CN1599749A - 促进细胞粘附、生长和分泌的肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供被鉴定为具有细胞粘附、生长、表达或分泌增强活性的特殊的肽。可采用诸如化学合成或重组DNA技术之类的方法大量制备本发明的许多肽。它们可以非特异性吸附、或化学结合于表面上，或者，它们可被配制到培养基中，以对培养的细胞产生所需的作用。

Description

促进细胞粘附、生长和分泌的肽
                           发明背景
1.发明领域
本发明涉及影响培养的细胞生物学活性的肽。具体而言，本发明涉及影响细胞的粘附、生长或分泌的特殊的肽。
2.相关技术描述
从19世纪晚期起，组织和蛋白水解产物已被常规地用作细胞培养基中的肽来源。它们是目前细菌学中使用的最常见的成分不明确的培养基，并常常用于代替哺乳动物培养中的血清(S.Saha和A.Sen.，Aptavirol，33：338-343，1989)。水解产物和血清并不是用于培养基的肽的最佳来源。此外，它们的组成不明确，每批都不相同，并且可能隐藏病原体如BSE。
已认识到，与其组分氨基酸相比，肽通常是用于细胞培养基的优选营养物。已努力采取了几种方法来确定哪些具体的肽可被细胞培养物利用，作为鉴定影响细胞生长或其它一些生物学活性的成分确定的肽的工具。例如，肽合成技术的最新进展使得筛选能增强培养基的大量化合物(不论是作为单独的成分确定的序列，还是作为肽文库中多种序列的混合物)成为可能。文库方法提供筛选更多的在细胞培养中具有所需生物学效果的肽序列的机会。一旦鉴定出具有所需生物学活性的肽序列，就可以大量地生产，如采用化学合成或重组DNA方法进行。接着，可通过将肽包被在表面或使其游离于培养基溶液中而包含在培养系统中。两种方式都能对培养细胞产生所需的效果。
细胞与胞外基质成分体内相互作用的能力涉及几种重要的生物学过程，包括细胞生长、迁移和分化。而且，依赖贴壁细胞必须先粘附于表面方能表面可能成功的进行细胞培养。具体是，细胞在固体基质上的粘附、扩展和收缩活性(contract)的能力对于正常的依赖贴壁细胞在体外的生长而言是必须具备的(Grinnell，F.，Psychology，53：67-149，1978和Couchman等，J.Cell Biol.，93：402-410，1982)。细胞粘附到表面的能力受到许多因素的影响，包括所使用的细胞培养基、具体的细胞类型以及细胞于其上培养的具体表面。当最终目标是在上清液中聚集产物、以及培养细胞是粘附型细胞时，在首先优化粘附和生长、接着优化表达和最终的分泌的条件下，通常会获得最佳的结果。
通常在聚合物表面上培养哺乳动物细胞。具体而言，粘附于合成性聚合物表面的所有哺乳动物细胞都受控于粘附性蛋白质，并且是受体介导的。例如，纤连蛋白是胞外基质的一种蛋白质组分，已显示其参与了哺乳动物细胞类型对组织培养基质的粘附(Pearlstein，E.，Nature，262：497-500，和Kleinman等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，72：426-432，1976)。纤连蛋白帮助细胞粘附的能力已定位于一种三聚体序列(RGD)，该序列位于纤连蛋白的细胞结合结构域中。
关于细胞培养基质和其它表面促进细胞粘附的作用，已知在将蛋白质溶液放置于组织培养基质上后，蛋白质立即吸附到该培养基质的表面上。倘若在细胞表面上存在被吸附的一些蛋白质的受体，且如果被吸附的蛋白质的构象不因吸附而发生大程度的变化以至于破坏配体-受体亲合力，则细胞可粘附于培养基质并发生扩散。
进一步参考细胞培养基质和其它表面在允许细胞粘附的作用，如果在缺乏被吸附的蛋白质的情况下将细胞接种在培养基质上，则存在于细胞表面上的蛋白质可能直接吸附于该表面，而且，如果存在合适的条件的话，细胞将以胞外基质的形式向该表面分泌蛋白质。但是，已知培养中的细胞除了通过中介的吸附蛋白质以外，它们从不直接接触表面。
已提出，为了促进细胞与表面的短时粘附，可使特殊的肽吸附于聚合物表面上。例如，Singer等提出，含有上述RGD序列的13-聚体肽吸附于聚合物基底能促进细胞粘附(Singer等，J.Cell.Bio.，104：573-584，1987)。使用此长度肽的缺点是，这类肽在高温下(如细胞培养过程中使用的温度)非常容易降解，且非常容易受到培养细胞自身的蛋白水解作用的影响。
使肽粘附于表面以促进细胞粘附的另一选择是，通过共价修饰使肽化学连接于表面。例如，Brandly等(Analytical Biochemistry，173：270，1988)提出，聚合物基底上包含9-聚体肽可促进细胞粘附。虽然此方法可促进细胞粘附，但是它需要高浓度的肽来促进细胞粘附达到可接受的水平。由于制备合成肽的成本高，因此，将肽掺入大量的聚合物中对细胞培养基质的商品化并不经济。
还已知，可使用具有少于12个氨基酸残基、含有下述氨基酸序列之一的肽衍生处理表面：GRGD(SEQ ID NO：71)、GYIGSR(SEQ ID NO：72)、GREDV(SEQ ID NO：73)。已进一步报道这些肽含有最小的细胞表面受体识别序列，例如RGD(SEQ ID NO：74)、YIGSR(SEQ ID NO：75)或REDV(SEQ IDNO：76)，可使得细胞能通过细胞受体介导的支持粘附于处理的表面上。较佳是通过将被植入表面的肽的末端伯胺和该聚合物表面上的活性基团的反应而将肽连接于表面。此方法的缺点是，该表面在被肽衍生化之前，首先必须被活化。用于活化表面的方法可能费时，并可能涉及对细胞有毒性的试剂，需要在用肽进行修饰之前和衍生化表面培养细胞之前彻底清洗该表面。此外，肽固定的效率高度依赖于之前的聚合物衍生方法。肽浓度的最终范围及其在表面上的取向受到限制。
因此，本领域需要发现其它用于修饰表面、以促进细胞粘附和生长的小肽，这些肽是热稳定的，并对细胞蛋白酶或蛋白酶如胰蛋白酶(常加入这些蛋白酶，以从组织培养基质中除去粘附型的哺乳动物细胞)的蛋白水解具有抗性。还需要所述小肽对脱吸附效果具有抗性，但不需要共价固定于表面。
本领域还需要能提高表达和分泌的小肽。当靶药物是分泌性性时，常常选择粘附细胞系用于生产。施用固定细胞使得技术人员能容易地除去存在于上清液中并为细胞生长期必需的高分子量组分，然后用仅含有不与所述靶药物共纯化的低分子量物质的稳定培养基替换该上清液。不幸的是，这些稳定培养基常常使表达和分泌水平降低。因此，使用能增加分泌产物在组织培养肉汤中积聚的低分子量肽是有利的。
最后，需要能加速发现具有上述特征的培养基或培养环境成分的肽文库。使肽性能与物理特性匹配的能力将使肽种类的益处通过许多细胞类型和培养条件而得以传送。此外，这类肽将使得生物工程技术人员能快速鉴定到高性能的生物活性肽，将其作为稀有细胞如干细胞的培养基组分。
                           发明概述
本发明提供具有细胞生长和/或分泌增强性能的经鉴定的肽。采用如化学合成方法或通过重组DNA方法进行表达可大量生产具有这些增强性能的特殊肽，且，这些肽可吸附在细胞培养系统的表面上，或者，可配制到培养基中，以对培养细胞产生所需的效果。
具体而言，本发明提供能增强细胞培养系统中的细胞生长和/或分泌的肽，所述细胞培养系统含有以下至少一种结构：(a)xxxkx、(b)xxkxx、(c)xxxxk、(d)xkxxx和(e)kxxxx，其中，k代表赖氨酸，各x可以是相同或不同的氨基酸，独立选自赖氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸及其衍生物。
本发明还提供一种能增强细胞生长和/或分泌的肽，该肽含有以下至少一种结构：(a)xxxkx、(b)xxkxx、(c)xxxxk、(d)xkxxx和(e)kxxxx，其中，各x可以是相同或不同的疏水性或不带电的极性氨基酸残基，k代表赖氨酸。
具有促进粘附和/或生长活性的本发明的特殊肽包括具有选自以下氨基酸序列的肽：IFFKG(SEQ ID NO：1)、FIKFG(SEQ ID NO：2)、FIFAK(SEQ IDNO：3)、QVVAK(SEQ ID NO：4)、FKFIG(SEQ ID NO：5)、AFFKI(SEQ ID NO：6)、VFPFK(SEQ ID NO：7)、AKIFF(SEQ ID NO：8)、AFKIF(SEQ ID NO：9)、KFAFI(SEQ ID NO：10)和FAKFI(SEQ ID NO：11)及其组合。
本发明另一方面公开一种肽组合物，该组合物促进粘附型细胞在表面上的粘附和/或生长，该组合物包括一对或多对选自以下组的肽：(a)AFFFQ(SEQID NO：12)/EEEMY(SEQ ID NO：13)和(b)FIKLM(SEQ ID NO：14)/FFIPY(SEQ IDNO：15)。
具有增强分泌活性的本发明的特殊肽包括具有选自以下氨基酸序列的肽：FKLVY(SEQ ID NO：16)，KKKKK(SEQ ID NO：17)，KKKKL(SEQ ID NO：18)，FKKKQ(SEQ IDNO：19)，FKFIG(SEQ ID NO：5)，KKKSK(SEQ ID NO：20)，KKKLK(SEQ ID NO：21)，FKKKK(SEQ ID NO：22)，LKKKK(SEQ ID NO：23)，KKLKK(SEQ ID NO：24)，KKKKT(SEQID NO：25)，KKPKK(SEQ ID NO：26)，KKPQY(SEQ ID NO：27)，SKKKK(SEQ ID NO：28)，KVKKK(SEQ ID NO：29)，KNQTY(SEQ ID NO：30)，FKKKV(SEQ ID NO：31)，KPKKK(SEQID NO：32)，FFKKK(SEQ ID NO：33)，HKNQT(SEQ ID NO：34)，FKLVG(SEQ ID NO：35)，KKQPK(SEQ ID NO：36)，EKKQT(SEQ ID NO：37)，EKKKK(SEQ ID NO：38)，KKIKQ(SEQID NO：39)，KKKKS(SEQ ID NO：40)，KKQKK(SEQ ID NO：41)，KKLNY(SEQ ID NO：42)，DGKKT(SEQ ID NO：43)，KKPTT(SEQ ID NO：44)，KFIFG(SEQ ID NO：45)，FKKMY(SEQ IDNO：46)，FFFKK(SEQ ID NO：47)，KQKKI(SEQ ID NO：48)，HIKKK(SEQ ID NO：49)，DFFHK(SEQ ID NO：50)，AKKKK(SEQ ID NO：51)，AHIKK(SEQ ID NO：52)，AHKKK(SEQID NO：53)，LKLVY(SEQ ID NO：54)，PKQKK(SEQ ID NO：55)，AKKKT(SEQ ID NO：56)，DEETY(SEQ ID NO：57)，HNPPY(SEQ ID NO：58)，GGHMS(SEQ ID NO：59)，AADEG(SEQID NO：60)，GGGGS(SEQ ID NO：61)，EEGLS(SEQ ID NO：62)，HHPST(SEQ ID NO：63)，FHHNT(SEQ ID NO：64)，ADELN(SEQ ID NO：65)，KKKK(SEQ ID NO：66)，KKK(SEQ IDNO：67)，KK(SEQ ID NO：68)，OrnOrnOrn(SEQ ID NO：69)，RRR(SEQ ID NO：70)，以及它们的组合物。
本发明提供了细胞培养基质，该基质包括一种或多种由SEQ ID NO：1-11和SEQ ID NO：16-70代表的本发明肽。此外，本发明细胞培养基质可包括一对或多对上述经鉴定的(a)(SEQ ID NO：12)/(SEQ ID NO：13)和(b)(SEQ IDNO：14)/(SEQ ID NO：15)肽。
本发明还提供一种细胞或组织培养基，该培养基含有本发明上述肽或肽组合物。
本发明提供可用于快速鉴定生物学活性肽的肽文库，其中，所述肽文库选自：(a)xxxkx、(b)xxkxx、(c)xxxxk、(d)xkxxx、(e)kxxxx、及其排列组合，其中k代表赖氨酸，各x可以是相同或不同的氨基酸，独立选自赖氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸及其衍生物。一旦在本发明的肽文库中鉴定到用于具体细胞类型的活性肽，即可产生具有核心特征(电荷、大小、疏水性)的肽的较小文库，并将其应用于新的细胞系统，从而减少必须筛选的化合物的数量。
本发明还提供能增强细胞培养系统中细胞分泌的肽，其中该肽的所有氨基酸都具有带正电的侧链。
还提供了一种修饰细胞培养系统的表面以增强该系统中的细胞生长和/或分泌的方法，所述方法包括将含有选自以下结构的肽施加于所述表面：(a)xxxkx、(b)xxkxx、(c)xxxxk、(d)xkxxx、(e)kxxxx及其组合，其中k代表赖氨酸，各x可以是相同或不同的，独立选自赖氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸及其衍生物。
本发明另一方面公开了一种将细胞粘附于表面以促进其生长的方法，所述方法包括(i)提供一表面，该表面至少有一部分被含有选自下述结构的肽包被：(a)xxxkx、(b)xxkxx、(c)xxxxk、(d)xkxxx、(e)kxxxx及其组合，其中，各x可以是相同或不同的疏水或不带电的极性氨基酸残基，k代表赖氨酸；和(ii)使所述至少部分包被的表面与细胞接触足够长的时间，使细胞粘附到该表面上。
最后，本发明提供一种增强细胞生长和/或分泌的方法，所述方法包括在本发明的肽或肽组合物存在的条件下培养细胞或组织的步骤。
                       附图的简要说明
图1是用于监测MC3T3细胞生长情况的氧生物传感器试验的结果的图解。本发明的肽是在初始的最大多样性文库(MDL-100)和后续文库MDL-400中鉴定得到的。所述MDL-400文库拥有的空间中填充了MDL-100粗略覆盖的化合物组成。比较存在和缺乏本发明肽以及存在和缺乏胞外基质(ECM)对照和已知肽对照的情况下对细胞的生物学效果。590nm下测得的吸收值可衡量与细胞生长相关的相对氧消耗。
                        发明详述
术语“增强分泌”、“促进分泌”等指在存在一种或多种本发明肽的情况下，培养基上清液中的靶分子水平大于不存在所述肽的水平。这种结果与多种因素有关，包括但不限于蛋白表达水平和胞内运输的改变。
采用常规的肽合成技术构建两个初始肽最大多样性文库MDL-400和MDL-100以及由与早期前导序列(early lead)有关的化合物组成的后续文库。采用“最近邻居”技术(“Nearest Neighbor”techniques)选择后续文库中的候选肽。接着筛选这些候选肽中具有某些所需特征的生物学活性的肽。本工作的一个目标是，通过测量培养细胞的氧消耗量的增加，鉴定出当其非共价连接于或非特异性吸附于表面时能增加细胞生长的肽，其中，使用氧生物传感器测量所述氧消耗量的增加。第二个目标是鉴定出能增强分泌的肽。具体而言，选择一种分泌血小板衍生生长因子的细胞系，采用夹心ELISA监测上清液中PDGF的水平。首先根据它们对PDGF分泌的影响来筛选所述MDL文库，接着在由最近的邻居组成的后续文库中发现其它的前导序列。进一步的分析尚未揭示被确定为提高了细胞生长的生物学活性异构体组。
根据具体的设计标准，包括电荷、分子量、质量和疏水性选择初始肽候选物的各文库。下表A根据氨基酸侧链的极性将它们分类。
                 表A
疏水的 不带电、极性 带正电 带负电
丙氨酸 丝氨酸 赖氨酸 天冬氨酸
亮氨酸 苏氨酸 精氨酸 谷氨酸
异亮氨酸 酪氨酸 组氨酸
缬氨酸 天冬酰胺
脯氨酸 谷氨酰胺
苯丙氨酸 半胱氨酸
色氨酸 甘氨酸
甲硫氨酸
从MDL和最近邻居后续文库获得的各肽由5个氨基酸残基组成。通常根据合成的容易程度选择氨基酸用于形成文库肽。
大多数的PDGF分泌增强序列(SEQ ID NO：16-56和SEQ ID NO：5)具有以下结构之一：(a)xxxkx、(b)xxkxx、(c)xxxxk、(d)xkxxx、(e)kxxxx，其中k代表赖氨酸，各x可以是相同或不同的，独立选自赖氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸及其衍生物。筛选用于生长的少量MDL肽得到相同的共有结构：a)xxxkx、(b)xxkxx、(c)xxxxk、(d)xkxxx、(e)kxxxx，其中，各x可以是相同或不同的疏水或不带电的极性氨基酸残基：苯丙氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺，k代表赖氨酸。对于生长和分泌筛选，发现了较少量无赖氨酸的无关生物学活性化合物。
为了鉴定具体文库中能正面影响细胞表达和分泌的肽，将各测试肽加到含有单层中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的孔中。所选择的细胞是已知的分泌血小板衍生生长因子的依赖贴壁CHO细胞，所述细胞最初生长于使用了血清的培养基的组织培养表面上。在建立起单层后，将化学成分确定的基础培养基和一种测试肽加到各孔中。在该工作中，通过收集各孔的上清液并对上清液进行PDGF特异性ELISA，评估在存在和缺乏从文库获得的肽时PDGF的分泌。输出值为492nm处的吸光度。评价了细胞在富含氨基酸、必需维生素、金属、碳源和共有CHO培养因子(consensus CHO culture factors)的基础培养基中的分泌。将PDGF水平与加入到用所用培养基中的已知标准品比较。
具有分泌增强活性的特殊的本发明肽包括具有选自以下氨基酸序列的肽：SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70及其组合。
为了鉴定某具体文库中能正面影响细胞培养中的细胞生长的肽，用生长试验筛选了所述文库。所选择的细胞是依赖贴壁MC3T3细胞，该细胞在预先包被有本发明的肽的组织培养表面上生长。用于评估所述文库肽的筛选培养基是低血清培养基，因而培养基中存在的不确定材料对肽效果评估的干扰也低。在该工作中，在存在和缺乏文库肽的情况下评估了MC3T3细胞的生长，所述肽以干燥的膜的形式存在于组织培养基质上。在富含氨基酸和含有必需维生素、金属和单一碳源的基础培养基中评估生长。经过适当的培养时间后，将补充了各肽的培养基中的生长情况与未补充的培养基中的生长情况比较。使用Becton Dickinson氧传感器检测细胞的氧消耗，以评估生长程度。然后用荧光计间接评估含有某具体肽的各孔中的细胞数量，该荧光计使用以465nm为激发波长、590nm为发射波长的带通滤波器测量荧光染料发出的荧光。
简言之，氧生物传感器以在氧存在时猝灭的钌染料的荧光为基础。该染料被固定在一惰性但高度可渗透的硅氧烷基质中，该基质位于微滴定孔的底部。先前的数据表明，氧消耗增加与细胞数量增加有关(Wodnicka，M.，Guarino，R.D.，Hemperly，J.J.，Termmins，M.R.，Stitt，D.和Pitner，J.B.，2000，J.ofBiomolecular Screening，5：141-152)。
在MDL-400肽文库的最初筛选中鉴定到几条能增强细胞生长的肽。这些肽包括：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11以及它们的组合。具体而言，如下文详述，与在未包被表面细胞的生长相比，这些肽的每一条在吸附到表面上时，细胞都产生了明显不同的生长。
还鉴定到两种具有生长提高性能的本发明肽组合物。这些组合物在筛选文库MDL-100的过程中选到。所鉴定的具体肽对如下：(a)SEQ ID NO：12/SEQID NO：13和(b)SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：15。
典范的肽或异构体具有相同的氨基酸组成，仅序列存在变化。当多条典范的肽能产生提高作用时，暗示了存在一种广泛的非特异性机制。在此，初步筛选了肽文库能提高CHO细胞中PDGF表达的肽。发现典范的FKFIG(SEQID NO：5)和KFIFG(SEQ ID NO：45)对于PDGF表达有正面作用。然后筛选同组典范肽对MC3T3生长有影响的成员。根据此种生长筛选，发现FKFIG(SEQ IDNO：5)和该典范组中另两个成员IFFKG(SEQ ID NO：1)和FIKFG(SEQ ID NO：2)也有正面作用。这些结果显示在表1、3和图1中。这些结果鉴定到了可用于细胞培养的新的一类化合物。
如上所述，本发明提供能增强细胞培养系统中的细胞生长和/或分泌的肽，其中，所述肽含有至少以下结构之一：(a)xxxkx、(b)xxkxx、(c)xxxxk、(d)xkxxx和(e)kxxxx，其中k代表赖氨酸，各x可以是相同或不同的，独立选自赖氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸及其衍生物。
能促进细胞培养系统中的细胞生长和/或分泌的本发明肽可含有5个以上氨基酸残基的方案也在本发明的范围之内，条件是在它们的序列中所含结构对应于以下至少一种：(a)xxxkx、(b)xxkxx、(c)xxxxk、(d)xkxxx和(e)kxxxx，其中k代表赖氨酸，各x可以是相同或不同的，独立选自赖氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸及其衍生物。但是，应注意的是，必须注意培养系统中内源和外源蛋白酶的作用。这些蛋白酶很可能降解序列中含有蛋白酶水解位点的较长肽。此外，完整的蛋白或大的肽更容易降解。
注意到本发明的五肽通常不含有内部蛋白酶切割位点。但是，就用于生产本发明肽的所需方法而言，特别有利的是选择的肽是其C末端和N末端对应于传统培养基蛋白水解中蛋白质的酶促或化学切割产生的C末端和N末端的肽。例如，本发明的肽QVVAK(SEQ ID NO：4)不具有内部胰蛋白酶位点，但具有C末端赖氨酸，该C末端赖氨酸可被解离(leverage)，从而可经济地将该肽制备成本领域已知的各种重组生产系统中的多联体。该多联体可含有上百份编码序列的拷贝。多联体核酸构建了本发明具有C末端和N末端的编码肽，所述C末端或N末端被酶或化学切割，产生的多肽含有被方便的切割位点隔开的肽氨基酸序列的重复亚单元。使用适当的酶或化学方法进行的切割可释放出肽单体。这种制备方法提高了所需肽的产率，并降低了制备成本。由于通过克隆多联体结构可获得切割位点的缘故，表达后的加工也被简化。
本发明还涉及增强细胞生长和/或分泌的肽，所述肽含有至少一种以下结构：(a)xxxkx、(b)xxkxx、(c)xxxxk、(d)xkxxx和(e)kxxxx，其中x可以是相同或不同的疏水或不带电极性氨基酸残基，k代表赖氨酸。在一个实施例中，所述疏水或不带电极性残基选自Phe、Ile、Ala、Val、Pro、Gly、Gln、Tyr、Thr、Leu及它们的衍生物。
可采用本领域已知的各种合适的方法合成本发明的肽，如Atherton和Sheppard〔1989，《固相肽合成》，Merrifield 1965〕的FMOC化学合成法。也可采用Boc化学合成法，以及在各种不同的固相载体上进行的合成、“茶袋”合成(“tea-bag”synthesis)(Houghten)以及分裂和分离组合方法。也可采用液相方法进行肽的合成。
作为化学合成的另一选择，可采用重组方法更经济地生产本发明的肽。对于重组生产，首先将肽序列转变成编码其氨基酸序列的相应的核酸序列。该核酸序列可以是接着被翻译从而产生所述肽的RNA序列，或者它可以是DNA序列，该序列之后被克隆到表达载体中。在启动子的控制下，该DNA序列发生转录，随后发生mRNA的翻译，从而产生所述肽。用于重组生产所需的肽或蛋白质序列的许多这样的方法是技术人员已知的，可在生产本发明肽的过程中采用这些方法而勿需创造性的劳动。如果需要，还可采用本领域技术人员已知的标准的物理、化学和亲和分离方法纯化所述肽。
本发明的有用肽可包括C末端(如酰胺或酯)、N末端(如乙酰基)和下文将详细描述的非天然氨基酸(如正亮氨酸)的修饰。这些修饰可能对肽活性产生影响。此外，修饰可提供用于与载体或接头分子共价连接的工具。
可将本发明的肽含于制备的用于原核生物和酵母以及脊椎动物和无脊椎动物衍生的培养细胞和组织的组织培养基中，以对所述细胞产生所需的效果，如提高的粘附、生长和/或表达和分泌。加入本发明肽的基础培养基可以是化学成分确定的培养基，或者是含有不确定成分如胎牛血清或酵母水解产物的复合培养基。但是，优选化学成分确定或半确定的培养基，因为本发明的肽将是最有利的用作减少或消除由于不确定的培养基成分产生的性能变化的工具，以及减少或消除用于生产药物产品的培养基中动物来源的成分的工具。
确定选择的培养基或包被溶液中本发明肽的适当浓度是本领域技术人员能力范围之内。在一个实施例中，以约500μM到约6mM的浓度将肽加入细胞培养系统中。在另一个实施例中，以约250μM到约24mM的浓度将肽加入细胞培养系统中。在又一实施例中，以3mM到约12mM的浓度将肽加入细胞培养系统中。此外，可将多个肽加到培养基中，或者将它们加到用于包被表面以产生协同效果(如果它们对细胞具有相同的作用)或者产生多重效果(如果各肽对相同的细胞产生不同的作用)的溶液中。
本领域技术人员将理解，本发明肽增强细胞粘附、生长、表达或分泌的能力可能受到基础培养基和/或其它培养基成分的的影响。可使用培养基培养任何感兴趣的细胞、组织或器官。较佳的是，培养基是细胞培养基。通常，且较佳的是，本发明的肽可用作培养基的成分，用于体外培养细胞。具体而言，本发明可用于实施动物(更佳的是哺乳动物、鸟类或昆虫)、植物、细菌、原生动物、真菌或酵母的培养。此外，培养基可以是用于包装宿主细胞中的病毒或噬菌体的培养基。本发明的培养基还可用于培养原代细胞(如用于培养产生胰岛素的β胰岛细胞)。含有本发明肽的培养基的其它用途包括用于培养经基因工程改造成表达重组肽或蛋白的细胞。最后，培养基可以是液体、半固体或固体培养基，优选液体培养基。
本发明的肽可溶于诸如水之类的载体中，以产生包被组织培养基质或用于粘附型细胞生长的其它表面的溶液。例如，可将含有一种或多种本发明肽的溶液分配到某表面上，在反向气流罩中干燥，结果使肽以干燥的膜形式存在于所述表面上。
在本发明的一个实施例中，肽增加细胞的氧消耗。例如，通过测定细胞氧消耗增加发现，与未包被表面上获得的生长情况相比，本发明的肽在以干燥的膜的形式吸附到表面上时促进了细胞的生长。本发明的肽在可体外或体内增加细胞生长。例如，可用此肽处理组织培养表面，以增强细胞的体外生长，或者，肽可增强植入体内的生物医学装置表面上的细胞的生长。
在另一个实施例中，细胞选自(但不限于)：内皮细胞、上皮细胞、真皮细胞、神经细胞、肿瘤细胞、淋巴细胞、干细胞及它们的组合。通常，本发明的肽可用于促进依赖贴壁细胞的粘附和生长。
使本发明肽结合于表面的方法包括非共价相互作用、非特异性吸附和共价连接。在本发明的一个实施例中，可使此肽直接吸附到表面上。在另一个实施例中，可将肽吸附到已经至少一种以下物质(但不限于)处理的表面上：牛血清白蛋白、卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、聚赖氨酸、具有细胞表面受体识别序列的肽、免疫球蛋白、多糖或生长因子。在另一个实施例中，以游离的形式或者偶联于表面的形式同时施用肽和上述一种蛋白质。
本发明增强生长的肽适用于于促进包括二维或三维表面在内的表面上各种依赖贴壁细胞的粘附和生长。例如，表面可以是生物反应器的表面，该表面使细胞以3-D阵列粘附。通过将细胞粘附于经本发明肽修饰的3-D表面上，可设计出比现有的生物反应器更有效的生物反应器。
对于可用于实施本发明的具体的表面类型，合适的例子包括但不限于陶瓷、金属或聚合物表面。最佳的是，本发明使用聚合物表面和陶瓷，如玻璃表面。用于本发明的合适的表面包括但不限于塑料皿、塑料瓶、塑料微滴定板、塑料试管、缝合线、膜(membrane)、薄膜(film)、生物反应器和微颗粒。聚合物表面可包括但不限于聚(羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚(四氟乙烯)、氟化乙烯、聚(二甲基硅氧烷)和其它硅氧烷橡胶。玻璃表面可包括甘油丙基硅烷结合的玻璃。
根据本发明的一个具体的实施例，可使肽与载体结合。选择合适的载体分子的前提是，肽的功能性生物学活性不应被载体或被偶联方法削弱。用于本发明的载体分子可属于各物质类别，包括但不限于胞外基质的蛋白质组分，如纤连蛋白、胶原蛋白和层粘连蛋白。此外，可将肽共价连接于多种确定的物质上，所述物质包括但不限于：聚赖氨酸、卵白蛋白、牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、免疫球蛋白、多糖、脂蛋白、生长因子及它们的组合。合适的多糖包括淀粉、糖原、纤维素、胶质、淀粉酶、糊精、聚蔗糖或壳聚糖。与本发明肽化学偶联的合适的生长因子包括但不限于bFGF、GCSF、ILGF-1或VEGF。此外，本发明的肽可以与合成的聚合物偶联，所述聚合物如聚乙二醇或聚乙烯醇；或者可以与磷脂偶联，所述磷脂包括陶瓷或石蜡；或者与醇如甘油偶联。
本发明肽与所述物质类别中的任一种之间的化学偶联通常直接受到载体物质与肽之间的反应性基团影响，或者可通过接头的帮助进行偶联。例如，可使用双功能接头磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸将本发明的肽连接到合适的生长因子或胞外基质蛋白。反应性基团可事先存在在载体和肽上。但是，也可通过激活分子中的反应性基团导入这类基团。常用的反应性官能团包括氨基、亚氨基、羟基、巯基或羧基。
应注意的是，将一种以上肽分子偶联到具体的载体上，以提高其增强粘附和生长促进性能是有利的。
在本发明的一个实施例中，将偶联物的载体成员吸附在具体的表面，如组织培养表面上。例如，载体可以是吸附于表面上的胞外基质蛋白，含有反应性官能团，以提供与本发明肽的结合或偶联，如通过所述肽的N末端或C末端上的非天然氨基酸反应。在此例子中，将修饰的肽加到已预先预包被了含有反应性官能团的载体的组织培养基质中。或者，通过将偶联物包被在表面上或者使所述偶联物作为培养基组分加入到培养基中，从而将预先形成的偶联物加到培养系统中。
如上所述，通过测量细胞增加的氧消耗发现，与在未包被表面上的粘附和生长相比，本发明的几种肽可用于增强细胞与表面的粘附以及增强粘附于其上的细胞的生长。因此，本发明提供一种细胞培养基质，该基质包含一种或多种对应于SEQ ID NO：1-11的肽。
或者，可用包含一对或多对下述肽(a)SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：13和(b)SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：15的肽组合物包被该基质，所述序列如前所述能增强依赖贴壁相比的粘附和生长。
本发明还提供一种细胞培养基质，该基质含有选自对应于SEQ ID NO：16-70和SEQ ID NO：5及其组合的分泌增强性肽。
本发明还包括以下范围：除了包括本发明的肽之外，所述细胞/组织培养基质还包括至少以下一种物质：牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、聚赖氨酸、具有细胞表面受体识别序列的肽、免疫球蛋白、多糖或生长因子。例如，本发明的肽可与表面上的蛋白质协同作用，以增强依赖贴壁细胞的粘附和生长。本发明的内容还包括，细胞培养基质可包括细胞单层。
适用于包被培养基质的肽可与载体(如，上述载体)共价连接，所述载体尤其包括胞外基质蛋白、牛血清白蛋白、聚赖氨酸、免疫球蛋白、多糖或生长因子。如上所述，可将肽偶联于载体，接着将偶联物包被在表面上，或者，可将肽与已预先包被于表面上的载体偶联或共价连接，条件是在肽、载体上存在合适的反应性官能团，或者存在分子接头。
本发明提供选自以下的肽文库：(a)xxxkx、(b)xxkxx、(c)xxxxk、(d)xkxxx，(e)kxxxx及其排列组合，其中k代表赖氨酸，各x可以是相同或不同的氨基酸，独立选自赖氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸及其衍生物。
在一个实施例中，本发明的肽文库包括共价连接于特殊的载体的肽。合适的载体与上述的载体相同，包括但不限于牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、聚赖氨酸、具有细胞表面受体识别序列的肽、免疫球蛋白、多糖和生长因子。
对于本发明提供的方法，一种方法涉及修饰细胞培养系统中的表面，以增强该系统中的细胞生长和/或分泌，其中，所述方法包括将含有选自以下结构的肽施用于所述表面的步骤：(a)xxxkx、(b)xxkxx、(c)xxxxk、(d)xkxxx，(e)kxxxx及其组合，其中k代表赖氨酸，各x可以是相同或不同的氨基酸，独立选自赖氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸及其衍生物。
适用于修饰表面以促进其上的细胞粘附和生长的特殊的肽包括选自以下的肽：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11以及它们的组合。
此外，一种或多种下述本发明肽组合物也适用于修饰表面，以促进其上的细胞粘附和生长：(a)SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：13和(b)SEQ ID NO：14/SEQID NO：15。
在又一实施例中，可将对应于SEQ ID NO：16-56和SEQ ID NO：5的一种或多种肽施加于细胞培养系统的培养基质上，用于增强细胞分泌。
本发明还提供一种将细胞粘附到表面上以促进细胞生长的方法，所述方法包括(i)提供一表面，该表面至少部分被含有选自下述结构的肽包被：(a)xxxkx、(b)xxkxx、(c)xxxxk、(d)xkxxx、(e)kxxxx及其组合，其中，各x可以是相同或不同的疏水或不带电的极性氨基酸残基，k代表赖氨酸；和(ii)使所述至少部分包被的表面与细胞接触足够长的时间，以使细胞粘附到该表面上。在一个实施例中，所述疏水或不带电的极性氨基酸残基选自：Phe、Ile、Ala、Val、Pro、Gly、Gln及其衍生物。
适用于将依赖贴壁细胞粘附于表面以促进细胞生长的特殊的肽包括SEQID NO：1-11及其组合代表的序列。此外，对于下述肽对的本发明组合物也是有用的：(SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：13)和(SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：15)。可将肽共价连接于上述任一载体上。
在本发明一种将细胞粘附到表面以促进细胞生长的方法中，细胞在体外生长，如在组织培养基质上生长，所述基质包括但不限于微滴定孔、组织培养瓶、培养皿和瓶。或者，细胞可在体内生长，如在植入体内的如生物医学装置上生长。
对于本发明肽在生物医学植入物上的使用，通常需要使植入物周围组织的细胞粘附于其上，并在其上扩展。本发明的肽提供了一种修饰表面以在宿主体内获得所需的植入物整合效果的方法。具体而言，经表面处理的生物医学植入装置提高了粘附于表面上的细胞的数量和比例以及生长，并因此提高了该装置在体内与组织整合的比例。而且，细胞的粘附和生长的提高在生物医学装置和生物组织之间提供了一连续的保护层，阻止细菌和其它感染物侵入组织中。由于保护性的细胞覆盖减少了感染物潜在入侵的机会，因此，具有增强细胞粘附促进表面作为其一部分的装置能将不利的影响减到最小。
此外，本发明的肽具有降低对细胞蛋白酶易感性的所需性能，所述性能赋予所暴露的处理表面具有长期稳定性。这使得使用本发明肽修饰表面的方法在制备长期安放在体内的各种生物医学植入物时是个理想的系统。所述植入物包括但不限于神经生长导向物和留置管。使用本发明的系统修饰表面的方法还可用于设计哺乳动物细胞生物反应器，因为它提供了稳定的集成表面组分，使得它可用于支持细胞粘附和细胞生长，而完全不需要细胞粘附中介分子如纤连蛋白和胶原蛋白。此外，包被有本发明肽的培养基质还提供了这样的优点，即可使用细胞粘附分子含量低或不足的低血清或无血清培养基。
用本发明肽修饰表面的方法可用于处理实验室中用作细胞培养基质的玻璃器皿和塑料器皿，包括但不限于组织培养瓶和培养皿。对于大规模组织和细胞培养，所述方法可用于处理微载体、大载体、中空纤维和滚瓶(roller bottle)的表面。此外，可使用该方法处理可植入的人造血管植入物的内部，以促进表面的内皮细胞化(endothelialization)。此外，也可使用本发明的肽处理血管植入物的外壁和末端区域，以促进其与组织整合。还可将本发明的肽用于其它可植入的装置，如人造腱、系带、接骨螺钉和板、骨碎片、关节和皮肤使可植入的装置与组织整合。此外，也可处理缝合线，以促进其与整合组织的粘附。
                          影响细胞粘附和生长的肽
实施例1
细胞系
MC3T3-E1是是小鼠颅盖衍生的成骨细胞的克隆系〔从新生小鼠颅盖建立的克隆成骨细胞系，Jpn.J.Oral Biol 23，899(1981)〕。
实施例2
细胞的维持
在使用前，将MC3T3细胞维持在补充有2％胎牛血清(FCS，灭活)和100单位或100μg/ml的青霉素/链霉素的αMEM中(GIBCO目录号12561)一个月。按常规以约1×104细胞每20毫升培养基的密度接种细胞，放在250毫升经处理的角颈(canted neck)聚苯乙烯组织培养瓶中(Becton Dickinson)。将细胞培养至每个瓶中获得约2×106个细胞，将这些细胞重悬浮在含2％FCS的5mlαMEM中，最终细胞浓度约为5×104个细胞每150μl，用于筛选肽。
实施例3
筛选条件
为测定文库肽和适当的对照对MC3T3细胞的生物学作用，使细胞(5×104个细胞/150μl)在经下述处理的96孔氧传感器平板中生长。
文库肽
筛选从MDL-400文库或MDL-100文库获得的肽。将1mM原液浓度的50微升肽的磷酸缓冲盐溶液加到96孔氧传感器平板的孔中，然后在反向气流罩中过夜干燥30小时。
对照
从Cohesion获得Vitrogen-胶原蛋白-I(Palo Alto，CA，商品目录号FXP-019)，从Sigma获得纤连蛋白(目录号F-0895)。所有其它胞外基质(ECM)化合物都从Becton Dickenson Labware(Bedford，MA)获得。从Becton DickinsonLadware获得聚赖氨酸，RDGSP-若丹明从AnaSpec Inc.(San Jose，CA)获得。使用以下原液浓度的胞外基质组分(ECM)或已知的肽：
Vitrogen-胶原蛋白-I          3.2mg/ml
纤连蛋白                     0.1％
胶原蛋白-V                   1mg/ml
层粘连蛋白                   2mg/ml
h-胶原蛋白-I                 1mg/ml
胶原蛋白-IV                  0.5mg/ml
胶原蛋白-III                 1mg/ml
聚赖氨酸                     5mg/ml
RGDSP-若丹明                 1mg/ml
将25微升原液浓度的对照和25微升磷酸缓冲盐溶液加到96孔氧传感器平板的各孔中，如上所述过夜干燥。
实施例4
使用Becton Dickinson氧生物传感器监测如上述处理的96孔氧传感器平板上细胞的生长。监测以下时间点的生长：1小时、24小时、32小时、48小时和86小时。每3天换一次培养基。培养期间培养基不再补充额外的肽。
荧光氧生物传感器试验能够对细胞生进行实时非侵入性监测。该试验以溶解在试验培养基中的氧的测量为基础。Becton Dickinson生物传感器以在氧存在下猝灭的钌染料的荧光为基础。所述染料被固定在惰性但氧可高度渗透的硅氧烷基质中。先前的数据表明，细胞数量的增加与氧消耗的增加相关。
在37℃，使用底部平板读数装置，用polarstar荧光计(BMG LabTechnologics，Durham，NC)获得所有数据。带通滤波器的激发波长为465nm，发射波长为590nm。因为荧光板上的强度读数是任意单位的，所以，通过将选择时间点上的孔测定值除以加入细胞前同一孔中的最初读数，而将测定值归一化〔Wodnicka，M.，Guarino，R.D.，Hemperly，J.J.，Temmins，M.R.，Stitt，D.和Pitner.J.B.(2000)，J.of Biomolecular Screening，5：141-152〕。
实施例5
氧生物传感器试验的结果
此实施例中的数据证明，本发明的肽有效地促进依赖贴壁细胞MC3T3在组织培养表面上的粘附和生长，这些效果与采用已知的ECM组分所获得的效果类似。如上所述，文库肽和对照在加入细胞之前就吸附到氧生物传感器多孔平板的各孔的底部。如上述使用氧生物传感器试验监测生长。在590nm的吸光度读数提供了与细胞生长相关的相对氧消耗测量值。比较存在和缺乏肽文库(MDL-400和MDL-100)中的肽的情况下细胞的生长情况。如下文详述，进一步将生长情况与ECM对照和已知的肽对照进行比较。
筛选本发明肽的标准是，在86小时这一时间点上相对氧消耗(590nm处的吸光度)为2.0及2.0以上。如下表1和2所示，在MDL-400文库中筛选到总共11条本发明肽，其吸光度为2.0或更高。结合表2，这些肽对应于SEQ IDNO：1-11。
结合表1和2，在MDL-100文库中筛选到两种本发明肽组合物，它们的吸光度大于2.0。所述组合物对应于下述肽对：(SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：13)和(SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：15)，如表2所示。
注意到表1所示的对照和肽的结果是都是在86小时这一时间点上从相同的96孔氧传感器平板上获得。还注意到，在较早的时间点上也获得类似的吸光度模式，其中本发明的肽和肽组合物产生的吸光度读数比相同试验平板上其它文库肽的读数高。但是，总的吸光度值低于86小时时获得的值，这与预期的相符。
                           表1
    MDL-400文库     MDL-100文库 对照
    肽编号     590nm的吸光度 肽编号     590nm的吸光度 条件     590nm的吸光度
    592     2.11*     5，6     1.27 Vitrogen-胶原蛋白-I     1.26
    596     1.65     7，11     1.22 胶原蛋白-IV     3.14
    601     2.38*     12，15     1.38 纤连蛋白     2.12
    593     1.42     18，19     1.50 胶原蛋白-III     1.45
    597     2.08*     24，26     1.55 胶原蛋白-V     1.76
    524     1.71     27，31     1.70 h-胶原蛋白-I     1.79
    528     1.45     33，36     1.38 层粘连蛋白     2.65
    530     1.77     40，42     1.39 聚赖氨酸     1.08
    531     1.70     46，48     1.60 RGDSP     1.25
    590     2.06*     53，60     1.63 HECM     1.78
    533     1.30     61，66     2.22* 血清     1.35
    535     1.57     67，70     1.40 细胞和培养基     1.20
    536     1.81     72，74     1.62 培养基     1.15
    538     1.81     75，76     1.31
    594     1.50     77，78     1.46
    539     1.48     83，84     1.91
    540     1.68     85，87     1.93
    541     1.29     99，102     1.89
    544     2.11*     106，123     1.28
    599     1.81     128，133     1.98
    549     1.60     138，141     2.13*
    575     1.29     144，145     1.37
    576     1.55     149，151     1.90
    577     1.87     161，163     1.77
    591     2.53*
    579     1.31
    583     1.33
    584     2.27*
    585     2.01*
    595     2.06*
    586     1.78
    587     1.56
    588     2.08*
    589     2.78*
    600     1.93
   *表示本发明的肽/肽组合物
                                       表2
    本发明肽编号     序列号
    61，66  SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：13
    138，141  SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：15
    592  SEQ ID NO：10
    601  SEQ ID NO：2
    597  SEQ ID NO：3
    590  SEQ ID NO：11
    544  SEQ ID NO：4
    591  SEQ ID NO：1
    584  SEQ ID NO：5
    585  SEQ ID NO：6
    595  SEQ ID NO：7
    588  SEQ ID NO：8
    589  SEQ ID NO：9
图1显示了86小时时间点从氧生物传感器试验中获得的结果，其中将本发明的肽与ECM或已知的肽对照相比。如图中所示，本发明的肽促进了MC3T3细胞的生长，而肽对照、聚赖氨酸和RDGSP则没有。已知这些肽对照能促进细胞粘附到组织培养基质上，这是依赖贴壁细胞在体外生长首先必须具备的(Grinnel，F.，Psychology，53：67-149，1978和Couchman等，J.Cell Biol.，93：402-410，1982)。
此外，图1表明，本发明的各肽在促进MC3T3细胞的粘附和生长方面比几种ECM对照(包括Vitrogen-胶原蛋白-I、胶原蛋白-III、胶原蛋白-V、h-胶原蛋白-I、HECM和血清)更好。
此外，本发明各肽促进细胞的粘附和生长等于或好于纤连蛋白对照。最后，相对氧消耗分别为2.53和2.78的本发明两条肽SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：9具有与胶原蛋白-IV和层粘连蛋白对照(其吸光度分别为3.14和2.65)相当的结果。
                       影响PDGF分泌的肽
实施例6
细胞系
选择具有PDGF基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用于分泌筛选。CHO细胞是生物技术领域最广泛用于生产重要治疗药物的动物细胞系，(Martin等，REVIEW，J.of Biotechnology.Progress 1998 14，807-833)。从美国典型培养物保藏中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，Md.20853)获得产生rPDGF的中国仓鼠细胞系(CRL 9395/CRL 9360)。保藏人为Inc.of Thousand Oaks(加州)。关于该细胞系及其表达产物的更详细内容可参见US 5175255。
实施例7
细胞的维持
37℃、5-7％CO2，在含有5％血清的DMEM/FI2培养基中繁殖细胞。接种前，将传代次数限定为5，采用western印迹和ELISA监测PDGF表达。按常规以约1×104细胞每毫升培养基的浓度接种细胞，置于250毫升经处理的角颈聚苯乙烯组织培养瓶(Becton Dickinson)中培养。培养细胞至铺满，用胰蛋白酶处理得到用于接种的细胞。
实施例8
添加剂-1A培养基和对照的制备
使用1A培养基作为PDGF阴性对照(培养前)，使40ng PDGF标准品水合(培养前)，使测试肽水合(培养前)以及归一化所有其它测试和对照PDGF的结果(培养后)。将下述成分加到500毫升瓶中的DMEM/F12(GIBCO目录号11330-032)制备1A培养基：2.5毫升10mM的NEAA原液(GIBCO目录号11140-050)；10毫升200mM的L谷氨酰胺原液(GIBCO目录号25030-08)；1毫升50mg/ml的庆大霉素硫酸盐原液(GIBCO目录号15750-0601)；150微升100μM氨甲蝶呤原液(Sigma目录号M8407)；0.5毫升7.5mg/ml的胰岛素原液(Sigma I-6634)；50微升1mg/ml胰岛素样生长因子原液(Long R2 Factor，Sigma目录号I-1271)；2.5克牛血清白蛋白(Sigma目录号A-7906)；和0.5毫升7.5mg/ml全-转铁蛋白原液(Sigma T-1283)。
实施例9
培养平板设置和采样
CHO模型细胞系是从未适应过无血清环境的粘附性培养物。因此，使用含有血清的培养基接种各孔。使用两种模式：覆盖(overlay，O)和洗涤(Wash，W)将含有测试肽的培养基加入附着的细胞中。
在O模式中，第2天轻轻地将化合物加到接种培养基的顶部。在O模式中，以1000细胞/96孔将9360细胞接种到含有1.5％血清、125微升体积的1A培养基中。2天后加入含有12mM测试肽的1A培养基(无血清)，最终的肽浓度为6mM和0.75％血清。第10天从各测试环境中收集细胞培养上清液，用于后面的PDGF试验。
在W模式中，在除去接种培养基后，第2或3天加入化合物。在W模式中，将9359和9360细胞以每96孔6000个细胞接种在250微升体积的DMEM/F12(含5％血清)中。3天后，除去接种培养基，用250微升含有6mM测试肽的1A培养基(无血清)替换。第5天和第12天收集细胞培养上清液，用于后面的PDGF试验。
实施例10
监测组织培养上清液中的PDGF
收集含有测试化合物的培养基中繁殖的CRL9359/9360的各培养物中的上清液。采用ELISA测量rPDGF水平。下文将进行详细的描述。
37℃下用从PharMinger(目录号15-681A)获得的大鼠抗人PDGF AB/BB亚单元(IgG1)包被平板1小时，接着倾去抗体溶液。然后加入阻断剂，在37℃培育1小时，以去除非特异性结合。倾去阻断剂，洗涤平板3次。然后加入测试上清液和阳性对照、阴性对照(阳性对照为Sigma Human rPDGF的合并液，目录号为P3201和P4306或单独的P3201)，37℃培育1小时。然后倾去溶液，洗涤平板3次。接着加入PDGF特异性抗体IgG2a同种型(从ATCC获得，AmgenMAB 133)，37℃培育1小时。倾去抗体溶液后，洗涤平板。然后加入次级抗体HRP偶联物抗-小鼠(IgG2a特异性的)，37℃培育1小时。倾去次级抗体溶液后，再次洗涤平板。然后加入过氧化物酶底物，使其生色。然后终止反应，在492nm读取平板。
本发明肽产生的信号至少为0.2OD，高于1A基础培养基(富含传统的添加剂)。只有当基础培养基(培养前)信号低于0.2OD(原始值)和1A基础培养基(培养后)口40ng PDGF标准品之间的差为0.5OD(以上)时才接受数据。
实施例11
PDGF试验的结果
此实施例获得的数据证明，本发明肽有效地促进组织培养表面上依赖贴壁CHO细胞中的PDGF表达和分泌，这些效果超过使用含有血清和/或常规血清添加剂的合并物的培养基所获得的结果。如上所述，在细胞粘附后将文库肽和对照加到96孔平板中。采用夹心ELISA监测上清液中PDGF的积聚。492nm的吸光度读数提供了受各测试肽刺激产生的相对PDGF水平的测量值。比较存在和不存在几个肽文库中的肽的时上清液PDGF的水平。进一步将PDGF水平与培养基、培养前、培养后和加入已知浓度的PDGF的培养前所获得的结果进行比较。
筛选本发明肽的标准是，在第12天或不久后测定的相对ELISA PDGF值(492nm的吸光度)最小要高于1A基础培养基0.2。如下表3所示，在组合的MDL-100/MDL-400和后续文库中总共鉴定到56条本发明肽。这些肽对应于SEQ ID NO：16-70和SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：5对MC3T3生长也是阳性的。
下表3包括检测血小板衍生生长因子的典型酶联免疫吸附试验对照获得的结果。显示了试验对照、1A培养基培养前、1A培养基培养后和加入40ng/mlPDGF的1A培养基培养前所获得的原始值和归一化值。
表3包括检测血小板衍生生长因子的多个酶联免疫吸附试验获得的结果。在初始最大多样性文库(MDL-100)、在拥有的空间中装填了化合物的后续文库(MDL-400)以及围绕早期前导序列的后续文库中鉴定到本发明的五聚体。随着将本发明肽的值相对于1A培养基归一化(减去培养后1A培养基的值)后，显示本发明肽对细胞的生物学作用高于基础培养基(1A)。492nm吸光度是对本发明五聚体的细胞培养上清液中相对PDGF水平的一种衡量。注意到51个五聚体中，有42个含有碱性氨基酸赖氨酸。在MDL-100、MDL-400和后续文库中发现的这些负面作用肽的3个例子显示在表3中。
表3的后续文库包括市售获得的含赖氨酸的二聚体、三聚体和四聚体(分别为SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：66)所产生的结果。该后续文库栏中还提供了精氨酸和精氨酸前体鸟氨酸的三聚体(SEQ ID NO：70和SEQID NO：69)的值。这些结果证明，在其整体中含有赖氨酸或精氨酸或精氨酸前体鸟氨酸的肽对培养基中的PDGF积聚具有阳性结果。
                                表3
  MDL-400文库   MDL-100文库   后续文库
  本发明肽序列号   492nm的归一化吸光度   本发明肽序列号   492nm的归一化吸光度   本发明肽序列号     492nm的归一化吸光度
  16   1.38   17   1.32   18     0.82
  19   0.79   33   0.44   5     0.77
  22   0.59   47   0.28   20     0.76
  27   0.55   49   0.26   21     0.64
  30   0.50   59   0.55   23     0.58
  31   0.49   62   0.34   24     0.58
  34   0.42   64   0.26   25     0.58
  37   0.38   26     0.56
  38   0.37   28     0.55
  43   0.32   29     0.51
  44   0.31   32     0.48
  46   0.28   35     0.42
  50   0.25   36     0.39
  51   0.25   39     0.37
  53   0.22   40     0.36
  56   0.20   41     0.36
  58   0.58   42     0.35
  60   0.45   45     0.28
  61   0.43   48     0.26
  63   0.33   52     0.25
  65   0.23   54     0.22
  55     0.21
  57     0.68
  66     1.37
  67     1.11
  68     0.34
  69     1.31
  70     0.90
  负面作用肽   负面作用肽   负面作用肽
  -0.41   -0.36     -0.21
  -0.05   -0.81     -0.56
  -0.23   -1.07     -0.64
  对照     原始值     归一化值
  基础培养基，培养前     0.20     -1.08
  基础培养基，培养后     1.28     0.00
  40ng PDGF标准品     2.47     1.19
                               序列表
<110>
<120>促进细胞粘附、生长和分泌的肽
<130>102-410
<160>76
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>1
Ile Phe Phe Lys Gly
1               5
<210>2
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>2
Phe Ile Lys Phe Gly
1               5
<210>3
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>3
Phe Ile Phe Ala Lys
1               5
<210>4
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>4
Gln Val Val Ala Lys
1               5
<210>5
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>5
Phe Lys Phe Ile Gly
1               5
<210>6
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>6
Ala Phe Phe Lys Ile
1               5
<210>7
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>7
Val Phe Pro Phe Lys
1               5
<210>8
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>8
Ala Lys Ile Phe Phe
1               5
<210>9
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>9
Ala Phe Lys Ile Phe
1               5
<210>10
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>10
Lys Phe Ala Phe Ile
1               5
<210>11
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>11
Phe Ala Lys Phe Ile
1               5
<210>12
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>12
Ala Phe Phe Phe Gln
1               5
<210>13
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>13
Glu Glu Glu Met Tyr
1               5
<210>14
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>14
Phe Ile Lys Leu Met
1               5
<210>15
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>15
Phe Phe Ile Pro Tyr
1               5
<210>16
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>16
Phe Lys Leu Val Tyr
1               5
<210>17
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>17
Lys Lys Lys Lys Lys
1               5
<210>18
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>18
Lys Lys Lys Lys Leu
1               5
<210>19
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>19
Phe Lys Lys Lys Gln
1               5
<210>20
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>20
Lys Lys Lys Ser Lys
1               5
<210>21
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>21
Lys Lys Lys Leu Lys
1               5
<210>22
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>22
Phe Lys Lys Lys Lys
1               5
<210>23
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>23
Leu Lys Lys Lys Lys
1               5
<210>24
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>24
Lys Lys Leu Lys Lys
1               5
<210>25
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>25
Lys Lys Lys Lys Thr
1               5
<210>26
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>26
Lys Lys Pro Lys Lys
1               5
<210>27
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>27
Lys Lys Pro Gln Tyr
1               5
<210>28
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>28
Ser Lys Lys Lys Lys
1               5
<210>29
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>29
Lys Val Lys Lys Lys
1               5
<210>30
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>30
Lys Asn Gln Thr Tyr
1               5
<210>31
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>31
Phe Lys Lys Lys Val
1               5
<210>32
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>32
Lys Pro Lys Lys Lys
1               5
<210>33
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>33
Phe Phe Lys Lys Lys
1               5
<210>34
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>34
His Lys Asn Gln Tyr
1               5
<210>35
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>35
Phe Lys Leu Val Gly
1               5
<210>36
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>36
Lys Lys Gln Pro Lys
1               5
<210>37
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>37
Glu Lys Lys Gln Thr
1               5
<210>38
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>38
Glu Lys Lys Lys Lys
1               5
<210>39
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>39
Lys Lys Ile Lys Gln
1               5
<210>40
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>40
Lys Lys Lys Lys Ser
1                5
<210>41
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>41
Lys Lys Gln Lys Lys
1               5
<210>42
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>42
Lys Lys Leu Asn Tyr
1               5
<210>43
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>43
Asp Gly Lys Lys Thr
1               5
<210>44
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>44
Lys Lys Pro Thr Thr
1               5
<210>45
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>45
Lys Phe Ile Phe Gly
1               5
<210>46
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>46
Phe Lys Lys Met Tyr
1               5
<210>47
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>47
Phe Phe Phe Lys Lys
1               5
<210>48
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>48
Lys Gln Lys Lys Ile
1               5
<210>49
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>49
His Ile Lys Lys Lys
1               5
<210>50
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>50
Asp Phe Phe His Lys
1               5
<210>51
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>51
Ala Lys Lys Lys Lys
1               5
<210>52
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>52
Ala His Ile Lys Lys
1               3
<210>53
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>53
Ala His Lys Lys Lys
1               5
<210>54
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>54
Leu Lys Leu Val Tyr
1               5
<210>55
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>55
Pro Lys Gln Lys Lys
1               5
<210>56
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>56
Ala Lys Lys Lys Thr
1               5
<210>57
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>57
Asp Glu Glu Thr Tyr
1               5
<210>58
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>58
His Asn Pro Pro Tyr
1               5
<210>59
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>59
Gly Gly His Met Ser
1               5
<210>60
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>60
Ala Ala Asp Glu Gly
1               5
<210>61
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>61
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>62
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>62
Glu Glu Gly Leu Ser
1               5
<210>63
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>63
His His Pro Ser Thr
1               5
<210>64
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>64
Phe His His Asn Thr
1               5
<210>65
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>65
Ala Asp Glu Leu Asn
1               5
<210>66
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>66
Lys Lys Lys Lys
1
<210>67
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>67
Lys Lys Lys
1
<210>68
<211>2
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>68
Lys Lys
1
<210>69
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(3)
<223>orn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(3)
<223>Orn在所有的Xaa位置
<400>69
Xaa Xaa Xaa
1
<210>70
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>70
Arg Arg Arg
1
<210>71
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>71
Gly Arg Gly Asp
1
<210>72
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>72
Gly Tyr Ile Gly Ser Arg
1               5
<210>73
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>73
Gly Arg Glu Asp Val
1               5
<210>74
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>74
Arg Gly Asp
1
<210>75
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>75
Tyr Ile Gly Ser Arg
1               5
<210>76
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>选出的具有生物学活性的合成肽
<400>76
Arg Glu Asp Val
1

Claims (52)

1.一类增强细胞培养系统中的细胞生长和/或分泌的肽，其特征在于，所述肽含有至少一种以下结构：(a)xxxkx、(b)xxkxx、(c)xxxxk、(d)xkxxx和(e)kxxxx，其中，所述k代表赖氨酸，各x可以是相同或不同的氨基酸，独立选自赖氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸及其衍生物。
2.如权利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽促进依赖贴壁细胞粘附于表面。
3.如权利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽增强细胞生长，选自：IFFKG(SEQ ID NO：1)、FIKFG(SEQ ID NO：2)、FIFAK(SEQ ID NO：3)、QVVAK(SEQ ID NO：4)、FKFIG(SEQ ID NO：5)、AFFKI(SEQ ID NO：6)、VFPFK(SEQ ID NO：7)、AKIFF(SEQ ID NO：8)、AFKIF(SEQ ID NO：9)、KFAFI(SEQ ID NO：10)和FAKFI(SEQ ID NO：11)及其组合。
4.如权利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽增强细胞分泌，选自：FKLVY(SEQ ID NO：16)，KKKKK(SEQ ID NO：17)，KKKKL(SEQ ID NO：18)，FKKKQ(SEQ IDNO：19)，FKFIG(SEQ ID NO：5)，KKKSK(SEQ ID NO：20)，KKKLK(SEQ ID NO：21)，FKKKK(SEQ ID NO：22)，LKKKK(SEQ ID NO：23)，KKLKK(SEQ ID NO：24)，KKKKT(SEQID NO：25)，KKPKK(SEQ ID NO：26)，KKPQY(SEQ ID NO：27)，SKKKK(SEQ ID NO：28)，KVKKK(SEQ ID NO：29)，KNQTY(SEQ ID NO：30)，FKKKV(SEQ ID NO：31)，KPKKK(SEQID NO：32)，FFKKK(SEQ ID NO：33)，HKNQT(SEQ ID NO：34)，FKLVG(SEQ ID NO：35)，KKQPK(SEQ ID NO：36)，EKKQT(SEQ ID NO：37)，EKKKK(SEQ ID NO：38)，KKIKQ(SEQID NO：39)，KKKKS(SEQ ID NO：40)，KKQKK(SEQ ID NO：41)，KKLNY(SEQ ID NO：42)，DGKKT(SEQ ID NO：43)，KKPTT(SEQ ID NO：44)，KFIFG(SEQ ID NO：45)，FKKMY(SEQ IDNO：46)，FFFKK(SEQ ID NO：47)，KQKKI(SEQ ID NO：48)，HIKKK(SEQ ID NO：49)，DFFHK(SEQ ID NO：50)，AKKKK(SEQ ID NO：51)，AHIKK(SEQ ID NO：52)，AHKKK(SEQID NO：53)，LKLVY(SEQ ID NO：54)，PKQKK(SEQ ID NO：55)，AKKKT(SEQ ID NO：56)。
5.如权利要求1所述的肽，其特征在于，以约500μm到约6mM的浓度将所述肽加入细胞培养系统中。
6.如权利要求1所述的肽，其特征在于，以约250μm到约24mM的浓度将所述肽加入细胞培养系统中。
7.如权利要求1所述的肽，其特征在于，以3mM到约12mM的浓度将所述肽加入细胞培养系统中。
8.如权利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽以干燥的膜形式存在于表面上。
9.如权利要求8所述的肽，其特征在于，所述表面是二维或三维表面。
10.如权利要求1所述的肽，其特征在于，所述细胞培养系统含有选自以下的细胞：上皮细胞、内皮细胞、真皮细胞、神经细胞、肿瘤细胞、淋巴细胞、干细胞及它们的组合。
11.如权利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽增加所述细胞的氧消耗。
12.如权利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽增强所述细胞的体外或体内生长。
13.如权利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽结合或非特异性吸附于表面。
14.如权利要求13所述的肽，其特征在于，所述表面包被有牛血清白蛋白、卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、聚赖氨酸、具有细胞表面受体识别序列的肽、免疫球蛋白、多糖或生长因子中的至少一种。
15.如权利要求13所述的肽，其特征在于，所述表面选自塑料皿、塑料瓶、塑料微滴定板、塑料试管、缝合线、膜、薄膜、生物反应器、中空纤维、囊和微颗粒。
16.如权利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽共价连接于以下一种物质：胞外基质蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、免疫球蛋白、多糖、生长因子以及它们的组合。
17.如权利要求16所述的共价连接的肽，其特征在于，所述物质吸附在表面上。
18.如权利要求16所述的共价连接的肽，其特征在于，所述生长因子包括至少一种bFGF、GCSF、ILGF-1或VEGF。
19.如权利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽是培养基的组成成分。
20.增强细胞生长和/或分泌的肽，其特征在于，所述肽含有至少一种以下结构：(a)xxxkx、(b)xxkxx、(c)xxxxk、(d)xkxxx和(e)kxxxx，其中，各x可以是相同或不同的疏水或不带电的极性氨基酸残基，k代表赖氨酸。
21.如权利要求20所述的肽，其特征在于，所述疏水或不带电的极性残基选自：Phe、Ile、Ala、Val、Pro、Gly、Gln、Tyr、Thr、Leu及它们的衍生物。
22.如权利要求20所述的肽，其特征在于，所述肽增强附着型细胞的细胞粘附和生长，选自IFFKG(SEQ ID NO：1)、FIKFG(SEQ ID NO：2)、FIFAK(SEQID NO：3)、QVVAK(SEQ ID NO：4)、FKFIG(SEQ ID NO：5)、AFFKI(SEQ IDNO：6)、VFPFK(SEQ ID NO：7)、AKIFF(SEQ ID NO：8)、AFKIF(SEQ ID NO：9)、KFAFI(SEQ ID NO：10)和FAKFI(SEQ ID NO：11)及其组合。
23.如权利要求20所述的肽，其特征在于，所述肽增强细胞分泌，选自：FKFIG(SEQ ID NO：5)、FKLVY(SEQ ID NO：16)、KNQTY(SEQ ID NO：30)、FKLVG(SEQ ID NO：35)、KFIFG(SEQ ID NO：45)、LKLVY(SEQ ID NO：54)，以及它们的组合。
24.一类促进细胞粘附和/或生长的肽，其特征在于，所述肽选自：IFFKG(SEQ ID NO：1)、FIKFG(SEQ ID NO：2)、FIFAK(SEQ ID NO：3)、QVVAK(SEQ ID NO：4)、FKFIG(SEQ ID NO：5)、AFFKI(SEQ ID NO：6)、VFPFK(SEQ ID NO：7)、AKIFF(SEQ ID NO：8)、AFKIF(SEQ ID NO：9)、KFAFI(SEQ ID NO：10)和FAKFI(SEQ ID NO：11)及其组合。
25.如权利要求24所述的肽，其特征在于，所述肽结合或非特异性吸附于表面上。
26.如权利要求24所述的肽，其特征在于，所述肽是培养基的组成成分。
27.一种促进细胞的粘附和/或生长的肽组合物，其特征在于，所述组合物有一对或多对选自以下的肽：(a)AFFFQ(SEQ ID NO：12)/EEEMY(SEQ IDNO：13)和(b)FIKLM(SEQ ID NO：14)/FFIPY(SEQ ID NO：15)。
28.如权利要求27所述的肽组合物，其特征在于，所述肽组合物结合或非特异性粘附于表面上。
29.如权利要求27所述的肽组合物，其特征在于，所述组合物是培养基的组成成分。
30.一类增强细胞分泌的肽，其特征在于，所述肽选自：FKLVY(SEQ ID NO：16)，KKKKK(SEQ ID NO：17)，KKKKL(SEQ ID NO：18)，FKKKQ(SEQ IDNO：19)，FKFIG(SEQ ID NO：5)，KKKSK(SEQ ID NO：20)，KKKLK(SEQ ID NO：21)，FKKKK(SEQ ID NO：22)，LKKKK(SEQ ID NO：23)，KKLKK(SEQ ID NO：24)，KKKKT(SEQID NO：25)，KKPKK(SEQ ID NO：26)，KKPQY(SEQ ID NO：27)，SKKKK(SEQ ID NO：28)，KVKKK(SEQ ID NO：29)，KNQTY(SEQ ID NO：30)，FKKKV(SEQ ID NO：31)，KPKKK(SEQID NO：32)，FFKKK(SEQ ID NO：33)，HKNQT(SEQ ID NO：34)，FKLVG(SEQ ID NO：35)，KKQPK(SEQ ID NO：36)，EKKQT(SEQ ID NO：37)，EKKKK(SEQ ID NO：38)，KKIKQ(SEQID NO：39)，KKKKS(SEQ ID NO：40)，KKQKK(SEQ ID NO：41)，KKLNY(SEQ ID NO：42)，DGKKT(SEQ ID NO：43)，KKPTT(SEQ ID NO：44)，KFIFG(SEQ ID NO：45)，FKKMY(SEQ IDNO：46)，FFFKK(SEQ ID NO：47)，KQKKI(SEQ ID NO：48)，HIKKK(SEQ ID NO：49)，DFFHK(SEQ ID NO：50)，AKKKK(SEQ ID NO：51)，AHIKK(SEQ ID NO：52)，AHKKK(SEQID NO：53)，LKLVY(SEQ ID NO：54)，PKQKK(SEQ ID NO：55)，AKKKT(SEQ ID NO：56)，DEETY(SEQ ID NO：57)，HNPPY(SEQ ID NO：58)，GGHMS(SEQ ID NO：59)，AADEG(SEQID NO：60)，GGGGS(SEQ ID NO：61)，EEGLS(SEQ ID NO：62)，HHPST(SEQ ID NO：63)，FHHNT(SEQ ID NO：64)，ADELN(SEQ ID NO：65)，KKKK(SEQ ID NO：66)，KKK(SEQ IDNO：67)，KK(SEQ ID NO：68)，OrnOrnOrn(SEQ ID NO：69)，RRR(SEQ ID NO：70)，以及它们的组合物。
31.如权利要求30所述的肽，其特征在于，所述肽结合或非特异性吸附于表面上。
32.如权利要求30所述的肽，其特征在于，所述肽是培养基的组成成分。
33.一种修饰细胞培养系统表面以增强所述系统中的细胞生长和/或分泌的方法，其特征在于，所述方法包括向所述表面施加含有选自以下结构的肽的步骤：(a)xxxkx、(b)xxkxx、(c)xxxxk、(d)xkxxx、(e)kxxxx及其组合，其中，k代表赖氨酸，各x可以是相同或不同的氨基酸，独立选自赖氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸及其衍生物。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述肽增强细胞生长，选自：IFFKG(SEQ ID NO：1)、FIKFG(SEQ ID NO：2)、FIFAK(SEQ ID NO：3)、QVVAK(SEQ ID NO：4)、FKFIG(SEQ ID NO：5)、AFFKI(SEQ ID NO：6)、VFPFK(SEQ ID NO：7)、AKIFF(SEQ ID NO：8)、AFKIF(SEQ ID NO：9)、KFAFI(SEQ ID NO：10)和FAKFI(SEQ ID NO：11)及其组合。
35.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述肽增强细胞分泌，选自：FKLVY(SEQ ID NO：16)，KKKKK(SEQ ID NO：17)，KKKKL(SEQ ID NO：18)，FKKKQ(SEQ IDNO：19)，FKFIG(SEQ ID NO：5)，KKKSK(SEQ ID NO：20)，KKKLK(SEQ ID NO：21)，FKKKK(SEQ ID NO：22)，LKKKK(SEQ ID NO：23)，KKLKK(SEQ ID NO：24)，KKKKT(SEQID NO：25)，KKPKK(SEQ ID NO：26)，KKPQY(SEQ ID NO：27)，SKKKK(SEQ ID NO：28)，KVKKK(SEQ ID NO：29)，KNQTY(SEQ ID NO：30)，FKKKV(SEQ ID NO：31)，KPKKK(SEQID NO：32)，FFKKK(SEQ ID NO：33)，HKNQT(SEQ ID NO：34)，FKLVG(SEQ ID NO：35)，KKQPK(SEQ ID NO：36)，EKKQT(SEQ ID NO：37)，EKKKK(SEQ ID NO：38)，KKIKQ(SEQID NO：39)，KKKKS(SEQ ID NO：40)，KKQKK(SEQ ID NO：41)，KKLNY(SEQ ID NO：42)，DGKKT(SEQ ID NO：43)，KKPTT(SEQ ID NO：44)，KFIFG(SEQ ID NO：45)，FKKMY(SEQ IDNO：46)，FFFKK(SEQ ID NO：47)，KQKKI(SEQ ID NO：48)，HIKKKK(SEQ ID NO：49)，DFFHK(SEQ ID NO：50)，AKKKK(SEQ ID NO：51)，AHIKK(SEQ ID NO：52)，AHKKK(SEQID NO：53)，LKLVY(SEQ ID NO：54)，PKQKK(SEQ ID NO：55)，AKKKT(SEQ ID NO：56)，以及它们的组合。
36.一种使细胞粘附到表面以促进细胞生长的方法，其特征在于，所述方法包括：
(i)提供一表面，该表面至少有一部分被含有选自下述结构的肽包被：(a)xxxkx、(b)xxkxx、(c)xxxxk、(d)xkxxx、(e)kxxxx及其组合，其中，各x可以是相同或不同的疏水或不带电的极性氨基酸残基，k代表赖氨酸；和
(ii)使所述至少部分包被的表面与细胞接触足够长的时间，以使细胞粘附到该表面上。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述疏水或不带电的极性残基选自：Phe、Ile、Ala、Val、Pro、Gly、Gln及它们的衍生物。
38.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述肽含有选自以下的氨基酸序列：IFFKG(SEQ ID NO：1)、FIKFG(SEQ ID NO：2)、FIFAK(SEQ IDNO：3)、QVVAK(SEQ ID NO：4)、FKFIG(SEQ ID NO：5)、AFFKI(SEQ ID NO：6)、VFPFK(SEQ ID NO：7)、AKIFF(SEQ ID NO：8)、AFKIF(SEQ ID NO：9)、KFAFI(SEQ ID NO：10)和FAKFI(SEQ ID NO：11)及其组合。
39.一种细胞培养基质，其特征在于，该培养基质含有选自以下的肽：IFFKG(SEQ ID NO：1)、FIKFG(SEQ ID NO：2)、FIFAK(SEQ ID NO：3)、QVVAK(SEQ ID NO：4)、FKFIG(SEQ ID NO：5)、AFFKI(SEQ ID NO：6)、VFPFK(SEQ ID NO：7)、AKIFF(SEQ ID NO：8)、AFKIF(SEQ ID NO：9)、KFAFI(SEQ ID NO：10)和FAKFI(SEQ ID NO：11)及其组合。
40.一种细胞培养基质，其特征在于，所述培养基质含有一种肽组合物，该肽组合物含有一对或多对选自以下的肽：(a)AFFFQ(SEQ IDNO：12)/EEEMY(SEQ ID NO：13)和(b)FIKLM(SEQ ID NO：14)/FFIPY(SEQ IDNO：15)。
41.一种细胞培养基质，其特征在于，该培养基质含有选自以下的肽：FKLVY(SEQ ID NO：16)，KKKKK(SEQ ID NO：17)，KKKKL(SEQ ID NO：18)，FKKKQ(SEQ IDNO：19)，FKFIG(SEQ ID NO：5)，KKKSK(SEQ ID NO：20)，KKKLK(SEQ ID NO：21)，FKKKK(SEQ ID NO：22)，LKKKK(SEQ ID NO：23)，KKLKK(SEQ ID NO：24)，KKKKT(SEQID NO：25)，KKPKK(SEQ ID NO：26)，KKKPQY(SEQ ID NO：27)，SKKKK(SEQ ID NO：28)，KVKKK(SEQ ID NO：29)，KNQTY(SEQ ID NO：30)，FKKKV(SEQ ID NO：31)，KPKKK(SEQID NO：32)，FFKKK(SEQ ID NO：33)，HKNQT(SEQ ID NO：34)，FKLVG(SEQ ID NO：35)，KKQPK(SEQ ID NO：36)，EKKQT(SEQ ID NO：37)，EKKKK(SEQ ID NO：38)，KKIKQ(SEQID NO：39)，KKKKS(SEQ ID NO：40)，KKQKK(SEQ ID NO：41)，KKLNY(SEQ ID NO：42)，DGKKT(SEQ ID NO：43)，KKPTT(SEQ ID NO：44)，KFIFG(SEQ ID NO：45)，FKKMY(SEQ IDNO：46)，FFFKK(SEQ ID NO：47)，KQKKI(SEQ ID NO：48)，HIKKK(SEQ ID NO：49)，DFFHK(SEQ ID NO：50)，AKKKK(SEQ ID NO：51)，AHIKKK(SEQ ID NO：52)，AHKKK(SEQID NO：53)，LKLVY(SEQ ID NO：54)，PKQKK(SEQ ID NO：55)，AKKKT(SEQ ID NO：56)，DEETY(SEQ ID NO：57)，HNPPY(SEQ ID NO：58)，GGHMS(SEQ ID NO：59)，AADEG(SEQID NO：60)，GGGGS(SEQ ID NO：61)，EEGLS(SEQ ID NO：62)，HHPST(SEQ ID NO：63)，FHHNT(SEQ ID NO：64)，ADELN(SEQ ID NO：65)，KKKK(SEQ ID NO：66)，KKK(SEQ IDNO：67)，KK(SEQ ID NO：68)，OrnOrnOrn(SEQ ID NO：69)，RRR(SEQ ID NO：70)，以及它们的组合物。
42.一种肽文库，其特征在于，该文库选自以下的文库：(a)xxxkx、(b)xxkxx、(c)xxxxk、(d)xkxxx、(e)kxxxx及其排列组合，其中，k代表赖氨酸，各x可以是相同或不同的氨基酸，独立选自赖氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸及其衍生物。
43.如权利要求42所述的肽文库，其特征在于，所述文库含有共价连接于以下物质的肽：牛血清白蛋白、卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、免疫球蛋白、多糖、生长因子以及它们的组合。
44.含有权利要求1所述的肽的细胞或组织培养基。
45.含有权利要求24所述的肽的细胞或组织培养基。
46.含有权利要求27所述的肽组合物的细胞或组织培养基。
47.含有权利要求30所述的肽的细胞或组织培养基。
48.一种增强细胞生长和/或分泌的方法，其特征在于，所述方法包括在存在权利要求1所述的肽的情况下培养细胞或组织的步骤。
49.一种增强细胞培养系统中细胞分泌的肽，其特征在于，所述肽的所有氨基酸都具有带正电的侧链。
50.如权利要求49所述的肽，其特征在于，所述肽含有2个氨基酸到约20个氨基酸。
51.如权利要求49所述的肽，其特征在于，约250μM到约24mM浓度的所述肽增强所述系统中的细胞分泌。
52.如权利要求49所述的肽，其特征在于，所述肽是培养基的组成成分。
CNA02822910XA 2001-11-19 2002-11-19 促进细胞粘附、生长和分泌的肽 Pending CN1599749A (zh)

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