JP5899246B2 - 幹細胞の包装製品並びに同包装製品を作製する方法および輸送する方法 - Google Patents

Description

本発明は、種々の幹細胞の包装および輸送のための方法および製品に関する。

幹細胞は、有糸分裂によってそれら自体再生し、多様な範囲の特殊な細胞種に分化する能力を特徴とする細胞種である。ヒト幹細胞は一般に、自己再生し、かつ、種々の成熟ヒト細胞系譜を生成することができる全能性または多能性前駆細胞である。この能力は器官および組織の発達に必要な細胞の分化および特殊化の基礎として働く。幹細胞を用いて、全てではないにしても多くの組織を再定着させ、生理学的および解剖学的機能を回復させることができるということを証明する最近の証拠もある。よって、幹細胞は、神経系外傷、悪性腫瘍、遺伝病、ヘモグロビン症、および免疫不全を含む多様な疾患および損傷を治療する際に使用できる可能性を有する。多くの異なるタイプの哺乳動物幹細胞が同定されている。例としては胚性幹細胞、胚性生殖細胞、成体幹細胞、およびその他の運命付けられた幹細胞または前駆細胞が挙げられ、知られている。さらに、臍帯血は、間葉系幹細胞ならびに造血幹細胞および前駆細胞の既知の代替供給源である。

しかしながら、これらの細胞の適用はしばしば論理的問題によって阻まれる。例えば、幹細胞（臍帯血細胞を含む）は、ひと度採取されると、通常、貯蔵施設（細胞バンクなど）で低温保存され、必要であれば、その施設から病院へ輸送される。細胞または組織が０℃より低い温度、一般に７７Ｋまたは−１９６℃（液体窒素の沸点）まで冷却することにより保存されるこの低温保存法は、ある種のリスクを必然的に伴う。例えば、保存される細胞は、低温化アプローチ中の凍結または室温への温めのために損傷を受ける場合がある。幹細胞移植の最も重要な側面の１つは生存力のある幹細胞の数と移植時におけるそれらの発達能であることから、これらのリスクは幹細胞（臍帯血細胞を含む）にとっては特に重大である。この懸念から、幹細胞は通常、できる限り短時間で低温保存輸送される。実際に、ドライアイス上でのまたは液体窒素シッパー中での一晩の輸送が業界標準であり、温度の監視にもさらに注意を払わなければならない。これを行ってもなお、前記のリスクはなくならない。また、それは特別にコストがかかり、長距離（例えば、大陸横断）輸送には実用的でない。

従って、幹細胞を輸送するより実用的なプロセスまたは方法が強く求められている。本発明はこの必要性、またその他の必要性を満たすものである。

本発明は、少なくとも一部には、幹細胞を包装および輸送するための方法が低温保存を必要とせず、かつ、幹細胞の生存率または発達能を著しく損なわないという予期しない発見に基づくものである。

よって、本発明の一態様は、複数の多能性細胞を含有する組成物及び基質を含む容器とを含む包装製品を特徴とし、基質はポリマーからなる。ポリマーはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ペルフルオロアルコキシ（ＰＦＡ）、フッ化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエチレン、またはポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）であり得、低摩擦または非粘着性の特性を有する。ポリマーはまた、超低密度ポリエチレン、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、直鎖低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、同軸延伸ポリプロピレン（ＣＯＰＰ）、二軸延伸ポリプロピレン（ＢＯＰＰ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ナイロンなどのポリミド（ｐｏｌｙｍｉｄｅ）樹脂、エチレンビニルアルコールポリマー（ＥＶＯＨ）、およびそれらの金属化型といった、生物製品に好適な他のポリマーであってもよい。

包装製品は、限定されるものではないが、バッグ、シリンジまたは注射器用バイアルを含む、いずれの好適な形状であってもよい。一例では、製品は、臨床使用のための幹細胞が充填済みである。多能性細胞は、造血幹細胞または間葉系幹細胞などの幹細胞であり得る。組成物は、末梢血細胞、臍帯血細胞、または骨髄細胞を含有することができる。

組成物は、５〜４０℃、例えば、５〜３７℃、５〜３０℃、１０〜３０℃または１５〜２５℃の範囲内の温度を有し得る。組成物は、培養培地、好ましくは、ＣＯ_２非依存性培地（ＣＩＭ： ＣＯ_２ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｄｉｕｍ）を含有し得る。好ましい実施形態では、培地は、例えば、０．５〜２０％（例えば、１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１５、および２０％）の血清、例えば、ヒト血清を含有し得る。別の実施形態では、組成物は医薬組成物であり、薬学上許容される担体を含有する。包装製品は、例えば輸送の目的で密封することができる。組成物は、少なくとも１×１０^６細胞、例えば、２×１０^６、５×１０^６、１０×１０^６、２０×１０^６、４０×１０^６、８０×１０^６、１００×１０^６、または２００×１０^６細胞を含有し得る。上述の細胞は、ＣＤ３４^＋、ＣＤ１３３^＋、ＣＤ３４^＋ＣＤ１３３^＋、またはその他の幹細胞種であり得る。

一実施形態において、上述の細胞（例えば、末梢血細胞、臍帯血細胞、または骨髄）は、凍結および解凍されたもの、例えば、血液バンクから入手されるものであり得る。その場合、培地は、約１０〜１００Ｕ／ｍｌ、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００Ｕ／ｍｌのＤＮＡｓｅ（例えば、ヒトＤＮＡｓｅ）を含有する可能性がある。あるいは、細胞は、ドナーから新しく得られ、凍結されていないものでもよく、この場合には、ＤＮＡｓｅは必要でなく、組成物はＤＮＡｓｅを含んでいない。

第２の態様において、本発明は、上述の包装製品を作製するための方法を特徴とする。この方法は、（ａ）多能生細胞を含有する組成物を準備する工程；（ｂ）ポリマーからなる基質を含む容器を準備する工程；（ｃ）組成物を容器に入れる工程；および（ｄ）容器を密封する工程を含む。

第３の態様において、本発明は、幹細胞を輸送するための方法を特徴とする。この方法は、上述の包装製品を準備する工程および包装製品を、受取人、例えば、急送便業者、受け取り病院の代理人または担当者などに配送する工程を含む。配送工程において、温度は、５〜４０℃、例えば、５〜３７℃、５〜３０℃、１０〜３０℃、１２〜２８℃、または１５〜２５℃の範囲内（すなわち、室温またはＲＴ）であり得る。この方法を使用すれば、細胞は、１〜８日、例えば、少なくとも２４時間または２、３、４、５、６、７、もしくは８日かけて配送することができる。

配送時、多能性細胞は、４０％を超える（例えば、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％の）回収率を有し得る。また、配送時、多能性細胞は、５０％を超える（例えば、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％の）生存率（本明細書で開示されるトリパンブルー排除法で測定）を有し得る。一実施形態では、配送時、多能性細胞は、０．５％を超える（例えば、０．５５％、０．６％、０．６５％、０．７％、０．７５％、０．８％、０．８５％、０．９％、０．９５％、１．０％、１．１％、１．１５％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、または２．０％の）ＣＤ３４^＋細胞を有し得る。別の実施形態では、配送時、多能性細胞は、０．２５％を超える（例えば、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．５５％、０．６％、０．６５％、０．７％、０．７５％、０．８％、０．８５％、０．９％、０．９５％、１．０％、１．１％、１．１５％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、または２．０％の）ＣＤ１３３^＋細胞を有し得る。さらに別の実施形態では、配送時、多能性細胞は、２を超える（例えば、５、１０、１５、２０、２５、または３０）ＣＦＵ／５×ｌ０^４細胞を形成することができる。上述の値は、以下の例に記載されている方法に従って求めることができる。

本発明の１以上の実施形態の詳細を以下の説明で示す。本発明の他の特徴、目的、および利点は、この説明および特許請求の範囲から明らかになる。

幹細胞の収集、処理、輸送、および受取時の検査の例示的手順における操作を示すフローチャートである。 幹細胞を３種類のバッグで３日かけて輸送した場合に、両バッグ種および輸送温度が、回収率（図２Ａ）、細胞生存率（図２Ｂ）、ＣＤ３４^＋細胞集団のレベル（図２Ｃ）、ＣＤ１３３^＋細胞集団のレベル（図２Ｄ）、およびＣＦＵ（図２Ｅ）に異なる程度で影響を及ぼしたことを示す一連の図である。 幹細胞を３種類のバッグで３日かけて輸送した場合に、両バッグ種および輸送温度が、回収率（図２Ａ）、細胞生存率（図２Ｂ）、ＣＤ３４^＋細胞集団のレベル（図２Ｃ）、ＣＤ１３３^＋細胞集団のレベル（図２Ｄ）、およびＣＦＵ（図２Ｅ）に異なる程度で影響を及ぼしたことを示す一連の図である。 幹細胞を３種類のバッグで３日かけて輸送した場合に、両バッグ種および輸送温度が、回収率（図２Ａ）、細胞生存率（図２Ｂ）、ＣＤ３４^＋細胞集団のレベル（図２Ｃ）、ＣＤ１３３^＋細胞集団のレベル（図２Ｄ）、およびＣＦＵ（図２Ｅ）に異なる程度で影響を及ぼしたことを示す一連の図である。 幹細胞を３種類のバッグで３日かけて輸送した場合に、両バッグ種および輸送温度が、回収率（図２Ａ）、細胞生存率（図２Ｂ）、ＣＤ３４^＋細胞集団のレベル（図２Ｃ）、ＣＤ１３３^＋細胞集団のレベル（図２Ｄ）、およびＣＦＵ（図２Ｅ）に異なる程度で影響を及ぼしたことを示す一連の図である。 幹細胞を３種類のバッグで３日かけて輸送した場合に、両バッグ種および輸送温度が、回収率（図２Ａ）、細胞生存率（図２Ｂ）、ＣＤ３４^＋細胞集団のレベル（図２Ｃ）、ＣＤ１３３^＋細胞集団のレベル（図２Ｄ）、およびＣＦＵ（図２Ｅ）に異なる程度で影響を及ぼしたことを示す一連の図である。 ＲＴでの細胞生存率に及ぼすＩＭＤＭおよびＣＩＭの影響を示す図表である。 ＲＴおよび４℃での細胞生存率に及ぼすＩＭＤＭ培地およびＣＩＭ培地の影響を示す図表である。 細胞をＲＴまたは４℃にてテフロン（登録商標）バッグで輸送した場合に、ＣＩＭ培地およびＨＴＳ培地が、細胞回収率（５Ａ）、生存率（５Ｂ）、ＣＤ３４^＋細胞レベル（５Ｃ）、ＣＤ１２３^＋細胞レベル（５Ｄ）、およびＣＦＵ（５Ｅ）に異なる影響を有していたことを示す一連の図である。 細胞をＲＴまたは４℃にてテフロン（登録商標）バッグで輸送した場合に、ＣＩＭ培地およびＨＴＳ培地が、細胞回収率（５Ａ）、生存率（５Ｂ）、ＣＤ３４^＋細胞レベル（５Ｃ）、ＣＤ１２３^＋細胞レベル（５Ｄ）、およびＣＦＵ（５Ｅ）に異なる影響を有していたことを示す一連の図である。 細胞をＲＴまたは４℃にてテフロン（登録商標）バッグで輸送した場合に、ＣＩＭ培地およびＨＴＳ培地が、細胞回収率（５Ａ）、生存率（５Ｂ）、ＣＤ３４^＋細胞レベル（５Ｃ）、ＣＤ１２３^＋細胞レベル（５Ｄ）、およびＣＦＵ（５Ｅ）に異なる影響を有していたことを示す一連の図である。 細胞をＲＴまたは４℃にてテフロン（登録商標）バッグで輸送した場合に、ＣＩＭ培地およびＨＴＳ培地が、細胞回収率（５Ａ）、生存率（５Ｂ）、ＣＤ３４^＋細胞レベル（５Ｃ）、ＣＤ１２３^＋細胞レベル（５Ｄ）、およびＣＦＵ（５Ｅ）に異なる影響を有していたことを示す一連の図である。 細胞をＲＴまたは４℃にてテフロン（登録商標）バッグで輸送した場合に、ＣＩＭ培地およびＨＴＳ培地が、細胞回収率（５Ａ）、生存率（５Ｂ）、ＣＤ３４^＋細胞レベル（５Ｃ）、ＣＤ１２３^＋細胞レベル（５Ｄ）、およびＣＦＵ（５Ｅ）に異なる影響を有していたことを示す一連の図である。 末梢血におけるＣＤ３４^＋細胞の列挙を示す一連のヒストグラムである。 ３種類の供試バッグ、すなわち、ハイクローン（ＨＹＣＬＯＮＥ）ポリエチレンバッグ（左）、テルモ（ＴＥＲＵＭＯ）ポリ塩化ビニルバッグ（中央）およびテフロン（登録商標）バッグ（右）の写真である。

本発明は、室温（すなわち、１５〜２５℃）などの条件下での長期間にわたる幹細胞または幹細胞含有調製物（例えば、臍帯血）の包装および／または輸送に関する。このようにして包装および輸送された幹細胞および調製物は予期しないことに、臨床使用に満足のいく生存率および発達能を有していた。

図１に、臍帯血細胞または臍帯血から単離された細胞成分の、採取、処理、輸送、および検査の手順の一例を示す。
簡単に述べれば、臍帯血細胞は、病院の現場で採取することができ、または臍帯血バンク（ＳＴＥＭＣＹＴＥ Ｉｎｃ．により維持されているものなど）から入手することもできる。当技術分野で認知されているいずれの採取および保存手順を使用してもよいが、好ましい手順を以下の例に記載する。一般に、種々の感染マーカーに関する無菌性検査を行うべきである。さらに、低温保存のために凍結させる前に、総細胞数、ＣＤ３４＋細胞数、およびユニット容量を測定し、記録するべきである。採取した血液には赤血球（ＲＢＣ）が含まれ、凍結および解凍の際に崩壊する傾向にある。その場合、溶解すると、ＲＢＣのＤＮＡが採取された臍帯血細胞の粘度を増し、臨床使用のための臍帯血細胞のさらなる取り扱いを妨げる。これを防ぐため、ＤＮＡを分解するために、低温保存前に採取細胞にＤＮＡｓｅを添加することができる。このようにすれば、細胞の粘着性および凝集を軽減することができ、それにより、浸透圧勾配（例えば、フィコール（ＦＩＣＯＬＬ））での細胞の分離もより容易となる。いくつかの市販のＤＮＡｓｅを使用することができる。例としては、ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ社が販売しているＰＵＬＭＯＺＹＭＥ（登録商標）が挙げられる。

あるいは、臍帯血に、赤血球が実質的に除去されるような、赤血球除去のための処理を施すこともできる。所望により、臍帯血は、浸透圧勾配（例えば、フィコール）によるか、または以下の実施例１に記載されているようにして、いくつかの有用なユニット（例えば、全単核細胞（ＴＭＮ）、白血球細胞、リンパ球、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、マクロファージ、およびその他の細胞）に分離することができる。また、上述のように、輸送する臍帯血細胞は、ドナーから新しく得ることもでき、凍結されない。これらのアプローチにおいて、このような新鮮なユニットを包装および／または輸送する際には、ＤＮＡｓｅは必要でない。さらに、その内容が全て参照により本明細書の一部とされる米国特許出願第２００８０１６６３２４号に記載されているものなどの当技術分野で公知の方法に従って、血漿を除去することもできる。

次に、採取された細胞を、病院内の現場、または例えば上述の血液バンクなどの現場を離れた場所にある処理施設で輸送用に包装および調製する。これらの細胞が低温保存されていた場合には、以下の実施例１に記載されているようにして解凍することができる。ここでもまた、種々の感染マーカーに関する無菌性検査を行うことができ、総細胞数、ＣＤ３４＋細胞数、濃度、およびユニット容量を測定し、記録すべきである。その後、これらの細胞を上記の容器に入れ、指定の運搬者による輸送のための包装物を形成する。

いくつかの培地を使用することができるが、ＣＯ_２非依存性培地（ＣＩＭ）が好ましい。これらのＣＩＭ培地はカリウムの枯渇を防ぎ、より良好な細胞生存率をもたらす。また、それらは大気中のＣＯ_２（０．０４％）が無くても長期間ｐＨ安定性を維持することができる。ＣＩＭ培地の例としては、ＧＩＢＣＯ社により例えばカタログ番号８０４５として販売されているものが挙げられる。また、ヒト血清の使用も好ましい。

これらの細胞を用いて、薬学上許容される担体を有する医薬組成物を形成することができる。限定されない例として、通常の緩衝生理食塩水（例えば、約１３５〜１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を薬学上許容される担体として使用することができる。他の好適な担体としては、限定されるものではないが、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどが挙げられる。本発明の培養幹細胞およびリチウム塩の配送に使用するのに好適なさらなる担体は、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１８ｔｈ ｅｄ．（１９９５）に記載されている。

本明細書に開示されているように、容器の材料は重要である。一般に、この材料は、細胞に対して低摩擦または非粘着性であり、かつ、細胞に対して毒性がなく、または幹細胞の受容者に有害でないポリマーであり得る。好適なポリマーの例としては、限定されるものではないが、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ペルフルオロアルコキシ（ＰＦＡ）、フッ化エチレンプロピレン（ＦＥＰ），ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、超低密度ポリエチレン、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、直鎖低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、同軸延伸ポリプロピレン（ＣＯＰＰ）、二軸延伸ポリプロピレン（ＢＯＰＰ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ナイロンなどのポリミド（ｐｏｌｙｍｉｄｅ）樹脂、エチレンビニルアルコールポリマー（ＥＶＯＨ）、およびそれらの金属化型が挙げられる。他のポリマーも、それらの摩擦係数（研磨綱に対する）が上述のポリマーの摩擦係数に匹敵するかまたはそれより低ければ、使用可能である。上述のポリマーの摩擦係数は当技術分野で公知であり、参照により本明細書の一部とされる。例えば、摩擦係数は、０．５未満、例えば、０．４、０．３、０．２、または０．１であり得る。好ましい実施形態では、ＤＵＰＯＮＴ社によるテフロン（登録商標）、ハイクローンポリエチレン系容器、またはテルモＰＶＣ系容器の銘柄で販売されているＰＴＦＥ、ＰＦＡ、ＰＥＰ、またはＰＶＤＦ系容器を使用することができる。

容器の基質は、細胞の受容および保持に好適な形状に成形することができる。これらの形状の例としては、限定されるものではないが、バッグ、チューブ、シリンジまたは注射器用バイアルが挙げられる。いくつかの実施形態において、この基質は、培養に、またはＣＮＳなどの種々の組織における幹細胞の移植または埋植部位に好適な形状に成形される。例としては、テープ、膜、糸、スライド、マイクロビーズ、微粒子、細胞培養プレート、マルチウェルプレート、およびバイオリアクターが挙げられ、それらは全て細胞を受容することができる。

本明細書に記載のように、輸送中、包装内の細胞は、低い温度で維持する必要はなく、例えば、低温保存する必要はなく、または一晩で配送する必要はない。代わりに、これらの細胞は、室温を含め、むしろより広い温度範囲で、かなり長期間（例えば、３〜８日）かけて輸送することができる。このようなあまり厳重でない条件ではあるが、この包装物は、温度保護容器で輸送し、かつ／または必要であれば輸送者または受取人に情報を提供するために温度プローブで監視することが好ましい。このようなあまり厳重でない条件のために、低温保存輸送に伴うコストが無くなる。さらに、輸送時間が５〜８日という長期間であり得るので、大陸横断輸送などの長距離輸送も実用的となる。結果として、特定の幹細胞（例えば、希少な適合ＨＬＡ型を有するもの）の供給源から遠く離れた患者が、幹細胞移植から利益を得ることができる。

急送便業者から細胞を受け取った際、細胞を以下の例に記載されているようにして処理し、それらの移植適性を検査することができる。この目的で、以下の４つの判定基準を用いて、それらの細胞が移植に適しているかどうかを判定することができる。

細胞の計数
移植および分析のために十分な生細胞が存在しなければならない。好ましくは、移植（例えば、脊髄への）に必要とされる細胞数の少なくとも２倍が好ましく、そうであれば、細胞分析用の細胞が十分残る。例えば、以下の実施例２に開示されているように、Ａ群、Ｂ群およびＣ群では、１６、３２および６４μｌの細胞懸濁液（１００，０００細胞／μｌ）が移植に必要であった。言い換えれば、１．６、３．２および６．４×１０^６細胞が使用された。この量を倍にするには、それぞれ最低３．２、６．４および１２．８×１０^６の単核細胞が必要となる。仮に、出荷物がより少ない数の細胞を含んでいた場合、その出荷物は移植には適切というべきではない。

生存率
死細胞が多すぎれば、調製は避けるべきである。この目的で、トリパンブルー排除（ＴＢＥ）を用いた手動計数を生存率の基準として使用することができる。パーセンテージとして表される細胞懸濁液のＴＢＥは、青色に染色されない細胞を染色細胞と非染色細胞の総数で割ったものである。移植指定を受ける細胞では、ＴＢＥは少なくとも７０％であるべきである。一般に、以下の例に記載される洗浄手順は死細胞を除き、細胞懸濁液は一般に、移植直前に９０％を超えるＴＢＥを有する。

汚染
汚染の証拠またはリスクは報告されなければならない。これには例えば、輸送バッグ内での液漏れの存在、細胞懸濁液の異常な濁度、顕微鏡下で観察できる細菌もしくは真菌、または過去の汚染の報告が含まれる。本明細書に開示されているように、母体Ｂ型肝炎コア抗原、ならびに全米骨髄バンク（ＮＭＤＰ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｒｒｏｗ Ｄｏｎｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍ）の登録から臍帯血ユニットを通常除外する他の全ての病原体に関して陽性である臍帯血ユニットを除外するように注意を払わなければならない。

単核細胞
最終的な調製物は９５％以上の単核細胞を有するべきである。細胞の生存率計数で５％を超える赤血球または好中球などの他細胞が明らかな場合は、それらの細胞は移植に使用しない。臍帯血には未成熟有核赤血球細胞がいくらか存在する場合があることに留意されたい。

好ましい実施形態では、下記の点：（ｉ）温度プロフィールが、１２℃〜２８℃という指定の許容範囲を超える温度を示すこと、および（ｉｉ）（処理のための臍帯血ユニットの）最初の解凍からの総時間経過が５日を超えないことが真であれば、その包装物は却下すべきである。

上記の手順では、細胞調製物に抗生物質を加えることができる。例えば、処理および輸送中の汚染のリスクを軽減するために、細胞処理の開始時にゲンタマイシンを加えることができる。ゲンタマイシンは、過去の複数回の培地充填試験が、汚染が導入されていないことを示していたとしても、細菌の増殖を抑制する可能性がある。受け入れ病院において、細胞を２回洗浄および再懸濁し、細胞懸濁液に存在し得る抗生物質を著しく希釈する。６ヶ月の期間、洗浄溶液の培養物は、１５ユニットを超える処理済み臍帯血で、陽性培養を出さないことが判明した。同様に、２週間のＣＦＵ培養でも細菌の増殖は示されなかった。

上記の手順では、臍帯血幹細胞は、幹細胞プールの大量増殖、すなわちｉｎ ｖｉｔｒｏ大量増殖のために、それらの内容が参照により全て本明細書の一部とされる米国特許出願第２０１００１８９６９６号、同第２０１００３２３９２０号、同第２００８０２２７１９７号および同第２００８０１６６３２４号に記載されているものなどの方法を用いてさらに処理することもできる。用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ大量増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」とは、実験室での幹細胞の培養を意味する。このような細胞は哺乳動物細胞および適当な環境、例えば、リチウム塩を含有する培地中で培養することにより生成されたさらなる量の細胞から抽出することができる。可能であれば、細胞の継続的増殖を可能とするために、安定な細胞株を確立する。

本発明の実施には、種々の幹細胞を使用することができる。幹細胞の例としては、臍帯血細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞、骨髄幹細胞、末梢血幹細胞、胎盤血液、および機能的細胞、例えば、ニューロンまたはグリア細胞へと分化可能なその他の幹細胞が挙げられる。用語「幹細胞」とは、いくつかの最終的な分化した特殊な細胞種に分化する能力を有する任意の細胞を意味する。幹細胞は全ての胚層（すなわち、外胚葉、中胚葉、および内胚葉）から発生する。幹細胞の典型的な供給源としては、胚、骨髄、末梢血、臍帯血、胎盤血、筋肉組織、および脂肪組織が挙げられる。

幹細胞は全能性または多能性であり得る。全能性幹細胞は一般に、いずれの細胞種にも発達する能力を有する。全能性幹細胞は胚起源および非胚起源の双方があり得る。多能性細胞は一般に、いくつかの異なる最終の分化した細胞種に分化する能力を有する細胞である。例えば、多能性幹細胞は、神経系、皮膚、肝臓、腎臓、血液、筋肉、骨などの細胞を生じることができる。多能性幹細胞の例としては、限定されるものではないが、臍帯血幹細胞、神経系幹細胞、造血幹細胞、脂肪由来幹細胞、間葉系幹細胞、胎盤由来幹細胞、剥離歯由来幹細胞、および毛包幹細胞が挙げられる。これに対し、多分化性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）または成体幹細胞は一般に限定された細胞種を生じる。本明細書において、幹細胞という用語は、特に断りのない限り、前駆細胞を含む。単能性幹細胞は１つの細胞種のみを生じ得るが、自己再生特性を有することで非幹細胞とは異なる。これらの幹細胞は、限定されるものではないが、血液、神経、筋肉、皮膚、消化管、骨、腎臓、肝臓、膵臓、胸腺などを含む種々の組織または器官系に起源し得る。本発明によれば、幹細胞は成体または新生児組織または器官に由来し得る。

本発明に記載される細胞は、実質的に純粋であり得る。用語「実質的に純粋」とは、幹細胞またはそれに由来する細胞（例えば、分化細胞）に関して用いる場合、指定の細胞が調製物中の細胞の実質的一部または大多数を構成することを意味する（すなわち、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％超）。例えば、実質的に精製された細胞集団は、調製物中の細胞の少なくとも約７０％を構成し、通常、調製物中の細胞の約８０％、特に、調製物中の細胞の少なくとも約９０％（例えば、９５％、９７％、９９％または１００％）を構成する。

好ましい実施形態では、臍帯血細胞が使用される。これらの細胞は、以下の実施例のセクションに記載されるように、または当技術分野で公知の方法により入手し、次に、標準的な技術により検査することができる。細胞の分化能を確認するためには、例えば、種々のコロニー形成単位を形成するよう、当技術分野で公知の方法により、それらを誘導することができる。このようにして確認された細胞を、自発的分化、老化、形態変化、増殖速度の増大、またはニューロンへの分化能の変化なく、１０、２０、５０、または１００回超に集団倍加するように非分化培地培養でさらに増殖させることができる。これらの細胞は、使用まで標準的な方法によって保存することができる。

細胞に関して本明細書で互換的に使用される用語「増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）」および「大量増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」は、分裂により同種の細胞数を増大させることを意味する。用語「分化」とは、細胞が特定の機能に特化されるようになる発達プロセスを意味し、例えば、そこで細胞は最初の細胞種とは異なる１以上の形態的特徴および／または機能を獲得する。用語「分化」には、系譜の決定と最終分化プロセスの両方が含まれる。分化は、例えば、免疫組織化学または当業者に公知の他の手順を用いて系譜マーカーの有無を監視することによって評価することができる。前駆細胞に由来する分化した後代細胞は、必ずしも必要ではないが、幹細胞の供給源組織と同じ胚葉または組織に関するものであってよい。例えば、神経系前駆細胞および筋肉前駆細胞は造血細胞系譜に分化することができる。本明細書で互換的に使用される用語「系譜の決定」および「特化」は、幹細胞が受ける、幹細胞が特定の限定された範囲の分化細胞種を形成することを運命付けられた前駆細胞を生じるプロセスを意味する。運命が決定された前駆細胞は自己再生能または細胞分裂能を有する場合が多い。用語「最終分化」とは、細胞の成熟した、完全に分化した細胞への最終的な分化を意味する。例えば、造血前駆細胞および筋肉前駆細胞は神経系またはグリア細胞系譜へ分化することができ、その最終分化が成熟したニューロンまたはグリア細胞をもたらす。通常、最終分化は細胞周期からの離脱および増殖の停止に関連する。

本明細書において用語「前駆細胞」とは、特定の細胞系譜へと運命が決定され、かつ、一連の細胞分裂によりこの系譜の細胞を生じる細胞を意味する。前駆細胞の例としては、ニューロン系譜、肝臓系譜、腎臓形成系譜、脂肪生成系譜、骨芽細胞系譜、破骨細胞系譜、肺胞系譜、心臓系譜、腸管系譜、または内皮系譜の前駆細胞が挙げられる。

用語「培養する」とは、幹細胞を、それらが増殖でき、老化を避け得る条件下で維持することを意味する。例えば、本発明では、幹細胞を、リチウム塩および選択的に１以上の増殖因子、すなわち、増殖因子カクテルを含有する培地で培養する。

用語「臍帯血」とは、出生後に残される臍帯の血液から得られる、多能性および多分化性幹細胞の供給源を意味する。臍帯血中に見られる幹細胞の例としては、限定されるものではないが、間葉系幹細胞、造血幹細胞および前駆細胞が挙げられる。間葉系幹細胞および前駆細胞は一般に、神経細胞、骨髄間質細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、腱細胞、および靱帯細胞へ分化する。

造血幹細胞は一般に、リンパ系譜、骨髄系譜、および赤血球系譜の細胞を生じる。臍帯血を採取および処理する方法の詳細な記載は以下に示す。
用語「臍帯血ユニット」とは、単一のドナーから採取された一定容量の臍帯血を意味する。本発明の方法では一般に単一の臍帯血ユニットが使用されるが、幹細胞数を増やすために複数の臍帯血ユニット、例えば、ダブルユニットの臍帯血を使用することもできる。

本明細書において、用語「血漿を実質的に除去する」および「血漿除去された」とは、約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を超える容量の血漿が除去されている、処理済みの臍帯血ユニットを意味する。例えば、血漿は、臍帯血を遠心分離し、血漿画分から細胞画分を分離することによって実質的に除去することができる。実質的除去後に残る血漿容量は一般に約０〜約３０容量％、好ましくは約１０〜約３０容量％である。

本明細書において用語「非赤血球除去」および「赤血球が除去されない」とは、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満の容量の赤血球が除去されている、処理済みの臍帯血ユニットを意味する。本明細書において、用語「赤血球が実質的に除去する」および「赤血球除去された」とは、約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を超える容量の赤血球が除去されている、処理済みの臍帯血ユニットを意味する。

「有核細胞」とは、核、すなわち、染色体ＤＮＡを含むオルガネラを有する細胞を意味する。有核細胞としては、例えば、白血球細胞および幹細胞が挙げられる。「無核細胞」としては、例えば、成体赤血球が挙げられる。

本実施例では、凍結シングルバッグＳＴＥＭＣＹＴＥ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｕｎｉｔｓ（ＵＣＢＵ）の制御解凍の例示的手順および包装を記載する。
１．Ｈｓａ／Ｇｅｎｔｒａｎ洗浄液の調製
以下の品目をバイオセーフティーキャビネット（ＢＳＣ： Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓａｆｅｔｙ Ｃａｂｉｎｅｔ）内に入れた：アルコールワイプ４枚、解凍バッグセット（Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐａｃｋ Ｕｎｉｔ）１個、Ｇｅｎｔｒａｎ ４０バッグ１個、シリンジフィルター１個、（２）×５０ｍＬＨＡＳ １個、針１本、血漿トランスファーセット１個、およびハサミ１個。バイオセーフティーキャビネット内で、解凍バッグセットのバッグ＃１の外部注入口に血漿トランスファーセットの一方の末端を接続した。このユニットが１００ｍＬ以下の低温保存容量であれば、３００ｍＬのトランスファーセットを使用したが、ユニットが１００ｍＬを超えれば、６００ｍＬのトランスファーセットを使用した。次に、キャップを外し、ＨＳＡの５０ｍＬバイアルのゴムダイアフラムを、７０％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）ワイプで拭いた。ＨＳＡダイアフラムに、上述の血漿トランスファーセットのもう１つのスパイクを接続した。シリンジフィルターを取り付けた皮下針を血漿スパイクの横のＨＳＡダイアフラムに挿入し、バイアルを排出した。このＨＳＡバイアルをバッグ＃１より上に持ち上げ、バイアル（５０ｍＬ）の全内容物をトランスファーバッグに流れ込むようにした。容量が＞１００ｍＬのＵＣＢＵでは、２本のバイアル（１００ｍＬ）を６００ｍＬのトランスファーバッグに注がなければならない。ＨＳＡバイアルとバッグ＃１の間のチューブは、ＨＳＡバイアルと余分なチューブを廃棄する前にバッグ＃１の注入口付近で熱封止した。バッグ＃１の残りの注入口に、トランスファーセットのチューブ上のローラークランプを閉める前に、新たな血漿トランスファーセットを接続した。Ｇｅｎｔｒａｎ ４０バッグの注入口に、血漿トランスファーセットの他方の末端を接続した。

次に、バッグ＃１を電子天秤にのせ、０に合わせた。トランスファーチューブの留め金を緩めて、低温保存容量が１００ｍＬ以下のＵＣＢＵでは、１９０ｇのＧｅｎｔｒａｎ ４０をバッグ＃１に流入させた。ＵＣＢＵ容量が１００ｍＬを超える場合には、３８０ｇのＧｅｎｔｒａｎ ４０をバッグ＃１に移した。血漿トランスファーチューブは、バッグ＃１および排出チューブの横で熱封止した。バッグ＃１の最終容量は、およそ２４０ｍＬ（または４８０ｍＬ）で、終濃度は、ＨＡＳでは５％、Ｇｅｎｔｒａｎでは８％となるはずある。その後、バッグ＃１のラベルに洗液調製の日時およびオペレーターのイニシャルを記録した。この解凍バッグセットを、ＵＣＢＵを解凍する前におよそ３０分間２〜８℃の冷蔵庫に入れた。この洗浄溶液は調製から１日以内に使用しなければならない。

冷凍ＵＣＢＣのバッグを以下の第ＩＩ節に記載されている手順に従って解凍した。
ＩＩ．冷凍ＵＣＢＵの解凍／洗浄
ＩＩ．１ 手順の前に以下の品目をＢＳＣ内に入れた：（１２）×５０ｍＬの遠心管６個；大小の冷蔵した冷却パック；（１０）×２．５ｍＬアンプルのＤＮＡｓｅ５個；１０００ｍＬのＤＮＡｓｅ洗浄バッファー；１００ｍＬの２５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２；非粒状化ワイプ；ＷＦＩ水；（８）×２５ゲージ針４本；２５ｍＬのピペット；サンプリングサイトカプラー（ｓａｍｐｌｉｎｇ ｓｉｔｅ ｃｏｕｐｌｅｒ）；１０ｍＬのシリンジ２本；１ｍＬのシリンジ２本；ＩＰＡワイプ；電子天秤；止血鉗子；およびチューブシーラー。

２．下式に従って必要なＤＮＡｓｅおよび２５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２溶液の容量を計算し、このようにして調製した溶液を、０．２μｍのディスクフィルター及び注入針を備えた適当な大きさのシリンジに入れる。

ＨＳＡ／ＧＥＮＴＲＡＮ洗浄液に必要なＤＮＡｓｅの容量＝ＨＳＡ／Ｇｅｎｔｒａｎ洗浄液の容量÷２５；
ＵＣＢＵバッグへの注入に必要なＤＮＡｓｅの容量＝ＵＣＢＵバッグ容量÷２５；
ＨＳＡ／ＧＥＮＴＲＡＮ洗浄液に必要な２５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２の容量＝ＨＳＡ／Ｇｅｎｔｒａｎ洗浄液の容量÷１００；

ＵＣＢＵバッグへの注入に必要な２５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２の容量＝ＵＣＢＵバッグの容量÷１００。
ＩＩ．３ 冷却遠心機を２〜８℃に予冷する。
遠心機の設定：
遠心速度を１，８６０ｇ（４箇所キャリアを備えたＳＯＲＶＡＬＬ ＨＳ−４アルミニウムローターで３，０８０ｒｐｍ）に設定する。

中度の設定でブレーキをかける（ＨＥＲＡＥＵＳ ＳＵＰＥＲＦＵＧＥでは減速を７に設定）。
ＩＩ．４ 添付書類から低温保存容量を記録する。
ＩＩ．５ １．５容量の臍帯血ユニット（ＵＣＢＵ）を計算する。
１．５ＵＣＢＵの容量＝ＵＣＢＵの容量（上記の工程４）×１．５
ＩＩ．６ 少なくとも３０分、長くて１日冷蔵したＨＳＡ／Ｇｅｎｔｒａｎ洗浄溶液およびＤＮＡｓｅ洗浄溶液を確認する。

ＩＩ．７ およそ２０３．２ｍｍ（８”）×２５４ｍｍ（１０”）のプラスチックバッグを得る。氷または冷凍アイスパックの入ったバケット内に立てて置く。およそ１５２．４〜２０３．２ｍｍ（６〜８インチ）まで水を満たす。

ＩＩ．８ このアイスコンテナ解凍手順の適切な位置に置く。
ＩＩ．９ 解凍バッグセットを冷蔵庫から取り出してＢＳＣに入れる。サンプリングサイトカプラーを２ポートのうちの一方に挿入し、ＨＳＡ／Ｇｅｎｔｒａｎ洗浄液に必要なＤＮＡｓｅ試薬およびＭｇＣｌ_２を注入する。混合し、冷却パックの間に置く。

ＩＩ．１０ 冷凍ＵＣＢＵを貯蔵所から得る。カセット上のＵＣＢＵ ＩＤラベルは必要書類と一致するか確認し、ＵＣＢＵ ＩＤを記録する。
ＩＩ．１１ 冷凍カセットを注意深く開封し、ＵＣＢＵバッグ上のＵＣＢＵ ＩＤ番号がカセット上のＩＤおよび必要書類と一致するか確認する。

ＩＩ．１２ カセットからのＵＣＢＵバッグを２０３．２ｍｍ（８”）×２５４ｍｍ（１０”）の無菌バッグに入れる。ＵＣＢＵを含有するバッグを氷浴に入れる。ポートが浸からないようにする。タイマーを用いて５分計測する。

ＩＩ．１３ ５分後、解凍されているかどうかを見るためにＵＣＢＵを確認する。解凍されていなければ、「融解状態」となるまで定期的に確認を続ける。解凍されたＵＣＢＵフリージングバッグを氷浴から取り出し、糸くずの出ないワイプで水分をぬぐう。

注：手早く洗浄するために以下の工程を始める。
ＩＩ．１４ ＵＣＢＵをＢＳＣ内の冷却パックの間に、ポートを露出させて置く。１０秒間ＵＣＢＵを穏やかに揺すって混合する。

ＩＩ．１５ ＵＣＢＵバッグの２ポートのうち一方からストッパーを外す。ポートにサンプリングサイトカプラーを接続する。
ＩＩ．１７ ＵＣＢＵポートに接続した後すぐに、ＵＣＢＵバッグに注入するためにＤＮＡｓｅ試薬およびＭｇＣｌ_２を注ぐ（上記の工程２を参照）。穏やかに混合する。

ＩＩ．１８ 残りのポートに解凍バッグセットに取り付けたスパイクを接続する。
注：ＵＣＢＵを添加する前に解凍セットチューブ上の全てのローラークランプが確実に閉まっていることを確認する。

ＩＩ．１９ 冷却パックを天秤にのせる。ＵＣＢＵバッグを冷却パックに入れる。ＵＣＢＵバッグの上に別の冷却パックを置き、天秤の風袋をとる。
注：ＵＣＢＵおよび全ての材料は２〜８℃で維持しなければならない。
ＩＩ．２０ バッグ＃１から出るチューブに止血鉗子を留める。ＵＣＢＵバッグへ向かうチューブのローラークランプを開ける。バッグ＃１の止血鉗子を緩め、ＵＣＢＵ容量の１．５倍の洗浄溶液を移す（上記の工程５を参照）。加えた容量を記録する。

ＩＩ．２１ 洗浄液の移行が完了したら、チューブを留める。
注：この最初の希釈工程は、解凍後できるだけ速やかに完了しなければならない。
ＩＩ．２２ ＵＣＢＵを冷却パック間に保持しながらおよそ１０秒間バッグを手で回転させることによって、ＵＣＢＵバッグ内で洗浄溶液と臍帯血を十分に混合する。

ＩＩ．２３ バッグ＃２付近のチューブ上の、アルミニウムクリップを外すか、または設けられていればローラークランプを開け、洗浄液／血液混合物をバッグ＃２に流入させる。ＵＣＢＵバッグからできる限り多くの混合物を取り出す。この工程中、バッグ＃２は冷却パック間に保持する。

ＩＩ．２４ 移行が完了したら、バッグ＃２の付近のチューブを閉める。
ＩＩ．２５ ＵＣＢＵバッグを天秤のプラットフォーム上に残っている冷却パック間に戻し、天秤を０に合わせる。

ＩＩ．２６ バッグ＃１付近の止血鉗子を緩め、ＵＣＢＵの低温保存容量と同量の洗浄溶液をＵＣＢＵバッグに追加流入させる。完了したら、バッグ＃１付近のチューブを再び留める。添加した容量を記録する。

ＩＩ．２７ 洗浄済みのＵＣＢＵバッグの横のローラークランプを閉める。
ＩＩ．２８ ＵＣＢＵバッグ内で洗浄液／血液混合物を十分に混合する。ＵＣＢＵバッグのポート／テール領域からもできる限り多くの臍帯血を取り出す。

ＩＩ．２９ バッグ＃２の横のチューブを緩め、洗浄液／血液混合物をバッグ＃２に流入させ得る。ＵＣＢＵバッグを巻き上げて、できるかぎり多くの血液がＵＣＢＵバッグから取り出されるようにする。

注：この時点で、解凍されたＵＣＢＵは、低温保存ＵＣＢＵの容量と同量〜２．５倍（最初の１．５倍＋追加の１．０倍）の洗浄溶液によって希釈されている。
ＩＩ．３０ バッグ＃２の横のチューブを留め、ＵＣＢＵバッグの横のローラークランプを閉める。

ＩＩ．３１ すぐにチューブを、２つのスパイクへとつながる「Ｙ」接続部の下、かつ、バッグ＃２の横のクランプの上で熱封止する。封止されたら、余分なチューブは除去してもよい。

ＩＩ．３２ バッグ＃２のポートに新たな血漿トランスファーセットを無菌的に接続し、バッグ＃２の内容物を氷上で維持した５０ｍＬ管に移す。
ＩＩ．３３ ５０ｍＬ管が入った遠心バケットのバランスをとる。
ＩＩ．３４ ５０ｍＬ管をおよそ１８６０ｇ（４箇所キャリアを備えたＳＯＲＶＡＬＬ ＨＳ−４アルミニウムローターで３，０８０ｒｐｍ）にて、０℃〜８℃で１５分間遠心分離する。遠心機のブレーキは中度に設定すべきである。

ＩＩ．３５ 遠心分離が完了したら、遠心分離済みの５０ｍＬ管を注意深く取り出す。ペレットを乱さないようにする。
ＩＩ．３６ セーフティーキャビネット内で、遠心分離済み管を開封し、ペレットを乱さずに、管の底におよそ５ｍＬを残して、大部分の洗浄液を吸引する。

ＩＩ．３７ ５ｍＬの洗浄バッファーを加え、１０ｍＬのピペットを用いて穏やかに混合する。
ＩＩ．３８ ５０ｍＬ管に５０ｍＬマークまで洗浄バッファーを満たす。
ＩＩ．３９ ５０ｍＬ管をおよそ１８６０ｇ（４箇所キャリアを備えたＳＯＲＶＡＬＬ ＨＳ−４アルミニウムローターで３，０８０ｒｐｍ）にて、０℃〜８℃で１０分間遠心分離する。遠心機のブレーキは中度に設定すべきである。

ＩＩ．４０ 遠心分離が完了したら、５０ｍＬ管を注意深く取り出す。
ＩＩ．４１ セーフティーキャビネット内で、遠心機分離済みの管を開封し、ペレットを乱さずに、管の底におよそ５ｍＬを残して、大部分の洗浄液を吸引する。

ＩＩ．４２ チューブのＢＳＣ表面を軽くたたくことにより、各管において細胞ペレットを再懸濁させる。
次に、解凍されたＵＣＢＣに対し、下記の第ＩＩＩ節に記載されているように血液溶解液手順か、または以下の第ＩＶ節に記載されているように単核細胞（ＭＮＣ： ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）の単離のいずれかを行った。

ＩＩＩ．赤血球溶解液手順
ＩＩＩ．１ ＢＳＣに以下の品目を入れる。
（１２）×５０ｍＬ遠心管６本
１６０ｍＬのＵＳＰ水（周囲温度）
１６０ｍＬの２倍生理食塩水
ＩＩＩ．２ ２２．５ｍＬの周囲温度ＵＳＰ水を各５０ｍＬ管に加える。水の添加の終了時から３０秒タイマーを始動させる。ピペット操作により混合する。

ＩＩＩ．３ ３０秒後、すぐに２２．５ｍＬの１．８％（２Ｘ）ＮａＣｌ溶液を５０ｍＬ管に加え、転倒させて穏やかに混合する。各管で個々に工程ＩＩＩ．２およびＩＩＩ．３を完了させる。

ＩＩＩ．４ 各管を２本の管に分け、それぞれ５０ｍＬまで洗浄バッファーを満たす。
ＩＩＩ．５ ５０ｍｌ管をおよそ８３０ｇ（４箇所キャリアを備えたＳｏｒｖａｌｌ ＨＳ−４アルミニウムローターで２，０５０ｒｐｍ）にて、０℃〜８℃で１０分間遠心分離する。遠心機のブレーキは中度に設定すべきである。

ＩＩＩ．６ 遠心分離が完了したら、遠心分離済みの５０ｍＬ管をバケットから注意深く取り出す。
ＩＩＩ．７ セーフティーキャビネット内で、遠心機分離済みの管を開封し、ペレットを乱さずに、管の底におよそ１ｍＬを残して、大部分の洗浄液を吸引する。

ＩＩＩ．８ ５ｍＬの洗浄バッファーを加え、１０ｍｌのピペットを用いて細胞ペレットを穏やかに再懸濁させる。
ＩＩＩ．９ さらに１０ｍｌのＤＮＡｓｅ洗浄バッファーで管を洗浄し、これらの細胞を１本の管にプールする。

ＩＩＩ．１０ プールした細胞の容量をＤＮＡｓｅ洗浄バッファーを用いて３０ｍＬとする。
注：温度を２５℃に、速度を７，０００ｒｐｍに設定することにより、遠心機の温めを始める。スタートボタンを押す（一般に約３０秒かかる）。

ＩＶ．ヒト臍帯血からのＭＮＣの単離
ＩＶ．１ ＢＳＣ内に以下の品目を入れる：５０ｍＬ遠心管６本；９０ｍＬ ＬＳＭ；２５ｍＬピペット１０本；１０ｍＬピペット２本；コニカル管（２２５ｍＬ）１本。

ＩＶ．２ ２２５ｍＬ無菌コニカル管内で、臍帯血細胞をＤＮＡｓｅ洗浄バッファーで１：５に希釈する。希釈した血液を旋回撹拌により穏やかに混合する。
ＩＶ．３ ＢＳＣ内に６本の５０ｍＬ遠心管を入れる。
ＩＶ．４ 無菌の２５ｍＬピペットを用い、希釈血液を各５０ｍＬ管に３０ｍＬずつ分注する。

ＩＶ．５ 無菌の１０ｍＬピペットに１３ｍＬのＬＳＭを満たす。ピペットを、管の側面を底に向かってゆっくりスライドさせる。血液のレベルより下にＬＳＭを穏やかにピペットで注いでいる間、管の角度を保持する。層の混合が起こらないように、管の壁面に沿ってピペットをゆっくり取り出す。

注：ＬＳＭをピペットから完全に排出しないようにする−気泡がＬＳＭ層を乱す。
ＩＶ．６ 管の蓋を閉め、注意深く遠心機に移す。
ＩＶ．７ およそ４６７ｇ（４箇所キャリアを備えたＳｏｒｖａｌｌ ＨＳ−４アルミニウムローターでは１，５４０ｒｐｍ、またはＳ４ １８０ローターでは１６００ｒｐｍ）、３２分、温度：２４℃、ブレーキオフ（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｓｕｐｅｒｆｕｇｅでは減速を２に設定）のスィングバケットローターに前記の管を入れる。遠心機が指定速度に達したことを確認する。

ＩＶ．８ 無菌の５０ｍＬ管６本をＢＳＣ内のラックに入れる。
１１．９ 遠心分離後、層の混合が起こらないように、遠心機から前記の管を注意深く取り出し、新しい管をラックに入れる。

１１．１０ 遠心機を冷却用に設定する。温度を１０℃に、タイマーを１０分に設定する。スタートキーを押して遠心機を始動させる。
１１．１１ ＢＳＣ内で、遠心機分離済みの管を開封する。上清を吸引し、単核層を露出させる。この単核層（バフィーコート）のみを、無菌の１０ｍＬピペットを用いて採取する。新しい管に移し、各管に４５ｍＬまでＤＮＡｓｅ洗浄バッファーを満たす。

ＩＶ．１２ 前記の管をスィングバケットローターに入れ、遠心機をおよそ４６７ｇ（４箇所キャリアを備えたＳＯＲＶＡＬＬ ＨＳ−４アルミニウムローターで１，５４０ｒｐｍ）、１０分、１０℃に設定し、ブレーキを中度の設定とする（ＨＥＲＡＥＵＳ ＳＵＰＥＲＦＵＧＥでが減速を７に設定）。

ＩＶ．１３ 遠心分離後、セーフティーキャビネット内で、前記の管を開封し、ペレットを乱さずに、およそ１ｍＬ残して、大部分の上清を吸引する。
ＩＶ．１４ １本の新しい５０ｍＬ遠心管にラベルを付ける：「プールＭＮＣ」、「Ｖ９０１９５」、「工程ＩＶ．１４」、この製造管理のロット番号、日付、およびオペレーターのイニシャル。

ＩＶ．１５ 無菌の１０ｍＬピペットを用い、細胞ペレットを５ｍＬのＤＮＡｓｅ洗浄バッファーを用いて穏やかに再懸濁させる。これらの細胞を１本の遠心管にプールする。
ＩＶ．１６ 細胞をプールした後、６本の管を全て４ｍＬ容量のＤＮＡｓｅ洗浄バッファーで洗浄し、全単核細胞（ＭＮＣ）が回収されるようにする。

ＩＶ．１７ ラベルされた「プールＭＮＣ」管に洗浄液を移し、ＤＮＡｓｅ洗浄バッファーを５０ｍＬまで加える。
ＩＶ．１８ 前記の管を、バランス管を備えたスィングバケットローターに入れ、遠心機をおよそ４６７ｇ（４箇所キャリアを備えたＳＯＲＶＡＬＬ ＨＳ−４アルミニウムローターで１，５４０ｒｐｍ）、１０分、１０℃に設定し、ブレーキをオンとする。

ＩＶ．１９ 遠心分離後、セーフティーキャビネット内で、前記の管を開封し、細胞ペレットを乱さずに、管内におよそ１ｍＬ残して、大部分の洗浄液を吸引する。
ＩＶ．２０ 無菌の１０ｍＬピペットを用い、前記ペレットを５ｍＬの洗浄バッファーに再懸濁させる。

ＩＶ．２１ プールしたＭＮＣ管の容量を２０ｍＬとし、よく混合する。
ＩＩ．２２ よく混合したＭＮＣの十分な容量のサンプルを生存率およびＭＮＣ細胞の計数のために管に移す。サンプリングした量を記録する。

ＩＶ．２３ 細胞密度および生存率％を求める。
ＩＶ．２４ 下式に従って細胞総数を計算する：
ＩＶ．２３からの生細胞密度×（２０−ＩＶ．２２からサンプリングした量）。
ＩＶ．２５ 生細胞総数が２０×１０^６未満である場合には、臨床コーディネーターに連絡をとる。却下されたロットは、検討の転帰を保留して保持する。

上記の手順に従って調製した細胞を、次に、下記の第Ｖ節に記載されている手順に従って、種々の輸送バッグに移した。ルアーロックフィッティングを備えた以下の３種のサンプルバッグを用いた：ハイクローンＰＥサンプルバッグ（ＴＨＥＲＭＯ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、テフロン（登録商標）バッグ（ＤＵ ＰＯＮＴ）、およびＴＥＲＵＦＫＥＸ（登録商標）トランスファーバッグ（ＴＥＲＵＭＯ、ＰＶＣ）。

ハイクローンＰＥサンプルバッグ（例えば、２端ポートを備えたハイクローン６０ｍＬ〜２０Ｌ ２−Ｄ Ｌａｂｔａｉｎｅｒ、例えば、ＳＨ３ｂ６５００およびＳＨ３ｂ６５００）を３層の９ｍｉｌ（０．２２９ｍｍ）キャストフィルムであるＣＸ３−９フィルムから構成し、外部フィル層は、ポリエステルエラストマーが超低密度ポリエチレン接触層と共押出されたものであった。ＴＥＲＵＦＫＥＸ（登録商標）トランスファーバッグ（例えば、１ＢＢ^＊Ｔ０１５ＣＢ７０、１ＢＢ^＊Ｔ０３０ＣＢ７１、１ＢＢ^＊Ｔ０６０ＣＢ７１、１ＢＢ^＊Ｔ０８０ＢＢ７１、１ＢＢ^＊Ｔ１００ＢＢ７１、および１ＢＢ^＊Ｔ２００ＢＢ７１）はＰＶＣに基づくものであった。テフロン（登録商標）バッグは、ＰＦＡに基づくものであった（例えば、ＰＦＡバッグ−２．０ｍｉｌ（０．０５０８ｍｍ）または−５．０ｍｉｌ（０．１２７ｍｍ）テフロン（登録商標）バッグ）。

Ｖ．細胞の輸送バッグへの移行
Ｖ．１ ＢＳＣ内に以下の品目を入れる：５０ｍＬ遠心管２本；１００ｍＬの輸送培地（Ｖ９０１９９：ＣＩＭ＋１０％ＨＳ、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、ガラクトースおよび１００Ｕ／ｍＬゲンタマイシン）；および５ｍＬピペット２本；無菌輸送バッグ。

Ｖ．２ 必要な輸送培地の容量を計算する：必要な輸送培地の容量（ｍＬ）＝工程ＩＶからの細胞総数２４×１０^−６。
Ｖ．３ ラベルを付けたＭＮＣ管を、バランス管を備えたスィングバケットローターに入れ、遠心機をおよそ４６７ｇ（４箇所キャリアを備えたＳｏｒｖａｌｌ ＨＳ−４アルミニウムローターでは１，０４０ｒｐｍ）、１０分、１０℃に設定し、ブレーキは中度の設定とする（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｓｕｐｅｒｆｕｇｅでは減速を７に設定）。

Ｖ．４ 遠心分離後、セーフティーキャビネット内で、前記の管を開封し、廃棄容器へ上清を吸引する。
Ｖ．５ 無菌の１０ｍＬピペットを用い、ペレットを５ｍＬの輸送培地に再懸濁させる。

Ｖ．６ 培地を加えて細胞濃度を１×１０^６／ｍｌに調整する。
Ｖ．７ 必要なゲンタマイシンの容量を計算する。
必要なゲンタマイシンの容量（ｍＬ）＝工程Ｖ．２からの細胞の総容量÷５００
Ｖ．８ 保有のために３ｍｌの細胞を抜き取り、１５ｍｌコニカル管に移す。
Ｖ．９ ゲンタマイシン（Ｖ．７で計算された容量）を細胞懸濁液に加え、穏やかに混合する。

Ｖ．１０ 細胞懸濁液を輸送バッグに移す。
Ｖ．１１ 前記バッグにラベルを付ける：「冷凍ＵＣＢＵから調製されたＭＮＣ」、「ＩＤ＃」、「Ｖ９０１９５」、「工程Ｖ．１１」、この製造管理のロット番号、総細胞数、日付、およびオペレーターのイニシャル。

Ｖ．１２ 輸送のためにＳＯＰ４００．０１４に従って細胞を包装する。細胞のユニットには、生産明細を伴う証明書：ユニット番号、ロット番号、細胞総数、生存率および無菌性に関する情報が含まれる。この文書にはＣＯＡのコピーを添付する。

Ｖ．１３ ０．５ｍＬの細胞保有株を用いてＴＳＢ培養液の管１本に接種を行い、また、０．５ｍｌを用いて、チオグリコール酸培養液の管１本に接種を行う。
Ｖ．１４ １．０ｍＬのサンプルは、１週間、保有サンプルとして２〜８℃で保存すべきである。管には「冷凍ＵＣＢＵから調製されたＭＮＣの２〜８℃保有サンプル」、ＩＤ番号、「工程Ｖ．１４」、ロット番号、総細胞数、日付、およびオペレーターのイニシャルのラベルを付ける。

Ｖ．１５ １．０ｍＬのサンプルは、保有サンプルとして−８０℃で保存すべきである。管には「冷凍ＵＣＢＵから調製されたＭＮＣの−８０℃保有サンプル」、ＩＤ番号、「工程Ｖ．１５」、ロット番号、総細胞数、日付、およびオペレーターのイニシャルのラベルを付ける。

細胞は、上記の様式で、数種の異なる培地で包装を行い、その後、いくつかの異なる温度で、１〜８日かけて異なる場所へ輸送した。

本実施例では、上記の実施例１に記載されている様式で包装および輸送された臍帯血細胞を検査するためのアッセイを行った。
航空貨物でバッグの包装物が到着した際、処理を行うまで安全な場所に、その包装物をその容器内で保管し、その包装物の温度監視を続けた。処理前に、包装物をその変化に関して検査し、報告した。処理のために元の血液ユニットを最初に解凍してから経過した総時間も記録した。

包装の開封
輸送容器を開封し、ｈＵＣＢ−ＭＮＣバッグが入った包装物を取り出し、指定の温度（ＲＴ）で維持したバイオセーフティーキャビネット（ＢＳＣ）内で、前記のバッグを損傷または漏れに関して検査した。バイオセーフティーキャビネット内で、バッグを穏やかに揺すって細胞を混合した。１対の無菌手袋とルアーロックシリンジを用い、各バッグの内容物をｈＵＣＢ−ＭＮＣのラベルを付けた無菌の３０ｍｌ、５０ｍｌ、または１００ｍｌ遠心管に移した。次に、これらの管を４００ｘｇにて１０分間、指定の温度（ＲＴ）で遠心分離した。１０ｍｌのピペットを用い、ペレットを乱さずに、遠心管から上清を吸引し、無菌性検査に用いた（サンプル１）。この細胞ペレットを臨床グレードの生理食塩水中、１％の正常血清アルブミン（ＮＳＡ）１ｍｌに再懸濁させ、注射用の初期細胞懸濁液を形成した。

ＵＣＢ−ＭＮＣの生存率アッセイおよび細胞計数
１．生存率アッセイ
セーフティーキャビネット内で、１００μｌチップを用いて分注し、１％ＮＳＡを添加した生理食塩水４５０μｌの入った１２×７５ｍｍ管中に５０μｌの細胞懸濁液を混合することにより、１：１０細胞希釈液を調製した。１００μｌチップを用い、４０μｌの希釈細胞懸濁液を０．５ｍｌエッペンドルフ管中の１０μｌトリパンブルー溶液にピペットで注いだ。数回のピペット操作により混合した後、トリパンブルー染色細胞懸濁液を改良型ノイバイエル血球計算盤にのせ、１６の小さな四角を含む各１ｍｍ×１ｍｍの４つの大きな四角内で、青色に染色された死細胞と染色されない生細胞の数を計数した。有核ＲＢＣは、顕微鏡下で対物レンズを上下させることにより反射鏡のように見えることから、染色されない生有核細胞から容易に識別することができた。次に、生細胞のパーセンテージを、非染色細胞の数を青色に染色された細胞と非染色細胞の総数で割ることによって計算した。

２．手作業による計数
セーフティーキャビネット内で、５０μｌの上述の初期細胞懸濁液を１２×７５ｍｍ管内の、メチレンブルーを含む３％酢酸溶液４５０μｌに移すことによって、１：１００細胞希釈液を調製した。得られた細胞懸濁液を、改良型ノイバイエル血球計算盤の上および下の両方のチャンバーに装填し、上および下の両チャンバーにおける、各１ｍｍ×１ｍｍの８つの大きな四角内で、青色に染色された細胞の数を計数した。細胞数は、総数を８で割り、１００（希釈倍率）および１０，０００を掛けることによって計算した。

３％酢酸によるＲＢＣの溶解は即時的であったが、有核細胞は少なくとも４０分間完全な状態を維持していた。有核細胞は、メチレンブルーを添加した３％酢酸中で青色に染色された。細胞濃度は、各１ｍｍ×１ｍｍの四角中におよそ５０の細胞密度となるように調整するのが最適であった。上のチャンバー（Ｎ_１）および下のチャンバー（Ｎ_２）から得られた計数値は、Ｎ_２がＮ_１±√Ｎ_１の範囲内にあるはずであるという場合に匹敵していた。そうでなければ、技術的不完全性および不適格性によって生じる非無作為性および不明確性を避けるために、充填手順および計数を反復した。

３．自動計数
細胞懸濁液は血液分析装置Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＡＣＴ Ｄｉｆｆでも計数し、手作業による計数の精度を対比確認した。

細胞の調製
細胞生存率および細胞総数を記録した後、細胞を含有する管に４００ｘｇで５分間、遠心分離を行った。各管の上清を、細胞ペレットを乱さずに吸引し、１％ＮＳＡを添加した臨床グレードの生理食塩水に細胞を再懸濁させ、１×１０^５生細胞／μｌの濃度に調整した。得られた細胞懸濁液１００μｌを２本（１本はバックアップ用）の無菌０．２５ｍｌエッペンドルフ管に移した。次に、細胞懸濁液を以下の注射投与に用いた。

ａ．４μｌ×注射４回分（１６×１０^５生細胞）
ｂ．８μｌ×注射４回分（３２×１０^５生細胞）
ｃ．１６μｌ×注射４回分（６４×１０^５生細胞）
簡単に述べると、細胞を含むエッペンドルフ管を操作室に送った。操作室で、細胞懸濁液を、１％ＮＳＡを添加した臨床グレードの生理食塩水とともにハミルトンシリンジおよびバタフライニードルに充填した。より具体的には、３群の被験体Ａ、ＢおよびＣに投与する前に、適当な容量の細胞懸濁液を、バタフライニードルを介して５０μｌまたは１００μｌハミルトンシリンジに充填した。Ａ群またはＢ群では、５０μｌハミルトンシリンジを使用し、Ａ群では２０μｌ（５μｌ×４）を、またはＢ群では４０μｌ（１０μｌ×４）を吸引した。Ｃ群では、１００μｌハミルトンシリンジを用い、８０μｌを吸引した。各被験体の脊髄の脊髄後根侵入帯に４回の注射を行った。

上述のバックアップ管に、４００ｘｇで５分間遠心分離を行った。得られた上清を吸引し、無菌性検査に用いた（サンプル２）。これらの細胞に対して、次に、直接免疫蛍光（下記参照）およびコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイによって系譜分析を行った。

無菌性検査
上述のサンプル１およびサンプル２（工程３８）の両方に、病院の標準的プロトコールまたは適正な手作業によるプロトコールの後すぐに無菌性検査を行った。

コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイ
まず、生細胞数を計数し、次に、培養を行い、２週間かけて形成されたＣＦＵの数を決定した。簡単に述べると、ＩＭＤＭ（イスコブの改変ダルベッコ培地）に増殖因子、ｒｈＧ−ＣＳＦおよびｒｈＩＬ−３を添加したプレミックスメチルセルロース培地（Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｈ４２３０；ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ Ｉｎｃ．）に細胞をピペットで移した。最終調整濃度は１％メチルセルロース、３０％ウシ胎児血清、１％ウシ血清アルブミン、１０^−４Ｍ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ １−グルタミン、１０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＩＬ−３、および５００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＧ−ＣＳＦであった。細胞を穏やかにボルテックスにかけ、１．１ｍｌの細胞懸濁液（５×１０^４細胞）を３５ｍｍ×１０ｍｍ無菌培養ディッシュ（ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）に２連で播種した。水で飽和した５％ＣＯ_２インキュベーターにて３７℃で細胞を培養した後、２０以上の細胞からなるＣＦＵ−ＧＭコロニーを、標準的な倒立顕微鏡で手作業により計数した。細菌または真菌で汚染されていた培養物があれば記録した。

ｈＵＣＢ−ＭＮＣの直接免疫蛍光分析
以下は、十分な残存細胞があった場合に行うべき任意選択の分析である。施設の慣行によって、分析技術は二重または単一プラットフォームのいずれかであり、洗浄有り無しのいずれかであり得る。ＩＳＨＡＧＥゲーティング法を用いて、ＣＤ３４^＋細胞およびＣＤ１３３^＋細胞を計数した。

この分析に必要な試薬としては、ヒト細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体（ＩｇＧ−ＰＥ、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ、ＣＤ３４−ＰＥおよびＣＤ１３３−ＰＥ）、７−アミノ−アクチノマイシン（７−ＡＡＤ；ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅまたは同等物）、ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｐ全血溶解試薬（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）、洗浄バッファー（０．１％アジ化ナトリウムを添加したＰＢＳ）、染色バッファー（０．１％アジ化ナトリウムおよび１％ＮＳＡを添加したＰＢＳ）、１％パラホルムアルデヒド溶液、および１２×７５ｍｍポリスチレン試験管が含まれた。以下は染色法である。

１．工程７の生存率アッセイで調製した細胞懸濁液から、必要に応じて１％ＮＳＡを用い、有核細胞数を＜１×１０^７／ｍｌに調整する。
２．１２×７５ｍｍ試験管にラベルを付け、次のように抗体および細胞を分配する。

３．穏やかにボルテックスにかけ、暗所で、４℃にて２０分または室温で３０分静置する。
４．Ｑ−ＰｒｅｐディスペンサーおよびＩｍｍｕｎｏＰｒｅｐ全血溶解試薬を用い、溶解、中和、固定染色を行う。シグナル獲得前に少なくとも１時間暗所に静置するか、または

４ａ．細胞懸濁液に５００μｌのＲＢＣ溶解バッファーを加え、穏やかに混合し、暗所で室温にて１０分間インキュベートする。２ｍｌの冷洗浄バッファーで２回洗浄する。３００ｘｇにて２〜８℃で５分間、遠心分離を行う。上清を除去し、細胞を０．５ｍｌの１％パラホルムアルデヒド溶液に再懸濁させる。

５．図ＸＩに示されているようにＩＳＨＡＧＥプロトコールを用い、７５，０００以上のＣＤ４５^＋事象および最低１００のＣＤ３４^＋事象を確保する。
図６には、ＩＳＨＡＧＥ指針に従うプロトコールを用いたＣＤ３４計数の例が示されている。非洗浄プロトコールを用い、細胞をＣＤ４５−ＦＩＴＣおよびＣＤ３４−ＰＥで標識した。分析前、７−ＡＡＤを加えた。ＳＳとＣＤ４５のサイトグラムに領域Ａを設定し、白血球を画定した。ＣＤ３４＋ｖｅ細胞を囲むために領域Ｂを設定した。ゲートで選別したＳＳとＣＤ４５（ＡおよびＢ）のドットプロット上に、弱い陽性のＣＤ４５細胞を含むように領域Ｃを設定した。領域ＤはＳＳとＣＤ４５プロット上でリンパ球を囲んだものであり、ＳＳとＦＳのプロットのゲート選別に使用した。領域Ｅは全てのリンパ球を含むように描かれ、この領域はゲートで選別される別の分散プロット上にコピーした（ＡおよびＢおよびＣ）、（Ｅ２）。領域Ｆは、ＳＳと７−ＡＡＤのドットプロット上に、７−ＡＡＤ陽性細胞（死）およびこの領域にゲートで選別されたこれまでプロットを全て排除するように描いた。次に、領域Ｅ２の細胞をＣＤ３４＋細胞として記録した。

１．バッグの種類および温度
図２に示されるように、幹細胞を上述の３種のバッグで３日かけて輸送した場合、バッグの種類と輸送温度は両方とも、回収率（図２Ａ）、細胞生存率（図２Ｂ）、ＣＤ３４^＋細胞集団のレベル（図２Ｃ）、ＣＤ１３３^＋細胞集団のレベル（図２Ｄ）、およびＣＦＵ（図１Ｅ）に様々な程度で影響を及ぼした。

例えば、回収率および細胞生存率は３つのバッグ種で匹敵するものであったが（図２ＡおよびＢ参照）、ＣＤ３４^＋細胞集団のレベル及びＣＤ１３３^＋細胞集団のレベルは、ハイクローンＰＥサンプルバッグおよびテルモ（ＰＶＣ）バッグで輸送されたもので高かった（図２ＣおよびＤ）。これに対し、テフロン（登録商標）バッグで輸送された細胞は、ハイクローンＰＥサンプルバッグで輸送された細胞の場合より有意に高いＣＦＵを有しており、テルモ（ＰＶＣ）バッグで輸送された細胞の場合より有意に高いＣＦＵを有していた（図２Ｅ）。

輸送温度に関しては、ＲＴで輸送された細胞はより低い回収率または細胞生存率の傾向を示す（図２ＡおよびＢ）。しかしながら、ＲＴで輸送された細胞は、バッグの種類によらず、より高いレベルのＣＤ３４^＋細胞集団およびＣＤ１３３^＋細胞集団を有していたことは予期しないことであった（図２ＣおよびＤ）。さらに、テフロン（登録商標）バッグにてＲＴで輸送された細胞は最高のＣＦＵレベルを有していたこと、および同様に、ハイクローンＰＥサンプルバッグにてＲＴで輸送された細胞も高いＣＦＵレベルを有していたことも予期しないことであった。

上記の結果は、幹細胞をＲＴで輸送すると、予期されないほど高いレベルのＣＦＵまたは高いレベルのＣＤ３４^＋細胞集団およびＣＤ１３３^＋細胞集団を有していたことを実証した。

２．培地
輸送培地の影響も検討した。ＣＩＭ培地で輸送した細胞は、ＩＭＤＭで輸送したものよりも約２日後により高い細胞生存率を有することが判明した（図３および４）。特に、５日後に、ＣＩＭ培地中の細胞はなお約７４％の生存率を有していた。

次に、このＣＩＭ培地をＨＹＰＯＴＨＥＲＭＯＳＯＬ（登録商標）（ＨＴＳ）培地（ＢＩＯＬＩＦＥ ＳＯＬＵＴＩＯＮＳ）と比較した。一般に、テフロン（登録商標）バッグにてＣＩＭ培地中、ＲＴまたは４℃で輸送された細胞は、ＨＴＳ培地の場合に匹敵するか、またはそれより高い細胞回収率、生存率、およびＣＤ３４^＋細胞レベルを有することが判明した（図５Ａ〜Ｃ）。ＣＩＭ培地中、ＲＴで輸送された細胞が、ＣＤ３４^＋細胞レベル、ＣＤ１３３^＋細胞レベル、およびＣＦＵに関して最高値を有していたことは、予期されないことであった。また、１％ＮＳＡが、バッグの種類とは無関係に、ＨＴＳおよびＣＩＭの両方で細胞生存率を改善したことも判明した。下記表１〜３を参照。

要約すれば、手順の試験に用いたバッグの中では、テフロン（登録商標）バッグで最良のＣＦＵ数が得られることが判明した。しかしながら、これらのバッグのＧＭＰ供給源は無く、テフロン（登録商標）バッグでは内容物の開封操作が必要であったことから、汚染リスクを避けるために余分な注意を払わなければならなかった。ハイクローンバッグはテルモバッグよりも高い生存率、総有核数、およびＣＦＵ数を有していた。従って、さらなる輸送および実験にはハイクローンバッグを選択した。

ＣＩＭ中、テフロン（登録商標）バッグで輸送される細胞について温度を検討するためにさらなるアッセイを行った。データを以下に示す。

上記の表に示されるように、テフロン（登録商標）バッグ、ＲＴ、ＣＯ_２非依存性培地でのインキュベーションにおけるヒト単核細胞は、８日にわたって、ＣＤ３４^＋細胞またはＣＤ１３３^＋細胞に関して最高の相対レベルを有していた。

以上の例および好ましい実施形態の説明は例示と見なされるべきであり、特許請求の範囲によって定義される本発明を限定するものではない。本明細書に引用されている全ての刊行物は参照によりその全内容が本明細書の一部とされる。容易に明らかとなるように、上記に示される特徴の多くの変形および組合せが、特許請求の範囲に示される本発明から逸脱することなく、利用可能である。このような変形は本発明の範囲からの逸脱と見なされず、このような変形は全て、以下の特許請求の範囲内に含まれるものとする。

Claims (15)

1. 複数の多能性細胞とＣＯ _２ 非依存性培地とを含有する組成物と、
   前記組成物を保持し、かつ、ポリマーからなる基質を含む容器と
   を含む、包装製品。
2. 前記ポリマーがポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ペルフルオロアルコキシ（ＰＦＡ）、フッ化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエチレン、またはポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）である、請求項１に記載の包装製品。
3. 前記容器がバッグ、チューブ、シリンジ、または注射器用バイアルである、請求項１または２に記載の包装製品。
4. 前記多能性細胞が幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、ＣＤ３４^＋細胞、またはＣＤ１３３^＋細胞である、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の包装製品。
5. 前記組成物が末梢血細胞、臍帯血細胞、骨髄細胞、または胎盤血細胞を含有する、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の包装製品。
6. 前記組成物が５〜３０℃の範囲内の温度を有する、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の包装製品。
7. 前記培地が血清またはヒト血清を含有する、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の包装製品。
8. 請求項１乃至７のいずれか一項に記載の包装製品を作製するための方法であって、前記方法は、
   多能性細胞を含有する組成物を準備する工程；
   ポリマーからなる基質を含む容器を準備する工程；
   前記組成物を前記容器に入れる工程；および
   前記容器を密封する工程、
   を含む、方法。
9. 多能性細胞を輸送するための方法であって、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の包装製品を準備する工程、および前記包装製品を受取人に５〜３０℃の範囲内の温度にて配送する工程、を含む、方法。
10. 前記配送する工程が１０〜３０℃の範囲内の温度で行われる、請求項９に記載の方法。
11. 前記配送する工程が１５〜２５℃の範囲内の温度で行われる、請求項１０に記載の方法。
12. 前記配送する工程が少なくとも１日かけて行われる、請求項９乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記配送する工程が少なくとも３日かけて行われる、請求項１２に記載の方法。
14. 前記配送する工程が少なくとも５日かけて行われる、請求項１３に記載の方法。
15. 請求項１２乃至１４のいずれか一項に記載の方法において、
    配送時、前記多能性細胞が、以下の特徴：
    ４０％を超える回収率；
    ７０％を超える生存率；
    ０．５％を超えるＣＤ３４ ^＋ 細胞；
    ０．２５％を超えるＣＤ１３３ ^＋ 細胞；及び
    ２ＣＦＵ／５×１０ ^４ 細胞より多く形成可能であること、
    のうちの１つ以上を有する、方法。