CN1934245A

CN1934245A - 多能干细胞的增殖方法

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Publication number: CN1934245A
Application number: CNA200580009492XA
Authority: CN
Inventors: 赤池敏宏; 福田惠一; 长冈正人; 小清水右一
Original assignee: Daiichi Asubio Pharma Co Ltd
Priority date: 2004-03-23
Filing date: 2005-03-23
Publication date: 2007-03-21
Anticipated expiration: 2025-03-23
Also published as: JP4688793B2; KR101178786B1; US7892835B2; KR20060129486A; AU2005224569A1; IL178232A0; EP1734112B1; AU2005224569B2; WO2005090557A1; EP1734112A1; CA2560581A1; CA2560581C; RU2375448C2; EP1734112A4; IL178232A; RU2006137300A; BRPI0509179A; CN1934245B; US20070155013A1; JPWO2005090557A1

Abstract

本发明涉及增殖多能干细胞如ES细胞的新方法。本发明提供了用于多能干细胞的增殖方法和基因导入方法，包括在维持多能干细胞未分化状态和多能性的条件下培养多能干细胞，该方法的特征在于：通过使用液体培养基以及通过在基质固相表面进行固定化或包被而具有指定浓度的、能黏着多能干细胞的分子的培养容器，而不使用任何饲养细胞，使多能干细胞在分散状态下增殖并同时保留了多能干细胞的未分化状态和多能性，以及向其中转移和表达基因。

Description

多能干细胞的增殖方法

技术领域

本发明涉及用于多能干细胞如ES细胞的增殖方法和基因转移方法，以及通过此方法所制备的多能干细胞。

背景技术

为了持续生存，生物具有快速替代和修复已丢失的或受损的细胞和组织的能力，并且这种能力称为“再生能力”。高等动物中的“再生能力”实例包括常见的皮肤和血管伤口愈合现象，即使是诸如肝脏和肾脏的实质器官在对组织损伤反应时也发生细胞生长和组织重构以便快速恢复组织稳态。近年来一直试图利用生物有机体的这种天生的“再生能力”以实现多种疾病和创伤的治愈和改善，并且这种新医学技术开始称作“再生医学”。

干细胞在“再生医学”实践中发挥关键作用。通常将“干细胞”定义为具有分化为特化细胞或多功能细胞能力以及具有自我复制能力(从而反复产生与自身完全相同的细胞)的未分化细胞。在每种组织和细胞类型中均发现独特的干细胞，例如从衍生于称作“造血干细胞”的干细胞的祖细胞产生了血细胞，如红细胞、淋巴细胞和巨核细胞，而从称作“卫星细胞”和“成肌细胞”的干细胞/前体细胞产生了骨骼肌细胞。迄今已鉴定的其它类型干细胞包括神经组织如脑和脊髓中存在的并产生神经元和神经胶质细胞的神经干细胞、产生表皮细胞和毛囊细胞的表皮干细胞、产生肝细胞和胆管细胞的卵形细胞(肝脏干细胞)以及产生心肌细胞的心脏干细胞。

已使用源自此类细胞的干细胞或前体细胞实施了某些再生医学疗法，并且众所周知，使用造血干细胞或造血前体细胞的输注移植方法可治疗因血细胞缺乏或功能缺陷所致的疾病，如白血病和再生障碍性贫血。然而，在实质器官如脑、心脏或肝脏中存在的干细胞在技术上难以从活组织得到和/或体外培养，而且这些干细胞通常还具有低增殖潜能。干细胞也可以从尸体来源的组织中获得，但是以如此方式得到的干细胞的医学用途带来了伦理问题。因此，用于神经病、心脏病等的再生疗法需要多种技术的开发，以便使用除了此类靶组织中的干细胞以外的细胞来产生所需要细胞类型。

首先，作为基于该方法的策略可以提到的是利用“多能干细胞”的方法。将“多能干细胞”定义为能够在体外(in vitro)延长增殖或者实际上无限增殖、同时保持其未分化状态的细胞，该细胞表现为正常核型(染色体)并具有在适宜条件下分化为三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的全部细胞类型的能力。目前最常见的多能干细胞是从早期胚胎分离的胚胎干细胞(ES细胞)，以及从胎儿原生殖细胞分离的的同功胚胎生殖细胞(EG细胞)，这两种细胞均是正在研究的主题。

作为未分化干细胞群的ES细胞可通过这样的过程分离，即将胚泡期胚胎中的内细胞团转移出来进行体外培养并将此细胞团反复分离和传代。ES细胞在从原代培养小鼠胚胎成纤维细胞(以下称为MEF细胞，其从小鼠胎儿组织衍生)或基质细胞如STO细胞制备的饲养细胞上具有合适细胞密度，并且反复传代同时频繁更换培养基可以建立保留未分化干细胞特性的细胞系。ES细胞的另一个特征是存在端粒酶，端粒酶具有维持染色体端粒长度的活性，并且该酶赋予ES细胞在体外实际上无限细胞分裂的能力。

因为以这种方式产生的ES细胞在维持正常核型的同时可几乎无限地反复生长和传代并且能够分化为多种不同的细胞类型，所以它们是“多能”的。例如，当将ES细胞以皮下、腹内或睾丸内方式移植至动物体内时，它们形成所谓“畸胎瘤”的肿瘤，但是该肿瘤包含不同细胞和组织的混合物，包括神经元、骨细胞、软骨细胞、肠细胞、肌肉细胞等。在小鼠中，向假孕小鼠进行子宫内移植通过向胚泡期胚胎或具有八细胞期胚胎的聚集物内输注移植ES细胞所产生的丛生胚导致产生“嵌合小鼠”，该小鼠是一种在整个身体或部分器官和组织内拥有衍生自ES细胞的已分化细胞的后代。该技术常用作产生带有某些已人工破坏或修饰基因的“基因敲除小鼠”的主要方法。

人们还已知，通过体外培养可将ES细胞诱导分化为各种细胞类型。尽管具体方法会取决于细胞类型而有所不同，但通常使用通过形成胚样体(以下称为“EB”)的诱导分化方法，该胚样体是通过悬浮培养使ES细胞聚集而产生的处于胚胎样状态的细胞团。此方法可产生具有胎儿期内胚层、外胚层和中胚层特性的细胞和已分化的细胞，如血细胞、血管内皮细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、神经胶质细胞、神经元、上皮细胞、黑色素细胞、角质形成细胞、脂肪细胞等。以这种方式通过体外培养产生的已分化细胞基本上具有与器官和组织中存在的细胞相同的结构和功能特性，并且使用实验动物进行的移植实验已证实，从ES细胞衍生的细胞在器官和组织内定植并且正常发挥功能。

对于ES细胞特性和培养方法及其体内(in vivo)和体外分化能力的综述，参考如下文献：Guide to Techniques in Mouse Development(Wasserman等，Academic Press，1993)；Embryonic Stem CellDifferentiation In Vitro(M.V.Wiles，Meth.Enzymol.225：900，1993)；Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual(Hogan等，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1994)(非专利文件1)；Embryonic StemCells(Turksen编辑，Humana Press，2002)(非专利文件2)。

可以通过使用白血病抑制因子(以下称为LIF)和碱性成纤维细胞生长因子(以下称为bFGF/FGF-2)或者化学试剂如毛喉素(Matsui等，Cell70：841，1992；Koshimizu等，Development 122：1235，1996)，以与ES细胞相同的方式来刺激在饲养细胞(如MEF细胞或STO细胞)上的胎儿生殖细胞(称作原生殖细胞)产生EG细胞。已经证实EG细胞具有与ES细胞极其类似的特性并具有多能性(Thomson和Odorico，Trends Biotechnol.18：53，2000)。因此术语“ES细胞”在本说明书通篇范围内可以包括“EG细胞”。

在Thomson等人于1995年首先从灵长类(恒河猴)中建立ES细胞后，使用多能干细胞的再生医学概念才开始成为可能(美国专利号5,843,780；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844，1995)。随后，研究人员使用类似方法成功地从人早期胚中分离并建立了ES细胞系(Science 282：114，1998)。澳大利亚和新加坡的研究小组其后提交了类似报告(Reubinoff等，Nat.Biotech.18：399，2000；国际专利公布号WO00/27995)，目前在美国国立卫生研究院(NIH)(http：//stemcell.nih.gov/registry/index)上登记了20种不同的人ES细胞系。同样，Gearhart及其同事已成功地从人原生殖细胞中建立了人EG细胞系(Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：13726，1998；美国专利号6,090,622)。

当这些多能干细胞用于产生研究材料或再生医学产品时，所必需的是所用传代方法能维持细胞的未分化状态和高增殖能力。为了维持细胞的未分化状态和高增殖能力，通常使用MEF细胞或类似细胞(如STO细胞)作为ES/EG细胞的饲养细胞。向培养基中添加胎牛血清(以下称为FBS)也是重要的，并且关键在于选择适于培养ES/EG细胞的FBS产品，通常添加大约10-20％的FBS。此外，已经鉴定出，LIF可作为维持源自小鼠胚胎的ES/EG细胞未分化状态的因子(Smith和Hooper，Dev.Biol.121：1，1987；Smith等，Nature 366：688，1988；Rathjen等，Genes Dev.4：2308，1990)，并且向培养物中添加LIF可更有效地保留未分化状态(参见如下文献：Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual(Hogan等，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1994)(非专利文件1)；Embryonic StemCell(Turksen编辑，Humana Press，2002)(非专利文件2))。

然而，当人ES(或EG)细胞用于再生医学或其它实践目的时，用于这些典型ES/EG细胞的培养方法不适宜的。其中一个原因在于人ES细胞对LIF不反应，同时饲养细胞的缺乏引起细胞死亡或未分化状态丧失并分化为不同细胞类型(Thomson等，Science 282：1145，1998)。饲养细胞的使用本身是另一个问题，因为这种共同培养系统提高了生产成本并且难以适应大规模培养，同时当实际使用ES细胞时，需要从饲养细胞上分离并纯化ES细胞。在将来，当人ES细胞和其它多能干细胞作为再生医学、特别是细胞移植疗法的细胞来源时，使用非人动物的细胞产品如MEF细胞和FBS将因为存在种种危险而不合乎需要，其中危险包括ES细胞受异种动物病毒潜在感染以及受可作为异种抗原识别的抗原性分子的污染(Martin等，Nature Med.11：228，2005)。

因此，为了改进ES/EG细胞培养方法并且调整这些方法以便适应将来的实施，正在积极努力地开发FBS替代物(国际专利公布号WO98/30679)并且使用人细胞替代MEF细胞作为饲养细胞(Rechards等，Nature Biotech.20：933，2002；Cheng等，Stem cells 21：131，2003；Hovatta等，HumanReprod.18：1404，2003；Amit等，Biol.Reprod.18：2150，2003)。另一个诱人的前景是开发不使用饲养细胞的培养方法。Carpenter及其同事已报道，在Mitrigel或层粘连蛋白包被的培养平板中接种ES细胞并向培养基中添加MEF细胞条件培养基，可以在维持人ES细胞未分化状态和多能性的同时延长培养该细胞(Xu等，Nature Biotech.19：971，2001(非专利文件3)；国际专利公布号WO01/51616(专利文件1))。该小组还通过开发含有所添加的bFGF/FGF-2或干细胞因子(以下称为SCF)的无血清培养基，成功建立了更有效的ES细胞培养系统(国际专利公布号WO03/020920(专利文件2))。以色列的研究小组也报道了使用相同的无血清培养基并且不需要饲养细胞的ES细胞培养系统(Amit等，Biol.Reprod.70：837，2004(非专利文件4))。近来，还报道了通过添加bFGF/FGF-2和骨形态发生蛋白拮抗剂Noggin维持人ES细胞未分化状态的方法(Xu等，Nature Methods 2：185，2005)。个别地，已证实在不添加生长因子等等以及不使用饲养细胞的情况下，向培养基中单纯添加糖原合酶激酶(GSK)-3抑制剂可有效维持小鼠和人ES细胞的未分化状态(Sato等，Nature Med.10：55，2004(非专利文件5))。

虽然当前提出不使用饲养细胞来培养多能干细胞的新方法，但是多能干细胞的实际操作和工业用途仍然需要更方便的多能干细胞生长效果以及培养方法。

一个众所周知的维持小鼠ES/EG细胞未分化状态并提高其增殖能力的因子是以上提及的LIF，尽管LIF相关性IL-6家族的分子属于该类(Yoshida等，Mech.Dve.45：163，1994；Koshimizu等，Development122：1235，1996)，却几乎没有其它实例的报道。近来，据报道含有所添加bFGF/FGF-2或SCF的无血清培养基显著促进人ES细胞的增殖能力(国际专利公布号WO03/020920(专利文件2))。

即便ES细胞与其他细胞类型相比具有活跃特性，即增殖特性，实际上很少对它们的增殖能力进行研究；然而，再生医学的需求将需要此类细胞提高的增殖作用。

目前在培养多能干细胞中所遇到的问题之一是细胞通常形成紧密集落，因此难以进行传代等的操作。通常发现未分化的ES/EG细胞处于这样的状况：细胞彼此紧密黏着形成集落，即细胞间界限模糊的细胞团。因此，为了提供用于传代或分化诱导实验的ES/EG细胞，需要通过胰蛋白酶等的蛋白酶溶液在尽可能短时间内处理使这种集落分散。然而当实施这种处理时，将ES/EG细胞集落分散成单个细胞则需要相对高浓度蛋白酶的处理和/或剧烈的机械搅拌，这些方法显著降低ES/EG细胞的活力和黏着能力。

此外，因为ES/EG细胞在簇集条件下连续培养期间发生自发分化，所以在传代期间必须将它们分散为单个细胞并且必须在集落生长达到超常大小之前进行传代。例如通常需要2-3天对小鼠ES细胞进行一次传代，并且若未通过合适的方法传代，可能在细胞簇集中会出现细胞脱离其未分化状态，从而使这些细胞不适合使用。这种情况不可能单纯地通过添加足量的可维持ES/EG细胞未分化状态的因子，如以上提及的LIF或GSK-3抑制剂予以克服，相反这种处理诱导过度的集落生长和具有已分化表型的细胞。因此预期，增殖ES/EG细胞而不形成集落(即细胞为单个分散的)的方法对于提供ES/EG细胞用于工业用途极为有用。然而，迄今未见这种尝试或迄今未见该尝试获得成功。

本发明人先前曾在包被E-钙黏着蛋白的培养平板上接种已知通过集落形成而正常增殖的胚胎癌性细胞系F9细胞(Nagaoka等，Biotechnol.Lett.24：1857，2002(非专利文件6))，并发现这阻止了细胞集落的形成(于2002年4月14-16日在台湾台北召开的国际生物材料和药物送递系统专题讨论会；于2002年4月18-19日在日本京都召开的日本再生医学学会第一次会议)。具体而言，F9细胞在具有固定于未处理的聚苯乙烯培养平板上E-钙黏着蛋白的培养平板上(以下称为“E-cad平板”)表现出分散的细胞形态，E-钙黏着蛋白是已知的F9细胞的细胞黏着分子。

F9细胞表现为略类似于ES细胞的表型，其表达作为ES/EG细胞特异性标志的碱性磷酸酶(以下称为ALP)或SSEA-1和Oct-3/4(Lehtonen等，Int.J.Dev.Biol.33：105，1989；Alonso等，Int.J.Dev.Biol.35：389，1991)。然而，F9细胞不需要用于维持细胞未分化状态的饲养细胞或LIF，因此在维持自身未分化状态的机制上不同。此外，ES细胞具有成为全部三个胚层的三胚层分化能力，而F9细胞的分化限于内胚层细胞，并且F9细胞不能形成嵌合体。也就是说，虽然F9细胞可以用作某些实验中的ES/EG细胞模式系统，但是它们在多个方面与ES细胞不同，包括培养方法和培养条件。

因此，基于科学证据，不可能预测E-cad平板是否可用于不需要饲养细胞的ES细胞培养方法、通过此方法培养的ES细胞是否可以传代而同时保留其未分化状态和多能性、以及ES细胞的增殖能力是否可以提高。实际上，在E-cad平板上培养的F9细胞的增殖能力与在常规培养平板上培养的F9细胞的增殖能力大致相同，并且未得到证明ES细胞的增殖能力可能因此得以提高的资料。

已知未分化的小鼠ES细胞表达E-钙黏着蛋白，并且还已知因为基因修饰而缺乏E-钙黏着蛋白基因表达的ES细胞分子间的黏着被显著抑制(Larue等，Development 122：3185，1996)。然而，仍没有在ES/EG细胞培养方法中使用E-钙黏着蛋白作为黏着基质的尝试。

当多能干细胞如ES细胞用作实验室材料或用于产生再生医学产品时，除以上所描述的有效培养方法以外，还需要设计向细胞内有效导入所选择外源基因并表达该基因的方法。具体地，一个在再生医学中应用ES细胞治疗多种疾病的策略是改变细胞的特性，如增殖和分化能力或药物敏感性，而这可以通过向细胞中导入和表达适当外源基因满意地实现。以小鼠ES细胞为例，众所周知基因可以被人工修饰以便产生转基因小鼠或基因敲除小鼠，对于此，有效的基因转移方法尤其有用。

向细胞中常规转移外源基因通常使用如磷酸钙、DEAE葡聚糖和阳离子脂质制品的试剂完成。然而，已知对ES细胞应用此类方法其效率低于用于其它细胞类型的效率(Lakshmipathy等，Stem Cell 22：531，2004(非专利文件8))。还报道了使用多种病毒载体转移外源基因的方法。例如，逆转录病毒载体(Cherry等，Mol.Cell Biol.20：7419，2000)、腺病毒载体(Smith-Arica等，Cloning Stem Cell 5：51，2003)、慢病毒载体(Amaguchi等，J.Virol.74：10778，2000；Asano等，Mol.Ther.6：162，2002；国际专利公布号WO02/101057)和仙台病毒载体(Sasaki等，Gene Ther.12：203，2005；日本未审查专利公开号2004-344001)已为公众所知。然而，病毒载体的构建和制备相对复杂并且耗费时间，同时生物安全(这由所用病毒决定)也是一个问题，因此这种方法既不方便，也无法做到通用。

因而，外源基因向ES细胞中的转移最普遍地通过电穿孔方法实施。这种技术涉及向细胞施加电脉冲，以便暂时在细胞膜中开孔以便外源基因导入细胞内，并且这是一个高度灵活的方法。最近，已经建立了一种叫作核转染(nucleofection)的改进技术，由此可将外源基因直接转移入细胞核内以获得明显较高的表达效率(Lorenz等，Biotechnol.Lett.26：1589，2004；Lakshmipathy等，Stem Cells 22：531，2004(非专利文件8))。然而这种方法需要特殊的电脉冲产生装置，并且不易制定优化条件。此外，需要首先用蛋白酶如胰酶处理细胞以便分散成单个细胞，故细胞毒性相对较高。

因此用于多能干细胞如ES细胞的最有用的基因转移方法是使用廉价且便于制备并且允许向培养箱中所培养的细胞中有效转移外源基因的基因转移试剂的方法。

非专利文件1：Manipulating the Mouse Embryo：A LaboratoryManual(Hogan等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1994)。

非专利文件2：Embryonic Stem Cell(Turksen编辑，Humana Press，2002)。

非专利文件3：Xu等，Nature Biotech.19：971，2001。

非专利文件4：Amit等，Biol.Reprod.70：837，2004。

非专利文件5：Sato等，Nature Med.10：55，2004。

非专利文件6：Nagaoka等，Biotechnol.Lett.24：1857，2002。

非专利文件7：Nagaoka等，Protein Eng.16：243，2003。

非专利文件8：Lakshmipathy等，Stem Cell 22：531，2004。

专利文件1：国际专利公布号WO01/51616。

专利文件2：国际专利公布号WO03/02920。

本发明公开

在这些前提下，本发明的一个目标是提供用于不使用饲养细胞培养多能干细胞如ES细胞的方法，其中细胞的增殖能力增强并且基因转移效率提高。

为解决以上所描述的问题，本发明人研究了通过培养处于无集落形成状态即处于分散状态下的ES细胞，提高ES细胞增殖能力和基因转移效率的可能性。

如上所述，本发明人已成功地培养了处于无集落形成状态即处于分散状态下的胚胎癌性细胞系F9细胞。当制备在固相表面固化或包被E-钙黏着蛋白的培养平板(E-cad平板)并在该平板上接种F9细胞时，F9细胞表现为分散的形态而无集落形成。在E-cad平板上培养的F9细胞的增殖能力与在普通平板上培养的F9细胞的增殖能力基本相同。

当试图在E-cad平板上接种ES细胞时，几乎所有细胞均黏着于平板并且它们表现出类似于F9细胞的分散细胞形态而无集落形成。最引人注目的是，在这些培养条件下在E-cad平板上所接种ES细胞的增殖能力显著高于在普通平板上所培养ES细胞的增殖能力。另外，外源基因的转移效率和表达水平也显著较高。

进一步证实，如果向液体培养基中加入可维持未分化作用的因子，在E-cad平板上经多次传代的ES细胞仍然未分化并且维持其多能性。此外，已证实可以通过已知的方法使通过上述方法制备的ES细胞诱导分化成功能分化的细胞，如神经元和心肌细胞，并且还证实可通过将这些ES细胞移植进入小鼠早期胚胎产生嵌合小鼠，并且因此完成本发明。

由此，根据本发明的第一个模式，提供了一种新的不需要饲养细胞的多能干细胞(如ES细胞)的增殖方法。本发明方法的特征在于，所用培养容器在基质固相表面以预定密度固定化或包被黏着多能干细胞的分子，因此细胞可以在分散状态下培养以提高增殖能力。以这种方式制备的多能干细胞保留了其未分化状态和多能性。

根据第二种模式，本方法的特征在于，所用的培养容器在基质固相表面以预定密度固定化或包被黏着多能干细胞的分子，因而培养分散状态下的细胞可以提高对细胞的基因转移效率。

作为另一个有效模式，本发明涉及通过本发明公开的方法所制备的具有未分化状态和多能性的多能干细胞。为了本公开的目的，多能干细胞的“未分化”状态可通过至少一种未分化标志的表达予以证实。

根据另一个有效模式，本发明涉及通过适宜的分化诱导处理从通过本发明所公开方法制备的多能干细胞产生的已分化细胞。对已分化的细胞没有具体限制，只要它们是通常可从多能干细胞诱导分化的细胞类型即可。具体而言，它们是外胚层细胞或外胚层衍生来源的细胞、中胚层细胞或中胚层来源的细胞、内胚层细胞或内胚层来源的细胞等。

根据另一个有效模式，本发明涉及使用通过本发明公开的方法制备的多能干细胞产生嵌合胚胎或嵌合动物的方法，并且涉及所产生的嵌合胚胎或者嵌合动物。

本发明主要涉及如下方面：

(1)用于多能干细胞的增殖方法，其特征在于，使用液体培养基和在基质固相表面固定化或包被可黏着所述多能干细胞的分子的培养容器，而不使用饲养细胞，使所述多能干细胞在分散状态下增殖而同时保留了其未分化状态和多能性。

(2)用于多能干细胞的基因转移方法，其特征在于，使用液体培养基和在基质固相表面固定化或包被可黏着多能干细胞的分子的培养容器，向多能干细胞中有效地转移基因并表达此基因。

(3)以上(1)或(2)的方法，其中可黏着多能干细胞的分子是由多能干细胞表达的分子，或者在结构上与该分子同源并对此多能干细胞具有嗜同性结合能力的分子。

(4)以上(3)的方法，其中可黏着多能干细胞的分子是属于钙黏着蛋白家族的分子。

(5)以上(4)的方法，其中属于钙黏着蛋白家族的分子是E-钙黏着蛋白，或者在结构上与E-钙黏着蛋白同源、包含E-钙黏着蛋白EC1结构域和来自EC2结构域、EC3结构域、EC4结构域和EC5结构域中的一个或多个结构域、并且对多能干细胞具有嗜同性结合能力的分子。

(6)以上(5)的方法，其中E-钙黏着蛋白源自哺乳动物。

(7)以上(6)的方法，其中E-钙黏着蛋白源自人或小鼠。

(8)以上(1)至(7)中任一项所述的方法，其中可黏着多能干细胞的分子与免疫球蛋白Fc区域融合并且通过此Fc区域固定化于基质固相表面。

(9)以上(1)至(8)中任一项所述的方法，其中多能干细胞是哺乳动物胚胎干细胞(ES细胞)或胚胎生殖细胞(EG细胞)。

(10)通过以上(1)至(9)中任一项所述的方法所产生的多能干细胞。

附图简述

图1是显示ES细胞(R1和EB3细胞系)与聚苯乙烯平板上所包被E-cad-Fc黏着的两张图。黏着率表示为相对值，其中100％是与明胶(0.1％)包被平板黏着的ES细胞数目。BSA：与0.1％牛血清白蛋白包被平板黏着的ES细胞组。*：相对于明胶组，p＜0.01。

图2是一组显示在E-cad-Fc平板上所接种ES细胞形态学的照片。细胞图像摄于ES细胞在明胶、I型胶原、纤粘连蛋白或E-cad-Fc包被平板(分别用Gel.、Col.、Fn.和E-cad-Fc表示)上接种两天后。

图3A是显示在E-cad-Fc平板上所接种ES细胞的增殖能力的图。ES细胞在明胶平板(表示为Cont)或E-cad-Fc平板上接种，并且在第三天比较细胞数目。*：相对于Cont组，p＜0.01。

图3B是显示在E-cad-Fc平板上所接种ES细胞摄入BrdU的图。ES细胞(EB3)在明胶平板(表示为Cont)或E-cad-Fc平板上接种并用BrdU标记。三天后，通过使用荧光染料的抗体染色检测细胞中所摄入的BrdU。*：相对于Cont组，p＜0.01。

图4A是显示在E-cad-Fc平板上所接种ES细胞的未分化状态标志表达的一组照片。ES细胞(EB3细胞系)在明胶平板(表示为Cont)或E-cad-Fc平板上接种，并且在培养第14天检测ALP活性。本图中的LIF(+)和(-)分别表示向培养基中添加LIF/不添加LIF。

图4B是显示在E-cad-Fc平板上所接种的未分化ES细胞的标志表达的一组照片。ES细胞(EB3细胞系)在明胶平板(表示为Cont)或E-cad-Fc平板上接种，并且在培养第14天检测Oct-3/4蛋白质。DAPI：用DAPI染色的细胞核。Merged：DAPI和Oct-3/4抗体染色的重叠。

图5是显示在E-cad-Fc平板上所接种的未分化ES细胞的标志表达的一组照片。ES细胞在明胶平板(表示为Cont)或E-cad-Fc平板上接种，并且在第14天通过RT-PCR分析Oct-3/4基因和Rex-1基因的表达。符号+和-在本图中分别代表向培养基中添加LIF和不添加LIF。

图6是显示在E-cad-Fc平板上所接种ES细胞对LIF反应性的图。ES细胞(R1细胞系)在明胶平板(表示为Cont)或E-cad-Fc平板上接种并且以不同浓度LIF培养以形成集落，检测ALP活性以测量“未分化”集落的比例。*：相对于Cont/LIF 1000U/ml，p＜0.05。

图7显示在E-cad-Fc平板上所传代ES细胞的多能性的一组照片。将在明胶平板(表示为Cont)或E-cad-Fc平板上接种并传代的ES细胞(R1细胞系)回收，并且在无LIF培养基中形成EB以诱导分化。使用在EB形成第16天后所回收的样品(图中的“EB”)，通过RT-PCR分析不同分化标志基因的表达。作为对照组，使用前面所提及的传代前ES细胞并且使用由这些细胞所形成的第16天的EB细胞(分别是本图中左起的第一和第二)。T/Bra：T/Brachyury，βH1：血红蛋白，AFP：甲胎蛋白，TTR：运甲状腺素蛋白，GAPDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶。

图8显示在E-cad-Fc平板上所传代ES细胞的多能性的两张照片。将在E-cad-Fc平板上接种的ES细胞(R1细胞系)诱导分化成神经元(上图)和心肌细胞(下图)。这些照片显示在诱导分化后第12天固定并用抗神经元特异标志和抗心肌细胞特异标志的抗体染色的细胞图像。

图9显示在E-cad-Fc平板上培养的ES细胞的生殖系转变的两张照片。野生型C57BL/6小鼠与通过在E-cad-Fc平板上培养的ES细胞所产生的嵌合小鼠交配，并且使用两种不同的微卫星标志对它们的后代进行RT-PCR分析。M：DNA大小标准物，ES：ES细胞(EB3细胞系)，B6：C57BL/6小鼠，#1-#4：根据被毛颜色认为ES细胞未作出贡献的个体。#5-#8：根据被毛颜色认为ES细胞作出贡献的个体。垂直轴线上的数字代表DNA大小(bp)。

图10显示在E-cad-Fc平板上所接种ES细胞的基因转移和表达效率的图。ES细胞(EB3)在明胶平板(表示为Cont)或E-cad-Fc平板上接种，并且使用GFP表达载体对其进行基因转移。通过使用荧光染料的抗体染色检测一天后细胞内的GFP，并且测量荧光密度。*：相对于Cont组，p＜0.01。

图11是显示在人E-cad-Fc平板上所接种ES细胞的形态学的一组照片。细胞图像摄于ES细胞在明胶(Cont)或E-cad-Fc包被平板上接种两天后。

本发明的最佳实施方式

定义

如本说明书通篇所用，术语“多能干细胞”指能够在体外延长地增殖或实际上无限制地增殖，同时保持其未分化状态，表现正常核型(染色体)并且具有在适宜条件下分化为全部三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)能力的细胞。术语“多能干细胞”包括但不限于从早期胚胎分离的ES细胞和从胎儿期原生殖细胞分离的同功EG细胞。在本说明书通篇范围内，“ES”细胞将用于包括“EG”细胞。

如本说明书通篇所用，术语“未分化状态”指表现未分化状态的多能干细胞的特性，其中该未分化状态可基于一种或多种未分化ES细胞标志如ALP活性或Oct-3/4基因(产物)的表达或基于多种抗原分子的表达予以证实。多能干细胞的未分化状态意味着多能干细胞能够在体外延长地增殖或实际上无限制地增殖，并表现正常核型(染色体)，同时具有在适宜条件下分化为全部三个胚层的能力。

如本说明书通篇所用，术语“多能性”指分化成多种细胞类型的能力。对分化的细胞没有具体限制，只要它们是可通常从多能干细胞诱导分化的细胞类型即可。具体而言，它们是外胚层细胞或外胚层来源的细胞、中胚层细胞或中胚层来源的细胞和内胚层细胞或内胚层来源的细胞等。

如本说明书通篇所用，术语“液体培养基”包括可用于以常规方法将多能干细胞传代的任何液体培养基。

如本说明书通篇所用，术语“多能干细胞黏着分子”指亲和性结合并黏着多能干细胞的分子，并且这种分子可以是任何类型，如蛋白质、肽、糖链，低分子量化合物(药物)等。作为多能干细胞黏着分子，优选分子是细胞所表达的并具有嗜同性结合能力的分子，例如钙黏着蛋白家族分子。已知E-钙黏着蛋白由未分化ES细胞表达并且因此被优选使用，但是其不是对多能干细胞黏着分子的具体限制。当黏着分子是蛋白质分子或肽分子时，可以使用其肽片段，只要该肽片段具有与该蛋白质分子或该肽分子相同的黏着活性即可。

多能干细胞黏着分子可通过固定化或包被于培养容器或培养基质(此后总称为“培养基质”)的固相表面而用于本发明的培养方法。任何常规用于细胞培养的培养基质如平板或瓶均可作为本发明的培养基质使用。这些培养基质可由无机材料如玻璃制成，或由有机材料如聚苯乙烯或聚丙烯制成，但是培养基质优选地是抗高热和抗湿的可灭菌材料。

向培养基质固相表面固定化或包被多能干细胞黏着分子的方法可以是物理方法如吸附或化学方法如共价结合，并且因为操作简便，吸附方法为优选。此外可以事先添加人工抗原性分子或使此抗原性分子与黏着分子预先融合以便利用特异性抗体对该抗原性分子的结合。在这种情况下，特异性抗体必须通过物理方法(如吸附)或化学方法(如共价结合)预先固定化或包被于培养基质的固相表面。

以如此方式所制备的培养基质可直接用于多能干细胞的常规培养。即可以在常用液体培养基或细胞培养基内悬浮适宜数目的多能干细胞，并将此混合物应用于培养基质。随后可以按照与常规方法相同的方式进行后续的液体培养基换液和传代。

如本说明书通篇所用，术语“嗜同性结合”指细胞与细胞或细胞与基质通过黏着分子的结合，该结合涉及同类型黏着分子的结合或联合。

如本说明书通篇所用，术语“饲养细胞”指预先所培养的并且起到供应培养基中所缺乏营养素和生长因子的独立细胞，也称支持细胞，其中该培养基用于培养不能独自存活和生长的细胞。“饲养细胞”包括但不限于MEF细胞和基质细胞如STO细胞。

如本说明书通篇所用，术语“分散状态”指在培养基质表面上黏着的生长细胞的状态，在该状态时无明显集落形成并且单个细胞不与其它细胞接触，或当部分接触时，具有非常微小的接触面积。

如本说明书通篇所用，术语“基因”指遗传物质，并且指包括转录单位在内的核酸。基因可以是RNA或DNA，并且可以是天然存在的或人工设计的序列。此外，基因不必要必须编码蛋白质，例如其可以编码功能性RNA，如核酶或siRNA(短/小干扰RNA)。

除了以上所描述的效应以外，本发明的其它优势和特点将在如下所提供的优选实施方案中详细描述中解释。

除非另外说明，为实施本发明可参考本领域内的标准文献，使用分子生物学和重组DNA技术中所用的基因工程方法以及常用的细胞生物学方案和常规技术。这些标准参考文献例如包括：Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第3版(Sambrook和Russell等，Cold Spring HarborLaboratory Press，2001)；Current Protocols in Molecular LaboratoryBiology(Ausubel等编辑，John Wiley & Sons，1987)；Methods inEnzymology系列(Academic Press)；PCR Protocols：Methods in MolecularBiology(Bartlet和Striling编辑，humana Press，2003)；Animal Cell Culture：A practical approach，第3版(Master编辑，Oxford University Press，2000)和Antibodies：A Laboratory Manual(Harlow等和Lane编辑，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1987)。在本说明书通篇内所指的用于细胞培养和细胞生物学实验的试剂和试剂盒可从商业供应商获得，如Sigma、Aldrich、Invitrogen/GIBCO、Clontech和Stratagene。

此外，用于细胞培养和发育以及用于使用多能干细胞的细胞生物学实验的普通方法可参考本领域内的标准参考文献进行。这些标准参考文献包括：Guide to Techniques in Mouse Development(Wasserman等编辑，Academic Press，1993)；Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro(M.V.Whiles，Meth.Enzymol.225：900，1993)；Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual(Hogan等编辑，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1994)和Embryonic Stem Cell(Turksen编辑，Humana Press，2002)。在本说明书通篇内所指的用于细胞培养和发育以及细胞生物学实验的试剂和试剂盒可从商业供应商获得，如Invitrogen/GIBCO和Sigma。

产生、传代和保存小鼠多能干细胞和人多能干细胞的标准方法已建立，并且这些方法可参考以上提到的文献以及其它大量文献(Matsui等，Cell70：841，1992；Thomson等，美国专利号5,843,780；Thomson等，Science282：114，1998；Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：13726，1998；Shamblott等，美国专利号6,090,622；Reubinoff等，Nat.Biotech.18：399，2000；国际专利公布号WO00/27995)并使用多能干细胞实施。用于建立其它动物种属如猴(Thomson等，美国专利号5,843,780；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844，1996)、大鼠(Iannaccon等，Dev.Biol.163：288，1994；Loring等，国际专利公布号WO99/27076)、鸡(Pain等，Development，122：2339，1996；美国专利号5,340,740；美国专利号5,656,479)、猪(Wheeler等，Reprod.Fertil.Dev.6：563，1994；Shim等，Biol.Reprod.57：1089，1997)等的ES细胞或ES样细胞的方法亦为所知，并且可根据以上所述的每种方法制备用于本发明的ES细胞。

ES细胞是作为未分化干细胞聚集物而分离的多能干细胞，其通过提取胚泡期胚胎内部细胞团(称作内细胞团)并且将其转移到体外培养，使该细胞团反复分离和传代而分离得到。已知存在小鼠ES细胞的多种细胞系，包括E14、D3、CCE、R1、J1、EB3等，其中的某些细胞系可以从美国典型培养物保藏中心、Ceu & Molecular Technologies或Thromb-X获得。目前在世界范围内已建立了50个人ES细胞系，并且在美国国立卫生研究院(NIH)(http：//stemcells.nih.gov/registry/index.asp)上已经登记了20个不同的细胞系。其中的某些细胞系可以从ES Cell International或WisconsinAlumni Research Foundation获得。

通常，ES细胞系通过培养早期胚胎建立，但是ES细胞也可以从通过对体细胞核进行核转移所得到的早期胚胎产生(Munsie等，Curre.Biol.10：989，2000；Wakayama等，Science 292：740，2001；Hwang等，Science303：1669，2004)。还提出了用于从胚泡期胚样细胞结构产生ES细胞的方法，其中该胚样细胞结构通过向另一个种属的已分裂为数个部分的卵母细胞或去核卵母细胞(称作胞质体或卵质体(ooplastoid))中转移所需动物的细胞核得到(国际专利公布号WO99/45100、WO01/46401、WO01/96532、美国在先公开号02/90722；02/194637)。此外，例如还报道了从发育至与胚泡期相同阶段的单性胚产生ES细胞的尝试(美国在先公开号02/168763；Vrana K等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：11911-6)，以及将ES细胞与体细胞融合以便产生具有体细胞核遗传信息的ES细胞的方法(国际专利公布号WO00/49137；Tada等，Curre.Biol.1l：1553，2001)。用于本发明的ES细胞包括通过此类方法所产生的ES细胞以及通过基因工程技术使其染色体DNA受到修饰的ES细胞。

用于本发明的EG细胞可通过使用LIF、bFGF/FGF-2或毛喉素，按照与ES细胞相同方式刺激在饲养细胞如MEF细胞、STO细胞或Sl/Sl⁴-m220细胞上的胎儿生殖细胞(也称作原生殖细胞)产生(Matsui等，Cell 70：841，1992；Koshimizu等，Development 122：1235，1996)，并且它们的特性与ES细胞极为类似(Thomson和Odorico，Trends Biotechnol.18：53，2000)。如同ES细胞，通过EG细胞与体细胞融合所产生的EG细胞(Tada等，EMBO J.16：6510，1997；Andrew等)以及通过基因工程技术使其染色体DNA受到修饰的EG细胞也可以用于本发明的方法。

此外，将要用于本发明增殖方法的多能干细胞虽然不限于ES细胞或EG细胞，但是其包括从哺乳动物胚胎或胎儿、脐带或者成体组织或血液(如成体器官或骨髓)衍生的并具有ES/EG细胞样特征的所有多能干细胞。例如通过在特殊培养条件下培养生殖细胞所得到的ES样细胞表现出与ES/EG细胞极为类似的特征(Kanatsu-Shinohara等，Cell 119：1001，2004)，并且可用作多能干细胞。另一个例子是从骨髓细胞分离的、具有分化为全部三个胚层潜能的多能成体祖细胞/干细胞(MAPC)。此外，还包括通过在特殊培养条件下培养根鞘细胞或角质形成细胞(国际专利公布号WO02/51980)、肠上皮细胞(国际专利公布号WO02/57430)或内耳细胞(Li等，Nature Med.9：1293，2003)所得到的多能干细胞，以及通过用M-CSF(巨嗜细胞集落刺激因子)+PMA(佛波醇12-肉豆蔻13-乙酸)(Zhao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：2426，2000)或CR3/43抗体(Abuljadayel，Curr.Med.Res.Opinion 19：355，2003)处理血液单核细胞(或在单核细胞的细胞级分中包含的干细胞)所产生的多能干细胞，只要它们的特征与ES/EG细胞的特征完全相同即可。在这种情况下，与ES/EG细胞类似的特征可定义为ES/EG细胞独特的细胞生物学特性，如细胞特异性表面(抗原性)标志的存在和细胞特异性基因的表达，以及形成畸胎瘤的能力和形成嵌合小鼠的能力。

本发明涉及培养包括ES细胞在内的多能干细胞的方法，并且其特征在于使用可黏着多能干细胞的分子(以后称作“多能干细胞黏着分子”)。用于实施本发明的多能干细胞黏着分子可通过固定化或包被于培养容器或培养基质(以后总称为“培养基质”)的固相表面而用于本发明培养方法。任何培养基质均可以用作本发明的培养基质，只要其能够用于培养多能干细胞即可，但是这种培养基质优选地是先前技术所用的用于培养细胞的培养基质。用于细胞培养的培养基质实例是碟、平板、瓶、小室载玻片、管、细胞工厂、滚瓶、旋动瓶、中空纤维、微载体、珠等。这些培养基质可以由无机材料如玻璃制成，或由有机材料如聚苯乙烯制成，但是优选地使用对蛋白质和肽具有高吸附特性的材料如聚苯乙烯，或者通过例如旨在提高吸附特性的亲水处理或疏水处理已进行处理的材料。具有抗高热性和抗湿性的可灭菌的材料也是优选的。此种优选基质的实例是未经特别细胞培养处理的聚苯乙烯碟和或平板(以下称为“未处理的聚苯乙烯平板”)，其在培养大肠杆菌(E.coli.)中最为常用，并且这类培养基质可商业性获得。

多能干细胞黏着分子是亲和性地结合并黏着多能干细胞的分子，并且这种分子可以是任何类型，如蛋白质、肽、糖链，低分子量化合物或由这些类型中的两种或两种以上所组成的分子。对于未分化ES/EG细胞的黏着分子几乎没有报道，但是已知它们表达例如属于免疫球蛋白超家族的ICAM-1、VCAM-1和NCAM(Tian等，Biol.Reprod.57：561，1997)。多能干细胞黏着分子优选地是在所用的多能干细胞的细胞膜表面表达的黏着分子，并且更优选地是具有嗜同性结合能力的分子。细胞黏着的嗜同性结合意指细胞与细胞或细胞与基质通过黏着分子的结合，其中涉及同类型黏着分子间的结合或联合。已知具有此类特性的黏着分子包括NCAM、L1、丛蛋白和钙黏着蛋白，然而从黏着强度看，优选地使用其中的钙黏着蛋白家族分子。据报道，E-钙黏着蛋白由未分化的ES细胞特异性表达(Larue等，Development 122：3185，1996)，因此优选地使用这种分子。然而，待使用的黏着分子不限于E-钙黏着蛋白，并且可以使用由多能干细胞表达的任何钙黏着蛋白家族分子或具有嗜同性结合的黏着分子。为了使分子用于本发明方法，可以通过基因工程技术对细胞进行基因修饰，使其表达编码具有嗜同性结合能力的分子的全长基因或部分基因，甚至该基因可以是在正常情况下ES细胞不表达的分子。

钙黏着蛋白是涉及Ca²⁺依赖性细胞间黏着和结合(称作黏着性结合或黏着连接结合)的黏着分子，并且钙黏着蛋白的三种类型：E(表皮)-钙黏着蛋白、N(神经)-钙黏着蛋白和P(胎盘)-钙黏着蛋白已众所周知。这些钙黏着蛋白分子是由700-750个氨基酸残基组成的膜结合糖蛋白，其细胞外区域包含五个由约110个氨基酸残基组成的、称作细胞外钙黏着蛋白(EC)结构域的重复结构。例如，人E-钙黏着蛋白的结构域(如SEQ ID NO：1所列的氨基酸序列)是EC1、EC2、EC3、EC4和EC5，分别对应于氨基酸残基157-262、265-375、378-486、487-595和596-700(其中的编号是如SEQ IDNO：1中所列氨基酸序列的残基编号)。此外，小鼠钙黏着蛋白(如SEQ IDNO：2所列氨基酸序列)的结构域是EC1、EC2、EC3、EC4和EC5，分别对应于氨基酸残基159-264、267-377、380-488、489-597和598-702(其中的编号是如SEQ ID NO：2中所列氨基酸序列的残基编号)。这些EC结构域在不同钙黏着蛋白分子间同源，并且位于N端的结构域(EC1、EC2)间具有特别高的同源性。目前已知超过50种钙黏着蛋白分子具有这种类似结构，并且将它们集中称为钙黏着蛋白家族。可在Takeichi，Curr.Opin.CellBiol.7：619，1995；Marrs和Nelson，Int.Rev.Cytol.165：159，1996；Yap等，Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.13：119，1997；Yagi和Takeichi，Gene Dev.14：1169，2000；Gumbiner，J.Cell.Biol.148：399，2000中及其它地方找到关于钙黏着蛋白的综述。

E-钙黏着蛋白(也叫钙黏着蛋白-1)在上皮细胞，如内部器官如肝脏、肾脏和肺的实质细胞内以及在角质形成细胞内广泛表达，并且已知E-钙黏着蛋白是细胞间黏着的重要黏着分子(参见综述：Mareel等，Int.J.Dev.Biol.37：227，1993；Mays等，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.60：763，1995；El-Bahrawy和Pignatelli，Microsc.Res.Tech.43：224，1998；Nollet等，Mol.Cell.Biol.Res.Commun.2：77，1999)。此外，E-钙黏着蛋白在未分化的小鼠ES细胞表面也大量表达，并且已知因基因工程使得E-钙黏着蛋白表达缺乏的ES细胞的细胞间黏着被显著抑制(Larue等，Development 122：3185，1996)。另外基于在美国国家生物技术信息中心(NCBI)中的公共基因表达数据库内所储存的数据，证实E-钙黏着蛋白基因还在人ES细胞系中表达。

虽然没有具体限制，但是产生用于实施本发明的钙黏着蛋白分子如E-钙黏着蛋白或当其它黏着分子的方法，在该分子是蛋白质或肽时，优选地包括使用分子生物学技术产生、纯化和使用重组蛋白。还可以使用具有可比结果的其它方法，并且例如多能干细胞黏着分子可以从活组织或活细胞中提取和纯化后加以使用，或者使用化学合成的肽。

已建立了用于产生如多能干细胞黏着分子的重组蛋白以及得到编码此类蛋白质基因的标准方案，并且可参考如上提到的文献，但其不是限制性的。以E-钙黏着蛋白为例，已经分离并鉴定了包括人(SEQ ID NO：1)、小鼠(SEQ ID NO：2)和大鼠在内的动物E-钙黏着蛋白基因，并且可从公众DNA数据库如NCBI(登录号：(人)(NM 004360)；(小鼠)NM 009846；(大鼠)NM 031334)中获得各自的核苷酸序列。本领域技术人员因此可以设计对目的E-钙黏着蛋白基因特异的引物或探针，并且在普通分子生物学技术中使用以便得到和使用E-钙黏着蛋白基因的cDNA。备选地，E-钙黏着蛋白基因的cDNA可从RKEN基因库(Tsukuba，日本)或美国典型培养物保藏中心(ATCC)或Invitrogen/ResGen得到。所用的黏着分子编码基因优选地来自与多能干细胞所来源的动物种属相同的动物种属，并且例如当使用小鼠ES细胞实施本发明时，优选地使用小鼠E-钙黏着蛋白的cDNA。然而，可以使用来自其它种属如人、猴、奶牛、马、猪、绵羊、鸟(例如鸡)或两栖类(例如非洲爪蟾(Xenopus laevis))的E-钙黏着蛋白cDNA。

产生用于实施本发明的黏着分子重组蛋白的方法的实例的特征在于，向哺乳动物如COS细胞、293细胞或CHO细胞内转移并表达编码该分子的基因。优选地，该基因与允许该基因在广泛类型的哺乳动物细胞内转录和表达的核酸序列(即启动子序列)以使得转录和表达处于启动子控制下的方式进行连接。所转录和表达的基因还优选地与聚腺苷酸添加信号连接。优选启动子可以是来自病毒如SV(猿猴病毒)40病毒、巨细胞病毒(CMV)或劳斯肉瘤病毒的启动子、或β-肌动蛋白启动子、EF(延伸因子)1α启动子等。

用于产生重组蛋白的基因没有必要必须包含编码该分子的基因的全长区域，因为该基因可以是部分基因序列，只要由该部分序列所编码的蛋白质分子或肽分子具备与原始分子的黏着活性相同或超过原始分子黏着活性的黏着活性即可。例如适合本发明用途的E-钙黏着蛋白可以是从包含编码细胞外区域的N端690-710氨基酸残基的部分序列构建的重组蛋白，即包含EC1-EC5结构域的蛋白质。由于最靠近钙黏着蛋白分子N端的结构域(EC1)通常决定该分子的结合特异性或嗜同性结合特性(Nose等，Cell61：147，1990)，因此可以构建和使用至少含有EC1而缺少一个或多个剩余结构域的蛋白质分子。还可以使用与前述蛋白质分子具有至少80％、优选地至少85％、更优选地至少90％、最优选地至少95％氨基酸水平同源性、并表现出黏着活性的蛋白质。

如上提到的重组蛋白还可以作为与另一种蛋白质或肽的融合蛋白质产生。例如，此重组蛋白可以作为与免疫球蛋白Fc区域或与GST(谷胱苷肽-S-转移酶)蛋白质、MBP(甘露糖结合蛋白)、抗生物素蛋白、His(寡聚组氨酸)标签、HA(血凝素)、Myc标签、VSV-G(水疱性口炎病毒糖蛋白)标签等融合的融合蛋白质产生，并且为于方便和高效地纯化此重组蛋白质，可以使用蛋白质A/G柱和特异性抗体柱。由于Fc-融合蛋白质对由例如聚苯乙烯材料制成的培养基质具有更大的吸附能力，故Fc-融合蛋白质尤其优选地用于实施本发明。

已经在包括人在内的动物中分离并鉴定了众多编码免疫球蛋白Fc区域的基因。已报道了众多这样的核苷酸序列，并且例如含有人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4Fc区域核苷酸序列的序列数据可从公共DNA数据库如NCBI中获得，这些序列已分别作为登录号AJ294730、AJ294731、AJ294732和AJ294733注册。因此，本领域技术人员可以设计对Fc区域特异的引物或探针，并且在普通分子生物学技术中使用以便得到和使用编码Fc区域的cDNA。在这种情况下，不具体限制动物种属和编码目的Fc区域基因的亚型，但是该基因优选地编码对蛋白质A/G具有强结合亲和性的人IgG1或IgG2或者小鼠IgG2a或IgG2b的Fc区域。通过在Fc区域内导入突变以便增强对蛋白质A的结合亲和性的方法(Nagaoka等，Protein Eng.16：243，2003(非专利文件7))是已知的，并且还可以使用通过此类方法已进行基因修饰的Fc蛋白质。

本发明人已经在文献中公开了用于产生优选地用来实施本发明的E-钙黏着蛋白重组蛋白的方法实例(Nagaoka等，Biotechnol.Lett.24：1857，2002(非专利文件6)；Protein Eng.16：243，2003(非专利文件7))。

此外，还可以商业性获得已纯化的重组蛋白，该重组调蛋白通过向小鼠细胞中导入融合基因(通过将含有编码人IgG Fc区域和His标签序列的cDNA与编码小鼠或人E-钙黏着蛋白细胞外区域cDNA连接获得)并表达可作为小鼠或人E-钙黏着蛋白使用的重组蛋白(重组人/小鼠E-钙黏着蛋白-Fc嵌合体；R & D System，Genzyme Techne)产生。

在实施本发明所公开方法中所用的培养基质固相表面上固定化或包被多能干细胞黏着分子的方法可以是物理方法(如吸附)或化学方法(如共价结合)，而因为实施方便，吸附方法为优选的。当黏着分子是蛋白质分子或肽分子时，或者黏着分子是含有糖链的高分子化合物时，这种分子可通过将该分子的溶液与培养基质如平板的固相表面接触，然后在预定时间段后移去溶剂而容易地吸附。更具体地，可将使用溶剂如蒸馏水或PBS制备的黏着分子溶液过滤和灭菌，随后与培养基质如平板接触，并且维持几个小时至一个完整白天/黑夜的时间，以便得到具有已固定化或已包被黏着分子的细胞培养基质。这种细胞培养基质优选地在用蒸馏水或PBS洗涤数次并用平衡盐溶液如PBS替换后使用。

优选地，预先向黏着分子中添加人造抗原性分子或与之融合，因为这将可以利用对该抗原性分子特异性抗体的结合，并且使该黏着分子有效地在基质表面附着。在这种情况下，特异性抗体必须通过物理方法(如吸附)或化学方法(如共价结合)预先固定化或包被于培养基质表面。例如，对于通过IgG Fc区域与黏着分子融合得到的重组蛋白，预先附着于培养基质的抗体可以是特异性识别该IgG Fc区域的抗体。对于通过蛋白质序列或标签序列与黏着分子融合得到的重组蛋白，对该融合分子呈特异性的抗体可以预先附着于培养基质上以便使用。

在实施本发明所用的细胞培养基质的固相表面上所固定化或包被的黏着分子可以是单一类型，或者可以组合使用两种或多种不同黏着分子。在这种情况下，可以将每种黏着分子的溶液混合并且以如上所描述的方式应用混合的溶液。

必须基于分子的吸附和/或亲和性以及分子的物理特性适当考虑黏着分子溶液的浓度，但是对于通过Fc区域与E-钙黏着蛋白细胞外区域融合得到的重组蛋白，该浓度是大约0.01-1000μg/ml，优选地是大约0.1-200μg/ml，甚至更为优选地是1-50μg/ml并且最优选地是5-10μg/ml。

将实施本发明所用的多能干细胞接种于以如上所述方式制备的培养基质上。培养多能干细胞的培养方法和培养条件可以是用于培养多能干细胞的普通培养方法和普通培养条件，例外的是使用如上所述的培养基质。用于培养多能干细胞的普通培养方法和普通培养条件描述于以述文献，虽然对这些文献没有特别的限制，但具体地是Guide to Techniques in MouseDevelopment(Wasserman等编辑，Academic Press，1993)；EmbryonicStem Cell Differentiation in vitro(M.V.Wiles，Meth.Enzymol.225：900，1993)；Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual(Hogan等编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1994)；Embryonic Stem Cell(Turksen编辑，Humana Press，2002)以及其它来源(Matsui等，Cell 70：841，1992；Thomson等，美国专利号5,843,780；Thomson等，Science 282：114，1998；Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：13726，1998；Shamblott等，美国专利公布号6,090,622；Reubinoff等，Nat.Biotech.18：399，2000；和国际专利公布号WO00/27995)。

用于培养多能干细胞的液体培养基可以是在多能干细胞传代的常规方法中应用的任何一种液体培养基。可提及的具体例子是Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)、Glasgow极限必需培养基(GMEM)、RPMI1640培养基等，通常添加大约2mM谷氨酰胺和/或大约100μM2-巯基乙醇。也可以使用可商业获得的KnockOut DMEM(Invitrogen)、ES细胞限制DMEM(Cell & Molecular Technologies)和TX-WES(Thromb-X)作为ES细胞培养培养基。此类培养基优选地含有添加至大约5-25％的FBS，但是这些培养基也可以是由例如15-20％ KnockOut Serum Replacement(Invitrogen)替代的无血清培养基。还可以使用MEF细胞培养上清液或含有添加的bFGF/FGF-2、SCF等的培养基，并且其详细方法已为公众所知(Xu等，Nature Biotech.19：971，2001；国际专利公布号WO01/51616；国际专利公布号WO03/020920；Amit等，Biol.Reprod.70：837，2004)。

用于培养多能干细胞的液体培养基优选地还具有为辅助维持多能干细胞未分化状态而添加的物质和因子。对具体的物质和因子没有特别的限制，但是LIF优选地用于小鼠ES/EG细胞。LIF是在已发表文献(Smith和Hooper，Dev.Biol.121：1，1987；Smith等，Nature 366：688，1988；Rathjen等，Genes Dev.4：2308，1990)中以及通过登录号X13967(人LIF)、X06381(小鼠LIF)和NM 022196(大鼠LIF)为公众所知的蛋白质因子，并且LIF重组蛋白可以商业性得到，例如商品名ESGRO(Chemcon)。向培养基中添加GSK-3抑制剂而不添加其它生长因子或生物活性因子可有效维持小鼠和人ES细胞的未分化状态(Sato等，Nature Med.10：55，2004)。在这种情况下，可以使用具有GSK-3活力抑制活性的任何物质，可提及的是例如Wnt家族的分子(Manoukian和Woodgett，Adv.Cancer Res.84：203，2002；Doble和Woodgett，J.Cell Sci.116：1175，2003)。

通过在如上所描述方法制备的培养基质上接种经常规方法传代而维持的多能干细胞，并且使用用来实施本发明的培养方法和培养条件进行培养，可以实现将细胞以分散状态传代而同时维持细胞原始未分化状态。因为以这种状态培养的多能干细胞在细胞分裂期间不受物理性限制，和/或由细胞间接触所介导的细胞生长抑制机制不起作用，和/或在细胞存活增加的同时死细胞数目下降，故观察到细胞显著增殖。作为一个实例，在通过本发明方法培养小鼠ES细胞时，与通过常规方法培养相比可以获得至少1.25倍、优选地至少1.5倍并且更优选地至少2倍的增殖速率。在这些条件下经过大约4次传代后可回收的细胞数目是通过常规方法所回收细胞数目的至少3倍、优选地至少10倍。该增殖速率可以表示为诸如细胞数目增加速率或每单位时间内倍增速度的指数，并且所用的测量和计算方法可以是任何为公众所知的、用于常规细胞实验的方法。

如以上所解释，多能干细胞的未分化状态意指多能干细胞能够延长地增殖或实际上无限制地增殖，并表现出正常核型(染色体)，同时具有在适宜条件下分化为全部三个胚层的能力。此外，它们优选地具有至少一种多能干细胞的其它特性，如端粒酶活性维持、畸胎瘤形成或形成嵌合体的能力。分析细胞特征和特性的方法可参考以上所引用的文献如Guide toTechniques in Mouse Development(Wasserman等编辑，Academic Press，1993)；Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro(M.V.Whiles，Meth.Enzymol.225：900，1993)；Manipulating the Mouse Embryo：A LaboratoryManual(Hogan等编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1994)或Embryonic Stem Cell(Turksen编辑，Humana Press，2002)，使用已建立的标准方案轻易地实施，但对这些方法没有具体限制。

可以将处于未分化状态的多能干细胞定义为：可通过以下所描述方法中的至少一种方法、并且优选地一种以上的方法证实至少一种并且优选地一种以上标志分子的细胞。未分化多能干细胞特异的多种标志的表达可通过常规生物化学方法或免疫化学方法检测。虽然对所采用方法没有具体限制，但优选免疫化学方法，如免疫组化染色或免疫印迹分析。在此类方法中可以使用结合未分化多能干细胞的标志特异性多克隆抗体或单克隆抗体。靶向各个特定标志的抗体是商业可得的并且可以方便地使用。未分化多能干细胞的特异性标志包括ALP活性和Oct-3/4或Rex-1/Zfp42基因产物的表达。还可以使用多种抗原性分子，包括小鼠ES细胞的未分化标志SSEA-1、人ES细胞的未分化标志SSEA-3或者未分化标志SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-60、gCTM-2等。在ES细胞分化时，它们的表达减少或停止。

备选地，未分化多能干细胞标志的表达可以通过在先前技术中常常用于扩增、检测和分析编码目的标志蛋白质的mRNA的分子生物学方法(例如逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)或杂交分析)证实，而不用考虑具体方法如何。编码未分化多能干细胞特异性标志蛋白质(例如Oct-3/4、Rex-1/Zfp42或Nanog)的基因的核酸序列是已知的，并且作为引物或探针的必需的特异性标志序列可以从公众数据库NCBI容易地确定。

作为向多能干细胞中进行基因转移方法的用途

根据本发明的另一个方式，本发明所公开的方法可用作向多能干细胞中高效转移所需外源基因的方法。对待进行转移的外源基因没有特别的限制，例如该外源基因可以是天然蛋白质如生长因子或受体、酶、转录因子等的基因或是通过使用基因工程方法修饰所产生的人工蛋白质的基因。所转移的基因还可以是功能性RNA，如核酶或siRNA。该外源基因甚至可以是用于评估基因转移效率或表达稳定性的标志基因，如编码GFP(绿色荧光蛋白)或β-半乳糖苷酶、荧光素酶的基因等。

作为一个优选的方式，将待转移的外源基因与允许该基因转录和表达的核酸序列即启动子序列以使得基因转录和表达处于启动子控制下的方式连接。在这些情况下，该基因还优选地与聚腺苷酸信号序列连接。作为允许外源基因在多能干细胞中转录和表达的启动子可以是来自病毒如SV40、CMV或劳斯肉瘤病毒的启动子，或β-肌动蛋白启动子、EF1α启动子等。可使用允许特定基因在某些细胞/组织类型中或在特定分化阶段的细胞中转录或表达核酸序列，即细胞/组织特异性启动子或分化阶段特异性启动子，或者用于RNA表达的Pol.III启动子，这取决于使用目的。这些启动子序列可以从公众DNA数据库如NCBI中加以利用，并且可以使用常规分子生物学技术构建包含所需基因序列的基因载体。用于这些启动子的载体可以从Invitrogen、Promega、Ambion和其它地方获得。

对导入基因(载体)的方法没有特别的限制，可以提及的是例如使用磷酸钙或DEAE-葡聚糖的转染方法。将基因转移至细胞靶标的移转染方法还可以使用脂类制剂形成含有靶基因的脂质体-核酸复合体进行，脂类制剂可以被细胞摄入并具有低细胞毒性，如LipofectAMINE(Invitrogen)、Superfect(Qiagen)或DOTMA(Roche)。备选地，目的基因可以整合入用于感染细胞的病毒载体如逆转录病毒或腺病毒以及重组病毒。在这种情况下，病毒载体是全长或部分缺陷性或突变的病毒DNA或RNA核酸序列与以可表达方式整合入的目的基因的重构体(re-construct)。

通过本发明方法所增殖的多能干细胞的用途

随后可以使用公众所知的细胞回收方法高效并且大量获得根据本发明增殖方法所增殖的多能干细胞，这些多能干细胞是保持其未分化状态的多能干细胞。本发明的基因转移方法可以高效和高产量地产生具有转移进入并在其中表达的所需基因的多能干细胞。以这种方式得到的多能干细胞此后称作“根据本发明制备的多能干细胞”。

作为回收多能干细胞的方法可以提及的是使用公众所知的、常规用于多能干细胞传代的酶处理方法。作为具体实例提及的是这样一种方法，即将培养基从已经进行多能干细胞培养的培养容器内移出，使用PBS洗涤数次，优选地是2-3次，加入含有适宜蛋白酶的溶液(例如含有胰蛋白酶或中性蛋白酶的溶液)，在37℃温育适宜时间，优选地是1-20分钟并且更优选地是3-10分钟，随后将混合物悬浮于适宜溶液如前述ES细胞培养基以得到单个细胞。还可以使用非酶方法，例如可以提及的是这样一种方法，即将培养基从已经进行多能干细胞培养的培养容器内移出，使用PBS洗涤数次，优选地是2-3次，加入乙二胺四乙酸(EDTA)溶液至终浓度0.01-100mM，优选地是0.1-50mM并且更优选地是1-10mM，在37℃温育处理达适宜时间，优选地是大约1-60分钟并且更优选地是10-30分钟以使细胞分散，随后将混合物悬浮于适宜溶液如前述ES细胞培养基中以得到单个细胞。还可以以乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)替代EDTA开展同一方法。

本发明还提供通过适宜的诱导分化处理从根据本发明制备的多能干细胞产生的已分化细胞。对已分化细胞没有特别的限制，只要它们是通常可以从多能干细胞诱导分化的细胞类型即可。具体而言，可以提到的是外胚层细胞或外胚层来源的细胞、中胚层细胞或中胚层来源的细胞、内胚层细胞或内胚层来源的细胞等。

外胚层来源的细胞是形成如下组织或器官的细胞，如神经组织、松果体、肾上腺髓质、质体和表皮组织，但它们不限于此。中胚层来源的细胞是形成如下组织或器官的细胞，如肌肉组织、结缔组织、骨组织、软骨组织、心脏组织、血管组织、血液组织、皮组织、泌尿器官和生殖器官，但它们不限于此。内胚层来源的细胞是形成如下组织或器官的细胞，如消化道组织、呼吸器官或胸腺、甲状腺、甲状旁腺、膀胱、中耳、肝脏和胰腺组织，但它们不限于此。

将根据本发明制备的多能干细胞和/或从这类细胞制备的已分化细胞用于多种生理活性物质(如药物)或功能未知的新基因产物的药理学评估或活性评估。例如，它们可以用于筛选参与多能干细胞或多种已分化细胞的功能调节的物质和药物，和/或筛选对多能干细胞或多种已分化细胞具有毒性或抑制作用的物质和药物。目前，几乎没有建立使用人细胞的筛选方法，因此从本发明所制备多能干细胞衍生的已分化细胞是开展此类筛选方法的有用的细胞源。

本发明还涉及使用通过本发明所公开方法制备的多能干细胞来产生嵌合胚胎或嵌合动物的方法，并且涉及所产生的嵌合胚胎和嵌合动物。已经建立了产生嵌合胚胎或嵌合动物的标准方法，并且可以参考例如Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual(Hogan等编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1994)容易地产生嵌合胚胎或嵌合动物，尽管不具体限制于该参考文献。

实施例

现在将通过如下实施例对本发明更详细地加以解释，同时应当理解这些实施例仅是本发明的例子并且无论如何将不限制本发明的范围。

实施例1：重组E-钙黏着蛋白的制备

构建用来表达包含小鼠E-钙黏着蛋白细胞外区域和IgG Fc区域(IgG/Fc)的融合蛋白(以下称为“E-cad-Fc”)的载体的方法以及产生和纯化该蛋白的方法是以本发明人已报道的方法为基础(Nagaoka等，Biotechnol.Lett.24：1857，2002(非专利文件6)；Protein Eng.16：243，2003(非专利文件7))。首先使用含有小鼠E-钙黏着蛋白全长序列(由RIKEN提供；RDB编号1184)的cDNA作为模板，从E-钙黏着蛋白cDNA中扩增了编码细胞外结构域(E-Cad-ECD)的DNA片段(对应于氨基酸残基1-699)。从cDNA中分离了编码小鼠IgG/Fc的DNA片段，其中通过从表达小鼠IgG1的杂交瘤中制备mRNA并且用逆转录酶进行逆转录得到该cDNA。在证实两种DNA片段的核苷酸序列后，将它们整合入表达载体pCR-CMV(Invitrogen)以构建含有E-cad-ECD和IgG/Fc序列的表达载体pCR-E-cad-Fc。

使用CHO-K1细胞(从RIKEN，Tsukuba得到)产生E-cad-Fc蛋白质。根据该产品手册中所推荐的方案，将线性化的pCR-E-cad-Fc(0.1μg)与5.0μlLipofectAMINE^TM试剂(Invitrogen)混合，并向CHO-K1细胞中转移基因。接着，为了得到持续且大量地产生E-cad-Fc蛋白质的细胞克隆，在基因转移后第二天回收细胞并且在96孔平板(IWAKI)中每孔0.2细胞接种。在含有400μg/ml G418(Invitrogen)的RMPI 1640中培养7天后，从含有存活细胞的孔收集培养上清液，并且测量该培养上清液中E-cad-Fc蛋白质的浓度。将具有最高E-cad-Fc蛋白质产量的克隆(4G7)分离并用于如下实验。将这些细胞在无血清培养基(CHO-S-SFMII；Invitrogen)中驯化，随后在旋动瓶内大量培养，并收集培养上清液。

用0.45μm滤膜过滤培养上清液，随后使用100kDa孔径的超滤膜(YM100；Amicon)和搅拌小室(Amicon 8200；Amicon)浓缩。将浓缩的溶液对20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)透析，随后通过使用蛋白质A柱(Amersham Bioscience)的普通方法纯化，并用于如下实验。

实施例2：ES细胞对E-cad-Fc平板的黏着

分析了ES细胞对E-cad-Fc蛋白质包被的细胞培养平板(此处以后称为“E-cad-Fc平板”)的黏着。向不同大小的未处理聚苯乙烯培养平板内倾入以PBS稀释的E-cad-Fc蛋白质溶液并且在37℃包被处理过夜。在洗涤之后和接种细胞之前，为阻止细胞的非特异性黏着，用0.1％BSA溶液封闭处理1-2小时。作为对照，使用BSA(0.1％)、明胶(0.1％)、I型胶原(0.01％；KOKEN)或纤粘连蛋白(5.0μg/ml；KOKEN)包被的平板。

所用的ES细胞系是EB3细胞(由RIKEN的Hitoshi Niwa教授提供)、R1细胞(Nagy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8424，1993)和129SV细胞(从Dainippon Pharmaceutical Co.Ltd得到)，并且实验结果显示不同ES细胞系之间不存在差异。根据Manipulating the Mouse Embryo：ALaboratory Manual(Hogan等编辑，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1994)和Embryonic Stem Cells：Methods and Protocols(Turksen编辑，Humana Press，2002)中所描述的方法，使用含有10％FBS、0.1mM的MEN非必需氨基酸溶液、2mM L-谷氨酰胺和0.1mM 2-巯基乙醇的KnockOout DMEM(Invitrogen)培养基(以后称为ESM)并添加1000U/mlLIF(ESGRO；Chemicon)将这些ES细胞传代，并同时维持了ES细胞的未分化状态，将它们用于如下实验。将在这些条件下进行传代的ES细胞此后称作“在普通条件下传代的ES细胞”。

将普通条件下传代的ES细胞用无血清培养基洗涤两次并且用含有1mM EDTA的0.25％胰蛋白酶溶液处理以得到悬浮于ESM中的单个细胞。除非另外说明，此后对于ES细胞从平板上分离、传代和其它实验使用相同的条件。通过以上所描述的方法在未处理的96孔平板(IWAKI)上包被纯化的E-cad-Fc蛋白质，并且将制备的3.0×10⁵个细胞/ml细胞悬液以100μl每孔接种于其中，培养4小时。在用无血清培养基洗涤后，将培养基替换成含有10％Alamar蓝(Biosource International)的培养基，反应4小时后，测量作为有活力的细胞数指数的吸收值。

结果示于图1。与成纤维细胞和上皮细胞相比，ES细胞通常具有低黏着能力，并且它们基本上不能与未经处理或者以BSA包被的聚苯乙烯平板黏着，因此它们在培养基中形成聚集的细胞团；然而，在用明胶、胶原或纤粘连蛋白预处理培养平板后，ES细胞能够以与在普通细胞培养平板接种时的相同方式黏着。当使用不同浓度的E-cad-Fc所包被平板分析ES细胞的黏着能力时，R1细胞系和EB3细胞系对5.0μg/ml及更高浓度E-cad-Fc所包被平板表现出令人满意的黏着性，另外，ES细胞还能够在无血清条件下黏着于E-cad-Fc平板，并且对平板的黏着显然不依赖于血清中的黏着分子，如纤粘连蛋白。

已知通过E-钙黏着蛋白的结合是呈Ca²⁺依赖性的(Mareel等，Int.J.Dev.Biol.37：227，1993；Takeichi，Curr.Opin.Cell Biol.7：619，1995；Marrs和Nelson，Int.Rev.Cytol.165：159，1996)。为了分析添加螯合剂对ES细胞与E-cad-Fc平板黏着的影响，以相同方式用5mM浓度乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)处理在E-cad-Fc平板上培养4小时的ES细胞，并且在用PBS洗涤细胞后，以如上相同方式用Alamar蓝测定细胞数。对于使用具有低金属离子选择性的EDTA处理，ES细胞与E-cad-Fc和纤粘连蛋白的黏着均解离，但是对于使用具有高Ca²⁺选择性的EGTA处理，ES细胞与纤粘连蛋白的结合未受抑制并且仅仅是ES细胞与E-钙黏着蛋白的结合解离。对于EGTA处理，甚至添加5mMMg²⁺也不能阻止该效应。这些结果表明，ES细胞与E-cad-Fc平板的黏着涉及ES细胞表面存在的E-钙黏着蛋白分子与固定化于E-cad-Fc平板固相表面的E-钙黏着蛋白分子间的相互作用。

随后，将在普通条件下传代的ES细胞接种于E-cad-Fc平板内或用另一种基质包被的24孔平板(IWAKI)内并培养。已知ES细胞通常在饲养细胞或在普通细胞培养平板上形成紧密的圆形集落。在这里，ES细胞形成了相同类型的清晰紧密集落，甚至在使用以明胶、I型胶原、或纤粘连蛋白包被的未处理聚苯乙烯培养平板时也是如此(见图2)。然而，值得注意的是在E-cad-Fc平板上接种的ES细胞，无论是EB3细胞还是R1细胞即使在接种2-3天后基本上也不能形成清晰集落，并且反而观察到单个已分散细胞数目的增加。

实施例3：使用E-cad-Fc平板培养ES细胞

为了分析ES细胞在E-cad-Fc平板上的增殖能力，将在普通条件下传代的ES细胞回收并将500个ES细胞接种于E-cad-Fc平板或明胶平板(96孔平板)并培养3至4天。在用无血清培养基洗涤细胞后，以如上相同方式用Alamar蓝测定细胞数。结果，对于EB3细胞系和R1细胞系，培养3天后在E-cad-Fc平板上所培养ES细胞的数目相对于在明胶平板上所培养ES细胞的数目显著更高(见图3A)。此外，通过在第4天计数可见，E-cad-Fc平板组中的两种ES细胞系的细胞数高大约2倍。当ES细胞在四次类似传代后回收并且计数时，E-cad-Fc平板上所培养ES细胞的数目比那些在普通明胶平板上所培养ES细胞的数目高3-5倍。就接种ES细胞后的即刻黏着速率而言，在平板间不存在差异，这表明在E-cad-Fc平板上培养的ES细胞具有较高增殖能力和存活能力。当用F9细胞进行相同实验时，在E-cad-Fc平板培养组和普通平板培养组之间未发现细胞增殖能力的差异。

随后，使用5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)的摄取作为指数分析了ES细胞的DNA合成。将在如上所述条件下培养3天的ES细胞用BrdU(10μM)标记30分钟后回收为单个细胞，并在96孔平板中再次接种。4小时后，已附着的ES细胞用FixDenat溶液(Roche Applied Science)固定并用PBS洗涤，此后与抗BrdU抗体(BMG 6H8；Roche Applied Science)(100倍稀释)反应并且使用氰3(Cy3)标记抗体(Jackson Immunoresearch Laboratory)(1∶1000稀释)染色。细胞核用4′，6-二脒基-2苯基吲哚(DAPI)溶液(0.1μg/ml)染色。抗体和染料染色图像使用ArrayScan^TM(Cellomics)观察。结果，E-cad-Fc平板培养组的BrdU摄取显著高于普通平板培养组(见图3B)。

已知ES细胞通常在形成大的封闭集落后发生自发分化。因此，当在普通平板上培养本实验中所用的三种不同的小鼠ES细胞系时，集落发生过度生长并且产生具有不同形态学的已分化细胞，除非每隔2至3天对它们进行传代。然而当在E-cad-Fc平板上培养时，如果降低最初的接种数目，甚至大约每5-7天进行一次传代即足够，并且在这些培养条件下未观察到集落过度形成和已分化细胞。因此，为了证实在E-cad-Fc平板所培养的ES细胞是否维持了其未分化状态或者ES细胞的分散状态和未分化状态是否在甚至多次传代后仍然维持，将这些ES细胞在平板上传代数次，并且分析得到ES细胞的特性。

首先分析了作为未分化ES细胞指标的ALP活性或Oct-3/4蛋白质的表达，以便证实ES细胞的未分化状态。使用Sigma诊断碱性磷酸酶试剂盒(Sigma)检测ALP活性。在所培养的ES细胞(EB3细胞系和R1细胞系)用PBS洗涤后，用含有66％丙酮/3％福尔马林的柠檬酸盐溶液固定并且用PBS洗涤，此后用试剂盒中所带的萘酚AS-BI磷酸盐碱性染色溶液处理15分钟进行显色反应(见图4A)。

通过免疫染色分析Oct-3/4蛋白质的表达。具体地，所培养的ES细胞用8％甲醛(Wako Pure Chemical Industries Co.，Ltd.)固定并用PBS洗涤，随后与抗Oct-3/4抗体(Santa Cruz产品)(1∶200稀释)反应并用Alexa Fluor-标记的抗体(Alexa-488；Molecular Probe)(1∶1000稀释)染色。细胞核用DAPI溶液(0.1μg/ml)染色。抗体和染料染色图像使用荧光显微镜观察(见图4B)。

结果证实，在E-cad-Fc平板上培养14天的ES细胞中具有高ALP活性(图4A)和高Oct-3/4蛋白质表达(图4B)，这类似于在明胶包被平板(以下称为“明胶平板”)上所培养的作为对照组的ES细胞。

此后分析了作为未分化ES细胞标志的Oct-3/4和Rex-1/Zfp42基因的表达。将在E-cad-Fc平板或明胶平板上培养14天的ES细胞回收并且使用1ml TRIZOL(Invitrogen)制备总mRNA。随后，使用M-MLV逆转录酶(Invitrogen)，通过常规方法合成cDNA，并且该cDNA用作使用如下引物的聚合酶链式反应(PCR)的模板来扩增每种基因片段。

Oct-3/4[扩增大小：528bp]

5′-引物：5′-GAAGTTGGAGAAGGTGGAACC-3′(SEQ ID NO：3)

3′-引物：5′-GCCTCATACTCTTCTCGTTGG-3′(SEQ ID NO：4)

Rex-1[扩增大小：930bp]

5′-引物：5′-AAAGTGAGATTAGCCCCGAG-3′(SEQ ID NO：5)

3′-引物：5′-TCCCATCCCCTTCAATAGCA-3′(SEQ ID NO：6)

Nanog[扩增大小：710bp]

5′-引物：5′-GAGGAAGCATCGAATTCTGG-3′(SEQ ID NO：7)

3′-引物：5′-AAGTTATGGAGCGGAGCAGC-3′(SEQ ID NO：8)

GAPDH[3-磷酸甘油醛脱氢酶][扩增大小：858bp]

5′-引物：5′-GGAAGCTTGTCATCAACGG-3′(SEQ ID NO：9)

3′-引物：5′-CTCTTGCTCAGTGTCCTTGC-3′(SEQ ID NO：10)

使用TaKaRa PCR热循环仪MP(TaKaRa)，以TaKaRa Taq(TAKARA)作为热稳定DNA聚合酶实施PCR。首先，在94℃加热含有该cDNA的PCR反应溶液，随后重复22次如下的热循环：94℃：30秒→59℃：30秒→72℃：30秒，随后72℃终末加热5分钟，最后冷却至4℃。PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，以SYBR绿I(TAKARA)染色并且用Typhoon 8600(Amersham Bioscience)检测。

结果示于图5。在普通明胶平板上培养的ES细胞在LIF存在的条件下表现出Oct-3/4、Rex-1和Nanog的高表达，在无LIF时它们的表达显著下降。在E-cad-Fc平板上培养的ES细胞中也发现了类似结果，即在LIF存在条件下出现Oct-3/4、Rex-1和Nanog的高表达。使用相同的样品检测了神经元、中胚层细胞和内胚层细胞的分化标志基因如NeuroD3或Sox-1、T/Brachyury、Flk-1、血红蛋白、甲胎蛋白和运甲状腺素蛋白基因的表达，然而在LIF存在条件下，对于在明胶平板和E-cad-Fc平板上培养的ES细胞均未发现分化标志基因的表达。如图4A、4B和5中的结果所示，证实了在E-cad-Fc平板上培养的ES细胞会增殖但不形成集落，并且表现出与普通培养的形态不同的形态，与此同时却保持了它们的未分化状态。

随后分析了在E-cad-Fc平板上培养的ES细胞对LIF的反应性是否改变。在普通明胶平板和E-cad-Fc平板上传代的ES细胞与0-1000U/ml浓度的LIF培养5天而不传代，随后将两组细胞再次接种与明胶平板上并且培养3天(在培养期间维持恒定的LIF浓度)。通过如上所描述的相同方法检测在平板上所形成的ES细胞集落的ALP活性，并且测量了保留未分化状态的集落的比例。将至少80％的细胞具有ALP活性的集落判定为“未分化”。

在头5天培养结束时，在明胶平板上培养的ES细胞形成过大的集落，但是未观察到可以明确判定为已分化细胞的细胞。如以前的实验，在E-cad-Fc平板上培养的ES细胞会增殖但未形成集落，并且维持了它们的分散状态。再次接种后，在普通平板上与1000U/ml浓度LIF培养的ES细胞在几乎所有集落中均维持ALP活性，但是未分化集落的比例随LIF浓度降低而下降(见图6)。先前在E-cad-Fc平板上培养的ES细胞能够在几乎所有集落中保留未分化状态，甚至在LIF浓度为100U/ml时也是如此。未发现较低浓度LIF对其增殖能力的抑制。这提示使用E-cad-Fc平板的培养与先前方法相比，可以减少ES细胞生长所必需的附加因子如LIF的数量。

随后分析E-cad-Fc平板是否可用于对ES细胞进行不依赖于饲养细胞的驯化。通常ES/EG细胞通过与饲养细胞共同培养进行传代和维持，但是它们依赖饲养细胞的培养状态可以驯化为不依赖于饲养细胞的状态。然而，这需要高密度的ES细胞以及在含有高浓度LIF(通常大约5-10倍)的培养基中反复传代。例如，为了将以依赖饲养细胞的状态生长的ES细胞(R1细胞系)驯化为不依赖饲养细胞的状态，需要以大约5×10⁴个细胞/cm³的细胞密度接种并且添加浓度为1×10⁴U/ml的LIF。然而，通过以500个细胞/cm²的细胞密度将ES细胞接种于E-cad-Fc平板并且用含有1×10³U/mlLIF的培养基传代，可以将ES细胞驯化为如先前技术中的不依赖饲养细胞的状态。还证实，以该方式制备的ES细胞充分保持了它们的未分化状态和多能性。

实施例4：对在E-cad-Fc平板上所培养ES细胞的分化能力的分析

已证实，在E-cad-Fc平板上经多次传代的ES细胞仍具有多能性。在无LIF的条件下悬浮培养ES细胞以形成胚样体(EB)，并且基于数个分化标志基因的表达分析自发分化的进程。具体而言，为了从ES细胞形成EB，将已在E-cad-Fc平板上传代至少3次的ES细胞回收成为单个细胞，随后在15μl无LIF的ESM中准备用于悬滴培养的含有500个细胞的液滴。定期收集在悬滴培养中所形成的EB并且通过与如上所述相同的方法进行RNA制备和cDNA合成。用这种cDNA作为模板，使用如下用于扩增每种标志基因片段的引物实施RT-PCR。

NeuroD3[扩增大小：405bp]

5′-引物：5′-CATCTCTGATCTCGACTGC-3′(SEQ ID NO：11)

3′-引物：5′-CCAGATGTAGTTGTAGGCG-3′(SEQ ID NO：12)

Sox-1[扩增大小：407bp]

5′-引物：5′-GCACACAGCGTTTTCTCGG-3′(SEQ ID NO：13)

3′-引物：5′-ACATCCGACTCCTCTTCCC-3′(SEQ ID NO：14)

T/Brachyury[扩增大小：528bp]

5′-引物：5′-TCCAGGTGCTATATATTGCC-3′(SEQ ID NO：15)

3′-引物：5′-TGCTGCCTGTGAGTCACAAC-3′(SEQ ID NO：16)

Flk-1[扩增大小：398bp]

5′-引物：5′-TAGGTGCCTCCCCATACCCTGG-3′(SEQ ID NO：17)

3′-引物：5′-TGGCCGGCTCTTTCGCTTACTG-3′(SEQ ID NO：18)

血红蛋白[扩增大小：415bp]

5′-引物：5′-AACCCTCAATGGCCTGTGG-3′(SEQ ID NO：19)

3′-引物：5′-TCAGTGGTACTTGTGGGACAGC-3′(SEQ ID NO：20)

甲胎蛋白[扩增大小：997bp]

5′-引物：5′-TGCTCAGTACGACAAGGTCG-3′(SEQ ID NO：21)

3′-引物：5′-ACTGGTGATGCATAGCCTCC-3′(SEQ ID NO：22)

运甲状腺素蛋白[扩增大小：440bp]

5′-引物：5′-AGTCCTGGATGCTGTCCGAG-3′(SEQ ID NO：23)

3′-引物：5′-TCAGAGGTCGGGCAGCCCAGC-3′(SEQ ID NO：24)

结果示于图7。当为了从在普通明胶平板上培养的ES细胞诱导EB的自发分化而从培养基中移走LIF之后，观察到包括外胚层(NeuroD3、Sox-1)、中胚层(T/Brachyury、Flk-1、血红蛋白)和内胚层(甲胎蛋白、运甲状腺素蛋白)在内的三个胚层中的特异性标志基因的表达。甚至对于在E-cad-Fc平板上培养的ES细胞，证实全部三个胚层的标志基因表达水平与明胶平板组的标志基因表达水平大致相同。

随后分析ES细胞分化为神经元和心肌细胞的能力。据报道，将ES细胞与饲养细胞(为预先在培养平板上接种的基质细胞)共同培养可诱导ES细胞分化为神经元和/或心肌细胞(Yamane等，Methods Mol.Biol.184：261，2002；Schroeder等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：4018，2003)。因此，在使用PA6细胞的分化系统内分析ES细胞分化为神经元的能力，并且在使用ST2细胞的分化系统内分析ES细胞分化为心肌细胞的能力。为了用作饲养细胞，将PA6细胞或ST2细胞(均从RIKEN细胞库得到)接种于6孔细胞培养平板(CORNING)并使用含有10％FBS的DMEM(Invitrogen)培养基培养至汇合。随后制备ES细胞的单细胞的培养物，并且用PBS洗涤饲养细胞两次，以每孔2000个细胞接种。在第二天，将培养基替换成含20％ KnockOut Serum Replacement(Invitrogen)的ESM(对于神经分化系统(PA6饲养细胞))或含10％FBS的ESM(对于心肌分化系统(ST2饲养细胞))。在培养第12天，将细胞用70％乙醇溶液固定并且与作为一级抗体的抗微管相关蛋白-2(MAP-2)抗体(AB5622；Chemicon)或抗肌节肌球蛋白抗体(MF20；美国典型培养物保藏中心)反应，随后与辣根过氧化物酶标记的二级抗体(Histofine Simple Stain PO(R)或PO(M)；Nichirei Biosciences)反应，最后使用ACE(3-氨基-9-乙基咔唑)底物溶液(Nichirei Bioscience)进行显色反应，此后用光学显微镜观察。结果示于图8。

当在普通明胶平板上培养的ES细胞在这些培养条件下接种于PA6细胞上时，在数天的培养期间形成肉眼可观察大小的集落，并且在培养的第7天左右，发生了形态学改变，分化的细胞具有清晰的神经突结构。细胞对神经元标志-MAP-2呈强阳性，表明该ES细胞已经分化成神经元。在ST2细胞上接种的ES细胞从培养第12天开始形成了表现自主博动的细胞集落，该细胞集落对心肌细胞标志-肌节肌球蛋白呈强阳性，这清楚地说明该ES细胞已经分化成心肌细胞。当使用在E-cad-Fc平板上培养的ES细胞时，也证实了其向神经元和心肌细胞的分化，这与对照组类似。这些实验结果表明，在E-cad-Fc平板上培养的ES细胞保留了其体外多能性。

随后分析ES细胞形成畸胎瘤的能力。畸胎瘤是包含来自三个胚层-内胚层、中胚层和外胚层的胎儿组织和成熟组织的肿瘤，该肿瘤在将ES细胞移植到动物如小鼠体内后形成，并且畸胎瘤形成能力被用作ES细胞多能性的一个指标。

将ES细胞(EB3细胞系)接种于明胶平板和E-cad-Fc平板并且每3天传代5次。通过常规方法将ES细胞注入Balb/c裸鼠的卵巢内(每只鼠大约200个细胞)，并且在60天，在全部ES细胞移植试验中均发现形成畸胎瘤，肿瘤大小在明胶平板培养组和E-cad-Fc平板培养组之间无显著差异。同时，通过一般方法制备组织切片并进行组织学观察，发现两个组中的畸胎瘤均形成了外胚层组织/细胞包括表皮样组织和不同神经元标志(βIII微管蛋白、GFAP、神经丝M、GAP-43)呈阳性的神经元、中胚层组织/细胞(包括骨、软骨和骨骼肌样组织)以及内胚层组织/细胞(包括肠道和气管上皮样组织)，因此证实，在E-cad-Fc平板上培养的ES细胞保持了畸胎瘤形成能力。

实施例5：对在E-cad-Fc平板上培养的ES细胞的嵌合体形成能力的分析

确定了在E-cad-Fc平板上经多次传代的ES细胞是否保留了嵌合体形成能力。将与已证实具有嵌合体形成能力的冷冻贮藏物同一批的细胞得到ES细胞(EB3细胞系)，并接种于明胶平板和E-cad-Fc平板，每3天传代5次。通过常规方法将ES细胞注入C57BL/6小鼠胚泡(每个胚泡大约100个细胞)，将这些胚泡移植至假孕ICR小鼠(8-10周龄)的子宫内，最终实现分娩。C57BL/6小鼠的正常毛色为黑色，但是某些新生个体在身体的一部分具有从ES细胞衍生的野灰色毛发(5-8％)；从明胶平板上所培养的ES细胞中总共获得四只这种嵌合小鼠，并且从E-cad-Fc平板上所培养的ES细胞中总共获得7只嵌合小鼠。

为证实ES细胞所衍生的被毛颜色可传递至下一代，随后将这种嵌合小鼠与正常ICR小鼠交配，产生后代。从通过移植在E-cad-Fc平板上培养的ES细胞所产生的两只雄性嵌合小鼠分别得到了14只和17只幼仔，在表现出C57BL/6小鼠(其胚泡作为宿主)被毛颜色的个体中，分别有5只和6只表现出从ES细胞衍生的被毛颜色。对小鼠的种系特异性微卫星标志分析证实，这些个体具有从ES细胞衍生的基因型(图9)。具体地，通过常规方法从每一幼年个体中得到基因组DNA，并且检测了4个微卫星标志D4Mit72、D4Mit116、D7Mit276和D10Mit186，以便在基因上区别从ES细胞衍生的129SV小鼠和用于产生嵌合小鼠和杂交的C57BL/6小鼠。结果显示，在根据被毛颜色认为ES细胞未产生遗传性贡献的个体中(照片中的#1-#4)，全部微卫星标志模式与C57BL/6小鼠相同。另一方面，根据被毛颜色认为ES细胞产生了遗传性贡献的个体中(照片中的#5-#8)，既发现了C57BL/6小鼠微卫星标志模式，也发现了ES细胞特异性为卫星标志模式，从而证实ES细胞基因已经传递至这些个体。

实施例6：对在E-cad-Fc平板上所培养ES细胞的基因转移率的分析

为了向在明胶平板和E-cad-Fc平板上培养3天的ES细胞转移GFP表达载体pEGFP-N2(Clontech)，使用了借助Lipofectamine2000(Invitrogen)的常规方法。次日回收单个细胞，并在96孔平板中再次接种。4小时后，用8％福尔马林溶液固定已黏着的ES细胞10分钟，随后用0.2％TritonX-100/PBS溶液和Image-iT FX信号增强剂(Invitrogen)处理。在用PBS洗涤并与抗GFP单克隆抗体(Nacalai Tesque)反应后，使用Alexa Fluor 546标记的抗大鼠IgG抗体染色。细胞核用DAPI溶液(0.1μg/ml)染色。抗体和染料染色图像使用ArrayScan^TM系统(Cellomics)观察。结果表明，E-cad-Fc平板培养组中GFP表达显著高于普通平板培养组，表明与普通培养的ES细胞相比，在E-cad-Fc平板上培养的ES细胞具有更高的基因转移效率和/或表达效率(见图10)。

实施例7：人E-cad-Fc蛋白质的制备及可用性分析

为了构建表达人E-钙黏着蛋白细胞外区域和IgG/Fc融合蛋白(以下称作hE-cad-Fc)的载体，使用来自人鳞状细胞癌细胞系A431的cDNA作为扩增编码人E-钙黏着蛋白细胞外结构域(hE-Cad-ECD)的DNA片段(对应于氨基酸残基1-697)的模板。在证实核苷酸序列后，将该DNA片段插入含有在实施例1中所提到的IgG/Fc序列的表达载体中，以便构建pRC-hE-cad-Fc。根据在实施例1中所描述的方法完成hE-cad-Fc载体的构建和纯化。

在hE-cad-Fc蛋白质包被的细胞培养平板(以下称为“hE-cad-Fc平板”)上分析小鼠ES细胞的黏着和增殖。制备hE-cad-Fc平板的方法与如上实施例2中所述相同。具体地，向未处理的聚苯乙烯培养平板内倒入以PBS稀释的hE-cad-Fc蛋白质溶液并且在37℃包被处理过夜，用作hE-cad-Fc平板。当在这种平板内接种ES细胞(EB3细胞系和R1细胞系)时，表现出如同使用小鼠E-cad-Fc蛋白质包被平板时所表现出的强烈黏着。此外，在hE-cad-Fc平板上接种的ES细胞甚至在接种2天或3天后也没有形成清晰的集落，并且观察到单个细胞处于分散状态以及活跃增殖状态(图11)。如同使用小鼠E-cad-Fc平板一样，ES细胞的未分化状态和多能性也得以维持。

工业应用性

通过使用本发明的增殖方法，可以高效且大量地产生多能干细胞，如ES细胞，而无需使用饲养细胞。此外，由于多能干细胞可以在分散的状态下培养，因此细胞传代和回收十分方便。还可以减少向液体培养基中添加的因子如LIF的数量。此外，本发明的方法允许向多能干细胞如ES细胞中高效转移目的基因，并使其高水平表达。以这种方式所产生的多能干细胞可用于多种类型功能分化细胞(通过应用已知的适宜诱导分化系统)的产生，并且可用于多种药理学活性物质或未知功能的新基因产物的药理学评估或者活性评估。

序列表

<110>第一阿斯比奥制药株式会社

<120>多能干细胞的增殖方法

<130>DSTY-R678/PCT(fP05-02WO-1)

<160>24

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>882

<212>PRT

<213>人E-钙黏附蛋白

<220>

<221>结构域

<222>(157)..(262)

<223>EC1

<220>

<221>结构域

<222>(265)..(375)

<223>EC2

<220>

<221>结构域

<222>(378)..(486)

<223>EC3

<220>

<221>结构域

<222>(487)..(595)

<223>EC4

<220>

<221>结构域

<222>(596)..(700)

<223>EC5

<400>1

Met Gly Pro Trp Ser Arg Ser Leu Ser Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gln

1 5 10 15

Val Ser Ser Trp Leu Cys Gln Glu Pro Glu Pro Cys His Pro Gly Phe

20 25 30

Asp Ala Glu Ser Tyr Thr Phe Thr Val Pro Arg Arg His Leu Glu Arg

35 40 45

Gly Arg Val Leu Gly Arg Val Asn Phe Glu Asp Cys Thr Gly Arg Gln

50 55 60

Arg Thr Ala Tyr Phe Ser Leu Asp Thr Arg Phe Lys Val Gly Thr Asp

65 70 75 80

Gly Val Ile Thr Val Lys Arg Pro Leu Arg Phe His Asn Pro Gln Ile

85 90 95

His Phe Leu Val Tyr Ala Trp Asp Ser Thr Tyr Arg Lys Phe Ser Thr

100 105 110

Lys Val Thr Leu Asn Thr Val Gly His His His Arg Pro Pro Pro His

115 120 125

Gln Ala Ser Val Ser Gly Ile Gln Ala Glu Leu Leu Thr Phe Pro Asn

130 135 140

Ser Ser Pro Gly Leu Arg Arg Gln Lys Arg Asp Trp Val Ile Pro Pro

145 150 155 160

Ile Ser Cys Pro Glu Asn Glu Lys Gly Pro Phe Pro Lys Asn Leu Val

165 170 175

Gln Ile Lys Ser Asn Lys Asp Lys Glu Gly Lys Val Phe Tyr Ser Ile

180 185 190

Thr Gly Gln Gly Ala Asp Thr Pro Pro Val Gly Val Phe Ile Ile Glu

195 200 205

Arg Glu Thr Gly Trp Leu Lys Val Thr Glu Pro Leu Asp Arg Glu Arg

210 215 220

Ile Ala Thr Tyr Thr Leu Phe Ser His Ala Val Ser Ser Asn Gly Asn

225 230 235 240

Ala Val Glu Asp Pro Met Glu Ile Leu Ile Thr Val Thr Asp Gln Asn

245 250 255

Asp Asn Lys Pro Glu Phe Thr Gln Glu Val Phe Lys Gly Ser Val Met

260 265 270

Glu Gly Ala Leu Pro Gly Thr Ser Val Met Glu Val Thr Ala Thr Asp

275 280 285

Ala Asp Asp Asp Val Asn Thr Tyr Asn Ala Ala Ile Ala Tyr Thr Ile

290 295 300

Leu Ser Gln Asp Pro Glu Leu Pro Asp Lys Asn Met Phe Thr Ile Asn

305 310 315 320

Arg Asn Thr Gly Val Ile Ser Val Val Thr Thr Gly Leu Asp Arg Glu

325 330 335

Ser Phe Pro Thr Tyr Thr Leu Val Val Gln Ala Ala Asp Leu Gln Gly

340 345 350

Glu Gly Leu Ser Thr Thr Ala Thr Ala Val Ile Thr Val Thr Asp Thr

355 360 365

Asn Asp Asn Pro Pro Ile Phe Asn Pro Thr Thr Tyr Lys Gly Gln Val

370 375 380

Pro Glu Asn Glu Ala Asn Val Val Ile Thr Thr Leu Lys Val Thr Asp

385 390 395 400

Ala Asp Ala Pro Asn Thr Pro Ala Trp Glu Ala Val Tyr Thr Ile Leu

405 410 415

Asn Asp Asp Gly Gly Gln Phe Val Val Thr Thr Asn Pro Val Asn Asn

420 425 430

Asp Gly Ile Leu Lys Thr Ala Lys Gly Leu Asp Phe Glu Ala Lys Gln

435 440 445

Gln Tyr Ile Leu His Val Ala Val Thr Asn Val Val Pro Phe Glu Val

450 455 460

Ser Leu Thr Thr Ser Thr Ala Thr Val Thr Val Asp Val Leu Asp Val

465 470 475 480

Asn Glu Ala Pro Ile Phe Val Pro Pro Glu Lys Arg Val Glu Val Ser

485 490 495

Glu Asp Phe Gly Val Gly Gln Glu Ile Thr Ser Tyr Thr Ala Gln Glu

500 505 510

Pro Asp Thr Phe Met Glu Gln Lys Ile Thr Tyr Arg Ile Trp Arg Asp

515 520 525

Thr Ala Asn Trp Leu Glu Ile Asn Pro Asp Thr Gly Ala Ile Ser Thr

530 535 540

Arg Ala Glu Leu Asp Arg Glu Asp Phe Glu His Val Lys Asn Ser Thr

545 550 555 560

Tyr Thr Ala Leu Ile Ile Ala Thr Asp Asn Gly Ser Pro Val Ala Thr

565 570 575

Gly Thr Gly Thr Leu Leu Leu Ile Leu Ser Asp Val Asn Asp Asn Ala

580 585 590

Pro Ile Pro Glu Pro Arg Thr Ile Phe Phe Cys Glu Arg Asn Pro Lys

595 600 605

Pro Gln Val Ile Asn Ile Ile Asp Ala Asp Leu Pro Pro Asn Thr Ser

610 615 620

Pro Phe Thr Ala Glu Leu Thr His Gly Ala Ser Ala Asn Trp Thr Ile

625 630 635 640

Gln Tyr Asn Asp Pro Thr Gln Glu Ser Ile Ile Leu Lys Pro Lys Met

645 650 655

Ala Leu Glu Val Gly Asp Tyr Lys Ile Asn Leu Lys Leu Met Asp Asn

660 665 670

Gln Asn Lys Asp Gln Val Thr Thr Leu Glu Val Ser Val Cys Asp Cys

675 680 685

Glu Gly Ala Ala Gly Val Cys Arg Lys Ala Gln Pro Val Glu Ala Gly

690 695 700

Leu Gln Ile Pro Ala Ile Leu Gly Ile Leu Gly Gly Ile Leu Ala Leu

705 710 715 720

Leu Ile Leu Ile Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Arg Arg Arg Ala Val

725 730 735

Val Lys Glu Pro Leu Leu Pro Pro Glu Asp Asp Thr Arg Asp Asn Val

740 745 750

Tyr Tyr Tyr Asp Glu Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp Gln Asp Phe Asp

755 760 765

Leu Ser Gln Leu His Arg Gly Leu Asp Ala Arg Pro Glu Val Thr Arg

770 775 780

Asn Asp Val Ala Pro Thr Leu Met Ser Val Pro Arg Tyr Leu Pro Arg

785 790 795 800

Pro Ala Asn Pro Asp Glu Ile Gly Asn Phe Ile Asp Glu Asn Leu Lys

805 810 815

Ala Ala Asp Thr Asp Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp Ser Leu Leu Val

820 825 830

Phe Asp Tyr Glu Gly Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ser Leu Ser Ser Leu

835 840 845

Asn Ser Ser Glu Ser Asp Lys Asp Gln Asp Tyr Asp Tyr Leu Asn Glu

850 855 860

Trp Gly Asn Arg Phe Lys Lys Leu Ala Asp Met Tyr Gly Gly Gly Glu

865 870 875 880

Asp Asp

<210>2

<211>884

<212>PRT

<213>小鼠E-钙黏附蛋白

<220>

<221>结构域

<222>(159)..(264)

<223>EC1

<220>

<221>结构域

<222>(267)..(377)

<223>EC2

<221>结构域

<222>(380)..(488)

<223>EC3

<220>

<221>结构域

<222>(489)..(597)

<223>EC4

<220>

<221>结构域

<222>(598)..(702)

<223>EC5

<400>2

Met Gly Ala Arg Cys Arg Ser Phe Ser Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gln

1 5 10 15

Val Ser Ser Trp Leu Cys Gln Glu Leu Glu Pro Glu Ser Cys Ser Pro

20 25 30

Gly Phe Ser Ser Glu Val Tyr Thr Phe Pro Val Pro Glu Arg His Leu

35 40 45

Glu Arg Gly His Val Leu Gly Arg Val Arg Phe Glu Gly Cys Thr Gly

50 55 60

Arg Pro Arg Thr Ala Phe Phe Ser Glu Asp Ser Arg Phe Lys Val Ala

65 70 75 80

Thr Asp Gly Thr Ile Thr Val Lys Arg His Leu Lys Leu His Lys Leu

85 90 95

Glu Thr Ser Phe Leu Val Arg Ala Arg Asp Ser Ser His Arg Glu Leu

100 105 110

Ser Thr Lys Val Thr Leu Lys Ser Met Gly His His His His Arg His

115 120 125

His His Arg Asp Pro Ala Ser Glu Ser Asn Pro Glu Leu Leu Met Phe

130 135 140

Pro Ser Val Tyr Pro Gly Leu Arg Arg Gln Lys Arg Asp Trp Val Ile

145 150 155 160

Pro Pro Ile Ser Cys Pro Glu Asn Glu Lys Gly Glu Phe Pro Lys Asn

165 170 175

Leu Val Gln Ile Lys Ser Asn Arg Asp Lys Glu Thr Lys Val Phe Tyr

180 185 190

Ser Ile Thr Gly Gln Gly Ala Asp Lys Pro Pro Val Gly Val Phe Ile

195 200 205

Ile Glu Arg Glu Thr Gly Trp Leu Lys Val Thr Gln Pro Leu Asp Arg

210 215 220

Glu Ala Ile Ala Lys Tyr Ile Leu Tyr Ser His Ala Val Ser Ser Asn

225 230 235 240

Gly Glu Ala Val Glu Asp Pro Met Glu Ile Val Ile Thr Val Thr Asp

245 250 255

Gln Asn Asp Asn Arg Pro Glu Phe Thr Gln Pro Val Phe Glu Gly Phe

260 265 270

Val Ala Glu Gly Ala Val Pro Gly Thr Ser Val Met Lys Val Ser Ala

275 280 285

Thr Asp Ala Asp Asp Asp Val Asn Thr Tyr Asn Ala Ala Ile Ala Tyr

290 295 300

Thr Ile Val Ser Gln Asp Pro Glu Leu Pro His Lys Asn Met Phe Thr

305 310 315 320

Val Asn Arg Asp Thr Gly Val Ile Ser Val Leu Thr Ser Gly Leu Asp

325 330 335

Arg Glu Ser Tyr Pro Thr Tyr Thr Leu Val Val Gln Ala Ala Asp Leu

340 345 350

Gln Gly Glu Gly Leu Ser Thr Thr Ala Lys Ala Val Ile Thr Val Lys

355 360 365

Asp Ile Asn Asp Asn Ala Pro Val Phe Asn Pro Ser Thr Tyr Gln Gly

370 375 380

Gln Val Pro Glu Asn Glu Val Asn Ala Arg Ile Ala Thr Leu Lys Val

385 390 395 400

Thr Asp Asp Asp Ala Pro Asn Thr Pro Ala Trp Lys Ala Val Tyr Thr

405 410 415

Val Val Asn Asp Pro Asp Gln Gln Phe Val Val Val Thr Asp Pro Thr

420 425 430

Thr Asn Asp Gly Ile Leu Lys Thr Ala Lys Gly Leu Asp Phe Glu Ala

435 440 445

Lys Gln Gln Tyr Ile Leu His Val Arg Val Glu Asn Glu Glu Pro Phe

450 455 460

Glu Gly Ser Leu Val Pro Ser Thr Ala Thr Val Thr Val Asp Val Val

465 470 475 480

Asp Val Asn Glu Ala Pro Ile Phe Met Pro Ala Glu Arg Arg Val Glu

485 490 495

Val Pro Glu Asp Phe Gly Val Gly Gln Glu Ile Thr Ser Tyr Thr Ala

500 505 510

Arg Glu Pro Asp Thr Phe Met Asp Gln Lys Ile Thr Tyr Arg Ile Trp

515 520 525

Arg Asp Thr Ala Asn Trp Leu Glu Ile Asn Pro Glu Thr Gly Ala Ile

530 535 540

Phe Thr Arg Ala Glu Met Asp Arg Glu Asp Ala Glu His Val Lys Asn

545 550 555 560

Ser Thr Tyr Val Ala Leu Ile Ile Ala Thr Asp Asp Gly Ser Pro Ile

565 570 575

Ala Thr Gly Thr Gly Thr Leu Leu Leu Val Leu Leu Asp Val Asn Asp

580 585 590

Asn Ala Pro Ile Pro Glu Pro Arg Asn Met Gln Phe Cys Gln Arg Asn

595 600 605

Pro Gln Pro His Ile Ile Thr Ile Leu Asp Pro Asp Leu Pro Pro Asn

610 615 620

Thr Ser Pro Phe Thr Ala Glu Leu Thr His Gly Ala Ser Val Asn Trp

625 630 635 640

Thr Ile Glu Tyr Asn Asp Ala Ala Gln Glu Ser Leu Ile Leu Gln Pro

645 650 655

Arg Lys Asp Leu Glu Ile Gly Glu Tyr Lys Ile His Leu Lys Leu Ala

660 665 670

Asp Asn Gln Asn Lys Asp Gln Val Thr Thr Leu Asp Val His Val Cys

675 680 685

Asp Cys Glu Gly Thr Val Asn Asn Cys Met Lys Ala Gly Ile Val Ala

690 695 700

Ala Gly Leu Gln Val Pro Ala Ile Leu Gly Ile Leu Gly Gly Ile Leu

705 710 715 720

Ala Leu Leu Ile Leu Ile Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Arg Arg Arg

725 730 735

Thr Val Val Lys Glu Pro Leu Leu Pro Pro Asp Asp Asp Thr Arg Asp

740 745 750

Asn Val Tyr Tyr Tyr Asp Glu Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp Gln Asp

755 760 765

Phe Asp Leu Ser Gln Leu His Arg Gly Leu Asp Ala Arg Pro Glu Val

770 775 780

Thr Arg Asn Asp Val Ala Pro Thr Leu Met Ser Val Pro Gln Tyr Arg

785 790 795 800

Pro Arg Pro Ala Asn Pro Asp Glu Ile Gly Asn Phe Ile Asp Glu Asn

805 810 815

Leu Lys Ala Ala Asp Ser Asp Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp Ser Leu

820 825 830

Leu Val Phe Asp Tyr Glu Gly Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ser Leu Ser

835 840 845

Ser Leu Asn Ser Ser Glu Ser Asp Gln Asp Gln Asp Tyr Asp Tyr Leu

850 855 860

Asn Glu Trp Gly Asn Arg Phe Lys Lys Leu Ala Asp Met Tyr Gly Gly

865 870 875 880

Gly Glu Asp Asp

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>Oct-3/4，528bp大小，5’引物

<400>3

gaagttggag aaggtggaac c 21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>Oct-3/4，528bp大小，3’引物

<400>4

gcctcatact cttctcgttg g 21

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>Rex1，930bp大小，5’引物

<400>5

aaagtgagat tagccccgag 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>Rex1，930bp大小，3’引物

<400>6

tcccatcccc ttcaatagca 20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>Nanog，930bp大小，5’引物

<400>7

gaggaagcat cgaattctgg 20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>Nanog，930bp大小，3’引物

<400>8

aagt tatgga gcggagcagc 20

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>GAPDH，858bp大小，5’引物

<400>9

ggaagcttgt catcaacgg 19

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>GAPDH，858bp大小，3’引物

<400>10

ctcttgctca gtgtccttgc 20

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>NeuroD3，405bp大小，5’引物

<400>11

catctctgat ctcgactgc 19

<210>12

<211>19

<212>DNA

<213>NeuroD3，405bp大小，3’引物

<400>12

ccagatgtag ttgtaggcg 19

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>Sox1，407bp大小，5’引物

<400>13

gcacacagcg ttttctcgg 19

<210>14

<211>19

<212>DNA

<213>Sox1，407bp大小，3’引物

<400>14

acatccgact cctcttccc 19

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>T/Brachyury，528bp大小，5’引物

<400>15

tccaggtgct atatattgcc 20

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>T/Brachyury，528bp大小，3’引物

<400>16

tgctgcctgt gagtcacaac 20

<210>17

<211>22

<212>DNA

<213>Flk1，398bp大小，5’引物

<400>17

taggtgcctc cccataccct gg 22

<210>18

<211>22

<212>DNA

<213>Flk1，398bp大小，3’引物

<400>18

tggccggctc tttcgcttac tg 22

<210>19

<211>19

<212>DNA

<213>β-H1，415bp大小，5’引物

<400>19

aaccctcaat ggcctgtgg 19

<210>20

<211>22

<212>DNA

<213>β-H1，415bp大小，3’引物

<400>20

tcagtggtac ttgtgggaca gc 22

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>甲胎蛋白，997bp大小，5’引物

<400>21

tgctcagtac gacaaggtcg 20

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>甲胎蛋白，997bp大小，3’引物

<400>22

actggtgatg catagcctcc 20

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>运甲状腺素蛋白，440bp大小，5’引物

<400>23

agtcctggat gctgtccgag 20

<210>24

<211>21

<212>DNA

<213>运甲状腺素蛋白，440bp大小，3’引物

<400>24

tcagaggtcg ggcagcccag c 21

Claims

1.用于多能干细胞的增殖方法，其特征在于，使用液体培养基和在基质固相表面固定化或包被可黏着所述多能干细胞的分子的培养容器，而不使用饲养细胞，使所述多能干细胞在分散状态下增殖而同时保留了其未分化状态和多能性。

2.用于多能干细胞的基因转移方法，其特征在于，使用液体培养基和在基质固相表面固定化或包被可黏着所述多能干细胞的分子的培养容器，而不使用饲养细胞。

3.权利要求1或2所述的方法，其中可黏着所述多能干细胞的分子是由所述多能干细胞表达的分子，或者是在结构上与该分子同源并对该多能干细胞具有嗜同性结合能力的分子。

4.权利要求3所述的方法，其中可黏着所述多能干细胞的分子是属于钙黏着蛋白家族的分子。

5.权利要求4所述的方法，其中所述的属于钙黏着蛋白家族的分子是E-钙黏着蛋白，或者在结构上与所述分子同源、包含E-钙黏着蛋白EC1结构域和来自EC2结构域、EC3结构域、EC4结构域和EC5结构域中的一个或多个结构域、并且对所述多能干细胞具有嗜同性结合能力的分子。

6.权利要求5所述的方法，其中所述的E-钙黏着蛋白源自哺乳动物。

7.权利要求6所述的方法，其中所述的E-钙黏着蛋白源自人或小鼠。

8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中可黏着所述多能干细胞的分子与免疫球蛋白Fc区域融合并且通过该Fc区域固定化于所述基质固相表面。

9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述的多能干细胞是哺乳动物胚胎干细胞(ES细胞)或胚胎生殖细胞(EG细胞)。

10.通过权利要求1-9中任一项所述方法产生的多能干细胞。