CN1516738A - gp41片段的乙酰化 - Google Patents
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Abstract
一种用于在原核宿主细胞中生产长度约为10－50个氨基酸的抗融合肽的方法，其特征在于在形成所述非融合抗融合肽或所述融合肽的内含体的条件下，a)在所述宿主细胞中表达编码作为非融合肽的所述抗融合肽或编码长度约为14－70个氨基酸的融合肽的核酸，所述融合肽包含N－末端与长度约为4－30个氨基酸的另外的肽连接的所述抗融合肽；b)培养所述宿主细胞；c)回收和溶解所述内含体；d)在所述融合肽的情形中将所述抗融合肽从所述另外的肽切离；和e)分离所述抗融合肽。
Description
技术领域
本发明涉及重组生产抑制病毒与靶细胞膜融合的肽的方法。特别地，本发明涉及重组生产慢病毒属如人免疫缺陷病毒(HIV)，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，麻疹病毒(MEV)，流感病毒如呼吸道合胞病毒(RSV)或人副流感病毒(HPV)的肽抑制剂的方法。
发明背景
对于有包膜病毒如HIV-I，HIV-II，RSV，麻疹病毒，流感病毒，副流感病毒，埃-巴二氏病毒和肝炎病毒进入到细胞，病毒与细胞膜的融合是一个必需步骤。在已进入细胞后可以引发导致病毒感染的病毒复制级联。
HIV是慢病毒属的一种，所述慢病毒属包括拥有复杂基因组和显示圆锥状衣壳核心颗粒的逆转录病毒。慢病毒属的其它实例包括猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，脑膜脑炎病毒和马传染性贫血病毒(EIAV)。类似所有逆转录病毒，HIV的基因组是由RNA编码，其在进入新宿主细胞后由病毒逆转录酶(RT)逆转录为病毒DNA。Bullough，P.A.，等，Nature371(1994)37-43；Carr，C.M.，和Kim，P.S.，Cell 73(1993)823-832；和Wilson，I.A.，等，Nature 289(1981)366-373描述了流感病毒和它们的细胞进入机制。
所有慢病毒属是由源于宿主细胞膜的脂双层包裹。通过与跨膜蛋白质(TM，gp41)相互作用将曝露的表面糖蛋白(SU，gp120)锚定给病毒。脂双层还含有几种源于宿主细胞的细胞膜蛋白，包括主要组织相容性抗原，肌动蛋白和遍在蛋白质(Arthur，L.O.，等，Science 258(1992)1935-1938)。一种含有大约2000个拷贝基质蛋白(MA，p17)的基质壳排列在病毒膜的内表面，并且一种含有大约2000个拷贝衣壳蛋白(CA，p24)的圆锥状衣壳核心颗粒位于病毒的中心。衣壳颗粒包裹两个拷贝未剪接的病毒基因组，其被稳定成一种具有大约2000个拷贝核衣壳蛋白(NC，p7)的核糖核蛋白复合体，并且还含有三种基本的病毒编码的酶：蛋白酶(PR)，逆转录酶(RT)和整合酶(IN)。病毒颗粒还包装辅助蛋白，Nef，Vif和Vpr。似乎不包装在宿主细胞内发挥作用的另外三种辅助蛋白，Rev，Tat和Vpu。
在HIV的情形中，病毒进入是与HIV包膜表面糖蛋白相关(Lawless，M.K.，等，Biochemistry 35(1996)13697-13708；和Turner，B.G.，和Summers，M.F.，J.Mol.Biol.285(1999)1-32)。在HIV-1的情形中，该表面蛋白是作为一种单个的160kD的前体蛋白被合成，所述前体蛋白被一种细胞蛋白酶切割成两种糖蛋白gp-41和gp-120。gp-41是一种跨膜蛋白质，gp-120是一种以三聚体或多聚体形式保持与gp-41非共价结合的胞外蛋白(Hammarskjld，M.-L.，等，Biochim.Biophys.Acta 989(1989)269-280)。由于CD4表面蛋白充当HIV-I病毒的细胞受体，因此HIV靶向CD4+淋巴细胞。病毒进入细胞取决于与细胞CD4+受体分子结合的gp-120而gp-41将包膜糖蛋白复合体锚定在病毒膜中并介导膜融合(McDougal，J.S.，等，Science 231(1986)382-385；和Maddon，P.J.，等，Cell 47(1986)333-348)。
gp41是介导病毒和细胞膜融合的跨膜亚单位。gp41胞外域核心是一个由三个螺旋状发夹结构组成的六螺旋束，每个发夹结构由与反向平行的C螺旋成对的N螺旋组成(Chan，D.C.，等，Cell 89(1997)263-273；Weissenhom，W.，等，Nature 387(1997)426-430；Tan，K.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)12303-12308)。该N螺旋形成一个具有三个保守疏水沟的内部三聚体卷曲螺旋；一个C螺旋填充于这些沟的每一个之中。该结构可能相当于gp41融合-活性(fusion-active)状态的核心。依照Chan，D.C.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)15613-15617，有证据表明在1类HIV gp41的卷曲螺旋中的显著的空腔是有吸引力的药物目标。
据假设gp-41介导膜融合的机制可能涉及一种卷曲螺旋三聚体的形成，其被认为是推动从静止到融合状态的转变，如例如对于流感血凝素的描述(Wilson，I.A.，等，Nature 289(1981)366-373；Carr，C.M.和Kim，P.S.，Cell 73(1993)823-832；Bullough，P.A.，等，Nature 371(1994)37-43)。
有包膜病毒的C肽(对应于C螺旋的肽)，如DP178和C34，有效地抑制HIV-1的适合实验室的毒株和原始分离株的膜融合(Malashkevich，V.N.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)9134-9139；Wild，C.T.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1994)9770-9774)。使用C肽DP178的I期临床试验提示它具有导致病毒负荷减少的体内抗病毒活性(Kilby，J.M.，等，Nature Medicine 4(1998)1302-1307)。gp41核心的结构特征暗示这些肽通过一种优势的一负(dominant-negative)调节机制作用，其中C肽结合于gp41的中心卷曲螺旋并导致它的失活(Chan，D.C.，等，Cell 93(1998)681-684)。
在每个卷曲螺旋界面是一个由一串在N螺旋卷曲螺旋中的残基形成的深腔，其已被提出成为用于开发抗病毒化合物有吸引力的目标。源于C螺旋的三个残基(Trp-628，Trp-631，和Ile-635)插入到该空腔中并造成广泛的疏水接触。突变分析说明包含该空腔的N-螺旋残基中的两个(Leu-568和Trp-571)对于膜融合活性是关键性的(Cao，J.，等，J.Virol.67(1993)2747-2755)。因此，以高亲和力与该空腔结合并抑制正常的N和C螺旋配对的化合物可能是有效的HIV-1抑制剂。在不同的HIV-1分离株中该空腔中的残基是高度保守的。而且，含有该空腔结合区域的C肽比缺少该区域的DP178对抗性病毒的进化更不敏感得多(Rimsky，L.T.，等，J.Virol.72(1998)986-993)。这些观察暗示以高度保守的卷曲螺旋表面，尤其它的空腔为目标的高亲和性配体将具有对不同HIV分离株的广泛活性并更不可能被逃避药物的突变体回避。
从流感病毒，莫洛尼鼠类白血病病毒和猿猴免疫缺陷病毒(在Chan，D.C.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)15613-15617中引证)，人呼吸道合胞病毒，埃博拉病毒，人T细胞白血病病毒，猿猴副流感病毒显示了包膜融合蛋白的融合结构。它说明在正粘病毒科，副粘病毒科，逆转录病毒科和其它类线状病毒科各科之间的一种紧密关系，其中类跨膜糖蛋白如HIV-1的gp41，流感病毒的血凝素，埃博拉病毒的GP2及其它使得病毒能够进入靶细胞(Zhao，X.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)14172-14177)。
在技术水平方面，描述了用于制备肽抑制剂(C-肽)的方法(参见，例如，Root，M.J.，等，Science 291(2001)884-888；Root等描述了来源于HIV-1.HXB2和含有残基625-661的肽C37-H6)。它是作为带有GGR-接头和组氨酸标记的N40-节段被重组表达，其是在大肠杆菌中表达并从细菌裂解物的可溶性级分来纯化。Zhao，X.等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)14172-14177中描述了一种recRSV-1(人呼吸道合胞病毒)的合成基因，其编码残基153-209，一个富含G的接头，残基476-524，Xa因子切割位点和一个组氨酸标记。Chen.，C.H.，等，在J.Virol.69(1995)3771-3777中描述了作为残基540-686融合至MBP的融合蛋白gp41胞外结构域的重组表达。
已知了这类膜融合相关事件的许多肽抑制剂，其也称为抗融合肽，所述相关事件包括例如抑制逆转录病毒传染未感染细胞。例如Lambert，D.M.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)2186-2191，美国专利号6,013,263；6,017,536；和6,020,459和WO00/69902，WO99/59615，WO96/40191中描述了这类肽。在美国专利号6,093,794；6,060,065；6,020,459；6,017,536；6,013,263；5,464,933；5,656,480中和在WO96/19495中描述了另外的抑制融合相关事件的肽。
来源于HIV-Igp-41胞外域的抑制病毒融合的线性肽的实例是DP-107和DP-178。DP-107是靠近N-末端融合肽的gp-41的一部分并已经显示为螺旋状的，它以与卷曲螺旋结构一致的方式强烈寡聚化(Gallaher，W.R.，等，Aids Res.Hum.Retrovirus 5(1989)431-440，Weissenhom，W.，等，Nature387(1997)426-430)。DP-178是源于gp-41胞外域的C-末端区域。(Weissenhom，W.，等，Nature 387(1997)426-430)。尽管在溶液中没有可辨别的结构，该肽和来自于其的限定的类似物(constrained analogs)采取一种螺旋状结构，与gp41 N-末端卷曲螺旋三聚体的一个沟结合并且因而防止gp41转化为融合态(Judice，J.K.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)13426-13430)。
这类短链肽通常是通过化学合成制备。例如Mergler，M.，等，Tetrahedron Letters 29(1988)4005-4008和4009-4012；Andersson，L.，等，Biopolymers 55(2000)227-250；和由Jones，J.H.，J.Pept.Sci.6(2000)201-207描述了化学合成。在WO 99/48513中描述了另外的方法。
然而，化学肽合成有几个缺点。最重要的是外消旋化，其导致不充分的光学纯度。在肽化学中，外消旋化也就意味着在几个手性中心之一的差向异构化。如果对于单个偶联步骤仅仅发生1％的外消旋化，那么在100个偶联步骤将得到仅仅61％的目标肽(Jakubke，H.D.，肽，SpektrumAkad.Verlag，Heidelberg(1996)，198页)。明显的是杂质的数量随增长的链长增大并且它们的去除是越来越困难和昂贵。
高费用和作为原材料的保护性氨基酸衍生物可利用性的缺乏限制了大规模化学合成。一方面，这些原材料应该过量使用以使完成反应，另一方面，由于成本原因，安全性和环境方面的因素它们的使用应该是均衡的(Andersson等，Biopolymer 55(2000)227-250)。
通过重组DNA技术也可生产肽。尽管从技术水平已知了重组生产多于50个氨基酸链长的可溶蛋白，但生产含有少于50个氨基酸的肽具有几个缺点(Doebeli，H.，等，蛋白质表达和纯化12(1998)404-414)。这类短链或中链肽通常不被稳定表达。它们被内在肽酶攻击并降解。这可能由于它们小的尺寸或缺乏高度有序的三级结构(WO00/31279)。其它作者已经发现肽的重组生产要求60-80个氨基酸的最小链长以稳定表达，并且这类肽是作为可溶肽而不是作为内含体生产是另外的常识(参见例如van Heeke，G.，等，分子生物学方法36(1994)245-260，B.M.Dunn和M.W.Pennington编辑，Humana Press Inc.，Totowa，N.J)；和Goldberg等，最大化基因表达(1986)，287-314页，Reznikoff，W.，和Gold，L.，编辑Butterworks，Stoneham，MA)。重组生产较短的肽尤其不成功，因为如果在原核生物中表达这类肽，它们保持可溶并立即被原核肽酶降解。为了避免该问题，按照常识，这类肽是作为大的(多于150-200个氨基酸)融合蛋白表达，由此融合尾部致使融合蛋白相当可溶并避免内含体的形成，或者融合尾部是在原核生物中重组表达期间形成内含体的蛋白质，因此由该融合尾部和想要的短肽组成的融合蛋白在原核生物中的过量表达期间也将形成内含体。该方法的一个极大缺点是所述融合尾部的分子量比想要的肽的分子量相当地高。因此，想要的肽的产率非常低并且必须分离切割的融合尾部的剩余物。
Lepage，P.，等，在Analytical Biochemistry 213(1993)40-48中描述了用于生产HIV-1Rev肽的重组方法。该肽表达为具有金黄色葡萄球菌蛋白A的合成免疫球蛋白类型G(IgG)结合结构域的融合蛋白。该肽具有大约20个氨基酸的长度，而Ig-G结合部分具有大约170个氨基酸的长度，所以表达的融合蛋白具有大约190个氨基酸的总长。表达该融合蛋白，以可溶的形式分泌在培养基中，并通过亲和层析纯化。作者报道使用该方法可能以每升培养物几百毫克的数量生产重组蛋白。然而，由于在信号肽序列中的备选处理和融合蛋白及切割肽中的几种翻译后修饰导致该方法体系是受限制的。假定一个氨基酸的平均分子量为110道尔顿，期望的肽具有大约2,000-5,000道尔顿的分子量，然而如果将金黄色葡萄球菌蛋白A的IgG结合域用作该融合尾部，则该融合尾部具有至少170个氨基酸的长度(大约19,000 D)。因此，只有10-25％的重组生产的蛋白是想要的肽。
EP 0 673 948描述使用表达载体pSEM3重组生产作为与β-半乳糖苷酶的融合蛋白的gp41肽(Knapp，S.，等，BioTechniques 8(1990)280-281)。该融合蛋白包含β-半乳糖苷酶基因的一大部分和另外23个多接头序列的密码子，所述β-半乳糖苷酶基因的一大部分编码N-末端375个氨基酸。
由Uhlen和Moks，在Methods in Enzymology 185(1990)129-143，Academic Press的“Gene Fusions For Purposes of Expression，AnIntroduction”中描述了通过大的融合蛋白在大肠杆菌中重组生产小肽的另外实施例和方法。关于通过“内含体”途径生产，Uhlen和Moks提到包括融合部分如trpE，cII和再一次β-半乳糖苷酶的融合产物。Ningyi，L.，等，Gaojishu Tongxun 10(2000)28-31描述在大肠杆菌中重组表达p24gag基因。
因此本发明的目的是提供一种通过内含体途径能重组生产高产率抗融合肽的方法，其适于这类肽的大规模工业生产。
发明概述
本发明因此提供一种在原核宿主细胞中生产作为长度约为14-70个氨基酸的融合肽的抗融合肽的方法，其特征在于在该条件下形成所述融合肽的内含体，
a)在所述宿主细胞中，表达编码所述融合肽的核酸，所述融合肽包括N-末端与长度约为4-30个氨基酸的另外的肽连接的长度约为10-50个氨基酸的所述抗融合肽；
b)培养所述宿主细胞；
c)形成，回收和溶解所述内含体；
d)分离所述融合肽。
优选所述抗融合肽是在内含体溶解期间或之后从所述另外的肽切割。
优选所述抗融合肽是来自慢病毒属病毒包膜融合蛋白的跨膜亚基的C螺旋片段。
所述另外的肽，如果在所述宿主细胞中作为非融合肽重组表达，将不以内含体的形式被发现因为它非常短。
在本发明的一个优选实施方案中，所述另外的肽由第一和/或第二部分组成，
(a)其中所述第一部分是1-20个氨基酸的一段序列，优选影响融合肽的等电点的亲水性氨基酸，和/或所述第一部分在溶解度，与层析分离树脂的相互作用方面显著不同于抗融合肽和/或改善切割蛋白酶的接近(Polyak，S.W.，等，Protein Eng.10(1997)615-619)和
(b)其中所述第二部分是1-10个氨基酸的可切割肽接头区域(参见例如表3)，并位于靠近融合肽的N-末端和第一部分的C-末端。
如果另外的肽仅由第一或第二部分组成，为了在表达mRNA期间的稳定优选所述部分具有至少4个氨基酸的长度(包括起始密码子编码的甲硫氨酸)。所述4个氨基酸优选包括至少一个精氨酸。
在本发明的另一个实施方案中，所述抗融合肽包含连接在它C-末端的甘氨酸。该甘氨酸是为了酶促C-末端酰胺化。
在本发明的一个优选实施方案中，抗融合肽的分子量与融合肽中另外的肽的分子量的比率为10∶1-1∶2。
本发明的另外优选实施方案包含一种原核表达载体，其含有编码按照本发明的融合肽的核酸，和它用于重组生产所述肽的用途。
本发明的优选实施方案包含按照本发明的融合肽的内含体制剂和生产该内含体的方法。
本发明的另外优选实施方案包含编码按照本发明的融合肽的核酸。
发明详述
令人惊讶地发现可以在原核生物如大肠杆菌中通过内含体途径将短链抗融合肽(优选长度为10-50个氨基酸，更优选长度为10-40个氨基酸)成功表达为长度高达70个氨基酸的短融合肽。
按照本发明，在形成不溶性蛋白内含体的条件下在原核生物中过量表达N-末端与另外的肽连接的抗融合肽组成的融合肽。如果使用不包含信号序列的表达载体，在细胞质中发现内含体，其否则可使蛋白可溶性分泌至周质或培养基中。这些内含体是例如通过细胞裂解后离心从其它细胞组分中分离。通过变性剂如盐酸胍，脲，物质如精氨酸或强碱如KOH或NaOH溶解内含体。在溶解后，通常必须通过稀释或通过透析重折叠该蛋白质。因为按照本发明方法生产的融合肽是不含二硫键的短链肽，不需要复性。在溶解后，以使得能够切割另外的肽这样的方式简单改变溶液条件，如pH等，并且如果需要进行切割。然后可以以一种简单的方式，例如通过大小排阻层析，离子交换层析或反相层析从该溶液回收融合肽或抗融合肽。
在此使用的“抗融合”和“抗膜融合”指相对于膜融合的水平，肽抑制或降低在两种或更多结构，例如细胞膜或病毒包膜或菌毛之间的融合事件水平的能力，所述膜融合是在不存在该肽时在所述结构之间发生。关于这个的实例是慢病毒属如人免疫缺陷病毒(HIV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，人副流感病毒(HPV)，麻疹病毒(MEV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的肽抑制剂。这类抗融合肽是来源于慢病毒属病毒包膜融合蛋白的跨膜亚基C螺旋，并且结合于各个病毒跨膜亚基的中心卷曲螺旋。
特别优选HIV-1抗融合肽。表1描述源于gp41 C-肽的HIV-1抗融合肽实施例。这些抗融合肽和其片段在本发明中特别有用。
表1
| 名称* | 名称 | 氨基酸序列(单字母代码) | SEQ ID NO： |
| T-1249 | T13571) | WQEQEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF | 7 |
| T-20，DP178 | T6802) | YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF | 8 |
| T-118 | RSV1183) | FDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST | 9 |
| T-257 | MV2573) | LHRIDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELL | 10 |
*对于N-末端乙酰化和/或C-末端酰胺化的肽；T-20(与DP178同义)和T-1249是源于1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)，T-118源于呼吸道合胞病毒(RSV)，T-257源于麻疹病毒(MV)
1)WO99/59615
2)Rimsky，L.T.，等，J.Virol.72(1998)986-993
3)Lambert，D.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)2186-2191
按照本发明的另外的肽是被N-末端增加到抗融合肽的肽，其不是为了改善内含体形成的目的。它的目的是例如改善表达mRNA的稳定，纯化(例如组氨酸标记；参见例如，Zhang，J.-H.，等，Nanjing Daxue Xuebao，Ziran Kexue 36(4)(2000)515-517)或允许随后类似乙酰化或聚乙二醇化(PEGylation)的N-末端修饰。
按照本发明的另外的肽是一段包含至少四个氨基酸(用于切割mRNA的稳定和/或表达目的的蛋氨酸和三个其它氨基酸)至大约30个氨基酸，优选至大约20个氨基酸(关于核苷酸密码子水平)的短肽序列。另外的肽的长度对于本发明不是关键性的，只要在其中大的蛋白质如免疫球蛋白，链霉抗生物素或组织型纤溶酶原激活物是作为内含体生产的条件下，在原核生物中，在重组表达期间该肽在细胞质中以可溶形式形成。然而，为了提高抗融合肽的产率优选另外的肽是非常短的。(如果另外的肽对抗融合肽的长度比率是3∶1，与回收的融合肽的量相比，抗融合肽的量大约比如果比率是1∶1时如果生产相同量的融合肽相比低50％)为了获得可接受的抗融合肽产率，选择另外的肽的长度以使融合肽的总长不超过大约70个氨基酸，优选50个并最优选40个氨基酸。因此，特别优选另外的肽仅包括适当切割位点，用于改善融合肽的表达和可溶性，促进它的内含体的溶解过程或改善切割蛋白酶的接近(避免空间位阻)的一些氨基酸，和/或一些用于纯化方法的氨基酸如组氨酸标记(Hengen，P.，TrendsBiochem.Sci.20(1995)285-286)和必需的并由起始密码子编码的蛋氨酸。
另外的肽是短链肽，如果在原核生物如大肠杆菌中单独过量表达并且不含信号序列，其在细胞质中将不形成内含体而保持可溶或者在细胞质中被迅速降解。该蛋白质不形成固定的变性三级结构，因此它们不能形成几乎不溶的固定三级结构，因此保持可溶并且如果表达将被大肠杆菌蛋白酶降解。
按照本发明的另外的肽优选包括不形成固定三级构象的氨基酸，所述固定三级构象可能空间阻碍切割试剂接近融合肽和另外的肽之间的切割位点。因此，优选另外的肽不含半胱氨酸残基。半胱氨酸含有巯基或硫醇基，其是高度活性的并可形成二硫键。半胱氨酸的存在可抵制(workagainst)想要的另外的肽缺乏固定的二级或三级构象，因此避免它的使用。
在本发明的一个优选实施方案中，所述N-末端连接的另外的肽序列在它的C-末端包含可以通过酶促或化学方法容易切割的序列。
按照本发明的另外的肽也优选在融合肽中使用以在表达、溶解、纯化和肽修饰过程中保护抗融合肽的N-末端。这类融合肽在用于生产N-末端修饰的抗融合肽的方法中特别有价值。该方法涉及形成作为融合肽的重组多肽，其融合部分保护N-末端。然后可以用高达三种化学保护试剂与重组融合肽反应以选择性保护活性侧链基团，并由此防止侧链基团被修饰。接着使用至少一种切割试剂在肽和融合部分之间切割融合肽以形成一个未保护的末端氨基酸活性基团。为了N-末端乙酰化，使用至少一种化学修饰试剂如乙酐或N-羟基琥珀酰亚胺乙酯修饰未保护的末端氨基酸的活性基团。然后将侧链去保护以形成N-末端修饰的肽。例如在WO94/01451；美国专利号5,635,371；和美国专利号5,656,456中描述了这类方法。
另外的肽部分优选具有这样一种结构以使它促进融合肽的纯化。为了这个目的另外的肽优选含有一种“亲和标记”(参见Pandiaitan，B.，等，Gene 237(1999)333-342)，如聚组氨酸(约6个组氨酸残基)或类似物。
为了容易表达和在切割后分离片段，优选以这样一种方式选择另外的肽即它的等电点(IP)不同于抗融合肽的IP。表2显示不同融合肽的等电点和非融合融合肽T680和T1357的等电点(按照WO96/40191和WO99/59615命名)。优选融合肽和融合肽的抗融合部分的IP相差大约1个pH值单位，优选大约1-2个pH单位。该IP转变可以优选通过包含在另外的肽中的碱性氨基酸和/或组氨酸来进行。
表2
计算抗融合肽的等电点
| SEQ ID NO： | 序列2) | 计算出的 |
| 8 | T680 | 4.13 |
| 15 | M-HHHHHH-IEGR-T680-G | 6.13 |
| - | T1249 | 5.11) |
| 7 | T1357 | 4.53 |
| 14 | M-HHHHHH-IEGR-T1357-G | 6.23 |
| 2 | MRGS-HHHHHH-AIVD-IEGR-T1357-G | 6.23 |
1)实验测定。
2)单字母代码的氨基酸；相反部分(inverse part)是肽的名称。
在本发明的另一个优选实施方案中，抗融合肽在它的C-末端含有一个甘氨酸。该甘氨酸是用于随后的酶促C-末端酰胺化(Bradbury，A.F.，和Smyth，D.G.，Trends Biochem.Sci.16(1991)112-115)。
特别优选的按照本发明的融合肽是(标准单字母代码的氨基酸)：
MRGS-HHHHHH-AIDV-IEGR-T1357-G， (SEQ ID NO：2)
MRGS-HHHHHH-AIDV-IEGR-RSV118-G (SEQ ID NO：11)
MRGS-HHHHHH-AIDV-IEGR-MV257-G (SEQ ID NO：12)
M-HHHHHH-AIDV-IEGR-T680-G， (SEQ ID NO：13)
M-HHHHHH-IEGR-T1357-G (SEQ ID NO：14)所述融合肽不含聚组氨酸标记(His6)，或含有SEQ ID NO：2，11或12开始的4个氨基酸作为融合肽中的另外的肽。
注释：相关部分是肽的名称，因此包括在这些部分中的字母不组成氨基酸的单字母代码。
存在很多描述在原核生物中通过内含体途径重组生产蛋白质的出版物。这些出版物的实例是Misawa，S.，等，Biopolymers 51(1999)297-307；Lilie，H.，Curr.Opin.Biotechnol.9(1998)497-501；Hockney，R.C.，TrendsBiotechnol.12(1994)456-463。
在原核生物中过量表达按照本发明的融合肽。不含信号肽的过量表达导致内含体的形成。可以在进一步加工期间切割由起始密码子编码并在上述实施例中提及的蛋氨酸。用于在原核生物中过量表达蛋白的常规方法在领域中已众所周知很长时间。在该领域中的出版物的实例是Skelly，J.V.，等，Methods Mol.Biol.56(1996)23-53和Das，A.，Methods Enzymol.182(1990)93-112。
在原核生物中过量表达意味着使用具有启动子如tac或lac启动子(EP-B 0 067 540)的优化的表达盒的表达。通常，通过使用含有化学诱导启动子或通过温度改变诱导的启动子的载体可以进行过量表达。适于大肠杆菌的有用启动子之一是温度-敏感的冲L启动子(参见EP-B 0 041767)。另一个有效的启动子是tac启动子(参见美国专利号4,551,433)。这类用于原核生物如大肠杆菌的强调节信号通常来源于攻击细菌的噬菌体(参见Lanzer，M.，等，Proc.Natl.，Acad.Sci.美国85(1998)8973-8977；Knaus，R.，和Bujard，H.，EMBO Journal 7(1988)2919-2923；对于λT7启动子：Studier，F.W.，等，Methods Enzymol.185(1990)60-89)；对于T5启动子：EP 0 186 069)。
通过使用该过量生产的原核生物细胞表达系统，在至少构成细胞总表达蛋白的10％，典型地30-40％，偶尔高达50％的水平上生产按照本发明的融合肽。
在此使用的“内含体”(IBs)指在原核生物中过量表达编码核酸之后重组生产的一种不溶形式的多肽。该现象在本领域中是广泛了解的并且例如由Misawa S.，和Kumagai，I.，Biopolymers 51(1999)297-307)；Guise，A.D.，等，Mol.Biotechnol.6(1996)53-64；和Hockney等，Trends Biotechnol.12(1994)456-463综述。
优选通过加入变性剂如脲，盐酸胍或KOH或NaOH碱溶液进行内含体的溶解(Guise，A.D.，等，Mol.Biotechnol.6(1996)53-64；Fischer，B.，等，Arzneimittelforschung 42(1992)1512-1515)。
在溶解后可以使用专一性切割蛋白酶(限制性蛋白酶)酶切按照本发明的融合肽。考虑待生产的抗融合肽的氨基酸序列来选择蛋白酶。如果可能，必须注意限制性蛋白酶的识别/切割序列不出现在抗融合肽之中，并且优选也不在另一个肽中，即，它应该只出现在切割区域(接头区域)。合适的专一性切割内切蛋白酶是，例如Xa因子，凝血酶，枯草杆菌蛋白酶，BTN变体/遍在蛋白质蛋白酶肽酶，凝乳酶，胶原酶，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，内切蛋白酶Lys-C，激肽释放酶(Carter，P.：在：Ladisch，M.R.；Willson，R.C.；Painton，C.C.；Builder，S.E.，编辑.，ProteinPurification：From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes；ACSSymposium Series No.427，American Chemical Society，181-193页(1990)，TEV蛋白酶(Parks，T.D.，等，Anal.Biochem.216(1994)413-417)，IgA蛋白酶(Pohlner，J.，等，Nature 325(1987)458-462)，Kex2p蛋白酶(EP-A0 467 839)或金黄色葡萄球菌V8蛋白酶。
除了不含半胱氨酸之外，另外的肽的序列可优选采用促进在预选的切割环境中的有效切割的其它设计策略。具体地，如果预选切割试剂是一种内肽酶，优选另外的肽在水性环境中是可溶的。因此，优选在另外的肽中包含具有带电侧链基团和亲水性质的氨基酸以增进溶解性或促进切割蛋白酶接近的任何其它氨基酸。这类氨基酸是，例如，Glu和Asp(阴离子)，Arg和Lys，和Ser和Thr(中性，亲水性的)。如果使用精氨酸，必须考虑到精氨酸构成胰蛋白酶切割位点。因此，在其中另外的肽必须含有精氨酸的这种情形中，应该避免胰蛋白酶作为切割蛋白酶。赖氨酸的使用也受到限制。如果必须对肽进行N-末端修饰(参见上面)，可能需要保护赖氨酸基团。因此，在该情形中，在另外的肽中优选避免赖氨酸。
典型选择切割位点以使它不包含在抗融合肽中并优选包含在另外的肽中。例如在WO92/01707和WO95/03405中描述了化学和酶切割位点以及用于接近所述位点中的一个的肽键有效切割的相应试剂。
在下面表3中描述关于切割酶和切割序列的实例：
表3
| 酶 | 切割序列1) | SEQ ID NO： |
| 肠激酶 | DDDDK | 16 |
| Xa因子 | IEGR | 17 |
| 凝血酶 | RGPR | 18 |
| 遍在蛋白质 | RGG | |
| 凝乳酶 | HPFHL-LVY | 19 |
| 胰蛋白酶 | D或R | |
| 胰凝乳蛋白酶 | F或Y或W | |
| 梭菌蛋白酶 | R | |
| 金黄色葡萄球菌V8 | G |
化学切割
| 切割物质 | 切割序列1) |
| BrCN | M |
| BNPS-3-甲基吲哚 | W |
| 5-硝基-5-氰硫基苯甲酸(5-Nitro-5-thiocyanobenzoate) | C |
1)单字母代码的氨基酸
优选使用胰蛋白酶，其在精氨酸的C-末端专一性地切割蛋白质和肽。该酶已知是例如来源于猪或牛的胰腺或重组酵母。如果赖氨酸残基被保护并被所述酶攻击，胰蛋白酶特别适合产生所需的多肽。
在本发明的意义中将能够被内切蛋白酶切割的肽序列理解为一条短链肽序列，其优选包含1-20个氨基酸，优选1-10个氨基酸，并且含有一个适于期望的内切蛋白酶的C-末端切割位点。这个另外的肽优选在N-末端和期望的内切蛋白酶识别序列之间另外含有几个氨基酸的组合(第一部分)，优选选自氨基酸Gly，Thr，Ser，Ala，Pro，Asp，Glu，Arg和Lys。优选将其中两至八个这些另外的氨基酸是带负电的氨基酸Asp和/或Glu的氨基酸序列用作第一部分。
只要抗融合肽不含蛋氨酸也可使用BrCN切割(化学切割)。
通过在原核生物中表达编码肽的DNA(核酸序列)生产融合肽。表达载体不含介导将融合肽分泌至培养基或周质中的任何元件(例如信号肽)。因此，肽是作为不溶的折射体(IP’s)而形成。
按照在本领域已知的方法可以制备编码融合肽的DNA。更优选用另外的调节和转录元件扩展核酸序列以优化在宿主细胞中的表达。优选通过合成生产适合表达的DNA。该方法对于本领域的技术人员是熟悉的，并且例如在Beattie，K.L.，和Fowler，R.F.，Nature 352(1991)548-549；EP-B 0424 990；Itakura，K.，等，Science 198(1977)1056-1063中描述。修饰按照本发明的肽的核酸序列也可能是有利的。
该修饰是例如：
-为了引入限制性酶的各种识别序列以易化连接，克隆和突变的步骤而修饰核酸序列；
-修饰核酸序列以引入适于宿主细胞的优选密码子；
-为了优化在宿主细胞中的表达使用另外的调节和转录元件扩展核酸序列。
在构建合适表达载体和表达的方法中的所有另外的步骤是当今技术水平并且对于本领域的技术人员是熟悉的。例如在Sambrook等，分子克隆：实验手册(1989)，冷泉港实验室出版社，纽约，美国中描述了这类方法。
因为不分泌融合肽，它在细胞内，优选在细胞质中聚集。这里肽是以压缩和不溶的形式(内含体)保存。这将对细胞功能如蛋白酶解降解的干扰减少到最小。
大肠杆菌，链霉菌属或芽孢杆菌属例如作为原核宿主生物是合适的。为了生产按照本发明的融合肽，以通常方式用含有编码该肽的DNA的载体转化原核生物并且随后以通常方式发酵。在细胞裂解后以通常方式例如通过离心(沉淀组分)分离不溶的无活性肽(IBs)。如果需要可以通过例如使用含有去污剂的缓冲液洗涤沉淀进一步富集所需的不溶肽聚集体。
优选使用碱性溶液(例如KOH，pH10)溶解不溶性融合肽并通过适当方法例如pH8.0的Xa因子切割。
令人惊讶地，已经证明用按照本发明方法生产的作为内含体形成的融合肽在宿主细胞中不被降解，并接着可以被完全酶切而在抗融合肽元件它本身中没有显著切割。
提供下列实施例，参考文献，图1和序列表以帮助理解本发明，其真正的范围在后附的权利要求中阐明。在未背离本发明的精神的条件下对阐明的程序进行修改。
图1显示编码Xa-T 1357的表达载体。
序列表
SEQ ID NO：1合成基因Xa-T1357。
SEQ ID NO：2肽Xa-T1357。
SEQ ID NO：3引物1。
SEQ ID NO：4引物2。
SEQ ID NO：5引物3。
SEQ ID NO：6引物4。
SEQ ID NO：7肽T1357。
SEQ ID NO：8肽T680。
SEQ ID NO：9肽RSV118。
SEQ ID NO：10肽MV257。
SEQ ID NO：11肽Xa-RSV118。
SEQ ID NO：12肽Xa-MV257。
SEQ ID NO：13肽M-HHHHHH-AIDV-IEGR-T1357-G。
SEQ ID NO：14肽M-HHHHHH-IEGR-T1357-G。
SEQ ID NO：15肽M-HHHHHH-IEGR-T680-G。
SEQ ID NO：16切割序列。
SEQ ID NO：17切割序列。
SEQ ID NO：18切割序列。
SEQ ID NO：19切割序列。
实施例1
表达载体构建
合成基因Xa-T1357具有下列结构(从N-末端至C-末端)：
-EcoRI切割位点
-噬菌体T5的核糖体结合位点
-氨基酸M，R，G，S
-氨基酸6xH(组氨酸-标记)
-氨基酸A，I，D，V
-Xa因子接头I，E，G，R
-T1357序列(39个氨基酸)
-氨基酸G
-2个终止密码子
-BamHI切割位点
并通过SEQ ID NO：1描述。
使用四种由含有20，21和20个碱基对的三个重叠区域的基因序列组成的寡核苷酸通过基因合成构建合成基因。通过两步PCR反应进行合成。在第一步中，将寡核苷酸1和2以及寡核苷酸3和4每个分别用作完全合成基因的N-末端部分和基因的C-末端部分的模板。将产物用作第二步的模板，由此使用等分的这些产物。将引物1和4用作该步骤的合成引物。
使用EcoRI和BamHI消化产生的合成基因和载体pQE-30(Qiagen，DE)。通过凝胶提取(Qiagen)纯化两个限制酶切消化，然后用来连接以产生表达载体。插入片段与载体的比率为3∶1。载体在图1中显示。
通过限制对照(restriction control)和测序(SequiServe，DE)确定构建体的序列和正确定向。
实施例2
发酵，IB分离和溶解
发酵和IB分离：
在复合培养基(complex medium)中发酵包含实施例1表达载体的大肠杆菌细胞，使用氨苄青霉素和卡那霉素选择。将LB培养基用于预培养。对于主要培养物，将酵母提取物用作作为C-和N-源的唯一复合组分(complex component)，并将甘氨酸用作另外的C-源。在补料分批阶段以浓缩的形式加入两种组分。在适当的生长阶段诱导使用IPTG的表达。使用磷酸/苟性苏打将pH值调整为7±0.2。在高达0.5巴的过压下进行发酵。通过搅拌棒的旋转速度，通气和/或用量速率控制氧分压。在生长停止后和在相应的表达期后，立即或冷却后通过离心收获生物量并保存在冷冻状态。
以内含体(IB)的形式胞内获得待表达的外源蛋白，在纯化前进行IB制备。为此，使用匀浆器破裂生物量并在几个洗涤和离心步骤中纯化IB。溶解
在搅拌同时将5.21g IB(通过在100ml破裂缓冲液(100mMTris-HCl，10mM EDTA，pH7.0)中高压破裂从20g细胞制备)室温溶解在206ml 30mM KOH pH12中。
蛋白质含量加溶物(solubilisate)：c＝3.2mg/ml(Bradford蛋白质测定法，Bradford M.M.，Analytical Biochemistry 72(1976)248-254)→659.2mg总蛋白。融合肽的分子量：MW＝7161.96(7156.05单种同位素)
以同样的方式生产肽
MRGS-HHHHHH-AIDV-IEGR-RSV118-G(SEQ ID NO：11)
MRGS-HHHHHH-AIDV-IEGR-MV257-G(SEQ ID NO：12)
由此使用序列RSV 118和MV 257(参见表1)而不是序列“T1357”。
实施例3
柠康酰化(Citraconylation)和切割
a)柠康酰化
为了柠康酰化，将1∶1比率的柠康酸酐(MW：112.09，p＝1.245g/ml)和二噁烷的混合物加入融合肽，由此以每摩尔氨基基团12倍的过量使用柠康酸酐。为了柠康酰化，需要0.66g融合肽(MW：7162，实施例2b的破裂缓冲液中C＝3.2mg/ml)，五个氨基/分子和570μl柠康酸酐。通过使用浓缩HCl将加溶物(solubilisate)调整至pH值为11。接着，逐滴加入570μl柠康酸酐和570μl二噁烷的混合物并使用2M KOH缓冲该溶液以使pH值不下降至8.5之下。在将pH值调整为pH10后，在搅拌同时将制剂在室温温育过夜。使用乙醇胺(21ml 1M乙醇胺水溶液，pH8.0)(溶液中乙醇胺的终浓度：100mM)终止反应并通过使用2M HCl将pH值调整为pH8.5。然后将柠康酰化的物质保存在-20℃。
反应分批的总体积：237ml。
b)用胰蛋白酶切割
将反应分批与11.85ml 1M NaCl(终浓度50mM)和与1.25ml 1MCaCl2(终浓度2mM)混合，在搅拌同时将每个10ml它们的分批物与1.3U/ml胰蛋白酶室温温育80分钟。在1.3U/ml胰蛋白酶水平上，融合肽的完全切割已经发生。通过16％-麦黄酮-SDS凝胶和HPLC分析来确定切割。使用的胰蛋白酶是来自Roche Diagnostics GmbH的胰蛋白酶(纯度II，0.0091％胰凝乳蛋白酶活性，活性：206U/ml)。
c)通过HPLC分析测定切割
通过HPLC使用线性校准曲线测定肽部分，所述线性校准曲线是使用合成的Ac-T1357-G-OH制备。使用下列HPLC系统：
柱：Pharmacia Source 15RPC ST 4.6/100
洗脱液：缓冲液A：20mM Tris，pH7.5；缓冲液B：70％乙腈+30％
缓冲液A
梯度：28分钟内从0％B至100％B
流速：1ml/min。
检测：UV 226nm
实施例4
纯化
a)硫酸铵沉淀
向实施例3b的反应混合物加入固体硫酸铵(AS)(终浓度2M)，在溶解AS后，室温搅拌。通过4℃离心(10,000rpm)5分钟去除沉淀肽并将获得的沉淀(含有肽和胰蛋白酶)溶解在5ml Tris缓冲液(50mM，pH8.5)中。
b)苄脒琼脂糖6B层析
通过苄脒柱完成胰蛋白酶从上述溶液的去除。
施用：5mg蛋白
柱：HR 16(Pharmacia，h＝3.3cm，d＝1.6cm，V＝10ml)
材料：苄脒琼脂糖6B(Pharmacia No.17-0568-01)，按照制造商的说明书再生并用50mM Tris缓冲液，pH8.5平衡。
流速：1ml/min。
洗涤柱子：50mM Tris缓冲液，pH.8.540-80％的肽流经柱子，剩余的与柱材料结合。在随后使用60％乙醇的洗脱中，不能测定可能存在的胰蛋白酶的共洗脱，因为当乙醇含量是20％或更高时胰蛋白酶不再可检测。在流通和洗脱中，肽在HPLC分析中表现为单峰，并且肽在SDS凝胶中也是均一的。
c)通过苯基琼脂糖FF纯化
苯基琼脂糖FastFlow(Pharmacia)：将5mg含有AS的粒状沉淀(蛋白含量c＝5mg/ml)溶解于1ml Tris缓冲液(50mM Tris pH8.5)中，并上柱。肽完全与柱材料结合并可以用50mM Tris HCl，pH8.5中20-60％的乙醇梯度洗脱，洗脱在长期保留期间发生。肽组分是均一的。
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U.S.Patent No.6,013,263
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序列表
<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司
<120>重组生产肽抗病毒融合抑制剂的方法
<130>Case 20904
<140>
<141>
<160>22
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成基因
Xa-T1357
<220>
<221>CDS
<222>(32)..(211)
<400>1
cgaggaattc attaaagagg agaaattaac t atg aga gga tcg cat cat cat 52
Met Arg Gly Ser His His His
1 5
cat cat cat gct atc gat gtt att gaa ggc cgt tgg cag gaa tgg gaa 100
His His His Ala Ile Asp Val Ile Glu Gly Arg Trp Gln Glu Trp Glu
10 15 20
cag aaa att acc gcc ctg ctg gaa cag gcg caa att cag caa gag aaa 148
Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys
25 30 35
aac gaa tat gag ctg cag aaa ctg gat aag tgg gcg age ctg tgg gaa 196
Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Glu
40 45 50 55
tgg ttc ggc taa tga ggatccagct 221
Trp Phe Gly
60
<210>2
<211>58
<212>PRT
<213>人工序列
<223>人工序列的描述：合成基因
Xa-T1357
<400>2
Met Arg Gly Ser His His His His His His Ala Ile Asp Val Ile Glu
1 5 10 15
Gly Arg Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln
20 25 30
Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp
35 40 45
Lys Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe Gly
50 55
<210>3
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物1
<400>3
cgaggaattc attaaagagg agaaattaac tatgagagga tcgcatcatc atcatcatca 60
tgctatcgat 70
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物2
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agcagggcgg taattttctg ttcccattcc tgccaacggc cttcaataac atcgatagca 60
tgatgatgat 70
<210>5
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物3
<400>5
acagaaaatt accgccctgc tggaacaggc gcaaattcag caagagaaaa acgaatatga 60
gctgcagaaa c 71
<210>6
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物4
<400>6
agctggatcc tcattagccg aaccattccc acaggctcgc ccacttatcc agtttctgca 60
gctcatattc g 71
<210>7
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：肽T1357
<400>7
Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln
1 5 10 15
Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp
20 25 30
Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe
35
<210>8
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：肽T680
Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln
1 5 10 15
Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
20 25 30
Trp Asn Trp Phe
35
<210>9
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：肽RSV118
<400>9
Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu
1 5 10 15
Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly
20 25 30
Lys Ser Thr
35
<210>10
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：肽MV257
<400>10
Leu His Arg Ile Asp Leu Gly Pro Pro Ile Ser Leu Glu Arg Leu Asp
1 5 10 20
Val Gly Thr Asn Leu Gly Asn Ala Ile Ala Lys Leu Glu Asp Ala Lys
20 25 30
Glu Leu Leu
35
<210>11
<211>54
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：肽
Xa-RSV118
<400>11
Met Arg Gly Ser His His His His His His Ala Ile Asp Val Ile Glu
1 5 10 15
Gly Arg Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln
20 25 30
Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn
35 40 45
Ala Gly Lys Ser Thr Gly
50
<210>12
<211>54
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：肽
Xa-MV257
<400>12
Met Arg Gly Ser His His His His His His Ala Ile Asp Val Ile Glu
1 5 10 15
Gly Arg Leu His Arg Ile Asp Leu Gly Pro Pro Ile Ser Leu Glu Arg
20 25 30
Leu Asp Val Gly Thr Asn Leu Gly Asn Ala Ile Ala Lys Leu Glu Asp
35 40 45
Ala Lys Glu Leu Leu Gly
50
<210>13
<211>52
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：肽
M-HHHHHH-AIDV-IEGR-T1357-G
<400>13
Met His His His His His His Ala Ile Asp Val Ile Glu Gly Arg Tyr
1 5 10 15
Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu
20 25 30
Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp
35 40 45
Asn Trp Phe Gly
50
<210>14
<211>51
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：肽
M-HHHHHH-IEGR-T1357-G
<400>14
Met His His His His His His Ile Glu Gly Arg Trp Gln Glu Trp Glu
1 5 10 15
Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys
20 25 30
Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Glu
35 40 45
Trp Phe Gly
50
<210>15
<211>48
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：肽
M-HHHHHH-IEGR-T680-G
<400>15
Met His His His His His His Ile Glu Gly Arg Tyr Thr Ser Leu Ile
1 5 10 15
His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln
20 25 30
Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Gly
35 40 45
<210>16
<211>42
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：肽
MR-T1357-G
<400>16
Met Arg Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln
1 5 10 15
Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp
20 25 30
Lys Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe Gly
35 40
<210>17
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：切割
序列
<400>17
Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210>18
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：切割
序列
<400>18
Ile Glu Gly Arg
1
<210>19
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：切割
序列
<400>19
Arg Gly Pro Arg
1
<210>20
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：切割
序列
<400>20
His Pro Phe His Leu Leu Val Tyr
1 5
Claims (7)
1.一种用于在原核宿主细胞中生产作为长度约为14-70个氨基酸的融合肽的抗融合肽的方法，其特征在于，在形成所述融合肽的内含体的条件下，
a)在所述宿主细胞中表达编码所述融合肽的核酸，所述融合肽包括长度约为10-50个氨基酸的抗融合肽，其N-末端与长度约为4-30个氨基酸的另外的肽连接；
b)培养所述宿主细胞；
c)形成，回收和溶解所述内含体；
d)分离所述融合肽。
2.按照权利要求1的方法，其特征在于所述另外的肽由第一和/或第二部分组成，
(a)其中所述第一部分是高达20个氨基酸的一段序列，和
(b)其中所述第二部分是高达10个氨基酸的可切割的肽接头区域
并位于所述融合肽N-末端和所述第一部分C-末端附近。
3.按照权利要求1至2的方法，其特征在于所述抗融合肽的分子量与所述第二个肽的分子量的比率是10∶1-1∶2。
4.按照权利要求1至3的方法，其特征在于所述抗融合肽是在所述内含体溶解期间或之后从所述另外的肽切割。
5.一种编码长度约为14-70个氨基酸的融合肽的核酸，所述融合肽包括N末端与长度为4-30个氨基酸的另外的肽连接的长度约为10-50个氨基酸的抗融合肽。
6.一种含有核酸的原核表达载体，所述核酸编码长度约为10-50个氨基酸的抗融合肽或长度约为14-70个氨基酸的融合肽，所述融合肽包括N末端与长度为4-30个氨基酸的另外的肽连接的所述抗融合肽。
7.一种长度约为10-50个氨基酸的抗融合肽或长度约为14-70个氨基酸的融合肽的内含体制剂，所述融合肽N末端与长度为4-30个氨基酸的另外的肽连接。
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