第４の培地を用いた培養により，基質羊膜上で細胞が増殖し，ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞からなる細胞層が形成される。
　第４の培地を用いた培養に引き続いて，ヒト角膜上皮由来細胞は，基質羊膜の底面が浸る一方，基質羊膜上に形成されたヒト角膜上皮由来細胞に由来する細胞からなる細胞層の表面の全部又は一部が培地に覆われない状態（培養器中の気相に曝された状態）で，好ましくは2～5日，より好ましくは3日間培養される。このように培養細胞の表面を気相に暴露させて培養する方法を，一般にair-lifting培養という。air-lifting培養において使用できる培地は，ヒト角膜上皮シート製造用基本培地にＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ－β受容体阻害剤を添加した培地であり，第４の培地を好適に用いることができる。
air-lifting培養の間，培地は好ましくは10～24時間毎，より好ましくは12時間毎に交換される。このようにして，基質羊膜の表面上にヒト角膜上皮由来細胞からなる細胞層が形成されたヒト角膜上皮シートが得られる。
　本発明において，ヒト角膜上皮シートというときは，基質羊膜の羊膜上皮を剥離した側の面（基質羊膜の表面）がヒト角膜上皮由来細胞により形成された細胞層により覆われたシートのことをいう。本発明において，ヒト角膜上皮シートは，基質羊膜の表面の好ましくは95%以上，より好ましくは98%以上，更に好ましくは99.5%以上，更により好ましくは99.8%以上がヒト角膜上皮由来細胞からなる細胞層で覆われたものであり，また，ヒト角膜上皮由来細胞からなる細胞層の，好ましくは90%以上，更に好ましくは98%以上が，二層以上の細胞からなる重層構造を有するものである。また，ヒト角膜上皮由来細胞からなる細胞層の，好ましくは95%以上が，三層以上の細胞からなる重層構造を有するものである。また，ヒト角膜上皮由来細胞からなる細胞層の，好ましくは95%以上が，四層以上の細胞からなる重層構造を有するものである。
本発明において，ヒト角膜上皮シートは，ヒト角膜上皮由来細胞からなる細胞層の表面の好ましくは90%以上が，より好ましくは98%以上が扁平な細胞で覆われたものである。
本発明において，基質羊膜の表面に形成されたヒト角膜上皮由来細胞からなる細胞層内における，線維芽細胞の比率は，好ましくは0.1%未満であり，より好ましくは0.02%未満である。
　本発明において，ヒト角膜上皮シートを構成するヒト角膜上皮由来細胞は，好ましくは98%以上がサイトケラチンAE1/AE3陽性であり，80%以上がサイトケラチン12陽性であり，より好ましくは99%以上がサイトケラチンAE1/AE3陽性であり，85%以上がサイトケラチン12陽性である。
本発明において製造されたヒト角膜上皮シートは，角膜疾患の患者の治療用として，従来の角膜移植に替えて使用することができる。ヒト角膜上皮シートによる治療対象となる角膜疾患は，バリアー機能等の角膜上皮の機能が損なわれる疾患である限り特に限定はないが，特にバリアー機能等の角膜上皮の機能が不可逆的に損なわれる疾患であり，再発性の角膜ジストロフィー，スティーブンス・ジョンソン症候群，化学外傷及び角膜上皮幹細胞疲弊症等である。
　以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
〔支持細胞の調製〕
　凍結保存していたヒト間葉系幹細胞（hMSC）を，37℃恒温槽ですばやく解凍し，DMEM/10% FBS培地を添加して懸濁した後，遠心して細胞を沈殿させて回収した。回収した細胞をDMEM/10% FBS培地で懸濁し，生細胞数を測定した。15000～25000個/cm2の密度となるようにセルカルチャーインサートコンパニオンプレート 6ウェル（6ウェルコンパニオンプレート，BD Biosciences社）のボトムウェルに播種し，DMEM/10% FBS培地中で，5% CO2存在下，1～3日間37℃で培養した。hMSCをヒト角膜上皮細胞の初代培養（P0培養）における支持細胞として用いる直前にDMEM/10% FBS培地をボトムウェルから取り除き，角膜上皮細胞培養用培地（CELLEnTEC社）にSupplement A，Supplement B，Supplement C及び10μg/mLのゲンタマイシン（インビトロジェン社）を添加した培地（CnT-20培地）に10μMのY27632（ROCK阻害剤）（シグマ社）及び100μMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX，ホスホジエステラーゼ阻害剤）（シグマ社）を更に添加した培地をボトムウェルに1.5mL添加した。これを支持細胞添加6ウェルコンパニオンプレートとした。　　
〔ヒト角膜上皮細胞の初代培養（P0培養）〕
　研究用ヒト角膜組織（2眼分，SightLife社製）から，実体顕微鏡下で手術用メス及び角膜用ハサミを用いて強膜，結膜などを切り落とし，角膜上皮組織及び輪部を含む組織切片を切り出した。切り出した組織切片に，ディスパーゼ溶液（1.2U/mLのディスパーゼ（三光純薬）を含有するPBS（インビトロジェン社）を添加して，37℃で1時間振とう機で緩やかに振とうした。次いで，0.02% EDTAを含むPBSで酵素反応を停止した後，組織切片を35mmシャーレ（プライムサーフェス，住友ベークライト社）に移した後，実体顕微鏡観察下で，組織切片から無鉤摂子を用いてヒト角膜上皮細胞を掻把し，細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液をエッペンチューブ（プロテオフリー，住友ベークライト）に移した後遠心し，上清を除いた後のペレットにCnT-20培地を添加して再度遠心し，細胞を回収した。回収した細胞を10μMのY27632（ROCK阻害剤）（シグマ社）及び100μMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX，ホスホジエステラーゼ阻害剤）（シグマ社）を含有するCnT-20培地（実施例における第１の培地）6mLに懸濁させた。
　上記の支持細胞添加6ウェルコンパニオンプレートに，支持膜としてFNC Coating Mix（AthenaES社）でコーティングした6ウェルセルカルチャーインサート（孔径0.4μm，ポリエチレンテレフタレート製，BD Falcon Cell Culture Insert, BD Biosciences社）を静置し，次いで，この6ウェルセルカルチャーインサートの各ウェルに上記の回収したヒト角膜上皮細胞の懸濁液を0.5mLずつ（1眼から調製した細胞の1/12量）添加し，培養を開始した。培養開始3～5時間後に，6ウェルセルカルチャーインサートに10μMのY27632（ROCK阻害剤）（シグマ社）及び100μMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX，ホスホジエステラーゼ阻害剤）（シグマ社）を含有するCnT-20培地を0.5mL添加し，更に2～3日間培養した。次いで，培地を100μMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX，ホスホジエステラーゼ阻害剤）（シグマ社），1μMのSB203580（ＭＡＰキナーゼ阻害剤）（シグマ社）及び1μMのSB431542（ＴＧＦ－β受容体阻害剤）（シグマ社）を含むCnT-20培地（実施例における第２の培地）に交換し，2～3日毎に培地を交換しながら細胞を培養した。この間に，ボトムウェルの支持細胞が，顕著にボトムウェルから剥離する等の変化が認められた場合は，ボトムウェルの底面に支持細胞を固着させた6ウェルコンパニオンプレートを新たに準備し，これに6ウェルセルカルチャーインサートを移して培養を継続した。以下の工程も含め，細胞の培養は5% C02存在下，37℃で行った。ヒト角膜上皮細胞の初代培養における培養容器のセッティングを模式的に図４に示した。図４において，６ウェルコンパニオンプレート(培養容器)は，微細孔を有する膜により，下側の室(第１の室)と上側の室(第２の室)の，上下に仕切られている。第１の室には支持細胞としてヒト間葉系幹細胞が加えられ，第２の室にはヒト角膜上皮細胞が加えられている。ヒト間葉系幹細胞は第１の室中で培養容器の底面に固着し，ヒト角膜上皮細胞は第２の室中で微細孔を有する膜上で培養されている。
〔ヒト角膜上皮由来細胞の凍結保存〕
　上記ヒト角膜上皮細胞の初代培養において，6ウェルセルカルチャーインサート(支持膜)の表面の90～100%を細胞が占める状態となった時点で培地を交換し，更に約24時間培養した。次いで，培地を捨て，6ウェルセルカルチャーインサートに10μg/mLとなるようにゲンタマイシン（インビトロゲン社）を加えたPBS溶液（G-PBS）を添加して細胞を洗浄した後，再度G-PBSを添加して37℃で約15分間静置した。次いで，1mg/mLの濃度となるようにコラゲナーゼＡ（ロシュ社製）を添加し，37℃で1～2時間振とう機上で緩やかに振とうし，細胞を6ウェルセルカルチャーインサートから剥離させた。次いで，0.02% EDTAを含むPBSで酵素反応を停止した後，細胞を懸濁し，細胞懸濁液を遠沈管（ステムフル，住友ベークライト社）に移し，遠心して細胞を沈殿させて回収した。細胞をCnT-20培地で懸濁させて，生細胞数及び生存率を測定した後，再度遠心し，細胞を沈殿させて回収した。次いで，細胞の濃度が約1X105個/mLとなるように，セルバンカー１（日業本全薬工社）を添加して細胞を懸濁させた。細胞懸濁液をクライオチューブ（WHEATON社）に1mLずつ分注し，これを予め4℃に冷却した凍結処理容器（BICELL，日本フリーザー社）に収納したうえで，-80℃冷凍庫に1晩置いて凍結させた後，液体窒素中に移した。
〔ヒト角膜上皮シートの製造に用いる基質羊膜の準備〕
DMEM（Gibco社）と，滅菌したグリセリンとを1:1で混合した溶液に，10μg/mLとなるようにゲンタマイシンを加え，これを羊膜保存液とした。羊膜（再生医療支援機構）を安全キャビネット内のトレー上に置き，G-PBSに浸して，滅菌手袋を装着した状態で，指先で羊膜の絨毛膜を剥離し，医療用メスを用いて約2cmX2cmの正方形に切り分けた。正方形に切り分けた羊膜を羊膜保存液に入れ，-80℃で保存した。
　羊膜を解凍した後，10cmシャーレ上に移し，G-PBSで2回洗浄して羊膜保存液を除いた後，0.02% EDTA/PBSを添加し，37℃で2時間以上処理を行った。G-PBSで2回洗浄した後実体顕微鏡観察下で，セルスクレイパーを用いて羊膜の上皮を剥離させた。上皮を剥離させた羊膜（基質羊膜）は，G-PBS溶液に浸して4℃で保存した。
〔ヒト角膜上皮シートの製造〕
　凍結保存していたヒト間葉系幹細胞（hMSC）を，37℃恒温槽ですばやく解凍し，DMEM/10% FBS培地を添加して懸濁した後，遠心して細胞を沈殿させて回収した。回収した細胞をDMEM/10% FBS培地で懸濁し，生細胞数を測定した。1.5X104～2.5 X104個/cm2の細胞密度となるように6ウェルコンパニオンプレート（コーニング社）のボトムウェルに播種し，DMEM/10% FBS培地中で1～3日間培養した。hMSCをヒト角膜上皮シートの製造における支持細胞として用いる直前にDMEM/10% FBS培地中を取り除き，PBSで洗浄した後，10μMのY27632（ROCK阻害剤）（シグマ社）を含有するKB+SHEM培地を1.5mL加えた。これを支持細胞添加6ウェルコンパニオンプレートとした。KB+SHEM培地とは，下記に作製方法を示したKB培地とSHEM培地を2:1の割合で混合した培地を指す。KB培地は，正常ヒト角膜上皮細胞増殖用無血清液体培地（LIFELINE Cell Technology社）に付属の7種類の添加因子のうちウシ脳下垂体抽出液（BPE）を除く6種類の添加因子（0.2%(v/v) OcuFactor Lifefactor，5μg/mL トランスフェリン，0.18μg/mL ハイドロコルチゾン，1μM アドレナリン，6mM L-グルタミン，5.0μg/mL 組み換えヒトインスリン）を加え，更に10μg/mLの濃度となるようにゲンタマイシンを加えて作製した培地である。SHEM培地は，DMEM/F-12（Gibco社）に5μg/mLの組み換えヒトインスリン，10ng/mLの組み換えヒト EGF（Gibco社），10%のFBS（Hyclone社），更に10μg/mLの濃度となるようにゲンタマイシンを加えて作製した培地である。
上皮を剥離した羊膜（基質羊膜）を，6ウェルセルカルチャーインサート（トランズウェルクリアーTM，孔径3μm，ポリエステル製，コーニング社）に上皮を剥離した側が上になるように移し，実体顕微鏡下で無鉤摂子を用いて6ウェルセルカルチャーインサート全体を覆うように広げた。基質羊膜を数分間風乾させた後，Ｏリング（デュポン社）を6ウェルセルカルチャーインサートに挿入し，基質羊膜が6ウェルセルカルチャーインサート内で移動しないように固定し，実体顕微鏡により培養面に皺，気泡，微孔がないことを確認した後，これを支持細胞添加6ウェルコンパニオンプレート（ボトムウェル）に静置した。
次いで，上記凍結保存した角膜上皮由来細胞を37℃恒温槽ですばやく解凍し，KB+SHEM培地を添加して懸濁した後，遠心して細胞を沈殿させて回収した。回収した細胞を10μMのY27632（ROCK阻害剤）（シグマ社）を含有するKB+SHEM培地で懸濁し細胞懸濁液とし，生細胞数を測定した。
懸濁した角膜上皮由来細胞懸濁液を6ウェルセルカルチャーインサートに置いた基質羊膜上に生細胞数が1X104個/cm2以上になるように添加し，培養を開始した。このとき添加する細胞懸濁液の液量の上限は0.5mLとした。培養開始から3～5時間後に0.5mLの10μMのY27632を含むKB+SHEM培地（実施例における第３の培地）を6ウェルセルカルチャーインサートに更に添加し，2～3日間培養した。
次いで，6ウェルセルカルチャーインサート及びボトムウェルの培地を捨て，培地を1μMのSB203580（シグマ社）及び1μMのSB431542（シグマ社）を含むKB+SHEM培地（KB+SHEM培養用培地，実施例における第４の培地）に交換し，当該培地（KB+SHEM培養用培地）を2日毎に交換しながら細胞を4～6日間培養した。次いで，当該培地（KB+SHEM培養用培地）を１日毎に交換しながら細胞を7～14日間培養した。この間に，ボトムウェルの支持細胞が，顕著にボトムウェルから剥離する等の変化が認められた場合は，ボトムウェルの底面に支持細胞を固着させた6ウェルコンパニオンプレートを新たに準備し，これに6ウェルセルカルチャーインサートを移して培養を継続し，基質羊膜上で細胞を増殖させて，基質羊膜上にヒト角膜上皮細胞に由来する細胞からなる細胞層を形成させた。
最後に培地を交換した24時間経過後から培養上清中の乳酸濃度の測定を開始し，乳酸濃度が8～10mMを超えた時点を目安に6ウェルセルカルチャーインサート及びボトムウェルの培地を捨て，次いで，1.4mLの培地（KB+SHEM培養用培地）をボトムウェルに加え，6ウェルセルカルチャーインサート上に置いた基質羊膜の底面が培地に浸る一方，6ウェルセルカルチャーインサート内の基質羊膜上に形成されたヒト角膜上皮細胞に由来する細胞からなる細胞層の表面の全部又は一部が培地に覆われない状態（但し，細胞層の表面は乾燥させない状態），すなわち細胞層の表面の全部又は一部が培養器中の気相に曝された状態で，3日間培養した。この間，培地を約12時間毎に計5回交換した。このように細胞層の表面の全部又は一部が培地に覆われない状態で行う培養をair-lifting培養という。
培養終了後，6ウェルセルカルチャーインサート上に形成された，基質羊膜と基質羊膜上に形成されたヒト角膜上皮由来細胞の細胞層とからなるシートを，ヒト角膜上皮シートとして，HE染色及びFACS解析により，その品質評価を実施した。
〔ヒト角膜上皮シートの分割〕
　培養終了後のヒト角膜上皮シートを6ウェルセルカルチャーインサート上でKB+SHEM培養用培地で3回洗浄した後，生検トレパン及びスカルペルを用いて1/2シート，及び1/4シート2枚に分割した。
〔HE染色〕
分割後，1/2シートをスーパーフィックス（クラボウ）で10分間固定し，次いでスーパーフィックスを除いてPBSで3回洗浄した。次にマイヤーヘマトキリン溶液（和光純薬工業）で30分間染色し，マイヤーヘマトキリン溶液を除いた後，PBSで3回洗浄した。マイヤーヘマトキリン溶液により細胞核が染色されていることを確認した後，PBSで5倍希釈したエオシンY溶液（和光純薬工業）で10秒間染色し，次いでエオシンY溶液を除いてPBSで3回洗浄した。エオシンY溶液により細胞質が染色されていることを確認した後，スライドガラス上で細胞シートを支持膜から剥がし，PBSを用いてカバーガラスで封入したものを作成し，これを用いてヒト角膜上皮シートの表面を顕微鏡下で観察し，基質羊膜表面上に形成されたヒト角膜上皮由来細胞の細胞層（培養細胞層）の範囲及び線維芽細胞の存在の有無を顕微鏡下で観察した。
また，分割後の1/4シート1枚をTissue-Tek（登録商標） O.C.T.Compound（サクラファインテックジャパン）に包埋・薄切し，スライドガラスに切片を貼り付けた。切片を貼り付けたスライドガラスを，スーパーフィックス（クラボウ）を加えたスライド染色バットに10分間浸し，細胞を固定した後，水道水で10分間水洗した。次にマイヤーヘマトキリン溶液を加えたスライド染色バットに45秒間浸し，水道水で10分間水洗した。細胞核が染色されていることを確認した後，PBSで5倍希釈したエオシンY溶液（和光純薬工業）で10秒間染色し，水道水で10分間水洗した。エオシンY溶液により細胞質が染色されていることを確認した後，70，80，90，95%エタノールの順番でそれぞれのスライド染色バットに1～10秒間ずつ浸し，その後，キシレンの入った染色バットに10分間浸した。最後に，スライドガラスを取り出し，風乾した後，オイキット（O. Kindler GmbH社）を用いてカバーガラスで封入したものを作成し，これを用いてヒト角膜上皮シートの断面を顕微鏡下で観察し，重層化及び扁平な細胞の形成の程度を観察した。
〔HE染色の結果〕
　ヒト角膜上皮シートの表面を顕微鏡下で観察した結果，線維芽細胞の存在は全く認められなかった（図１）。顕微鏡視野内には，少なくとも1000個の細胞があったので，ヒト角膜上皮由来細胞中の線維芽細胞の比率は0.1%未満であった。また，顕微鏡視野内において，基質羊膜の表面の全面積の98%以上が培養細胞層に覆われており，且つ，培養細胞層の90%以上が二層以上の重層構造を形成していることがわかった（図１）。
　次いで，ヒト角膜上皮シートの断面を顕微鏡下で観察した結果，シート断面の95%以上が培養細胞層を有しており，且つ培養細胞層の90%以上が二層以上の重層構造を形成していることがわかった（Ｂ，図２）。また，重層構造の大部分は，3～4層の重層構造であった。また，培養細胞層の表面の90%以上が扁平な細胞（Ａ，図２）で覆われていることがわかった。この扁平な細胞を含めた培養細胞層の構造は，バリアー機能を有する非角化重層扁平上皮からなる角膜上皮組織と近似の形態を示した。
〔FACS解析〕
リン酸緩衝液生理食塩水 pH 7.4, contains BSA, powder（シグマ社）を純水に溶解し，0.22μmフィルターに通して，2% BSA（0.138M塩化ナトリウム，0.0027M塩化カリウム，2%(w/v)ウシ血清アルブミンを含有する0.01Mリン酸緩衝生理食塩水（pH 7.4））を調製した。調製した2% BSAにTriton X-100（和光純薬工業）を0.1%の濃度になるように加え，これをBSA-Tとした。
抗体希釈液を以下のとおり調製した。485μLのBSA-TにマウスIgG抗体溶液（DAKO）を10μLとウサギIgG抗体溶液（DAKO）を5μL加え，これをアイソタイプコントロロール用1次抗体希釈液とした。また，486μLのBSA-Tにマウス抗サイトケラチンAE1/AE3抗体溶液（DAKO）を10μL加えて，これをサイトケラチンAE1AE3検出用1次抗体希釈液とした。また，486μLのBSA-Tにウサギ抗サイトケラチン12抗体溶液（TransGenic）を4μL加えて，これをサイトケラチンAE1AE3検出用1次抗体希釈液とした。また，998μLのBSA-TにAlexa Fluor（登録商標）488-標識-ヤギ抗マウスIgG抗体溶液（ライフテクノロジーズジャパン）を2μL加えてサイトケラチンAE1AE3検出用2次抗体希釈液とした。また，998μLのBSA-TにAlexa Fluor（登録商標）647-標識-ヤギ抗ウサギIgG抗体溶液（ライフテクノロジーズジャパン）を2μL加えてサイトケラチン12検出用2次抗体希釈液とした。
上記ヒト角膜上皮シートの分割で得た1/4シート1枚からインサートメンブレンを取り除き，培養細胞層及び基質羊膜を0.25%トリプシン溶液（ライフテクノロジーズジャパン）で10分間，37℃でインキュベートした後，培地（KB+SHEM培養用培地）を加え，ピペッティングにより培養細胞層を形成する細胞のみを回収した。回収した細胞を遠沈管に移し，遠心して細胞を沈殿させ，上清を除去した。次いで細胞を，4℃に冷却した1mLのメタノール（和光純薬工業）で懸濁し，冷凍庫内（-20℃）で10分間固定した。固定後，遠心して細胞を沈殿させ，メタノールを除去した。次いで1mL のBSA-Tを加えて懸濁した後，遠心して細胞を沈殿させ，BSA-Tを除去した。この洗浄作業を2回繰り返した。
次いで細胞を4mLのBSA-Tで懸濁した後，1mLずつ4本のチューブに分け，遠心して細胞を沈殿させ，BSA-Tを除去した。この4本のチューブのうち，2本をアイソタイプコントロール用チューブ，1本をサイトケラチンAE1AE3検出用チューブ，1本をサイトケラチン12検出用チューブとし，各チューブにアイソタイプコントロール用1次抗体希釈液，サイトケラチンAE1AE3検出用1次抗体希釈液及びサイトケラチン12検出用1次抗体希釈液をそれぞれ500μLずつ加え懸濁し，室温で30分間反応させた。1次抗体反応後，遠心して細胞を沈殿させ，各1次抗体希釈液を除去した。次いで，1mLのBSA-Tを加えて細胞を懸濁した後，遠心して細胞を沈殿させ，BSA-Tを除去した。この洗浄作業を3回繰り返した。次いで，サイトケラチンAE1AE3検出用チューブにサイトケラチンAE1AE3検出用2次抗体希釈液，サイトケラチン12検出用チューブにサイトケラチン12検出用2次抗体希釈液を，それぞれ500μLずつ加えて懸濁し，室温で30分間反応させた（遮光）。また，2本の各アイソタイプコントロール用チューブにサイトケラチンAE1AE3検出用2次抗体希釈液とサイトケラチン12検出用2次抗体希釈液を500μLずつそれぞれ加えて懸濁し，それぞれサイトケラチンAE1AE3検出用コントールチューブ及びサイトケラチン12検出用コントールチューブとし，室温で30分間反応させた（遮光）。2次抗体反応後，遠心して細胞を沈殿させ，2次抗体希釈液を除去した。次いで1mLのBSA-Tを加えて細胞を懸濁した後，遠心して細胞を沈殿させ，BSA-Tを除去した。この洗浄作業を3回繰り返した。最後にPropidium iodide solution（シグマアルドリッチ）をBSA-Tで500倍希釈した溶液500μLを各チューブに加え懸濁した。
サイトケラチンAE1AE3検出用チューブとサイトケラチンAE1AE3検出用コントールチューブの細胞懸濁液をセルストレーナーに通し，BD FACS Canto（登録商標）（BD社）を用いて両者のAlexa Fluor 488色素に由来する蛍光強度を比較することにより，サイトケラチンAE1AE3陽性細胞の比率を測定した。また，サイトケラチン12検出用チューブとサイトケラチン12検出用コントールチューブの細胞懸濁液をセルストレーナーに通し，BD FACS Canto（登録商標）（BD社）を用いて両者のAlexa Fluor 647色素に由来する蛍光強度を比較することにより，サイトケラチン12陽性細胞の比率を計測した。
〔FACS解析の結果〕
　FACS解析の結果，基質羊膜上の培養細胞層を形成する細胞のほぼ全て（99.99%以上）が，サイトケラチンAE1/AE3陽性であり（図３－１），87%以上の細胞がサイトケラチン12陽性であることがわかった（図３－２）。
〔細胞シートの品質評価の結果〕
HE染色及びFACS解析の結果から，上記手法により製造したヒト角膜上皮シートは，線維芽細胞の存在が認められず，且つ，バリアー機能を担う非角化重層扁平上皮からなる角膜上皮組織と類似の形態を示すことから，移植用の角膜上皮シートとして適したものであることがわかった。
〔ヒト角膜上皮細胞の初代培養（P0培養）別法〕
ヒト角膜上皮細胞の初代培養（P0培養）を，上記記載の方法に代えて，以下の方法(別法を採して実施した。研究用ヒト角膜組織（2眼分，SightLife社製, 組織保存液としてCnT-20培地が使用されたもの）から，実体顕微鏡下で手術用メス及び角膜用ハサミを用いて強膜，結膜などを切り落とし，角膜上皮組織及び輪部を含む組織切片を切り出した。切り出した組織切片に，ディスパーゼ溶液（1.2U/mLのディスパーゼ（三光純薬）を含有するCnT-20培地（CELLEnTEC社）を添加して，4℃で15～20時間静置した。次いで，37℃で1時間静置した後に0.02% EDTAを含むPBSで酵素反応を停止した後，組織切片を３５mmシャーレ（プライムサーフェス，住友ベークライト社）に移した後，実体顕微鏡観察下で，組織切片から無鉤摂子を用いてヒト角膜上皮細胞を掻把し，細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液をエッペンチューブ（プロテオフリー，住友ベークライト）に移した後遠心し，上清を除いた後のペレットにCnT-20培地を添加して再度遠心し，細胞を回収した。回収した細胞を10μMのY27632（ROCK阻害剤）（シグマ社）及び100μMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX，ホスホジエステラーゼ阻害剤）（シグマ社）を含有するCnT-20培地（実施例における第１の培地）1mLに懸濁させた。細胞懸濁液の一部を分取し，Trypan Blue Stain（Life Technologies社）で10倍希釈して細胞を染色して細胞数を計測した後に，細胞懸濁液にCnT-20培地を加えて細胞濃度が2X105個/mLとなるように調整した。
　上記の支持細胞添加6ウェルコンパニオンプレートに，FNC Coating Mix（AthenaES社）でコーティングした6ウェルセルカルチャーインサート（孔径0.4μm，培養面積約4.2cm2，ポリエチレンテレフタレート製，BD Falcon Cell Culture Insert, BD Biosciences社）を静置し，次いで，この6ウェルセルカルチャーインサートの各ウェルに上記の回収したヒト角膜上皮細胞の懸濁液を1.05mLずつ（1ウェルあたり2X105個）添加し，培養を開始した。培養開始3～5時間後に，6ウェルセルカルチャーインサートに10μMのY27632（ROCK阻害剤）（シグマ社）及び100μMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX，ホスホジエステラーゼ阻害剤）（シグマ社）を含有するCnT-20培地を0.5mL添加し，更に2～3日間培養した。次いで，培地を100μMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX，ホスホジエステラーゼ阻害剤）（シグマ社），1μMのSB203580（ＭＡＰキナーゼ阻害剤）（シグマ社）及び1μMのSB431542（ＴＧＦ－β受容体阻害剤）（シグマ社）を含むCnT-20培地（実施例における第２の培地）に交換し，2～3日毎に培地を交換しながら細胞を培養した。この間に，ボトムウェルの支持細胞が，顕著にボトムウェルから剥離する等の変化が認められた場合は，ボトムウェルの底面に支持細胞を固着させた6ウェルコンパニオンプレートを新たに準備し，これに6ウェルセルカルチャーインサートを移して培養を継続した。以下の工程も含め，細胞の培養は5% C02存在下，37℃で行った。ヒト角膜上皮細胞の初代培養における培養容器のセッティングを模式的に図４に示した。図４において，６ウェルコンパニオンプレート(培養容器)は，微細孔を有する膜により，下側の室(第１の室)と上側の室(第２の室)の，上下に仕切られている。第１の室には支持細胞としてヒト間葉系幹細胞が加えられ，第２の室にはヒト角膜上皮細胞が加えられている。ヒト間葉系幹細胞は第１の室中で培養容器の底面に固着し，ヒト角膜上皮細胞は第２の室中で微細孔を有する膜上で培養されている。
　　上記別法によって得たヒト角膜上皮由来細胞を用いて，上記手法により製造したヒト角膜上皮シートをHE染色して，その表面を顕微鏡下で観察した結果，線維芽細胞の存在は全く認められなかった（図５）。顕微鏡視野内には，少なくとも1000個の細胞があったので，ヒト角膜上皮由来細胞中の線維芽細胞の比率は0.1%未満であった。また，顕微鏡視野内において，基質羊膜の表面の全面積の99.5%以上が培養細胞層に覆われており，且つ，培養細胞層の95%以上が四層以上の重層構造を形成していることがわかった（Ｂ，図６）。また，培養細胞層の表面の90%以上が扁平な細胞（Ａ，図６）で覆われていることがわかった。この扁平な細胞を含めた培養細胞層の構造は，バリアー機能を有する非角化重層扁平上皮からなる角膜上皮組織と近似の形態を示した。
〔ヒト角膜上皮細胞の培養時におけるＭＡＰキナーゼ阻害剤とＴＧＦ－β受容体阻害剤の組合せのヒト角膜上皮細胞の増殖促進効果の検討〕
上記凍結保存した角膜上皮由来細胞を37℃恒温槽ですばやく解凍し， CnT-20培地を添加して懸濁した後，遠心して細胞を沈殿させて回収した。回収した細胞をCnT-20培地で懸濁し細胞懸濁液とし，生細胞数を測定した。次いで，懸濁した角膜上皮由来細胞懸濁液を，FNC Coating Mix（AthenaES社）でコーティングした96ウェルプレートに生細胞数が3500個/ウェルになるように添加した。次いで，これらのウェルに表９に示す(1)～(6)群の組合せ及び濃度で，ＭＡＰキナーゼ阻害剤とＴＧＦ－β受容体阻害剤とを培地に添加した。すなわち，各群におけるＭＡＰキナーゼ阻害剤とＴＧＦ－β受容体阻害剤の組合せ及び培地中における濃度は，(1) SB203580（1μM）+ SB431542（1μM），(2) SB203580（1μM）+ A83-01（10μM），(3) SB203580（1μM）+ LY364947（10μM），(4) SB239063（10μM）+ SB431542（1μM），(5) SB239063（10μM）+ A83-01（10μM），(6) SB239063（10μM）+ LY364947（10μM）とした。また，ＭＡＰキナーゼ阻害剤とＴＧＦ－β受容体阻害剤を培地に添加しないものをコントロール（NA）とした。培養開始から5日後に水溶性テトラゾリウム塩WST-8を発色試薬として含有するCell Counting Kit-8(CCK-8)溶液を培地に10μL添加し，1時間後にプレートリーダーで波長450nmでの吸光度（OD450）を測定した。測定は，各組合せとも4ウェルで実施し，コントロールの測定値の平均値を100%として，コントロールとの比較で各群の測定値を求めた。なお，生細胞数は，こうして求められる吸光度とほぼ比例関係にあることが知られている。
　その結果，コントロール（NA）と比較して(1)～(6)の全ての群で測定値が100%を超え，ＭＡＰキナーゼ阻害剤とＴＧＦ－β受容体阻害剤を組合わせて培地に添加することにより，ヒト角膜上皮細胞の増殖が促進されることが示された（図７)。また，(1) SB203580（1μM）+ SB431542（1μM），(3) SB203580（1μM）+ LY364947（10μM），(4) SB239063（10μM）+ SB431542（1μM），及び(6) SB239063（10μM）+ LY364947（10μM）の各群では，測定値が120%を超え，これらのＭＡＰキナーゼ阻害剤とＴＧＦ－β受容体阻害剤の組合せが，特にヒト角膜上皮細胞の増殖を促進することが示された（図７)。また，(1) 群のSB203580（1μM）+ SB431542（1μM）では，測定値が約130%であり，(4) 群のSB239063（10μM）+ SB431542（1μM）では，測定値が140%を超えたことから，これらの組合せが，更に特にヒト角膜上皮細胞の増殖を促進することが示された（図７)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　本発明によれば，再発性の角膜ジストロフィー等の角膜疾患の患者に移植し得る，品質の安定したヒト角膜上皮シートを，安定して供給することができる。
１．６ウェルセルカルチャーインサート
２．６ウェルコンパニオンプレート(培養容器)
３．微細孔を有する膜
４．ヒト角膜上皮細胞
５．支持細胞（ヒト間葉系幹細胞）
６．第１の室
７．第２の室
８．ボトムウェル
 
 
 
 

Claims (27)

  1. 　ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞の製造方法であって，
    　細胞を通過させない微細孔を有する膜により第１の室と第２の室に仕切られた培養容器の，該第１の室に支持細胞を加え，該第２の室にヒト角膜上皮細胞を加えて，ROCK阻害剤及びホスホジエステラーゼ阻害剤を含有する第１の培地を用いて該ヒト角膜上皮細胞を培養し，次いで，ホスホジエステラーゼ阻害剤，ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ－β受容体阻害剤を含有する第２の培地を用いて該ヒト角膜上皮細胞を培養することを含む，製造方法。
  2. 　該培養容器が，該微細孔を有する膜により，上側の室と下側の室の，上下に２室に仕切られたものである，請求項１に記載の製造方法。
  3. 該下側の室が該第１の室であり，該上側の室が該第２の室であり，該ヒト角膜上皮細胞を，該微細孔を有する膜の上で培養するものである，請求項２に記載の製造方法。
  4. 　該ヒト角膜上皮細胞を，該細胞を通過させない微細孔を有する膜であって該培養容器内に支持されたものである膜の上で，該支持細胞と直接接触させることなく，培養するものである，請求項３に記載の製造方法。
  5. 該第１の培地に含有される該ROCK阻害剤がY27632であり，該第１及び該第２の培地に含有される該ホスホジエステラーゼ阻害剤が3-イソブチル-1-メチルキサンチンであり，該第２の培地に含有されるＭＡＰキナーゼ阻害剤がSB203580，若しくはSB239063，又はこれらの組合せから選択されるものであり，該第２の培地に含有されるＴＧＦ－β受容体阻害剤が，SB431542，LY364947，若しくはA83-01，又はこれらの組合せから選択されるものである，請求項１乃至４の何れかに記載の製造方法。
  6. 該第１の培地に含有される該ROCK阻害剤がY27632であり，該第１及び該第２の培地に含有される該ホスホジエステラーゼ阻害剤が3-イソブチル-1-メチルキサンチンであり，該第２の培地に含有されるＭＡＰキナーゼ阻害剤がSB203580であり，該第２の培地に含有されるＴＧＦ－β受容体阻害剤が，SB431542である，請求項１乃至４の何れかに記載の製造方法。
  7. 該第１の培地に含有されるY27632の濃度が1～20μMであり，該第１及び該第２の培地に含有される3-イソブチル-1-メチルキサンチンの濃度が50～150μMであり，該第２の培地に含有されるSB203580の濃度が0.2～2μMであり，SB431542の濃度が0.2～2μMである，請求項６に記載の製造方法。　
  8. 該第１の培地に含有されるY27632の濃度が約10μMであり，該第１及び該第２の培地に含有される3-イソブチル-1-メチルキサンチンの濃度が約100μMであり，該第２の培地に含有されるSB203580の濃度が約1μMであり，SB431542の濃度が約1μMである，請求項６に記載の製造方法。
  9. 該支持細胞が，ヒト間葉系幹細胞である，請求項１乃至８の何れかに記載の製造方法。
  10. 請求項１乃至９の何れかに記載の製造方法で得られた細胞を，細胞凍結液に懸濁して凍結し，凍結細胞とする工程を更に含む，製造方法。
  11. 請求項１乃至１０の何れかに記載の製造方法で得られるヒト角膜上皮細胞に由来する細胞。
  12. 請求項１０に記載の製造方法で得られる凍結されたヒト角膜上皮細胞に由来する細胞。
  13. ヒト角膜上皮シートの製造方法であって，
    　請求項１１に記載のヒト角膜上皮細胞に由来する細胞にあってはその解凍後に，請求項１１又は１２に記載のヒト角膜上皮細胞に由来する細胞を，支持細胞を含んだ培養容器中で，該支持細胞を通過させない微細孔を有する膜であって該培養容器内に支持されたものである膜の上に置かれた基質羊膜上で，ROCK阻害剤を含有する第３の培地を用いて培養し，次いで，ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ－β受容体阻害剤を含有する第４の培地を用いて培養して，該基質羊膜上で該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞からなる細胞層を形成させるステップと，次いで，該細胞層の表面の全部又は一部が培地に覆われない状態で，該第４の培地を用いて培養するステップとを含む，製造方法。
  14. 該基質羊膜が，羊膜上皮を剥離した側を上に向けて該培養容器中に置かれるものである，請求項１３に記載の製造方法。　
  15. 該第３の培地に含有される該ROCK阻害剤がY27632であり，該第４の培地に含有されるＭＡＰキナーゼ阻害剤がSB203580であり，該第４の培地に含有されるＴＧＦ－β受容体阻害剤がSB431542である，請求項１３又は１４に記載の製造方法。
  16. 該第３の培地に含有されるY27632の濃度が1～20μMであり，該第４の培地に含有されるSB203580の濃度が0.2～2μMであり，該第４の培地に含有されるSB431542の濃度が0.2～2μMである，請求項１５に記載の製造方法。
  17. 該第３の培地に含有されるY27632の濃度が約10μMであり，該第４の培地に含有されるSB203580の濃度が約1μMであり，SB431542の濃度が約1μMである，請求項１５に記載の製造方法。
  18. 該支持細胞が，ヒト間葉系幹細胞である，請求項１３乃至１７の何れかに記載の製造方法。
  19. 請求項１３乃至１８の何れかに記載の製造方法で得られる，該基質羊膜と該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞とからなるヒト角膜上皮シート。
  20. 該基質羊膜の羊膜上皮を剥離した側の面積の95％以上が，該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞により形成された細胞層で覆われているものである，請求項１９に記載のヒト角膜上皮シート。
  21. 該細胞層の90％以上が二層以上の細胞層からなる重層構造を有する，請求項２０に記載のヒト角膜上皮シート。
  22. 該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞の98％以上がサイトケラチンAE1/AE3陽性であり，80％以上がサイトケラチン12陽性である，請求項１９乃至２１の何れかに記載のヒト角膜上皮シート。
  23. 該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞の99％以上がサイトケラチンAE1/AE3陽性であり，85％以上がサイトケラチン12陽性である，請求項１９乃至２１の何れかに記載のヒト角膜上皮シート。
  24. 角膜疾患の治療用の請求項１９乃至２３の何れかに記載のヒト角膜上皮シート。
  25. 該角膜疾患が，角膜上皮のバリアー機能が不可逆的に損なわれる疾患である，請求項２４に記載のヒト角膜上皮シート。
  26. 該角膜疾患が，角膜ジストロフィー，スティーブンス・ジョンソン症候群，化学外傷及び角膜上皮幹細胞疲弊症からなる群から選択されるものである，請求項２４に記載のヒト角膜上皮シート。
  27. 　基質羊膜の表面の99.5%以上が，ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞により形成された細胞層で覆われているものであり，該細胞の98％以上がサイトケラチンAE1/AE3陽性であり，該細胞の80％以上がサイトケラチン12陽性であり，該細胞層の95%以上が四層以上の細胞層からなる重層構造を有し，該細胞層の表面の90%以上が扁平な細胞で覆われており，該細胞層内における線維芽細胞の存在比率が0.1%未満である，ヒト角膜上皮シート。
     
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