CN1217724A - 降钙素片段的重组制备方法和其在制备降钙素和相关类似物中的用途 - Google Patents

降钙素片段的重组制备方法和其在制备降钙素和相关类似物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种降钙素片段的重组制备方法和该片段在制备降钙素和相关类似物中的用途。该方法包括重组形成融合蛋白,该融合蛋白包括连接到碳酸酐酶上的降钙素片段。其后切割重组形成的融合蛋白以产生包括降钙素片段的多肽。本发明也提供了一种产生降钙素碳类似物的方法,该方法包括使重组形成的降钙素片段与脱氨九肽缩合。

Description

降钙素片段的重组制备方法和 其在制备降钙素和相关类似物中的用途
人们已知降钙素和相关类似物(如Elcatonin)是可以用于治疗骨萎缩(参见，例如美国专利4,086,221)的多肽。天然存在的降钙素(如鳗鱼、鲑鱼或者人体降钙素)是C末端酰胺化的多肽，该多肽由32个氨基酸组成，在每一种情况中其第一和第七个氨基酸是L-半胱氨酸，两个半胱氨酸的巯基通过二硫键的形成来相互连接。可以例如通过从哺乳动物甲状腺中提取获得天然降钙素(参见，例如美国专利5,428,129)。
Elcatonin是一种改进的合成降钙素“碳”类似物，其活性可与鳗鱼降钙素相比(Morikawa等，Experienta,32,1004,1976)。与鳗鱼降钙素相比，Elcatonin缺乏氨基末端，并且鳗鱼降钙素的二硫键为-(CH2)5-“碳桥”所取代。
当前，利用纯化学过程制备Elcatonin的各种方法是已知的。这些化学方法包括相应的氨基酸或者肽的缩合(参见，例如美国专利4,086,221和美国专利5,428,129)。然而纯化学方法都有其缺点，即由于所要求的精细纯化方法，只能以低产率获得Elcatonin，随之而来的是它的制备十分昂贵。
因此，在通过利用某一方法制备Elcatonin的过程中能够避免纯化学方法的不利之处将是有益的，这些方法包括分子部分的重组制备。这一目的是可以实现的，例如，如果有一种用于重组制备C末端多肽片段的简单方法。然后可以将重组合成的C末端片段用作为制备降钙素或者碳类似物(如Elcatonin)的起始肽。部分重组方法也将有利于降钙素的肽类/肽类似物、Elcatonin和相关类似物或者衍生物的合成，这些衍生物可能包括非天然的氨基酸。
发明概要
本发明涉及降钙素片段的重组制备方法和该片段在制备降钙素和相关类似物中的用途，该相关类似物包括如Elcatonin的碳类似物(在下文称作为“降钙素碳类似物”)。本发明包括重组形成融合蛋白，该融合蛋白包括通过切割位点连接到碳酸酐酶上的靶序列。该靶序列包括至少大约15个氨基酸残基，该残基对应于接近降钙素C-末端的片段或者对应于这种片段的密切相关类似物。典型地，靶序列包括对应于降钙素或者密切相关类似物的氨基酸残基10直至32(在下文共同称作为“10-32片段”)的氨基酸序列。其后用切割试剂切割重组形成的融合蛋白以产生包括靶序列的多肽。通过使融合蛋白与化学切割试剂或者酶促切割试剂接触来实现切割反应。合适切割试剂和掺入融合蛋白中的相应切割位点的选择都将取决于存在于融合蛋白中的具体的靶序列和碳酸酐酶序列。典型地，可这样选择切割试剂以及切割位点，其中构成切割位点的氨基酸序列并不出现在靶序列或者碳酸酐酶的氨基酸序列之中。例如，不能对包括猪、牛或者羊降钙素10-32片段的融合蛋白在蛋氨酸上进行溴化氰切割。
切割位点典型地存在于连接碳酸酐酶和靶序列的接头序列中。此外，融合蛋白可以包括一种构建体，其中碳酸酐酶的C-末端直接与靶序列的N-末端连接。这可以发生在碳酸酐酶的C末端残基和靶序列的N末端残基构成切割位点(其使得可以进行上述两片段之间的肽键的切割)的情况下。除存在于接头序列中的切割位点之外，融合蛋白的碳酸酐酶部分也可以包括不同的切割位点，该切割位点使得融合蛋白可以被切割从而形成“微型融合蛋白质”，即具有仍然与靶序列连接的碳酸酐酶的C末端部分的一种多肽。
本发明的一种实施方案包括一种用于多肽的重组制备的方法，该多肽对应于降钙素或者相关类似物的氨基酸10-32(“10-32个片段”)。该方法典型地包括下式的多肽片段(“10-32片段-Xxx”)的重组制备：A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ ID NO:1)
其中A10是Gly或者Ser,A11是Lys、Thr或者Ala,A12是Leu或者Tyr,A13是Ser、Thr或者Trp,A14是Gln、Lys或者Arg,A15是Glu、Asp或者Asn,A16是Leu或者Phe,A17是His或者Asn,A18是Lys或者Asn,A19是Leu、Tyr或者Phe,A20是Gln或者His,A21是Thr或者Arg,A22是Tyr或者Phe,A23是Pro或者Ser,A24是Arg、Gly或者Gln,A25是Thr或者Met,A26是Asp、Ala、Gly或者Asn,A27是Val、Leu、Ile、Phe或者Thr,A29是Ala、Val、Pro或者Ser,A30是Gly、Val或者Glu,A31是Thr、Val或者Ala。C-末端-Xxx基团典型地是C末端羧酸(“-OH”)，C末端甲酰胺(“-NH2”)，或者能转化成C末端甲酰胺的基团，如氨基酸残基或者多肽基团(典型地，具有2至大约10个氨基酸残基)。由残基A10至A32(SEQ IDNO:2)表示的10-32片段相应于得自鳗鱼(SEQ ID NO:37)，鲑鱼Ⅰ(SEQ IDNO:38)、鲑鱼Ⅱ(SEQ ID NO:39)、鲑鱼Ⅲ(SEQ ID NO:40)，小鸡(SEQID NO:41)、人(SEQ ID NO:42)、兔(SEQ ID NO:43)、猪(SEQ IDNO:44)、牛(SEQ ID NO:45)和羊(SEQ ID NO:46)降钙素或者密切相关类似物(参见显示在图9中的降钙素序列)的氨基酸序列的残基10直至32。本方法也用来重组产生与修饰的降钙素序列相应的10-32片段。修饰的降钙素序列可以包括一个或多个在天然氨基酸序列中的保守氨基酸取代。
10-32片段可以用于降钙素和相关类似物的制备。这种制备典型地包括下式的N末端片段：
Figure A9719312300091
其中A2是Gly、Ser或者Ala,A3是Asn或者Ser,Aa是Val或者Met,R2是(CH2)4或者-CH(NH2)CH2S-S-，以及Y是OH、OR1，其中-R1是低级烷基；
与重组形成的具有下式的多肽在非酶促联试剂的存在下缩合：A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ ID NO:1)
其中A10是Gly或者Ser,A11是Lys、Thr或者Ala,A12是Leu或者Tyr,A13是Ser、Thr或者Trp,A14是Gln、Lys或者Arg,A15是Glu、Asp或者Asn,A16是Leu或者Phe,A17是His或者Asn,A18是Lys或者Asn,A19是Leu、Tyr或者Phe,A20是Gln或者His,A21是Thr或者Arg,A22是Tyr或者Phe,A23是Pro或者Ser,A24是Arg、Gly或者Gln,A25是Thr或者Met,A26是Asp、Ala、Gly或者Asn,A27是Val、Leu、Ile、Phe或者Thr,A29是Ala、Val、Pro或者Ser,A30是Gly、Val或者Glu,A31是Thr、Val或者Ala,以及-Xxx是-OH、-NH2、氨基酸残基或者多肽基团；
形成具有下式的降钙素衍生物：A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ ID NO:48)
在本发明的一个实施方案中，用脱氨九肽缩合重组形成的10-32片段。脱氨九肽是N末端降钙素片段的碳类似物并且典型地具有式：
Figure A9719312300102
其中A2是Gly、Ser或者Ala,A3是Asn或者Ser,A8是Val或者Met，以及Y是OH、OR1，其中-R1是低级烷基(即C1-C6烷基)。利用如在美国专利4,086,221和美国专利5,428,129所描述的那些化学偶联反应可以实现缩合反应，这些专利的公开内容并入本文作为参考。化学偶联剂是本领域技术人员所熟知的。合适的化学偶联剂包括碳二亚胺和各种其它非酶促试剂，这些非酶促试剂能够与肽的α-羧酸基团进行反应从而形成活化的羧酸衍生的α-羧酸衍生物，该α-羧酸衍生物与另一个氨基酸或者多肽的N末端α-氨基反应。其中使脱氨九肽的C末端α-羧酸转化成为酰基叠氮、混合酸酐、咪唑酰胺或者活性酯的化学偶联反应可以用于本发明中。在存在碳二亚胺和能够形成活性酯的试剂的情况下，可以实现一种特别有效的偶联两个肽片段的方法，所说试剂例如为二环己基碳二亚胺(“DCC”)和N-羟基琥珀酰亚胺(“HOSu”)或者1-羟基苯并三唑(“HOBt”)的混合物。
用于缩合的重组形成的10-32片段优选地具有下式：A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ ID NO:1)
其中，A10直至A31和-Xxx如本文所定义。
偶联反应的产物典型地是具有下式的降钙素碳类似物：
Figure A9719312300111
A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ ID NO:4)
其中，A10直至A31和-Xxx如本文脱氨九肽(SEQ ID NO:3)或者10-32片段-Xxx(SEQ ID NO:1)下所定义的一样。典型地，在存在非酶促偶联试剂的情况下实现脱氨九肽和重组形成的肽的偶联。
本发明的一个优选实施方案提供了一种方法，该方法用于具有下式的多肽片段(这里称作为“ECF2-酰胺”)的重组制备和酰胺化：Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH2(SEQ ID NO:6)以及用于偶联ECF2-酰胺到Elcatonin的氨基末端片段(下文称作为“ECH1”)，该氨基末端片段具有式：
Figure A9719312300112
本发明也提供了一个核酸序列，该核酸序列包括编码降钙素或者相关类似物的氨基酸10-32的序列。该核酸序列典型地编码融合蛋白，该融合蛋白包括通过切割位点连接到碳酸酐酶上的10-32片段。优选利用用于目标宿主细胞(如大肠杆菌、酿酒酵母或者巴斯德毕赤酵母)的最佳密码子使用，设计编码10-32片段的基因部分。
附图简要描述
图1显示质粒pET31F1mhCAⅡ的图。该质粒包括与pSP65复制起点的相反方向上引入的来自质粒pEMBL8的复制起点F1。
图2显示质粒pABN的图。质粒pABN包括编码接头肽片段(SEQ IDNO:49)的核酸序列(SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48)，该接头肽片段插入到质粒中邻近人碳酸酐酶Ⅱ(“hCAⅡ”)的基因序列的羧基末端处。
图3显示质粒pTBN的图。质粒pTBN是四环素抗性表达载体，该载体得自pABN的1.5kb片段向质粒pBR322中的插入。该1.5kb片段包括pABN的T7启动子、hCAⅡ、接头和T7终止子序列。
图4A是用PCR方法制备编码ECF2-Ala和附加的限制酶切位点(使得将片段克隆进入质粒得以实现)的核苷酸序列的第一步的示意说明。通过利用Taq DNA聚合酶在PCR MIX 1上实施PCR反应实现这一步骤。
图4B是编码ECF2-Ala的DNA序列的制备的第二步的示意性说明。得自在PCR MIX 1中的寡核苷酸2和3的延伸(分别为2Ext(SEQ ID NO:8)和3Ext(SEQ ID NO:50))的PCR产物在它们的3’末端上具有20bp互补序列。利用Taq DNA聚合酶的第二个PCR反应产生了双链核苷酸片段，该核苷酸片段包括编码ECF2-Ala(SEQ ID NO:9)的全长无间断基因序列。
图5显示质粒pTBN26的图。质粒pTBN26包括总hCAⅡ-接头-ECF2-Ala融合蛋白(“hCA-ECF2-Ala”)构建体的基因序列。
图6A显示hCAⅡ-接头-ECF2-Ala融合蛋白构建体的N末端蛋氨酸和hCAⅡ残基1-162的核苷酸(SEQ ID NO:11)和氨基酸(SEQ ID NO:12)序列。
图6B显示hCAⅡ-接头-ECF2-Ala融合蛋白构建体的hCAⅡ残基162-257以及接头和ECF2-Ala片段的核苷酸(SEQ ID NO:11)和氨基酸(SEQ ID NO:12)序列。
图7显示Elcatonin和鳗鱼降钙素的23氨基酸C末端片段(“ECF2”)的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)和氨基酸(SEQ ID NO:6)序列。所显示的核苷酸序列是编码ECF2的序列，ECF2存在于掺入到质粒pTBN26中的hCA-ECF2-Ala融合蛋白的基因中。
图8显示包含ECF2-酰胺(SEQ ID NO:6)的样品的代表性制备性HPLC图(利用聚磺乙基天冬酰胺(polysulfolethylaspartamide)柱)。ECF2-酰胺的峰值出现在14.5和16.3分钟之间。
图9A显示来源于一些物种的降钙素的残基1-15的氨基酸序列。
图9B显示来源于一些物种的降钙素的残基16-32的氨基酸序列。
图10显示经由PCR方法从5寡核苷酸(描述在实施例1.1中)合成的双链DNA片段(SEQ ID NO:9)以及由该双链DNA片段(SEQ ID NO:10)编码的肽序列。
图11描述在编码ECF2的基因序列的PCR合成期间产生的寡核苷酸2Ext的核苷酸序列(SEQ ID NO:8)。
图12描述在编码ECF2的基因序列的PCR合成期间产生的寡核苷酸3Ext的核苷酸序列(SEQ ID NO:50)。
发明详述
按照本发明的融合蛋白的重组制备包括编码靶序列的核酸序列(“FP核酸序列”)的构建，该靶序列通过切割位点连接到碳酸酐酶上。在图6中所显示的FP核酸序列是用于本方法的合适核酸序列的一个例子。在图6中所显示的核酸序列包括编码人碳酸酐酶Ⅱ(“hCAⅡ”)的残基1-257的密码子。
这一氨基酸序列或者碳酸酐酶的其它功能活性片段在融合蛋白中的包含极大地有利于融合蛋白从细胞碎片中分离出来。如本文所使用的，术语“碳酸酐酶”包括天然存在的碳酸酐酶(和任一等位变体)、功能活性碳酸酐酶片段或者其修饰体(“突变体”)。这里的“功能活性碳酸酐酶片段和突变体”意指碳酸酐酶的片段或者修饰体，其仍显示出hCAⅡ的酶抑制剂结合性质。具有这样性质的片段能够极紧密地结合碳酸酐酶抑制剂(如磺胺)。具有这样结合性质的功能活性片段显示出高度选择性的与低分子量配体(例如磺胺或者其合成衍生物)的亲和结合。一般来说，这种结合是如此强烈以致碳酸酐酶/配体缀合物将显示出不超过大约10-7M的溶液解离常量(结合常数的倒数)。一般地，这种配体是碳酸酐酶的可逆抑制剂。合适的碳酸酐酶片段可以缺乏酶的N末端或者C末端部分，只要该片段保持酶的功能性抑制剂结合活性。同样地，修饰碳酸酐酶(在本发明融合蛋白中可以用作为结合蛋白)可以通过一个或多个氨基酸的加入、缺失或者插入得到修饰，只要修饰酶本质上显示出以上所描述的抑制剂结合活性。典型地，通过缺失或者改变氨基酸残基修饰碳酸酐酶，结果是修饰酶不包含将要在融合蛋白中用作为切割位点的特异氨基酸。例如，当溴化氰将要用作为切割试剂时，可以修饰碳酸酐酶以除去或者取代正常存在的任一蛋氨酸(“Met”)残基。
FP核酸序列包括编码10-32片段的序列，即降钙素或者密切相关类似物的氨基酸残基10-32。密切相关类似物可以得自在降钙素10-32片段中的保守氨基酸取代。可以设计这部分核酸序列以便优化融合蛋白在特异宿主细胞中的表达。例如，在将要利用肠杆菌(如大肠杆菌)作为宿主有机体进行融合蛋白的表达的情况下，典型地基于在目标宿主有机体中的密码子使用频率(参见，例如，Gribskov等，核酸研究，12,539-549,1984中的密码子使用频率的讨论)构建编码10-32片段的核酸序列和切割位点。
切割位点可以是化学切割位点或者酶促切割位点。在PCT专利申请号WO 92/01707中详尽地描述了化学和酶促切割位点和用来进行与这些位点之一连接的肽键切割的相应试剂，该专利申请的公开内容引入本文作为参考。适合于在本发明中用作为切割位点的肽序列(以及编码它的DNA基因序列)和相应的切割酶或者化学切割条件的例子显示在表1中。所表明的基因序列是编码相应肽序列的一种可能序列。可以构建编码相同肽序列的其它DNA序列。优选地，基于将要用于融合蛋白表达的宿主细胞的每一氨基酸的更通常使用的密码子，设计编码切割位点的核酸序列。例如，核苷酸序列可以基于在如大肠杆菌的肠杆菌中的最佳密码子使用(参见，例如Gribskov等，1984，核酸研究，12,539-549)。
切割位点可以存在作为接头肽的一部分，该接头肽连接碳酸酐酶和靶序列。例如，在图6中描述的hCAⅡ-接头-ECF2-Ala(“hCA-ECF2-Ala”)的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)包括一个七氨基酸接头序列(-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Asn-；(SEQ ID NO:14))，该接头序列建立了可由羟胺(“Asn-Gly”)切割的化学切割位点，该切割位点位于接头的C末端天冬酰胺残基和靶序列的N末端甘氨酸残基之间。
表1用于切割的酶    肽序列            DNA序列肠激酶          (Asp)4Lys         GACGACGACGATAAA
            (SEQ ID NO:16)    (SEQ ID NO:15)因子Xa          IleGluGlyArg      ATTGAAGGAAGA
            (SEQ ID NO:18)    (SEQ ID NO:17)凝血酶          GlyProArg或者     GGACCAAGA或者
            GlyAlaArg         GGAGCGAGA遍在蛋白切割酶  ArgGlyGly         AGAGGAGGA肾素            HisProPheHisLeu-  CATCCTTTTCATC-
            LeuValTyr         TGCTGGTTTAT
            (SEQ ID NO:20)    (SEQ ID NO:19)胰蛋白酶        Lys或者Arg         AAA或者CGT胰凝乳蛋白酶    Phe或Tyr或Trp      TTT或TAT或TGG梭菌蛋白酶      Arg                CGTS.aureus V8     Glu                GAA化学切割        肽序列             DNA序列(在pH3)         AspGly或AspPro     GATGGA或GATCCA(羟胺)          AsnGly             AATCCA(CNBr)          蛋氨酸             ATGBNPS-粪臭素     Trp                TGG2-硝基-5-       Cys                TGT氰硫基苯甲酸
融合蛋白包括至少一个拷贝，并且可以包括多个靶序列拷贝。在存在多个靶序列拷贝的情况下，这些拷贝可以串联地连接在一起。此外，靶序列的拷贝可以由内部接头肽连接在一起。上述内部接头肽可以与外部接头肽相同或者不相同，上述外部接头肽把碳酸酐酶与靶肽的第一个拷贝相连接。如果上述内部和上述外部接头肽是相同的或者包括相同的切割位点，那么可以直接切割融合蛋白从而产生一些片段，这些片段的每一个包含靶肽的单拷贝。然而，如果上述内部和上述外部接头肽包含不同的切割位点，那么就有可能是首先把碳酸酐酶片段切割下来从而形成具有一个以上靶肽拷贝的中间多肽。
利用本方法可以从多拷贝构建体(具有包括蛋氨酸残基的内部连接肽)中产生无蛋氨酸残基的靶序列。在蛋氨酸残基与靶序列的C-末端直接连接的情况下，可以用溴化氰切割上述多拷贝构建体。可以利用例如丝氨酸羧肽酶(如羧肽酶Y)的羧肽酶对所产生的片段进行转肽基作用从而用α-酰胺化的氨基酸取代C末端高丝氨酸残基。该片段也可以利用羧肽酶转酰胺化从而用2-硝基苄胺化合物取代C末端高丝氨酸残基。这一过程产生具有C末端(2-硝基苄基)酰氨基的片段，所说的酰氨基可以以光化学方式分解从而产生无高丝氨酸残基的α-酰胺化的肽片段。
在构建体中包括多拷贝靶序列的融合蛋白的一个例子中，所说的构建体包括hCA-(MetValAspAspAspAspAspAsn-ECF2)n-Xxx，其中hCA、ECF2和Xxx如本文所定义，n是一个整数(典型地是2-20)。可以利用CNBr处理这种构建体从而形成ValAspAspAspAspAsn-ECF2-Hse(SEQID NO:49)肽片段(其中Hse是由CNBr与Met残基的反应产生的高丝氨酸残基)。然后当如羧肽酶Y的肽酶存在时可以使该肽片段与如邻硝基苯基甘氨酸酰胺(“ONPGA”)的亲核体进行反应，结果导致Hse残基为ONPGA所取代。利用光解，将转肽基作用产物转化成为C末端甲酰胺。通过用羟胺处理可以从所述片段上切除N末端尾序列ValAspAspAspAspAsn(SEQ ID NO:50)。
本发明的一个优选实施方案涉及C末端鳗鱼降钙素多肽片段即ECF2-酰胺(SEQ ID NO:6)的制备。该制备包括下列蛋白质构建体的起始遗传表达：
Met-hCAⅡ’-Met240-Va1241-hCAⅡ”-接头-ECF2-aa
              (“hCA-ECF2-aa”)其中，aa是氨基酸残基，Met是任一大肠杆菌蛋白质所需要的N末端残基。将Met残基加入至hCAⅡ’(人碳酸酐酶Ⅱ的239氨基酸N末端多肽片段)的第一个残基的N-末端上，Met240-Va1241是在人碳酸酐酶Ⅱ(“hCAⅡ”)中的唯一的溴化氰不稳定的肽键，hCAⅡ”是来源于邻近hCAⅡ(残基242-257)的C末端的16氨基酸片段(SEQ ID NO:21)。ECF2-aa的C末端氨基酸残基(SEQ ID NO:22)(即aa)提供了酰胺化信号从而使之能够转变成为Pro-酰胺，该Pro-酰胺构成Elcatonin(SEQ IDNO:13)的C-末端。aa残基典型地是如丙氨酸的氨基酸残基，该氨基酸残基能够经由转酰胺反应与亲核体的交换。
所需要的产物ECF2-aa(SEQ ID NO:22)可以用至少两种方法得自hCA-ECF2-aa蛋白质构建体。第一种方法使用利用羟胺在Asn-Gly键上对hCA-ECF2-aa的切割，从而直接产生ECF2-aa(SEQ ID NO:22)。此外，利用溴化氰(CNBr)的切割产生微型融合蛋白质，该融合蛋白质包括连接到ECF2-aa多肽(SEQ ID NO:22)上的hCAⅡ的hCAⅡ”C末端片段(SEQ ID NO:21)。其后可以在微型融合蛋白质侧链残基的衍生化作用之前或者之后用羟胺切割该微型融合蛋白质从而提供ECF2-aa(SEQ IDNO:22)，所说的衍生化作用是指例如，其中ECF2-aa(SEQ ID NO:22)的Lys残基已得到衍生而形成具有Z-保护侧链氨基的Lys残基。在其中衍生化作用试剂修饰Lys的侧链氨基功能的情况下，在衍生的微型融合蛋白质切割之后，所产生的带保护基的ECF2-aa(SEQ ID NO:22)在N末端甘氨酸残基的α位上将仅仅具有单自由氨基功能团。自由N末端α-氨基可以用于尔后的特异性化学反应，例如偶联到ECF1(SEQ ID NO:7)的C末端残基上从而提供Elcatonin(SEQ ID NO:13)。这种类型的偶联反应可以在ECF2-aa多肽(SEQ ID NO:22)已转化成为具有C末端残基Pro-酰胺(“ECF2-酰胺”，(SEQ ID NO:6))的ECF2衍生物之后进行，或者可以用来产生衍生形式的Elcatonin(例如“Elcatonin-aa”，(SEQ ID NO:30))，该衍生形式的Elcatonin用于尔后的向Elcatonin(SEQ ID NO:13)的转变。
ECF2-aa的优选序列是：Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Ala(“ECF2-Ala”,SEQ ID NO:23)
ECF2-Ala肽片段可以得自hCA-ECF2-Ala蛋白质构建体的切割，例如通过利用羟胺的处理。hCA-ECF2-Ala蛋白质构建体可以包括序列：hCAⅡ’-Met-Val-Asp-Asn-Trp-Arg-Pro-Ala-Gln-Pro-Leu-Lys-Asn-Arg-Gln-Ile-Lys-Ala-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Asn-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Ala(SEQ ID NO:12)
此外，可以在不同键上切割hCA-ECF2-Ala蛋白质构建体从而产生前ECF2-Ala肽，即微型融合蛋白质。例如，可以切割hCA-ECF2-Ala蛋白质构建体从而产生前ECF2-Ala肽，这些肽包括hCAⅡ的C末端片段或者其修饰体连接在ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)的N-末端上。在本发明的一个优选实施方案中，可以用溴化氰(CNBr)切割hCA-ECF2-Ala蛋白质构建体(SEQ ID NO:12)从而产生具有下列氨基酸序列的微型融合蛋白质(“MFP”)：Val-Asp-Asn-Trp-Arg-Pro-Ala-Gln-Pro-Leu-Lys-Asn-Arg-Glu-Ile-Lys-Ala-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Asn-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Ala(SEQ ID NO:24)
MFP包括hCAⅡ的C末端的Val241-hCAⅡ”片段：Val-Asp-Asn-Trp-Arg-Pro-Ala-Gln-Pro-Leu-Lys-Asn-Arg-Glu-Ile-Lys-Ala(SEQ ID NO:25)以及具有下式的接头序列：
Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Asn(SEQ ID NO:14)。
人碳酸酐酶Ⅱ(hCAⅡ)的多肽片段hCAⅡ’-Met240-Val241-hCAⅡ”已在生物化学，9,2638(1970)中有报道，并且可以用作为结合蛋白片段，用来利用如在(WO 92/01707)中所描述的那些方法纯化碳酸酐酶-ECF2-aa蛋白质构建体。按照WO 92/01707，碳酸酐酶片段或者修饰的碳酸酐酶也可以用作为结合蛋白片段。
用于一些其它碳酸酐酶的氨基酸序列也有报道(参见，例如Hewett-Emmett等，在碳酸酐酶中，Dodgson等编著，第2章，pp.15-32,1991)。如果特异碳酸酐酶的氨基酸序列是已知的但没有基因可供使用，那么可以利用本领域技术人员所熟知的方法(参见，例如Sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，N.Y,1989；以及Tanhauser等，基因，117,113-117,1992)分离编码碳酸酐酶的cDNA。这些方法典型地包括构建编码所讨论的碳酸酐酶片段的核酸探针(例如长为大约20-30个碱基对)。基于已知氨基酸序列或者相关DNA序列的简并性核苷酸探针可以用来筛选cDNA文库(参见，例如Wallace等，核酸研究，6,3543,1979和Wallace等，核酸研究，9,879,1981)。
在本发明的另一个实施方案中，靶序列可以包括其中10-32片段的至少一个C末端残基已为一个或多个氨基酸残基(“离去单位”)所取代的氨基酸序列。可以在除去碳酸酐酶部分的融合蛋白切割之前或者之后经由转肽基反应修饰靶序列的C末端。转肽基反应典型地导致离去单位从靶序列的C末端上除去以及它被“10-32片段”的丢失的C末端残基(或者多个残基)所取代。例如，可以利用S.aureus V8对具有C末端离去单位的重组产生的肽(如鳗鱼降钙素的氨基酸残基10-30偶联到C末端丙氨酸上的鳗鱼(10-30)-Ala)进行转肽基作用从而在残基Glu30取代Ala C末端残基之后引入Thr-Pro-NH2二肽。
除用于降钙素碳类似物(如Elcatonin)的制备外，本发明的重组合成的10-32片段可以用于降钙素的合成。例如，可以利用非酶促偶联试剂将鳗鱼降钙素的环氧化形式的残基1-9与ECF2酰胺的侧链保护的衍生物偶联，例如，其中Ser、Thr和Glu残基被保护作为苄基醚或者酯并且Lys残基为CBZ基团所保护。可以用来实现偶联反应的合适的非酶促偶联试剂的例子包括DCC、N-乙基-N′-二甲基氨丙基-碳二亚胺(“EDAPC”)、DCC/HOSu、DCC/HOBt以及EDAPC/HOSu(参见，例如美国专利5,429,129，其公开内容并入本文作为参考)。Ⅰ．融合蛋白的重组形成
a．载体
选择掺入融合蛋白基因的表达载体以便使之可与宿主细胞相容。一般地，所利用的载体具有许多共同的特性。这些特性包括可与宿主细胞相容的复制起点、用于转录和转录调节(对于可诱导系统)的调节DNA序列、有效的核糖体结合位点(对于原核宿主)、聚A信号(对于真核宿主)。此外，可以包括表型基因、调节区以及前导序列。
原核载体(如那些用于在大肠杆菌中表达的载体)的特点在于复制起点、用于转化细菌的选择的遗传标记(表型)以及将指导感兴趣的基因的表达的DNA调节序列。典型地，所说的调节序列将包括驱动转录的启动子、控制转录(开/关开关)的操纵基因、起始翻译的有效的核糖体结合位点以及转录终止信号。起始和终止密码子由插入(融合蛋白)的基因提供。
原核载体尤其包含合适的“表达盒”，该表达盒基于一些可供使用的启动子/操纵基因系统之任一个。包含在原核载体中的典型的启动子包括乳糖、色氨酸、T7、脂蛋白、碱性磷酸酶、λ左或右启动子或者它们的混合物(杂合启动子)。乳糖和色氨酸操纵基因以及温敏的λ启动子是典型的开/关开关，这种开关可以包括在原核载体中。包含在原核载体中的典型的表型标记包括用于产生对氨苄青霉素、四环素、卡那霉素以及氯霉素的抗性的基因。
真核载体(如那些用于在酵母、酿酒酵母中表达的载体)典型地是穿梭载体，该穿梭载体包含用于大肠杆菌的复制起点和用于酿酒酵母的复制起点、两种细胞类型的遗传标记以及将指导在酵母中表达的DNA调节序列。所说的调节序列典型地包括启动子、调节序列以及转录终止信号(包括聚腺苷酸化信号)。用于指导细胞分泌的可有可无的信号序列也可以插入到真核载体中。将要掺入的典型的标记对基因中的突变的互补提供阳性选择，该基因对于尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、腺嘌呤、色氨酸等的产生是必要的。可以优选地掺入真核载体中的启动子序列包括醇脱氢酶Ⅰ或者Ⅱ、磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerokinase)、半乳糖、色氨酸、交配因子α等等。
依据所选择的载体的性质，可以在各种有机体中表达ECF2-aa基因片段。具有特异宿主范围的载体和具有广泛宿主范围的载体都适合用于本发明中。具有特异宿主范围的载体的例子，例如对于大肠杆菌来说，是pBR322(Bolivar等，基因，2,95-113,1977)、PUC18/19(Yanisch Perron等，基因，23,103-119,1985)、pK18/19(Pridmore，基因，56,309-312,1987)、pRK290X(Alvarez-Morales等，核酸研究，14,4207-4227,1986)和pRA95(可得自Nycomed Pharm a AS,Huidove，丹麦)。
可以使用的其它载体是适合用于革兰氏阴性细菌中的“广泛宿主范围”载体。这样的“广泛宿主范围”载体的例子是pRK290(Ditta等，Proe.Nat.Acad.Sci.,77,7347-7351,1980)、pKT240(Bagdasarian等，基因，26,273-282,1983)、如pLAFR1(Long等，自然，289,485-488,1982)的pRK290衍生物、如pMMB66EH(Furste等，基因，48,119-131,1986)或者pGSS33(Sharpe，基因，29,93-102,1984)的pKT240衍生物。
b．质粒pTBN的构建
包含hCAⅡ基因的表达载体pET31F1mhCAⅡ获自佛罗里达大学的P.J Laipis博士。氨苄青霉素抗性的T7表达载体由在Tanhauser等，基因，117,113-117(1992)中所描述的方法从质粒pET-3c(Studier等，Methods EnZymol.,185,60-89,1990)中构建。将得自pET-3c载体的T7表达盒转移到截短的pSP65质粒上。为了使单链质粒DNA能够产生，将得自pEMBL8+(Dente等，核酸研究，11,1645-1655,1983)的F1起点连接到阳性克隆的BglⅡ限制酶切位点中。指定所产生的质粒为pET31F1m,其中F1m表示F1起点具有pSP65复制起点的相反方向。最后，将人碳酸酐酶ⅡcDNA(hCAⅡ cDNA)克隆在pET31F1m质粒中Nde±和BamHⅠ位点之间，从而给出指定为pET31F1mhCAⅡ(参见图1)的质粒。
通过首先在佛罗里达大学的DNA Synthesis Core of theInterdisciplinary Center for Biotechnology合成两种互补寡核苷酸来建立质粒的接头区：5′A GCT TTC GTT GAC GAC GAC GAT ATC TT 3′(SEQ ID NO:26)5′AGC TAA GAT ATC GTC GTC GTC AAC GAA 3′(SEQ ID NO:27)
将上述寡核苷酸磷酸化、退火并连接到邻近hCAⅡ基因序列的羧基末端的Hind Ⅲ位点中。包含插入片段的质粒具有唯一的EcoR Ⅴ位点，该位点紧随多肽片段即接头(SEQ ID NO:14)中的第四个天冬氨酸残基。所产生的质粒称作为pABN(参见图2)。
利用质粒pABN和pBR322(Bolivar等，基因，2,95-113,1977)构建四环素抗性的表达载体，该表达载体用于ECF2-aa(SEQ ID NO:27)的产生，例如其中aa是Ala。将得自pABN的1.5-kb SspⅠ/BspEⅠ片段插入到pBR322的ScaⅠ位点中，结果产生pTBN(参见图3)。
c．宿主菌株和转化
用于按照本发明进行限制性切割、连接、转化、选择、培养和裂解的方法中的过程一般采用本领域所知的标准方法。提供这些方法的细节的文献包括Sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，N.Y.(1989)，其公开内容并入本文作为参考。
为了制备用于发酵的生产菌株，把编码hCA-ECF2-aa的DNA片段引入适合于hCA-ECF2融合蛋白表达的宿主菌株。适合于表达这一基因的微生物(典型地包括具有底物和原材料的高耐受性的菌株)的例子是肠杆菌，如埃希氏菌属。大肠杆菌种的微生物是特别优选的。该微生物可以包含在载体分子上的或者在整合到它们的染色体中的hCA-ECF2-aaDNA片段。用包含hCA-ECF2-aa DNA片段的载体利用本领域技术人员所熟知的方法(参见，例如Sambrook等，上述引用的)转化所选择的微生物。合适的生产菌株的例子是大肠杆菌JM 109(DE3)和大肠杆菌BL21(DE3)，在所说的每一种生产菌株的情况下都包含编码融合蛋白的质粒，例如pTBN26。
真核细胞可以包括单细胞生物(如酵母细胞)以及得自高等生物的无限增殖细胞(如植物、昆虫或者哺乳动物细胞)。合适的真核宿主细胞包括酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、黑曲霉、草地夜蛾以及玉米、烟草或者大豆植物细胞。可作为宿主的高等生物包括具有可进行转化的生殖细胞的高等植物和动物。包括在其中的是如烟草、玉米、大豆和有果植物的植物和鱼、鸟的无脊椎动物和脊椎动物以及如绵羊、山羊、母牛，马和猪的哺乳动物。
典型地，将所转化的宿主菌株从加有抗生素的选择性营养培养基分离出来，其中由于标记基因定位在载体上面因而宿主菌株具有对抗生素的抗性。
d．发酵
利用微生物实现hCA-ECF2-aa融合蛋白的重组制备，该微生物包含hCA-ECF2-aa DNA片段和/或载体质粒(包含hCA-ECF2-aa片段)。利用本质上已知的方法可以实现上述过程，例如利用在WO 92/01707中所描述的方法。据此，可以利用市售的生长培养基，如Luria肉汤。分批向发酵液中补加氧和氨基酸补料以提供高细胞密度。在发酵完成之后，可以如同在WO 92/01707中所描述的一样破坏微生物，并且纯化hCA-ECF2-aa融合蛋白，例如利用如WO 92/01707中所描述的磺胺亲和层析。Ⅱ．产生ECF2-Ala的融合蛋白的切割
可以在氨基酸Asn 7(接头序列的氨基酸7)和Gly A10(ECF2-Ala的氨基酸1)之间(由下列的“*”指出)切割具有以下所显示的序列的融合蛋白：hCAⅡ’-Met-Val-Asp-Asn-Trp-Arg-Pro-Ala-Gln-Pro-Leu-Lys-Asn-Arg-Gln-Ile-Lys-Ala-Ser-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Asn*-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Ala(SEQ ID NO:12)
通过用羟胺处理可以实现在该位点的特异性切割。所产生的ECF2-Ala片段(SEQ ID NO:23)可以由常规方法纯化。Ⅲ．形成ECF2-酰胺(SEQ ID NO:6)的ECF2-aa(SEQ ID NO:22)的酰胺化
通过在有羧肽酶Y(参见下述的方案1)的情况下利用亲核氨基化合物转酰胺化如ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)的ECF2-aa肽，按照WO 92/05271可以实现ECF2-aa(SEQ ID NO:22)的酰胺化，从而形成能够被反应或者分解而形成ECF2-NH2(SEQ ID NO:6)的肽中间体。合适的亲核体的例子包括邻硝基苄胺，如邻硝基苯基甘氨酸酰胺(“ONPGA”)。转酰胺化导致ECF2-aa(SEQ ID NO:22)的C末端-aa残基为亲核胺所取代。所产生的光不稳定中间体(例如ECF2-ONPGA(SEQ ID NO:28))的光解导致亲核体的切割和在羧基末端具有酰胺化的脯氨酸的ECF2片段(“ECF2-酰胺”，SEQ ID NO:6)的产生。ECF2-酰胺可以由常规方法纯化。方案1
Figure A9719312300241
Ⅳ.Elcatonin片段1(ECF1)和ECF2-酰胺的缩合
利用如本文所描述的标准的肽偶联反应，例如在有DCC/HOSu、EDAPC/HOSu或者DCC/HOBt的情况下，可以偶联N末端Elcatonin片段ECF1(SEQ ID NO:7)和Elcatonin相关片段ECF2-Xxx(SEQ IDNO:1)。如果利用无保护形式的ECF1和ECF2-酰胺进行偶联反应，那么ECF1片段的C末端α-羧酸在ECF2片段加入之前就典型地转化成为活化酯。通过偶联反应产生的Elcatonin(SEQ ID NO:13)可以由常规技术(如制备性HPLC方法)纯化。
利用ECF1(SEQ ID NO:7)和其它10-32片段，例如鲑鱼Ⅰ降钙素10-32片段(SEQ ID NO:29)，用类似的方法可以制备其它降钙素的Carba类似物(例如鲑鱼Ⅰ降钙素，(SEQ ID NO:38))和相关降钙素碳类似物。通过得自一物种的降钙素的C末端片段和与得自另一不同物种的降钙素相应的N末端碳片段的结合，本发明也可以制备碳类似物。方案2
C(O)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-NHCHC(O)-Val-Leu-OH
(CH2)5    (SEQ ID NO:7)Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-
Figure A9719312300251
Ⅴ．给出微型融合蛋白质(MFP)的融合蛋白hCA-ECF2-aa的切割
在本发明的另一个实施方案(其在Elcatonin(SEQ ID NO:13)的形成中使用化学偶联反应)中，经由CNBr处理可以在Met240和Va1241残基之间切割Met-hCAⅡ’-Met240-Val241-hCATⅠ”-接头-ECF2-Ala融合蛋白(SEQ ID NO:12)，从而产生48氨基酸微型融合蛋白质(Val241-hCAⅡ”-接头-ECF2-Ala，下文的“MFP”(SEQ ID NO:24))。MFP由3种组分片段组成。微型融合蛋白质的氨基末端部分基本上由在ECF2-Ala片段(SEQID NO:23)的N-末端上的24残基“生物保护基团”组成。可以由常规方法纯化MFP(SEQ ID NO:24)，其后使之衍生从而保护氨基酸侧链残基。Ⅵ．向微型融合蛋白质引入保护基团
当要以化学保护形式分离ECF3-aa(SEQ ID NO:22)时，可以从切割之后的融合蛋白中分离出微型融合蛋白质，然后使之接受化学衍生化作用从而用各种保护基团(“R”)封阻活性侧链基团，如赖氨酸残基的ε氨基功能团。N末端肽片段起保护基团的作用，保护ECF2-aa的N末端Gly的α-氨基不受化学保护试剂衍生化。
在多肽化学中常用的氨基保护基团R，例如那些在Houben-Weyl(Methoden der organischen Chemie 15/1和15/2,Thieme VerlagStuttgart,1974)中描述的保护基团，都适合于用作为保护基团。优选的氨基保护基团包括苄氧基羰基-(“Z”)、叔丁氧基羰基-(“BOC”)、芴基甲氧基羰基(“FMOC”)或者金刚烷氧基羰基-(“ADOC”)。其它活性侧链基团也可以由保护基团保护，例如可以保护羟基和羧基分别作为苄基醚和苄基酯。Ⅶ．保护的ECF2-Ala片段的制备
通过首先用适当的衍生化试剂(“R”试剂)处理微型融合蛋白质可以形成保护的10-32片段，其中R是氨基保护基团(其中n与微型融合蛋白质中的赖氨酸残基的数量相对应)。然后切割所产生的保护的微型融合蛋白质(“Rn-MFP”(SEQ ID NO:24))从而形成保护的10-32片段(“Rn-ECF2-Ala”(SEQ ID NO:23))，其中只有Lys残基的自由ε-氨基为“R”基团所保护而α-氨基没有得到保护(参见以下的方案3)。可以以化学方式或者酶促方式进行切割。对于化学切割，羟胺可以用来切割Asn-Gly键(用箭头指出)，例如按照由Bomstein，生物化学，12,2408-2421,1979所描述的方法，从而产生Rn-ECF2-Ala的片段(SEQ ID NO:23)。其后可以由常规化学方法(如果需要的话)纯化所产生的Rn-ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)。在本发明的这一实施方案的一个例子中，通过使MFP与BOC-酸酐进行反应可以形成BOC保护的Val241-hCAⅡ”-接头-ECF2-Ala(“BOC4-MFP”(SEQ ID NO:24))。可以用羟胺在Asn和Gly氨基酸残基之间切割所产生的BOC4-MFP(SEQ ID NO:24)从而产生BOC2-ECF2-Ala(SEQ IDNO:23)。方案3
 MFP                     Val-Asp-Asn-Trp-Arg-Pro-Ala-Gln-(SEQ ID NO:24)               Pro-Leu-Lys(R)-Asn-Arg-Glu-Ile-+ Lys(R)-Ala-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-“R试剂”                    Asn-Gly-Lys(R)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-
                         His-Lys(R)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-
                         Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Ala
                        “R4-MFP” (SEQ ID NO:24)NH2OH                        Gly-Lys(R)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-
Figure A9719312300262
His-Lys(R)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-
                         Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Ala
                        “R2-ECF2-Ala”(SEQ ID NO:23)Ⅷ．产生非酰胺化的Elcatonin的保护性Rn-ECF2-aa与ECF1片段的偶联
本发明还涉及ECF2-aa(SEQ ID NO:22)或者其修饰形式(如Rn-ECF2-aa)在如Elcatonin(SEQ ID NO:13)的降钙素类似物的制备中的用途。在这一实施方案中，用本领域技术人员所熟知的方法，利用非酶促偶联试剂可以首先使RnECF2-aa(SEQ ID NO:22)的自由α-氨基与肽片段(如ECF1(SEQ ID NO:7))或者保护的ECF1的自由羧基缩合，从而产生Elcatonin前体，如Elcatonin-Ala。
Figure A9719312300271
Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Ala
“Elcatonin-Ala”(SEQ ID NO:31)
例如，用其中Ser和Thr残基的羟基和Lys残基的侧链氨基如同以上所描述的一样得到保护的起始物可以实现用来产生Elcatonin前体的缩合。该缩合导致形成侧链保护的、氨基酸延伸的、非酰胺化形式的Elcatonin(“Rn-Elcatonin-Ala(SEQ ID NO:31))。
由碳二亚胺或者叠氮化物方法，利用已知的方式可以实现缩合。在两个片段已经以化学方式缩合之后，例如通过如(Houben Weyl,Meth.derOrg.Chemie,15,1-2 Thieme Verlag,Stuttgart,1974)所描述的氢解、水解、酸化、还原或者肼解，利用适合于具体保护基的常规技术可以使产物脱保护。Ⅸ．Elcatonin-Ala向Elcatonin的转化
按照WO 92/05271，通过在有羧肽酶的情况下使前体多肽Elcatonin-aa(SEQ ID NO:30)与亲核化合物(例如ONPGA)进行反应以给出可切割的中间体，然后该中间体可以由光解切割从而给出Elcatonin(其作为C末端α-甲酰胺存在)，如此可以实现氨基酸延伸的Elcatonin前体向具有下式的Elcatonin的转化：Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH2(SEQ ID NO:13)
本文用于氨基酸的缩写是：Gly，甘氨酸；Lys,L-赖氨酸；Leu,L-亮氨酸；Ser,L-丝氨酸；Gln,L-谷氨酰胺；Glu,L-谷氨酸；His,L-组氨酸；Thr,L-苏氨酸；Tyr,L-酪氨酸；Pro,L-脯氨酸；Arg,L-精氨酸；Asp,L-天门冬氨酸；Val,L-缬氨酸；Ala,L-丙氨酸；Met,L-蛋氨酸；Asn,L-天冬酰胺；Trp,L-色氨酸；Ile,L-异亮氨酸；以及Phe,L-苯丙氨酸。
实施例
1.1包含编码hCA-ECF2-Ala融合蛋白的DNA的质粒pTBN26的制备
利用PCR方法构建编码ECF2的氨基酸10-32的基因。在佛罗里达大学合成下列五种寡核苷酸：1．5′ GGA TCC AAG CTT GTT A 3′       (SEQ ID NO:32)2．5′ GTC GAC GAA TTC GAT A 3′       (SEQ ID NO:33)3．5′ GGA TCC AAG CTT GTT AAC GGT AAA CTG TCT CAGGAG CTC CAT AAA CTG 3′                (SEQ ID NO:34)4．5′ CTG ACG TTG GTG CTG GTA CCC CGG CTT AAG ATATCG AAT TCG TCG AC 3′                 (SEQ ID NO:35)5．5′ GGT ACC AGC ACC AAC GTC AGT ACG CGG GTA AGTCTG CAG TTT ATG GAG CTC CTG AGA 3′    (SEQ iD NO:36)
将寡核苷酸2-5混合在PCR反应混合物PCR MIX 1中。寡核苷酸3的3’末端互补于寡核苷酸5的3’末端，而寡核苷酸2互补于寡核苷酸4的3’末端。将上述四种核苷酸一起退火，如图4A中所示。如图A的虚线所指出的一样，在PCR期间，Taq DNA聚合酶用来伸展寡核苷酸3到寡核苷酸5的5’末端，寡核苷酸5则伸展到寡核苷酸3的5’末端，寡核苷酸2则伸展到寡核苷酸4的5’末端。
第二个PCR反应用来连接得自PCR MIX 1中的PCR产物，结果产生双链核苷酸片段(SEQ ID NO:9)，该片段包含完全的、无间断的Asn-ECF2-Ala基因序列以及有利于克隆的限制酶切位点。分别得自寡核苷酸2(2Ext(SEQ ID NO:8))和3(3Ext(SEQ ID NO:50))的PCR延伸产物在它们的3’末端(参见图4B中的示意说明)都具有20bp的互补序列。在与PCRMIX 2的最初几个循环的反应期间，寡核苷酸2Ext(SEQ ID NO:8)和3Ext(SEQ ID NO:50)(其中它们的序列是互补的)得到退火并延伸从而建立双链片段，该双链片段包括ECF2(SEQ ID NO:10)的全长无间断基因序列。最后，寡核苷酸1和2用来扩增上述全长基因序列。图11和12显示完全的、无间断的ECF2基因序列(SEQ ID NO:10)的核酸序列以及分别为寡核苷酸2Ext(SEQ ID NO:8)和3Ext(SEQ ID NO:50)的核酸序列。
用HpaⅠ和EcoRⅤ消化所扩增的PCR产物。在唯一的EcoRⅤ位点上将这一平端DNA片段(编码多肽片段接头的C末端氨基酸(Asn)以及整个多肽片段ECF2)插入到pABN质粒中。筛查该质粒以确保Asn-ECF2基因以正确的取向插入。所产生的质粒指定为pABN26。最后，用XbaⅠ和BspEⅠ消化pABN26，并将整个Met-hCAⅡ’-Met240-Val241-hCAⅡ”-接头-ECF2-aa序列转移到pTBN质粒(已用相同的酶消化过)中从而产生质粒pTBN26(图5)。
最后构建体的DNA序列显示在图6中，该构建体具有加下划线的Met溴化氰切割位点和Asn-Gly(SEQ ID NO:11)以及用箭头指出的相应的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)切割位点。
1.2质粒pTBN26(包含hCA-ECF2-aa DNA片段的载体)的转化
按照在WO 92/01707中所描述的方法实现转化。所利用的宿主微生物是大肠杆菌HB101和大肠杆菌BL21(DE3)，两者都描述在van Heeke等，蛋白质表达和纯化，4,265-275,1993中。
1.3包含hCA-ECF2-AlaDNA的载体的选择
利用如那些在WO 92/01707中所描述的标准方法实现选择。选择基于四环素抗性向宿主生物中的引入。2．包含质粒pTBN26的大肠杆菌的发酵
2.1用于接种发酵罐的预培养物的生长
在37℃下在摇瓶中使包含质粒pTBN26的大肠杆菌菌株BL21(DE3)生长在Luria肉汤(LB)培养基(包含四环素(15mg/L)和葡萄糖溶液(50mg/L))中直到在550nm(OD550)达到大约4的光密度，该过程历时大约14小时。Luria肉汤培养基(LB培养基)的组合物是：1.0g/L胰蛋白胨、1.0g/L NaCl和0.5g/L酵母提取物。
2.2发酵
在New Brunswick MPP-80发酵罐中完成发酵。在发酵罐中加入包含300g酵母提取物、30g NaCl和溶于15L H2O的1200g酪蛋白氨基酸的发酵培养基，其后加入30L蒸馏水。在121℃下将发酵罐灭菌25分钟。在发酵罐的内含物已冷却至37℃之后，依次加入下列无菌溶液：在800mL H2O中的480g葡萄糖、在250mL H2O中的120gMgSO4·H2O、在3.0L H2O中的495g K2PO4和465g KH2PO4、以及在30mL95％EtOH和20mL H2O的混合物中的0.9g盐酸四环素。此外，还加入无菌无机混合物，该无菌无机混合物包含3.6g FeSO4·7H2O,3.6gCaCl2·2H2O,0.90g MnSO4,0.90g AlCl3·6H2O,0.09gCuCl2·2H2O,0.18g钼酸，以及溶于490.0mL H2O和10.0mL浓HCl的0.36g CoCl2·6H2O。
将试剂级别的NH4OH(28％)加入到发酵罐的自动pH进料泵中并将pH调整至6.8。利用校准电极连续地监控发酵液，并且通过间歇地加入NH4OH使pH保持在6.8。另外，连续地监控溶氧，利用校准氧探测器。通过调整搅拌速率保持氧浓度。通气速率保持在40L/min。当所有系统都正常运行时，通过无菌方法加入600mL接种物进行接种。
在整个发酵过程中监控浊度、溶氧以及葡萄糖水平。当浊度达到15-20 OD(550)时，向培养基补加300g酵母提取物和1,200g酪蛋白氨基酸。当搅拌速率达到500rpm时，向以5L/min速率进给的空气中补加纯氧并使通气速率减少至20L/min以保持40％的溶氧。
当浊度达到30 OD550单位时，向发酵培养基提供异丙基硫代半乳糖苷至2mM以诱导质粒的表达。此外，加入足够的ZnCl2以提供100μM终浓度，同时在培养基中加入无菌氨基酸溶液，该氨基酸溶液包含225gL-Ser和各为75g的L-Tyr、L-Trp、L-Phe、L-Pro和L-His。在诱导之后第2小时，取细胞样品用于分析。对样品进行干重和SDS-PAGE蛋白质分析，其中样品在诱导时采集并且其后每30分钟采集一次。
在发酵结束时，在无菌条件下将培养基转移到无菌存贮槽中并冷却至8℃。利用装备有200 kD分子量截断膜的Millipore Pro Stack通过错流过滤从废培养基中分离出细胞。将细胞浓缩至5L，然后立即处理或者以1L等分试样包装在塑料冷藏袋中并存储在-20℃下用于以后处理。
用32L裂解缓冲液(50mM Tris,1,mM EDTA,0.5％Triton-X100,pH7.8，包含0.05 mM基甲磺酰氟)稀释浓缩的细胞(5L)，然后使之两次通过在4-15℃下以12,000 psi运行的Gaulin APV中试规模匀浆器。然后制备溶菌酶的1.3μM溶液，培养15分钟(在4-15℃下)，然后使之迅速通过匀浆器。
可溶性大肠杆菌蛋白质的大约50％为hCA-ECF2-aa，通过按照Verpoorte等，生物学化学杂志，242,4221-4229,1967测量融合蛋白的人碳酸酐酶部分的酶促活性来评估。
2.3 hCA-ECF2-Ala融合蛋白的纯化
用裂解缓冲液(没有加入甲苯磺酰氟)以1∶1稀释获自实施例2.2的裂解液(32L)，并加入聚乙烯亚胺至0.35％的终浓度。将上述整个溶液搅拌20分钟，然后以10,000xg离心以除去沉淀的DNA、RNA、非必需的蛋白质以及膜泡，然后利用Pall Profile Filter(1.0μm)过滤。
其后由亲和层析纯化可溶性融合蛋白。通过加入Tris碱将所过滤的蛋白质溶液的pH调整至8.7，并以200ml/min流速将该溶液装载在1L的对氨甲基苯磺酰胺亲和树脂(van Heeke等，Methods.Molec.Biol.,36,245-260,1994)柱上。在装载之后，用5倍柱量的0.1M pH9.0 Tris-硫酸盐缓冲液(包含0.2M K2SO4和0.5mM EDTA)洗涤上述柱。然后用5倍柱量的0.1M pH7.0 Tris-硫酸盐缓冲液(包含1M NaCl)洗涤上述树脂。用5倍柱量的0.1M pH6.8 Tris-硫酸盐缓冲液(包含0.4mM硫氰酸钾和0.5mM EDTA)从亲和材料上洗脱重组产生的hCA-ECF2-Ala融合蛋白。混合包含hCA-ECF2-Ala融合蛋白的级分，并用乙酸处理该混合物至pH4.0以沉淀产物，其后离心收集该产物。冻结并冷冻干燥所产生的糊状物。这一步骤的产率是85％。3．给出ECF2-Gla的hCA-ECF2-Gla融合蛋白的切割
3.1利用羟胺对hCA-ECF2-Ala融合蛋白的切割
用羟胺在Asn和Gly之间切割融合蛋白而成为包含hCAⅡ的片段以及多肽片段ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)。通过将溶解于羟胺缓冲液(2M盐酸羟胺，5M盐酸胍，50mM 3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙烷磺酸，用氢氧化锂调整pH至10)中的40g hCA-ECF2-Ala培养4小时来实现切割。每小时取出一等分试样，融合蛋白切割成为ECF2-Ala的程度则由HPLC分析(C18 Vydac,4.6×300mM，缓冲液A:0.1％三氟乙酸，5％体积的乙腈，95％体积水；缓冲液B:0.1％三氟乙酸，5％体积水，95％体积乙腈；5％缓冲液A至68％缓冲液B的线性梯度；流速：1ml/min)测定。然后用15％乙酸将反应产物稀释至4L，所沉淀的包含hCAⅡ的片段由10000×G的离心除去。
离心所产生上清液包含ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)，然后通过将其以50ml/min流速装载到用在5％乙腈中的10mM乙酸平衡的制备性C8柱(5×5.1cm)上来除去上清液的盐分。在装载之后，用在10％乙腈中的10mM乙酸洗涤上述柱，并用在45％乙腈中的10mM乙酸洗脱ECF2-Ala。包含ECF2-Ala的级分由如上所述的分析型HPLC确定，集中并冻干这些级分。获得总计1.14g的ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)，相应的产率为82％。
3.2 ECF2-Ala的纯化
为了进一步纯化ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)，利用了如5.3部分所详尽描述的半制备性聚磺乙基天冬酰胺HPLC，其产率为85％。4．ECF2-Ala向ECF2-酰胺的转化
按照在WO 92/05271中所描述的方法实现ECF2-Ala(SEQ IDNO:23)的酰胺化。将ECF2-Ala(12.8mg)溶解在1mL的5mM EDTA、25mM吗啉代乙烷-磺酸、pH7.0中，并在其中加入72mg邻硝基苯基甘氨酸酰胺(ONPGA)。用5M NaOH将pH调整至6.0并加入羧肽酶-Y(120μg)。在暗处搅拌大约48小时之后，加入乙腈(1mL)，并由如5.2部分的C18反相HPLC纯化ECF2-ONPGA(SEQ ID NO:28)产物，冻干所得产物。接着酰胺化反应过程的步骤是在10、60、120和180分钟之后提取样品，提取的样品用于分析型C18 HPLC(如WO 92/05271中所描述的)的分析。
为了进行尔后的光解，将冻干的ECF2-ONPGA(12mg)溶解在5mL的50％乙醇中。在该溶液中加入NaHSO3(26mg)和苯甲酸钠(7.2mg)并用5M NaOH将pH调整至9.5。然后使氮气通过反应混合物15分钟。按照在WO 92/05271中所描述的方法进行尔后的光解、反应过程的分析以及所产生的ECF2-酰胺(SEQ ID NO:6)的鉴定。5．产生微型融合蛋白质的hCA～ECF2-Ala融合蛋白的切割
5.1利用溴化氰的hCA～ECF2-Ala融合蛋白的化学切割
当使用化学而非酶促片段偶联时，MFP(SEQ ID NO:24)首先从融合蛋白(SEQ ID NO:12)上切割下来。为了切割Met240-Val241键(在ECF2-Ala的开始之前的24个氨基酸)，在暗处在氩气环境下在室温下利用0.02M溴化氰(在70％甲酸中)处理40mg/mL的hCA-ECF2-Ala融合蛋白(SEQ ID NO:12)6小时。加入蛋氨酸(0.03M)至0.03M的终浓度以终止切割反应，并且搅拌所产生的溶液30分钟。在反应混合物中两次加入反应量的包含10％乙酸和112g/L硫酸钠的溶液以沉淀包含hCAⅡ”的片段，同时搅拌混合物20分钟。离心(10分钟，10,000×G)除去所沉淀的材料。微型融合蛋白质(SEQ ID NO:24)仍然溶解在上清液中。获得相对于所使用的hCA-ECF2-Ala融合蛋白(SEQ ID NO:12)的58％MFP(SEQID NO:24)回收率。
5.2使微型融合蛋白质脱盐
将得自酸沉淀的上清液(4.5g微型融合蛋白质)装载在C8 Vydac半制备柱(22×250mM)上，该柱已用0.1％三氟乙酸和5％乙腈平衡。利用0.1％三氟乙酸(在25％乙腈中)洗脱上述蛋白质，尔后冻干。获得总计4.05g的85％纯微型融合蛋白质，相应的产率为90％。
5.3利用聚磺乙基天冬酰胺HPLC的微型融合蛋白质的纯化
将聚磺乙基天冬酰胺层析用于纯化微型融合蛋白质(SEQ IDNO:24)、ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)和ECF2-酰胺(SEQ ID NO:6)。将肽溶解在缓冲液A(25mM乙酸，35％乙腈)中从而使终浓度为5mg/mL，然后以20ml/min流速将其装载在聚磺乙基天冬酰胺HPLC柱(2.2×25cm)上。其后就可能利用10％缓冲液B(25mM乙酸，400mM乙酸钠，35％乙腈)至47％缓冲液B的线性梯度洗脱蛋白质，该过程历时30分钟。产率典型地是50％或者更大。图8显示包含ECF2-酰胺(SEQ ID NO:6)的样品的代表性HLPC图。ECF2-酰胺的峰值出现在14.5和16.3分钟之间。
5.4聚磺乙基天冬酰胺HPLC后的脱盐
冻干之后，在C8柱(5×20cm，用95％乙醇平衡)上装载蛋白质用于脱盐。然后用4倍柱量的水和用4倍柱量的5％乙醇(包含1％乙酸)洗涤该柱。然后用2倍柱量的90％乙醇洗脱肽。由HPLC分析各组分。产率典型地是80％或者更大。6．保护基团向微型融合蛋白质中的掺入
一般方法：
在重组MFP(SEQ ID NO:24)之内的ECF2片段(SEQ ID NO:6)的α-氨基是被生物保护的，即通过N末端hCAⅡ”片段的存在得到保护。MFP中的Lys基团的ε-氨基被酰基供体(如Z、BOC、ADOC或者FMOC)所保护。精氨酸-胍基功能团与Z-OSU的反应通过加入如N-羟基琥珀酰亚胺的试剂被封阻。
实验方法：
将MFP(SEQ ID NO:24)(270mg)溶解在水(20mL)中，同时加入二噁烷(4mL)和680μL的O.1N HCl(以确保两个精氨酸-胍基功能团上形成盐)。在反应之前，加入78mg N-羟基琥珀酰亚胺和104.7μL三乙胺以保护His氮，然后在整个溶液中加入169mg Z-OSU、146mg BOC-OSU、135mg ADOC氟化物或者229mg FMOC-OSU，并伴随冷却。
然后在室温下搅拌反应混合物24小时，其后在真空中干燥。用二氯甲烷(两次)然后用乙腈(两次)细心地研磨所产生的残渣。通过过滤收集产物并在真空中干燥。Z保护的微型融合蛋白质的产量是300mg,BOC保护的蛋白质的产量是295mg,ADOC保护的和FMOC保护的蛋白质的产量是310mg。
利用保护的和无保护的肽由薄层层析对具有各自保护基团的微型融合蛋白质的完全反应进行检验。在薄层二氧化硅平板(洗脱液∶苯酚∶H2O=775∶225)上检验完全反应。当利用540mg MFP(SEQ ID NO:24)时Z-OSU反应的产率是75％，并且该产率相对于利用其它封阻剂所发现的产率来说是典型的。7．产生保护性ECF2-Ala片段的保护性微型融合蛋白质的切割
7.1利用羟胺的切割
为了释放为氨基酸序列所生物保护的α-氨基，用羟胺在Asn和Gly之间切割微型融合蛋白质成为Z-保护的ECF2-Ala片段(SEQ ID NO:23)和24个氨基酸长的包含Trp的片段。羟胺缓冲液的组成与3.1部分所描述的相同。
在260mg Z-保护的微型融合蛋白质(SEQ ID NO:24)中加入羟胺缓冲液(26mL)，然后超声处理(20秒)全部溶液并用4M氢氧化锂调整pH至pH10.0。在30℃和pH10.0下培养所产生的混合液多达5小时。然后利用浓乙酸调整pH至6.0。
每小时取出一等分试样，Z-保护性微型融合蛋白质(SEQ ID NO:24)切割成为Z-保护性ECF2-Ala片段(SEQ ID NO:23)的程度则由HPLC分析(C18 Vydac,5×300mM，缓冲液A:0.1％三氟乙酸；缓冲液B:0.1％三氟乙酸，5％体积水，95％乙腈；5％缓冲液A至68％缓冲液B的线性梯度；1ml/min)测定。羟胺切割的终止如在3.1部分中所描述的一样。
利用Vydac C18柱由HPLC分析得自C8柱的级分。用于HPLC的缓冲液是那些以前所描述的缓冲液。流速是1mL/min。用41％缓冲液A至71％缓冲液B的线性梯度洗脱蛋白质。检测在210nm进行。获得总计156mg的Z-保护性ECF2-Ala(“Z-ECF2-Ala”(SEQ ID NO:23))，相应的产率为60％。
7.2 Z-ECF2-Ala的纯化
利用半制备C8 HPLC纯化Z-ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)。将Z-ECF2-Ala(160mg)溶解在5M乙酸(5mL)中，其后加入缓冲液A(100mM乙酸，5％乙腈)(5mL)。然后将样品装载在半制备HPLC C8柱上(细节如3.2部分一样)。在羟胺切割和纯化之后，获得120mg Z-ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)，对于C8纯化步骤来说相应的产率为75％。
为了进一步纯化Z-ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)，如以上5.3部分所描述的一样利用半制备聚磺乙基天冬酰胺HPLC。利用这一方法，可获得59mg 95-98％的纯Z-ECF2-Ala，相应的产率为85.5％。8．ECF2-酰胺和ECF1-OMe的缩合
在有非酶促偶联试剂的情况下，可以偶联按照实施例4产生的酰胺化的ECF2(SEQ ID NO:6)和环状Elcatonin片段ECF1(SEQ ID NO:7)。例如，在ECF1(SEQ ID NO:3)(Thr和Ser的侧链羟基作为苄醚被保护)和ECF2-酰胺(SEQ ID NO:2)(具有Lys、Ser、Thr和/或Glu残基的活性侧链基团被保护)的溶液中，可以加入二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)。在大约0℃下搅拌反应8小时。在这一期间的片段缩合之后的是HPLC分析。在反应终止之后，可以通过加入1％三氟乙酸来稀释上述混合物。产物Elcatonin(SEQ ID NO:13)可以由制备HPLC纯化。可以由HPLC分离和纯化未反应的ECF2-酰胺(SEQ ID NO:2)，并使之再循环。9．Z-ECF2与ECF1的化学偶联
利用碳二亚胺或者叠氮化物方法(参见，例如Greenstein等，氨基酸的化学，卷2,John Wiley，纽约，pp 804ff,1016ff,1961)，可以实现Z-ECF2-Ala片段(即具有为苄氧羰基所保护的侧链氨基的EFC2-Ala)的自由α-氨基与肽片段ECF1的自由C末端α-羧基基团的偶联。典型地，通过加入Z-ECF2-Ala片段至活化的酯(从ECF1片段的C末端α-羧酸形成)中实现偶联反应。经由氢解可以实现从偶联产物中除去Cbz保护基团，所产生的产物则由制备性HPLC纯化从而产生Elcatonin-Ala(即“ECF1-ECF2-Ala”；SEQ ID NO:31)。10．Elcatonin-Ala向Elcatonin-酰胺的转变
利用在第4部分中所描述的方法，可以使按照第9部分产生的Elcatonin-Ala(SEQ ID NO:31)肽酰胺化。可以纯化酰胺化的Elcatonin(SEQ ID NO:13)，其后利用在5.3和5.4部分中所描述的方法可以使之脱盐。
虽然已按照各种具体的和优选的实施方案和技术描述了本发明。然而，应该明白的是可以进行许多变化和修饰而保持在本发明的精神与范围之内。
本说明书中所涉及的出版物表明了本发明所属领域的一般技术水平，并且这些出版物相同程度地引入本文作为参考，如同每一种出版物被具体地和单独地引述。
              序列表(1)一般信息
(ⅰ)申请人：
  (A)名称：BioNebraska,Inc.
  (B)街道：西北第46街3820号
  (C)城市：Lincoln
  (D)州：Nebraska
  (E)邮政编码(ZIP)：68524
  (F)国家：美国
(ⅱ)发明名称：降钙素的重组制备方法和其在制备降钙素和相关类似
物中的用途
(ⅲ)序列数：50
(ⅳ)通讯地址：
  (A)地址：Merchant&Gould
  (B)街道：3100 Norwest Center,90 S.7th Street
  (C)城市：Minneaplis
  (D)州：明尼苏达
  (E)国家：美国
  (F)ZIP:55402
(ⅴ)计算机可读形式：
  (A)介质类型：软盘
  (B)计算机：IBM兼容机
  (C)操作系统：DOS
  (D)软件：FastSEQ版本1.5
(ⅵ)当前的申请数据：
  (A)申请号：未知
  (B)申请日期：1997年2月4日
  (C)分类号：
(ⅶ)在先中请的数据：
  (A)申请号：08/595,868
  (B)申请日：06-FEB-1996
(ⅷ)代理人/代理机构信息：
  (A)名称：CARTER,Charles G./BRUESS,Steven C.
  (B)注册号：35,093/34,130
  (C)证书号：8648.59WO01
(ⅸ)电讯信息：
  (A)电话：612/371-5278/612/336-4711
  (B)传真：612/336-4751
  (C)电传：(2)SEQ ID NO:1的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：24个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：N末端
(ⅵ)原始来源：
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：其它
  (B)位置：24
  (D)其它信息：/注=具有-OH、-NH2、氨基酸或者多肽的α-羧基
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1               5                  10                  15Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Pro Xaa20(2)SEQ ID NO:2的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：23个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：C末端
(ⅵ)原始来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1               5                  10                  15Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Pro20(2)SEQ ID NO:3的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：8个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：N末端
(ⅵ)原始来源：
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：其它
  (B)位置：1...6
  (D)其它信息：注=在位置1和6之间的L-氨基辛二酸键
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:Xaa Xaa Leu Ser Thr Xaa Xaa Leu1               5(2)SEQ ID NO:4的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：31个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：N末端
(ⅵ)原始来源：
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：其它
  (B)位置：1...6
  (D)其它信息：注=在1和6位置之间的L-氨基辛二酸键
  (A)名称/关键词：其它
  (B)位置：31...31
  (D)其它信息：注=具有-OH、-NH2、氨基酸或者多肽的α-羧基
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:Xaa Xaa Leu Ser Thr Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1               5                  10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Pro20                  25                  30(2)SEQ ID NO:5的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：69个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：
(ⅵ)原始来源：
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：编码序列
  (B)位置：1...69
  (D)其它信息：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:GGT AAA CTG TCT CAG GAG CTC CAT AAA CTG CAG ACT TAC CCG CGT ACT         48Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr1               5                  10                  15GAC GTT GGT GCT GGT ACC CCG                                             69Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro20(2)SEQ ID NO:6的信息：
(ⅱ)序列特征：
  (A)长度：23个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅲ))假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：内部
(ⅵ)原始来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg1               5                  10                  15Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro20(2)SEQ ID的NO:7信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：8个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：N末端
(ⅵ)来源：
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：其它
  (B)位置：1...6
  (D)其它信息：注=在1和6位置之间的L-氨基辛二酸键
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:Ser Asn Leu Ser Thr Xaa Val Leu1               5(2)SEQ ID NO:8的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：47个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：
(ⅵ)原始来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:GACGACGAAT TCGATATCTT AAGCCGGGGT ACCAGCACCA ACGTCAG      47(2)SEQ ID NO:9的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：111个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：否
(ⅲ)反义：否
(ⅴ)片段类型：
(ⅵ)原始来源：
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：编码序列
  (B)位置：16...90
  (D)其它信息：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:GGATCCAAGC TTGTT AAC GGT AAA CTG TCT CAG GAG CTC CAT AAA CTG CAG     51Asn Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu Gln1               5                  10ACT TAC CCG CGT ACT GAC GTT GGT GCT GGT ACC CCG GCT TAAGATATCG AAT   103Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro Ala15                  20                  25TCGTCGAC                                                             111(2)SEQ ID NO:10的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：25个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：内部
(ⅵ)原始来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10:Asn Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg1               5                  10                  15Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro Ala20                  25(2)SEQ ID NO:11的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：864个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：
(ⅵ)原始来源：
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：编码序列
  (B)位置：1...864
  (D)其它信息：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11:ATG TCC CAT CAC TGG GGG TAC GGC AAA CAC AAC GGA CCT GAG CAC TGG        48Met Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp1               5                  10                  15CAT AAG GAC TTC CCC ATT GCC AAG GGA GAG CGC CAG TCC CCT GTT GAC        96His Lys Asp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp20                  25                  30ATC GAC ACT CAT ACA GCC AAG TAT GAC CCT TCC CTG AAG CCC CTG TCT       144Ile Asp Thr His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser35                  40                  45GTT TCC TAT GAT CAA GCA ACT TCC CTG AGG ATC CTC AAC AAT GGT CAT       192Val Ser Tyr Asp Gln Ala Thr Ser Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His50                  55                  60GCT TTC AAC GTG GAG TTT GAT GAC TCT CAG GAC AAA GCA GTG CTC AAG       240Ala Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys65                  70                  75                  80GGA GGA CCC CTG GAT GGC ACT TAC AGA TTG ATT CAG TTT CAC TTT CAC       288Gly Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His85                  90                  95TGG GGT TCA CTT GAT GGA CAA GGT TCA GAG CAT ACT GTG GAT AAA AAG       336Trp Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys100                 105                 110AAA TAT GCT GCA GAA CTT CAC TTG GTT CAC TGG AAC ACC AAA TAT GGG       384Lys Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His Trp Asn Thr Lys Tyr Gly115                 120                 125GAT TTT GGG AAA GCT GTG CAG CAA CCT GAT GGA CTG GCC GTT CTA GGT       432Asp Phe Gly Lys Ala Val Gln Gln Pro Asp Gly Leu Ala Val Leu Gly130                 135                 140ATT TTT TTG AAG GTT GGC AGC GCT AAA CCG GGC CTT CAG AAA GTT GTT       480Ile Phe Leu Lys Val Gly Ser Ala Lys Pro Gly Leu Gln Lys Val Val145                 150                 155                 160GAT GTG CTG GAT TCC ATT AAA ACA AAG GGC AAG AGT GCT GAC TTC ACT       528Asp Val Leu Asp Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr165                 170                 175AAC TTC GAT CCT CGT GGC CTC CTT CCT GAA TCC TTG GAT TAC TGG ACC       576Asn Phe Asp Pro Arg Gly Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr180                 185                 190TAC CCA GGC TCA CTG ACC ACC CCT CCT CTT CTG GAA TGT GTG ACC TGG      624Tyr Pro Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp195                 200                 205ATT GTG CTC AAG GAA CCC ATC AGC GTC AGC AGC GAG CAG GTG TT3 AAA      672Ile Val Leu Lys Glu Pro Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys210                 215                 220TTC CGT AAA CTT AAC TTC AAT GGG GAG GGT GAA CCC GAA GAA CTG ATG      720Phe Arg Lys Leu Asn Phe Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met225                 230                 235                 240GTG GAC AAC TGG CGC CCA GCT CAG CCA CTG AAG AAC AGG CAA ATC AAA      768Val Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys245                 250                 255GCT TTC GTT GAC GAC GAC GAC AAC GGT AAA CTG TCT CAG GAG CTC CAT      816Ala Phe Val Asp Asp Asp Asp Asn Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His260                 265                 270AAA CTG CAG ACT TAC CCG CGT ACT GAC GTT GGT GCT GGT ACC CCG GCT      864Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro Ala275                 280                 285(2)SEQ ID NO:12的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：288个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：C末端
(ⅵ)原始来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12:Met Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp1               5                  10                  15His Lys Asp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp20                  25                  30Ile Asp Thr His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser35                  40                  45Val Ser Tyr Asp Gln Ala Thr Ser Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His50                  55                  60Ala Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys65                  70                  75                  80Gly Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His85                  90                  95Trp Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys100                 105                 110Lys Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His Trp Asn Thr Lys Tyr Gly115                 120                 125Asp Phe Gly Lys Ala Val Gln Gln Pro Asp Gly Leu Ala Val Leu Gly130                 135                 140Ile Phe Leu Lys Val Gly Ser Ala Lys Pro Gly Leu Gln Lys Val Val145                 150                 155                 160Asp Val Leu Asp Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr165                 170                 175Asn Phe Asp Pro Arg Gly Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr180                 185                 190Tyr Pro Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp195                 200                 205Ile Val Leu Lys Glu Pro Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys210                 215                 220Phe Arg Lys Leu Asn Phe Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met225                 230                 235                 240Val Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys245                 250                 255Ala Phe Val Asp Asp Asp Asp Asn Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His260                 265                 270Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro Ala275                 280                 285(2)SEQ ID NO:13的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：31个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：C末端
(ⅵ)原始来源：
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：其它
  (B)位置：1...6
  (D)其它信息：注=在1和6位置之间的L-氨基辛二酸键
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13:Ser Asn Leu Ser Thr Xaa Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His1               5                  10                  15Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro20                  25                  30(2)SEQ ID NO:14的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：7个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：内部
(ⅵ)原始来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:14:Phe Val Asp Asp Asp Asp Asn1                5(2)SEQ ID NO:15的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：15个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：
(ⅵ)原始来源：
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：编码序列
  (B)位置：1...15
  (D)其它信息：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:15:GAC GAC GAC GAT AAA                                      15Asp Asp Asp Asp Lys                                      151               5(2)SEQ ID NO:16的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：5个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅲ)假设：否
(ⅵ)反义：否
(ⅴ)片段类型：内部
(ⅵ)原始来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:16:Asp Asp Asp Asp Lys1              5(2)SEQ ID NO:17的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：12个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：
(ⅵ)原始来源：
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：编码序列
  (B)位置：1...12
  (D)其它信息：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:17:ATT GAA GGA AGA                                          12Ile Glu Gly Arg1(2)SEQ ID NO:18的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：4个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：内部
(ⅵ)原始来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:18:Ile Glu Gly Arg1(2)SEQ ID NO:19的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：24个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：
(ⅵ)原始来源：
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：编码序列
  (B)位置：1...24
  (D)其它信息：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:19:CAT CCT TTT CAT CTG CTG GTT TAT                          24His Pro Phe His Leu Leu Val Tyr1               5(2)SEQ ID NO:20的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：8个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：内部
(ⅵ)原始来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:20:His Pro Phe His Leu Leu Val Tyr1              5(2)SEQ ID NO:21的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：16个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：内部
(ⅵ)原始来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:21:Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Glu Ile Lys Ala1               5                  10                  15(2)SEQ ID NO:22的信息：
(ⅱ)序列特征：
  (A)长度：24个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：C末端
(ⅵ)原始来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:22:Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr1               5                  10                  15Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro Xaa20(2)SEQ ID NO:23的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：24个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：C末端
(ⅵ)原始来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:23:Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr1               5                  10                  15Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro Ala20(2)SEQ ID NO:24的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：48个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：C末端
(ⅵ)原始来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:24:Val Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Glu Ile Lys1               5                  10                  15Ala Phe Val Asp Asp Asp Asp Asn Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His20                  25                  30Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro Ala35                  40                  45(2)SEQ ID NO:25的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：17个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：内部
(ⅵ)原始来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:25:Val Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Glu Ile Lys1               5                  10                  15Ala(2)SEQ ID NO:26的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：27个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：
(ⅵ)原始来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:26:AGCTTTCGTT GACGACGACG ATATCTT                            27(2)SEQ ID NO:27的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：27个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅸ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：
(ⅵ)原始来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:27:AGCTAAGATA TCGTCGTCGT CAACGAA                            27(2)SEQ ID NO:28的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：24个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：N末端
(ⅵ)原始来源：
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：其它
  (B)位置：24...24
  (D)其它信息：/注=邻-NO2-苯基甘氨酸酰胺
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:28:Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr1               5                  10                  15Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro Xaa20(2)SEQ ID NO:29的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：23个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：C末端
(ⅵ)原始来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:29:Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr1               5                  10                  15Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro20(2)SEQ ID NO:30的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：32个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：N末端
(ⅵ)原始来源：
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：其它
  (B)位置：1...6
  (D)其它信息：/注=在1和6位置之间的L-氨基辛二酸键
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(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：其它
  (B)位置：1...6
  (D)其它信息：/注=在1和6位置之间的L-氨基辛二酸键
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:31:Ser Asn Leu Ser Thr Xaa Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His1               5                  10                  15Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro Ala20                  25                  30(2)SEQ ID NO:32的信息：
(ⅰ)序列特征：
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  (B)类型：氨基酸
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  (A)长度：32个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
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(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：32个氨基酸
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(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：28个碱基对
  (B)类型：核酸
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(ⅱ)分子类型：基因组DNA
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(ⅵ)原始来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:47:AGCTTTCGTT GACGACGACG ATATCTTA                           28(2)SEQ ID NO:48的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (a)长度：27个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：否
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(ⅴ)片段类型：
(ⅵ)原始来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:48:AAGCAACTGC TGCTGCTATA GAATCGA                            27(2)SEQ ID NO:49的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：10个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
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(ⅱ)分子类型：肽
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(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：内部
(ⅵ)原始来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:49:Lys Ala Phe Val Asp Asp Asp Asp Ile Leu1                5                  10(2)SEQ ID NO:50的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：84个碱基对
  (B)类型：核酸
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(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：否
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(ⅵ)原始来源：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:50:GGCTCCAAGC TTGTTAACGG TAAACTGTCT CAGGAGCTCC ATAAACTGCA GACTTACCCG    60CGTACTGACG TTGGTGCTGG TACC                                           84

Claims (21)

1．一种合成降钙素片段的重组方法，该方法包括：
(a)重组形成一种融合蛋白，该融合蛋白包括通过一个切割位点连接到碳酸酐酶上的靶序列；以及
(b)用一种切割试剂切割上述融合蛋白以产生包括靶序列的第一多肽，其中所说的靶序列包括具有下式的氨基酸序列：A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ ID NO:1)
其中A10是Gly或者Ser,A11是Lys、Thr或者Ala,A12是Leu或者Tyr,A13是Ser、Thr或者Trp,A14是Gln、Lys或者Arg,A15是Glu、Asp或者Asn,A16是Leu或者Phe,A17是His或者Asn,A18是Lys或者Asn,A19是Leu、Tyr或者Phe,A20是Gln或者His,A21是Thr或者Arg,A22是Tyr或者Phe,A23是Pro或者Ser,A24是Arg、Gly或者Gln,A25是Thr或者Met,A26是Asp、Ala、Gly或者Asn,A27是Val、Leu、Ile、Phe或者Thr,A29是Ala、Val、Pro或者Ser,A30是Gly、Val或者Glu,A31是Thr、Val或者Ala，以及-Xxx是-OH、-NH2、氨基酸残基或者多肽基团。
2．权利要求1的方法，其中-Xxx是具有α-C(O)NH2基团的氨基酸残基。
3．权利要求1的方法，其中A10是Gly；切割位点包括Asn-A10；切割步骤包括使融合蛋白与羟胺相接触。
4．权利要求1的方法，其中-Xxx是-OH；该方法还包括使第一多肽与一种酰胺化剂进行反应以形成第二肽，其中-Xxx是-NH2。
5．权利要求1的方法，其中-Xxx包括氨基酸残基；该方法还包括把Pro-XXX序列转化成为C末端Pro-NH2残基。
6．权利要求5的方法，其中转化步骤包括用邻硝基苄胺使-Xxx转酰胺化以形成第三肽；以及光解第三肽以形成包括具有下式的氨基酸序列的第二肽：A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-NH2(SEQ ID NO:2)
7．权利要求1的方法，其中A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ IDNO:1)序列是：Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Xxx(SEQ ID NO:6)
8．权利要求1的方法，该方法包括使所述融合蛋白与一种保护试剂进行反应以形成一种保护的融合蛋白，所说的保护的融合蛋白包括具有被保护的氨基、羟基或者羧基活性侧链基团的氨基酸残基。
9．权利要求8的方法，该方法包括使所述融合蛋白与一种保护试剂进行反应以形成一种保护的融合蛋白，所说的保护的融合蛋白包括具有被保护侧链氨基的Lys残基。
10．权利要求1的方法，其中切割步骤包括使所述融合蛋白与切割试剂相接触以形成一种微型融合蛋白质，所说的微型融合蛋白质包括具有下式的氨基酸序列：接头肽-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx
11．权利要求10的方法，其中微型融合蛋白质具有下式：Val-Asp-Asn-Trp-Arg-Pro-Ala-Gln-Pro-Leu-Lys-Asn-Arg-Glu-Ile-Lys-Ala-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Asn-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Ala-Pro-Ala(SEQ ID NO:24)。
12．权利要求11的方法，其中所说的碳酸酐酶是人碳酸酐酶Ⅱ，所说的切割试剂包括溴化氰。
13．权利要求11的方法，该方法还包括用羟胺切割上述微型融合蛋白质以形成一种肽，该肽包括具有下式的氨基酸序列：Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Xxx(SEQ ID NO:6)
14．权利要求10的方法，该方法还包括使所述微型融合蛋白质与一种保护试剂进行反应以形成一种保护的微型融合蛋白质，所说的保护性微型融合蛋白质包括具有被保护的氨基、羟基或者羧基活性侧链基团的氨基酸残基。
15．权利要求1的方法，其中所说的碳酸酐酶是人碳酸酐酶Ⅱ；所说的靶序列包括具有下式的氨基酸序列：Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-AlaC(SEQ ID NO:23)，其中AlaC是C末端残基；并且该方法还包括用邻硝基苯基甘氨酰胺对-AlaC进行转肽基作用以形成一种第三肽；以及光解所说的第三肽以形成一种第二肽，所说的第二肽包括具有下式的氨基酸序列：Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH2(SEQ ID NO:6)。
16．权利要求15的方法，其中所说的切割位点包括Asn-A10；以及切割步骤包括使上述融合蛋白与羟胺相接触。
17．一种核酸序列，该核酸序列包含一个具有下式的序列：GGT AAA CTG TCT CAG GAG CTC CAT AAA CTG CAG ACT TACCCG CGT ACT GAC GTT GGT ACC CCG(SEQ ID NO:5)
18．一种用于产生降钙素碳类似物的方法，该方法包括将下式的N末端片段：
Figure A9719312300041
其中A2是Gly、Ser或者Ala,A3是Asn或者Ser,A8是Val或者Met,R2是(CH2)4或者-CH(NH2)CH2S-S-，以及Y是OH、OR1,其中-R1是低级烷基；
在非酶促偶联试剂存在下与重组形成的具有下式的多肽缩合：A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ ID NO:1)
其中A10是Gly或者Ser,A11是Lys、Thr或者Ala,A12是Leu或者Tyr,A13是Ser、Thr或者Trp,A14是Gln、Lys或者Arg,A15是Glu、Asp或者Asn,A16是Leu或者Phe,A17是His或者Asn,A18是Lys或者Asn,A19是Leu、Tyr或者Phe,A20是Gln或者His,A21是Thr或者Arg,A22是Tyr或者Phe,A23是Pro或者Ser,A24是Arg、Gly或者Gln,A25是Thr或者Met,A26是Asp、Ala、Gly或者Asn,A27是Val、Leu、Ile、Phe或者Thr,A29是Ala、Val、Pro或者Ser,A30是Gly、Val或者Glu,A31是Thr、Val或者Ala，以及-Xxx是-OH、-NH2、氨基酸残基或者多肽基团；
形成具有下式的降钙素衍生物：
Figure A9719312300051
A16-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ ID NO:48)。
19．权利要求18的方法，其中所说的非酶促偶联试剂包括N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯并三唑或者碳二亚胺。
20．权利要求18的方法，其中所说的非酶促偶联试剂包括(ⅰ)N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺；(ⅱ)N-羟基琥珀酰亚胺和N-乙基-N’-二甲基氨丙基碳二亚胺或者(ⅲ)N-羟基苯并三唑和二环己基碳二亚胺。
21．一种用于产生降钙素或者相关类似物的方法，该方法包括将一种具有下式的脱氨九肽：
Figure A9719312300052
其中A2是Gly、Ser或者Ala,A3是Asn或者Ser,A8是Val或者Met,以及Y是OH、OR1，其中-R1是低级烷基；
在非酶促偶联剂存在下与重组形成的具有下式的多肽缩合：A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ ID NO:1)
其中A10是Gly或者Ser,A11是Lys、Thr或者Ala,A12是Leu或者Tyr,A13是Ser、Thr或者Trp,A14是Gln、Lys或者Arg,A15是Glu、Asp或者Asn,A16是Leu或者Phe,A17是His或者Asn,A18是Lys或者Asn,A19是Leu、Tyr或者Phe,A20是Gln或者His,A21是Thr或者Arg,A22是Tyr或者Phe,A23是Pro或者Ser,A24是Arg、Gly或者Gln,A25是Thr或者Met,A26是Asp、Ala、Gly或者Asn,A27是Val、Leu、Ile、Phe或者Thr,A29是Ala、Val、Pro或者Ser,A30是Gly、Val或者Glu,A31是Thr、Val或者Ala，以及-Xxx是-OH、-NH2、氨基酸残基或者多肽基团；
形成具有下式的降钙素衍生物：
Figure A9719312300061
A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ ID NO:4)
CN97193123.2A 1996-02-06 1997-02-04 降钙素片段的重组制备方法和其在制备降钙素和相关类似物中的用途 Pending CN1217724A (zh)

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