JP6414945B2 - ヒト角膜上皮シートの製造法 - Google Patents
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Description
(1)ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞の製造方法であって,
細胞を通過させない微細孔を有する膜により第1の室と第2の室に仕切られた培養容器の,該第1の室に支持細胞を加え,該第2の室にヒト角膜上皮細胞を加えて,ROCK阻害剤及びホスホジエステラーゼ阻害剤を含有する第1の培地を用いて該ヒト角膜上皮細胞を培養し,次いで,ホスホジエステラーゼ阻害剤,MAPキナーゼ阻害剤及びTGF−β受容体阻害剤を含有する第2の培地を用いて該ヒト角膜上皮細胞を培養することを含む,製造方法。
(2)該培養容器が,該微細孔を有する膜により,上側の室と下側の室の,上下に2室に仕切られたものである,上記(1)に記載の製造方法。
(3)該下側の室が該第1の室であり,該上側の室が該第2の室であり,該ヒト角膜上皮細胞を,該微細孔を有する膜の上で培養するものである,上記(2)に記載の製造方法。
(4)ヒト角膜上皮細胞を,該細胞を通過させない微細孔を有する膜であって該培養容器内に支持されたものである膜の上で,該支持細胞と直接接触させることなく,培養するものである,上記(3)に記載の製造方法。
(5)該第1の培地に含有される該ROCK阻害剤がY27632であり,該第1及び該第2の培地に含有される該ホスホジエステラーゼ阻害剤が3-イソブチル-1-メチルキサンチンであり,該第2の培地に含有されるMAPキナーゼ阻害剤がSB203580,若しくはSB239063,又はこれらの組合せから選択されるものであり,該第2の培地に含有されるTGF−β受容体阻害剤が,SB431542,LY364947,若しくはA83-01,又はこれらの組合せから選択されるものである,上記(1)〜(4)の何れかに記載の製造方法。
(6)該第1の培地に含有される該ROCK阻害剤がY27632であり,該第1及び該第2の培地に含有される該ホスホジエステラーゼ阻害剤が3-イソブチル-1-メチルキサンチンであり,該第2の培地に含有されるMAPキナーゼ阻害剤がSB203580であり,該第2の培地に含有されるTGF−β受容体阻害剤が,SB431542である,上記(1)〜(4)のいずれかに記載の製造方法。
(7)該第1の培地に含有されるY27632の濃度が1〜20μMであり,該第1及び該第2の培地に含有される3-イソブチル-1-メチルキサンチンの濃度が50〜150μMであり,該第2の培地に含有されるSB203580の濃度が0.2〜2μMであり,SB431542の濃度が0.2〜2μMである,上記(6)に記載の製造方法。
(8)該第1の培地に含有されるY27632の濃度が約10μMであり,該第1及び該第2の培地に含有される3-イソブチル-1-メチルキサンチンの濃度が約100μMであり,該第2の培地に含有されるSB203580の濃度が約1μMであり,SB431542の濃度が約1μMである,上記(6)に記載の製造方法。
(9)該支持細胞が,ヒト間葉系幹細胞である,上記(1)〜(8)の何れかに記載の製造方法。
(10)上記(1)〜(9)の何れかに記載の製造方法で得られた細胞を,細胞凍結液に懸濁して凍結し,凍結細胞とする工程を更に含む,製造方法。
(11)上記(1)〜(10)の何れかに記載の製造方法で得られるヒト角膜上皮細胞に由来する細胞。
(12)上記(10)に記載の製造方法で得られる凍結されたヒト角膜上皮細胞に由来する細胞。
(13)ヒト角膜上皮シートの製造方法であって,
上記(11)に記載のヒト角膜上皮細胞に由来する細胞にあってはその解凍後に,上記(11)又は(12)に記載のヒト角膜上皮細胞に由来する細胞を,支持細胞を含んだ培養容器中で,該支持細胞を通過させない微細孔を有する膜であって該培養容器内に支持されたものである膜の上に置かれた基質羊膜上で,ROCK阻害剤を含有する第3の培地を用いて培養し,次いで,MAPキナーゼ阻害剤及びTGF−β受容体阻害剤を含有する第4の培地を用いて培養して,該基質羊膜上で該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞からなる細胞層を形成させるステップと,次いで,該細胞層の表面の全部又は一部が培地に覆われない状態で,該第4の培地を用いて培養するステップとを含む,製造方法。
(14)該基質羊膜が,羊膜上皮を剥離した側を上に向けて該培養容器中に置かれるものである,上記(13)に記載の製造方法。
(15)該第3の培地に含有される該ROCK阻害剤がY27632であり,該第4の培地に含有されるMAPキナーゼ阻害剤がSB203580であり,該第4の培地に含有されるTGF−β受容体阻害剤がSB431542である,上記(13)又は(14)に記載の製造方法。
(16)該第3の培地に含有されるY27632の濃度が1〜20μMであり,該第4の培地に含有されるSB203580の濃度が0.2〜2μMであり,該第4の培地に含有されるSB431542の濃度が0.2〜2μMである,上記(15)に記載の製造方法。
(17)該第3の培地に含有されるY27632の濃度が約10μMであり,該第4の培地に含有されるSB203580の濃度が約1μMであり,SB431542の濃度が約1μMである,上記(15)に記載の製造方法。
(18)該支持細胞が,ヒト間葉系幹細胞である,上記(13)〜(17)の何れかに記載の製造方法。
(19)上記(13)〜(18)の何れかに記載の製造方法で得られる,該基質羊膜と該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞とからなるヒト角膜上皮シート。
(20)該基質羊膜の羊膜上皮を剥離した側の面積の95%以上が,該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞により形成された細胞層で覆われているものである,上記(19)に記載のヒト角膜上皮シート。
(21)該細胞層の90%以上が二層以上の細胞層からなる重層構造を有する,上記(20)に記載のヒト角膜上皮シート。
(22)該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞の98%以上がサイトケラチンAE1/AE3陽性であり,80%以上がサイトケラチン12陽性である,上記(19)〜(21)に記載の何れかのヒト角膜上皮シート。
(23)該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞の99%以上がサイトケラチンAE1/AE3陽性であり,85%以上がサイトケラチン12陽性である,上記(19)〜(21)に記載の何れかのヒト角膜上皮シート。
(24)角膜疾患の治療用の上記(19)〜(23)に記載のヒト角膜上皮シート。
(25)該角膜疾患が,角膜上皮のバリアー機能が不可逆的に損なわれる疾患である,上記(24)に記載のヒト角膜上皮シート。
(26)該角膜疾患が,角膜ジストロフィー,スティーブンス・ジョンソン症候群,化学外傷及び角膜上皮幹細胞疲弊症からなる群から選択されるものである,上記(24)に記載のヒト角膜上皮シート。
(27)基質羊膜の表面の99.5%以上が,ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞により形成された細胞層で覆われているものであり,該細胞の98%以上がサイトケラチンAE1/AE3陽性であり,該細胞の80%以上がサイトケラチン12陽性であり,該細胞層の95%以上が四層以上の細胞層からなる重層構造を有し,該細胞層の表面の90%以上が扁平な細胞で覆われており,該細胞層内における線維芽細胞の比率が0.1%未満である,ヒト角膜上皮シート。
0.1575%(w/v)RPMI1640粉末培地(粉末)を含有する水溶液が挙げられる。市販の細胞凍結保存液であるセルバンカー(日本全薬工業社),又はCnT-CRYO-50(CELLnTEC社)は,ヒト角膜上皮由来細胞の凍結保存に好適に用いることができる。
凍結保存していたヒト間葉系幹細胞(hMSC)を,37℃恒温槽ですばやく解凍し,DMEM/10% FBS培地を添加して懸濁した後,遠心して細胞を沈殿させて回収した。回収した細胞をDMEM/10% FBS培地で懸濁し,生細胞数を測定した。15000〜25000個/cm2の密度となるようにセルカルチャーインサートコンパニオンプレート 6ウェル(6ウェルコンパニオンプレート,BD Biosciences社)のボトムウェルに播種し,DMEM/10% FBS培地中で,5% CO2存在下,1〜3日間37℃で培養した。hMSCをヒト角膜上皮細胞の初代培養(P0培養)における支持細胞として用いる直前にDMEM/10% FBS培地をボトムウェルから取り除き,角膜上皮細胞培養用培地(CELLEnTEC社)にSupplement A,Supplement B,Supplement C及び10μg/mLのゲンタマイシン(インビトロジェン社)を添加した培地(CnT-20培地)に10μMのY27632(ROCK阻害剤)(シグマ社)及び100μMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX,ホスホジエステラーゼ阻害剤)(シグマ社)を更に添加した培地をボトムウェルに1.5mL添加した。これを支持細胞添加6ウェルコンパニオンプレートとした。
研究用ヒト角膜組織(2眼分,SightLife社製)から,実体顕微鏡下で手術用メス及び角膜用ハサミを用いて強膜,結膜などを切り落とし,角膜上皮組織及び輪部を含む組織切片を切り出した。切り出した組織切片に,ディスパーゼ溶液(1.2U/mLのディスパーゼ(三光純薬)を含有するPBS(インビトロジェン社)を添加して,37℃で1時間振とう機で緩やかに振とうした。次いで,0.02% EDTAを含むPBSで酵素反応を停止した後,組織切片を35mmシャーレ(プライムサーフェス,住友ベークライト社)に移した後,実体顕微鏡観察下で,組織切片から無鉤摂子を用いてヒト角膜上皮細胞を掻把し,細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液をエッペンチューブ(プロテオフリー,住友ベークライト)に移した後遠心し,上清を除いた後のペレットにCnT-20培地を添加して再度遠心し,細胞を回収した。回収した細胞を10μMのY27632(ROCK阻害剤)(シグマ社)及び100μMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX,ホスホジエステラーゼ阻害剤)(シグマ社)を含有するCnT-20培地(実施例における第1の培地)6mLに懸濁させた。
上記ヒト角膜上皮細胞の初代培養において,6ウェルセルカルチャーインサート(支持膜)の表面の90〜100%を細胞が占める状態となった時点で培地を交換し,更に約24時間培養した。次いで,培地を捨て,6ウェルセルカルチャーインサートに10μg/mLとなるようにゲンタマイシン(インビトロゲン社)を加えたPBS溶液(G-PBS)を添加して細胞を洗浄した後,再度G-PBSを添加して37℃で約15分間静置した。次いで,1mg/mLの濃度となるようにコラゲナーゼA(ロシュ社製)を添加し,37℃で1〜2時間振とう機上で緩やかに振とうし,細胞を6ウェルセルカルチャーインサートから剥離させた。次いで,0.02% EDTAを含むPBSで酵素反応を停止した後,細胞を懸濁し,細胞懸濁液を遠沈管(ステムフル,住友ベークライト社)に移し,遠心して細胞を沈殿させて回収した。細胞をCnT-20培地で懸濁させて,生細胞数及び生存率を測定した後,再度遠心し,細胞を沈殿させて回収した。次いで,細胞の濃度が約1X105個/mLとなるように,セルバンカー1(日業本全薬工社)を添加して細胞を懸濁させた。細胞懸濁液をクライオチューブ(WHEATON社)に1mLずつ分注し,これを予め4℃に冷却した凍結処理容器(BICELL,日本フリーザー社)に収納したうえで,-80℃冷凍庫に1晩置いて凍結させた後,液体窒素中に移した。
DMEM(Gibco社)と,滅菌したグリセリンとを1:1で混合した溶液に,10μg/mLとなるようにゲンタマイシンを加え,これを羊膜保存液とした。羊膜(再生医療支援機構)を安全キャビネット内のトレー上に置き,G-PBSに浸して,滅菌手袋を装着した状態で,指先で羊膜の絨毛膜を剥離し,医療用メスを用いて約2cmX2cmの正方形に切り分けた。正方形に切り分けた羊膜を羊膜保存液に入れ,-80℃で保存した。
凍結保存していたヒト間葉系幹細胞(hMSC)を,37℃恒温槽ですばやく解凍し,DMEM/10% FBS培地を添加して懸濁した後,遠心して細胞を沈殿させて回収した。回収した細胞をDMEM/10% FBS培地で懸濁し,生細胞数を測定した。1.5X104〜2.5 X104個/cm2の細胞密度となるように6ウェルコンパニオンプレート(コーニング社)のボトムウェルに播種し,DMEM/10% FBS培地中で1〜3日間培養した。hMSCをヒト角膜上皮シートの製造における支持細胞として用いる直前にDMEM/10% FBS培地中を取り除き,PBSで洗浄した後,10μMのY27632(ROCK阻害剤)(シグマ社)を含有するKB+SHEM培地を1.5mL加えた。これを支持細胞添加6ウェルコンパニオンプレートとした。KB+SHEM培地とは,下記に作製方法を示したKB培地とSHEM培地を2:1の割合で混合した培地を指す。KB培地は,正常ヒト角膜上皮細胞増殖用無血清液体培地(LIFELINE Cell Technology社)に付属の7種類の添加因子のうちウシ脳下垂体抽出液(BPE)を除く6種類の添加因子(0.2%(v/v) OcuFactor Lifefactor,5μg/mL トランスフェリン,0.18μg/mL ハイドロコルチゾン,1μM アドレナリン,6mM L-グルタミン,5.0μg/mL 組み換えヒトインスリン)を加え,更に10μg/mLの濃度となるようにゲンタマイシンを加えて作製した培地である。SHEM培地は,DMEM/F-12(Gibco社)に5μg/mLの組み換えヒトインスリン,10ng/mLの組み換えヒト EGF(Gibco社),10%のFBS(Hyclone社),更に10μg/mLの濃度となるようにゲンタマイシンを加えて作製した培地である。
培養終了後のヒト角膜上皮シートを6ウェルセルカルチャーインサート上でKB+SHEM培養用培地で3回洗浄した後,生検トレパン及びスカルペルを用いて1/2シート,及び1/4シート2枚に分割した。
分割後,1/2シートをスーパーフィックス(クラボウ)で10分間固定し,次いでスーパーフィックスを除いてPBSで3回洗浄した。次にマイヤーヘマトキリン溶液(和光純薬工業)で30分間染色し,マイヤーヘマトキリン溶液を除いた後,PBSで3回洗浄した。マイヤーヘマトキリン溶液により細胞核が染色されていることを確認した後,PBSで5倍希釈したエオシンY溶液(和光純薬工業)で10秒間染色し,次いでエオシンY溶液を除いてPBSで3回洗浄した。エオシンY溶液により細胞質が染色されていることを確認した後,スライドガラス上で細胞シートを支持膜から剥がし,PBSを用いてカバーガラスで封入したものを作成し,これを用いてヒト角膜上皮シートの表面を顕微鏡下で観察し,基質羊膜表面上に形成されたヒト角膜上皮由来細胞の細胞層(培養細胞層)の範囲及び線維芽細胞の存在の有無を顕微鏡下で観察した。
ヒト角膜上皮シートの表面を顕微鏡下で観察した結果,線維芽細胞の存在は全く認められなかった(図1)。顕微鏡視野内には,少なくとも1000個の細胞があったので,ヒト角膜上皮由来細胞中の線維芽細胞の比率は0.1%未満であった。また,顕微鏡視野内において,基質羊膜の表面の全面積の98%以上が培養細胞層に覆われており,且つ,培養細胞層の90%以上が二層以上の重層構造を形成していることがわかった(図1)。
リン酸緩衝液生理食塩水 pH 7.4, contains BSA, powder(シグマ社)を純水に溶解し,0.22μmフィルターに通して,2% BSA(0.138M塩化ナトリウム,0.0027M塩化カリウム,2%(w/v)ウシ血清アルブミンを含有する0.01Mリン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4))を調製した。調製した2% BSAにTriton X-100(和光純薬工業)を0.1%の濃度になるように加え,これをBSA-Tとした。
FACS解析の結果,基質羊膜上の培養細胞層を形成する細胞のほぼ全て(99.99%以上)が,サイトケラチンAE1/AE3陽性であり(図3−1),87%以上の細胞がサイトケラチン12陽性であることがわかった(図3−2)。
HE染色及びFACS解析の結果から,上記手法により製造したヒト角膜上皮シートは,線維芽細胞の存在が認められず,且つ,バリアー機能を担う非角化重層扁平上皮からなる角膜上皮組織と類似の形態を示すことから,移植用の角膜上皮シートとして適したものであることがわかった。
ヒト角膜上皮細胞の初代培養(P0培養)を,上記記載の方法に代えて,以下の方法(別法を採して実施した。研究用ヒト角膜組織(2眼分,SightLife社製, 組織保存液としてCnT-20培地が使用されたもの)から,実体顕微鏡下で手術用メス及び角膜用ハサミを用いて強膜,結膜などを切り落とし,角膜上皮組織及び輪部を含む組織切片を切り出した。切り出した組織切片に,ディスパーゼ溶液(1.2U/mLのディスパーゼ(三光純薬)を含有するCnT-20培地(CELLEnTEC社)を添加して,4℃で15〜20時間静置した。次いで,37℃で1時間静置した後に0.02% EDTAを含むPBSで酵素反応を停止した後,組織切片を35mmシャーレ(プライムサーフェス,住友ベークライト社)に移した後,実体顕微鏡観察下で,組織切片から無鉤摂子を用いてヒト角膜上皮細胞を掻把し,細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液をエッペンチューブ(プロテオフリー,住友ベークライト)に移した後遠心し,上清を除いた後のペレットにCnT-20培地を添加して再度遠心し,細胞を回収した。回収した細胞を10μMのY27632(ROCK阻害剤)(シグマ社)及び100μMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX,ホスホジエステラーゼ阻害剤)(シグマ社)を含有するCnT-20培地(実施例における第1の培地)1mLに懸濁させた。細胞懸濁液の一部を分取し,Trypan Blue Stain(Life Technologies社)で10倍希釈して細胞を染色して細胞数を計測した後に,細胞懸濁液にCnT-20培地を加えて細胞濃度が2X105個/mLとなるように調整した。
上記凍結保存した角膜上皮由来細胞を37℃恒温槽ですばやく解凍し, CnT-20培地を添加して懸濁した後,遠心して細胞を沈殿させて回収した。回収した細胞をCnT-20培地で懸濁し細胞懸濁液とし,生細胞数を測定した。次いで,懸濁した角膜上皮由来細胞懸濁液を,FNC Coating Mix(AthenaES社)でコーティングした96ウェルプレートに生細胞数が3500個/ウェルになるように添加した。次いで,これらのウェルに表9に示す(1)〜(6)群の組合せ及び濃度で,MAPキナーゼ阻害剤とTGF−β受容体阻害剤とを培地に添加した。すなわち,各群におけるMAPキナーゼ阻害剤とTGF−β受容体阻害剤の組合せ及び培地中における濃度は,(1) SB203580(1μM)+ SB431542(1μM),(2) SB203580(1μM)+ A83-01(10μM),(3) SB203580(1μM)+ LY364947(10μM),(4) SB239063(10μM)+ SB431542(1μM),(5) SB239063(10μM)+ A83-01(10μM),(6) SB239063(10μM)+ LY364947(10μM)とした。また,MAPキナーゼ阻害剤とTGF−β受容体阻害剤を培地に添加しないものをコントロール(NA)とした。培養開始から5日後に水溶性テトラゾリウム塩WST-8を発色試薬として含有するCell Counting Kit-8(CCK-8)溶液を培地に10μL添加し,1時間後にプレートリーダーで波長450nmでの吸光度(OD450)を測定した。測定は,各組合せとも4ウェルで実施し,コントロールの測定値の平均値を100%として,コントロールとの比較で各群の測定値を求めた。なお,生細胞数は,こうして求められる吸光度とほぼ比例関係にあることが知られている。
2.6ウェルコンパニオンプレート(培養容器)
3.微細孔を有する膜
4.ヒト角膜上皮細胞
5.支持細胞(ヒト間葉系幹細胞)
6.第1の室
7.第2の室
8.ボトムウェル
Claims (17)
- ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞の製造方法であって,
細胞を通過させない微細孔を有する膜により第1の室と第2の室に仕切られた培養容器の,該第1の室に支持細胞を加え,該第2の室にヒト角膜上皮細胞を加えて,ROCK阻害剤及びホスホジエステラーゼ阻害剤を含有する第1の培地を用いて該ヒト角膜上皮細胞を培養し,次いで,ホスホジエステラーゼ阻害剤,MAPキナーゼ阻害剤及びTGF−β受容体阻害剤を含有する第2の培地を用いて該ヒト角膜上皮細胞を培養することを含む,製造方法。 - 該培養容器が,該微細孔を有する膜により,上側の室と下側の室の,上下に2室に仕切られたものである,請求項1に記載の製造方法。
- 該下側の室が該第1の室であり,該上側の室が該第2の室であり,該ヒト角膜上皮細胞を,該微細孔を有する膜の上で培養するものである,請求項2に記載の製造方法。
- 該ヒト角膜上皮細胞を,該細胞を通過させない微細孔を有する膜であって該培養容器内に支持されたものである膜の上で,該支持細胞と直接接触させることなく,培養するものである,請求項3に記載の製造方法。
- 該第1の培地に含有される該ROCK阻害剤がY27632であり,該第1及び該第2の培地に含有される該ホスホジエステラーゼ阻害剤が3-イソブチル-1-メチルキサンチンであり,該第2の培地に含有されるMAPキナーゼ阻害剤がSB203580,若しくはSB239063,又はこれらの組合せから選択されるものであり,該第2の培地に含有されるTGF−β受容体阻害剤が,SB431542,LY364947,若しくはA83-01,又はこれらの組合せから選択されるものである,請求項1乃至4の何れかに記載の製造方法。
- 該第1の培地に含有される該ROCK阻害剤がY27632であり,該第1及び該第2の培地に含有される該ホスホジエステラーゼ阻害剤が3-イソブチル-1-メチルキサンチンであり,該第2の培地に含有されるMAPキナーゼ阻害剤がSB203580であり,該第2の培地に含有されるTGF−β受容体阻害剤が,SB431542である,請求項1乃至4の何れかに記載の製造方法。
- 該第1の培地に含有されるY27632の濃度が1〜20μMであり,該第1及び該第2の培地に含有される3-イソブチル-1-メチルキサンチンの濃度が50〜150μMであり,該第2の培地に含有されるSB203580の濃度が0.2〜2μMであり,SB431542の濃度が0.2〜2μMである,請求項6に記載の製造方法。
- 該第1の培地に含有されるY27632の濃度が10μMであり,該第1及び該第2の培地に含有される3-イソブチル-1-メチルキサンチンの濃度が100μMであり,該第2の培地に含有されるSB203580の濃度が1μMであり,SB431542の濃度が1μMである,請求項6に記載の製造方法。
- 該支持細胞が,ヒト間葉系幹細胞である,請求項1乃至8の何れかに記載の製造方法。
- 請求項1乃至9の何れかに記載の製造方法でヒト角膜上皮細胞に由来する細胞を得て該細胞を,細胞凍結液に懸濁して凍結し,凍結細胞とする工程を更に含む,製造方法。
- ヒト角膜上皮シートの製造方法であって,
請求項1乃至9の何れかに記載の製造方法でヒト角膜上皮細胞に由来する細胞を得て該細胞を,支持細胞を含んだ培養容器中で,該支持細胞を通過させない微細孔を有する膜であって該培養容器内に支持されたものである膜の上に置かれた基質羊膜上で,ROCK阻害剤を含有する第3の培地を用いて培養し,次いで,MAPキナーゼ阻害剤及びTGF−β受容体阻害剤を含有する第4の培地を用いて培養して,該基質羊膜上で該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞からなる細胞層を形成させるステップと,次いで,該細胞層の表面の全部又は一部が培地に覆われない状態で,該第4の培地を用いて培養するステップとを含む,製造方法。 - ヒト角膜上皮シートの製造方法であって,
請求項10に記載の製造方法でヒト角膜上皮細胞に由来する細胞を得て該細胞を解凍後に,支持細胞を含んだ培養容器中で,該支持細胞を通過させない微細孔を有する膜であって該培養容器内に支持されたものである膜の上に置かれた基質羊膜上で,ROCK阻害剤を含有する第3の培地を用いて培養し,次いで,MAPキナーゼ阻害剤及びTGF−β受容体阻害剤を含有する第4の培地を用いて培養して,該基質羊膜上で該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞からなる細胞層を形成させるステップと,次いで,該細胞層の表面の全部又は一部が培地に覆われない状態で,該第4の培地を用いて培養するステップとを含む,製造方法。 - 該基質羊膜が,羊膜上皮を剥離した側を上に向けて該培養容器中に置かれるものである,請求項11又は12に記載の製造方法。
- 該第3の培地に含有される該ROCK阻害剤がY27632であり,該第4の培地に含有されるMAPキナーゼ阻害剤がSB203580であり,該第4の培地に含有されるTGF−β受容体阻害剤がSB431542である,請求項11乃至13の何れかに記載の製造方法。
- 該第3の培地に含有されるY27632の濃度が1〜20μMであり,該第4の培地に含有されるSB203580の濃度が0.2〜2μMであり,該第4の培地に含有されるSB431542の濃度が0.2〜2μMである,請求項14に記載の製造方法。
- 該第3の培地に含有されるY27632の濃度が10μMであり,該第4の培地に含有されるSB203580の濃度が1μMであり,SB431542の濃度が1μMである,請求項14に記載の製造方法。
- 該支持細胞が,ヒト間葉系幹細胞である,請求項11乃至16の何れかに記載の製造方法。
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