CN106999518A - 脐带血以及末梢血的冻结保存方法以及冻结保存用溶液 - Google Patents
脐带血以及末梢血的冻结保存方法以及冻结保存用溶液 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106999518A CN106999518A CN201580061720.1A CN201580061720A CN106999518A CN 106999518 A CN106999518 A CN 106999518A CN 201580061720 A CN201580061720 A CN 201580061720A CN 106999518 A CN106999518 A CN 106999518A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cryopreservation
- blood
- cord blood
- solution
- peripheral blood
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title claims abstract description 194
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 144
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 107
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 title claims abstract description 107
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 64
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 62
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 36
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 34
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 30
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 87
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfoxide Natural products CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 68
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 42
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 42
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 16
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 claims description 14
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 claims description 14
- 230000037387 scars Effects 0.000 claims description 14
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 abstract description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 110
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 28
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 27
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 17
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 17
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 14
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 8
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 7
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 6
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 3
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 2
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 2
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000289695 Eutheria Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 230000002528 anti-freeze Effects 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000003219 hemolytic agent Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N propane-1,1-diol Chemical class CCC(O)O ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 2
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010053481 Antifreeze Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241000408529 Libra Species 0.000 description 1
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- HDSBZMRLPLPFLQ-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol alginate Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(C(O)=O)C1OC1C(O)C(O)C(C)C(C(=O)OCC(C)O)O1 HDSBZMRLPLPFLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920001495 poly(sodium acrylate) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 1
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000000770 propane-1,2-diol alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010409 propane-1,2-diol alginate Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- NNMHYFLPFNGQFZ-UHFFFAOYSA-M sodium polyacrylate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C=C NNMHYFLPFNGQFZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0278—Physical preservation processes
- A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/51—Umbilical cord; Umbilical cord blood; Umbilical stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
Abstract
本发明的目的在于，提供一种能够利用于脐带血、末梢血、以及包含来源自这些血液的造血干细胞的成分的冻结保存、且具备适合于各种利用方式的特性的冻结保存用溶液及其用途，在本发明涉及的冻结保存方法中，冻结将包含防冻剂以及葡萄糖的冻结保存用溶液和脐带血或者末梢血混合得到的混合物。
Description
技术领域
本发明涉及脐带血以及末梢血的冻结保存方法以及冻结保存用溶液。更详细的是，涉及一种脐带血以及末梢血的冻结保存方法以及冻结保存用溶液，在解冻后的脐带血或者末梢血中的细胞存活率良好，且能够在解冻后对生物体安全地适用。
背景技术
脐带血以及末梢血包含造血干细胞，与骨髓共同作为造血干细胞源临床应用。脐带血以及末梢血根据需要，将包含造血干细胞的成分分离回收后，与冻结保存用溶液混合，冻结保存至使用之前。
作为用于冻结保护包含造血干细胞的成分的冻结保存用溶液，例如，列举出CP-1(商品名)或者CryoSure-DEX40(商品名)(非专利文献1～2)。CP-1包含羟乙基淀粉和二甲基亚砜作为主要成分，CryoSure-DEX40包含葡聚糖和二甲基亚砜作为主要成分。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1
Takanashi M,Oba A,Ogawa A,et al.Red blood cell depletionof cord bloodusing an automated system-Evaluation of the AXP system.使用了自动分离装置的脐带血的红血球去除调制-AXP系统的评价。
日本输血细胞治疗学会杂志56(1):62-67,2010。
非专利文献2
Yamaguchi R,Takanashi M,Ito M,et al.Plasticizer concentration in cordblood cryopreserved with DMSO(用DMSO冰镇保存的脐带血中的增塑剂浓度).BoneMarrow Transplant 49(1):157-8,2014.
发明内容
被冻结保存的包含造血干细胞的成分在解冻后，例如，有时会分离回收造血干细胞而利用，也有时会在包含冻结保存用溶液的状态下适用于生物体。因此，强烈要求脐带血用或者末梢血用的冻结保存用溶液以及包含从脐带血或者末梢血来源的造血干细胞的成分用的冻结保存用溶液具有适合于各种利用方式的特性。
关于对生物体的适用，在非专利文献1～2中记载的羟乙基淀粉以及葡聚糖均作为医疗用医药品被认可，即使在输入血管内的情况下，也为对生物体而言安全性优良的成分。然而，这些成分成为过敏性休克等的副作用的报告，希望利用安全性更加优良的成分。
另外，在解冻后，在分离回收造血干细胞而利用的情况下，希望冻结保护液是容易回收造血干细胞的组成。
而且，关于CP-1，在标准的使用法中，由于必须添加血清白蛋白，所以尤其是在医疗现场利用时，在操作性以及迅速性中具有改良的余地。
本发明是为了解决上述的课题而完成的，其目的之一在于，提供一种能够在脐带血、末梢血、以及包含从这些血液来源的造血干细胞的成分的冻结保存中利用、且具备适合于各种各样的利用方式的特性的冻结保存用溶液及其用途。
本发明涉及的冻结保存方法是冻结保存脐带血或者末梢血的方法，包含：混合步骤，其中，混合包含防冻剂以及葡萄糖的冻结保存用溶液和脐带血或者末梢血步骤；以及冻结步骤，其中，冻结在上述混合步骤中得到的混合物。
本发明涉及的制作方法是制作脐带血或者末梢血的冻结物的方法，包含：混合步骤，其中，混合包含防冻剂以及葡萄糖的冻结保存用溶液和含有活细胞的脐带血或者末梢血；以及冻结步骤，其中，冻结通过上述混合步骤得到的混合物。
本发明另外提供使用上述制作方法制作的脐带血或者末梢血的冻结物。
本发明涉及的脐带血或者末梢血的冻结保存用溶液包含防冻剂以及葡萄糖。
本发明涉及的冻结保存用试剂盒是用于冻结保存脐带血或者末梢血的试剂盒，具备上述脐带血或者末梢血的冻结保存用溶液和能够储存冻结保存用溶液以及脐带血或者末梢血的耐寒性的容器。
如果使用本发明的冻结保存方法以及冻结保存用溶液，则解冻后的脐带血或者末梢血中的细胞存活率良好，另外，能够相对于生物体安全地适用解冻的脐带血或者末梢血。
具体实施方式
本发明发明人为了解决上述课题进行了锐意研究，结果发现，将脐带血与包含防冻剂以及葡萄糖的溶液混合而进行冻结的情况下，解冻后的细胞存活率良好，从而完成了本发明。以下，对本发明的实施方式详细地说明。
[脐带血或者末梢血的冻结保存方法]
本发明所涉及的脐带血或者末梢血的冻结保存方法包含：混合包含防冻剂以及葡萄糖的冻结保存用溶液和脐带血或者末梢血混合步骤；和冻结在混合步骤中得到的混合物的冻结步骤。
能够适用于本发明所涉及的冻结保存方法的脐带血的来源无特别限定，能够保存所有有胎盘类的哺乳动物的脐带血。作为有胎盘类的哺乳动物，列举如下：小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、除人以外的灵长类等的实验动物；狗、猫等的玩赏动物(宠物)；牛、马、猪、羊等的家畜；人。另外，能够适用于本发明涉及的冻结保存方法的末梢血的来源无特别限定，例如，列举出前述的动物。根据本发明涉及的冻结保存方法，能够有效地适用于人类的脐带血以及末梢血。
脐带血例如通过穿刺脐带静脉而自然流下的方式提取即可。末梢血例如完全通过体外循环的方法提取即可。因此，在本发明涉及的冻结保存方法的一实施方式中，还包含从脐带提取脐带血的步骤或者从生物体提取末梢血的步骤。
如果包含在冻结保存用溶液中的防冻剂能够构成能够充分地保存脐带血或者末梢血的冻结保存用溶液，则无特别限定。作为防冻剂，列举出例如二甲基亚砜(以下称为DMSO)、丙三醇、丙二醇、以及1-甲基-2-吡咯烷酮等。作为防冻剂，优选DMSO以及丙二醇，尤其优选DMSO。防冻剂在通过混合步骤得到的混合物中，优选包含3.0～10.0w/v％，更优选包含5.0～8.0w/v％或者5.0～8.0v/v％，从细胞回收率以及DMSO量的减少化的观点来看进一步优选包含5.0v/v％。
葡萄糖在通过混合步骤得到的混合物中，优选包含0.25～5.0w/v％，更优选包含0.5～5.0w/v％，进一步优选包含1.0～2.5w/v％，尤其优选包含1.5～2.0w/v％。
冻结保存用溶液将防冻剂与葡萄糖的浓度比优选设为20:1～1:1、更优选设为10:1～2:1、进一步优选设为20:3～10:3。通过该组成，与现有技术比较，能够大幅度降低防冻剂的浓度。因此，尤其是在适用于生物体的情况下，由于能够降低进入体内的防冻剂的量，所以更加安全。
冻结保存用溶液还可以包含其他成分。作为其他成分，例如列举出pH调整剂、以及增粘剂等。作为pH调整剂，例如列举出碳酸氢钠、HEPES、以及磷酸盐缓冲液等。另外，在基础母液(BSS:Basic Stock Solution)中不添加磷酸盐缓冲液的情况下，也能够使用添加了生理食盐水的溶液。其中，尤其优选使用磷酸盐缓冲液。pH调整剂优选为了将冻结保存用溶液中的pH调整为大约6.5～9.0、优选调整为7.0～8.5而合适地使用。另外，本发明中的磷酸盐缓冲液是指氯化钠、磷酸二氢钠(无水)、磷酸二氢钾(无水)、磷酸氢二钠(无水)、磷酸三钠(无水)、氯化钾、以及磷酸二氢钾(无水)等的溶液，尤其优选使用氯化钠、磷酸二氢钠(无水)、氯化钾、或者磷酸二氢钾(无水)的溶液。pH调整剂优选在冻结保存用溶液中包含0.01～1.0w/v％，更优选包含0.05～0.5w/v％。
冻结保存用溶液也可以包含增粘剂。作为增粘剂，例如列举出羧甲基纤维素(以下称为CMC)、羧甲基纤维素钠(以下称为CMC-Na)、有机酸聚合物、海藻酸丙二醇酯、以及海藻酸钠等。作为增粘剂，优选CMC以及CMC-Na，尤其优选CMC-Na。另外，在有机酸聚合物中，优选聚丙烯酸钠。然而，在本发明中，由于即使在冻结保存用溶液中不包含增粘剂也能够良好地保存脐带血或者末梢血，所以在本发明涉及的冻结保存方法的一个优选实施方式中，冻结保存用溶液不包含增粘剂。对于设想为对人类的静脉内输入的细胞制剂，希望不包含增粘剂。
冻结保存用溶液既可以包含天然的动物来源成分，也可以不包含天然的动物来源成分。作为天然的动物来源成分，例如列举出白蛋白、血清以及基础培养基等。作为血清列举出成年牛血清、幼年牛血清、新生牛血清、以及牛胎儿血清等。作为基础培养基，列举出RPMI培养基、MEM培养基、HamF-12培养基、以及DM-160培养基等。冻结保存用溶液优选不包含天然的动物来源成分。在不包含天然的动物来源成分的冻结保存用溶液中，在不产生天然的动物来源成分的批次间的品质不同的问题的基础上，能够避免由包含在血清中的各种细胞因子、增殖因子以及激素等的本来在细胞保存中不需要的成分导致的脐带血中的细胞的性质变化的问题，而且也能够避免包含在基础培养基中的来源不明的成分导致的影响。因此，不包含天然的动物来源成分的冻结保存用溶液尤其是在临床使用中，从能够安全地适用于生物体的观点而言是非常有用的。
冻结保存用溶液优选不包含葡聚糖。在不包含葡聚糖的情况下，能够降低引起过敏性休克的担忧，能够安全地适用于生物体。
冻结保存用溶液优选不包含羟乙基淀粉(HES)。在不包含羟乙基淀粉的情况下，能够降低引起过敏性休克的担忧，能够安全地适用于生物体。
冻结保存用溶液优选为水溶液。冻结保存用溶液的渗透压为了保持作为保存液的性能，优选1000mOsm以上，更优选为1000～2700mOsm。
另外，冻结保存用溶液的组成如果是能够充分地保存细胞的组成，则也能够使用在上述列举的各成分的具体例之中的任一成分的组合。另外，关于浓度也能够分别选择而组合。
冻结保存用溶液在优选的一例中，为包含防冻剂以及葡萄糖且不包含天然的动物来源成分、增粘剂、葡聚糖以及HES的水溶液。冻结保存用溶液在更优选的一例中，为包含DMSO以及葡萄糖且不包含天然的动物来源成分、增粘剂以及葡聚糖的水溶液。冻结保存用溶液在进一步优选的一例中，包含6.0～20.0w/v％的DMSO、包含1.0～10.0w/v％葡萄糖、且不包含天然的动物来源成分、增粘剂、葡聚糖以及HES的水溶液。冻结保存用溶液在更进一步优选的一例中，为包含10.0v/v％的DMSO、包含3.0w/v％的葡萄糖、且不包含天然的动物来源成分、增粘剂、葡聚糖以及HES的水溶液。冻结保存用溶液在尤其优选的一例中，为仅包含DMSO、葡萄糖和pH调整剂的水溶液。冻结保存用溶液在最优选的一例中，为仅包含DMSO、葡萄糖、pH调整剂的水溶液，为包含6.0～20.0w/v％的DMSO、包含1.0～10.0w/v％的葡萄糖的水溶液。冻结保存用溶液在最优选的进一步的一例中，为仅包含DMSO、葡萄糖、pH调整剂的水溶液，为包含10.0v/v％的DMSO、包含3.0w/v％葡萄糖的水溶液。
在冻结保存医疗用途中使用的脐带血或者末梢血的情况下，冻结保存用溶液优选已被灭菌。由于降低了细菌感染的风险，所以能够更加安全地对生物体适用。
冻结保存的脐带血或者末梢血也可以去除红血球的至少一部分，优选去除全部红血球。由于冻结容量通过去除红血球变小，所以大量样本的保存变得容易。红血球的去除例如能够通过公知的方法进行。
另外，冻结保存的脐带血或者末梢血也可以去除血浆的至少一部分。通过去除血浆的至少一部分，能够调整与冻结保存用溶液混合的脐带血或者末梢血的体积。另外，由于冻结容量变小，所以大量样本的保存变得容易。血浆的去除例如，能够通过公知的方法进行。
冻结保存用溶液和脐带血或者末梢血优选以1:1～3:1的体积比混合，更优选以1:1～2:1的体积比混合，在一例中进一步优选以1:1的体积比混合。通过在这些范围混合，能够达成更良好的解冻后的细胞存活率。在冻结保存用溶液中的各成分的浓度根据上述混合比调整。例如，在以1:1的体积比混合的情况下，冻结保存用溶液中的各成分的浓度设为混合物中的浓度的2倍的浓度即可。
冻结保存用溶液以及脐带血或者末梢血的总量无特别限定，例如能够设为10～100mL。
混合的方法无特别限定。混合从能够更均匀地混合的观点出发，优选一边搅拌一边进行。另外，混合时的温度无特别限定，优选10℃以下，更优选一边冰冷一边进行。另外，优选预先将冻结保存用溶液设为上述的温度。通过在这样的温度下进行混合，能够抑制混合物的温度上升的影响，能够更好地维持细胞存活率。
接下来冻结在混合步骤中的得到的混合物。也可以在冻结之前提取检测用的样本，或测定重量。另外，也可以将混合物转移到耐寒性的容器(例如冻结用袋)中。在这些操作之间，从细胞存活率保持的观点出发，优选预先将混合物冷却至10℃以下。
冻结步骤优选在混合步骤完成后尽快(例如30分钟以内、优选为10分钟以内)进行。冷却速度无特别限定，但优选以慢速进行冷却，例如能够设为1℃/分钟～3℃/分钟的冷却速度。以慢速进行冷却的情况下，例如使用编程冷冻机(プログラムフリーザー)等即可。最终的冻结的温度无特别限定，优选为-80℃以下，更优选为-150℃以下，进一步优选为-195.8℃以下。保存的温度越低，越能够在更长的期间、更良好的状态下保存。另外，可以将在-80℃左右被冻结的混合物转移到-180℃～-200℃(例如、液态氮中)下保存。优选移入耐寒性的容器而冻结。
使用本发明涉及的冻结保存方法而被冻结保存的脐带血或者末梢血在解冻后表现出良好的细胞存活率(参照后述的实施例)。使用本发明涉及的冻结保存方法而被冻结保存的脐带血或者末梢血例如经过2～3个月后，在冻结前为100％的情况下能够以80％以上、优选85％以上的细胞存活率回收细胞。另外，使用本发明涉及的冻结保存方法而被冻结保存的脐带血或者末梢血经过1个月后、经过3个月后、经过6个月后、经过1年后、经过3年后、经过5年后、或者经过10年后，或者经过更长时间后(半永久地)，在冻结前为100％的情况下能够以80％以上、优选85％以上的细胞存活率回收细胞。CD34阳性细胞的存活率尤其良好，能够为90％以上，优选为95％以上，更优选为98％以上。
因此，如果使用本发明涉及的冻结保存方法提前冻结保存脐带血或者末梢血，则在将来自己或他人的医疗时，能够解冻而使用。另外，有可能在当前的技术中未被分离的未知的细胞在将来能够进行分离时能够有效地使用。例如，即使是当前没有治疗法的疾患，在将来开发了治疗法时，能够利用预先冻结保存的脐带血或者末梢血。另外，在先天性基因疾患等中，也能够作为基因治疗用的自体细胞源利用。
另外，使用本发明涉及的冻结保存方法而被冻结保存的脐带血或者末梢血，在解冻后显示出良好的TNC(总有核细胞)回收率、CD34阳性细胞回收率、以及总CFU回收率(参照后述的实施例)。使用本发明涉及的冻结保存方法而被冻结保存的脐带血或者末梢血例如在经过2～3个月后，在冻结前为100％的情况下能够以92.5％以上的TNC(总有核细胞)回收率回收细胞。使用本发明涉及的冻结保存方法而被冻结保存的脐带血或者末梢血例如在经过2～3个月后，在冻结前为100％的情况下能够以67.1％以上的CD34阳性细胞回收率回收细胞。使用本发明涉及的冻结保存方法而被冻结保存的脐带血或者末梢血例如在经过了2～3个月后，在冻结前为100％的情况下能够以71.9％以上的总CFU回收率回收细胞。
在本发明中，即使不使用葡聚糖，也能够良好地冻结保存脐带血或者末梢血。因此，在解冻后能够对生物体安全地适用。另外，能够仅混合冻结保存用溶液和脐带血或者末梢血，不需要另外的添加的操作，迅速地冻结保存提取后的脐带血或者末梢血。
另外，在混合步骤中得到的脐带血或者末梢血和冻结保存用溶液的混合物(组合物)也在本发明的范围内。
[冻结保存的脐带血或者末梢血的解冻方法]
解冻使用本发明涉及的冻结保存方法冻结保存的脐带血或者末梢血的方法无特别限定。虽然解冻的温度无特别限定，但优选在30～40℃的范围内，更优选在37～40℃的范围内。解冻优选快速进行，例如，使用37～38℃的恒温水槽解冻即可。
解冻的脐带血或者末梢血能够在医疗或者研究等中使用。在一例中，解冻的脐带血或者末梢血既可以直接与冻结保存用溶液共同注入生物体，也可去除冻结保存用溶液后注入生物体。或者，也可以从解冻的脐带血或者末梢血回收活细胞。解冻的脐带血或者末梢血，或回收的活细胞，例如通过血管内输入等的方法注入生物体。如上所述，解冻的脐带血或者末梢血显示出良好的细胞存活率以及回收率。
因此，本发明提供包含将解冻的脐带血或者末梢血输入生物体的输入步骤的脐带血或者末梢血的输入方法。另外，本发明提供包含从解冻的脐带血或者末梢血回收活细胞的细胞回收步骤的从脐带血或者末梢血回收活细胞的回收方法。另外，本发明提供包含将从解冻的脐带血或者末梢血回收的活细胞输入生物体的输入步骤的脐带血或者末梢血的输入方法。
在细胞回收步骤中，回收活细胞的方法无特别限定，例如，能够使用用于从脐带血或者末梢血回收活细胞的公知的方法。回收的活细胞无特别限定，例如列举出造血干细胞等。被回收的活细胞优选为干细胞或者前驱细胞，更优选为造血干细胞。或者，能够是在当前不能分离的未知的细胞。另外，被回收的活细胞不限于包含在脐带血或者末梢血中的原始的细胞，也可以是通过培养技术增殖的细胞(即原始的细胞的复制)。回收的活细胞能够在医疗或者研究等中使用。在医疗中使用的情况下，被回收的活细胞能够向自己或者他人移植。
另外，解冻的脐带血或者末梢血和冻结保存用溶液的混合物(组合物)也是在本发明的范围内。
[脐带血或者末梢血的冻结物以及其制作方法]
本发明涉及的脐带血或者末梢血的冻结物的制作方法包含：混合包含防冻剂以及葡萄糖的冻结保存用溶液和含有活细胞的脐带血或者末梢血的混合步骤；和冻结通过上述混合步骤得到的混合物的冻结步骤。
混合步骤以及冻结步骤的说明与上述的[脐带血或者末梢血的冻结保存方法]中是相同的。
通过本发明涉及的制作方法制作的脐带血或者末梢血的冻结物示出在解冻后良好的细胞存活率(参照后述的实施例)。本发明涉及的脐带血或者末梢血的冻结物例如在经过2～3个月后，在冻结前为100％的情况下能够以80％以上的细胞存活率回收细胞。另外，使用本发明涉及的冻结保存方法冻结保存的脐带血或者末梢血经过1个月后、经过3个月后、经过6个月后、经过1年后、经过3年后、经过5年后、或者经过10年后，或者经过更长时间后(半永久地)，在冻结前为100％的情况下能够以80％以上的细胞存活率回收细胞。
本发明涉及的脐带血或者末梢血的冻结物也可以使用上述的回收方法回收活细胞。回收的活细胞能够在医疗或者研究等中使用。活细胞例如能够是造血干细胞等。另外，本发明涉及的脐带血或者末梢血的冻结物在解冻后，既可以直接注入生物体，也可以去除冻结保存用溶液后注入生物体。
[脐带血或者末梢血的冻结保存用溶液]
本发明涉及的脐带血或者末梢血的冻结保存用溶液包含防冻剂以及葡萄糖。冻结保存用溶液的说明与在上述的[脐带血或者末梢血的冻结保存方法]中所述的内容基本上相同。
在冻结保存用溶液中，防冻剂在一例中，优选包含6.0～20.0w/v％，更优选包含10.0～16.0w/v％或者10.0～16.0v/v％，从细胞回收率以及DMSO量的降低化的观点来看更优选包含10.0v/v％。
在冻结保存用溶液中，葡萄糖在一例中，优选包含0.5～10.0w/v％，更优选包含1.0～10.0w/v％，进一步优选包含2.0～5.0w/v％，尤其优选包含3.0～～4.0w/v％。
[冻结保存用试剂盒]
用于冻结保存本发明涉及的脐带血或者末梢血的试剂盒具备上述的脐带血或者末梢血的冻结保存用溶液和能够储存冻结保存用溶液以及脐带血或者末梢血的耐寒性的容器。
本发明涉及的试剂盒可合适地用于上述的[脐带血或者末梢血的冻结保存方法]以及[脐带血或者末梢血的冻结物以及其制作方法]。
如果容器能够储存冻结保存用溶液以及脐带血或者末梢血，且是耐寒性的，则无特别限定。容器的大小无特别限定，根据储存的脐带血或者末梢血的量适当选择即可。容器的大小例如能够设为容量10mL～100mL、优选设为20mL～30mL。耐寒性的程度如果能够耐保存脐带血或者末梢血的温度则无特别限定，例如，优选能耐-80℃的材料，更优选能耐-200℃的材料。作为这样的容器，列举出聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、以及氟化乙烯丙烯等的合成树脂制的容器。容器优选能够密封，也优选内部被灭菌。
本发明涉及的试剂盒也可以进一步具有试剂盒的使用说明书。在试剂盒的使用说明书中，记录了在上述[脐带血或者末梢血的冻结保存方法]一栏中说明的、本发明涉及的冻结保存方法的内容，以及/或者在上述[脐带血或者末梢血的冻结物以及其制作方法]一栏中说明的本发明涉及的制作方法的内容。另外，在试剂盒的使用说明书中，也可以记载以成为规定的最终浓度的方式使用冻结保存用溶液的主旨的指示。
[总结]
如以上所述，本发明涉及的冻结保存方法是冻结保存脐带血或者末梢血的方法，包含：混合包含防冻剂以及葡萄糖的冻结保存用溶液和脐带血或者末梢血的混合步骤；和冻结通过上述混合步骤得到的混合物的冻结步骤。
在本发明涉及的冻结保存方法中，优选上述冻结保存用溶液不包含增粘剂。
在本发明涉及的冻结保存方法中，优选上述冻结保存用溶液不包含天然的动物来源成分。
在本发明涉及的冻结保存方法中，优选上述防冻剂为二甲基亚砜。
在本发明涉及的冻结保存方法中，在上述混合物中，优选包含3.0～10.0w/v％的防冻剂、包含0.25～5.0w/v％的葡萄糖。
在本发明涉及的冻结保存方法中，在上述混合步骤中，优选将上述冻结保存用溶液与上述脐带血或者末梢血以1：1～3：1混合。
在本发明涉及的冻结保存方法中，优选上述脐带血或者末梢血去除了红血球的至少一部分。
在本发明涉及的冻结保存方法中，优选上述脐带血或者末梢血为人类来源。
本发明涉及的制作方法是制作脐带血或者末梢血的冻结物的方法，包含：混合包含防冻剂以及葡萄糖的冻结保存用溶液和含有活细胞的脐带血或者末梢血的混合步骤；和冻结通过上述混合步骤得到的混合物的冻结步骤。
本发明也提供使用上述制作方法制作的脐带血或者末梢血的冻结物。
本发明涉及的脐带血或者末梢血的冻结保存用溶液包含防冻剂以及葡萄糖。
本发明涉及的冻结保存用试剂盒是用于冻结保存脐带血或者末梢血的试剂盒，具备上述脐带血或者末梢血的冻结保存用溶液和能够存储冻结保存用溶液以及脐带血或者末梢血的耐寒性的容器。
以下示出实施例，关于本发明的实施方式进一步详细说明。当然，本发明不限定于以下的实施例，自不必说关于细节能够采用各种方式。而且，本发明不限定于上述实施方式，在权利要求所示的范围内能够进行各种变化，适当组合分别公开的技术手段而得到的实施方式也包含在本发明的技术范围中。另外，本说明书中记载的文献全文作为参考引用。
实施例
＜实施例1＞
[冻结保存用溶液的制备]
冻结保存用溶液A(实施例)：
制备包含10.0v/v％(11.0w/v％)的DMSO、3.0w/v％的葡萄糖、适量的pH调整剂的灭菌的水溶液作为冻结保存用溶液A。
冻结保存用溶液B(比较例)：
制备包含50.0％v/v(55w/v％)的DMSO、5.0w/v％的葡聚糖(Dex40)的灭菌的水溶液作为冻结保存用溶液B。
[脐带血的处理]
(1.添加HES)
计算原料脐带血液量的1/5容量的羟乙基淀粉(HES)。接着，在安全柜内，在原料脐带血袋上插入操作适配器。使用注射器，添加需要量的HES。充分地混合原料脐带血和HES。
(2.细胞分离)
用钳子夹止原料脐带血袋的软管后，使用无菌接合装置(TSCD)与细胞用分离袋连接。将原料脐带血袋设置于分离立架(分離スタンド)，静置至红血球与血浆之间的分界面变得清晰(大约60～90分钟之间)。分界面变得清晰后，打开调节夹，将血浆以及白血球层(血沉棕黄层)转移至细胞用分离袋。此时，红血球层的混入量达到3g。用调节夹夹止软管后，使用血袋封口机将原料脐带血袋与细胞用分离袋密封并分开。
(3.血浆去除)
从包装上用钳子夹止血浆去除用分离袋的软管前端部分后将包装开封，在与软管的钳子相比更靠近袋侧的位置密封(维持袋的无菌状态直至TSCD接合)。确认细胞用分离袋而在血浆去除用分离袋上写入脐带血管理编号或者贴标签，确认彼此的编号的一致性。用钳子夹止细胞用分离袋的软管后，使用无菌接合装置(TSCD)与血浆去除用分离袋连接。将连接的细胞用分离袋和血浆去除用分离袋以在大容量离心机的转子上立起的状态插入。将离心分离条件设定为400×G、10分钟进行离心分离。在离心分离结束后，将细胞用分离袋设置在分离立架上。去掉调节夹，将血浆转移至血浆去除用分离袋。此时，在与冻结保存用溶液A混合的情况下，调整血浆量以使细胞用分离袋中的浓缩脐带血容量为大约13.0mL。另外，在与冻结保存用溶液B混合的情况下，调整血浆量以使细胞用分离袋中的浓缩脐带血容量为23.4mL。使用血袋封口机密封软管并分开细胞用分离袋和血浆去除用分离袋。测定并记录细胞用分离袋的重量。
(4.冻结保存用溶液的添加)
以能够通过保冷剂冷却细胞用分离袋的方式在搅拌器上设置细胞用分离袋。对于冻结保存用溶液A，将注射器泵的注入速度(流量)设定为120mL/hr并确认(4档)。另外，对于冻结保存用溶液B将注射器泵的注入速度(流量)设定为20mL/hr并确认。将预先冷却的冻结保存用溶液A或者冻结保存用溶液B在注射器中按需要量取液。在取液的注射器中安装带翼静脉注射针而设置在注射器泵上。将带翼静脉注射针插入操作适配器，一边冷却搅拌一边注入冻结保存用溶液。此时，冻结保存用溶液A为13.0mL、冻结保存用溶液B为4.4mL。因此，关于冻结时的最终浓度，对于冻结保存用溶液A，DMSO为5.0v/v％，葡萄糖为1.5w/v％；对于冻结保存用溶液B，DMSO为8.0v/v％、葡聚糖(Dex40)为0.8w/v％。
(5.细胞数测定用样本提取)
确认细胞用分离袋的脐带血管理编号而在样本用试管上贴上标签。在细胞用分离袋中插入操作适配器，使细胞用分离袋中的细胞均匀地漂浮，将冻结前脐带血0.5mL提取至检测用试管。进一步提取0.5mL的无菌试验用样本。
(6.向冻结袋的转移)
将冻结袋的塑料针刺入细胞用分离袋的端口，将冻结前脐带血全部转移至冻结袋。在冻结袋的软管中充满冻结前脐带血，制作分段(セグメント)。测定冻结袋的最终重量，记录使用的电子天秤编号以及最终重量。冻结前脐带血通过保冷剂冷却直至冻结处理开始。另外，从冻结保存用溶液A的添加结束30分钟以内开始冻结。
(7.冻结)
确认冻结袋、存储罐、分段以及作业记录用纸的脐带血管理编号一致，将冻结袋收纳在存储罐中。使用编程冷冻机，以冷却速度1～3℃/分钟的条件进行冻结处理。测定每个冻结步骤冻结时的温度变化并记录。冻结处理结束后，迅速转移至液氮罐的气相中。
[冻结保存的脐带血的解冻]
将冻结保存2～3个月的脐带血带着冻结包放入35～37℃的恒温水槽而解冻。解冻后，冰冷直至开始各试验时。
[造血细胞关联检测]
(1.有核细胞检测)
对于冻结前的脐带血以及解冻后的脐带血，检测WBC(白血球)以及NRBC(有核红血球)。作为检测设备，使用自动血球计数装置：Sysmex XE-2100。这是基于使用半导体激光的流式细胞分析法的仪器。使用的试剂(Sysmex株式会社)如表1所示。
表1
用Cellpack适当稀释样本并充分地搅拌。测定通过手动模式进行。使用检测数据，求出有核细胞数浓度[(WBC+NRBC)×稀释倍率]。使用该有核细胞数浓度求出TNC(总有核细胞)回收率。
(2.CD34阳性细胞数/细胞存活率检测)
对于冻结前的脐带血以及解冻后的脐带血，检测CD34阳性细胞数以及细胞存活率。作为检测设备，使用流式细胞仪(以下称为FCM)：Cytomics FC500(BECKMAN COULTER社制)。这是基于使用半导体激光的流式细胞分析法的仪器。另外，作为解析用软件，使用stemCXP software(BECKMAN COULTER社制)。使用CD34阳性细胞数测定试剂盒(StemKit，BECKMAN COULTER社A15573)测定，其他试剂类如表2所示。
表2
确认样本量以及样本编号，用2％FBSPBS(-)适当稀释样本。准备三支样本用试管(BECKMAN COULTER社制，A26428)，记入样本编号以及SEQ号(1～3)。在试管1、2中添加7-AAD和CD45-FITC/CD34-PE各20μL。在试管3中添加7-AAD和CD45-FITC各20μL。在所有试管中添加100μL样本并充分地混合。在室温、暗处反应20分钟时间。用精制水10倍稀释溶血剂(NH4ClLysingSolution)，在各试管中添加2mL(溶血剂在用时调制)并充分地混和。在室温、暗处反应10分钟。
启动CXP程序，设定测定面板。输入样本编号等，开始测定。测定结束后，确认数据，在需要修正Gate的情况下，实施Listmode playback，修正Gate。
基于解析数据求出CD34阳性细胞浓度以及CD34阳性细胞数。对于解冻后的脐带血还求出细胞存活率。
(3.菌落形成细胞(CFU)数检测)
关于冻结前的脐带血以及解冻后的脐带血检测CFU-GM数以及总CFU数。使用的试剂(STEMCELL Technologies社)如表3所示。
表3
| 试剂名 | 使用量/分析物 |
| CFU用培养基：MethoCult H4034 Optimum(st04044V) | 大约4mL |
| 样本稀释用：包含2％FBS的IMDM | 适量 |
| 培养皿湿润用：灭菌蒸馏水 | 大约6mL |
将冻结保存(-15～-25℃)的MethoCult H4034 Optimum(st04044V)(大约4mL)从冷冻机取出，在室温以下解冻。用含有2％FBS的IMDM培养基稀释以使样本的有核细胞浓度为大约400个/μL，并充分地搅拌。在解冻的MethoCult H4034 Optimum(st04044V)4mL中添加调整了有核细胞浓度的样本400μL，用搅拌机激烈搅拌。静置大约5分钟直至大气泡浮上来。
使用甲基纤维素用注射器以及针，将与培养基混合后的样本分别向三个35mm培养皿分注1.1mL。与注入了大约3mL的灭菌蒸馏水的蒸馏水用35mm培养皿共同收纳于90mm培养皿中。放入CO2恒温箱，在37℃、5％CO2、湿度100％的条件下培养12～15日。
培养后，在倒立显微镜(尼康制TS100或者奥林巴斯制IX71-PH)下计算CFU数。基于计算值，求出CFU-GM数以及总CFU数。使用这些值，求出CFU-GM回收率以及总CFU回收率。
(4.结果)
在表4中总结各造血细胞关联检测的结果(数值的单位是％)。
表4
＜实施例2＞
[冻结保存用溶液的制备]
冻结保存用溶液C(实施例)：
制备包含16.0v/v％(17.6w/v％)的DMSO、3.0w/v％的葡萄糖、适量的pH调整剂的灭菌的水溶液作为冻结保存用溶液C。
冻结保存用溶液B(比较例)：
制备包含50.0％v/v(55w/v％)的DMSO、5.0w/v％的葡聚糖(Dex40)的灭菌的水溶液作为冻结保存用溶液B。
[脐带血的处理]
以与实施例1相同的顺序进行。另外，关于冻结时的最终浓度，对于冻结保存用溶液C，DMSO为8.0v/v％，葡萄糖为1.5w/v％那样；对于冻结保存用溶液B，DMSO为8.0v/v％、葡聚糖(Dex40)为0.8w/v％。
[冻结保存的脐带血的解冻]
将冻结保存2个月的脐带血带着冻结袋放入35～37℃的恒温水槽而解冻。解冻后，冰冷直至开始各试验。
[造血细胞关联检测]
与实施例1相同地进行。
(结果)
在表5中总结各造血细胞关联检测的结果(数值的单位为％)。另外，在实施例1的表4中，由于用冻结保存用溶液A和冻结保存用溶液B提取脐带血的时间点不同，所以在表5中也记载了在考虑这一点的情况下重新计算的结果。另外，对于表5的冻结保存用溶液C，是考虑了脐带血提取的时间点而计算的。另外，对于冻结保存用溶液B，由于在实施例1和实施例2中评价方法相同，所以在表5中合计。
表5
＜实施例3＞
使用同一样本进行脐带血的冻结保存的比较实验。
[冻结保存用溶液的制备]
冻结保存用溶液A(实施例)：
制备包含10.0v/v％(11.0w/v％)的DMSO、3.0w/v％的葡萄糖、适量的pH调整剂的灭菌的水溶液作为冻结保存用溶液A。
冻结保存用溶液C(实施例)：
制备包含16.0v/v％(17.6w/v％)的DMSO、3.0w/v％的葡萄糖、适量的pH调整剂的灭菌的水溶液作为冻结保存用溶液C。
[脐带血的处理]
以与实施例1相同的顺序去除红血球，离心浓缩至26.5mL。在此，将0.5mL作为冻结前的脐带血样品提取后，将剩余分成两份(13.0mL)。将此以与实施例1相同的顺序，与13.0mL的冻结保存用溶液A或者冻结保存用溶液C混合。然后，以与实施例1相同的顺序，将其冻结保存。另外，关于冻结时的最终浓度，对于冻结保存用溶液A，DMSO为5.0v/v％，葡萄糖为1.5w/v％；对于冻结保存用溶液C，DMSO为8.0v/v％、葡萄糖为1.5w/v％。
[冻结保存的脐带血的解冻]
将冻结保存2个月的脐带血带着冻结包放入35～37℃的恒温水槽而解冻。解冻后、冰冷直至开始各试验。
[造血细胞关联检测]
与实施例1同样地进行。
[结果]
在表6中总结各造血细胞关联检测的结果(数值的单位为％)。
表6
冻结保存用溶液A与冻结保存用溶液C相比，细胞回收率高，另外从输入的DMSO量的降低化的观点来看，认为更优选。
本发明能够利用于医疗以及研究等中的脐带血以及末梢血的冻结保存。
Claims (12)
1.一种脐带血或者末梢血的冻结保存方法，其中，包含：
混合步骤，其中，混合包含防冻剂以及葡萄糖的冻结保存用溶液和脐带血或者末梢血；以及
冻结步骤，其中，冻结通过所述混合步骤得到的混合物。
2.根据权利要求1所述的冻结保存方法，其中，
所述冻结保存用溶液不包含增粘剂。
3.根据权利要求1或2所述的冻结保存方法，其中，
所述冻结保存用溶液不包含天然的动物来源成分。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的冻结保存方法，其中，
所述防冻剂为二甲基亚砜。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的冻结保存方法，其中，
在所述混合物中，包含3.0～10.0w/v％的防冻剂，包含0.25～5.0w/v％的葡萄糖。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的冻结保存方法，其中，
在所述混合步骤中，将所述冻结保存用溶液和所述脐带血或者末梢血以1：1～3：1的体积比混合。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的冻结保存方法，其中，
所述脐带血或者末梢血去除了红血球的至少一部分。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的冻结保存方法，其中，
所述脐带血或者末梢血是人类来源。
9.一种脐带血或者末梢血的冻结物的制作方法，其中，包含：
混合步骤，其中，混合包含防冻剂以及葡萄糖的冻结保存用溶液和包含活细胞的脐带血或者末梢血；以及
冻结步骤，其中，冻结通过所述混合步骤得到的混合物。
10.一种脐带血或者末梢血的冻结物，其使用权利要求9所述的制作方法而制作。
11.一种脐带血或者末梢血的冻结保存用溶液，其包含防冻剂以及葡萄糖。
12.一种脐带血或者末梢血的冻结保存用试剂盒，其中，具备：
如权利要求11所述的脐带血或者末梢血的冻结保存用溶液；和
能够储存冻结保存用溶液以及脐带血或者末梢血的耐寒性的容器。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211403200.2A CN115777690A (zh) | 2014-11-14 | 2015-11-13 | 脐带血以及末梢血的冻结保存方法以及冻结保存用溶液 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2014-232211 | 2014-11-14 | ||
| JP2014232211 | 2014-11-14 | ||
| JP2015121460 | 2015-06-16 | ||
| JP2015-121460 | 2015-06-16 | ||
| PCT/JP2015/082034 WO2016076428A1 (ja) | 2014-11-14 | 2015-11-13 | 臍帯血および末梢血の凍結保存方法および凍結保存用溶液 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211403200.2A Division CN115777690A (zh) | 2014-11-14 | 2015-11-13 | 脐带血以及末梢血的冻结保存方法以及冻结保存用溶液 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106999518A true CN106999518A (zh) | 2017-08-01 |
Family
ID=55954503
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201580061720.1A Pending CN106999518A (zh) | 2014-11-14 | 2015-11-13 | 脐带血以及末梢血的冻结保存方法以及冻结保存用溶液 |
| CN202211403200.2A Pending CN115777690A (zh) | 2014-11-14 | 2015-11-13 | 脐带血以及末梢血的冻结保存方法以及冻结保存用溶液 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211403200.2A Pending CN115777690A (zh) | 2014-11-14 | 2015-11-13 | 脐带血以及末梢血的冻结保存方法以及冻结保存用溶液 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20170303530A1 (zh) |
| EP (1) | EP3219320B1 (zh) |
| JP (1) | JP6531256B2 (zh) |
| CN (2) | CN106999518A (zh) |
| WO (1) | WO2016076428A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110129179A (zh) * | 2019-05-29 | 2019-08-16 | 江苏省北科生物科技有限公司 | 一种三联袋以及应用三联袋分离脐带血造血干细胞的方法 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10456423B2 (en) | 2016-06-13 | 2019-10-29 | SMART SURGICAL, Inc. | Compositions for biological systems and methods for preparing and using the same |
| US10426796B2 (en) * | 2016-06-13 | 2019-10-01 | SMART SURGICAL, Inc. | Compositions for biological systems and methods for preparing and using the same |
| WO2018084228A1 (ja) * | 2016-11-04 | 2018-05-11 | 国立大学法人東京大学 | 動物細胞又は動物組織の凍結保存用溶液、凍結物、及び凍結保存方法 |
| WO2018225673A1 (ja) | 2017-06-06 | 2018-12-13 | Ｄｓファーマアニマルヘルス株式会社 | 細胞凝集低減方法および細胞凝集が低減された治療用組成物 |
| CN110100812A (zh) * | 2019-05-30 | 2019-08-09 | 南京艾德免疫治疗研究院有限公司 | 一种免疫细胞的冻存回输液、冻存方法及回输应用 |
| KR20230173111A (ko) * | 2021-03-22 | 2023-12-26 | 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 | 암에 대하여 향상된 효능을 갖는 조작된 자연 살해 세포의 제조를 위한 동결보존 제대혈 단위의 선별 방법 |
| WO2024015813A1 (en) * | 2022-07-11 | 2024-01-18 | Ossium Health, Inc. | Methods and compositions for cryopreserving subpopulations of lymphocytes |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1347983A (zh) * | 2000-10-11 | 2002-05-08 | 四川省脐血干细胞中心有限公司 | 用于保存脐带血造血干细胞的低温保存剂 |
| US6869758B1 (en) * | 2000-07-26 | 2005-03-22 | University Of Kentucky Research Foundation | Method and device for removal of cryoprotectant from cryopreserved biological cells and tissues |
| CN101142310A (zh) * | 2005-01-27 | 2008-03-12 | 雷格内泰克公司 | 提供容易获得的源于脐带血的细胞材料的方法及其组合物 |
| CN101310009A (zh) * | 2005-11-17 | 2008-11-19 | 日本全药工业株式会社 | 细胞保存用水溶液 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2003238620B2 (en) * | 2002-01-31 | 2008-11-06 | Asahi Techno Glass Corporation | Liquid for frozen storage of primate embryo stem cells and frozen storage method |
| WO2005009397A2 (en) * | 2003-02-21 | 2005-02-03 | Hasumi Llc (Dba Shukokai International) | Human lymphocyte vaccine adjuvant |
| KR20070114378A (ko) * | 2005-02-28 | 2007-12-03 | 리제네텍 인코포레이티드 | 말초혈액으로부터 유도된 쉽게 이용가능한 세포 물질을 제공하는 방법 및 그의 조성물 |
| KR101368035B1 (ko) * | 2005-04-08 | 2014-02-26 | 아르고스 쎄라퓨틱스 인코포레이티드 | 수지상 세포 조성물 및 방법 |
| BRPI0610968A2 (pt) * | 2005-06-02 | 2019-05-14 | Stemcyte, Inc. | composição de sangue de cordão umbilical, e, métodos para tratar uma doença maligna ou distúrbio benigno associado com o sistema hemoatopoiético e para preparar uma composição de sangue umbilical |
| JP2008237136A (ja) * | 2007-03-28 | 2008-10-09 | Foundation For Biomedical Research & Innovation | ヒト造血細胞の培養方法 |
| CA2597963A1 (en) * | 2007-08-20 | 2009-02-20 | Regenetech, Inc. | Method of providing readily available cellular material derived from peripheral blood and a composition thereof |
| US20090104650A1 (en) * | 2007-09-14 | 2009-04-23 | Cryo-Cell International, Inc. | Infectious diseases testing of menstrual fluid, endometrial/menstrual cells, amniotic fluid, umbilical cord blood or other samples |
| KR100953400B1 (ko) * | 2007-12-06 | 2010-04-20 | 주식회사 바이넥스 | 고농도 말초혈액단핵구의 항암 치료제 제조를 위한 장기간 냉동 보존 방법 |
| CA2891198A1 (en) * | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Pharmacosmos A/S | Cryoprotecting agent, cryoprotecting and cryopreserved compositions, uses thereof, and methods of cryopreservation |
| CN105308175B (zh) * | 2013-03-11 | 2018-09-21 | 日本化学研究株式会社 | 人角膜上皮片的制造法 |
| CN103563888B (zh) * | 2013-10-31 | 2015-11-25 | 北京永泰生物制品有限公司 | 细胞冻存液 |
| JP6745449B2 (ja) * | 2013-12-27 | 2020-08-26 | ゼノアックリソース株式会社 | 臍帯組織の凍結保存方法 |
| WO2015150394A1 (en) * | 2014-04-01 | 2015-10-08 | Pharmacosmos A/S | Cryoprotective agent, cryoprotective and cryopreserved compositions, uses thereof, and methods of cryopreservation |
-
2015
- 2015-11-13 JP JP2016559123A patent/JP6531256B2/ja active Active
- 2015-11-13 US US15/526,175 patent/US20170303530A1/en not_active Abandoned
- 2015-11-13 CN CN201580061720.1A patent/CN106999518A/zh active Pending
- 2015-11-13 WO PCT/JP2015/082034 patent/WO2016076428A1/ja active Application Filing
- 2015-11-13 CN CN202211403200.2A patent/CN115777690A/zh active Pending
- 2015-11-13 EP EP15859595.9A patent/EP3219320B1/en active Active
-
2023
- 2023-02-08 US US18/107,320 patent/US20230180740A1/en active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6869758B1 (en) * | 2000-07-26 | 2005-03-22 | University Of Kentucky Research Foundation | Method and device for removal of cryoprotectant from cryopreserved biological cells and tissues |
| CN1347983A (zh) * | 2000-10-11 | 2002-05-08 | 四川省脐血干细胞中心有限公司 | 用于保存脐带血造血干细胞的低温保存剂 |
| CN101142310A (zh) * | 2005-01-27 | 2008-03-12 | 雷格内泰克公司 | 提供容易获得的源于脐带血的细胞材料的方法及其组合物 |
| CN101310009A (zh) * | 2005-11-17 | 2008-11-19 | 日本全药工业株式会社 | 细胞保存用水溶液 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| R YAMAGUCHI ET AL.,: "Plasticizer concentration in cord blood cryopreserved with DMSO", 《BONE MARROW TRANSPLANTATION》 * |
| 刘斌等: "采用二甲基亚砜和右旋糖酐冻存脐血造血细胞的研究", 《中华儿科杂志》 * |
| 许遵鹏等: "二甲基亚砜和右旋糖酐对脐血造血细胞的低温保护作用", 《临床血液学杂志》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110129179A (zh) * | 2019-05-29 | 2019-08-16 | 江苏省北科生物科技有限公司 | 一种三联袋以及应用三联袋分离脐带血造血干细胞的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20230180740A1 (en) | 2023-06-15 |
| WO2016076428A1 (ja) | 2016-05-19 |
| CN115777690A (zh) | 2023-03-14 |
| EP3219320A1 (en) | 2017-09-20 |
| EP3219320A4 (en) | 2017-11-15 |
| JP6531256B2 (ja) | 2019-06-19 |
| EP3219320B1 (en) | 2019-05-01 |
| JPWO2016076428A1 (ja) | 2017-08-24 |
| US20170303530A1 (en) | 2017-10-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106999518A (zh) | 脐带血以及末梢血的冻结保存方法以及冻结保存用溶液 | |
| EP2271209B1 (en) | Materials and methods for hypothermic collection of whole blood | |
| US20150306288A1 (en) | Method for preserving placental blood | |
| CN107006453A (zh) | 一种脐带间充质干细胞冻存液及其使用方法 | |
| JP5899246B2 (ja) | 幹細胞の包装製品並びに同包装製品を作製する方法および輸送する方法 | |
| CN109511651A (zh) | 一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法 | |
| CN107106488A (zh) | 海藻糖在细胞混悬液中的用途 | |
| CN109913416B (zh) | 一种用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂的配制方法 | |
| CN103764028B (zh) | 凝固控制剂和包含凝固控制剂的装置 | |
| CN107711823A (zh) | 一种常温保存的细胞冻存液及其应用 | |
| Sputtek et al. | Cryopreservation of erythrocytes, thrombocytes, and lymphocytes | |
| AU2014255527B2 (en) | Methods of cell separation | |
| CN107041362B (zh) | 一种肿瘤组织块深低温冷冻方法 | |
| EP0061277B1 (en) | Anaerobic method for preserving whole blood, tissue and components containing living mammalian cells | |
| CN109195445A (zh) | 活细胞组合物及其相关方法 | |
| CN111374123B (zh) | 中性氨基酸作为细胞低温保护剂的使用方法及其应用 | |
| JP7328729B2 (ja) | 細胞の保存方法 | |
| RU2263448C1 (ru) | Способ криоконсервирования пуповинной крови | |
| CN111701097A (zh) | 一种脐带血造血干细胞解冻后清洗装置及基于其的解冻清洗与保存方法 | |
| CN117063913A (zh) | 用于外周血造血干细胞的冻存液及冻存方法 | |
| CN113632784A (zh) | 一种干细胞冻存保护剂及其使用方法 | |
| CN111676192A (zh) | 一种脐带来源的间充质干细胞培养方法 | |
| GB2525202A (en) | Methods of cell separation | |
| CN106727699A (zh) | 用于免疫治疗的制剂及其制备方法 | |
| Afreen et al. | Evaluation of procedures for quantification of CD34 haematopoietic stem cells and viability studies in umbilical cord blood derived mononuclear cells. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: Tokyo Applicant after: JAPAN RED CROSS Applicant after: Sinogen Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: Tokyo Applicant before: JAPAN RED CROSS Applicant before: Zenoaq Resource Co.,Ltd. |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170801 |