KR20210069640A - 각막 내피 세포를 보존하기 위한 방법 및 용기 - Google Patents

각막 내피 세포를 보존하기 위한 방법 및 용기 Download PDF

Info

Publication number
KR20210069640A
KR20210069640A KR1020217009502A KR20217009502A KR20210069640A KR 20210069640 A KR20210069640 A KR 20210069640A KR 1020217009502 A KR1020217009502 A KR 1020217009502A KR 20217009502 A KR20217009502 A KR 20217009502A KR 20210069640 A KR20210069640 A KR 20210069640A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
corneal endothelial
endothelial cells
container
cells
cell
Prior art date
Application number
KR1020217009502A
Other languages
English (en)
Inventor
노리코 고이즈미
나오키 오쿠무라
Original Assignee
학교법인 도시샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 학교법인 도시샤 filed Critical 학교법인 도시샤
Publication of KR20210069640A publication Critical patent/KR20210069640A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0236—Mechanical aspects
    • A01N1/0263—Non-refrigerated containers specially adapted for transporting or storing living parts whilst preserving, e.g. cool boxes, blood bags or "straws" for cryopreservation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A61F2/14—Eye parts, e.g. lenses, corneal implants; Implanting instruments specially adapted therefor; Artificial eyes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4409—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof only substituted in position 4, e.g. isoniazid, iproniazid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

본 발명은, 높은 세포 생존률로 각막 내피 세포를 보존하는 방법을 제공한다. 본 발명은, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 보존하는 방법으로서, 바닥 면적이 적어도 약 0.7cm2인 용기에 해당 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 보존하는 공정을 포함한 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 각막 내피 세포를 높은 세포 생존률로 보존할 수 있다. 또 이와 같이 하여 보존된 각막 내피 세포는 정상적인 각막 내피 세포의 기능을 가지고 있으며 또 각막 내피 질환 등의 치료용 세포로서 사용 가능하다.

Description

각막 내피 세포를 보존하기 위한 방법 및 용기
본 발명은 각막 내피 세포를 보존하기 위한 기술에 관한 것이다.
시각 정보는 안구 맨 앞면의 투명한 조직인 각막으로부터 들어온 빛이 망막에 도달하여 망막의 신경 세포를 흥분시키고 발생한 전기 신호가 시신경을 경유하여 대뇌의 시각 피질에 전달하는 것으로 인식된다. 양호한 시력을 얻기 위해서는 각막이 투명할 필요가 있다. 각막의 투명성은 각막 내피 세포의 펌프 기능과 배리어 기능에 의해 함수율이 일정하게 유지됨으로써 보존 유지된다.
인간의 각막 내피 세포는 출생시에는 1평방 밀리미터당 약 3000개의 밀도로 존재하고 있지만, 재생하는 능력이 한정되어 있기 때문에 중증 장해를 받으면 기능을 유지하지 못하고 각막의 투명성을 상실한다. 각막 내피 변성증이나 여러 가지 원인에 의한 각막 내피의 기능 부전에 의해 발생하는 수포성 각막증에서는 각막이 부종과 혼탁을 일으켜 현저한 시력 저하를 초래한다. 현재 수포성 각막증에 대해서는 도너 각막을 이용한 타가(他家) 각막 이식(heterologous corneal transplant)이 이루어지고 있다. 그러나 수술 침습, 거부 반응, 도너 부족 등 현재의 각막 이식에는 많은 해결 과제가 존재한다.
이러한 과제를 극복하기 위해 최근 각막 내피 질환에 대한 치료로서 침습성이 낮은 세포 이식 치료가 개발되고 있다(비특허 문헌 1). 각막 내피 세포의 배양은 곤란하여 통상의 방법으로는 증식되지 않고(비특허 문헌 2 및 3), 선유아 세포화되고(비특허 문헌 4), 세포 노화되는(비특허 문헌 5) 등의 문제가 있는데, 각막 내피 세포의 배양 방법은 활발하게 연구되고 있으며 실제로 임상 응용이 가능해졌다.
비특허 문헌 1: Kinoshita S, Koizumi N, Ueno M, et al. Injection of cultured cells withA ROCK inhibitor for bullous keratopathy. N Engl J Med 2018; 378: 995-1003. 비특허 문헌 2: Okumura N, Ueno M, Koizumi N, et al. Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro byA ROCK inhibitor. Invest Ophthalmol Vis Sci 2009; 50: 3680-3687. 비특허 문헌 3: Nakahara M, Okumura N, Kay EP, et al. Corneal endothelial expansion promoted by human bone marrow mesenchymal stem cell-derived conditioned medium. PLoS One 2013; 8: e69009. 비특허 문헌 4: Okumura N, Kay EP, Nakahara M, Hamuro J, Kinoshita S, Koizumi N. Inhibition of TGF-beta Signaling Enables Human Corneal Endothelial Cell Expansion In Vitro for Use in Regenerative Medicine. PLoS One 2013; 8: e58000. 비특허 문헌 5: HongoA, Okumura N, Nakahara M, Kay EP, Koizumi N. The Effect ofA p38 Mitogen-Activated Protein Kinase Inhibitor on Cellular Senescence of Cultivated Human Corneal Endothelial Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 2017; 58: 3325-3334.
본 발명자들은 예의 연구한 결과, 각막 내피 세포를 높은 생존률로 보존하는 방법을 찾아내기에 이르렀다. 구체적으로는, 본 발명자들은 각막 내피 세포를 특정 바닥 면적을 가진 용기 안에 보존함으로써 높은 생존률이 유지된다는 것을 발견하였다. 이와 같이 하여 보존된 각막 내피 세포는 정상적인 각막 내피 세포의 기능을 가지고 있으며, 따라서 본 개시에서 치료용 세포로서 추가로 실질적인 조작을 하지 않고 그대로 사용 가능한(Ready-to-use) 것이 제공된다.
따라서 본 발명은 이하를 제공한다.
(항목 1)
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 보존하는 방법으로서, 바닥 면적이 적어도 약 0.7cm2인 용기에 해당 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 보존하는 공정을 포함하는 방법.
(항목 2)
상기 세포의 보존을 위한 액체의 액면이 약 0.75mm 이상인, 항목 1에 기재된 방법.
(항목 3)
상기 용기의 바닥 면적이 약 0.7~약 4cm2인, 항목 1 또는 2에 기재된 방법.
(항목 4)
상기 용기의 바닥 면적이 약 1.5~약 3cm2인, 항목 1~3 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 5)
상기 용기의 바닥 면적이 약 1.8~약 2cm2인, 항목 1~4 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 6)
상기 용기는 접착 배양을 위한 표면 처리가 되어 있지 않은, 항목 1~5 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 7)
상기 용기는 저접착(low adhesion) 표면 용기 또는 표면 비처리 용기인, 항목 1~6 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 8)
상기 용기는 폴리스티렌, 폴리프로필렌 또는 유리로 되어있는, 항목 1~7 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 9)
상기 용기는 24웰 플레이트, 바이알병, 주사기, 디쉬로 이루어진 군에서 선택되는, 항목 1~8 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 10)
상기 세포의 보존이 약 12℃~약 42℃의 온도에서 행하여지는, 항목 1~9 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 11)
상기 세포의 보존이 약 17℃~약 39℃의 온도에서 행하여지는, 항목 1~10 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 12)
상기 세포의 보존이 약 27℃~약 37℃의 온도에서 행하여지는, 항목 1~11 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 13)
상기 세포의 보존이 약 37℃의 온도에서 행하여지는, 항목 1~12 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 14)
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 보존하기 위한 용기로서, 바닥 면적이 적어도 약 0.7cm2인 용기.
(항목 15)
상기 용기는 액면 높이를 약 0.75mm 이상으로 할 것을 허용하는 구조를 가진, 항목 14에 기재된 용기.
(항목 16)
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 보존하기 위한 용기로서, 바닥 면적이 약 0.7~약 4cm2인, 항목 14 또는 15에 기재된 용기.
(항목 17)
상기 용기의 바닥 면적이 약 1.5~약 3cm2인, 항목 14~16 중 어느 한 항에 기재된 용기.
(항목 18)
상기 용기의 바닥 면적이 약 1.8~약 2cm2인, 항목 14~17 중 어느 한 항에 기재된 용기.
(항목 19)
상기 용기는 접착 배양의 표면 처리가 되어 있지 않은, 항목 14~18 중 어느 한 항에 기재된 용기.
(항목 20)
상기 용기는 저접착 표면 용기 또는 표면 비처리 용기인, 항목 14~19 중 어느 한 항에 기재된 용기.
(항목 21)
상기 용기는 폴리스티렌, 폴리프로필렌 또는 유리로 되어 있는, 항목 14~20 중 어느 한 항에 기재된 용기.
(항목 22)
상기 용기는 24웰 플레이트, 바이알병, 주사기, 또는 디쉬로 이루어진 군에서 선택되는, 항목 14~21 중 어느 한 항에 기재된 용기.
(항목 23)
항목 1~13 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 보존된 각막 내피 세포 또는 각막 내피형 세포.
(항목 24)
항목 23에 기재된 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 포함하는, 각막 내피의 장해, 질환 또는 증상을 처치 또는 예방하기 위한 조성물.
(항목 25)
ROCK 저해제를 더 포함한, 항목 24에 기재된 조성물.
(항목 26)
상기 조성물은 ROCK 저해제와 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 항목 25에 기재된 조성물.
(항목 27) 상기 ROCK 저해제는 Y-27632인, 항목 25 또는 26에 기재된 조성물.
(항목 28)
(A) 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포와 (B) 해당 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 보존하기 위한 용기를 구비한 세포 함유 용기로서, 바닥 면적이 적어도 약 0.7cm2인, 세포 함유 용기.
(항목 29)
항목 15~22 중 어느 하나 또는 복수에 기재된 특징을 더 포함하는, 항목 28에 기재된 세포 함유 용기.
(항목 30)
ROCK 저해제를 더 포함하는, 항목 28 또는 29에 기재된 세포 함유 용기.
본 발명은 또한 이하의 항목도 제공한다.
(항목 1A)
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 보존하는 방법으로서, 바닥 면적이 적어도 약 0.7cm2의 용기에 해당 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 보존하는 공정을 포함하는 방법.
(항목 2A)
상기 각막 내피 세포 및 각막 내피형 세포가 임상 응용 가능한 세포인, 항목 1A에 기재된 방법.
(항목 3A)
상기 보존된 각막 내피 세포 및 각막 내피형 세포가 새로운 가공도 배양도 하지않고 투여되는 것을 특징으로 하는, 항목 1A 또는 2A에 기재된 방법.
(항목 4A)
적어도 약 6시간 보존되는, 항목 1A~3A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 5A)
상기 세포의 보존을 위한 액체의 액면 높이가 약 0.75mm 이상인, 항목 1A~4A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 6A)
상기 용기의 바닥 면적이 약 0.7~약 4cm2인, 항목 1A~5A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 7A)
상기 용기의 바닥 면적이 약 1.5~약 3cm2인, 항목 1A~6A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 8A)
상기 용기의 바닥 면적이 약 1.8~약 2cm2인, 항목 1A~7A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 9A)
상기 용기는 접착 배양을 위한 표면 처리가 되어 있지 않은, 항목 1A~8A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 10A)
상기 용기는 저접착 표면 용기 또는 표면 비처리 용기인, 항목 1A~9A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 11A)
상기 용기는 폴리스티렌, 폴리프로필렌 또는 유리로 되어 있는, 항목 1A~10A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 12A)
상기 용기는 24웰 플레이트, 바이알병, 주사기, 디쉬로 이루어진 군에서 선택되는, 항목 1A~11A중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 13A)
상기 세포의 보존이 약 0℃~약 42℃의 온도에서 이루어지는, 항목 1A~12A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 14A)
상기 세포의 보존이 약 17℃~약 39℃의 온도에서 행하여지는, 항목 1A~13A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 15A)
상기 세포의 보존이 약 27℃~약 37℃의 온도에서 행하여지는, 항목 1A~14A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 16A)
상기 세포의 보존이 약 37℃의 온도에서 행하여지는, 항목 1A~15A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 17A)
상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포가 세포 현탁액 상태로 보존되는, 항목 1A~16A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 18A)
상기 현탁액의 부피가 적어도 약 50μL인, 항목 1A~17A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 19A)
상기 현탁액의 부피가 약 100μL~약 2000μL인, 항목 1A~18A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 20A)
상기 보존된 상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포가 세포 주입 요법에 사용될 수 있는, 항목 1A~19A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 21A)
상기 용기에 보존되는 상기 세포의 세포 밀도가 약 2×104개/ml~약 8×107개/ml인, 항목 1A~20A중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 22A)
상기 용기에 보존되는 상기 세포의 세포 밀도가 약 2×106개/ml~약 4×106개/ml인, 항목 1A~21A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 23A)
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 보존하기 위한 용기로서, 바닥 면적이 적어도 약 0.7cm2인 용기.
(항목 24A)
상기 용기는 액면 높이가 약 0.75mm 이상으로 하는 것을 허용하는 구조를 가진, 항목 23A에 기재된 용기.
(항목 25A)
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 보존하기 위한 용기로서, 바닥 면적이 약 0.7~약 4cm2인, 항목 23A 또는 24A에 기재된 용기.
(항목 26A)
상기 용기의 바닥 면적이 약 1.5~약 3cm2인, 항목 23A~25A 중 어느 한 항에 기재된 용기.
(항목 27A)
상기 용기의 바닥 면적이 약 1.8~약 2cm2인, 항목 23A~26A 중 어느 한 항에 기재된 용기.
(항목 28A)
상기 용기는 접착 배양의 표면 처리가 되어 있지 않은, 항목 23A~27A 중 어느 한 항에 기재된 용기.
(항목 29A)
상기 용기는 저접착 표면 용기 또는 표면 비처리 용기인, 항목 23A~28A 중 어느 한 항에 기재된 용기.
(항목 30A)
상기 용기는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 또는 유리로 되어 있는, 항목 23A~29A 중 어느 한 항에 기재된 용기.
(항목 31A)
상기 용기는 24웰 플레이트, 바이알병, 주사기, 또는 디쉬로 이루어진 군에서 선택되는, 항목 23A~30A 중 어느 한 항에 기재된 용기.
(항목 32A)
상기 용기가 상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 세포 현탁액 상태로 보존하기 위한 것인, 항목 23A~31A 중 어느 한 항에 기재된 용기.
(항목 33A)
상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포가 세포 주입 요법에 사용될 수 있는, 항목 32A에 기재된 용기.
(항목 34A)
상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포가 적어도 약 6시간 보존되는, 항목 23A~33A 중 어느 한 항에 기재된 용기.
(항목 35A)
항목 1A~22A 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 보존된 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포.
(항목 36A)
상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포가 적어도 약 6시간 보존된 것인, 항목 35A에 기재된 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포.
(항목 37A)
항목 35A 또는 36A에 기재된 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 포함하는, 각막 내피의 장해, 질환 또는 증상을 처치 또는 예방하기 위한 조성물.
(항목 38A)
ROCK 저해제를 더 포함하는, 항목 37A에 기재된 조성물.
(항목 39A)
상기 조성물은 ROCK 저해제와 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 항목 38A에 기재된 조성물.
(항목 40A)
상기 ROCK 저해제는 Y-27632, 리파수딜, 파수딜, 또는 그 약학적으로 허용될 수 있는 염에서 선택되는, 항목 38A 또는 39A에 기재된 조성물.
(항목 41A)
(A) 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포와 (B) 해당 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 보존하기 위한 용기를 구비한 세포 함유 용기로서, 바닥 면적이 적어도 약 0.7cm2인 세포 함유 용기.
(항목 42A)
항목 24A~34A 중 어느 하나 또는 복수에 기재된 특징을 더 포함하는, 항목 41A에 기재된 세포 함유 용기.
(항목 43A)
ROCK 저해제를 더 포함한, 항목 41A 또는 42A에 기재된 세포 함유 용기.
(항목 44A)
상기 세포의 세포 밀도가 약 2×104개/ml~약 8×107개/ml인, 항목 4A1~43A 중 어느 한 항에 기재된 세포 함유 용기.
(항목 45A)
상기 세포의 세포수가 약 2×106개/ml~약 4×106개/ml인, 항목 41A~44A 중 어느 한 항에 기재된 세포 함유 용기.
(항목 46A)
상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포의 현탁액의 부피가 적어도 약 50μL인, 항목 41A~45A 중 어느 한 항에 기재된 세포 함유 용기.
(항목 47A)
상기 현탁액의 부피가 약 300μl~약 600μl인, 항목 46A에 기재된 방법.
(항목 48A)
각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포, 및 해당 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 보존하기 위한 용기를 포함하는 세포 제제로서, 해당 용기의 바닥 면적이 적어도 약 0.7cm2인 세포 제제.
(항목 49A)
상기 용기가 항목 24A~34A 중 어느 하나 또는 복수에 기재된 특징을 가진, 항목 48A에 기재된 세포 제제.
(항목 50A)
상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포가 적어도 약 6시간 보존되는, 항목 48A 또는 49A에 기재된 세포 제제.
(항목 51A)
상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포가 현탁 상태로 보존되는, 항목 48A~50A중 어느 한 항에 기재된 세포 제제.
(항목 52A)
상기 현탁 상태로 보존된 상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포가 세포 주입 요법에 사용될 수 있는, 항목 48A~51A 중 어느 한 항에 기재된 세포 제제.
(항목 53A)
피험체에서의 각막 내피의 장해, 질환 또는 증상을 처치 또는 예방하는 방법으로서, 항목 1A~22A 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 보존된 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포의 유효량을 해당 피험체에 투여하는 공정을 포함하는, 방법.
(항목 54A)
상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포가 적어도 약 6시간 보존되는, 항목 53A에 기재된 방법.
(항목 55A)
상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포가 세포 현탁액 상태로 보존되는, 항목 53A에 기재된 방법.
(항목 56A)
약 20μL~약 500μL의 상기 세포 현탁액이 투여되는, 항목 55A에 기재된 방법.
(항목 57A)
약 200μL~약 300μL의 상기 세포 현탁액이 투여되는, 항목 55A에 기재된 방법.
(항목 58A)
상기 각막 내피 세포 또는 각막 내피형 세포는 유효량의 ROCK 저해제와 조합하여 투여되는, 항목 53A~57A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 59A)
상기 ROCK 저해제는 Y-27632, 리파수딜, 파수딜, 또는 그 약학적으로 허용될 수 있는 염에서 선택되는, 항목 58A에 기재된 방법.
(항목 60A)
약 4만개~약 400만개의 세포가 투여되는, 항목 53A~59A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 61A)
약 40만개~약 100만개의 세포가 투여되는, 항목 53A~60A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 62A)
피험체에서의 각막 내피의 장해, 질환 또는 증상을 처치 또는 예방하기 위한, 항목 1A~22A 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 보존된 각막 내피 세포 또는 각막 내피형 세포.
(항목 63A)
피험체에서의 각막 내피의 장해, 질환 또는 증상을 처치 또는 예방하기 위해 의약의 제조시, 항목 1A~22A 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 보존된 각막 내피 세포 또는 각막 내피형 세포의 사용.
본 발명에서 상기 하나 또는 복수의 특징은 명시된 조합에 추가하여 더 조합하여 제공될 수 있음이 의도되는 것이다. 본 발명의 추가 실시 형태 및 이점은 당업자라면 필요에 따라 이하의 상세한 설명을 읽고 이해한다면 인식할 수 있다.
본 발명에 의하면 각막 내피 세포를 높은 세포 생존률로 보존하는 것이 가능하다. 또 이와 같이 하여 보존된 각막 내피 세포는 정상적인 각막 내피 세포의 기능을 가지고 있으며 또 각막 내피 질환 등의 치료용 세포로서 사용 가능하다. 또 본 발명에 의해 Ready-to-use로 제공 가능한 세포 제제가 제공된다.
[도 1] 도 1A는 각막 내피 세포 보존의 예시적인 순서의 개략을 나타낸다. 도 1B는 24웰 플레이트(세포 배양 플레이트), 24웰 플레이트(초저 접착), 48웰 플레이트(현탁 배양) 및 96웰 플레이트(초저 접착)에 각막 내피 세포를 보존한 후, 완만한 피펫팅으로 세포가 회수된 각 플레이트의 위상차 현미경 영상을 나타낸다.
[도 2] 도 2A는 24웰 플레이트(초저 접착), 48웰 플레이트(현탁 배양), 96웰 플레이트(초저 접착, 평평한 바닥), 96웰 플레이트(초저 접착, 둥근 바닥), 15ml 원뿔형 튜브(초저 접착) 및 2ml 동결 튜브에 보존한 각막 내피 세포의 생존 세포와 죽은 세포의 비율을 나타낸다. 도 2B는 24웰 플레이트(초저 접착)에서 37℃, 24웰 플레이트(초저 접착)에서 4℃, 24웰 플레이트(세포 배양 플레이트)에서 37℃로 보존한 각막 내피 세포의 생존 세포와 죽은 세포의 비율을 나타낸다. 도 2C는 24웰 플레이트(초저 접착), 24웰 플레이트(비처리) 및 10ml 유리 바이알 튜브에 보존한 각막 내피 세포의 생존 세포와 죽은 세포의 비율을 나타낸다. 도 2D는 24웰 플레이트(초저 접착)에 보존액의 양 300μl, 1000μl, 1500μl 및 2500μl로 보존한 각막 내피 세포의 생존 세포와 죽은 세포의 비율을 나타낸다. 바의 흰색 부분이 죽은 세포, 검은색 부분이 생존 세포를 나타낸다. 도 2E는 24웰 플레이트(초저 접착)에 보존한 각막 내피 세포를 배양 플레이트에 파종한 3시간 후 및 2주일 후의 위상차 현미경 영상을 나타낸다.
[도 3] 도 3A는 24웰 플레이트(초저 접착)에 보존한 각막 내피 세포가 전방에 주입된 토끼 모델에서의 세극등(細隙燈) 영상을 나타낸다. 도 3A는 왼쪽부터 주입 후 1일째, 7일째 및 14일째의 영상을 나타내고, 위에서부터 대조안(對照眼)(세포 주입 없음), 24시간 보존 세포 주입안, 48시간 보존 세포 주입안 및 72시간 보존 세포 주입안을 나타낸다. 도 3B는 주입 후 14일째의 샤임플러그(Scheimpflug) 화상을 나타낸다.
[도 4] 도 4A는 24웰 플레이트(초저 접착)에 보존한 각막 내피 세포가 전방에 주입된 토끼 모델에서, 주입 후 14일째에 PentacamTM으로 취득한 각막 두께의 칼라 맵을 나타낸다. 도 4B는 보존한 각막 내피 세포 주입 후의 중앙 각막 두께의 그래프를 나타낸다. 도 4C는 보존한 각막 내피 세포 주입 후의 각막 부피의 그래프를 나타낸다. 도 4D는 보존한 각막 내피 세포의 주입 후 14일째의 눈의 세포 밀도의 그래프를 나타낸다. 도 4E는 면역 형광 염색된 토끼 각막의 형광 현미경 영상을 나타낸다. 파란색은 DAPI 염색(세포핵)을 나타낸다. 녹색은 왼쪽부터 각각 Na＋／K＋-ATPase, ZO-1, N-카드헤린을 나타낸다.
[도 5] 도 5는 1ml의 주사기에 배양한 각막 내피 세포 50만개를 300μl의 세포 보존액에 현탁시켜 보존하고 있는 상태를 나타낸다.
[도 6] 도 6은 1ml의 주사기에 각막 내피 세포를 72시간 보존한 후의 위상차 현미경 사진을 나타낸다. 세포가 주사기의 측면에 침전되어 있다.
[도 7] 도 7은 1ml의 주사기에 각막 내피 세포를 72시간 보존한 후에 가볍게 태핑한 후의 위상차 현미경 사진을 나타낸다. 세포가 주사기의 측면에서 떠있다.
[도 8] 도 8은 1ml의 주사기에 각막 내피 세포를 72시간 보존한 후에 가볍게 태핑하고 주사기를 세포 보존액으로 온화하게 세정한 후의 위상차 현미경 사진을 나타낸다. 세포가 주사기의 측면에 접착되는 것은 발견되지 않았다.
[도 9] 도 9는 12℃, 17℃, 22℃, 27℃, 32℃, 35℃, 37℃, 39℃ 및 42℃에서 보존한 각막 내피 세포의 생존 세포와 죽은 세포의 비율을 나타낸다. 바의 흰색 부분이 죽은 세포, 검은색 부분이 생존 세포를 나타낸다.
[도 10] 도 10은 (1) 바이알병(주식회사 마루엠, 오사카, 0501-02), (2) 바이알병(2ml, 직경 16mm, 높이 33mm, IRAS 처리, 이와타 유리공업 주식회사, 오사카, lot: 181024), 및 (3) 바이알병(2ml, 직경 16mm, 높이 33mm, IRAS 처리 및 CRT 가공(SiO2 코팅), 이와타 유리공업 주식회사, 오사카, lot: 181102)의 사진을 나타낸다.
[도 11] 도 11은 (1) 바이알병(주식회사 마루엠, 오사카, 0501-02), (2) 바이알병(2ml, 직경 16mm, 높이 33mm, IRAS 처리, 이와타 유리공업 주식회사, 오사카), 및 (3) 바이알병(2ml, 직경 16mm, 높이 33mm, IRAS 처리 및 실리카 코팅 가공(SiO2 코팅), 이와타 유리공업 주식회사, 오사카)에 보존한 각막 내피 세포의 생존 세포와 죽은 세포의 비율을 나타낸다. 바의 흰색 부분이 죽은 세포, 검은색 부분이 생존 세포를 나타낸다.
이하, 본 발명을 설명하기로 한다. 본 명세서의 전체에 걸쳐 단수형 표현은 특별히 언급하지 않는 한 그 복수형의 개념도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 단수형 관사(예를 들면, 영어의 경우는 "a", "an", "the" 등)는 특별히 언급하지 않는 한 그 복수형의 개념도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또 본 명세서서 사용되는 용어는 특별히 언급하지 않는 한 해당 분야에서 통상 이용되는 의미로 이용되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 달리 정의되지 않는 한 본 명세서중에서 사용되는 모든 전문 용어 및 과학기술 용어는 본 발명이 속한 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 모순되는 경우 본 명세서(정의를 포함)가 우선한다. 본 명세서에서 "약"이란 후에 계속되는 값의 ±10%를 의미한다.
(정의)
본 명세서에서 "각막 내피 세포"란 해당 분야에서 이용되는 통상적인 의미로 이용된다. 각막이란 눈을 구성하는 층상 조직의 하나로서 투명하고 가장 외계에 가까운 부분에 위치한다. 각막은 인간의 외측(체표면)에서부터 순서대로 5층으로 이루어져 있으며 외측에서부터 각막 상피, 보우만막, 고유층, 데스메막(각막 내피 기저막), 및 각막 내피로 구성된다. 특히 특정하지 않는 한 상피 및 내피 이외의 부분은 "각막 실질"로 통칭하는 경우가 있으며, 본 명세서에서도 그와 같이 칭한다. 본 명세서에서 "HCEC"(human corneal endothelial cells)란 인간 각막 내피 세포의 약칭이다.
본 명세서에서 "각막 내피형 세포"란, 줄기세포로부터 분화된 세포, 예를 들면 iPS 세포 등으로부터 분화된 세포로서 각막 내피 세포와 실질적인 동일한 기능을 가진 세포를 가리킨다. 줄기세포, 예를 들면 ES세포, iPS 세포 등으로부터 각막 내피형 세포로 분화시키는 방법은 해당 분야에서 주지의 것이다(McCabe et al., PLoS One. 2015 Dec 21; 10(12): e0145266; Ali et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2018 May 1; 59(6): 2437-2444). 전형적인 예에서, 간결하게는 세포 해리 버퍼(Life Technologies)를 사용하여 0일째에 1:12 희석으로 iPS 세포를 35mm 매트리젤 코팅 플레이트(Corning)에 파종한다(80% 컨플루언트 플레이트를 12개의 플레이트로 나눈다). iPS 세포를 4일간 배지(mTeSR1; STEMCELL Technologies Inc.) 안에서 증식시킨다. 4일째에 mTeSR1 배지를 80% DMEM-F12(Life Technologies), 20% KSR(Life Technologies), 1% 비필수 아미노산(Life Technologies), 1mm L-글루타민(STEMCELL Technologies, inc.), 0.1mM β-메르캅토에탄올(MilliporeSigma), 및 8ng/mL βFGF(MilliporeSigma)의 기본 배지 안에 500ng/mL 인간 재조합 Noggin(R＆D Systems, Minneapolis, MN, USA) 및 10μM의 SB431542(MilliporeSigma)를 포함하는 Smad 저해제 배지로 치환한다. 6일째에 Smad 저해제 배지를 80% DMEM-F12(Life Technologies), 20% KSR(Life Technologies), 1% 비필수 아미노산(Life Technologies), 1mm L-글루타민(STEMCELL Technologies, inc.), 0.1mM β-메르캅토에탄올(MilliporeSigma), 및 8ng/mL βFGF(MilliporeSigma)의 기본 배양기 안에 0.1×B27 서플리먼트(Life Technologies), 10ng/mL 재조합 인간 혈소판 유래 증식 인자-BB(PDGF-BB; PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) 및 10ng/mL 재조합 인간 Dickkopf 관련 단백질-2(DKK-2; R＆D Systems)를 포함하는 각막 배지로 치환한다. 7일째에 분화중인 CEC를 새로운 매트리젤 코팅 플레이트(35mm)로 옮기고 13일간 각막 배지 안에서 증식시킨다. 분화된 CEC를 20일째에 회수한다. 상기 예는 전형적인 예로서, 당업자는 해당 분야에서 주지의 다른 방법(Fukuta et al., PLoS One. 2014 Dec 2; 9(12): e112291; Hayashi et al., Nature. 2016 Mar 17; 531(7594): 376-80)도 사용할 수 있다. 또 당업자라면 해당 분야에서 주지의 방법의 조건을 적절히 조절하여 각막 내피형 세포를 제작할 수 있다.
"각막 내피 세포" 및 "각막 내피형 세포"는 자성체(예를 들면, 철)를 포함해도 된다. 예를 들면, 자성 물질을 포함한 각막 내피 세포를 전방(前房) 내에 주입한 경우, 자력(磁力)에 의해 각막의 안쪽(예를 들면, 데스메막)으로 끌어당겨 접착을 촉진할 수 있다(Patel et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2009 May; 50(5): 2123-31; Mimura et al., Exp Eye Res. 2003 Jun; 76(6): 745-51; 및 Mimura et al., Exp Eye Res. 2005 Feb; 80(2): 149-57). "자성체"란 자기장에 의해 자화되는 물질을 가리키며, 예를 들면 철, 코발트, 니켈, 페라이트 등을 들 수 있다.
본 명세서에서 "접착 배양"이란 세포를 용기에 접착시켜 배양하는 것을 말한다. 접착 배양용 용기로서는, 예를 들면 세포 배양(TC: tissue culture) 처리가 이루어지는 것을 들 수 있다.
본 명세서에서 "저접착"이란 세포의 배양 또는 보존시에 세포가 용기에 거의 접착되지 않는 것을 가리킨다. 저접착 표면 용기는, 예를 들면 표면이 하이드로겔로 코팅(예를 들면, 공유 결합에 의해) 및/또는 실리카(SiO2) 코팅되어 있다. 다른 예로서는, 표면이 IRAS 처리된 유리 용기를 들 수 있다. IRAS 처리된 바이알병은 이와타 유리공업 주식회사(오사카)의 것을 이용할 수 있다. IRAS 처리에 의해 붕규산 유리로부터의 알칼리의 용출이 억제된다. 알칼리의 용출이 억제되는 처리라면 IRAS 처리 이외의 처리 방법도 본 발명에서 이용 가능하다. 예를 들면, 니치유(日油)에 의해 제공되는 LIPIDURE®-CM5206, LIPIDURE®-CR2001, LIPIDURE®-CR3001, LIPIDURE®-PC, LIPIDURE®-NH01에 의해 코팅 처리되어도 된다(https: //www.nof.co.jp/business/life/product04.html). 저접착 표면 용기는 현탁(부유) 배양용 용기로서 시판되는 경우도 있으며, 현탁(부유) 배양용 용기는 세포가 용기에 접착하지 않도록 표면 처리가 되어 있는 한, 본 명세서에서 저접착 표면 용기로 간주된다. 이 외에 실리코트 가공, (이산화규소 피막 코팅) 실리콘 가공, 유황(sulfur) 처리 등의 것도 이용 가능하다.
본 명세서에서 "표면 비처리"란 표면 처리가 되지 않은 것을 가리키고, "표면 비처리 용기"는 저접착 표면 용기와 동일하게 세포가 용기에 접착되지 않고 세포를 배양 또는 보존할 수 있는 용기를 가리킨다. 표면 비처리 용기는 현탁(부유) 배양용 용기로서 시판되는 경우도 있으며, 현탁(부유) 배양용 용기는 표면 처리가 되어 있지 않아 세포가 용기에 접착되지 않고 세포를 배양 또는 보존할 수 있는 한, 표면 비처리 용기로 간주된다.
본 명세서에서 세포의 "보존"이란 임의의 목적(예를 들면, 세포 주입 요법 또는 그것을 위한 수송)을 위해 용기 안에 일정 기간(전형적으로는 적어도 6시간이지만, 이에 한정되지는 않는다) 보관하는 것을 의미하며, 세포를 증식시키지 않고 세포의 기능을 유지하면서 용기 안에 유지하는 것을 가리킨다. 보존은 세포를 증식 시키는 것을 목적으로 하는 "배양"과는 다르다. 또 보존은 투여 직전에 세포를 주사기 등의 용기로 옮겨 넣는 것도, 투여 전에 사용시 조제하기 위해 용기 안에 일시적으로 보존 유지하는 것도 의미하지 않는다.
본 명세서에서 "세포 함유 용기"란 세포(대표적으로는, 각막 내피 세포 또는 각막 내피형 세포)를 함유하는 용기를 말하며, 대표적으로는 본 명세서에 개시되는 특징을 가진다.
(바람직한 실시 형태)
이하에 바람직한 실시 형태의 설명을 기재하는데, 이 실시 형태는 본 발명의 예시이며 본 발명의 범위는 그러한 바람직한 실시 형태로 한정되지는 않는다고 이해되어야 한다. 당업자는 또 이하와 같이 바람직한 실시예를 참고하여 본 발명의 범위 내에 있는 개변, 변경 등을 용이하게 실시할 수 있다고 이해할 것이다. 이러한 실시 형태에 대해 당업자는 적절히 임의의 실시 형태를 조합할 수 있다.
(보존 방법)
한 국면에서 본 발명은 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 보존하는 방법으로서, 특정 바닥 면적을 가진 용기에 해당 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 보존하는 공정을 포함하는 방법 및 이 보존 방법에 필요한 여러 가지 기술(예를 들면, 용기 등을 포함함)을 제공한다.
일 실시 형태에서 본 발명의 방법에 사용되는 용기의 바닥 면적은 적어도 약 0.7cm2일 수 있으며, 통상 약 0.7~약 4cm2일 수 있다. 이론에 매이고 싶지는 않지만 0.7cm2보다 바닥 면적이 작은 용기(예를 들면, 12웰 플레이트)의 경우에는 높은 세포 생존률이 달성되지 않고, 4cm2보다 바닥 면적이 큰 용기(예를 들면, 48웰 플레이트)의 경우 각막 내피 세포 주입 요법에 사용될 수 있는 세포 현탁액 또는 세포의 보존을 위한 액체(예를 들면, 약 300μl)를 용기에 넣으면 액면이 너무 낮아지기 때문에 보존에 적합하지 않다. 어느 실시 형태에서는 세포의 보존을 위한 액체의 액면 높이가 약 0.5mm 이상, 약 0.6mm 이상, 약 0.7mm 이상, 약 0.75mm 이상, 약 0.8mm 이상, 약 0.9mm 이상, 약 1.0mm 이상, 약 1.2mm 이상, 약 1.4mm 이상, 약 1.6mm 이상, 약 1.8mm 이상, 약 2mm 이상인 것이 바람직하다. 어느 실시 형태에서는 세포의 보존을 위한 액체의 액면이 약 1.0mm 이하, 약 1.5mm 이하, 약 1.8mm 이하, 약 2mm 이하, 약 3mm 이하, 약 4mm 이하, 약 5mm 이하, 약 6mm 이하, 약 7mm 이하, 약 8mm 이하, 약 9mm 이하, 약 10mm 이하, 약 15mm 이하, 약 20mm 이하 등일 수 있다. 몇개의 실시 형태에서는 본 발명의 방법에 사용되는 용기의 바닥 면적은 약 0.7~약 3.5cm2, 약 0.7~약 3cm2, 약 0.7~약 2.5cm2, 약 0.7~약 2.0cm2, 약 1~약 4cm2, 약 1~약 3.5cm2, 약 1~약 3cm2, 약 1~약 2.5cm2, 약 1~약 2cm2, 약 1.5~약 3cm2, 약 1.5~약 4cm2, 약 1.6~약 2.2 m2, 또는 약 1.8~약 2 m2일 수 있다. 보존되는 각막 내피 세포의 현탁액의 양이 각막 내피 세포 주입 요법에 사용될 수 있는 양보다 많은 경우에는 용기의 바닥 면적의 상한은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 바닥 면적의 범위에서 상한으로서 약 4.5cm2, 약 5cm2, 약 5.5cm2, 약 6cm2, 약 7cm2, 약 8cm2, 약 9cm2, 약 10cm2, 약 15cm2, 약 20cm2, 약 25cm2, 약 30cm2, 약 40cm2, 약 50cm2, 약 60cm2, 약 70cm2, 약 80cm2, 약 90cm2, 약 100cm2로 할 수 있다. 용기의 바닥 면적은 바람직하게는 약 1.5~약 3cm2이며, 보다 바람직하게는 약 2cm2이다. 특정 실시 형태에서는 용기의 바닥 면적은 약 1.88cm2이다.
본 발명의 방법으로 보존된 각막 내피 세포 및 각막 내피형 세포는 세포 주입 요법 등의 임상에 응용 가능한 세포일 수 있다. 본 발명의 보존 방법은 높은 생존률 및 세포 기능을 유지하는 것이 가능하고, 또 각막 내피 세포 및 각막 내피형 세포는 세포 현탁 상태(세포가 용기의 바닥면에 접착되어 있지 않아 가벼운 피펫팅으로 용이하게 분산 가능한 상태를 포함함), 이른바 "Ready-to-use" 상태로 유지될 수 있다. 따라서 본 발명의 방법으로 보존된 각막 내피 세포 및 각막 내피형 세포는 또한, 새로운 가공(약제 처리에 의한 보존 용기로부터의 세포 박리·현탁화나 기기에 의한 세포 집단으로부터의 특정 세포의 단리 등)도 배양도 하지않고 투여될 수 있다. 따라서 본 개시는 새로운 가공을 필요로 하지 않고 또는 최소한의 조작만으로 투여 가능한 세포 제제로서 이용 가능한 세포, 용기 및 용기에 격납된 세포 제제를 제공한다.
특정 실시 형태에서 본 발명의 방법으로 보존된 세포는 증식 및/또는 재분화의 목적으로 24시간 이상, 18시간 이상, 12시간 이상, 바람직하게는 6시간 이상(이것 이외에 임의의 시간 단위여도 됨) 세포 배양 또는 정치를 하지 않고 피험체에 투여될 수 있다.
따라서 이 국면에서는 본 발명은 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 포함한 세포 제제를 보존하는 방법으로서 특정 바닥 면적을 가진 용기에 해당 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 포함한 세포 제제를 보존하는 공정을 포함하는 방법을 제공하고, 및 이 보존 방법에 따라 보존된 또는 보존 가능한 세포 제제, 및 보존된 세포 제제를 이용하여 치료 또는 예방을 하는 방법을 제공한다.
몇개의 실시 형태에서 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포는 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 적어도 3시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 5시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 24시간 보존될 수 있다. 한정을 의도하는 것은 아니지만, 본 발명의 보존 방법은 세포 프로세싱 센터(CPC)가 없는 의료 기관에 세포 제제를 수송하기 위한 보존을 기도하고 있으며, 따라서 보존 기간은 수송에 걸리는 시간이나 투여까지의 대기 시간 등을 고려하여 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를, 예를 들면 적어도 약 3시간, 적어도 약 6시간, 또는 수송 거리에 따라 그 이상의 기간 보존할 수 있다. 특정 실시 형태에서 본 발명의 보존 방법으로 최대 약 72시간, 최대 약 96시간, 최대 약 120시간 보존될 수 있다. 이론에 매이고 싶지는 않지만 본 발명의 보존 방법에 의해 약 72시간 보존한 경우 약 80%의 생존률이 확인되고, 약 96시간 보존한 경우 약 57%의 생존률이 확인되었기 때문에(데이터는 미도시) 약 120시간 보존한다 해도 적어도 약 30% 이상의 생존이 예측될 수 있다. 몇개의 실시 형태에서 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포의 보존은 상기 기간, 세포 현탁액 상태로 보존될 수 있다. 실시예에 나타난 바와 같이 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 접착 상태가 아닌 현탁 상태로 일정 시간(예를 들면, 약 6시간) 보존할 수 있었던 것은 놀랄 만한 일이었다. 이론에 매이고 싶지는 않지만 현탁 상태로 세포가 보존되는 경우, 보존되는 세포는 접착 배양된 세포나 응집체를 형성하면서 배양/보존되는 세포에 비해 타이트 정션이 저하되어 있다. 타이트 정션은 ZO-1 등을 지표로 측정될 수 있다. 몇개의 실시 형태에서 본 발명의 보존 방법은 비계(scaffold) (세포 접착 또는 응집체의 형성을 촉진하는 기재(基材) 등)의 사용을 포함하지 않는다.
몇개의 실시 형태에서, 보존은 운반을 수반하는 것이면 된다. 본 발명의 보존 방법은 운반시의 진동을 견딜 수 있는 것이다. 운반은 육상 운송, 항공 수송, 기타 임의의 수송이어도 좋다.
본 발명의 방법으로 보존되는 세포의 세포 밀도는 약 2×104개/ml 이상인 것이 통상적이다. 이론에 매이고 싶지는 않지만 세포 주입용으로 이용할 경우 세포 밀도가 너무 적으면 치료 효과를 기대할 수 없고, 세포 밀도가 너무 높으면 세포의 중복이 증가함에 따라 보존중인 세포의 죽음이 촉진될 가능성이 있다. 따라서 전형적으로는 세포 밀도는 약 2×104개/ml~약 8×107개/ml의 범위 내에서 적절히 결정할 수 있으며, 바람직하게는 약 2×104개/ml~약 8×107개/ml, 보다 바람직하게는 약 2×105개/ml~약 8×106개/ml, 한층 더 바람직하게는 약 1×106개/ml~약 8×106개/ml, 가장 바람직하게는 약 2×106개/ml~약 4×106개/ml일 수 있다. 당업자라면 적절한 세포 밀도를 용도에 따라 적절히 결정할 수 있다.
본 발명의 방법은 보존 개시 시점에서부터 높은 세포수 및 높은 세포 생존률을 유지하면서 각막 내피 세포를 보존할 수 있도록 한다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 보존 개시 시점의 전세포를 100%로 하면 적어도 보존 후의 총세포수가 약 30% 이상이면서 생존 세포비(생존 세포/생존 세포＋죽은 세포)가 약 70% 이상, 바람직하게는 보존 후의 총세포수가 약 50% 이상이면서 생존 세포비가 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 보존 후의 총세포수가 70% 이상이면서 생존 세포비가 약 90% 이상일 때 각막 내피 세포를 달성할 수 있다. 특정 실시 형태에서 본 개시의 방법은 세포 생존률(보존 개시 시점의 전세포와 비교했을 경우의 생존 세포수의 비율)이 바람직하게는 약 30% 이상, 보다 바람직하게는 약 60% 이상, 한층 더 바람직하게는 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 이상이다. 새로운 특정 실시 형태에서는 상기 세포 생존률에 추가하여 생존 세포비(생존 세포/생존 세포＋죽은 세포)가 바람직하게는 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 이상이다.
바닥 면적은 용기의 저면이라고 불리는 면의 면적을 가리킨다. 본 개시의 방법은 주사기를 옆으로 눕힌 상태로 보존하는 것도 기도하지만, 그러한 경우 용기의 바닥 면적은 세포 현탁액이 접촉하는 원통 곡면 중 중력이 걸리는 면의 면적으로 한다. 또 주사기를 옆으로 눕힌 상태 외에 저면의 적어도 일부가 만곡 또는 경사져 있는 경우도 마찬가지로, 세포 현탁액이 접촉하는 면 중 중력이 걸리는 면의 면적을 바닥 면적으로 한다. 이론에 매이고 싶지는 않지만, 본 개시에서는 중력이 걸리는 국면에 세포를 둠에 따른 영향을 고려하는 것이 중요하다는 것을 발견하고 그것에 기초하여 바닥 면적을 규정함으로써 세포의 보존을 개선할 수 있다는 것을 발견했기 때문이다.
본 개시에서 보존시의 온도는 세포가 동결되지 않고 또 변성되지 않는 온도 범위라면 임의의 온도 범위여도 되고, 예를 들면 약 0℃~약 50℃의 범위 내일 수 있다. 너무 높아도 너무 낮아도 세포 생존률이 저하되기 때문이다. 당업자라면 보존시의 적합한 온도를 적절히 결정할 수 있다. 몇개의 실시 형태에서 보존시의 온도는 약 0℃, 약 1℃, 약 2℃, 약 3℃, 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 약 8℃, 약 9℃, 약 10℃, 약 11℃, 약 12℃, 약 13℃, 약 14℃, 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 또는 약 50℃일 수 있다. 바람직한 보존시의 온도 범위는 바람직하게는 약 12℃~약 42℃이며, 보다 바람직하게는 약 17℃~약 39℃이며, 한층 더 바람직하게는 약 27℃~약 37℃이다. 바람직한 실시 형태에서는 보존시의 온도는 실온 또는 약 37℃일 수 있다. 가장 바람직한 실시 형태에서는 보존시의 온도는 약 37℃일 수 있지만, 이에 한정되지는 않으며 보존·수송시에 몇℃ 정도 온도가 오르내리는 것(예를 들면, ±약 1℃, ±약 2℃, ±약 3℃, ±약 4℃, ±약 5℃ 등)도 허용할 수 있다는 것을 당업자라면 이해할 수 있다. 바람직하게는 온도 변동은 37℃를 기준으로 ±약 3℃인 것이 바람직하다.
각막 내피 세포는 포유동물(인간, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 소, 말, 양, 원숭이 등)에 유래한 세포일 수 있지만, 영장류 유래가 바람직하고, 특히 인간 유래가 바람직하다.
몇개의 실시 형태에서 용기는 접착 배양을 위한 표면 처리가 되어 있지 않다. 몇개의 실시 형태에서 용기는 저접착 표면 용기 또는 표면 비처리 용기이다. 몇개의 실시 형태에서 용기는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 또는 유리로 되어 있다. 구체적인 실시 형태에서 용기로서는, 예를 들면 24웰 플레이트, 바이알병, 주사기, 및 디쉬를 들 수 있지만 이들로 한정되지는 않는다.
본 개시에서 제공되는 용기는 세포 접착이 생기는 일 없이 보존이 가능하거나 세포 접착이 생겨도 세포 제제로서의 규격에 영향이 없는 한, 산소 투과성 재료로 되어 있어도 좋고 그렇지 않아도 된다. 산소 투과성 재료로서는, 예를 들면 폴리에틸렌 외에 산소를 투과하는 임의의 재료를 들 수 있다. 또 산소를 투과하지 않는 재료를 해당 분야에서 주지의 방법에 의해 산소를 투과하도록 가공하는 것도 가능하다.
본 개시에서 각막 내피 세포 또는 각막 내피형 세포의 보존 용액은 해당 분야에서 사용되는 주지의 보존 용액을 사용하면 되고, 보존에 적합한 것이라면 새로 제공되는 조성의 것이어도 된다. 사용될 수 있는 보존액으로서는, 예를 들면 OptiMEM-I® (Thermo Fisher Scientific), MEM, DMEM, M199, 각막 내피 세포 보존액(본 명세서에서 사용되는 보존액, Generation and Feasibility Assessment of a New Vehicle for Cell-Based Therapy for Treating Corneal Endothelial Dysfunction. Okumura N, Kakutani K, Inoue R, Matsumoto D, Shimada T, Nakahara M, Kiyanagi Y, Itoh T, Koizumi N.PLoS One. 2016 Jun 29; 11(6): e0158427. doi: 10.1371/journal.pone.0158427. eCollection 2016.PMID: 27355373) 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지는 않는다.
몇개의 실시 형태에서는 보존시의 액량은 약 100μl~약 2000μl, 바람직하게는 약 100μl~약 1000μl, 보다 바람직하게는 약 200μl~약 800μl, 가장 바람직하게는 약 300μl~약 600μl일 수 있지만, 목적에 따라 적절히 변경 가능하다. 제품 규격으로서는, 예를 들면 기준량(예를 들면, 300μl)의 ±약 5%, ±약 10%, ±약 15%, ±약 20%, ±약 25%, ±약 50% 등일 수 있다. 예를 들면, 보존시의 액량은 적어도 약 50μl, 예를 들면 약 100μl, 약 200μl, 약 300μl, 약 400μl, 약 500μl, 약 600μl, 약 700μl, 약 800μl, 약 900μl, 약 1ml, 약 2ml, 약 3ml, 약 4ml, 약 5ml, 약 6ml, 약 7ml, 약 8ml, 약 9ml, 또는 약 10ml일 수 있다. 몇개의 실시 형태에서 세포 주입 요법에서 양안으로의 주입을 기도할 경우에는, 제품 규격으로서 투여량의 2배량, 3배량, 또는 4배량이어도 된다. 양안으로의 주입을 기도하지 않는 경우라 해도 투여에 실패했을 때를 대비하여 제품 규격으로서 투여량의 2배량, 3배량, 또는 4배량이어도 된다. 액량의 범위는 상기 수치를 적절히 조합할 수 있다. 몇개의 실시 형태에서 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포는 세포 현탁액 상태로 보존될 수 있다. 상기 액량은 세포 현탁액의 액량일 수 있다.
(용기)
다른 국면에서 본 발명은 각막 내피 세포 또는 각막 내피형 세포를 보존하기 위한 용기로서 특정 바닥 면적을 가진 용기를 제공한다. 용기의 구체적인 특징은 상기 특히 (보존 방법)에 구체적으로 기재되는 임의의 실시 형태를 채용할 수 있다. 이론에 매이고 싶지는 않지만, 각막 내피 세포 또는 각막 내피형 세포의 보존에 적합한 가공이 이루어져 특정 바닥 면적을 가진 용기가 제공됨으로써 본 발명에서 Ready-to-use가 실현되는 세포 제제를 제공할 수 있게 되었다.
(세포 함유 용기)
다른 국면에서 본 발명은 각막 내피 세포 또는 각막 내피형 세포와 각막 내피 세포 또는 각막 내피형 세포를 보존하기 위한 용기를 포함하는 세포 함유 용기로서, 여기서 사용되는 용기는 특정 바닥 면적을 가진 용기를 제공한다. 용기의 구체적인 특징은 상기 특히 (보존 방법)에 구체적으로 기재되는 임의의 실시 형태를 채용할 수 있다.
몇개의 실시 형태에서 본 발명의 용기 안에는 Rho 키나제(ROCK) 저해제가 포함될 수 있다. 여기서 사용되는 ROCK 저해제는 본 명세서에 기재되는 임의의 실시 형태일 수 있다.
(각막 내피 세포)
다른 형태에서 본 발명은 상기 방법에 의해 보존된 각막 내피 세포 또는 각막 내피형 세포를 제공한다. 몇개의 실시 형태에서 본 개시의 각막 내피 세포 또는 각막 내피형 세포는 피험체에서의 각막 내피의 장해, 질환 또는 증상을 처치 또는 예방하기 위한 것일 수 있다.
또 다른 형태에서 본 발명은 상기 방법에 의해 보존된 각막 내피 세포 또는 각막 내피형 세포를 포함하는 각막 내피의 장해, 질환 또는 증상을 처치 또는 예방하기 위한 조성물을 제공한다.
몇개의 실시 형태에서 각막 내피의 장해, 질환 또는 증상은 퓨크스(Fuchs) 각막 내피 디스트로피, 각막 이식 후 장해, 각막 내피염, 외상, 안과 수술, 안과 레이저 수술 후의 장해, 노화, 후부 다형성 각막 디스트로피(PPD), 선천성 유전성 각막 내피 디스트로피(CHED), 특발성 각막 내피 장해 및 사이토메갈로바이러스 각막 내피염으로 이루어진 군에서 선택된다.
몇개의 실시 형태에서 본 개시의 조성물은 Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함해도 되고, ROCK 저해제와 조합하여 투여되어도 된다. 본 개시의 각막 내피 세포 또는 각막 내피형 세포는 또 ROCK 저해제와 조합하여 투여되어도 좋다. ROCK 저해제로서는, 하기 문헌: 미국 특허 4678783호, 특허 제3421217호, 국제 공개 제95/28387, 국제 공개 99/20620, 국제 공개 99/61403, 국제 공개 02/076976, 국제 공개 02/076977, 국제 공개 제2002/083175, 국제 공개 02/100833, 국제 공개 03/059913, 국제 공개 03/062227, 국제 공개 2004/009555, 국제 공개 2004/022541, 국제 공개 2004/108724, 국제 공개 2005/003101, 국제 공개 2005/039564, 국제 공개 2005/034866, 국제 공개 2005/037197, 국제 공개 2005/037198, 국제 공개 2005/035501, 국제 공개 2005/035503, 국제 공개 2005/035506, 국제 공개 2005/080394, 국제 공개 2005/103050, 국제 공개 2006/057270, 국제 공개 2007/026664 등에 개시된 화합물을 들 수 있다. 상기 화합물은 각각 개시된 문헌에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있다. 구체예로서 1-(5-이소퀴놀린술포닐) 호모피페라진 또는 그 염(예를 들어, 파수딜(1-(5-이소퀴놀린술포닐) 호모피페라진)), (＋)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-1-(4-피리딜카르바모일) 시클로헥산((R)-(＋)-트랜스-(4-피리딜)-4-(1-아미노에틸)-시클로헥산카르복사미드) 또는 그 염(예를 들어, Y-27632((R)-(＋)-트랜스-(4-피리딜)-4-(1-아미노에틸)-시클로헥산카르복사미드 2염산염 1수화물) 등) 등을 들 수 있으며 이러한 화합물은 시판품(와코순약 주식회사, 아사히화성 파마 등)을 매우 적합하게 이용할 수도 있다.
몇개의 실시 형태에서 사용될 수 있는 ROCK 저해제로서는, Y-27632((＋)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-1-(4-피리딜카르바모일)시클로헥산), 리파수딜(4-플루오로-5-｛［(2S)-2-메틸-1,4-디아제판-1-일］술포닐｝이소퀴놀린), 파수딜(1-(5-이소퀴놀린술포닐)호모피페라진), 및 그 약학적으로 허용될 수 있는 염을 들 수 있는데, 이들로 한정되지 않으며 예를 들면 US4678783, 특허 3421217, WO99/20620, WO99/61403, WO02/076976, WO02/076977, WO02/100833, WO03/059913, WO03/062227, WO2004/009555, WO2004/022541, WO2004/108724, WO2005/003101, WO2005/039564, WO2005/034866, WO2005/037197, WO2005/037198, WO2005/035501, WO2005/035503, WO2005/035506, WO2005/080394, WO2005/103050, WO2006/057270, WO2007/026664 등에 개시된 화합물(이들로 한정되지 않는다) 등의 다른 ROCK 저해제를 이용해도 좋다.
(세포 제제)
또 다른 국면에서 본 발명은 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포, 및 용기를 포함한 세포 제제를 제공한다. 이 세포 제제에 이용되는 용기는 해당 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포의 보존에 적합하며 그 용기의 바닥 면적이 적어도 약 0.7cm2인 세포 제제를 제공한다. 제재 중의 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포는 생존 세포가 거의 감소하는 일 없이 유지된다. 따라서 본 개시의 세포 제제는 그대로 투여 가능한, 이른바 Ready-to-use의 제재이다. 이러한 제재는 세포 주입 요법에 사용될 수 있다. 몇개의 실시 형태에서 본 개시의 세포 제제는 피험체에서의 각막 내피의 장해, 질환 또는 증상을 처치 또는 예방하기 위한 것일 수 있다. 각막 내피의 장해, 질환 또는 증상으로서는 퓨크스의 각막 내피 디스트로피, 각막 이식 후 장해, 각막 내피염, 외상, 안과 수술 후의 장해, 안과 레이저 수술 후의 장해, 노화, 후부 다형성 각막 디스트로피(PPD: posterior polymorphous dystrophy), 선천성 유전성 각막 내피 디스트로피(CHED: congenital hereditary endothelial dystrophy), 특발성 각막 내피 장해, 및 거대세포 바이러스 각막 내피염을 들 수 있지만, 이들로 한정되지는 않는다.
(치료 방법)
또 다른 형태에서 본 발명은 피험체에서의 각막 내피의 장해, 질환 또는 증상을 처치 또는 예방하는 방법으로서, 본 발명의 방법에 의해 보존된 각막 내피 세포 또는 각막 내피형 세포를 해당 피험체에 투여하는 공정을 포함하는 방법을 제공한다.
투여되는 세포수는 너무 적으면 치료 효과가 낮아지기 때문에 적어도 약 4만개일 수 있다. 각막 내피의 장해, 질환 또는 증상이 부분적인 경우, 통상보다 적은 개수, 예를 들면 적어도 4만개, 적어도 약 10만개, 바람직하게는 적어도 약 20만개여도 된다. 몇개의 실시 형태에서 투여되는 세포수는 약 4만개~약 400만개, 바람직하게는 약 10만개~약 200만개, 보다 바람직하게는 약 20만개~약 140만개, 가장 바람직하게는 약 40만개~약 100만개일 수 있다.
투여되는 액량은 적절한 점도, 투여되는 부위(예를 들면, 전방 내)에 투여될 수 있는 허용량 등을 고려하여 적절히 설정할 수 있다. 몇개의 실시 형태에서 약 20μL~약 500μL, 바람직하게는 약 30μL~약 400μL, 보다 바람직하게는 약 50μL~약 400μL, 가장 바람직하게는 약 200μL~약 300μL의 액량(세포 현탁액)이 투여될 수 있다.
(사용)
또 다른 형태에서 본 발명은 피험체에서의 각막 내피의 장해, 질환 또는 증상을 처치 또는 예방하기 위해 의약의 제조시, 본 개시의 방법에 의해 보존된 각막 내피 세포 또는 각막 내피형 세포의 사용을 제공한다.
이상, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시 형태를 보여주어 설명하였다. 이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 설명하는데 상술한 설명 및 이하의 실시예는 예시의 목적으로만 제공되며 본 발명을 한정하는 목적으로 제공한 것은 아니다. 따라서 본 발명의 범위는 본 명세서에 구체적으로 기재된 실시 형태에도 실시예에도 한정되지 않으며 특허 청구 범위에 의해서만 한정된다.
실시예
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 본 실시예에서 이용되는 각종 시약은 구체적으로 나타낸 것 외에 Sigma-Aldrich, BASF 재팬 주식회사 등으로부터 입수한 것도 이용할 수 있다. 인간 조직은 헬싱키 선언의 윤리 규정에 기초하여 취급되었다. 인간 도너 각막은 SightLifeTM(Seattle, WA)로부터 제공되었다. 연구 목적을 위한 눈의 기증에 대해서는 고인 도너의 근친자로부터 서면에 의한 동의서를 얻은 후 그 주의 통일 사체 제공법(UAGA)의 기준하에 각막을 채취하였다. 토끼의 실험은 도시샤 대학 동물 실험 등 위원회에 의해 승인된 지침에 기초하여 실시되었다(승인 번호 A18003).
(실시예 1: 세포 보존시의 용기 재질 및 사이즈의 스크리닝)
(재료 및 방법)
(각막 내피 세포의 배양)
질환을 앓는 40세 이상의 도너로부터 5개의 인간 도너 각막을 얻었다. 모든 각막은 사용 전에 14일 이내 동안 4℃에서 Optisol(Chiron Vision, Irvine, CA)에 보존되었다. 인간 각막 내피 세포(HCEC)는 이하와 같이 배양되었다. 간략하게는 각막 내피를 포함한 데스메막을 도너 각막으로부터 기계적으로 박리하여 12시간 37℃에서 1mg/mL의 콜라게나제A (RocheApplied Science, Penzberg, Germany)에 인큐베이트함으로써 소화하였다. HCEC를 OptiMEM-I (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA)로 세정 후, 라미닌 E8 프래그먼트(iMatrix-511; 닛피 주식회사, 도쿄)로 코팅된 48웰 플레이트 중 하나의 웰에 파종하였다.
배지는 이하와 같이 조제하였다. 간략하게는 8% 소의 태아 혈청(FBS), 5ng/mL 표피 증식 인자(EGF; Thermo Fisher Scientific), 20μg/mL 아스코르빈산(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO), 200mg/L 염화칼슘, 0.08% 콘드로이틴황산(Sigma-Aldrich), 및 50μg/mL 겐타마이신(Thermo Fisher Scientific)으로 보충된 OptiMEM-I를 NIH-3 T3와 함께 24시간 순화(馴化)시켰다. 순화된 배지를 그 후 회수하고 0.22μm의 필터 유닛(EMD Millipore Corporation, Billerica, MA)을 통해 필터링하여 HCEC의 배지로서 사용하였다.
5% CO2를 포함한 가습 분위기 하에서 HCEC를 37℃에서 배양하고 배지를 주 3회 교환하였다. HCEC의 계대 배양에서는 세포를 TrypLETM Select Enzyme(10X) (Thermo Fisher Scientific)으로 5분간 37℃에서 트립신화하여 1:2의 비율로 파종하였다. 본 시험에서는 5대에서 9대 계대 배양된 HCEC를 사용하였다.
HCEC를 Ca2＋나 mg2＋를 포함하지 않는 인산 완충 식염수(PBS)로 세정하고 TrypLETM Select Enzyme(10X)으로 15분간 37℃에서 트립신화하였다. 세포를 배양 플레이트로부터 회수한 후 2회 세정하고 280 G에서 3분간 원심분리하고 OptiMEM-I에 현탁시켰다. HCEC를 상술한 무혈청 배양액(주식회사 세포과학 연구소(미야기)에 의해 제공된 세포 요법 배양액)에서 1.0×106개/300μl의 세포 밀도로 72시간 4℃나 37℃에서 세포 현탁 형태로 보존하였다. HCEC 보존을 위한 사이즈 및 재질을 스크리닝하기 위해 이하의 세포 배양 플레이트, 시험관, 및 바이알이 사용되었다: 24웰 플레이트(초저 접착) (Corning Inc. Corning, New York), 24웰 플레이트(세포 배양) (Corning Inc. Corning), 24웰 플레이트(비처리) (AGC 테크노글라스 주식회사, 시즈오카), 48웰 플레이트(현탁 배양) (스미토모 베이크라이트 주식회사), 96웰 플레이트(초저 접착, 둥근 바닥) (Corning Inc.), 96웰 플레이트(초저 접착, 평평한 바닥) (Corning Inc.), 15ml 원뿔형 튜브(초저 접착) (스미토모 베이크라이트 주식회사, 도쿄), 2ml 크리오 바이알(Corning Inc. Corning), 및 10ml 유리 바이알병(주식회사 마루엠, 오사카) (표 1).
보존 바닥
형상		 직경
(mm)		 바닥
면적 (cm2)		 특징 재질 제조사
(모델번호)
24웰 플레이트
(초저 접착)		 평탄 15 1.88 초저
접착		 폴리스티렌 Corning (#3473)
15ml 원뿔형 튜브
(초저 접착)		 V자형 5 - 초저
접착		 폴리프로필렌 스미토모
베이크라이트
(#MS-90150)
2ml 냉동 바이알 둥ƒE 9 - 저접착 폴리프로필렌 Corning (#430488)
10ml 유리 바이알병 평탄 15 2.7 비처리 유리 마루엠
(Vial #No.3)
24웰 플레이트
(세포 배양)		 평탄
 15 1.88 세포
배양		 폴리스티렌 Corning (#3526)
24웰 플레이트
(비처리)		 평탄 15 1.88 비처리 폴리스티렌 AGC
테크노글라스
(#18020-024)
48웰 플레이트
(현탁 배양)		 평탄 9.1 0.65 현탁
배양		 폴리스티렌 스미토모
베이크라이트
(#MS-8048R)
96웰 플레이트
(현탁배양, 평탄)		 평탄 6.4 0.32 초저
접착		 폴리스티렌 Corning (#3474)
96웰 플레이트
(초저 접착, 둥ƒE)		 둥ƒE 6.4 - 초저 접착 폴리스티렌 Corning (#7007)
HCEC를 72시간 보존 후, 세포 배양 플레이트, 시험관, 또는 바이알로부터 부드럽게 피펫팅으로 회수하여 3분간 280 G에서 원심분리하고 1.0×106개/600μl의 세포 밀도로 세포 요법용 배양액에 재현탁시켰다. 죽은 세포를 0.5% 트리판블루 염색액(나카라이 테스크, 교토)으로 염색함으로써 세포 생존률을 산출하였다. 대조로서 TrypLETM Select Enzyme(10X)에서의 트립신화에 의해 회수한 HCEC를 3분간 280 G에서 원심분리하고 세포 요법용 배양액에서 재현탁시켰다. 그 후, 세포 현탁 형태로 보존하지 않고 세포 생존률을 즉석에서 평가하였다.
(결과)
(세포 현탁 형태 보존 조건의 세포 생존률에 대한 영향)
HCEC를 72시간 CTV에서 세포 현탁 형태로 1.0×106개/300μl의 세포 밀도로 보존하고 세포를 완만한 피펫팅으로 채취하여 세포 생존률을 평가하였다(도 1A). 위상차 화상은 접착 배양용 플레이트의 80~90%의 영역이 세포를 회수하기 위한 완만한 피펫팅 후에 HCEC로 덮여 있었던 것을 나타냈다. 한편 현탁세포 배양용 24웰 플레이트, 48웰 플레이트, 및 96웰 플레이트 어떤 것에서도 세포는 거의 관찰되지 않았다(도 1B). 접착 배양을 위한 표면 처리는 세포 현탁 형태로는 HCEC 보존에 적용할 수 없었기 때문에 본 실시예에서는 시판되는 배양 플레이트 및 시험관의 사이즈 및 형상의 세포 생존률에 대한 영향을 평가하였다. 트립신화되어 배양 플레이트로부터 채취된 직후의 대조에서 생존 세포와 죽은 세포의 비율은 90.3%과 9.7%이며, 24웰 플레이트(초저 접착)에서 보존된 세포에서는 82.6%과 10.1%(보존된 원래 세포수에 대해)였다. 그러나 생존 세포의 비율은 48웰 플레이트(현탁 배양), 96웰 플레이트(초저 접착, 평평한 바닥), 96웰 플레이트(초저 접착, 둥근 바닥), 15ml 원뿔형 튜브(초저 접착), 및 2ml 크리오 바이알(p＜0.01)의 대조와 비교하여 현저히 감소되었다(도 2A). 아마도 배양 플레이트 또는 시험관의 바닥 또는 벽에 세포 접착으로 인해 48웰 플레이트(현탁 배양), 15ml 원뿔형 튜브(초저 접착), 및 2ml 냉동 바이알에서의 보존 후에는 채취된 세포수가 현저히 감소되었다. 필자들은 추가적으로 온도의 세포 생존률에 대한 영향을 평가하여 95.1%의 세포가 37℃에서 생존하였으나 대량의 세포가 사멸했기 때문에 4℃에서 24웰 플레이트(초저 접착)에 보존한 후 세포는 거의 채취되지 않은 것을 나타냈다(도 2B). 다른 배양 플레이트 또는 시험관도 접착 배양을 위한 표면 처리를 하지 않고 평가하였다. 24웰 플레이트에서의 초저 접착과 마찬가지로, 비처리 24웰 플레이트 및 10ml 유리 바이알관(24웰 플레이트(약 1.9cm2)와 마찬가지로 바닥 면적은 약 2.7cm2)에서는 90% 이상의 세포 생존률을 유지하였다(도 2C). 중간 부피는 세포의 생존률을 현저히 변동시키지 않았다(도 2D).
24웰 플레이트(초저 접착)에서 세포 현탁 형태로 보존된 HCECK를 72시간 37℃에서 보존한 후 배양 플레이트 위에 파종하였다. 대표적인 위상차 영상에서는 보존된 HCEC가 대조와 동일하게 3시간의 파종 후에 뚜렷한 세포사를 동반하지 않고 배양 플레이트 위에 부착된 것을 나타냈다. 2주일 후, 보존된 HCEC는 대조와 동일한 다각형상의 단층 시트형 구조를 형성하고 있었다(도 2E).
(실시예 2: 토끼 각막 내피 대상 부전 모델에 대한 RCEC의 주입)
(재료 및 방법)
(토끼 CEC 배양)
본 실시예에서는 후나코시 주식회사(도쿄)로부터 구입한 토끼의 눈을 10개 사용하였다. 토끼 CEC(RCEC)를 상술한 바와 같이 배양하였다. 간략하게는 RCEC를 포함한 박리 데스메막을 37℃에서 15분간 0.6U/mLAccutase (나카라이 테스크, 교토)에서 인큐베이트하고 회수한 RCEC를 FNC Coating Mix®(Athena Environmental Sciences, Inc., Baltimore, MD)로 코팅한 배양 플레이트에 파종하였다. RCEC를 10% 소 태아 혈청(FBS), 50 U/mL 페니실린, 50μg/mL 스트렙토마이신, 및 2ng/mL 선유아 세포 증식 인자2(Life Technologies Corp.)로 보충한 둘베코 수정 이글 배지(Life Technologies Corp., Carlsbad, CA)에서 배양하였다. 1대에서 3대의 계대 배양을 거친 배양 RCEC를 사용하였다.
(토끼 각막 내피 대상 부전 모델에 대한 RCEC의 주입)
12마리의 일본 백색종(Japanese White Rabit)의 우안을 시험에 사용하고 좌안은 맹목을 피하기 위해 사용하지 않았다. 토끼 각막 내피 대상 부전 모델은 상술한 바와 같이 제작하였다. 간략하게는 전방을 깊게 하기 위해 렌즈를 일주일 전에 제거하고 각막 내피를 20 G 실리콘 니들 (소프트 테이퍼 니들, 주식회사 이나미, 도쿄)을 사용하여 기계적으로 제거하였다. 데스메막에서 각막 내피가 완전히 박리된 것을 0.1% 트리판블루 염색액으로 데스메막을 염색함으로써 확인하였다.
배양 RCEC를 PBS로 세정하고 37℃에서 5분간 0.05% Trypsin-EDTA (Life Technologies)로 트립신화하고 그 후 배지에서 중화하였다. RCEC를 3회 세정하고 24웰 플레이트(초저 접착)에서 1.0×106개/300μl의 CTV의 세포 밀도로 세포 현탁 형태로 보존하였다. 24, 48, 또는 72시간 보존 후, 토끼의 눈에 주입하기 위한 RCEC (1.0×106개/600μl의 CTV, 100μm의 Y-27632)를 조제하기 위해 RCEC (1.0×106개/300μl의 CTV)를 ROCK 저해제(200μM의 Y-27632(와코순약 주식회사)/300μl의 CTV)와 서서히 혼합하였다. 26 G의 주사기를 사용함으로써 각막 내피 대상 부전 모델의 전방에 합계 5.0×105의 RCEC와 함께 100μm의 Y-27632를 포함하는 300μl의 CTV를 주입하였다. 토끼를 전신 마취하에서 내피 표면을 아래로 한 상태로 3시간 유지하였다. 대조로서 각막 내피 대상 부전 모델의 전방에 Y-27632(최종 농도: 100μM)를 포함하는 CTV를 주입하였다. 각 그룹(대조, 24시간, 48시간, 및 72시간의 세포 보존)에서 3마리의 토끼 눈을 사용하였다.
눈의 전방부를 14일간 세극등 시험에 의해 평가하였다. 샤임플러그 화상을 Pentacam®(OCULUS Optikgerate GmbH, Wetzlar, 독일)으로 취득하고 각막의 7mm 직경의 부피도 샤임플러그 화상을 사용하여 측정하였다. 각막의 중앙 두께를 초음파 각막두께 측정기(pachymeter)(SP-2000; 도메이, 나고야)를 사용하여 측정하였다. 각막 두께는 심한 부종으로 인해 측정이 불가능했기 때문에 기기의 최대 독해치인 1200μm로 간주하였다.
(면역 형광 및 액틴 염색)
토끼 각막을 채취하여 실온에서 10분간 4% 포름알데히드로 고정화하였다. 검체를 45분간 37℃에서 1% 소 혈청 알부민과 함께 인큐베이트하고 Na＋／K＋-ATPase에 대한 항체(1:300, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), ZO-1(1:300, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA), N-카드레린(1:300, BD Biosciences, San Jose, CA))과 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이트하였다. PBS로 검체를 3회 세정 후, 검체를 Alexa Fluor®488 표지 염소 항마우스(1:1000, Life Technologies)와 함께 실온에서 60분간 배양하였다. 인큐베이트한 검체에 대해 Alexa Fluor®488 표지 팔로이딘(1:400, Life Technologies)으로 60분간 실온에서 액틴 염색을 실시하였다. 세포핵은 DAPI(도진도 화학연구소, 구마모토)로 염색하였다. 검체는 형광 현미경으로 관찰하였다(TCS SP2 AOBS; Leica Microsystems, Wetzlar 독일).
(통계 분석)
복수 샘플군의 비교시 통계적 유의성(p값)은 크러스컬-월리스 검정(Kruskal-Wallis test)에 의해 산정하였다. 결과는 평균치±표준 편차로서 표시되어 있다. 0.05 미만의 p값을 통계적 의미가 있는 값으로 하였다.
(토끼 모델에서의 세포 요법을 위한 보존 RCEC의 실시 가능성)
배양 RCEC를 채취하여 37℃에서 24시간, 48시간, 또는 72시간 24웰 플레이트(초저 접착)에 세포 배양 형태로 보존하였다. 토끼 모델에 주입하기 전에 Y-27632를 RCEC에 추가하여 토끼 각막 내피 대상 부전 모델의 전방에 주입하였다. 세극등 시험에서는 24, 48, 또는 72시간 보존 후에 RCEC를 주입한 눈에서는 모두 각막이 7일 이내에 투명성을 띄는 것을 나타냈다(도 3A). 대조안에서는 모두 각막 내피 대상 부전 때문에 각막이 불투명하였다. 샤임플러그 화상에서는 24, 48, 및 72시간 보존한 RCEC를 주입함으로써 해부학상 정상인 각막이 성공리에 재생되는 것을 나타냈으나, 대조안에서는 심각한 각막 부종을 나타냈다(도 3B).
PentacamTM으로 취득한 각막 두께의 칼라 맵은 24 및 48시간 보존한 RCEC가 그 주입 14일 후에 각막의 중심에서부터 외주부까지의 정상적인 각막 두께를 재생한 것을 나타내고 있다. 한편 72시간 보존된 RCEC를 주입한 눈은 세극등 시험으로 관찰했을 때에는 각막이 투명했으나 두께가 증가되었다(도 3A 및 4A). 초음파 각막두께 측정기에서는 24 및 48시간 보존한 RCEC를 주입한 눈에서 10일 후에 중심의 각막 두께가 약 400μm(정상 범위)가 된 것을 나타냈다. 그러나 72시간 보존한 RCEC를 주입한 눈에서는 24 또는 48시간 보존한 RCEC를 주입한 눈보다 중심 각막 두께의 감소가 적고 14일간은 현저히 높았다(p＜0.01)(도 4B). 중심의 각막 두께와 마찬가지로, 샤임플러그 화상으로 특정된 각막 부피는 72시간 보존한 RCEC를 주입한 눈보다 24 또는 48시간 보존한 RCEC를 주입한 눈에서 낮았다(도 4C). 액틴 및 DAPI에 의해 평가한 재생 각막 내피의 세포 밀도는 24시간 보존한 RCEC를 주입한 눈에서는 2465개/mm2이며, 48시간 보존한 RCEC를 주입한 눈에서는 2368개/mm2였다. 그러나 72시간 보존한 RCEC를 주입한 눈의 세포 밀도는 1548개/mm2이며, 24 또는 48시간 보존한 RCEC를 주입한 눈보다 현저히 낮은 값을 나타냈다(p＜0.05)(도 4D).
면역 형광 염색은 기능 관련 마커 Na＋/K＋-ATPase(펌프 기능 마커), ZO-1(밀집 결합 마커), 및 N-카드헤린(접착 결합 마커)이 24, 48, 및 72시간 보존한 RCEC를 주입한 눈에서의 모든 재생 CEC의 측막에 발현한다는 것을 실증하였다. 액틴 염색에 의해 재생 각막 내피가 다각형 단층 시트형 구조를 형성하는 것을 나타냈다. 한편, 대조안에서는 각막 내피 대상 부전에 의해 섬유화를 수반하는 기능 관련 마커를 발현하지 않는 세포는 거의 보이지 않았다(도 4E).
(실시예 3: 1ml 주사기를 이용한 각막 내피 세포의 보존)
(재료 및 방법)
HCEC를 72시간 CTV에서 세포 현탁 형태로 1.0×106개/300μl의 세포 밀도로 1ml 주사기(일회용 주사기, 등록 번호: 08B2X10007000001, 미사와 의과공업 주식회사, 이바라키현)에 보존하였다. 주사기를 눕혀서 정치시키고 72시간 37℃에서 보존하였다. 보존 후, 주사기를 손가락끝으로 털어 26G 바늘로 세포를 주사기 밖으로 꺼낸 후 세포의 생존률을 평가하였다. 보존 중인 세포가 주사기 내면에 접착되었는지 여부를 평가하기 위해 보존 후 주사기를 손가락끝으로 털어 세포를 주사기로부터 꺼낸 후 주사기 내면을 세포 보존액으로 가볍게 세정한 뒤 주사기 내면 상태를 관찰하였다.
(바닥 면적의 계산)
각 실험에서 액량은 300μl로 일정하게 하고 피스톤의 위치를 조절함으로써 바닥 면적을 조절하였다. 사용한 1ml 주사기의 내경은 6mm이다. 주사기의 끝단으로부터 10mm의 위치에 피스톤의 끝단(고무 부분)을 배치하고 주사기를 옆으로 눕힌 경우 바닥 면적은 본 명세서의 정의에 따라 (6×3.14÷2)×10=94.2mm2=0.942cm2가 된다. 이 때 공기의 양은 약 0μl이다.
주사기의 끝단으로부터 20mm의 위치에 피스톤의 끝단(고무 부분)을 배치하고 주사기를 옆으로 눕힌 경우 바닥 면적은 본 명세서의 정의에 따라 (6×3.14÷2)×20=188.4mm2=1.884cm2가 된다. 이 때 공기의 양은 약 300μl이다.
주사기의 끝단으로부터 20mm의 위치에 피스톤의 끝단(고무 부분)을 배치하고 주사기를 세로로 한 경우 바닥 면적은 6×6×3.14≒28mm2≒약 0.28cm2가 된다.
(결과)
1ml의 주사기에 배양한 각막 내피 세포 50만개를 300μl의 세포 보존액에 현탁시켜 보존하였다(도 5). 주사기에 각막 내피 세포를 72시간 보존한 바, 세포가 주사기 측면에 침전되는 것이 관찰되었다(도 5 아래 왼쪽). 가볍게 태핑한 바, 세포가 주사기 측면에서 떠올라 세포가 보존 중에 주사기 내면에 접착되지 않은 것을 나타낸다(도 5 아래 가운데). 72시간 보존한 후 가볍게 태핑하여 주사기를 세포 보존액으로 가볍게 세정했는데, 세포가 주사기 측면에 접착되는 것은 확인되지 않았다(도 5 아래 오른쪽).
주사기 안에서 72시간 보존 후의 생존 세포율은 보존 개시 시점의 전세포를 100%로 하면 (생존 세포율: 90.3%, 죽은 세포율: 9.7%)에 대해 생존 세포율: 70.9%, 죽은 세포율: 8.2%가 되어 약 90%의 세포가 생존하고 있어 보존 개시 시점과 동등했다(도 6). 한편, 주사기 안에 세포를 보존할 때 공기를 넣어 주사기를 옆으로 눕힘으로써 주사기 안의 바닥 면적을 약 2cm2로 했을 때 세포의 회수수가 높았지만, 공기를 포함하지 않고 주사기 안의 바닥 면적을 약 1cm2로 했을 때에 세포의 회수수가 반정도로 저하되었다. 마찬가지로 주사기 안에 공기를 넣은 상태로 주사기를 세우면 바닥 면적은 약 0.28cm2가 되는데, 세포의 회수수가 현저히 저하되었다(도 7). 이로써 주사기 안에 세포를 보존할 때도 바닥 면적이 약 2cm2 정도인 것이 세포의 회수율, 생존률을 높인다는 것이 나타났다.
(실시예 4: 세포 보존시의 최적 온도의 상세한 검토)
(재료 및 방법)
(각막 내피 세포의 배양)
질환을 앓는 40세 이상의 도너로부터 5개의 인간 도너 각막을 얻었다. 모든 각막은 사용전에 14일 이내 동안 4℃에서 Optisol (Chiron Vision, Irvine, CA)에 보존되었다. 인간 각막 내피 세포(HCEC)는 이하와 같이 배양되었다. 간략하게는 각막 내피를 포함하는 데스메막을 도너 각막으로부터 기계적으로 박리하여 12시간 37℃에서 1mg/mL의 콜라게나제A (Roche Applied Science, Penzberg, Germany)에 인큐베이트함으로써 소화하였다. HCEC를 OptiMEM-I (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA)로 세정 후, 라미닌 E8 프래그먼트(iMatrix-511; 닛피 주식회사, 도쿄)로 코팅된 48웰 플레이트의 하나의 웰에 파종하였다.
배지는 이하와 같이 조제하였다. 간략하게는 8% 소의 태아 혈청(FBS), 5ng/mL 상피 증식 인자 (EGF; Thermo Fisher Scientific), 20μg/mL 아스코르빈산(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO), 200mg/L 염화칼슘, 0.08% 콘드로이틴황산(Sigma-Aldrich), 및 50μg/mL 겐타마이신(Thermo Fisher Scientific)으로 보충된 OptiMEM-I를 NIH-3 T3와 함께 24시간 순화시켰다. 순화된 배지를 그 후 회수하고 0.22μm의 필터 유닛(EMD Millipore Corporation, Billerica, MA)을 통해 필터링하여 HCEC의 배지로서 사용하였다.
5% CO2를 포함한 가습 분위기 하에서 HCEC를 37℃에서 배양하고 배지를 주 3회 교환하였다. HCEC의 계대 배양에서는 세포를 TrypLETM Select Enzyme(10X) (Thermo Fisher Scientific)으로 5분간 37℃에서 트립신화하여 1:2의 비율로 파종하였다. 본 시험에서는 5대에서 9대 계대 배양된 HCEC를 사용하였다.
HCEC를 Ca2＋나 mg2＋를 포함하지 않은 인산 완충 식염수(PBS)로 세정하고 TrypLETM Select Enzyme(10X)으로 15분간 37℃에서 트립신 처리하였다. 세포를 배양 플레이트로부터 회수한 후 2회 세정하고 280 G에서 3분간 원심분리하여 OptiMEM-I에 현탁시켰다. HCEC를 상술한 무혈청 배양액(주식회사 세포과학 연구소(미야기)에 의해 제공된 세포 요법 배양액)에서 1.0×106개/300μl의 세포 밀도로 24웰 플레이트(비처리)(AGC 테크노글라스 주식회사, 시즈오카)에 72시간 세포 현탁 형태로 보존하였다. HCEC 보존을 위한 최적 온도를 검토하기 위해 12℃, 17℃, 22℃, 27℃, 32℃, 35℃, 37℃, 39℃, 42℃의 9개의 온도 조건으로 보존하였다.
HCEC를 72시간 보존 후, 세포 배양 플레이트로부터 온화하게 피펫팅으로 회수하여 3분간 280 G에서 원심분리하고 1.0×106개/600μl의 세포 밀도로 세포 요법용 배양액에 재현탁시켰다. 죽은 세포를 0.5% 트리판블루 염색액(나카라이 테스크, 교토)으로 염색함으로써 세포 생존률을 산출하였다. 대조로서 TrypLETM Select Enzyme(10X)에서의 트립신화에 의해 회수한 HCEC를 3분간 280 G에서 원심분리하고 세포 요법용 배양액에서 재현탁시켰다. 그 후, 세포 현탁 형태로 보존하지 않고 세포 생존률을 즉석에서 평가하였다.
(결과)
(세포 현탁 형태 보존시 온도 조건의 세포 생존률에 대한 영향)
HCEC를 72시간 CTV에서 세포 현탁 형태로 1.0×106개/300μl의 세포 밀도로 보존하고 세포를 온화한 피펫팅으로 채취하여 세포 생존률을 평가하였다(도 9).
9개의 온도 조건에서 37℃에서의 보존이 가장 생존 세포율이 높고, 72시간 보존 후의 생존 세포율은 보존 개시 시점의 전세포를 100%로 하면 생존 세포율: 92.4%, 죽은 세포율: 7.6%에 대해 생존 세포율: 95.4%, 죽은 세포율: 4.9%가 되어 보존 개시 시점과 동등한 세포 생존률을 나타냈다. 또 37℃보다 낮은 온도 조건하에서는 온도 저하에 비례하여 생존 세포율도 저하되고 12℃, 17℃, 22℃에서의 보존시에는 보존 개시 시점의 생존 세포율에 비해 유의미하게 낮은 생존 세포율을 나타냈으나 30% 이상의 생존률을 유지하였다. 39℃, 42℃의 조건에서도 온도 상승에 비례하여 생존 세포율이 저하되어 보존 개시 시점의 생존 세포율에 비해 유의미하게 낮은 생존 세포율을 나타냈으나 30% 이상의 생존률을 유지하였다. 이와 같이 30% 이상의 생존률을 유지할 수 있는 12℃~42℃의 범위에서 보존하는 것이 바람직하고, 60% 이상의 생존률을 유지할 수 있는 17℃~39℃에서 보존하는 것이 보다 바람직하고, 80% 이상의 생존률을 유지할 수 있는 27℃~37℃에서 보존하는 것이 더욱 바람직하고, 대조와 동등한 90% 이상의 생존률을 유지할 수 있는 37℃에서 보존하는 것이 가장 바람직하다.
(실시예 5: 유리제 바이알병을 이용한 세포 보존의 검토)
(재료 및 방법)
HCEC를 72시간 CTV에서 세포 현탁 형태로 1.0×106개/300μl의 세포 밀도로 유리제 바이알병에 보존하였다. 이하의 3개의 유리제 바이알병을 사용하였다: 통상의 유리 표면인 바이알병(주식회사 마루엠, 오사카, 0501-02), 및 저흡착 처리(IRAS 처리)가 이루어진 바이알병(이와타 유리공업 주식회사, 오사카, lot: 181024), 실리카에 의한 표면 처리(IRAS 처리 및 SiO2 코팅)가 이루어진 바이알병(이와타 유리공업 주식회사, 오사카, lot: 181102)(도 10). 이들 바이알병의 바닥 면적은, 약 2cm2이다.
72시간 보존 후, 바이알병으로부터 완만하게 피펫팅으로 회수하여 3분간 280 G에서 원심분리하고 1.0×106개/600μl의 세포 밀도로 세포 요법용 배양액에 재현탁시켰다. 죽은 세포를 0.5% 트리판블루 염색액(나카라이 테스크, 교토)으로 염색함으로써 세포 생존률을 산출하였다. 대조로서 TrypLETM Select Enzyme(10X)에서의 트립신화에 의해 회수한 HCEC를 3분간 280 G에서 원심분리하여 세포 요법용 배양액에서 재현탁시켰다. 그 후, 세포 현탁 형태로 보존하지 않고 세포 생존률을 즉석에서 평가하였다.
(결과)
HCEC를 72시간 CTV에서 세포 현탁 형태로 1.0×106개/300μl의 세포 밀도로 보존하고 세포를 완만한 피펫팅으로 채취하여 세포 생존률을 평가하였다(도 11).
바이알병(주식회사 마루엠, 오사카, 0501-02)에서는 바이알병에 세포가 접착되는 것이 관찰되었다. 한편, 바이알병(이와타 유리공업 주식회사, 오사카, 181024), 바이알병(이와타 유리공업 주식회사, 오사카, 181102)에서는 바이알병에 세포가 접착되지 않아 온화한 피펫팅으로 회수가 가능하였다. 보존 개시 시점의 전체세포를 100%로 하면 대조에서는 생존 세포율: 92.4%, 죽은 세포율: 7.6%인데 반해, 바이알병(주식회사 마루엠, 오사카, 0501-02)에 보존한 세포는 생존 세포율: 38.9%, 죽은 세포율: 7.4%가 되어 보존 개시 시점의 생존 세포수에 비해 유의미하게 낮은 생존 세포수를 나타냈다. 바이알병(이와타 유리공업 주식회사, 오사카, 181024)에 보존한 세포는 생존 세포율: 90.7%, 죽은 세포율: 7.8%, 바이알병(이와타 유리공업 주식회사, 오사카, 181102)에 보존한 세포는 생존 세포율: 84.6%, 죽은 세포율: 8.4%가 되어 보존 개시 시점과 동등한 세포 생존률을 나타냈다. 이와 같이 모든 유리제 바이알병도 30%의 세포 생존률을 나타냈으나 저접착 표면 처리가 되어 있는 것이 보다 높은 세포 생존률을 나타냈다.
(실시예 6: 세포 함유 제품의 제조예 및 운반예)
도너 각막으로부터 배양한 각막 내피 세포 또는 iPS 세포, ES세포, 신경능선 세포(neural crest cells) 등에서 분화시킨 각막 내피 세포 또는 각막 내피 세포와 동일한 기능을 가진 세포를 효소 처리에 의해 배양 접시로부터 회수한다. 회수한 세포를 300μl의 세포 주입용 용액에 대해, 예를 들면 약 50만개 내지 약 100만개의 비율로 현탁시키고 약 500μl 내지 약 800μl의 세포 현탁액을 바이알병(이와타 유리공업 주식회사, 오사카, lot: 181024) 또는 바이알병(이와타 유리공업 주식회사, 오사카, lot: 181102)에 보존한다. 바이알병은 고무마개 및 알루미늄으로 밀폐시킨다(1차 용기). 바이알병은 밀봉성, 누설 방지성이 담보된 2차 용기에 수납한다. 2차 용기는 37℃로 유지된 인큐베이터에 보존한다. 2차 용기를 외부 충격을 흡수하는 외장 용기에 수납하고 37℃로 유지된 상태에서 의료 기관에 수송한다.
이상과 같이, 본 발명의 바람직한 실시 형태를 이용하여 본 발명을 예시하였으나, 본 발명은 특허 청구범위에 의해서만 그 범위가 해석되어야 한다고 이해된다. 본 명세서에서 인용한 특허, 특허 출원 및 문헌은, 그 내용 자체가 구체적으로 본 명세서에 기재되어 있는 것과 마찬가지로 그 내용이 본 명세서에 대한 참고로서 원용되어야 한다고 이해된다. 본원은 2018년 10월 2일에 출원된 일본 특허 출원 제 2018-187754호 및 2018년 12월 28일에 출원된 2018-247970호의 우선권의 이익을 청구하고, 그 내용은 참조에 의해 본 명세서에 편입된다.
각막 내피 세포의 보존 방법이 제공된다. 본 발명에 의하면 각막 내피 세포를 높은 세포 생존률로 보존할 수 있다. 이와 같이 하여 보존된 각막 내피 세포는 정상적인 각막 내피 세포의 기능을 가지고 있으며 또 각막 내피 질환 등의 치료용 세포로서 사용가능하기 때문에 제약 등의 분야에 이용 가능하다.

Claims (63)

  1. 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 보존하는 방법으로서, 바닥 면적이 적어도 약 0.7cm2인 용기에 해당 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 보존하는 공정을 포함하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 각막 내피 세포 및 각막 내피형 세포가 임상 응용 가능한 세포인 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 보존된 각막 내피 세포 및 각막 내피형 세포가 새로운 가공도 배양도 하지 않고 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 약 6시간 보존되는 방법.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포의 보존을 위한 액체의 액면 높이가 약 0.75mm 이상인 방법.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용기의 바닥 면적이 약 0.7~약 4cm2인 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용기의 바닥 면적이 약 1.5~약 3cm2인 방법.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용기의 바닥 면적이 약 1.8~약 2cm2인 방법.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용기는 접착 배양을 위한 표면 처리가 되어 있지 않은 방법.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용기는 저접착 표면 용기 또는 표면 비처리 용기인 방법.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용기는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 또는 유리로 되어 있는 방법.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용기는 24웰 플레이트, 바이알병, 주사기, 디쉬로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포의 보존이 약 0℃~약 42℃의 온도에서 행하여지는 방법.
  14. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포의 보존이 약 17℃~약 39℃의 온도에서 이루어지는 방법.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포의 보존이 약 27℃~약 37℃의 온도에서 이루어지는 방법.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포의 보존이 약 37℃의 온도에서 이루어지는 방법.
  17. 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포가 세포 현탁액 상태로 보존되는 방법.
  18. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 현탁액의 부피가 적어도 약 50μL인 방법.
  19. 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 현탁액의 부피가 약 100μl~약 2000μl인 방법.
  20. 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 보존된 상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포가 세포 주입 요법에 사용될 수 있는 방법.
  21. 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용기에 보존되는 상기 세포의 세포 밀도가 약 2×104개/ml~약 8×107개/ml인 방법.
  22. 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용기에 보존되는 상기 세포의 세포 밀도가 약 2×106개/ml~약 4×106개/ml인 방법.
  23. 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 보존하기 위한 용기로서, 바닥 면적이 적어도 약 0.7cm2인 용기.
  24. 청구항 23에 있어서,
    상기 용기는 액면 높이를 약 0.75mm 이상으로 하는 것을 허용하는 구조를 가진 용기.
  25. 청구항 23 또는 24에 있어서,
    각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 보존하기 위한 용기로서, 바닥 면적이 약 0.7~약 4cm2인 용기.
  26. 청구항 23 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용기의 바닥 면적이 약 1.5~약 3cm2인 용기.
  27. 청구항 23 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용기의 바닥 면적이 약 1.8~약 2cm2인 용기.
  28. 청구항 23 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용기는 접착 배양의 표면 처리가 되어 있지 않은 용기.
  29. 청구항 23 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용기는 저접착 표면 용기 또는 표면 비처리 용기인 용기.
  30. 청구항 23 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용기는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 또는 유리로 되어 있는 용기.
  31. 청구항 23 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용기는 24웰 플레이트, 바이알병, 주사기, 또는 디쉬로 이루어진 군에서 선택되는 용기.
  32. 청구항 23 내지 청구항 31 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용기가 상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 세포 현탁액 상태로 보존하기 위한 것인 용기.
  33. 청구항 32에 있어서,
    상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포가 세포 주입 요법에 사용될 수 있는 용기.
  34. 청구항 23 내지 청구항 33 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포가 적어도 약 6시간 보존되는 용기.
  35. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 보존된 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포.
  36. 청구항 35에 있어서,
    상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포가 적어도 약 6시간 보존된 것인, 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포.
  37. 청구항 35 또는 청구항 36에 기재된 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 포함하는, 각막 내피의 장해, 질환 또는 증상을 처치 또는 예방하기 위한 조성물.
  38. 청구항 37에 있어서,
    ROCK 저해제를 더 포함하는 조성물.
  39. 청구항 38에 있어서,
    상기 조성물은 ROCK 저해제와 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  40. 청구항 38 또는 청구항 39에 있어서,
    상기 ROCK 저해제는 Y-27632, 리파수딜, 파수딜, 또는 그 약학적으로 허용될 수 있는 염에서 선택되는 조성물.
  41. (A) 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포와 (B) 해당 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 보존하기 위한 용기를 구비한 세포 함유 용기로서, 바닥 면적이 적어도 약 0.7cm2인 세포 함유 용기.
  42. 청구항 41에 있어서,
    청구항 24 내지 34 중 어느 한 항 또는 복수 항에 기재된 특징을 더 포함한 세포 함유 용기.
  43. 청구항 41 또는 42에 있어서,
    ROCK 저해제를 더 포함하는 세포 함유 용기.
  44. 청구항 41 내지 청구항 43 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포의 세포 밀도가 약 2×104개/ml~약 8×107개/ml인 세포 함유 용기.
  45. 청구항 41 내지 청구항 44 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포의 세포수가 약 2×106개/ml~약 4×106개/ml인 세포 함유 용기.
  46. 청구항 41 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포의 현탁액의 부피가 적어도 약 50μL인 세포 함유 용기.
  47. 청구항 46에 있어서,
    상기 현탁액의 부피가 약 300μl~약 600μl인 방법.
  48. 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포, 및 해당 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포를 보존하기 위한 용기를 포함하는 세포 제제로서, 해당 용기의 바닥 면적이 적어도 약 0.7cm2인 세포 제제.
  49. 청구항 43에 있어서,
    상기 용기가 청구항 24 내지 청구항 34 중 어느 한 항 또는 복수 항에 기재된 특징을 가진 세포 제제.
  50. 청구항 48 또는 청구항 49에 있어서,
    상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포가 적어도 약 6시간 보존되는 세포 제제.
  51. 청구항 48 내지 50 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포가 현탁 상태로 보존되는 세포 제제.
  52. 청구항 48 내지 51 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 현탁 상태로 보존된 상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포가 세포 주입 요법에 사용될 수 있는 세포 제제.
  53. 피험체에서의 각막 내피의 장해, 질환 또는 증상을 처치 또는 예방하는 방법으로서, 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 보존된 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포의 유효량을 해당 피험체에 투여하는 공정을 포함하는 방법.
  54. 청구항 53에 있어서,
    상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포가 적어도 약 6시간 보존되는 방법.
  55. 청구항 53 또는 청구항 54에 있어서,
    상기 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피형 세포가 세포 현탁액 상태로 보존되는 방법.
  56. 청구항 55에 있어서,
    약 20μl~약 500μl의 상기 세포 현탁액이 투여되는 방법.
  57. 청구항 55에 있어서,
    약 200μl~약 300μl의 상기 세포 현탁액이 투여되는 방법.
  58. 청구항 53 내지 청구항 57 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각막 내피 세포 또는 각막 내피형 세포는 유효량의 ROCK 저해제와 조합하여 투여되는 방법.
  59. 청구항 58에 있어서,
    상기 ROCK 저해제는 Y-27632, 리파수딜, 파수딜, 또는 그 약학적으로 허용될 수 있는 염에서 선택되는 방법.
  60. 청구항 53 내지 청구항 59 중 어느 한 항에 있어서,
    약 4만개~약 400만개의 세포가 투여되는 방법.
  61. 청구항 53 내지 청구항 60 중 어느 한 항에 있어서,
    약 40만개~약 100만개의 세포가 투여되는 방법.
  62. 피험체에서의 각막 내피의 장해, 질환 또는 증상을 처치 또는 예방하기 위한, 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 보존된 각막 내피 세포 또는 각막 내피형 세포.
  63. 피험체에서의 각막 내피의 장해, 질환 또는 증상을 처치 또는 예방하기 위해 의약의 제조시, 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 보존된 각막 내피 세포 또는 각막 내피형 세포의 사용.
KR1020217009502A 2018-10-02 2019-10-02 각막 내피 세포를 보존하기 위한 방법 및 용기 KR20210069640A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018187754 2018-10-02
JPJP-P-2018-187754 2018-10-02
JPJP-P-2018-247970 2018-12-28
JP2018247970 2018-12-28
PCT/JP2019/038961 WO2020071438A1 (ja) 2018-10-02 2019-10-02 角膜内皮細胞を保存するための方法および容器

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210069640A true KR20210069640A (ko) 2021-06-11

Family

ID=70055568

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217009502A KR20210069640A (ko) 2018-10-02 2019-10-02 각막 내피 세포를 보존하기 위한 방법 및 용기

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11445723B2 (ko)
EP (1) EP3862424A4 (ko)
KR (1) KR20210069640A (ko)
CN (1) CN113015429A (ko)
AU (1) AU2019352309A1 (ko)
CA (1) CA3109705A1 (ko)
WO (1) WO2020071438A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113143584B (zh) * 2021-03-09 2023-07-28 河南省立眼科医院 动物角膜上皮细胞收集及低温保存手持设备、收集方法

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4678783B1 (en) 1983-11-04 1995-04-04 Asahi Chemical Ind Substituted isoquinolinesulfonyl compounds
EP1195372A1 (en) 1994-04-18 2002-04-10 Mitsubishi Pharma Corporation N-heterocyclic substituted benzamide derivatives with antihypertensive activity
AU9646198A (en) 1997-10-22 1999-05-10 Nippon Shinyaku Co. Ltd. Isoquinoline derivative and drug
US6329547B1 (en) 1998-05-25 2001-12-11 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Vinylbenzene derivatives
CA2441492C (en) 2001-03-23 2011-08-09 Bayer Corporation Rho-kinase inhibitors
MY142915A (en) 2001-03-23 2011-01-31 Bayer Healthcare Llc Rho-kinase inhibitors
EP1378247B1 (en) 2001-04-11 2016-08-24 Senju Pharmaceutical Co., Ltd. Visual function disorder improving agents
EP1403255A4 (en) 2001-06-12 2005-04-06 Sumitomo Pharma INHIBITORS OF RHO KINASE
AU2003202263A1 (en) 2002-01-10 2003-07-30 Bayer Healthcare Ag Roh-kinase inhibitors
ATE381557T1 (de) 2002-01-23 2008-01-15 Bayer Pharmaceuticals Corp Rho-kinase inhibitoren
AU2003281623B8 (en) 2002-07-22 2009-06-11 Asahi Kasei Pharma Corporation 5-substituted isoquinoline derivative
CA2400996A1 (en) 2002-09-03 2004-03-03 Lisa Mckerracher 1,4-substituted cyclohexane derivatives
US7160894B2 (en) 2003-06-06 2007-01-09 Asahi Kasei Pharma Corporation Tricyclic compound
WO2005003101A2 (en) 2003-07-02 2005-01-13 Biofocus Discovery Limited Pyrazine and pyridine derivatives as rho kinase inhibitors
WO2005039564A1 (en) 2003-10-02 2005-05-06 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Phthalimide compounds useful as protein kinase inhibitors
EP1670466A4 (en) 2003-10-06 2007-04-25 Glaxo Group Ltd PREPARATION OF 1,6,7-TRISUBSTITUTED AZABENIC ZIMIDAZOLES AS KINASE-INHIBITORS
JP2007507547A (ja) 2003-10-06 2007-03-29 グラクソ　グループ　リミテッド キナーゼ阻害剤としての１，７−二置換アザベンゾイミダゾールの調製
US7547779B2 (en) 2003-10-06 2009-06-16 Glaxo Group Limited Preparation of 1,6-disubstituted azabenzimidazoles as kinase inhibitors
CN103173354B (zh) * 2003-10-08 2017-07-14 威尔森沃尔夫制造公司 利用透气性材料进行细胞培养的方法及装置
DK1675944T3 (da) * 2003-10-10 2011-02-28 Ge Ming Lui Humane corneale endotelceller og fremgangsmåder til opnåelse og dyrkning af celler til corneal celletransplantation
JP2007008816A (ja) 2003-10-15 2007-01-18 Ube Ind Ltd 新規イソキノリン誘導体
US7563906B2 (en) 2003-10-15 2009-07-21 Ube Industries, Ltd. Indazole derivatives
JP2007015928A (ja) 2003-10-15 2007-01-25 Ube Ind Ltd 新規オレフィン誘導体
CA2556589A1 (en) 2004-02-24 2005-09-01 Bioaxone Therapeutique Inc. 4-substituted piperidine derivatives
EP1756108A2 (en) 2004-04-02 2007-02-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Azaindoles useful as inhibitors of rock and other protein kinases
WO2006057270A1 (ja) 2004-11-26 2006-06-01 Asahi Kasei Pharma Corporation 含窒素３環化合物
WO2006092894A1 (ja) 2004-12-09 2006-09-08 Shiro Amano ヒト角膜内皮細胞由来の前駆細胞、細胞凝集体及びそれら作製方法、並びに前駆細胞および細胞凝集体の移植方法
WO2006092804A2 (en) 2005-03-03 2006-09-08 Visionix Ltd. Variable lens phoropter
EP1932841B1 (en) 2005-08-30 2014-01-01 Asahi Kasei Pharma Corporation Sulfonamide compound
US20080294149A1 (en) * 2007-05-25 2008-11-27 Arthur Krolman Corneal Viewing Chamber
CA2697895C (en) * 2007-08-29 2017-10-31 Senju Pharmaceutical Co., Ltd. Agent for promoting corneal endothelial cell adhesion
JP5891310B2 (ja) * 2012-09-26 2016-03-22 株式会社日立製作所 細胞培養容器およびそれを用いた細胞培養装置
EP2975117B1 (en) * 2013-03-11 2018-01-10 JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for producing human corneal epithelium sheet
WO2014140434A1 (fr) * 2013-03-14 2014-09-18 Universite Jean Monnet Dispositif medical destine a la conservation longue duree d'une cornee, ou a l'experimentation ex vivo sur cornee humaine ou animale
JP6384166B2 (ja) * 2013-07-23 2018-09-05 株式会社カネカ 細胞濃縮液の製造方法および細胞懸濁液処理システム
WO2015056302A1 (ja) * 2013-10-15 2015-04-23 株式会社日立製作所 細胞培養装置
CA2931280A1 (en) * 2013-11-27 2015-06-04 Senju Pharmaceutical Co., Ltd. Application of laminin to corneal endothelial cell culture
JP6637656B2 (ja) * 2014-01-16 2020-01-29 千寿製薬株式会社 角膜内皮細胞を含有する移植用組成物
JP6440107B2 (ja) 2014-03-03 2018-12-19 国立大学法人 東京大学 細胞シートの製造方法、組成物、細胞培養補助剤、及び細胞培養方法
WO2016093359A1 (ja) 2014-12-11 2016-06-16 学校法人慶應義塾 治療用角膜内皮代替細胞スフェアの製造方法
US10537995B2 (en) 2017-05-08 2020-01-21 Seiko Epson Corporation Controller and control method of robot, and robot system
IT201800004148A1 (it) * 2018-03-30 2019-09-30 Alchilife S R L Dispositivo medico per la conservazione di cornee espiantate

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
비특허 문헌 1: Kinoshita S, Koizumi N, Ueno M, et al. Injection of cultured cells withA ROCK inhibitor for bullous keratopathy. N Engl J Med 2018; 378: 995-1003.
비특허 문헌 2: Okumura N, Ueno M, Koizumi N, et al. Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro byA ROCK inhibitor. Invest Ophthalmol Vis Sci 2009; 50: 3680-3687.
비특허 문헌 3: Nakahara M, Okumura N, Kay EP, et al. Corneal endothelial expansion promoted by human bone marrow mesenchymal stem cell-derived conditioned medium. PLoS One 2013; 8: e69009.
비특허 문헌 4: Okumura N, Kay EP, Nakahara M, Hamuro J, Kinoshita S, Koizumi N. Inhibition of TGF-beta Signaling Enables Human Corneal Endothelial Cell Expansion In Vitro for Use in Regenerative Medicine. PLoS One 2013; 8: e58000.
비특허 문헌 5: HongoA, Okumura N, Nakahara M, Kay EP, Koizumi N. The Effect ofA p38 Mitogen-Activated Protein Kinase Inhibitor on Cellular Senescence of Cultivated Human Corneal Endothelial Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 2017; 58: 3325-3334.

Also Published As

Publication number Publication date
US11445723B2 (en) 2022-09-20
WO2020071438A1 (ja) 2020-04-09
CN113015429A (zh) 2021-06-22
CA3109705A1 (en) 2020-04-09
US20210153499A1 (en) 2021-05-27
EP3862424A4 (en) 2022-06-29
AU2019352309A1 (en) 2021-03-11
EP3862424A1 (en) 2021-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Peh et al. Human corneal endothelial cell expansion for corneal endothelium transplantation: an overview
AU2004282525B2 (en) Human corneal endothelial cells and methods of obtaining and culturing cells for corneal cell transplantation
ES2667620T3 (es) Método para preparar una célula endotelial corneal
Soh et al. Translational issues for human corneal endothelial tissue engineering
JP6414945B2 (ja) ヒト角膜上皮シートの製造法
CN107075469A (zh) 培养的哺乳动物角膜缘干细胞、其产生方法和其用途
Okumura et al. Generation and feasibility assessment of a new vehicle for cell-based therapy for treating corneal endothelial dysfunction
Wongvisavavit et al. Challenges in corneal endothelial cell culture
Numata et al. Cultivation of corneal endothelial cells on a pericellular matrix prepared from human decidua-derived mesenchymal cells
JP6664755B1 (ja) 角膜内皮細胞を保存するための方法および容器
Smeringaiova et al. Ex vivo expansion and characterization of human corneal endothelium for transplantation: a review
Riestra et al. Autologous method for ex vivo expansion of human limbal epithelial progenitor cells based on plasma rich in growth factors technology
US20210207088A1 (en) Composition and method for preserving or culturing ocular cells
Qin et al. Decellularized human stromal lenticules combine with corneal epithelial-like cells: a new resource for corneal tissue engineering
Fenner et al. A cellular and proteomic approach to assess proteins extracted from cryopreserved human amnion in the cultivation of corneal stromal keratocytes for stromal cell therapy
KR20210069640A (ko) 각막 내피 세포를 보존하기 위한 방법 및 용기
Han et al. Application of novel drugs for corneal cell regeneration
US20200157497A1 (en) Methods and materials for culturing, proliferating, and differentiating stem cells
WO2022025240A1 (ja) 角膜内皮細胞を保存するための方法および容器
Mingo-Botín et al. Corneal endothelium: isolation and cultivation methods
Habeler et al. Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells.
Zhu et al. Manufacturing of human corneal endothelial grafts
US20230048106A1 (en) Composition for regenerating growth plate
US20210290683A1 (en) Platelet lysate compositions and uses thereof
Komaratih et al. Scholars Academic Journal of Biosciences

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination