CN107306937A

CN107306937A - 干细胞的包装和运输

Info

Publication number: CN107306937A
Application number: CN201710450401.0A
Authority: CN
Inventors: 杨咏威; 孙东明; 罗伯特·弗雷斯阿卡; 金时肯特·曾
Original assignee: StemCyte Inc
Current assignee: StemCyte Inc
Priority date: 2011-02-18
Filing date: 2012-02-14
Publication date: 2017-11-03
Also published as: US20180273901A1; HK1197262A1; US9951309B2; TW201726097A; EP2675890A2; EP2675890A4; TW201244708A; ES2758882T3; EP2675890B1; TWI626939B; AU2012217778B2; WO2012112572A3; CA2827590A1; WO2012112572A2; JP5899246B2; CA2827590C; US10400212B2; JP2014513918A; AU2012217778A1; CN103748210A

Abstract

本发明涉及包装和运输干细胞的方法。本发明还公开了相关的包装产品。

Description

干细胞的包装和运输

本申请是2013年9月16日进入中国国家阶段、申请号为201280013451.8、申请日为2012年2月14日、发明名称为“干细胞的包装和运输”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2011年2月18日提交的美国临时专利申请第61/444,207号的优先权，该美国临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及包装和运输各种干细胞的方法和产品。

背景技术

干细胞是具有如下特征的多种类型的细胞：能够通过细胞有丝分裂进行自我更新并且能够分化为各种特化的细胞类型。人干细胞一般是能够自我更新并生成多种成熟的人细胞系的全能或多能前体细胞。这种能力用作器官和组织发育所需的细胞分化和特化的基础。最近的证据显示干细胞可用于使许多(如果不是全部的话)组织重建并且使生理功能和组织功能恢复。因此，干细胞具有用于治疗多种疾病和损伤(包括神经系统创伤，恶性肿瘤，遗传性疾病，血红蛋白病和免疫缺陷)的潜力。许多不同类型的哺乳动物干细胞已被表征。实例包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、成体干细胞，并且已知其他定向干细胞或祖细胞。此外，脐带血为间充质干细胞以及造血干细胞和祖细胞的已知的可选来源。

然而，这些细胞的应用通常因物流问题而受到限制。例如，一旦收集了干细胞(包括脐带血细胞)，通常就将该干细胞冷藏于存储设备(例如，细胞库)中，当需要时，将存储的干细胞从上述存储设备运输至医院。通过将细胞或组织冷却至零度以下的低温(通常为77K或-196℃，液氮的沸点)进行保藏的这种冷藏方式带来一些风险。例如，保藏的细胞会由于冷冻至低温或升温至室温而被损伤。这些风险对于干细胞(包括脐带血细胞)而言尤其严重，因为干细胞移植的最重要的方面之一为存活的干细胞的数量及其在移植时的发育潜力。出于这种担忧，通常在尽量短的时间段内冷藏运输干细胞。事实上，在干冰上或液氮罐中连夜运输是工业标准并且必须格外小心监控温度。但是，这种实际操作并没有消除风险，而且这种操作的成本昂贵，对于长途(例如跨洲)运输而言并不实用。

因此，亟需一种更加实用的运输干细胞的方法。本发明满足了这种需要和其他需要。

发明内容

本发明基于(至少部分基于)如下意想不到的发现：用于包装和运输干细胞的方法不需要冷藏并且不会显著损害干细胞的活力或发育潜力。

因此，本发明的一个方面的特征在于包含如下组合物和容器的包装产品，所述组合物包含多种多能细胞，所述容器包含基体；所述基体含有聚合物。所述聚合物可为聚四氟乙烯(PTFE)、全氟代烷氧基(PFA)、氟化乙烯丙烯(FEP)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚乙烯或聚氯乙烯(PVC)，所述聚合物具有低摩擦或无黏着性的性质。所述聚合物还可为适合于生物制品的其他聚合物，例如，超低密度聚乙烯、低密度聚乙烯(LDPE)、线性低密度聚乙烯(LLDPE)、高密度聚乙烯(HDPE)、同轴向聚丙烯(COPP)、双轴向聚丙烯(BOPP)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚酰亚胺树脂(例如，尼龙)、乙烯乙烯醇聚合物(EVOH)以及它们的金属化形式。

包装产品可为任何合适的形状，包括但不限于：袋状、注射器或注入器用小瓶。在一个实例中，所述产品预先装有供临床使用的干细胞。多能细胞可为干细胞，例如，造血干细胞或间充质干细胞。组合物可含有外周血细胞、脐带血细胞或骨髓细胞。

组合物的温度可为5℃至40℃，例如5℃至37℃，5℃至30℃，10℃至30℃ 或15℃至25℃。组合物可包含培养基，优选地，包含不依赖于CO₂的培养基 (CIM)。在优选的实施方式中，所述培养基包含血清，例如人血清，例如0.5％至20％(例如，1％，2％，3％，4％，5％，7％，8％，9％，10％，15％和20％) 的人血清。在另一实施方式中，所述组合物为药物组合物并且包含药学上可接受的载体。例如，为了运输的目的，可将包装产品密封。所述组合物可包括至少1×10⁶个细胞，例如，2×10⁶个细胞，5×10⁶个细胞，10×10⁶个细胞， 20×10⁶个细胞，40×10⁶个细胞，80×10⁶个细胞，100×10⁶个细胞或200×10⁶个细胞。上述细胞可为CD34⁺，CD133⁺，CD34⁺CD133⁺或其他类型的干细胞。

在一种实施方式中，上述细胞(例如，外周血细胞，脐带血细胞或骨髓细胞)可为已冷冻并解冻的那些细胞，例如，获自血库的那些细胞。在那种情况下，培养基可包含约10U/ml至100U/ml的DNAse(例如，人DNAse)，例如，10U/ml的DNAse，15U/ml的DNAse，20U/ml的DNAse，25U/ml的DNAse， 30U/ml的DNAse，40U/ml的DNAse，50U/ml的DNAse，60U/ml的DNAse，70U/ml 的DNAse，80U/ml的DNAse，90U/ml的DNAse，或100U/ml的DNAse。可选地，细胞可刚刚获自供体并且没有被冷冻，在该情况下，DNAse不是必须的并且组合物可不含DNAse。

第二方面，本发明的特征在于制造上述包装产品的方法。所述方法包括如下步骤：(a)提供含有多能细胞的组合物；(b)提供包含基体的容器，其中，所述基体包含聚合物；(c)将所述组合物放置于所述容器中，以及(d) 密封所述容器。

第三方面，本发明的特征在于运输干细胞的方法。所述方法包括如下步骤：提供上述包装产品并将所述包装产品递送至接收者，例如，快递员、接收医院的代理人或工作人员。在递送步骤中，温度可在5℃至40℃的范围内，例如，5℃至37℃，5℃至30℃，10℃至30℃，12℃至28℃或15℃至25℃(即，室温或RT)。使用该方法，可在1至8天内递送细胞，例如，在至少24小时或2 天、3天、4天、5天、6天、7天或8天内递送细胞。

递送之后，多能细胞可具有大于40％(例如，45％，50％，55％，60％， 65％，70％，75％，80％，85％，90％和95％)的回收率。并且，在递送之后，多能细胞可具有超过50％(例如，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％， 80％，85％，90％和95％)的活力(通过本文公开的台盼蓝拒染法确定)。在一种实施方式中，在递送之后，多能细胞可具有超过0.5％的CD34⁺细胞(例如， 0.55％，0.6％，0.65％，0.7％，0.75％，0.8％，0.85％，0.9％，0.95％，1.0％，1.1％，1.15％，1.2％，1.3％，1.4％，1.5％，1.6％，1.7％，1.8％，1.9％或2.0％)。在另一实施方式中，在递送之后，多能细胞可具有超过0.25％的CD133⁺细胞(例如，0.25％，0.3％，0.35％，0.4％，0.45％，0.5％，0.55％，0.6％，0.65％，0.7％， 0.75％，0.8％，0.85％，0.9％，0.95％，1.0％，1.1％，1.15％，1.2％，1.3％，1.4％， 1.5％，1.6％，1.7％，1.8％，1.9％或2.0％)。在又一实施方式中，在递送之后，多能细胞能够形成超过2(例如，5，10，15，20，25或30)CFU/5×10⁴个细胞。上述值可根据下面实施例中所描述的方法确定。

本发明的一种或一种以上实施方式的具体细节在下面的具体实施方式中阐述。本发明的其他特点、目的和优势可通过具体实施方式和权利要求的描述而变得明显。

附图说明

图1为显示在干细胞的收集、处理、运输和收到之后的检测的示例性步骤中的操作的流程图。

图2A至图2E为显示当在3天内用三种类型的袋子运输干细胞时，袋子的类型和运输温度均对回收率(图2A)、细胞活力(图2B)、CD34⁺细胞群的水平(图2C)、CD133⁺细胞群的水平(图2D)和CFU(图2E)具有不同程度的影响的系列图。

图3为显示室温下IMDM和CIM对细胞活力的影响的表格和图。

图4为显示室温和4℃下IMDM和CIM培养基对细胞活力的影响的表格和图。

图5A至图5E为显示当在室温或4℃下用TEFLON袋运输细胞时，CIM和 HTS培养基对细胞回收率(图5A)、活力(图5B)、CD34⁺细胞水平(图5C)、 CD123⁺细胞水平(图5D)和CFU(图5E)具有不同程度的影响的系列图。

图6为显示外周血中CD34⁺细胞计数的一组柱状图。

图7为所检测的三种袋子的照片：HYCLONE聚乙烯袋(左)、TERUMO 聚氯乙烯袋(中)和TEFLON袋(右)。

具体实施方式

本发明涉及在较长的时间段内在诸如室温(即，15℃至25℃)之类的条件下包装和/或运输干细胞或含有干细胞的制剂(例如，脐带血)。由此包装和运输的干细胞和制剂意想不到地具有令人满意的活力和发育潜力，以供临床使用。

图1显示了收集、处理、运输和测试脐带血细胞或从脐带血中分离的细胞组分的步骤的实例。

简言之，脐带血细胞可在医院就地收集或获自于脐带血库(例如，由 STEMCYTE公司维护的脐带血库)。尽管可使用任何本领域已知的用于收集和储存的步骤，但是在下面的实施例中描述优选的步骤。一般而言，应当对各种感染标志物进行无菌测试。此外，应当确定并记录总细胞数、CD34+细胞数和单位体积，随后进行冷冻冷藏。收集的血液含有红细胞(RBC)，所述红细胞在冷冻和解冻过程中易于分解。在那种情况下，一旦发生裂解，RBC的DNA使收集的脐带血细胞的粘度增加并且阻碍对临床用脐带血细胞的进一步处理。为了避免这种情况，可在致使DNA发生分解的冷藏之前将DNAse加至收集的细胞中。这样做可降低细胞的粘度并降低细胞凝集，从而在渗透梯度(例如，FICOLL)中更好地分离细胞。可使用多种商售DNAse。实例包括由GENENTECH销售的

可选地，可对脐带血进行处理除去红细胞，使其基本消除。如果需要的话，可通过渗透梯度(例如，FICOLL)或下面实施例1描述的方式将脐带血分为多个有用的单元(例如，总单核细胞(TMN)、白细胞、淋巴细胞、CD34+ 细胞、CD133+细胞、巨噬细胞和其他细胞)。并且，如上所述，待运输的脐带血细胞可刚刚获自供体并且未被冷冻。在这些方法中，在包装和/或运输这些刚刚获得的单元的过程中不需要DNAse。此外，可根据本领域已知的方法(例如，美国申请第20080166324号中描述的那些方法，该美国申请的全部内容在此通过引用并入本文)除去血浆。

随后，在医院内的加工设备中或在医院外(例如，上述血库)的加工设备中包装并制备收集的细胞以进行运输。如果细胞已经被冷藏，那么可以下面实施例1描述的方法解冻细胞。可再次对各种感染标志物进行无菌测试并应当确定和记录总细胞数、CD34+细胞数、浓度和单位体积。然后，将细胞放置于上述容器中，从而形成用于通过指定载体运输的包装。

虽然可使用多种培养基，但是不依赖于CO₂的培养基(CIM)为优选的。这些CIM培养基防止钾消耗并且产生更好的细胞存活率。并且，它们还能够维持pH长期稳定而无需CO₂气氛(0.04％)。CIM培养基的实例包括由GIBCO销售的那些培养基，例如，Cat.No.8045。还优选使用人血清。

细胞可用于形成药物组合物，所述药物组合物具有药学上可接受的载体。作为非限定性的实例，常规缓冲盐水(例如，约135mM-150mM NaCl)可用作药学上可接受的载体。其他合适的载体包括但不限于：水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸，等等。适用于递送本发明的培养的干细胞和锂盐的其他载体在例如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,Mack Publishing Co.,Philadelphia,Pa.,第18版(1995)中描述。

如本文所公开的，容器的材料至关重要。一般而言，材料可为低摩擦的或对细胞无黏着性并且对细胞无毒或对干细胞接受者无害的聚合物。合适的聚合物的实例包括但不限于：聚四氟乙烯(PTFE)、全氟代烷氧基(PFA)、氟化乙烯丙烯(FEP)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚乙烯、聚氯乙烯(PVC)、超低密度聚乙烯、低密度聚乙烯(LDPE)、线性低密度聚乙烯(LLDPE)、高密度聚乙烯(HDPE)、同轴向聚丙烯(COPP)、双轴向聚丙烯(BOPP)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚酰亚胺树脂(例如，尼龙)、乙烯乙烯醇聚合物(EVOH)以及它们的金属化形式。如果其他聚合物的摩擦系数(相对于抛光的钢)为与上述聚合物的摩擦系数相当或低于上述聚合物的摩擦系数，那么还可使用其他聚合物。上述聚合物的摩擦系数为本领域已知的并且通过引用并入本文。例如，摩擦系数可低于0.5，例如，0.4、0.3、0.2或0.1。在优选的实施方式中，本领域技术人员可使用由DUPONT销售的、商品名为 TEFLON的基于PTFE、PFA、PEP或PVDF的容器、HYCLONE的基于聚乙烯的容器或TERUMO的基于PVC的容器。

容器的基体可被成型为任何适于容纳和储存细胞的形状。所述形状的实例包括但不限于：袋状、管状、注射器或注入器用小瓶。在一些实施方式中，所述基体被成型为适于培养的形状或适于将干细胞移植或植入各种组织(例如，CNS)的某一位置的形状。实例包括带状、膜、线状、切片、微珠、微粒、细胞培养平板、多孔平板和生物反应器，所有这些均可容纳细胞。

如本文所述，在运输过程中，包装内的细胞不需要保持在较低的温度条件(例如，冷藏)下或不需要连夜运送。相反，细胞可在较宽的温度范围(包括室温)内在相对较长的时间段(例如，3天至8天)内运输。尽管可使用这些不太严格的条件，但是优选的是，在保温容器中运输包装和/或使用温度探针监控所述包装，从而向承运人或接收者提供信息(如果需要的话)。由于可使用这些不太严格的条件，因此避免了与运输冷藏细胞有关的成本。此外，因为运输时间可长达5天至8天，因此使长距离(例如跨洲)运输变得可行。因此，使距离特定干细胞(例如，具有罕见的匹配的HLA-型的那些干细胞) 的来源很远的患者能够得益于干细胞移植。

在从快递员处收到细胞之后，可以下面实施例所描述的方法处理细胞并测试其移植适用性。为此，可使用下面四个标准确定细胞是否适于移植。

细胞计数

必须有足够的活细胞用于移植和分析。优选的是，活细胞数为移植(例如，移植进入脊髓)所需的细胞数的至少两倍，这样会有足够的剩余细胞用于分析细胞。例如，如下面实施例2所公开的，对于A组、B组和C组而言，分别需要16μl、32μl和64μl的细胞悬浮液(100,000细胞/μl)用于移植。换言之，使用160万个细胞、320万个细胞和640万个细胞用于移植。这些量的两倍为所需的最少的单核细胞数，分别为320万个单核细胞、640万个单核细胞和1,280 万个单核细胞。如果运输包含更少的细胞，那么这种运输应当不适于移植。

活力

在制备中应当避免过多的死细胞。为此，使用台盼蓝拒染法(TBE)的人工计数可用作活力标准。表示为百分含量的细胞悬浮液的TBE代表没有被染成蓝色的细胞除以染色和未染色的细胞的总数。对于指定用于移植的细胞而言， TBE应当至少为70％。一般而言，下面实施例中所描述的洗涤步骤消除死细胞，并且细胞悬浮液就在移植前通常具有高于90％的TBE。

污染

任何污染证据或污染风险应当进行报告。这包括例如，运输袋中液体的任何渗漏的出现、细胞悬浮液中的异常混浊、显微镜下可见细菌或真菌或先前污染的报告。如本文所公开的，应当仔细地排除对母源性乙肝核心抗原呈阳性的脐带血单元和对所有其他感染原呈阳性的脐带血单元，所述其他感染原通常会使脐带血单元从根据国家骨髓供体计划(NMDP)的登记中排除。

单核细胞

最终制剂应当具有95％或更多的单核细胞。如果细胞活力计数显示高于 5％的其他细胞(例如红细胞或嗜中性粒细胞)，那么该细胞无法用于移植。注意在脐带血中可能存在一些不成熟的有核红细胞。

在优选的实施方式中，如果下列情况属实，那么应当去掉包装：(i)温度曲线显示温度在指定许可的12℃至28℃的温度范围之外和(ii)从初始解冻 (待处理的脐带血单元的解冻)开始所消耗的总时间未超过5天。

在上述步骤中，可将抗生素加至细胞制剂中。例如，可在开始处理细胞时添加庆大霉素以降低处理和运输过程中的污染风险。庆大霉素可抑制细菌生长，即使多次先前培养基灌装测试表明没有引入污染。在接收医院中，洗涤并重悬细胞两次，这可显著稀释可存在于细胞悬浮液中的抗生素。本发明发现在六个月的时间段中，在所处理的15个以上的脐带血单元中，对洗涤溶液进行培养没有产生任何阳性培养物。同样，两周CFU培养显示没有任何细菌生长。

在上述步骤中，使用诸如美国申请第20100189696号、20100323920号、第20080227197号和第20080166324号中所描述的那些方法，可对脐带血干细胞进行进一步处理以扩增干细胞池，即，体外扩增，上述美国申请的全部内容通过引用并入本文。术语“体外扩增”是指在实验室培养干细胞。这些细胞可从哺乳动物中提取并且可以是通过在合适的环境(例如，含有锂盐的培养基)中培养产生的增加的细胞。如果可能的话，建立稳定的细胞系以使细胞继续繁殖。

本发明可使用各种干细胞来实施。干细胞的实例包括脐带血细胞、造血干细胞、胚胎干细胞、骨髓干细胞、外周血干细胞、胎盘血和其他干细胞，上述干细胞可分化为功能细胞，例如，神经细胞或胶质细胞。术语“干细胞” 是指能够分化成多种最终的、分化的、特化的细胞类型的任何细胞。干细胞来自所有胚层(即，外胚层、中胚层和内胚层)。干细胞的典型来源包括胚胎、骨髓、外周血、脐带血、胎盘血、肌肉组织和脂肪组织。

干细胞可为全能干细胞或多能干细胞。全能干细胞通常具有发育成任何细胞类型的能力。全能干细胞可为胚胎干细胞来源的和非胚胎干细胞来源的这两者。多能细胞通常为能够分化成多种不同的最终分化的细胞类型的细胞。例如，多能干细胞可产生神经系统细胞、皮肤细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、血细胞、肌肉细胞、骨细胞等等。多能干细胞的实例包括但不限于：脐带血干细胞、神经干细胞、造血干细胞、脂肪衍生的干细胞、间充质干细胞、胎盘衍生的干细胞、脱落的牙衍生的干细胞和毛囊干细胞。形成鲜明对照的是，专能(multipotent)或成体干细胞通常产生有限的细胞类型。除非另有说明，本文使用的术语干细胞包括祖细胞。单能干细胞仅仅可产生一种细胞类型，但是具有使其区别于非干细胞的自我更新性质。这些干细胞可来源于各种不同的组织或器官系统，包括但不限于：血液、神经、肌肉、皮肤、肠、骨、肾脏、肝脏、胰脏、胸腺，等等。根据本发明，干细胞可来源于成人或新生儿组织或器官。

本发明描述的细胞可为基本上纯的。术语“基本上纯的”当涉及干细胞或从干细胞衍生得到的细胞(例如，分化的细胞)时，是指特定的细胞构成制剂中的大部分或大多数(即，超过20％，30％，40％，50％，60％，70％， 80％，90％或95％)细胞。例如，基本上纯的细胞群构成制剂中的至少约70％的细胞，通常构成制剂中的约80％的细胞并且尤其构成制剂中的至少约90％ (例如，95％，97％，99％或100％)的细胞。

在优选的实施方式中，使用脐带血细胞。这些细胞可如下面实施例部分中所描述的那样获得或可通过本领域已知的方法获得并且随后通过标准技术进行检测。例如，为了证实细胞的分化潜力，可通过本领域已知的方法诱导细胞形成各种集落形成单位。由此证实的细胞可进一步在非分化培养基中繁殖超过10次、20次、50次或100次群体倍增而不出现自发分化、衰老、形态变化、生长速率提高或分化为神经元的能力的改变。所述细胞可通过标准方法保存待用。

本文中可互换使用的涉及细胞的术语“增殖”和“扩增”是指通过分裂使相同类型的细胞的数目增加。术语“分化”是指如下的发育过程：通过该发育过程细胞特化为具有特定功能，例如，细胞获得一种或一种以上不同于初始细胞类型的形态特征和/或功能。术语“分化”包括谱系定向和终末分化过程。例如，分化可通过监测谱系标记物是否存在，使用免疫组化或其他本领域技术人员已知的步骤来评估。来自祖细胞的分化的子代细胞可与干细胞的来源组织相同的胚层或组织相关，但不是必须。例如，神经祖细胞和肌肉祖细胞可分化为造血细胞系。本文中可互换使用的术语“谱系定向”和“特化”是指干细胞所经历的如下过程：干细胞产生定向于形成具体限定范围的分化的细胞类型的祖细胞。定向的祖细胞通常能够进行自我更新或细胞分裂。术语“终末分化”是指细胞最后分化为成熟的完全分化的细胞。例如，造血祖细胞和肌肉祖细胞可分化为神经细胞系或胶质细胞系，神经细胞系或胶质细胞系的终末分化可产生成熟的神经元或胶质细胞。通常，终末分化与退出细胞周期和增殖的停止有关。

本文使用的术语“祖细胞”是指定向于特定细胞系的细胞，并且该细胞通过一系列细胞分裂产生该谱系的细胞。祖细胞的实例包括如下谱系的前体细胞：神经元谱系、肝谱系、肾谱系、脂肪谱系、成骨谱系、破骨谱系、肺泡谱系、心脏谱系、肠谱系或内皮谱系。

术语“培养”是指将干细胞维持在可使其增殖并避免衰老的条件下。例如，在本发明中，干细胞在含有锂盐和任选地一种或一种以上生长因子(即，生长因子混合物)的培养基中培养。

术语“脐带血”是指从出生后留下的脐带的血液中获得的多能干细胞和专能干细胞的来源。在脐带血中发现的干细胞的实例包括但不限于：间充质干细胞、造血干细胞和祖细胞。间充质干细胞和祖细胞通常可分化为神经细胞、骨髓基质细胞、软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、肌腱细胞和韧带细胞。造血干细胞通常可产生淋巴细胞系、骨髓细胞系和红细胞系。用于收集和处理脐带血的方法在下面详细描述。

术语“脐带血单元”是指从单个供体中收集到的脐带血的体积。在本发明的方法中通常使用单个脐带血单元，但是也可使用多个脐带血单元(例如两个脐带血单元)以增加干细胞数。

本文使用的术语“基本除去血浆”和“除去血浆的”是指已将其中体积大于约30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％， 85％，90％或95％的血浆除去的处理过的脐带血单元。例如，可通过对脐带血进行离心并分离细胞组分与血浆组分而基本除去血浆。基本除去血浆之后剩余的血浆体积通常为约0％至约30％(按体积计)，优选地为约10％至约30％ (按体积计)。

本文使用的术语“未除去红细胞”和“红细胞未被除去”是指将其中体积小于约30％，25％，20％，15％，10％，5％，4％，3％，2％或1％的红细胞除去的处理过的脐带血单元。本文使用的术语“红细胞被基本除去”和“除去红细胞的”是指已将其中体积大于约30％，35％，40％，45％，50％，55％， 60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％的红细胞除去的处理过的脐带血单元。

“有核细胞”是指带有细胞核(即，包含染色体DNA的细胞器)的细胞。有核细胞包括例如，白细胞和干细胞。“无核细胞”包括例如成人红细胞。

实施例1

本实施例描述对冷冻的单包STEMCYTE脐带血单元(UCBU)进行控制解冻并包装的示例性的步骤。

1.制备Hsa/Gentran洗剂

将下列物品放入生物安全橱(BSC)中：4个酒精棉签，1组解冻袋装置(转移包装单元)，1袋Gentran40，1个注射过滤器，1(2)×50mL HAS，1个针头，1个血浆转移装置和1把剪刀。在生物安全橱内部，用血浆转移装置的一端刺穿解冻袋装置#1袋的外部注入端口。如果单元为小于或等于100mL冷藏容积，那么使用300mL的转移装置；如果单元大于100mL，那么使用600mL的转移装置。随后将盖子移除并用70％的异丙醇(IPA)棉签清洁50mL HSA小瓶的橡胶膜。用上述血浆转移装置的第二尖端刺穿该HSA膜。将附带有注射过滤器的皮下注射针插入血浆尖端旁的HSA膜中，从而使小瓶开口。将HSA小瓶提高至#1袋上方，使小瓶(50mL)中的全部内容物流至转移袋中。对于体积大于100mL的UCBU而言，应当将两个小瓶(100mL)的内容物排放至600mL 转移袋中。在#1袋的注入端口附近将HSA小瓶和#1袋之间的管子热密封，随后丢弃HSA小瓶和多余的管子。用新的血浆转移装置刺穿#1袋的剩余注入端口，随后关闭转移装置管上的滚轮夹。用血浆转移装置的另一端刺穿Gentran40 袋的注入端口。

随后，将#1袋放置于电子称上并将皮重设置为零。对于冷藏体积不大于 100mL的UCBU而言，放开转移管的夹子，使190g Gentran40流至#1袋中。当 UCBU体积大于100mL时，将380g Gentran40转移至#1袋中。在靠近#1袋的位置热密封血浆转移管并且丢弃管。#1袋的最终体积应当为大约240mL(或 480mL)，其中，HAS的最终浓度为5％，Gentran的最终浓度为8％。然后在#1 袋的标签上记录制备洗剂的日期，时间和操作者首字母。在解冻UCBU之前，将解冻袋装置放置于2℃至8℃的冰箱中持续大约30分钟。洗剂溶液应当在制备好之后1天内使用。

根据下面II部分描述的步骤对一袋冷冻的UCBC进行解冻。

II.解冻/洗涤冷冻的UCBU

II.1在操作之前，将下列物品放置于BSC中：6(12)×50mL离心管，大的、小的冷冻冰袋，5(10)×2.5mL安瓿DNAse，1000mL DNAse 洗涤缓冲液，100mL 250mM MgCl₂，非颗粒性棉签，WFI水，4 (8)×25gauge针头，25mL吸管，采样点连接器，2×10mL注射器，2×1mL注射器，IPA棉签，电子称，止血器和管密封器。

II.2根据下面的公式计算所需的DNAse的体积和所需的250mM MgCl₂溶液的体积并且将由此制备的溶液置于带有0.2μm圆盘过滤器和注入用针头的合适尺寸的注射器中。

HSA/GENTRAN洗剂所需的DNAse的体积＝HSA/Gentran洗剂体积÷25；

需要注入UCBU袋中的DNAse的体积＝UCBU袋的体积÷25；

HSA/GENTRAN洗剂所需的250mM MgCl₂的体积＝ HSA/Gentran洗剂体积÷100；

需要注入UCBU袋中的250mM MgCl₂的体积＝UCBU袋的体积 ÷100。

II.3预先将冷冻离心机冷却至2℃至8℃。

离心设定：

离心速度设定为1,860g’s(在带有4个管架的SORVALL HS-4铝转子上，3,080rpm)。

将制动设置于中档(对于HERAEUS SUPERFUGE而言，将减速设定为7)。

II.4通过附带的文本记录冷藏体积。

II.5计算1.5体积的脐带血单元(UCBU)。

1.5 UCBU的体积＝UCBU体积(上述步骤4)×1.5

II.6确认HSA/Gentran洗剂和DNAse洗剂溶液已经冷冻至少30分钟但不超过1天。

II.7获得大约8”×10”的塑料袋。将其直立放置于带有冰或冷冻冰袋的桶内部。加水至大约6至8英寸。

II.8将冰容器放在解冻操作的位置中。

II.9从冰箱中取出解冻袋装置放入BSC中。将采样点连接器插入两个端口中的一个并注入HSA/Gentran洗剂所需的DNAse试剂和 MgCl₂。混合并放置在冰袋之间。

II.10从存储装置中获取冷冻的UCBU。确认盒上的UCBU ID标签与规定的文本匹配并记录UCBU ID。

II.11小心地打开冷冻盒并确认UCBU袋上的UCBU ID号与盒上的ID 和规定的文本匹配。

II.12将盒中的UCBU袋放置于8”×10”的无菌袋中。将含有UCBU的袋子放入冰浴中。不要浸没端口。使用计时器计时5分钟。

II.13 5分钟后，检查UCBU是否解冻。如果没有解冻，继续定期检查直至“融化”。从冰浴中取出解冻的UCBU冷冻袋，用不起毛的棉签擦干。

注意：立即开始进行如下清洗步骤。

II.14将UCBU放在BSC内部的冰袋之间，暴露端口。轻摇UCBU10秒进行混合。

II.15除去UCBU袋的两个端口中的一个的塞子。用采样点连接器刺穿端口。

II.17刺穿UCBU端口之后立即将用于注入的DNAse试剂和MgCl₂注入UCBU袋中(参见上述步骤2)。轻轻混合。

II.18用解冻袋装置所带有的尖端刺穿剩下的端口。

注意：检查确保解冻装置的管上的所有滚轮夹在刺穿UCBU之前都为关闭的。

II.19将冰袋放在秤上。将UCBU袋放置在冰袋上。将另一冰袋放置在 UCBU袋上方并称量皮重。

注意：UCBU和所有材料必须保持在2℃至8℃。

II.20将止血器夹在#1袋的管上。打开通向UCBU袋的管上的滚轮夹。打开#1袋上的止血器以转移UCBU体积的1.5倍的洗剂溶液(参见上述步骤5)。记录加入的体积。

II.21完成洗剂转移之后，夹住管子。

注意：该初始稀释步骤应当在解冻之后尽快完成。

II.22通过人工转动袋子大约10秒将UCBU袋中的洗剂溶液和脐带血充分混合，将UCBU保持在冰袋之间。

II.23除去#2袋附近的管上的铝夹或打开#2袋附近的管上的滚轮夹 (如果提供的话)并且使洗剂/血液混合物流进#2袋中。尽可能多的从UCBU袋中取出混合物。在该步骤过程中将#2袋保持在冰袋之间。

II.24一旦转移完成，将#2袋附近的管关闭。

II.25将UCBU袋放回冰袋之间，置于称的平台上并将皮重设置为零。 II.26打开#1袋附近的止血器并使与UCBU的冷藏体积相等的额外的洗剂溶液流进UCBU袋中。当完成时再次夹住#1袋附近的管。记录加入的体积。

II.27关闭已洗涤过的UCBU袋附近的滚轮夹。

II.28将UCBU袋中的洗剂/血液混合物充分混合。从UCBU袋的端口/ 尾部区域中尽量多的取出脐带血。

II.29打开#2袋附近的管并使洗剂/血液混合物流进#2袋中。卷起 UCBU袋以确保从UCBU袋中取出尽可能多的血液。

注意：这时，解冻的UCBU已被相当于2.5倍(1.5X初始+1.0X添加)冷藏的UCBU的体积的洗剂溶液稀释。

II.30夹住#2袋附近的管并关闭UCBU袋附近的滚轮夹。

II.31立即热密封位于通向两个尖端的“Y”连接的下方的但位于#2 袋附近的夹子的上方的管。一旦密封，可除去多余的管。

II.32在无菌条件下，用新的血浆转移装置刺穿#2袋的端口并将#2袋的内容物转移至保持在冰上的50mL管中。

II.33平衡包括50mL管的离心桶。

II.34在0℃至8℃的条件下，以大约1,860g’s(在带有4个管架的 SORVALL HS-4铝转子上，3,080rpm)的速度对50mL的管进行离心持续15分钟。离心制动应当设置在中档。

II.35完成离心之后，小心地取出离心后的50mL管。不要搅动小粒。

II.36在安全橱中，打开离心后的管并吸出大部分洗剂，剩下大约5mL 位于管底部，而不搅动小粒。

II.37添加5mL洗剂缓冲液并使用10mL吸管轻轻混合。

II.38用洗涤缓冲液填充50mL管至50mL的标记。

II.39在0℃至8℃的条件下，以大约1,860g’s(在带有4个管架的 SORVALL HS-4铝转子上，3,080rpm)的速度对50mL的管进行离心持续10分钟。离心制动应当设置在中档。

II.40完成离心之后，小心地取出50mL管。

II.41在安全橱中，打开离心后的管并吸出大部分洗剂，剩下大约5mL 位于管底部，而不搅动小粒。

II.42通过在BSC表面上轻叩管将细胞小粒重悬于各管。

随后对解冻的UCBC进行如下III部分所述的血液裂解操作或如下IV 部分所述的单核细胞(MNC)分离。

III.红细胞裂解操作

III.1将下列物品放置于BSC中：

6(12)×50mL离心管

160mL USP水(室温)

160mL 2×盐水

III.2将22.5mL的室温USP水加至每个50mL管中。在添加水结束之后打开30秒计时器。通过抽吸进行混合。

III.3 30秒后立即向50mL管中加入22.5mL 1.8％(2X)的NaCl溶液并通过倒置轻轻混合。在各个管中分别独立地完成步骤III.2和 III.3。

III.4将每个管中的内容物分至两个管中并再向每个管中填充洗涤缓冲液至50mL。

III.5在0℃至8℃的条件下，以大约830g’s(在带有4个管架的 SORVALL HS-4铝转子上，2,050rpm)的速度对50mL的管进行离心持续10分钟。离心制动应当设置在中档。

III.6完成离心之后，从桶中小心地取出离心后的50mL管。

III.7在安全橱中，打开离心后的管并吸出大部分洗剂，留下大约1mL 位于管底部，而不搅动小粒。

III.8加入5mL洗剂缓冲液并使用10mL吸管轻轻重悬细胞小粒。

III.9再用10ml DNAse洗剂缓冲液洗涤管并将细胞汇聚在一个管中。

III.10使用DNAse洗剂缓冲液将汇聚的细胞的体积增加至30mL。

注意：将温度设定为25℃，速度设定为7,000rpm开始离心加热。按下开始(通常约30秒)。

IV.从人脐带血中分离MNC

IV.1将下列物品放置于BSC中：6×50mL离心管；90mL LSM；10× 25mL吸管；2×10mL吸管；1个圆锥管(225mL)。

IV.2在225mL的无菌圆锥管中用1:5的DNAse洗剂缓冲液稀释脐带血细胞。通过旋转轻轻混合稀释的血液。

IV.3将六(6)个50mL离心管放置于BSC中。

IV.4使用无菌25mL吸管，将30mL稀释的血液分配至各50mL管中。

IV.5将13mL LSM填充至无菌10mL吸管中。缓慢地将吸管沿管侧壁向下滑至管底部。当在血液水平下方轻轻排出LSM时，将管保持在某一角度。沿着管壁轻轻取出吸管，避免各层混合。

注意：不要从吸管中完全排出LSM—气泡会搅动LSM层。

IV.6关闭管并小心地转移至离心机。

IV.7在24℃条件下，将管放置在速度为约467g’s的吊桶式转子中(带有4个管架的Sorvall HS-4铝转子的转速为1,540rpm或S4 180转子的转速为1600rpm)持续32分钟，关闭制动(对于Heraeus Superfuge而言将减速设定为2)。确认离心达到指定速度。

IV.8将六(6)个无菌50mL管放置于BSC中的搁架中。

11.9离心之后，从离心机中小心地取出各管，避免各层混合，并在搁架上放置新管。

11.10设置离心机进行冷却离心：将温度设定为10℃，并计时10分钟。按开始键启动离心。

11.11在BSC中打开离心后的管。吸出上清液，露出单核层。使用无菌10mL吸管，仅收集单核层(血沉棕黄层)。将其转移至新管并用DNAse洗剂缓冲液将各管填充至45mL。

IV.12在10℃条件下，将管放置在吊桶式转子中，并将离心速度设置为约467g’s(在带有4个管架的Sorvall HS-4铝转子上， 1,540rpm)，离心10分钟，制动设定在中档(对于Heraeus Superfuge而言，将减速设定为7)。

IV.13离心之后，在安全橱中打开各管，并吸出大部分上清液，留下大约1mL，而不搅动小粒。

IV.14在一个新50mL离心管上标记“汇聚的MNC”，“V90195”， “步骤IV.14”，该制备说明的批号、今天的日期和操作者的首字母。

IV.15使用无菌10mL吸管，用5mL DNAse洗剂缓冲液轻柔地重悬细胞小粒。将细胞汇聚至单个离心管中。

IV.16汇聚细胞之后，用4mL DNAse洗剂缓冲液洗涤所有六个管以确保收集到所有单核细胞(MNC)。

IV.17将洗剂转移至标签为“汇聚的MNC”的管中并加入DNAse洗剂缓冲液至50mL。

IV.18在10℃条件下，将管放置在带有平衡管的吊桶式转子中，设定离心速度为约467g’s(在带有4个管架的Sorvall HS-4铝转子上， 1,540rpm)，离心10分钟，打开制动。

IV.19离心之后，在安全橱中打开各管并吸出大部分洗剂，在管中留下大约1mL，而不搅动小粒。

IV.20使用无菌10mL吸管用5mL洗涤缓冲液重悬小粒。

IV.21将汇聚的MNC管的体积增加至20mL，充分混合。

11.22将足够体积的充分混合的MNC样品转移至管中，用于计算活力和MNC细胞计数。记录样品的量。

IV.23确定细胞密度和活力百分数。

IV.24根据下面的公式计算总细胞数：

IV.23中的活细胞密度×(20-IV.22中的样品量)

IV.25如果活细胞的总数小于两千万，那么联系临床协调员。保留被排除的批次等待调查结果。

根据上述步骤制备的细胞随后根据下面V部分所述的步骤被转移至各种不同的运输袋。使用下面三种带有鲁尔锁接头的样品袋：HYCLONE PE样品袋(THERMOSCIENTIFIC)、袋(DU PONT)和转移袋(TERUMO,PVC)。

HYCLONE PE样品袋(例如，HYCLONE 60mL至20L带有两个端口的2-D Labtainer，例如，SH3b6500和SH3b6500)由CX3-9薄膜(三层，9mil浇铸膜) 构成，其中，外膜层为与超低密度聚乙烯接触层共挤压的聚酯弹性体。转移袋(例如，1BB*T015CB70，1BB*T030CB71， 1BB*T060CB71，1BB*T080BB71，1BB*T100BB71以及1BB*T200BB71)为基于PVC的。袋为基于PFA的(例如，PFA袋—2.0mil或5.0mil 袋)。

V.将细胞转移至运输袋

V.1将下列物品放入BSC中：2×50mL离心管，100mL运输培养基 (V90199：添加有10％HS，2mM GlutaMAX，半乳糖和100U/mL 庆大霉素的CIM)和2×5mL吸管，无菌运输袋；

V.2计算所需的运输培养基体积：所需的运输培养基体积(mL) ＝IV.24步骤中的总细胞数×10^-6。

V.3将带有标签的MNC管放入带有平衡管的吊桶式转子中，设定离心速度为约467g’s(在带有4个管架的Sorvall HS-4铝转子上， 1,040rpm)，在10℃下离心10分钟并且将制动设定在中档(对于Heraeus Superfuge而言，减速设定为7)。

V.4离心后，在安全橱中打开管并将上清液吸出至废弃容器中。

V.5使用无菌10mL吸管，用5mL运输培养基重悬小粒。

V.6添加培养基以调节细胞浓度为1×10⁶/mL。

V.7计算所需的庆大霉素的体积。

所需的庆大霉素的体积(mL)＝步骤V.2中的细胞总体积÷500。

V.8取出3mL细胞，将其保留并转移至15ml圆锥管中。

V.9将庆大霉素(体积为V.7中所计算的)加至细胞悬浮液中并轻轻混合。

V.10将细胞悬浮液转移至运输袋。

V.11在袋上标记“由冷冻的UCBU制备的MNC”，ID#，“V90195”， “步骤V.11”，该制备说明的批号，总细胞计数，今天的日期和操作者的首字母。

V.12根据SOP400.014包装细胞用于运输。与细胞单元包括在一起的为产品说明证书：单元数、批号、细胞计数、活力和无菌信息。将COA的副本附在本文件中。

V.13保留的0.5mL细胞用于接种一管TSB肉汤并且0.5mL细胞用于接种一管巯基乙酸酯肉汤。

V.14将1.0mL样品作为保留样品储存在2℃至8℃持续一周的时间。管上标记为“由冷冻的UCBU制备的MNC的2℃至8℃保留样品”，ID号，“步骤V.14”，批号，总细胞计数，日期和操作者的首字母。

V.15将1.0mL的样品作为保留样品储存在-80℃。管上标记为“由冷冻的UCBU制备的MNC的-80℃保留样品”，ID号，“步骤V.15”，批号，总细胞计数，日期和操作者的首字母。

以上述方式将细胞包装在多种不同的培养基中，随后在多种不同的温度条件下在1至8天的时间段内运输至不同的地点。

实施例2

在该实施例中，进行实验来检查以上述实施例1描述的方式包装和运输的脐带血细胞。

在空运的袋状包装到达之后，在安全地方将包装储存在其容器内，直至对其进行处理，并且对包装保持温度监控。在处理之前，检查并记录包装上的任何变化。还要注意从开始解冻用于处理的原始血液单元所消耗的总时间。打开包装

打开运输容器，取出带有hUCB-MNC袋的包装并保持在指定温度(RT) 下。在生物安全橱(BSC)中，检查袋子有无损坏或泄露。在生物安全橱中，轻轻摇动袋子混合细胞。使用一双无菌手套和鲁尔锁扣注射器，将每个袋子中的内容物转移至标记为hUCB-MNC的无菌30ml、50ml或100ml离心管中。随后，在指定温度(RT)下，以400x g的速度对管进行离心处理持续10分钟。使用10ml吸管，吸出离心管中的上清液，不搅动小粒并且保留上清液用于无菌测试(样品1)。用1ml 1％的普通血清白蛋白(NSA)的临床级生理盐水溶液重悬细胞小粒以形成用于注射的初始细胞悬浮液。

UCB-MNC的活力实验和细胞计数

1.活力实验

在安全橱中，通过使用100μl枪头(tip)制备1:10细胞稀释液以将50μl细胞悬浮液分配并混合至含有450μl普通盐水(其中补充有1％NSA)的12×75mm 管中。使用100μl枪头，将40μl稀释的细胞悬浮液吸至0.5ml的EPPENDORF管中的10μl台盼蓝溶液中。通过抽吸若干次进行混合之后，台盼蓝染色的细胞悬浮液被加至改良的纽鲍尔(Neubauer)血细胞计数器中，从而对含有16个小正方形的四个大正方形(每个为1mm×1mm)中的染成蓝色的死细胞和未染色的活细胞的数目进行计数。无核的RBC可容易地与未染色的活的有核细胞区分开，因为在显微镜下通过上下对焦物镜所述无核的RBC看起来像反射镜面。随后，通过未染色的细胞数目除以染成蓝色的细胞和未染色的细胞的总数计算活细胞的百分数。

2.人工计数

在安全橱中，通过将50μl上述初始细胞悬浮液转移至12×75mm管中的 450μl含有亚甲基蓝的3％乙酸溶液来制备1:100细胞稀释液。将得到的细胞悬浮液加载至改良的纽鲍尔血细胞计数器的上部腔室和下部腔室中，从而对上部腔室和下部腔室中的八个大正方形(每个为1mm×1mm)中的染成蓝色的细胞的数目进行计数。通过总计数除以8再乘以100(稀释因子)和10,000来计算细胞数目。

通过3％乙酸对RBC进行瞬间裂解，而有核细胞保持完整持续至少40分钟。有核细胞在补充有亚甲基蓝的3％乙酸中被染成蓝色。任选地，将细胞浓度调节成使细胞密度为每个正方形(1mm×1mm)大约50个细胞。就N₂应当在 N₁±√N₁的范围内这一点而言，从上部(N₁)腔室得到的计数与从下部(N₂) 腔室中得到的计数是相当的。否则，重复进行填充步骤和计数以避免技术的不完善和不适当导致的非随机性和不准确性。

3.自动计数

还使用血液分析仪Beckman Coulter ACT Diff对细胞悬浮液进行计数以检查人工计数的准确性。

细胞制备

在记录细胞活力和细胞计数之后，将含有细胞的管在400x g的条件下离心5分钟。吸出每个管中的上清液，不搅动细胞小粒，并且重悬细胞，用补充有1％NSA的临床级生理盐水将细胞浓度调节为1×10⁵个活细胞/μl。随后，将 100μl得到的细胞悬浮液转移至两个无菌0.25ml EPPENDORF管中(一个备用)。然后将细胞悬浮液用于下面的注射剂量：

a.4μl×4次注射(16×10⁵个活细胞)

b.8μl×4次注射(32×10⁵个活细胞)

c.16μl×4次注射(64×10⁵个活细胞)

简言之，将含有细胞的EPPENDORF管运输至手术室。在手术室，将细胞悬浮液与补充有1％NSA的临床级生理盐水一起装入Hamilton注射器和蝶形针头中。更加具体而言，将合适体积的细胞悬浮液通过蝶形针头装入50μl或100μl Hamilton注射器中，随后给药于三组受治者(A组、B组和C组)。对于A组和 B组而言，用50μl Hamilton注射器抽吸20μl(5μl×4)给予A组或者抽吸40μl (10μl×4)给予B组。对于C组而言，用100μl Hamilton注射器抽吸80μl。四次注射发生于每个受治者的脊髓的背根进入区。

将上述备用管在400x g的条件下离心5分钟。抽吸得到的上清液并保存用于无菌测试(样品2)。随后，通过直接免疫荧光实验(参见下文)和集落形成单位(CFU)实验对细胞进行谱系分析。

无菌测试

按照医院标准规程或合适的指南规程，立即对上述样品1和样品2(步骤 38)进行无菌测试。

集落形成单位(CFU)实验

首先对活细胞数进行计数，随后培养活细胞以确定在两周的时间内形成的CFU的数目。简言之，将细胞吸至在IMDM(Iscove改良Dulbecco培养基) 中预先混合的甲基纤维素培养基(Methocult H4230，STEMCELL TECHNOLOGIES公司)中，该甲基纤维素培养基补充有生长因子、rhG-CSF 和rhIL-3。最终调节的浓度为1％甲基纤维素、30％胎牛血清、1％牛血清白蛋白、10^-4M 2-巯基乙醇、2mM 1-谷酰胺、10ng/ml rhIL-3和500ng/ml rhG-CSF。轻轻涡旋振荡细胞并将1.1ml的细胞悬浮液(5x10⁴个细胞)种植于35mm× 10mm无菌培养皿(FISHER SCIENTIFIC)上，一式两份。在37℃条件下，在水饱和的5％CO₂孵育器中，培养细胞之后，通过标准倒置显微镜对由20个细胞或更多的细胞构成的CFU-GM集落进行人工计数。注意被细菌或真菌污染的培养物(如果有的话)。

hUCB-MNC的直接免疫荧光分析

当有足够的剩余细胞时，进行下面描述的任选的分析。基于分析机构的惯常做法，分析技术可为双平台或单平台，使用或不使用洗剂。ISHAGE设门策略(gatingstrategy)用于对CD34⁺细胞和CD133⁺细胞进行计数。

该分析所需的试剂包括人细胞表面抗原的单克隆抗体(IgG-PE， CD45-FITC，CD34-PE和CD133-PE)、7-氨基-放线菌素(7-AAD；eBioScience 或等同物)，ImmunoPrep全血裂解试剂(BECKMAN COULTER)、洗涤缓冲液(补充有0.1％叠氮化钠的PBS)、染色缓冲液(补充有0.1％叠氮化钠和 1％NSA的PBS)、1％多聚甲醛溶液和12×75mm聚苯乙烯试管。下面是染色步骤。

1.如果需要的话，使用1％NSA将活力实验的步骤7中制备的细胞悬浮液中的有核细胞数调节为小于1×10⁷/ml。

2.给12×75mm的试管贴上标签，如下分配抗体和细胞：

3.轻轻涡旋振荡并且在4℃下在黑暗中静置20分钟或在室温下在黑暗中静置30分钟。

4.使用Q-Prep分配器和ImmunoPrep全血裂解试剂进行裂解、中和以及固定染色。在黑暗中静置至少1小时，随后捕获信号，或者，

4a.将500μl RBC裂解缓冲液添加至细胞悬浮液中，轻轻混合并在室温下在黑暗中孵育10分钟。用2ml冷洗剂缓冲液洗涤两次。在2℃至8℃下，在300x g条件下离心5分钟。除去上清液，将细胞重悬于0.5ml 1％的多聚甲醛溶液中。

5.如图X1所描述的，使用ISHAGE规程获取不少于75,000个CD45⁺结果和最少100个CD34⁺结果。

图6显示了使用根据ISHAGE指南的规程对CD34进行计数的实例。使用不洗涤规程，通过CD45-FITC和CD34-PE对细胞进行标记。分析之前，添加 7-AAD。将区域A设置在SS-CD45的细胞图上以描绘白细胞。将区域B设置为包括CD34+ve细胞。将包括弱阳性CD45细胞的区域C设置在(A和B)上设门 (gate)的SS-CD45的散点图上。区域D围绕SS-CD45图上的淋巴细胞绘制并且用于对SS-FS图设门。区域E绘制为包括所有淋巴细胞并且该区域可复制于在(A和B和C)上设门的另一散点图上(E2)。区域F绘制在SS-7-AAD的散点图上以排除7-AAD阳性细胞(死细胞)和所有先前在该区域设门的点。区域E2中的细胞随后被记录为CD34+细胞。

1.袋子的类型和温度

如图2所示，当用上述三种类型的袋子在3天的时间段内运输干细胞时，袋子的类型和运输温度均不同程度地影响回收率(图2A)、细胞活力(图2B)、 CD34⁺细胞群水平(图2C)、CD133⁺细胞群水平(图2D)和CFU(图2E)。

例如，当用三种类型的袋子的运输的干细胞之间的回收率和细胞活力(图 2A和图2B)相当时，HYCLONE PE样品袋和TERUMO(PVC)袋中运输的 CD34⁺细胞群水平和CD133⁺细胞群水平较高(图2C和图2D)。形成鲜明对照的是，用袋运输的细胞相对于用HYCLONE PE样品袋运输的细胞具有显著较高的CFU，用HYCLONE PE样品袋运输的细胞相对于用TERUMO (PVC)袋运输的细胞具有显著较高的CFU(图2E)。

关于运输温度，在室温下运输的细胞表现出较低的回收率或细胞活力(图 2A和图2B)的趋势。然而，意想不到的是，在室温下运输的细胞具有较高的 CD34⁺细胞群水平和CD133⁺细胞群水平，不论用何种类型的袋子运输(图2C 和图2D)。而且，还意想不到的是，在室温下，在袋中运输的细胞具有最高的CFU水平，类似地，在室温下，在HYCLONE PE样品袋中运输的细胞也具有高CFU水平。

上述结果说明室温下运输干细胞具有意想不到的较高的CFU水平或较高的CD34⁺细胞群水平和CD133⁺细胞群水平。

2.培养基

还检测了运输培养基的效果。本发明发现约两天后，在CIM培养基中运输的细胞相对于在IMDM中运输的细胞具有更高的细胞活力(图3和图4)。具体而言，5天后，CIM培养基中的细胞仍然具有约74％的活力。

随后将CIM培养基与(HTS)培养基(BIOLIFE SOLUTIONS)进行比较。总体而言，发现在室温或4℃下，在TEFLON袋中的 CIM培养基中运输的细胞具有与HTS培养基中的那些细胞相当的细胞回收率、细胞活力和CD34⁺细胞水平或者具有比HTS培养基中的那些细胞更高的细胞回收率、细胞活力和CD34⁺细胞水平(图5A至图5C)。意想不到的是，室温下，在CIM培养基中运输的细胞具有最高的CD34⁺细胞水平值、CD133⁺细胞水平值和CFU值。本发明还发现，1％的NSA提高HTS和CIM这两者中的细胞活力，无论使用何种类型的袋子。参见下表1至表3。

表1

运输袋：Teflon

表2

表3

小时

0

1

2

3

4

5

活力(台盼蓝拒染法)

87.5％

80.0％

81.0％

82.0％

80.0％

活力(7AAD)

78.7％

79.0％

80.2％

80.5％

79.4％

83.1％

细胞悬浮于1％NSA中

总之，本发明发现，在用于测试步骤的袋子中，TEFLON袋具有最佳CFU 计数。然而，因为没有这些袋子的GMP来源并且TEFLON袋需要对内容物进行开口处理，所以应当格外注意避免污染。HYCLONE袋相对于TERUMO袋具有更高的活力，总有核细胞计数以及CFU计数。因此，HYCLONE袋被选择用于进一步运输和实验。

进行其他实验以检测温度对在CIM和TEFLON袋中运输的细胞的影响。数据如下显示。

1.在TEFLON袋中的人单核细胞在4℃/不依赖于CO2的培养基中孵育

实验	第0天，周一	第1天，周二	第2天，周三	第4天，周五	第7天，周一
						FACS
CD34	0.93％	0.96％	1.07％	0.76	1.04％
						CD133	0.64％	0.89％	0.58	0.6	0.59％
细胞活力
						台盼蓝阴性	94％	92％	90％	82％	86％
总MNC数	35×10⁶	33×10⁶	31×10⁶	25×10⁶	22×10⁶

2.在TEFLON袋中的人单核细胞在4℃/不依赖于CO2的培养基中孵育

实验	第0天，周一	第1天，周二	第2天，周三	第4天，周五	第7天，周一
						FACS
CD34+	0.88％	0.68％	0.80％	0.73％	0.95％
						CD133+	0.99％	1.02％	0.79％	0.60％	0.67％
细胞活力
						台盼蓝阴性	94％	90％	87％	77％	84％
总MNC数	40×10⁶	36×10⁶	33×10⁶	28×10⁶	26×10⁶

3.在TEFLON袋中的人单核细胞在室温/不依赖于CO2的培养基中孵育

实验	第0天，周一	第1天，周二	第2天，周三	第4天，周五	第8天，周二
						FACS
CD34	0.88％	1.05％	1.99％	2.18％	1.46％
						CD133	0.92％	1.18％	2.20％	2.19％	1.42％
细胞活力
						台盼蓝阴性	98％	89％	83％	74％	48％
总MNC数	31×10⁶	26×10⁶	23×10⁶	19×10⁶	8.4×10⁶

4.在TEFLON袋中的人单核细胞在37℃/不依赖于CO2的培养基单元P.22 中孵育

实验	第0天，周一	第1天，周二	第2天，周三	第4天，周五	第7天，周一
						FACS
CD34+	0.88％	0.56％	0.55％	0.65％	0.62％
						CD133	0.99％	0.64％	0.71％	0.56％	0.87％
细胞活力
						台盼蓝阴性	94％	86％	81％	66％	80％
总MNC数	40×10⁶	20×10⁶	17×10⁶	14×10⁶	6.4×10⁶

如上表所示，在8天的时间段中，在室温下，不依赖于CO₂的培养基中孵育的TEFLON袋中的人单核细胞具有最高的相对CD34⁺细胞水平或CD133⁺细胞水平。

前述实施例和优选的实施方式的描述应当是作为举例说明，而不是限定权利要求界定的本发明。本文所引用的所有公开出版物的全部内容通过引用并入本文。容易理解的是，在不背离权利要求所界定的本发明的条件下，可使用上面举例说明的各种特征的多种改变和组合。这些改变不被认为是背离本发明的范围并且所有这些改变落入后附的权利要求的范围内。

Claims

1.一种适于在至少24小时的时间段内在5℃至40℃的温度范围内长途运输的包装产品，所述包装产品包括：

组合物，所述组合物(i)含有多种基本上纯的多能细胞和包含血清的不依赖于CO₂的培养基，并且(ii)基本不含红细胞；和

容器，所述容器包括基体，所述基体包括聚合物并且装有所述组合物，

其中，所述容器是密封的，并且，其中，在至少24小时的时间段内在5℃至40℃的温度范围内运输所述包装产品之后，所述多能细胞能够形成超过2CFU/5x10⁴个细胞。

2.如权利要求1所述的包装产品，其中，所述聚合物为聚四氟乙烯(PTFE)、全氟代烷氧基(PFA)、氟化乙烯丙烯(FEP)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚乙烯或聚氯乙烯(PVC)。

3.如权利要求1所述的包装产品，其中，所述容器为袋子、管、注射器或注入器用小瓶。

4.如权利要求1所述的包装产品，其中，所述多能细胞为干细胞。

5.如权利要求4所述的包装产品，其中，所述干细胞为造血干细胞、间充质干细胞或胚胎干细胞。

6.如权利要求1所述的包装产品，其中，所述组合物包含外周血细胞、脐带血细胞、骨髓细胞或胎盘血细胞。

7.如权利要求1所述的包装产品，其中，所述组合物的温度为5℃至30℃。

8.如权利要求1所述的包装产品，其中，所述培养基包含人血清。

9.如权利要求1所述的包装产品，其中，所述培养基含有0.5％至20％的血清。

10.如权利要求1所述的包装产品，其中，所述组合物包含已冷冻并解冻的外周血细胞、脐带血细胞或骨髓细胞。

11.如权利要求1所述的包装产品，其中，所述组合物包含未冷冻的外周血细胞、脐带血细胞或骨髓细胞。

12.如权利要求1所述的包装产品，其中，所述多能细胞是CD34⁺或CD133⁺。

13.如权利要求1所述的包装产品，其中，在5℃至40℃下保存1至8天之后，所述多能细胞的回收率大于40％或所述多能细胞的活力高于50％。

14.一种制造权利要求1所述的包装产品的方法，所述方法包括：

提供含有多能细胞的组合物；

提供包含基体的容器，其中，所述基体包括聚合物；

将所述组合物放置于所述容器内；以及

密封所述容器。

15.一种运输多能细胞的方法，所述方法包括提供权利要求1所述的包装产品并且将所述包装产品递送至接收者，其中，所述递送步骤进行至少1天，同时所述包装产品的组合物的温度为5℃至30℃，其中，递送之后，所递送的多能细胞能够形成超过2CFU/5x10⁴个细胞。

16.如权利要求15所述的方法，其中，所述递送步骤在10℃至30℃的温度范围内进行。

17.如权利要求15所述的方法，其中，在递送之后，所述多能细胞的回收率大于40％。

18.如权利要求15所述的方法，其中，在递送之后，所述多能细胞具有超过0.5％的CD34⁺细胞。

19.如权利要求15所述的方法，其中，在递送之后，所述多能细胞具有超过0.25％的CD133⁺细胞。

20.如权利要求15所述的方法，其中，在递送之后，所述多能细胞能够形成超过2CFU/5x10⁴个细胞。

21.如权利要求15所述的方法，其中，所述递送步骤进行至少2天。