JP6414945B2

JP6414945B2 - ヒト角膜上皮シートの製造法

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Publication number: JP6414945B2
Application number: JP2015505447A
Authority: JP
Inventors: 究今川; 前田　謙一; 謙一前田; 勇喜細田; 修一横山; 直毅奥村; 範子小泉; 木下　茂; 茂木下
Original assignee: KYOTO PREFECTURAL UNIVERSITY OF MEDICINE; JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: KYOTO PREFECTURAL UNIVERSITY OF MEDICINE; JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2013-03-11
Filing date: 2014-03-09
Publication date: 2018-10-31
Anticipated expiration: 2034-03-09
Also published as: JPWO2014142038A1; CN105308175A; EP2975117A4; CN105308175B; EP2975117A1; EP2975117B1; US10335439B2; WO2014142038A1; US20160008408A1

Description

本発明は，移植用のヒト角膜上皮シートに関し，詳しくは，ヒト角膜上皮細胞を培養して得られたヒト角膜上皮由来細胞を用いたヒト角膜上皮シートの製造法に関する。

角膜は，外側から内側に向かって，角膜上皮，ボーマン膜，角膜実質層，デスメ膜，角膜内皮の５層の細胞層から成る透明な組織であり，血管は存在しないが神経は分布している。角膜上皮は，厚さ約50μｍの非角化重層扁平上皮で，眼表面の一部を構成しており，物質の透過を制限し，且つ細菌，真菌等の角膜内部への侵入を防止するバリアーとして機能する。角膜上皮のバリアー機能の維持には，最表層の細胞間に存在するタイトジャンクションが重要な役割を果たしている。

角膜上皮は再生能力があり，上皮に傷がついても，角膜上皮幹細胞から損傷を修復するための角膜上皮細胞が供給され，更に細胞間のタイトジャンクションも再生されて，バリアー機能が回復，維持される。

角膜上皮のバリアー機能が不可逆的に損なわれる角膜疾患に対しては，角膜移植が有効な治療法として普及している。角膜移植には大きく分けて，角膜全層を移植する全層角膜移植と，角膜組織の一部を移植するものがある。全層角膜移植には，角膜全層切開に起因する眼球の脆弱性等の問題があるので，近年は，角膜組織の一部を移植する手法が普及しつつある。このような角膜組織の一部を移植する手法として，角膜実質の一部と角膜上皮とを同時に移植する表層角膜移植及び角膜上皮のみを移植する角膜上皮移植があり，これらの手法は，再発性の角膜ジストロフィー患者等を対象に，既に臨床の場において確立されている。

角膜輪部組織の基底部には，角膜上皮細胞への分化能を有する角膜上皮幹細胞が存在する。従って，角膜輪部組織が障害を受けると，角膜上皮細胞を修復するための角膜上皮幹細胞が供給されなくなる。また，角膜上皮が広範囲に障害を受けた場合には，角膜上皮幹細胞から損傷を修復するために必要な量の角膜上皮細胞が供給されるまでに時間がかかる。また角膜上皮細胞の細胞外基質であるボーマン膜が障害を受けている場合には，角膜上皮細胞が接着不良を起こし，角膜上皮に十分な細胞が供給できない。このようにして，角膜上皮が数週間以上に亘って修復されず，そのバリアー機能が損なわれた状態が継続すると，眼表面が細菌により感染され易くなる。一旦眼表面に感染が起こると，結膜上皮が血管新生を伴って眼表面を覆い，また，免疫細胞の遊走により，炎症が発生する。更には，細菌が分泌する酵素によって角膜組織が破壊され，失明に至る場合もある。このように，角膜上皮幹細胞の供給の不能又は低下により発生する疾患を角膜上皮幹細胞疲弊症という。角膜上皮幹細胞疲弊症により炎症を起こした角膜に対する角膜上皮移植は，拒絶反応により生着率が低い。

また，角膜上皮移植には，需要を満たす移植用の角膜上皮が得られないというドナー不足の問題もある。このドナー不足に対しては，角膜上皮細胞をin vitroで培養して細胞シートを作製し，このシートを角膜上皮の損傷部位へ移植する方法が考えられている。このようなヒト角膜上皮シートを損傷部位へ移植する場合も，移植部位の炎症が問題となる。そこで，炎症を抑制してヒト角膜上皮シートを移植する方法として，ヒト角膜上皮シートを羊膜上に形成させて，羊膜層を有するヒト角膜上皮シートを作製し，これを移植する方法が試みられている。

羊膜上に細胞シートを形成させる手法として，健常な白色家兎の角膜上皮輪部片をヒト基質羊膜（羊膜上皮細胞を剥離除去した羊膜）上に播種し，支持細胞（NIH-3T3細胞）と共に培養する方法が報告されている（非特許文献１）。ここで得られたヒト角膜上皮シートは，形態学的にも生体角膜上皮に類似した層構造を有することが確認されている。健常なヒト角膜上皮輪部片を用いて同様の手法によりヒト角膜上皮シートを作製し，これを難治性眼表面疾患患者に移植する臨床試験が行われ，かかる手法により得られたヒト角膜上皮シートの移植が，眼機能回復手段として有効であることが示されている（非特許文献２，非特許文献３）。

また，羊膜上に細胞シートを形成させる手法として，健常な白色家兎又はヒトの角膜上皮輪部片を酵素処理して角膜上皮細胞を懸濁させ，これをヒト基質羊膜（羊膜上皮細胞を剥離除去した羊膜）上に播種し，支持細胞（NIH-3T3細胞）と共に培養する方法が報告されている（特許文献１，非特許文献４）。ここで得られたヒト角膜上皮シートも，形態学的にも生体角膜上皮に類似した層構造を有することが確認されている。また，ヒト角膜上皮シートの培養過程で，培養細胞の表面を気相に暴露させて培養することにより（air-lifting），タイトジャンクション関連蛋白質の発現が誘導されることが確認されている。

ＷＯ２００４／０７８２２５

Koizumi N. et al., Cornea, 19, 65-71 (2000) Koizumi N. et al., Archives of Ophthalmology, 119, 298-300 (2001) Koizumi N. et al., The American Academy of Ophthalmology, 108, 1569-74 (2001) Koizumi N. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci, 43, 2114-21 (2002)

上記背景の下で，本発明の目的は，効率良く品質の安定したヒト角膜上皮シートを製造する方法を提供することである。

上記目的に向けた研究において，本発明者らは，ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞を，支持細胞としてヒト間葉系幹細胞を用いて，ROCK阻害剤，ホスホジエステラーゼ阻害剤，ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ−β受容体阻害剤を種々組合わせて加えた培地中で培養できること，更には，該培養で得られたヒト角膜上皮細胞を，ヒト羊膜上で培養することにより，ヒト角膜上皮細胞シートを効率良く製造できることを見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を提供する。
（１）ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞の製造方法であって，
細胞を通過させない微細孔を有する膜により第１の室と第２の室に仕切られた培養容器の，該第１の室に支持細胞を加え，該第２の室にヒト角膜上皮細胞を加えて，ROCK阻害剤及びホスホジエステラーゼ阻害剤を含有する第１の培地を用いて該ヒト角膜上皮細胞を培養し，次いで，ホスホジエステラーゼ阻害剤，ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ−β受容体阻害剤を含有する第２の培地を用いて該ヒト角膜上皮細胞を培養することを含む，製造方法。
（２）該培養容器が，該微細孔を有する膜により，上側の室と下側の室の，上下に２室に仕切られたものである，上記（１）に記載の製造方法。
（３）該下側の室が該第１の室であり，該上側の室が該第２の室であり，該ヒト角膜上皮細胞を，該微細孔を有する膜の上で培養するものである，上記（２）に記載の製造方法。
（４）ヒト角膜上皮細胞を，該細胞を通過させない微細孔を有する膜であって該培養容器内に支持されたものである膜の上で，該支持細胞と直接接触させることなく，培養するものである，上記（３）に記載の製造方法。
（５）該第１の培地に含有される該ROCK阻害剤がY27632であり，該第１及び該第２の培地に含有される該ホスホジエステラーゼ阻害剤が3-イソブチル-1-メチルキサンチンであり，該第２の培地に含有されるＭＡＰキナーゼ阻害剤がSB203580，若しくはSB239063，又はこれらの組合せから選択されるものであり，該第２の培地に含有されるＴＧＦ−β受容体阻害剤が，SB431542，LY364947，若しくはA83-01，又はこれらの組合せから選択されるものである，上記（１）〜（４）の何れかに記載の製造方法。
（６）該第１の培地に含有される該ROCK阻害剤がY27632であり，該第１及び該第２の培地に含有される該ホスホジエステラーゼ阻害剤が3-イソブチル-1-メチルキサンチンであり，該第２の培地に含有されるＭＡＰキナーゼ阻害剤がSB203580であり，該第２の培地に含有されるＴＧＦ−β受容体阻害剤が，SB431542である，上記（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。
（７）該第１の培地に含有されるY27632の濃度が1〜20μMであり，該第１及び該第２の培地に含有される3-イソブチル-1-メチルキサンチンの濃度が50〜150μMであり，該第２の培地に含有されるSB203580の濃度が0.2〜2μMであり，SB431542の濃度が0.2〜2μMである，上記（６）に記載の製造方法。
（８）該第１の培地に含有されるY27632の濃度が約10μMであり，該第１及び該第２の培地に含有される3-イソブチル-1-メチルキサンチンの濃度が約100μMであり，該第２の培地に含有されるSB203580の濃度が約1μMであり，SB431542の濃度が約1μMである，上記（６）に記載の製造方法。
（９）該支持細胞が，ヒト間葉系幹細胞である，上記（１）〜（８）の何れかに記載の製造方法。
（１０）上記（１）〜（９）の何れかに記載の製造方法で得られた細胞を，細胞凍結液に懸濁して凍結し，凍結細胞とする工程を更に含む，製造方法。
（１１）上記（１）〜（１０）の何れかに記載の製造方法で得られるヒト角膜上皮細胞に由来する細胞。
（１２）上記（１０）に記載の製造方法で得られる凍結されたヒト角膜上皮細胞に由来する細胞。
（１３）ヒト角膜上皮シートの製造方法であって，
上記（１１）に記載のヒト角膜上皮細胞に由来する細胞にあってはその解凍後に，上記（１１）又は（１２）に記載のヒト角膜上皮細胞に由来する細胞を，支持細胞を含んだ培養容器中で，該支持細胞を通過させない微細孔を有する膜であって該培養容器内に支持されたものである膜の上に置かれた基質羊膜上で，ROCK阻害剤を含有する第３の培地を用いて培養し，次いで，ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ−β受容体阻害剤を含有する第４の培地を用いて培養して，該基質羊膜上で該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞からなる細胞層を形成させるステップと，次いで，該細胞層の表面の全部又は一部が培地に覆われない状態で，該第４の培地を用いて培養するステップとを含む，製造方法。
（１４）該基質羊膜が，羊膜上皮を剥離した側を上に向けて該培養容器中に置かれるものである，上記（１３）に記載の製造方法。
（１５）該第３の培地に含有される該ROCK阻害剤がY27632であり，該第４の培地に含有されるＭＡＰキナーゼ阻害剤がSB203580であり，該第４の培地に含有されるＴＧＦ−β受容体阻害剤がSB431542である，上記（１３）又は（１４）に記載の製造方法。
（１６）該第３の培地に含有されるY27632の濃度が1〜20μMであり，該第４の培地に含有されるSB203580の濃度が0.2〜2μMであり，該第４の培地に含有されるSB431542の濃度が0.2〜2μMである，上記（１５）に記載の製造方法。
（１７）該第３の培地に含有されるY27632の濃度が約10μMであり，該第４の培地に含有されるSB203580の濃度が約1μMであり，SB431542の濃度が約1μMである，上記（１５）に記載の製造方法。
（１８）該支持細胞が，ヒト間葉系幹細胞である，上記（１３）〜（１７）の何れかに記載の製造方法。
（１９）上記（１３）〜（１８）の何れかに記載の製造方法で得られる，該基質羊膜と該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞とからなるヒト角膜上皮シート。
（２０）該基質羊膜の羊膜上皮を剥離した側の面積の95％以上が，該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞により形成された細胞層で覆われているものである，上記（１９）に記載のヒト角膜上皮シート。
（２１）該細胞層の90％以上が二層以上の細胞層からなる重層構造を有する，上記（２０）に記載のヒト角膜上皮シート。
（２２）該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞の98％以上がサイトケラチンAE1/AE3陽性であり，80％以上がサイトケラチン12陽性である，上記（１９）〜（２１）に記載の何れかのヒト角膜上皮シート。
（２３）該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞の99％以上がサイトケラチンAE1/AE3陽性であり，85％以上がサイトケラチン12陽性である，上記（１９）〜（２１）に記載の何れかのヒト角膜上皮シート。
（２４）角膜疾患の治療用の上記（１９）〜（２３）に記載のヒト角膜上皮シート。
（２５）該角膜疾患が，角膜上皮のバリアー機能が不可逆的に損なわれる疾患である，上記（２４）に記載のヒト角膜上皮シート。
（２６）該角膜疾患が，角膜ジストロフィー，スティーブンス・ジョンソン症候群，化学外傷及び角膜上皮幹細胞疲弊症からなる群から選択されるものである，上記（２４）に記載のヒト角膜上皮シート。
（２７）基質羊膜の表面の99.5％以上が，ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞により形成された細胞層で覆われているものであり，該細胞の98％以上がサイトケラチンAE1/AE3陽性であり，該細胞の80％以上がサイトケラチン12陽性であり，該細胞層の95％以上が四層以上の細胞層からなる重層構造を有し，該細胞層の表面の90％以上が扁平な細胞で覆われており，該細胞層内における線維芽細胞の比率が0.1％未満である，ヒト角膜上皮シート。

本発明によれば，再発性の角膜ジストロフィー等の角膜疾患の患者に移植し得る，品質の安定したヒト角膜上皮シートを，安定して供給することができるので，角膜上皮移植のドナー不足を解消し得る。

HE染色したヒト角膜上皮シートの表面の拡大図である（観察倍率100倍）。 HE染色したヒト角膜上皮シートの断面の拡大図である（観察倍率200倍）。Ａは表層の扁平な細胞，Ｂはヒト角膜上皮細胞に由来する細胞から形成された細胞層，Ｃは基質羊膜をそれぞれ示す。（１）サイトケラチンAE1/AE3陽性細胞をFACSで検出した図を示す。縦軸は細胞数，横軸はAlexa Fluor（登録商標） 488色素に由来する蛍光強度を示す。（Ａ）はコントール，（Ｂ）は抗サイトケラチンAE1/AE3抗体で染色した細胞の蛍光強度をそれぞれ示す。（２）サイトケラチン12陽性細胞をFACSで検出した図を示す。縦軸は細胞数，横軸はAlexa Fluor（登録商標） 647色素に由来する蛍光強度を示す。（Ｃ）はコントール，（Ｄ）は抗サイトケラチン12抗体で染色した細胞の蛍光強度をそれぞれ示す。実施例におけるヒト角膜上皮細胞の初代培養（P0培養）における培養容器のセッティングを模式的に示す図。別法によって得たヒト角膜上皮由来細胞を用いて製造したヒト角膜上皮シートの表面をHE染色した拡大図である（観察倍率100倍）。別法によって得たヒト角膜上皮由来細胞を用いて製造したヒト角膜上皮シートの断面をHE染色した拡大図である（観察倍率200倍）。Ａは表層の扁平な細胞，Ｂはヒト角膜上皮細胞に由来する細胞から形成された細胞層，Ｃは基質羊膜をそれぞれ示す。ヒト角膜上皮細胞の培養時における，各種ＭＡＰキナーゼ阻害剤とＴＧＦ−β受容体阻害剤の組合せのヒト角膜上皮細胞の増殖促進効果を示す図。縦軸は，コントロール群（NA）の吸光度（OD450）を100%としたときの，各群の吸光度の相対値（%）を示す。エラーバーは標準偏差を示す。

本発明におけるヒト角膜上皮細胞に由来する細胞の製造方法において，当該細胞を製造するために用いるヒト角膜上皮細胞は，ヒト角膜輪部又は，ヒト角膜上皮組織及び角膜輪部を含む組織切片を蛋白質分解酵素で処理して得られる。角膜輪部は，強膜から角膜へ移行する部分であり，角膜上皮細胞への分化能を有する幹細胞を含む。このときに用いられる蛋白質分解酵素は，好ましくは，ディスパーゼである。蛋白質分解酵素による処理は，好ましくは，まず組織切片をディスパーゼで処理し，組織切片の表面から細胞（又は細胞塊）を遊離させて懸濁液とする。このとき用いるディスパーゼ溶液は，好ましくは0.5〜2.0 U/mLの濃度のディスパーゼを含有するPBS又は後述する初代培養基本培地である。

また，ディスパーゼでの処理は，37℃で1時間振とう機で緩やかに振とうさせるか，又は4℃で12〜18時間，細胞を静置して行われる。特に，ディスパーゼ溶液として0.5〜2.0 U/mLの濃度のディスパーゼを含有する初代培養基本培地を用いる場合，ディスパーゼでの処理は，好ましくは4℃で12〜18時間静置した後37℃で40〜80分間，より好ましくは4℃で14〜16時間静置した後37℃で50〜70分間，更に好ましくは4℃で15〜20時間静置した後37℃で60分間細胞を静置して行われる。また，このときの初代培養基本培地としてはCnT-20（CELLEnTEC社）が好適に用いられる。

本発明において，上記蛋白質分解酵素による処理で得られたヒト角膜上皮細胞は，細胞を通過をさせない微細孔を有する膜（支持膜）により第１の室と第２の室に仕切られた培養容器であって，該第１の室に支持細胞を加えた培養容器の，該第２の室において， ROCK阻害剤を含有する第１の培地を用いて培養され，次いで，ホスホジエステラーゼ阻害剤，ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ−β受容体阻害剤を含有する第２の培地を用いて培養される。本発明において，この一連の培養を，ヒト角膜上皮細胞の初代培養（P0培養）という。

本発明の一実施形態において，上記蛋白質分解酵素による処理で得られたヒト角膜上皮細胞は，好ましくは，支持細胞を含んだ培養容器中で，細胞を通過させない微細孔を有する膜（支持膜）であって下側面が該支持細胞と接触しないように該培養容器内に支持されたものである膜の上で，該支持細胞と直接接触させることなく，ROCK阻害剤を含有する第１の培地を用いて培養され，次いで，ホスホジエステラーゼ阻害剤，ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ−β受容体阻害剤を含有する第２の培地を用いて培養される。上記と同様に，この一連の培養を，ヒト角膜上皮細胞の初代培養（P0培養）という。

本発明において，ヒト角膜上皮細胞及び支持細胞を培養するために用いられる培養容器は，哺乳動物細胞を培養できるものである限り特に制限はないが，細胞を固着させて培養できるものが好ましい。培養容器は，後に詳述する細胞を通過させない微細孔を有する膜により，第１の室と第２の室に仕切られる。当該膜は，細胞を通過させることがないので，培養容器中で，ヒト角膜上皮細胞と支持細胞が直接接触することはなく，これらの細胞が混じり合うことはない。当該膜は，培養容器の形状が平底のものである場合，平底の底面に垂直に設けてもよく，また，水平に設けてもよい。当該膜が平底の底面に垂直に設けられた場合，ヒト角膜上皮細胞と支持細胞は，共に培養容器の底面上で培養される。当該膜が平底の底面に水平に設けられた場合，ヒト角膜上皮細胞と支持細胞は，何れか一方が培養容器の底面上で，他の一方が当該膜上で培養される。

培養容器の形状が平底の培養容器としては，例えば，市販のセルカルチャープレート（２４ウェルプレート，１２ウェルプレート，６ウェルプレート等）がある。また，培養容器の底面は，細胞が固着し易いように，フィブロネクチン，コラーゲン（コラーゲンI型，IV型等），ラミニン等の細胞接着性糖タンパク質，又はこれら細胞接着性糖タンパク質の細胞接着活性部位（ＲＧＤ配列）を含むペプチドでコーティングされていることが好ましい。支持細胞として用いられるＮＩＨ３Ｔ３細胞又はヒト間葉系幹細胞をこのような培養容器上で培養すると，支持細胞は，当該容器の底面に固着する。

上述したとおり培養容器の内部は，微細孔を有し且つ支持細胞を通過させない膜（支持膜）が取り付けられ，この膜により２室に仕切られている。好ましい態様では，この膜は，培養容器の内部に，培養容器の底面と概ね水平に，その下側に支持細胞の培養スペースを確保でき且つその下側面が支持細胞と接触しないように取り付けられる。支持膜の材質としては，ポリエチレンテレフタレート及びポリカーボネートが好適であり，ポリエチレンテレフタレートが特に好適である。この膜が有する微細孔は，支持細胞の（及び更にヒト角膜上皮細胞の）通過は阻止するが，培地に溶質として含まれる液性成分は通過することができる孔径のものである。微細孔の孔径は，好ましくは，0.1〜1.5μｍ，より好ましくは0.2〜1.2μｍ，更に好ましくは0.4〜1.0μｍである。支持細胞は（及びヒト角膜上皮細胞も）これらの孔径を大きく超えるサイズであるため，浮遊するものがあっても支持膜を通過できないが，培地，及び支持細胞から分泌される成長因子等の液性成分は，支持膜を通過できる。従って，培養容器中で角膜上皮細胞と支持細胞が直接接触することはない。また，支持膜は，予めフィブロネクチン，コラーゲン（コラーゲンI型，IV型等），ラミニン等の細胞接着性糖タンパク質，又はこれら細胞接着性糖タンパク質の細胞接着活性部位（ＲＧＤ配列）を含むペプチドでコーティングされていることが好ましい。

実施例に則して，本発明におけるヒト角膜上皮細胞の初代培養における培養容器のセッティングの一例を模式的に図４に示した。図４において，培養容器（６ウェルコンパニオンプレート）は，微細孔を有する膜により，下側の室(第１の室)と上側の室(第２の室)の，上下に仕切られている。第１の室には支持細胞としてヒト間葉系幹細胞が加えられ，第２の室にはヒト角膜上皮細胞が加えられ，ヒト間葉系幹細胞は第１の室中で培養容器の底面で培養され，ヒト角膜上皮細胞は第２の室中で微細孔を有する膜上で培養されている。細胞は，微細孔を有する膜を通過できないが，培地，及び支持細胞から分泌される成長因子等の液性成分は，微細孔を通過することができる。

本発明において，支持細胞というときは，ヒト角膜上皮細胞（又はヒト角膜上皮細胞に由来する細胞）の初代培養又は角膜上皮シートの製造の際に，ヒト角膜上皮細胞（又はヒト角膜上皮細胞に由来する細胞）の増殖を促進するために用いられる細胞のことをいう。支持細胞は，培地中に不足する栄養分や特殊な成長因子を補給等することにより，細胞の増殖を促進する機能を有する。支持細胞として使用できる細胞としては，ヒト角膜上皮細胞（又はヒト角膜上皮細胞に由来する細胞）の増殖を促進できるものである限り，特に制限はないが，ＮＩＨ３Ｔ３細胞，ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞，Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３，間葉系幹細胞等が好適であり，間葉系幹細胞が特に好適である。支持細胞は，異種蛋白質の混入を防止する観点から，ヒト由来の細胞がより好ましい。

なお，本発明において，間葉系幹細胞（MSC）というときは，未分化の状態で増殖し，少なくとも2種類の細胞へ分化することが可能な，間葉に由来する幹細胞又はその前駆細胞のことをいう。間葉系幹細胞から分化誘導される細胞は，例えば骨芽細胞，軟骨芽細胞，脂肪芽細胞である。

MSCは，骨髄，脂肪組織，歯髄，臍帯血，胎盤，羊膜等，種々の組織から取得できることが知られている。本発明において使用するMSCは，これら取得先の組織に関わらず，いずれのものでも使用できるが，好ましくは，骨髄由来のMSCである。また，本発明において使用するMSCは, 好ましくはヒト間葉系幹細胞（hMSC）である。hMSCは，種々の方法により取得できるが，例えば骨髄由来のhMSCの場合，特許文献（特表平7-500001）等に記載の手法で取得することができる。

本発明において用いられるhMSCは，表面抗原の発現パターンにより更に特定することができ，特異的抗体を用いたフローサイトメトリー解析をした場合，好ましくは，CD29，CD44及びCD105が陽性であり，CD34及びCD45が陰性であり，より好ましくは，CD29，CD44，CD73，CD90及びCD105が陽性であり，CD34及びCD45が陰性であり，更に好ましくは，CD29，CD44，CD73，CD90，CD105及びCD166が陽性であり，CD34及びCD45が陰性であり，更により好ましくは，CD29，CD44，CD49a，CD49e，CD73，CD90，CD105及びCD166が陽性であり，CD34及びCD45が陰性である。

ヒト角膜上皮細胞の初代培養は，好ましくは，支持膜上に上記の蛋白質分解酵素による処理で得られたヒト角膜上皮細胞を添加して，支持膜を挟んで上側にヒト角膜上皮細胞（又はヒト角膜上皮細胞に由来する細胞），下側に支持細胞（但し，膜とは非接触である）が存在する状態で行われる。培養時には，支持膜上に添加されたヒト角膜上皮細胞が培地に完全に覆われるように培地が容器に加えられる。この場合，支持細胞は培養容器の底面で培養され，ヒト角膜上皮細胞は微細孔を有する膜（支持膜）上で培養される。このとき，支持細胞のある支持膜の下側が培養容器の第１の室となり，ヒト角膜上皮細胞のある上側が培養容器の第２の室となる。培養中，支持細胞に由来する成長因子等の成分が，支持膜の微細孔を通して，支持膜の上側にも供給される。このとき，ヒト角膜上皮細胞は，支持膜上で支持膜の表面に固着して培養されることが好ましい。

本発明において，ヒト角膜上皮細胞の初代培養は，支持膜を挟んで下側にヒト角膜上皮細胞（又はヒト角膜上皮細胞に由来する細胞），上側に支持細胞が存在する状態で行うこともできる。この場合，支持細胞は微細孔を有する膜上で培養され，ヒト角膜上皮細胞は培養容器の底面で培養される。このとき，ヒト角膜上皮細胞は，培養容器の底面に固着して培養されることが好ましい。またこのとき，支持細胞のある支持膜の上側が培養容器の第１の室となり，ヒト角膜上皮細胞のある下側が培養容器の第２の室となる。

初代培養（P0培養）の開始時において，ヒト角膜上皮細胞は，培養容器の底面又は支持膜上で，好ましくは1X10⁴〜1X10⁵個/cm²，より好ましくは4X10⁴〜6X10⁴個/cm²，更に好ましくは約5X10⁴個/cm²となるように培養容器中に加えられる。

本発明において，単に細胞というときは，広く哺乳動物細胞全般を包含するものを意味し，特に支持細胞及びヒト角膜上皮細胞（又はヒト角膜上皮細胞に由来する細胞）を合わせたものを意味する。

ヒト角膜上皮細胞の初代培養において，ヒト角膜上皮細胞は，ROCK阻害剤を含有する第１の培地を用いて培養し，次いで，ホスホジエステラーゼ阻害剤，ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ−β受容体阻害剤を含有する第２の培地を用いて培養される。初代培養における第１の培地，第２の培地とも，基本となる培地（初代培養基本培地）は，アミノ酸，ビタミン，無機塩類，及びその他の成分を含有する。初代培養基本培地に含まれるアミノ酸の種類及び濃度は，表１で示したものから適宜選択することができる。

初代培養基本培地に含まれるビタミンの種類及び濃度は，表２で示したものから適宜選択することができる。

初代培養基本培地に含まれる無機塩類の種類及び濃度は，表３で示したものから適宜選択することができる。

表３に示したものに加えて，培地には，適宜，亜セレン酸ナトリウム，モリブデン酸アンモニウム，塩化マンガン，硫酸ニッケル，塩化スズ，ケイ酸ナトリウム等の無機塩類を添加することができる。培地に亜セレン酸ナトリウム[Na₂SeO₃］を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.003〜0.02mg/Lであり，より好ましくは約0.005mg/Lである。培地にモリブデン酸アンモニウム[(NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O]を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.0005〜0.002mg/Lであり，より好ましくは約0.001mg/Lである。培地に塩化マンガン[MnCl₂・4H₂O]を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.0001〜0.0004mg/Lであり，より好ましくは約0.0002mg/Lである。培地に硫酸ニッケル[NiSO₄・6H₂O]を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.0001〜0.0005mg/Lであり，より好ましくは約0.0003mg/Lである。培地に塩化スズ[SnCl₂・2H₂O]を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.00005〜0.0002 mg/Lであり，より好ましくは約0.0001mg/Lである。培地にケイ酸ナトリウム[Na₂SiO₃・9H₂O] を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.0001〜0.2mg/Lであり，より好ましくは約0.14 mg/Lである。

初代培養基本培地に含まれるその他の成分の種類及び濃度は，表４で示したものから適宜選択することができる。

初代培養基本培地には，上皮増殖因子（EGF），塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF），インスリン，トランスフェリン等の成長因子，アデニン，L-エタノールアミン，ヒドロコルチゾン，D,L-リポ酸，ピルビン酸ナトリウム，ホスホリルエタノールアミン，ヘパリン，アドレナリン等から選択されるその他の成分を，一種又はニ種以上，適宜添加することもできる。培地にEGFを添加する場合，その濃度は，好ましくは1〜50ng/mLであり，より好ましくは5〜40ng/mLである。培地にbFGFを添加する場合，その濃度は，好ましくは1〜20ng/mLであり，より好ましくは3〜7ng/mLである。培地にインスリンを添加する場合，その濃度は，好ましくは1〜200μg/mLであり，より好ましくは2〜100μg/mLである。トランスフェリンを添加する場合，その濃度は，好ましくは1〜200μg/mLであり，より好ましくは2〜20μg/mLである。培地にアデニンを添加する場合，その濃度は，好ましくは15〜35mg/Lであり，より好ましくは20〜30mg/Lである。培地にL-エタノールアミンを添加する場合，その濃度は，好ましくは2.5〜4mg/Lであり，より好ましくは3〜3.5mg/Lである。培地にヒドロコルチゾンを添加する場合，その濃度は，好ましくは0.1〜1.0mg/Lであり，より好ましくは0.3〜0.7mg/Lである。培地にD,L-リポ酸を添加する場合，その濃度は，好ましくは20〜40mg/Lであり，より好ましくは25〜30mg/Lである。培地にピルビン酸ナトリウムを添加する場合，その濃度は，好ましくは40〜65mg/Lであり，より好ましくは50〜60 mg/Lである。培地にホスホリルエタノールアミンを添加する場合，その濃度は，好ましくは0.02〜0.12 mg/Lであり，より好ましくは0.05〜0.10mg/Lである。培地にヘパリンを添加する場合，その濃度は，好ましくは１〜570 IU/Lであり，培地にアドレナリンを添加する場合，その濃度は，好ましくは0.1〜2μMである。

初代培養基本培地として，ヒト角膜上皮継代用無血清培地であるCnT-20培地（CELLEnTEC社）を好適に使用することができる。また，初代培養基本培地は，特表2000-506374，特表2000-517188等の特許文献に開示された培地組成に基づいて，適宜作製することもできる。

初代培養における第１の培地は，初代培養基本培地にROCK阻害剤及びホスホジエステラーゼ阻害剤を添加したものである。このとき初代培養基本培地に添加することのできるROCK阻害剤に特に限定はないが，下記の化学式（I）で示されるY27632を好適に用いることができ，その培地中における好適な濃度は，1〜20μMであり，特に約10μMである。また，このとき初代培養基本培地に添加することのできるホスホジエステラーゼ阻害剤に特に限定はないが，3-イソブチル-1-メチルキサンチンが好適に用いられ，その培地中における好適な濃度は，50〜150μMであり，特に約100μMである。また，２又はそれ以上のROCK阻害剤を組合わせて用いることもでき，２又はそれ以上のホスホジエステラーゼ阻害剤を組合わせて用いることもできる。

（I）

初代培養における第２の培地は，初代培養基本培地にホスホジエステラーゼ阻害剤，ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ−β受容体阻害剤を添加したものである。このとき初代培養基本培地に添加することのできるホスホジエステラーゼ阻害剤に特に限定はないが，3-イソブチル-1-メチルキサンチンが好適に用いられ，その培地中における好適な濃度は，50〜150μMであり，特に約100μMである。また，２又はそれ以上のホスホジエステラーゼ阻害剤を組合わせて用いることもできる。

また，初代培養基本培地に添加することのできるＭＡＰキナーゼ阻害剤に特に限定はないが，下記の化学式（II）で示されるSB203580，又は下記の化学式（III）で示されるSB239063が好適に用いられる。SB203580を用いるとき，その培地中における好適な濃度は，0.2〜2μMであり，特に約1.0μMである。また，２又はそれ以上のＭＡＰキナーゼ阻害剤を組合わせて用いることもできる。

（II）

（III）

また，初代培養基本培地に添加することのできるＴＧＦ−β受容体阻害剤に特に限定はないが，下記の化学式（IＶ）で示されるSB431542，下記の化学式（Ｖ）で示されるLY364947，又は下記の化学式（ＶI）で示されるA83-01が好適に用いられ，特にSB431542又はLY364947が好適に用いられる。SB431542を用いるとき，その培地中における好適な濃度は，0.2〜2μMであり，特に約1.0μMである。また，２又はそれ以上のＴＧＦ−β受容体阻害剤を組合わせて用いることもできる。

（IＶ）

（Ｖ）

（ＶI）

本発明において，ヒト角膜上皮細胞を培養し増殖させて得られた細胞を，ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞（ヒト角膜上皮由来細胞）というが，便宜上，これを単にヒト角膜上皮細胞というときもある。ヒト角膜上皮細胞の初代培養は，ヒト角膜上皮由来細胞が，好ましくは支持膜表面の70%以上を占めるまで，より好ましくは85%以上を占めるまで，更に好ましくは90%以上を占めるまで行われる。ヒト角膜上皮細胞の初代培養で得られた細胞は，ヒト角膜上皮シートの製造に用いることができる。

初代培養により得られたヒト角膜上皮由来細胞は，凍結して保存することができる。凍結に際しては，ヒト角膜上皮由来細胞を培養容器又は膜上でPBSを用いて洗浄し，次いで蛋白質分解酵素で処理して細胞を培養容器又は膜から剥離し，剥離させた細胞を細胞凍結保存液に懸濁して細胞懸濁液とする。この細胞懸濁液を液体窒素中で凍結状態で保存する。このとき用いられる蛋白質分解酵素は，好ましくはコラゲナーゼＡである。

ヒト角膜上皮由来細胞の凍結保存に用いる細胞凍結保存液は，例えば，ジメチルスルホキシド（DMSO），ウシ胎児血清（FCS），天然高分子化合物又は有機合成高分子化合物，単糖又は二糖，及び緩衝液を含有する水溶液である。但し，天然高分子化合物又は有機合成高分子化合物は任意の成分であり，細胞の状態により，適宜添加される。細胞凍結保存液に含まれるDMSOの濃度は，好ましくは5〜15%（v/v）である。細胞凍結保存液に含まれるウシ胎児血清の濃度は，好ましくは50〜90%（v/v）である。細胞凍結保存液に含まれる天然高分子化合物は，好ましくはデキストラン，グリコーゲン，メチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースであり，その濃度は，好ましくは0.1〜1.0%（v/v）である。細胞凍結保存液に含まれる有機合成高分子化合物は，好ましくはポリエチレングリコール，ポリビニルピロリドンであり，その濃度は，好ましくは1〜10%（v/v）である。細胞凍結保存液に含まれる単糖は，好ましくはグルコースであり，その濃度は，好ましくは1〜10%（w/v）である。細胞凍結保存液に含まれるニ糖は，好ましくはショ糖であり，その濃度は，好ましくは1〜10%（w/v）である。緩衝液としては，炭酸緩衝液，リン酸緩衝液，HEPES等を好適に用いることができる。

好ましい細胞凍結保存液の組成として，例えば，75%（v/v）ウシ胎児血清，10%（v/v）DMSO，3%（w/v）グルコース，0.08%（w/v）炭酸水素ナトリウム，0.036%（w/v）HEPES，
0.1575%（w/v）RPMI1640粉末培地（粉末）を含有する水溶液が挙げられる。市販の細胞凍結保存液であるセルバンカー（日本全薬工業社），又はCnT-CRYO-50（CELLnTEC社）は，ヒト角膜上皮由来細胞の凍結保存に好適に用いることができる。

また，ヒト角膜上皮由来細胞の細胞凍結液中における濃度は，好ましくは0.5X10⁵〜1.5X10⁶個/mLであり，より好ましくは1X10⁵〜1X10⁶個/mLである。

本発明において，凍結して保存したヒト角膜上皮由来細胞は，解凍してヒト角膜上皮シートの製造に用いることができる。従って，ヒト角膜上皮由来細胞を凍結して大量に保存しておくことにより，ヒト角膜上皮シートを製造する際に，必要に応じてこれを解凍して使用することができるので，安定してヒト角膜上皮シートを供給することが可能となる。

本発明において，ヒト角膜上皮シートの製造は，ヒト角膜上皮細胞の初代培養で得られた細胞（ヒト角膜上皮由来細胞）を，支持細胞を含んだ培養容器中で，該支持細胞を通過させない微細孔を有する膜であって下側面が該支持細胞と接触しないように該培養容器内に支持されたものである膜の上に置かれた基質羊膜上で，ROCK阻害剤を含有する第３の培地を用いて培養し，次いで，ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ−β受容体阻害剤を含有する第４の培地を用いて培養することにより行われる。

ヒト角膜上皮シートの製造において，ヒト角膜上皮由来細胞は，上記手法により一旦凍結してから解凍して使用することができるだけでなく，凍結せずに使用することもできる。ヒト角膜上皮由来細胞を凍結せず使用するときは，初代培養終了後に細胞を支持膜上から蛋白質分解酵素で剥離し，これを培地に懸濁して使用する。このとき用いられる蛋白質分解酵素は，好ましくはコラゲナーゼＡである。

本発明のヒト角膜上皮シートの製造において，ヒト角膜上皮由来細胞は，培養容器の内部に取り付けられた微細孔を有し且つ支持細胞の通過を阻止することができる膜（支持膜）の上に置かれた基質羊膜上で培養される。このとき用いる支持膜は，培養容器の内部に，培養容器の底面と概ね水平に，その下側に支持細胞の培養スペースを確保でき且つその下側面が支持細胞と接触しないように取り付けられる。支持膜の材質としては，ポリエチレンテレフタレート及びポリカーボネートが好適であり，ポリエチレンテレフタレートが特に好適である。支持膜が有する微細孔は，支持細胞の（及び更にヒト角膜上皮細胞の）通過は阻止するが，培地に溶質として含まれる液性成分は通過することができる孔径のものである。微細孔の孔径は，好ましくは，0.1〜1.5μｍ，より好ましくは0.2〜1.2μｍ，更に好ましくは0.4〜1.0μｍである。支持細胞は（及びヒト角膜上皮細胞も）これらの孔径を大きく超えるサイズであるため，浮遊するものがあっても支持膜を通過できないが，培地，及び支持細胞から分泌される成長因子等の液性成分は，支持膜を通過する。また，支持膜は，予めフィブロネクチン，コラーゲン（コラーゲンI型，IV型等），ラミニン等でコートしておくことが好ましい。

また，このとき用いる基質羊膜とは，羊膜から羊膜の上皮を剥離させたものである。この基質羊膜の上皮を剥離した側の面を上側にして支持膜の全体を覆うようにして広げ，乾燥させた後，支持膜に対して固定する。従って，基質羊膜は羊膜上皮を剥離した側を上に向けて，支持膜上に培養容器中に置かれる。このとき用いる羊膜は好ましくはヒト羊膜である。また，羊膜の乾燥は風乾等の手法で行うことができる。

ヒト角膜上皮シートの製造において，ヒト角膜上皮由来細胞は，培地で懸濁させてから，好ましくは1X10⁴〜2X10⁴個/cm²の密度となるように支持膜に固定された基質羊膜上に播種される。培養時には，基質羊膜上に添加されたヒト角膜上皮細胞が培地に完全に覆われるように培地が容器に加えられる。すなわち，当該膜を挟んで下側に支持細胞（但し，膜とは非接触である），上側に基質羊膜とヒト角膜上皮由来細胞が存在する状態で培養が行われる。培養中，支持細胞に由来する成長因子等の成分が，膜の微細孔を通して，膜の上側にも供給される。

ヒト角膜上皮シートの製造において，基質羊膜上に播種されたヒト角膜上皮由来細胞の培養は，ROCK阻害剤及びホスホジエステラーゼ阻害剤を添加した第３の培地を用いて開始される。この第３の培地の基本となる培地（ヒト角膜上皮シート製造用基本培地）は，アミノ酸，ビタミン，無機塩類，及びその他の成分を含有する。ヒト角膜上皮シート製造用基本培地に含まれるアミノ酸の種類及び濃度は，表５で示したものから適宜選択することができる。

ヒト角膜上皮シート製造用基本培地に含まれるビタミンの種類及び濃度は，表６で示したものから適宜選択することができる。

ヒト角膜上皮シート製造用基本培に含まれる無機塩類の種類及び濃度は，表７で示したものから適宜選択することができる。

表７に示したものに加えて，培地には，適宜，亜セレン酸ナトリウム，モリブデン酸アンモニウム，塩化マンガン，硫酸ニッケル，塩化スズ，ケイ酸ナトリウム等の無機塩類を添加することができる。培地に亜セレン酸ナトリウム[Na₂SeO₃］を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.003〜0.02mg/Lであり，より好ましくは約0.005mg/Lである。培地にモリブデン酸アンモニウム[(NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O]を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.0005〜0.002mg/Lであり，より好ましくは約0.001mg/Lである。培地に塩化マンガン[MnCl₂・4H₂O]を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.0001〜0.0004 mg/Lであり，より好ましくは約0.0002mg/Lである。培地に硫酸ニッケル[NiSO₄・6H₂O]を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.0001〜0.0005mg/Lであり，より好ましくは約0.0003mg/Lである。培地に塩化スズ[SnCl₂・2H₂O]を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.00005〜0.0002 mg/Lであり，より好ましくは約0.0001mg/Lである。培地にケイ酸ナトリウム[Na₂SiO₃・9H₂O] を添加する場合，その濃度は，好ましくは0.0001〜0.2mg/Lであり，より好ましくは約0.14mg/Lである。

ヒト角膜上皮シート製造用基本培地に含まれるその他の成分の種類及び濃度は，表８で示したものから適宜選択することができる。

ヒト角膜上皮シート製造用基本培地は，好ましくはトランスフェリン，ヒドロコルチゾン，アドレナリン，インスリン，上皮増殖因子（EGF）等を更に含む。培地がトランスフェリンを含有する場合，その濃度は，好ましくは1〜200μg/mLであり，より好ましくは3〜5μg/mLである。培地がヒドロコルチゾンを含有する場合，その濃度は，好ましくは0.8〜1.4 mg/Lであり，より好ましくは1.0〜1.2mg/Lである。培地がアドレナリンを含有する場合，その濃度は，好ましくは0.1〜2μMであり，より好ましくは0.5〜0.8μMである。培地がインスリンを含有する場合，その濃度は，好ましくは1〜200μg/mLであり，より好ましくは3〜7μg/mLである。培地がEGFを含有する場合，その濃度は，好ましくは1〜50ng/mLであり，より好ましくは5〜40ng/mLである。

ヒト角膜上皮シート製造用基本培地には，塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）等の成長因子，アデニン，L-エタノールアミン，D,L-リポ酸，ピルビン酸ナトリウム，ホスホリルエタノールアミン，ヘパリン等から選択されるその他の成分を，一種又はニ種以上，適宜添加することもできる。培地にbFGFを添加する場合，その濃度は，好ましくは1〜20ng/mLであり，より好ましくは3〜7ng/mLである。培地にアデニンを添加する場合，その濃度は，好ましくは15〜35mg/Lであり，より好ましくは20〜30mg/Lである。培地にL-エタノールアミンを添加する場合，その濃度は，好ましくは2.5〜4mg/Lであり，より好ましくは3〜3.5 mg/Lである。培地にD,L-リポ酸を添加する場合，その濃度は，好ましくは20〜40mg/Lであり，より好ましくは25〜30mg/Lである。培地にピルビン酸ナトリウムを添加する場合，その濃度は，好ましくは40〜65mg/Lであり，より好ましくは50〜60mg/Lである。培地にホスホリルエタノールアミンを添加する場合，その濃度は，好ましくは0.02〜0.12mg/Lであり，より好ましくは0.05〜0.10mg/Lである。培地にヘパリンを添加する場合，その濃度は，好ましくは１〜570 IU/Lである。

ヒト角膜上皮シート製造用基本培地として，SHEM培地とKB培地とを，１：２の割合で混ぜた培地を好適に使用することができる。また，ヒト角膜上皮シート製造用基本培地には，ウシ胎児血清（FCS）を添加することもできる。培地にウシ胎児血清を添加する場合，その濃度は，好ましくは2〜10%であり，より好ましくは4〜6%である。

ヒト角膜上皮シートの製造において使用する第３の培地は，ヒト角膜上皮シート製造用基本培地にROCK阻害剤を添加したものである。このときヒト角膜上皮シート製造用基本培地に添加することのできるROCK阻害剤に特に限定はないが，Y27632を好適に用いることができ，その培地中における好適な濃度は，1〜20μMであり，特に約10μMである。

ヒト角膜上皮シートの製造において，第３の培地を用いた培養における細胞の培養期間は，好ましくは2〜4日間，より好ましくは2〜3日間である。

第３の培地を用いた培養に引き続いて，ヒト角膜上皮由来細胞は，ヒト角膜上皮シート製造用基本培地にＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ−β受容体阻害剤を添加した第４の培地を用いて培養される。このときヒト角膜上皮シート製造用基本培地に添加することのできるＭＡＰキナーゼ阻害剤に特に限定はないが，SB203580が好適に用いられる。SB203580を用いるとき，その培地中における好適な濃度は，0.2〜2μMであり，特に約1.0μMである。また，ヒト角膜上皮シート製造用基本培地に添加することのできるＴＧＦ−β受容体阻害剤に特に限定はないが，SB431542が好適に用いられる。SB431542を用いるとき，その培地中における好適な濃度は，0.2〜2μMであり，特に約1.0μMである。

ヒト角膜上皮シートの製造における第４の培地を用いた培養における，細胞の培養期間は，好ましくは7〜14日間である。この間，培養開始から4〜6日間は2日毎に培地を交換し，次いで7〜14日間は1日毎に培地を交換することが好ましい。最後に培地を交換した後，乳酸濃度を測定しながら，乳酸濃度が，好ましくは7〜11mM，より好ましくは8〜10mMとなった時点で培地を交換する。第３の培地及び第４の培地を用いた培養により，基質羊膜上で細胞が増殖し，ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞からなる細胞層が形成される。

第４の培地を用いた培養に引き続いて，ヒト角膜上皮由来細胞は，基質羊膜の底面が浸る一方，基質羊膜上に形成されたヒト角膜上皮由来細胞に由来する細胞からなる細胞層の表面の全部又は一部が培地に覆われない状態（培養器中の気相に曝された状態）で，好ましくは2〜5日，より好ましくは3日間培養される。このように培養細胞の表面を気相に暴露させて培養する方法を，一般にair-lifting培養という。air-lifting培養において使用できる培地は，ヒト角膜上皮シート製造用基本培地にＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ−β受容体阻害剤を添加した培地であり，第４の培地を好適に用いることができる。

air-lifting培養の間，培地は好ましくは10〜24時間毎，より好ましくは12時間毎に交換される。このようにして，基質羊膜の表面上にヒト角膜上皮由来細胞からなる細胞層が形成されたヒト角膜上皮シートが得られる。

本発明において，ヒト角膜上皮シートというときは，基質羊膜の羊膜上皮を剥離した側の面（基質羊膜の表面）がヒト角膜上皮由来細胞により形成された細胞層により覆われたシートのことをいう。本発明において，ヒト角膜上皮シートは，基質羊膜の表面の好ましくは95%以上，より好ましくは98%以上，更に好ましくは99.5%以上，更により好ましくは99.8%以上がヒト角膜上皮由来細胞からなる細胞層で覆われたものであり，また，ヒト角膜上皮由来細胞からなる細胞層の，好ましくは90%以上，更に好ましくは98%以上が，二層以上の細胞からなる重層構造を有するものである。また，ヒト角膜上皮由来細胞からなる細胞層の，好ましくは95%以上が，三層以上の細胞からなる重層構造を有するものである。また，ヒト角膜上皮由来細胞からなる細胞層の，好ましくは95%以上が，四層以上の細胞からなる重層構造を有するものである。

本発明において，ヒト角膜上皮シートは，ヒト角膜上皮由来細胞からなる細胞層の表面の好ましくは90%以上が，より好ましくは98%以上が扁平な細胞で覆われたものである。

本発明において，基質羊膜の表面に形成されたヒト角膜上皮由来細胞からなる細胞層内における，線維芽細胞の比率は，好ましくは0.1%未満であり，より好ましくは0.02%未満である。

本発明において，ヒト角膜上皮シートを構成するヒト角膜上皮由来細胞は，好ましくは98%以上がサイトケラチンAE1/AE3陽性であり，80%以上がサイトケラチン12陽性であり，より好ましくは99%以上がサイトケラチンAE1/AE3陽性であり，85%以上がサイトケラチン12陽性である。

本発明において製造されたヒト角膜上皮シートは，角膜疾患の患者の治療用として，従来の角膜移植に替えて使用することができる。ヒト角膜上皮シートによる治療対象となる角膜疾患は，バリアー機能等の角膜上皮の機能が損なわれる疾患である限り特に限定はないが，特にバリアー機能等の角膜上皮の機能が不可逆的に損なわれる疾患であり，再発性の角膜ジストロフィー，スティーブンス・ジョンソン症候群，化学外傷及び角膜上皮幹細胞疲弊症等である。

以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。

〔支持細胞の調製〕
凍結保存していたヒト間葉系幹細胞（hMSC）を，37℃恒温槽ですばやく解凍し，DMEM/10% FBS培地を添加して懸濁した後，遠心して細胞を沈殿させて回収した。回収した細胞をDMEM/10% FBS培地で懸濁し，生細胞数を測定した。15000〜25000個/cm²の密度となるようにセルカルチャーインサートコンパニオンプレート 6ウェル（6ウェルコンパニオンプレート，BD Biosciences社）のボトムウェルに播種し，DMEM/10% FBS培地中で，5% CO₂存在下，1〜3日間37℃で培養した。hMSCをヒト角膜上皮細胞の初代培養（P0培養）における支持細胞として用いる直前にDMEM/10% FBS培地をボトムウェルから取り除き，角膜上皮細胞培養用培地（CELLEnTEC社）にSupplement A，Supplement B，Supplement C及び10μg/mLのゲンタマイシン（インビトロジェン社）を添加した培地（CnT-20培地）に10μMのY27632（ROCK阻害剤）（シグマ社）及び100μMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX，ホスホジエステラーゼ阻害剤）（シグマ社）を更に添加した培地をボトムウェルに1.5mL添加した。これを支持細胞添加6ウェルコンパニオンプレートとした。

〔ヒト角膜上皮細胞の初代培養（P0培養）〕
研究用ヒト角膜組織（2眼分，SightLife社製）から，実体顕微鏡下で手術用メス及び角膜用ハサミを用いて強膜，結膜などを切り落とし，角膜上皮組織及び輪部を含む組織切片を切り出した。切り出した組織切片に，ディスパーゼ溶液（1.2U/mLのディスパーゼ（三光純薬）を含有するPBS（インビトロジェン社）を添加して，37℃で1時間振とう機で緩やかに振とうした。次いで，0.02% EDTAを含むPBSで酵素反応を停止した後，組織切片を35mmシャーレ（プライムサーフェス，住友ベークライト社）に移した後，実体顕微鏡観察下で，組織切片から無鉤摂子を用いてヒト角膜上皮細胞を掻把し，細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液をエッペンチューブ（プロテオフリー，住友ベークライト）に移した後遠心し，上清を除いた後のペレットにCnT-20培地を添加して再度遠心し，細胞を回収した。回収した細胞を10μMのY27632（ROCK阻害剤）（シグマ社）及び100μMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX，ホスホジエステラーゼ阻害剤）（シグマ社）を含有するCnT-20培地（実施例における第１の培地）6mLに懸濁させた。

上記の支持細胞添加6ウェルコンパニオンプレートに，支持膜としてFNC Coating Mix（AthenaES社）でコーティングした6ウェルセルカルチャーインサート（孔径0.4μm，ポリエチレンテレフタレート製，BD Falcon Cell Culture Insert, BD Biosciences社）を静置し，次いで，この6ウェルセルカルチャーインサートの各ウェルに上記の回収したヒト角膜上皮細胞の懸濁液を0.5mLずつ（1眼から調製した細胞の1/12量）添加し，培養を開始した。培養開始3〜5時間後に，6ウェルセルカルチャーインサートに10μMのY27632（ROCK阻害剤）（シグマ社）及び100μMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX，ホスホジエステラーゼ阻害剤）（シグマ社）を含有するCnT-20培地を0.5mL添加し，更に2〜3日間培養した。次いで，培地を100μMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX，ホスホジエステラーゼ阻害剤）（シグマ社），1μMのSB203580（ＭＡＰキナーゼ阻害剤）（シグマ社）及び1μMのSB431542（ＴＧＦ−β受容体阻害剤）（シグマ社）を含むCnT-20培地（実施例における第２の培地）に交換し，2〜3日毎に培地を交換しながら細胞を培養した。この間に，ボトムウェルの支持細胞が，顕著にボトムウェルから剥離する等の変化が認められた場合は，ボトムウェルの底面に支持細胞を固着させた6ウェルコンパニオンプレートを新たに準備し，これに6ウェルセルカルチャーインサートを移して培養を継続した。以下の工程も含め，細胞の培養は5% C0₂存在下，37℃で行った。ヒト角膜上皮細胞の初代培養における培養容器のセッティングを模式的に図４に示した。図４において，６ウェルコンパニオンプレート(培養容器)は，微細孔を有する膜により，下側の室(第１の室)と上側の室(第２の室)の，上下に仕切られている。第１の室には支持細胞としてヒト間葉系幹細胞が加えられ，第２の室にはヒト角膜上皮細胞が加えられている。ヒト間葉系幹細胞は第１の室中で培養容器の底面に固着し，ヒト角膜上皮細胞は第２の室中で微細孔を有する膜上で培養されている。

〔ヒト角膜上皮由来細胞の凍結保存〕
上記ヒト角膜上皮細胞の初代培養において，6ウェルセルカルチャーインサート(支持膜)の表面の90〜100%を細胞が占める状態となった時点で培地を交換し，更に約24時間培養した。次いで，培地を捨て，6ウェルセルカルチャーインサートに10μg/mLとなるようにゲンタマイシン（インビトロゲン社）を加えたPBS溶液（G-PBS）を添加して細胞を洗浄した後，再度G-PBSを添加して37℃で約15分間静置した。次いで，1mg/mLの濃度となるようにコラゲナーゼＡ（ロシュ社製）を添加し，37℃で1〜2時間振とう機上で緩やかに振とうし，細胞を6ウェルセルカルチャーインサートから剥離させた。次いで，0.02% EDTAを含むPBSで酵素反応を停止した後，細胞を懸濁し，細胞懸濁液を遠沈管（ステムフル，住友ベークライト社）に移し，遠心して細胞を沈殿させて回収した。細胞をCnT-20培地で懸濁させて，生細胞数及び生存率を測定した後，再度遠心し，細胞を沈殿させて回収した。次いで，細胞の濃度が約1X10⁵個/mLとなるように，セルバンカー１（日業本全薬工社）を添加して細胞を懸濁させた。細胞懸濁液をクライオチューブ（WHEATON社）に1mLずつ分注し，これを予め4℃に冷却した凍結処理容器（BICELL，日本フリーザー社）に収納したうえで，-80℃冷凍庫に1晩置いて凍結させた後，液体窒素中に移した。

〔ヒト角膜上皮シートの製造に用いる基質羊膜の準備〕
DMEM（Gibco社）と，滅菌したグリセリンとを1:1で混合した溶液に，10μg/mLとなるようにゲンタマイシンを加え，これを羊膜保存液とした。羊膜（再生医療支援機構）を安全キャビネット内のトレー上に置き，G-PBSに浸して，滅菌手袋を装着した状態で，指先で羊膜の絨毛膜を剥離し，医療用メスを用いて約2cmX2cmの正方形に切り分けた。正方形に切り分けた羊膜を羊膜保存液に入れ，-80℃で保存した。

羊膜を解凍した後，10cmシャーレ上に移し，G-PBSで2回洗浄して羊膜保存液を除いた後，0.02% EDTA/PBSを添加し，37℃で2時間以上処理を行った。G-PBSで2回洗浄した後実体顕微鏡観察下で，セルスクレイパーを用いて羊膜の上皮を剥離させた。上皮を剥離させた羊膜（基質羊膜）は，G-PBS溶液に浸して4℃で保存した。

〔ヒト角膜上皮シートの製造〕
凍結保存していたヒト間葉系幹細胞（hMSC）を，37℃恒温槽ですばやく解凍し，DMEM/10% FBS培地を添加して懸濁した後，遠心して細胞を沈殿させて回収した。回収した細胞をDMEM/10% FBS培地で懸濁し，生細胞数を測定した。1.5X10⁴〜2.5 X10⁴個/cm²の細胞密度となるように6ウェルコンパニオンプレート（コーニング社）のボトムウェルに播種し，DMEM/10% FBS培地中で1〜3日間培養した。hMSCをヒト角膜上皮シートの製造における支持細胞として用いる直前にDMEM/10% FBS培地中を取り除き，PBSで洗浄した後，10μMのY27632（ROCK阻害剤）（シグマ社）を含有するKB+SHEM培地を1.5mL加えた。これを支持細胞添加6ウェルコンパニオンプレートとした。KB+SHEM培地とは，下記に作製方法を示したKB培地とSHEM培地を2:1の割合で混合した培地を指す。KB培地は，正常ヒト角膜上皮細胞増殖用無血清液体培地（LIFELINE Cell Technology社）に付属の7種類の添加因子のうちウシ脳下垂体抽出液（BPE）を除く6種類の添加因子（0.2%(v/v) OcuFactor Lifefactor，5μg/mL トランスフェリン，0.18μg/mL ハイドロコルチゾン，1μM アドレナリン，6mM L-グルタミン，5.0μg/mL 組み換えヒトインスリン）を加え，更に10μg/mLの濃度となるようにゲンタマイシンを加えて作製した培地である。SHEM培地は，DMEM/F-12（Gibco社）に5μg/mLの組み換えヒトインスリン，10ng/mLの組み換えヒト EGF（Gibco社），10%のFBS（Hyclone社），更に10μg/mLの濃度となるようにゲンタマイシンを加えて作製した培地である。

上皮を剥離した羊膜（基質羊膜）を，6ウェルセルカルチャーインサート（トランズウェルクリアーTM，孔径3μm，ポリエステル製，コーニング社）に上皮を剥離した側が上になるように移し，実体顕微鏡下で無鉤摂子を用いて6ウェルセルカルチャーインサート全体を覆うように広げた。基質羊膜を数分間風乾させた後，Ｏリング（デュポン社）を6ウェルセルカルチャーインサートに挿入し，基質羊膜が6ウェルセルカルチャーインサート内で移動しないように固定し，実体顕微鏡により培養面に皺，気泡，微孔がないことを確認した後，これを支持細胞添加6ウェルコンパニオンプレート（ボトムウェル）に静置した。

次いで，上記凍結保存した角膜上皮由来細胞を37℃恒温槽ですばやく解凍し，KB+SHEM培地を添加して懸濁した後，遠心して細胞を沈殿させて回収した。回収した細胞を10μMのY27632（ROCK阻害剤）（シグマ社）を含有するKB+SHEM培地で懸濁し細胞懸濁液とし，生細胞数を測定した。

懸濁した角膜上皮由来細胞懸濁液を6ウェルセルカルチャーインサートに置いた基質羊膜上に生細胞数が1X10⁴個/cm²以上になるように添加し，培養を開始した。このとき添加する細胞懸濁液の液量の上限は0.5mLとした。培養開始から3〜5時間後に0.5mLの10μMのY27632を含むKB+SHEM培地（実施例における第３の培地）を6ウェルセルカルチャーインサートに更に添加し，2〜3日間培養した。

次いで，6ウェルセルカルチャーインサート及びボトムウェルの培地を捨て，培地を1μMのSB203580（シグマ社）及び1μMのSB431542（シグマ社）を含むKB+SHEM培地（KB+SHEM培養用培地，実施例における第４の培地）に交換し，当該培地（KB+SHEM培養用培地）を2日毎に交換しながら細胞を4〜6日間培養した。次いで，当該培地（KB+SHEM培養用培地）を１日毎に交換しながら細胞を7〜14日間培養した。この間に，ボトムウェルの支持細胞が，顕著にボトムウェルから剥離する等の変化が認められた場合は，ボトムウェルの底面に支持細胞を固着させた6ウェルコンパニオンプレートを新たに準備し，これに6ウェルセルカルチャーインサートを移して培養を継続し，基質羊膜上で細胞を増殖させて，基質羊膜上にヒト角膜上皮細胞に由来する細胞からなる細胞層を形成させた。

最後に培地を交換した24時間経過後から培養上清中の乳酸濃度の測定を開始し，乳酸濃度が8〜10mMを超えた時点を目安に6ウェルセルカルチャーインサート及びボトムウェルの培地を捨て，次いで，1.4mLの培地（KB+SHEM培養用培地）をボトムウェルに加え，6ウェルセルカルチャーインサート上に置いた基質羊膜の底面が培地に浸る一方，6ウェルセルカルチャーインサート内の基質羊膜上に形成されたヒト角膜上皮細胞に由来する細胞からなる細胞層の表面の全部又は一部が培地に覆われない状態（但し，細胞層の表面は乾燥させない状態），すなわち細胞層の表面の全部又は一部が培養器中の気相に曝された状態で，3日間培養した。この間，培地を約12時間毎に計5回交換した。このように細胞層の表面の全部又は一部が培地に覆われない状態で行う培養をair-lifting培養という。

培養終了後，6ウェルセルカルチャーインサート上に形成された，基質羊膜と基質羊膜上に形成されたヒト角膜上皮由来細胞の細胞層とからなるシートを，ヒト角膜上皮シートとして，HE染色及びFACS解析により，その品質評価を実施した。

〔ヒト角膜上皮シートの分割〕
培養終了後のヒト角膜上皮シートを6ウェルセルカルチャーインサート上でKB+SHEM培養用培地で3回洗浄した後，生検トレパン及びスカルペルを用いて1/2シート，及び1/4シート2枚に分割した。

〔HE染色〕
分割後，1/2シートをスーパーフィックス（クラボウ）で10分間固定し，次いでスーパーフィックスを除いてPBSで3回洗浄した。次にマイヤーヘマトキリン溶液（和光純薬工業）で30分間染色し，マイヤーヘマトキリン溶液を除いた後，PBSで3回洗浄した。マイヤーヘマトキリン溶液により細胞核が染色されていることを確認した後，PBSで5倍希釈したエオシンY溶液（和光純薬工業）で10秒間染色し，次いでエオシンY溶液を除いてPBSで3回洗浄した。エオシンY溶液により細胞質が染色されていることを確認した後，スライドガラス上で細胞シートを支持膜から剥がし，PBSを用いてカバーガラスで封入したものを作成し，これを用いてヒト角膜上皮シートの表面を顕微鏡下で観察し，基質羊膜表面上に形成されたヒト角膜上皮由来細胞の細胞層（培養細胞層）の範囲及び線維芽細胞の存在の有無を顕微鏡下で観察した。

また，分割後の1/4シート1枚をTissue-Tek（登録商標）O.C.T.Compound（サクラファインテックジャパン）に包埋・薄切し，スライドガラスに切片を貼り付けた。切片を貼り付けたスライドガラスを，スーパーフィックス（クラボウ）を加えたスライド染色バットに10分間浸し，細胞を固定した後，水道水で10分間水洗した。次にマイヤーヘマトキリン溶液を加えたスライド染色バットに45秒間浸し，水道水で10分間水洗した。細胞核が染色されていることを確認した後，PBSで5倍希釈したエオシンY溶液（和光純薬工業）で10秒間染色し，水道水で10分間水洗した。エオシンY溶液により細胞質が染色されていることを確認した後，70，80，90，95%エタノールの順番でそれぞれのスライド染色バットに1〜10秒間ずつ浸し，その後，キシレンの入った染色バットに10分間浸した。最後に，スライドガラスを取り出し，風乾した後，オイキット（O. Kindler GmbH社）を用いてカバーガラスで封入したものを作成し，これを用いてヒト角膜上皮シートの断面を顕微鏡下で観察し，重層化及び扁平な細胞の形成の程度を観察した。

〔HE染色の結果〕
ヒト角膜上皮シートの表面を顕微鏡下で観察した結果，線維芽細胞の存在は全く認められなかった（図１）。顕微鏡視野内には，少なくとも1000個の細胞があったので，ヒト角膜上皮由来細胞中の線維芽細胞の比率は0.1%未満であった。また，顕微鏡視野内において，基質羊膜の表面の全面積の98%以上が培養細胞層に覆われており，且つ，培養細胞層の90%以上が二層以上の重層構造を形成していることがわかった（図１）。

次いで，ヒト角膜上皮シートの断面を顕微鏡下で観察した結果，シート断面の95%以上が培養細胞層を有しており，且つ培養細胞層の90%以上が二層以上の重層構造を形成していることがわかった（Ｂ，図２）。また，重層構造の大部分は，3〜4層の重層構造であった。また，培養細胞層の表面の90%以上が扁平な細胞（Ａ，図２）で覆われていることがわかった。この扁平な細胞を含めた培養細胞層の構造は，バリアー機能を有する非角化重層扁平上皮からなる角膜上皮組織と近似の形態を示した。

〔FACS解析〕
リン酸緩衝液生理食塩水 pH 7.4, contains BSA, powder（シグマ社）を純水に溶解し，0.22μmフィルターに通して，2% BSA（0.138M塩化ナトリウム，0.0027M塩化カリウム，2%(w/v)ウシ血清アルブミンを含有する0.01Mリン酸緩衝生理食塩水（pH 7.4））を調製した。調製した2% BSAにTriton X-100（和光純薬工業）を0.1%の濃度になるように加え，これをBSA-Tとした。

抗体希釈液を以下のとおり調製した。485μLのBSA-TにマウスIgG抗体溶液（DAKO）を10μLとウサギIgG抗体溶液（DAKO）を5μL加え，これをアイソタイプコントロロール用1次抗体希釈液とした。また，486μLのBSA-Tにマウス抗サイトケラチンAE1/AE3抗体溶液（DAKO）を10μL加えて，これをサイトケラチンAE1AE3検出用1次抗体希釈液とした。また，486μLのBSA-Tにウサギ抗サイトケラチン12抗体溶液（TransGenic）を4μL加えて，これをサイトケラチンAE1AE3検出用1次抗体希釈液とした。また，998μLのBSA-TにAlexa Fluor（登録商標）488-標識-ヤギ抗マウスIgG抗体溶液（ライフテクノロジーズジャパン）を2μL加えてサイトケラチンAE1AE3検出用2次抗体希釈液とした。また，998μLのBSA-TにAlexa Fluor（登録商標）647-標識-ヤギ抗ウサギIgG抗体溶液（ライフテクノロジーズジャパン）を2μL加えてサイトケラチン12検出用2次抗体希釈液とした。

上記ヒト角膜上皮シートの分割で得た1/4シート1枚からインサートメンブレンを取り除き，培養細胞層及び基質羊膜を0.25%トリプシン溶液（ライフテクノロジーズジャパン）で10分間，37℃でインキュベートした後，培地（KB+SHEM培養用培地）を加え，ピペッティングにより培養細胞層を形成する細胞のみを回収した。回収した細胞を遠沈管に移し，遠心して細胞を沈殿させ，上清を除去した。次いで細胞を，4℃に冷却した1mLのメタノール（和光純薬工業）で懸濁し，冷凍庫内（-20℃）で10分間固定した。固定後，遠心して細胞を沈殿させ，メタノールを除去した。次いで1mL のBSA-Tを加えて懸濁した後，遠心して細胞を沈殿させ，BSA-Tを除去した。この洗浄作業を2回繰り返した。

次いで細胞を4mLのBSA-Tで懸濁した後，1mLずつ4本のチューブに分け，遠心して細胞を沈殿させ，BSA-Tを除去した。この4本のチューブのうち，2本をアイソタイプコントロール用チューブ，1本をサイトケラチンAE1AE3検出用チューブ，1本をサイトケラチン12検出用チューブとし，各チューブにアイソタイプコントロール用1次抗体希釈液，サイトケラチンAE1AE3検出用1次抗体希釈液及びサイトケラチン12検出用1次抗体希釈液をそれぞれ500μLずつ加え懸濁し，室温で30分間反応させた。1次抗体反応後，遠心して細胞を沈殿させ，各1次抗体希釈液を除去した。次いで，1mLのBSA-Tを加えて細胞を懸濁した後，遠心して細胞を沈殿させ，BSA-Tを除去した。この洗浄作業を3回繰り返した。次いで，サイトケラチンAE1AE3検出用チューブにサイトケラチンAE1AE3検出用2次抗体希釈液，サイトケラチン12検出用チューブにサイトケラチン12検出用2次抗体希釈液を，それぞれ500μLずつ加えて懸濁し，室温で30分間反応させた（遮光）。また，2本の各アイソタイプコントロール用チューブにサイトケラチンAE1AE3検出用2次抗体希釈液とサイトケラチン12検出用2次抗体希釈液を500μLずつそれぞれ加えて懸濁し，それぞれサイトケラチンAE1AE3検出用コントールチューブ及びサイトケラチン12検出用コントールチューブとし，室温で30分間反応させた（遮光）。2次抗体反応後，遠心して細胞を沈殿させ，2次抗体希釈液を除去した。次いで1mLのBSA-Tを加えて細胞を懸濁した後，遠心して細胞を沈殿させ，BSA-Tを除去した。この洗浄作業を3回繰り返した。最後にPropidium iodide solution（シグマアルドリッチ）をBSA-Tで500倍希釈した溶液500μLを各チューブに加え懸濁した。

サイトケラチンAE1AE3検出用チューブとサイトケラチンAE1AE3検出用コントールチューブの細胞懸濁液をセルストレーナーに通し，BD FACS Canto（登録商標）（BD社）を用いて両者のAlexa Fluor 488色素に由来する蛍光強度を比較することにより，サイトケラチンAE1AE3陽性細胞の比率を測定した。また，サイトケラチン12検出用チューブとサイトケラチン12検出用コントールチューブの細胞懸濁液をセルストレーナーに通し，BD FACS Canto（登録商標）（BD社）を用いて両者のAlexa Fluor 647色素に由来する蛍光強度を比較することにより，サイトケラチン12陽性細胞の比率を計測した。

〔FACS解析の結果〕
FACS解析の結果，基質羊膜上の培養細胞層を形成する細胞のほぼ全て（99.99%以上）が，サイトケラチンAE1/AE3陽性であり（図３−１），87%以上の細胞がサイトケラチン12陽性であることがわかった（図３−２）。

〔細胞シートの品質評価の結果〕
HE染色及びFACS解析の結果から，上記手法により製造したヒト角膜上皮シートは，線維芽細胞の存在が認められず，且つ，バリアー機能を担う非角化重層扁平上皮からなる角膜上皮組織と類似の形態を示すことから，移植用の角膜上皮シートとして適したものであることがわかった。

〔ヒト角膜上皮細胞の初代培養（P0培養）別法〕
ヒト角膜上皮細胞の初代培養（P0培養）を，上記記載の方法に代えて，以下の方法(別法を採して実施した。研究用ヒト角膜組織（2眼分，SightLife社製, 組織保存液としてCnT-20培地が使用されたもの）から，実体顕微鏡下で手術用メス及び角膜用ハサミを用いて強膜，結膜などを切り落とし，角膜上皮組織及び輪部を含む組織切片を切り出した。切り出した組織切片に，ディスパーゼ溶液（1.2U/mLのディスパーゼ（三光純薬）を含有するCnT-20培地（CELLEnTEC社）を添加して，4℃で15〜20時間静置した。次いで，37℃で1時間静置した後に0.02% EDTAを含むPBSで酵素反応を停止した後，組織切片を３５mmシャーレ（プライムサーフェス，住友ベークライト社）に移した後，実体顕微鏡観察下で，組織切片から無鉤摂子を用いてヒト角膜上皮細胞を掻把し，細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液をエッペンチューブ（プロテオフリー，住友ベークライト）に移した後遠心し，上清を除いた後のペレットにCnT-20培地を添加して再度遠心し，細胞を回収した。回収した細胞を10μMのY27632（ROCK阻害剤）（シグマ社）及び100μMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX，ホスホジエステラーゼ阻害剤）（シグマ社）を含有するCnT-20培地（実施例における第１の培地）1mLに懸濁させた。細胞懸濁液の一部を分取し，Trypan Blue Stain（Life Technologies社）で10倍希釈して細胞を染色して細胞数を計測した後に，細胞懸濁液にCnT-20培地を加えて細胞濃度が2X10⁵個/mLとなるように調整した。

上記の支持細胞添加6ウェルコンパニオンプレートに，FNC Coating Mix（AthenaES社）でコーティングした6ウェルセルカルチャーインサート（孔径0.4μm，培養面積約4.2cm²，ポリエチレンテレフタレート製，BD Falcon Cell Culture Insert, BD Biosciences社）を静置し，次いで，この6ウェルセルカルチャーインサートの各ウェルに上記の回収したヒト角膜上皮細胞の懸濁液を1.05mLずつ（1ウェルあたり2X10⁵個）添加し，培養を開始した。培養開始3〜5時間後に，6ウェルセルカルチャーインサートに10μMのY27632（ROCK阻害剤）（シグマ社）及び100μMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX，ホスホジエステラーゼ阻害剤）（シグマ社）を含有するCnT-20培地を0.5mL添加し，更に2〜3日間培養した。次いで，培地を100μMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX，ホスホジエステラーゼ阻害剤）（シグマ社），1μMのSB203580（ＭＡＰキナーゼ阻害剤）（シグマ社）及び1μMのSB431542（ＴＧＦ−β受容体阻害剤）（シグマ社）を含むCnT-20培地（実施例における第２の培地）に交換し，2〜3日毎に培地を交換しながら細胞を培養した。この間に，ボトムウェルの支持細胞が，顕著にボトムウェルから剥離する等の変化が認められた場合は，ボトムウェルの底面に支持細胞を固着させた6ウェルコンパニオンプレートを新たに準備し，これに6ウェルセルカルチャーインサートを移して培養を継続した。以下の工程も含め，細胞の培養は5% C0₂存在下，37℃で行った。ヒト角膜上皮細胞の初代培養における培養容器のセッティングを模式的に図４に示した。図４において，６ウェルコンパニオンプレート(培養容器)は，微細孔を有する膜により，下側の室(第１の室)と上側の室(第２の室)の，上下に仕切られている。第１の室には支持細胞としてヒト間葉系幹細胞が加えられ，第２の室にはヒト角膜上皮細胞が加えられている。ヒト間葉系幹細胞は第１の室中で培養容器の底面に固着し，ヒト角膜上皮細胞は第２の室中で微細孔を有する膜上で培養されている。

上記別法によって得たヒト角膜上皮由来細胞を用いて，上記手法により製造したヒト角膜上皮シートをHE染色して，その表面を顕微鏡下で観察した結果，線維芽細胞の存在は全く認められなかった（図５）。顕微鏡視野内には，少なくとも1000個の細胞があったので，ヒト角膜上皮由来細胞中の線維芽細胞の比率は0.1%未満であった。また，顕微鏡視野内において，基質羊膜の表面の全面積の99.5%以上が培養細胞層に覆われており，且つ，培養細胞層の95%以上が四層以上の重層構造を形成していることがわかった（Ｂ，図６）。また，培養細胞層の表面の90%以上が扁平な細胞（Ａ，図６）で覆われていることがわかった。この扁平な細胞を含めた培養細胞層の構造は，バリアー機能を有する非角化重層扁平上皮からなる角膜上皮組織と近似の形態を示した。

〔ヒト角膜上皮細胞の培養時におけるＭＡＰキナーゼ阻害剤とＴＧＦ−β受容体阻害剤の組合せのヒト角膜上皮細胞の増殖促進効果の検討〕
上記凍結保存した角膜上皮由来細胞を37℃恒温槽ですばやく解凍し， CnT-20培地を添加して懸濁した後，遠心して細胞を沈殿させて回収した。回収した細胞をCnT-20培地で懸濁し細胞懸濁液とし，生細胞数を測定した。次いで，懸濁した角膜上皮由来細胞懸濁液を，FNC Coating Mix（AthenaES社）でコーティングした96ウェルプレートに生細胞数が3500個/ウェルになるように添加した。次いで，これらのウェルに表９に示す(1)〜(6)群の組合せ及び濃度で，ＭＡＰキナーゼ阻害剤とＴＧＦ−β受容体阻害剤とを培地に添加した。すなわち，各群におけるＭＡＰキナーゼ阻害剤とＴＧＦ−β受容体阻害剤の組合せ及び培地中における濃度は，(1) SB203580（1μM）+ SB431542（1μM），(2) SB203580（1μM）+ A83-01（10μM），(3) SB203580（1μM）+ LY364947（10μM），(4) SB239063（10μM）+ SB431542（1μM），(5) SB239063（10μM）+ A83-01（10μM），(6) SB239063（10μM）+ LY364947（10μM）とした。また，ＭＡＰキナーゼ阻害剤とＴＧＦ−β受容体阻害剤を培地に添加しないものをコントロール（NA）とした。培養開始から5日後に水溶性テトラゾリウム塩WST-8を発色試薬として含有するCell Counting Kit-8(CCK-8)溶液を培地に10μL添加し，1時間後にプレートリーダーで波長450nmでの吸光度（OD450）を測定した。測定は，各組合せとも4ウェルで実施し，コントロールの測定値の平均値を100%として，コントロールとの比較で各群の測定値を求めた。なお，生細胞数は，こうして求められる吸光度とほぼ比例関係にあることが知られている。

その結果，コントロール（NA）と比較して(1)〜(6)の全ての群で測定値が100%を超え，ＭＡＰキナーゼ阻害剤とＴＧＦ−β受容体阻害剤を組合わせて培地に添加することにより，ヒト角膜上皮細胞の増殖が促進されることが示された（図７)。また，(1) SB203580（1μM）+ SB431542（1μM），(3) SB203580（1μM）+ LY364947（10μM），(4) SB239063（10μM）+ SB431542（1μM），及び(6) SB239063（10μM）+ LY364947（10μM）の各群では，測定値が120%を超え，これらのＭＡＰキナーゼ阻害剤とＴＧＦ−β受容体阻害剤の組合せが，特にヒト角膜上皮細胞の増殖を促進することが示された（図７)。また，(1) 群のSB203580（1μM）+ SB431542（1μM）では，測定値が約130%であり，(4) 群のSB239063（10μM）+ SB431542（1μM）では，測定値が140%を超えたことから，これらの組合せが，更に特にヒト角膜上皮細胞の増殖を促進することが示された（図７)。

本発明によれば，再発性の角膜ジストロフィー等の角膜疾患の患者に移植し得る，品質の安定したヒト角膜上皮シートを，安定して供給することができる。

１．６ウェルセルカルチャーインサート
２．６ウェルコンパニオンプレート(培養容器)
３．微細孔を有する膜
４．ヒト角膜上皮細胞
５．支持細胞（ヒト間葉系幹細胞）
６．第１の室
７．第２の室
８．ボトムウェル

Claims

ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞の製造方法であって，
細胞を通過させない微細孔を有する膜により第１の室と第２の室に仕切られた培養容器の，該第１の室に支持細胞を加え，該第２の室にヒト角膜上皮細胞を加えて，ROCK阻害剤及びホスホジエステラーゼ阻害剤を含有する第１の培地を用いて該ヒト角膜上皮細胞を培養し，次いで，ホスホジエステラーゼ阻害剤，ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ−β受容体阻害剤を含有する第２の培地を用いて該ヒト角膜上皮細胞を培養することを含む，製造方法。
該培養容器が，該微細孔を有する膜により，上側の室と下側の室の，上下に２室に仕切られたものである，請求項１に記載の製造方法。
該下側の室が該第１の室であり，該上側の室が該第２の室であり，該ヒト角膜上皮細胞を，該微細孔を有する膜の上で培養するものである，請求項２に記載の製造方法。
該ヒト角膜上皮細胞を，該細胞を通過させない微細孔を有する膜であって該培養容器内に支持されたものである膜の上で，該支持細胞と直接接触させることなく，培養するものである，請求項３に記載の製造方法。
該第１の培地に含有される該ROCK阻害剤がY27632であり，該第１及び該第２の培地に含有される該ホスホジエステラーゼ阻害剤が3-イソブチル-1-メチルキサンチンであり，該第２の培地に含有されるＭＡＰキナーゼ阻害剤がSB203580，若しくはSB239063，又はこれらの組合せから選択されるものであり，該第２の培地に含有されるＴＧＦ−β受容体阻害剤が，SB431542，LY364947，若しくはA83-01，又はこれらの組合せから選択されるものである，請求項１乃至４の何れかに記載の製造方法。
該第１の培地に含有される該ROCK阻害剤がY27632であり，該第１及び該第２の培地に含有される該ホスホジエステラーゼ阻害剤が3-イソブチル-1-メチルキサンチンであり，該第２の培地に含有されるＭＡＰキナーゼ阻害剤がSB203580であり，該第２の培地に含有されるＴＧＦ−β受容体阻害剤が，SB431542である，請求項１乃至４の何れかに記載の製造方法。
該第１の培地に含有されるY27632の濃度が1〜20μMであり，該第１及び該第２の培地に含有される3-イソブチル-1-メチルキサンチンの濃度が50〜150μMであり，該第２の培地に含有されるSB203580の濃度が0.2〜2μMであり，SB431542の濃度が0.2〜2μMである，請求項６に記載の製造方法。
該第１の培地に含有されるY27632の濃度が10μMであり，該第１及び該第２の培地に含有される3-イソブチル-1-メチルキサンチンの濃度が100μMであり，該第２の培地に含有されるSB203580の濃度が1μMであり，SB431542の濃度が1μMである，請求項６に記載の製造方法。
該支持細胞が，ヒト間葉系幹細胞である，請求項１乃至８の何れかに記載の製造方法。
請求項１乃至９の何れかに記載の製造方法でヒト角膜上皮細胞に由来する細胞を得て該細胞を，細胞凍結液に懸濁して凍結し，凍結細胞とする工程を更に含む，製造方法。
ヒト角膜上皮シートの製造方法であって，
請求項１乃至９の何れかに記載の製造方法でヒト角膜上皮細胞に由来する細胞を得て該細胞を，支持細胞を含んだ培養容器中で，該支持細胞を通過させない微細孔を有する膜であって該培養容器内に支持されたものである膜の上に置かれた基質羊膜上で，ROCK阻害剤を含有する第３の培地を用いて培養し，次いで，ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ−β受容体阻害剤を含有する第４の培地を用いて培養して，該基質羊膜上で該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞からなる細胞層を形成させるステップと，次いで，該細胞層の表面の全部又は一部が培地に覆われない状態で，該第４の培地を用いて培養するステップとを含む，製造方法。
ヒト角膜上皮シートの製造方法であって，
請求項１０に記載の製造方法でヒト角膜上皮細胞に由来する細胞を得て該細胞を解凍後に，支持細胞を含んだ培養容器中で，該支持細胞を通過させない微細孔を有する膜であって該培養容器内に支持されたものである膜の上に置かれた基質羊膜上で，ROCK阻害剤を含有する第３の培地を用いて培養し，次いで，ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ−β受容体阻害剤を含有する第４の培地を用いて培養して，該基質羊膜上で該ヒト角膜上皮細胞に由来する細胞からなる細胞層を形成させるステップと，次いで，該細胞層の表面の全部又は一部が培地に覆われない状態で，該第４の培地を用いて培養するステップとを含む，製造方法。
該基質羊膜が，羊膜上皮を剥離した側を上に向けて該培養容器中に置かれるものである，請求項１１又は１２に記載の製造方法。
該第３の培地に含有される該ROCK阻害剤がY27632であり，該第４の培地に含有されるＭＡＰキナーゼ阻害剤がSB203580であり，該第４の培地に含有されるＴＧＦ−β受容体阻害剤がSB431542である，請求項１１乃至１３の何れかに記載の製造方法。
該第３の培地に含有されるY27632の濃度が1〜20μMであり，該第４の培地に含有されるSB203580の濃度が0.2〜2μMであり，該第４の培地に含有されるSB431542の濃度が0.2〜2μMである，請求項１４に記載の製造方法。
該第３の培地に含有されるY27632の濃度が10μMであり，該第４の培地に含有されるSB203580の濃度が1μMであり，SB431542の濃度が1μMである，請求項１４に記載の製造方法。
該支持細胞が，ヒト間葉系幹細胞である，請求項１１乃至１６の何れかに記載の製造方法。