ES2245505T3 - Metodos y composiciones para la sintesis de peptidos (t-20). - Google Patents
Metodos y composiciones para la sintesis de peptidos (t-20).Info
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Abstract
Un método para la síntesis de un péptido que tiene la fórmula Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 (SEQ ID NO: 1), que comprende: (a) hacer reaccionar un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula: Fmoc-EKNEQELLEL-COOH (SEQ ID NO: 11) con un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula: NH2-DKWASLWNWF-NH2 (SEQ ID NO: 18) para producir un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 (SEQ ID NO: 12); (b) desproteger el término amino del péptido producido en (a); (c) hacer reaccionar el péptido producido en (b) con un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) para producir un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 (SEQ ID NO: 1); (d) modificar el término amino del péptido producido en (c) en una modificación de acetilo; y (e) desproteger las cadenas secundarias del péptido protegido en sus cadenas secundarias de (d) para producir un péptido de fórmula: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 (SEQ ID NO: 1).
Description
Métodos y composiciones para la síntesis de
péptidos (T-20).
La presente invención se refiere, primero, a
métodos para la síntesis de T-20 (al que también se
hace referencia como "DP-178"; SEQ ID NO: 1).
Tales métodos utilizan procedimientos de síntesis en fase sólida y
líquida para sintetizar y combinar grupos de fragmentos de péptidos
específicos para producir el péptido de interés. La presente
invención se refiere además a fragmentos de péptidos individuales
que actúan como intermedios en la síntesis del péptido. La presente
invención se refiere además todavía a grupos de tales fragmentos
intermedios de péptidos que pueden utilizarse juntos para producir
péptidos T-20 de longitud completa. La presente
invención se refiere además aún a fragmentos de péptidos
individuales que actúan como intermedios en la síntesis del péptido
sujeto.
Recientemente, se ha identificado un gran número
de péptidos que presentan capacidad para inhibir casos asociados con
fusión y, de modo importante, presentan también actividad antivírica
eficaz. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. Nº 5.464.933
y 5.656.480, y la Publicación PCT Nº WO
96/19495T-20. Para usar extensamente estos péptidos,
como agentes terapéuticos, por ejemplo, la necesidad surge de la
capacidad para sintetizar en cantidades a gran escala.
Aunque existen técnicas para síntesis de péptidos
(véase, por ejemplo, Mergler et al., 1988, Tetrahedron
Letters 29:4005-4008; Mergler et al., 1988,
Tetrahedron Letters 29:4009-4012; Kamber et
al. (reds.), "Peptides, Chemistry and Biology", ESCOM,
Leiden, 1992, 525-526; y Riniker et al.,
1993, Tetrahedron Letters 49:9307-9320) no existen
actualmente técnicas que puedan utilizarse para producción económica
a gran escala de péptidos purificados fácilmente tales como
T-20.
La presente invención se refiere, primero, a
métodos para la síntesis de T-20 (al que también se
hace referencia como "DP-178"; SEQ ID NO: 1).
Tales métodos utilizan procedimientos de síntesis en fase sólida y
líquida para sintetizar y combinar grupos de fragmentos de péptidos
específicos para producir el péptido de interés. Generalmente, los
métodos de la invención comprenden sintetizar intermedios de
fragmentos de péptidos protegidos en sus cadenas secundarias de
T-20 en un soporte sólido, acoplar los fragmentos
protegidos en solución para formar un péptido T-20
protegido y seguir por desprotección de las cadenas secundarias para
producir el péptido T-20 final. Los métodos de la
invención implican la síntesis de un péptido T-20
que tiene una secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID
NO: 1.
La presente invención se refiere además al uso de
fragmentos de péptidos individuales que actúan como intermedios en
la síntesis del péptido. Los fragmentos de péptidos de la invención
incluyen los que tienen secuencias de aminoácidos como se representa
en la siguiente Tabla 1:
\vskip1.000000\baselineskip
| Péptido Nº | Secuencia de aminoácidos | Secuencia de | |
| aminoácidos | |||
| numerada | |||
| correspondiente | |||
| de T-20 | |||
| 1 | YTSLIHSL | (SEQ ID NO: 2) | 1-8 |
| 2 | YTSLIHSLIEESQNQ | (SEQ ID NO: 3) | 1-15 |
| 3 | YTSLIHSLIEESQNQQ | (SEQ ID NO: 4) | 1-16 |
| 4 | YTSLIHSLIEESQNQQEK | 1-18 | |
| 5 | IEESQNQ | (SEQ ID NO: 6) | 9-15 |
| 6 | IEESQNQQ | (SEQ ID NO: 7) | 9-16 |
| 7 | QEKNEQELLELDKWASLWNW | (SEQ ID NO: 8) | 16-35 |
| Péptido Nº | Secuencia de aminoácidos | Secuencia de | |
| aminoácidos | |||
| numerada | |||
| correspondiente | |||
| de T-20 | |||
| 8 | QEKNEQELLELDKWASLWNWF | (SEQ ID NO: 9) | 16-36 |
| 9 | EKNEQEL | (SEQ ID NO: 10) | 17-23 |
| 10 | EKNEQELLEL | (SEQ ID NO: 11) | 17-26 |
| 11 | EKNEQELLELDKWASLWNWF | (SEQ ID NO: 12) | 17-36 |
| 12 | NEQELLELDKWASLWNW | (SEQ ID NO: 13) | 19-35 |
| 13 | NEQELLELDKWASLWNWF | (SEQ ID NO: 14) | 19-36 |
| 14 | LELDKWASLWNW | (SEQ ID NO: 15) | 24-35 |
| 15 | LELDKWASLWNWF | (SEQ ID NO: 16) | 24-36 |
| 16 | DKWASLWNW | (SEQ ID NO: 17) | 27-35 |
| 17 | DKWASLWNWF | (SEQ ID NO: 18) | 27-36 |
| 18 | EKNEQELLELDKWASLWNW | (SEQ ID NO: 19) | 17-35 |
La presente invención se refiere además todavía a
grupos particulares de fragmentos de péptidos que actúan como
intermedios en la síntesis del péptido de interés. Los grupos de
fragmentos de péptidos según la invención incluyen los Grupos
1-20, como se denominan en la siguiente Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
| Grupo | Secuencia de aminoácidos | Secuencia de aminoácidos | |
| numerada correspondiente | |||
| de T-20 | |||
| 1 | YTSLIHSLIEESQNQQ | (SEQ ID NO: 4) | 1-16 |
| EKNEQELLELDKWASLWNWF | (SEQ ID NO: 12) | 17-36 | |
| 2 | YTSLIHSLIEESQNQQ | (SEQ ID NO: 4) | 1-16 |
| EKNEQELLEL | (SEQ ID NO: 11) | 17-26 | |
| DKWASLWNWF | (SEQ ID NO: 18) | 27-36 | |
| 3 | YTSLIHSLIEESQNQQ | (SEQ ID NO: 4) | 1-16 |
| EKNEQELLEL | (SEQ ID NO: 11) | 17-26 | |
| DKWASLWNW | (SEQ ID NO: 17) | 27-35 | |
| 4 | YTSLIHSL | (SEQ ID NO: 2) | 1-8 |
| IEESQNQQ | (SEQ ID NO: 6) | 9-15 | |
| EKNEQELLEL DKWASLWNWF | (SEQ ID NO: 12) | 17-36 | |
| 5 | YTSLIHSL | (SEQ ID NO: 2) | 1-8 |
| IEESQNQQ | (SEQ ID NO: 6) | 9-15 | |
| EKNEQELLEL | (SEQ ID NO: 11) | 17-26 | |
| DKWASLWNWF | (SEQ ID NO: 18) | 27-36 | |
| 6 | YTSLIHSL | (SEQ ID NO: 2) | 1-8 |
| IEESQNQQ | (SEQ ID NO: 6) | 9-15 | |
| EKNEQELLEL | (SEQ ID NO: 11) | 17-26 | |
| DKWASLWNW | (SEQ ID NO: 17) | 27-35 |
| Grupo | Secuencia de aminoácidos | Secuencia de aminoácidos | |
| numerada correspondiente | |||
| de T-20 | |||
| 7 | YTSLIHSL | (SEQ ID NO: 2) | 1-8 |
| IEESQNQQ | (SEQ ID NO: 7) | 9-16 | |
| EKNEQELLELDKWASLWNWF | (SEQ ID NO: 12) | 17-36 | |
| 8 | YTSLIHSL | (SEQ ID NO: 2) | 1-8 |
| IEESQNQQ | (SEQ ID NO: 7) | 9-16 | |
| EKNEQELLEL | (SEQ ID NO: 11) | 17-26 | |
| DKWASLWNWF | (SEQ ID NO: 18) | 27-36 | |
| 9 | YTSLIHSL | (SEQ ID NO: 2) | 1-8 |
| IEESQNQQ | (SEQ ID NO: 7) | 9-16 | |
| EKNEQELLEL | (SEQ ID NO: 11) | 17-26 | |
| DKWASLWNW | (SEQ ID NO: 17) | 27-35 | |
| 10 | YTSLIHSLIEESQNQQ | (SEQ ID NO: 4) | 1-16 |
| EKNEQEL | (SEQ ID NO: 10) | 17-23 | |
| LELDKWASLWNWF | (SEQ ID NO: 16) | 24-36 | |
| 11 | YTSLIHSLIEESQNQQ | (SEQ ID NO: 4) | 1-16 |
| EKNEQEL | (SEQ ID NO: 10) | 17-23 | |
| LELDKWASLWNW | (SEQ ID NO: 15) | 24-35 | |
| 12 | YTSLIHSL | (SEQ ID NO: 2) | 1-8 |
| IEESQNQQ | (SEQ ID NO: 6) | 9-15 | |
| EKNEQEL | (SEQ ID NO: 10) | 17-23 | |
| LELDKWASLWNWF | (SEQ ID NO: 16) | 24-36 | |
| 13 | YTSLIHSL | (SEQ ID NO: 2) | 1-8 |
| IEESQNQ | (SEQ ID NO: 6) | 9-15 | |
| EKNEQEL | (SEQ ID NO: 10) | 17-23 | |
| LELDKWASLWNW | (SEQ ID NO: 15) | 24-35 | |
| 14 | YTSLIHSL | (SEQ ID NO: 2) | 1-8 |
| IEESQNQQ | (SEQ ID NO: 7) | 9-16 | |
| EKNEQEL | (SEQ ID NO: 10) | 17-23 | |
| LELDKWASLWNWF | (SEQ ID NO: 16) | 24-36 | |
| 15 | YTSLIHSL | (SEQ ID NO: 2) | 1-8 |
| IEESQNQQ | (SEQ ID NO: 7) | 9-16 | |
| EKNEQEL | (SEQ ID NO: 10) | 17-23 | |
| LELDKWASLWNW | (SEQ ID NO: 15) | 24-35 | |
| 16 | YTSLIHSLIEESQNQ | (SEQ ID NO: 3) | 1-15 |
| QEKNEQELLELDKWASLWNWF | (SEQ ID NO: 9) | 16-36 | |
| 17 | YTSLIHSLIEESQNQ | (SEQ ID NO: 3) | 1-15 |
| QEKNEQELLELDKWASLWNWF | (SEQ ID NO: 9) | 16-36 | |
| 18 | YTSLIHSLIEESQNQQEK | (SEQ ID NO: 5) | 1-18 |
| NEQELLELDKWASLWNWF | (SEQ ID NO: 14) | 19-36 | |
| 19 | YTSLIHSLIEESQNQQEK | (SEQ ID NO: 5) | 1-18 |
| NEQELLELDKWASLWNW | (SEQ ID NO: 13) | 19-35 | |
| 20 | YTSLIHSLIEESQNQQ | (SEQ ID NO: 4) | 1-16 |
| EKNEQELLELDKWASLWNW | (SEQ ID NO: 19) | 17-35 |
Esta invención se basa, en parte, en el
descubrimiento inesperado de los inventores de que ciertas
combinaciones de reacciones de síntesis en fase sólida y fase
líquida permiten fabricarse T-20 de alta pureza y
péptidos por primera vez a gran escala con alta capacidad de
producción y alto rendimiento. En particular, según los métodos de
la invención, pueden sintetizarse péptidos T-20 en
una escala de uno o más kilogramos. Se ha encontrado que,
seleccionando los fragmentos de péptido T-20
específicos de la invención para síntesis en fase sólida, puede
explotarse el acoplamiento altamente eficaz de técnicas en fase
sólida sin tener que usar el exceso de 3, 4 o incluso 5 veces de
aminoácidos y reactivos que se requieren normalmente en síntesis en
fase sólida. Los métodos de la invención usan sólo aproximadamente
1,5 veces de aminoácidos en la síntesis en fase sólida de los
fragmentos de péptidos de la invención. Esta reducción con ahorro de
costes en la cantidad de aminoácido y reactivos hace a los métodos
de la invención adecuados para síntesis a gran escala de péptidos
T-20.
Además, los inventores han encontrado
sorprendentemente que ciertos fragmentos de péptidos pueden
sintetizarse en fase sólida con una carga de aproximadamente 0,8 a 1
mmol por gramo de resina de fase sólida. Esta carga es
significativamente mayor que el intervalo de carga de 0,25 a 0,4
mmoles por gramo de resina conseguido típicamente en síntesis de
péptidos en fase sólida. Además, los inventores han encontrado que
sintetizar fragmentos de péptidos seleccionados en fase sólida
usando resina supersensible a ácidos produce fragmentos de péptidos
de pureza extraordinariamente alta. No son necesarias técnicas
cromatográficas para purificar los fragmentos de péptidos producidos
según la invención; los fragmentos se llevan simplemente a cabo
mediante etapas de precipitación y/o trituración antes de usar, o se
usan como se obtienen directamente de la resina. El uso de una
resina supersensible a ácidos permite a los péptidos protegidos
sintetizados de la invención ser divididos de la resina sin
separación concomitante de los grupos protectores de cadenas
secundarias. Esto reduce impurezas, y permite sintetizar con alta
pureza péptidos que comprenden 10 aminoácidos o más. El perfil de
impureza de péptidos T-20 que se sintetizan en fase
solución según los métodos de la invención por acoplamiento de los
fragmentos de péptidos de alta pureza producidos según la invención
consiste en principalmente fragmentos que no se acoplan, antes que
análogos relacionados estrechamente. Por consiguiente, los péptidos
T-20 producidos según la invención son mucho más
fáciles de purificar que los producidos según técnicas
convencionales. Los Ejemplos presentados en las posteriores
Secciones 9 y 11 demuestran tales síntesis combinatorias de péptidos
de longitud completa T-20. Los Ejemplos presentes en
la Sección 11 demuestran la síntesis a gran escala y purificación de
T-20 y péptidos intermedios de T-20.
Por consiguiente, con los métodos de la invención pueden producirse
T-20 e intermedios de péptido T-20
en una escala de uno o más kilogramos.
Los presentes inventores han encontrado también
inesperadamente que péptidos tales como T-20 y
ciertos fragmentos de péptidos descritos aquí pueden purificarse
usando materiales de alta capacidad que pueden usarse con intervalos
de pH básico como una realización particular. En resumen, la
presente invención ofrece muchos beneficios y soluciones innovadoras
a problemas planteados en el área de síntesis escalable de los
péptidos sujeto y la identificación de fragmentos de péptidos
individuales que actúan como intermedios en la síntesis de los
péptidos sujeto.
| Aminoácido | Símbolo de una letra | Abreviatura común | |
| Glutamina | Q | Gln | |
| Ácido glutámico | E | Glu | |
| Histidina | H | His | |
| Isoleucina | I | Ile | |
| Leucina | L | Leu | |
| Lisina | K | Lys | |
| Fenilalanina | F | Phe | |
| Serina | S | Ser | |
| Treonina | T | Thr | |
| Triptófano | W | Trp | |
| Tirosina | Y | Tyr |
Fig. 1: método de cuatro fragmentos de
T-20. Esta figura representa el esquema seguido en
el Ejemplo presentado en la posterior Sección 9.1, para la síntesis
de T-20 de longitud completa partiendo del Grupo 6
de fragmentos de péptidos intermedios, como se muestra en la
anterior Tabla 2.
Fig. 2: método de cuatro fragmentos de
T-20, vía 2. Esta figura representa un esquema de
cuatro fragmentos adicional que acopla el Grupo 6 de intermedios de
péptidos, como se muestra en la anterior Tabla 2, para la síntesis
de T-20 de longitud completa.
Fig. 3: método de tres fragmentos de
T-20. Esta figura representa el esquema seguido en
el Ejemplo presentado en la posterior Sección 9.1, para la síntesis
de T-20 de longitud completa.
Fig. 4. Método de tres fragmentos de
T-20, vía 2. Esta figura representa el esquema
seguido en el Ejemplo presentado en las posteriores Secciones 9.2,
9.3, 9.4 y 9.5, para la síntesis de T-20 de longitud
completa.
Fig. 5. Método de dos fragmentos de
T-20. Esta figura representa un esquema que acopla
el Grupo 18 de intermedios de péptidos como se muestra en la
anterior Tabla 2, para la síntesis de T-20 de
longitud completa.
La presente invención se refiere a métodos,
fragmentos de péptidos y grupos de fragmentos de péptidos que pueden
usarse para sintetizar el péptido conocido como T-20
o, alternativamente, DP-178. T-20 es
un péptido que corresponde a los residuos de aminoácidos 638 a 673
de la proteína transmembrana gp41 de aislado de
HIV-1_{LAI} y tiene la secuencia de 36 aminoácidos
(leyendo desde el término amino, NH_{2}, hasta carboxi, COOH):
NH_{2}-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH
Se entenderá que los métodos, fragmentos y grupos
de fragmentos y técnicas utilizadas para escoger los fragmentos y
grupos de fragmentos de la presente invención pueden usarse para
sintetizar fragmentos de tipo T-20 además de
T-20. Además de los péptidos T-20
descritos antes, los métodos, fragmentos y grupos de fragmentos de
la presente invención pueden usarse para sintetizar péptidos que
tengan extremos terminales amino y/o carboxilo modificados. Tomando
T-20 como ejemplo, tales péptidos pueden ser de
fórmula:
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
en la X representa un grupo amino;
un grupo hidrófobo seleccionado del grupo constituido por
carbobenzoxilo, dansilo y T-butiloxicarbonilo; un
grupo acetilo; un grupo
9-fluorenil-metoxi-carbonilo
(FMOC); o un grupo portador macromolecular seleccionado del grupo
constituido por conjugados de lípido-ácido graso, polietilenglicol e
hidratos de carbono; y Z representa un grupo carboxilo; un grupo
amido; un grupo T-butiloxicarbonilo; un grupo éster
de para-nitrobencilo; o un grupo portador
macromolecular seleccionado del grupo constituido por conjugados de
lípido-ácido graso, polietilenglicol e hidratos de carbono. Las
técnicas para la adición de tales grupos "X" y "Z" son muy
conocidas por los expertos en la
técnica.
En una realización preferida, se usan los métodos
de la invención para sintetizar el péptido que tiene la fórmula
anterior en la que X es un grupo acetilo y Z es un grupo amida. Los
Ejemplos presentados en la posterior Sección 9 demuestran la
síntesis con éxito de péptidos T-20 mediante el
acoplamiento de intermedios de péptidos descritos después en la
Sección 5.2. En un método preferido, pueden purificarse péptidos
T-20 e intermedios usando cualquier relleno de
columna no basado en sílice (para maximizar la capacidad de carga)
incluyendo rellenos basados en zirconio, poliestireno y rellenos
basados en poliacrílico u otro polímero que sean estables a
intervalos de pH elevados (mayores de 7). Por ejemplo, entre el
relleno de columna no cargada de sílice, que presenta un amplio
intervalo de pH que incluye valores de pH mayores que ese, están los
vendidos por Tosohaus (Montogomeryville, PA). Las columnas rellenas
con tal material pueden hacerse funcionar en cromatografía a baja,
media o alta presión. Véase, por ejemplo, el método de purificación
presentado en la posterior Sección 10.
La presente invención abarca grupos de
intermedios de fragmentos de péptidos de T-20 e
incluye los péptidos con secuencias de aminoácidos específicas como
se lista en la anterior Tabla 1, y especialmente en grupos como se
lista en la siguiente Tabla 2, que pueden utilizarse para producir
T-20.
Una cualquiera o más de las cadenas secundarias
de los residuos de aminoácidos de los fragmentos de péptidos
listados en las Tablas 1 o 2 pueden protegerse con grupos
protectores estándares tales como t-butilo
(t-Bu), tritilo (trt) y
t-butiloxicarbonilo (Boc). El grupo
t-Bu es el grupo protector de cadenas secundarias
preferido para los residuos de aminoácidos Tyr(Y),
Thr(T), Ser(S) y Asp(D); el grupo trt es el
grupo protector de cadenas secundarias preferido para los residuos
de aminoácidos His(H), Gln(Q) y Asn(N); y el
grupo Boc es el grupo protector de cadenas secundarias preferido
para los residuos de aminoácidos Lys(K) y Trp(W).
Durante la síntesis de los fragmentos 1, 2, 3 y 4
listados en la Tabla 1, debe protegerse la cadena secundaria del
residuo de histidina, preferiblemente con un grupo protector tritilo
(trt). Si no se protege, el ácido usado para dividir el fragmento de
péptido de la resina reaccionará perjudicialmente con el residuo de
histidina, causando la degradación del fragmento de péptido.
Preferiblemente, los residuos de glutamina de los
fragmentos de péptidos de la invención se protegen con grupos
tritilo (trt). Sin embargo, se prefiere no proteger el
residuo de glutamina en el extremo carboxi-terminal
de los fragmentos 1-16 y 9-16. Se ha
encontrado que la ausencia de un grupo protector en el residuo de
glutamina en el extremo carboxi-terminal del
fragmento 1-16 facilita la reacción del fragmento
1-16 con el fragmento 17-36,
permitiendo el acoplamiento de los fragmentos con sólo
aproximadamente 2% de racemización. Además, si se desea una
solubilidad menor de cualquiera de los fragmentos de péptidos de la
invención en disolventes orgánicos, pueden eliminarse los grupos
protectores tritilo de uno cualquiera o más de los otros residuos de
glutamina de los fragmentos.
Preferiblemente, se protegen todos los residuos
de asparagina de cada fragmento de péptido de la invención. Además,
se prefiere proteger el residuo de triptófano con un grupo Boc.
\newpage
Los fragmentos de péptidos protegidos según las
fórmulas de péptidos 1-18 listadas en la anterior
Tabla 1 incluyen los compuestos listados en la siguiente Tabla
3.
\vskip1.000000\baselineskip
| Fórmula de | Fórmula | Secuencia de |
| péptido Nº | aminoácidos | |
| numerada | ||
| correspondiente | ||
| de T-20 | ||
| 1a | Ac-YTSLIHSL-COOH (SEQ ID NO: 2) | 1-8 |
| 1b | FMOC-YTSLIHSL-COOH (SEQ ID NO: 2) | 1-8 |
| 3a | Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OPNB (SEQ ID NO: 4) | 1-16 |
| 3b | FMOC-YTSLIHSLIEESQNQQ-OPNB (SEQ ID NO: 4) | 1-16 |
| 3c | Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) | 1-16 |
| 3d | FMOC-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) | 1-16 |
| 5a | Ac-IEESQNQ-COOH (SEQ ID NO: 6) | 9-15 |
| 5b | FMOC-IEESQNQ-COOH (SEQ ID NO: 6) | 9-15 |
| 6a | NH_{2}-IEESQNQQ-OPNB (SEQ ID NO: 7) | 9-16 |
| 6b | FMOC-IEESQNQQ-OPNB (SEQ ID NO: 7) | 9-16 |
| 9a | Ac-EKNEQEL-COOH (SEQ ID NO: 10) | 17-23 |
| 9b | FMOC-EKNEQEL-COOH (SEQ ID NO: 10) | 17-23 |
| 10a | Ac-EKNEQELLEL-COOH (SEQ ID NO: 11) | 17-26 |
| 10b | FMOC-EKNEQELLEL-COOH (SEQ ID NO: 11) | 17-26 |
| 11a | NH_{2}-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 12) | 17-36 |
| 11b | FMOC-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 12) | 17-36 |
| 14a | Ac-LELDKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 15) | 24-35 |
| 14b | FMOC-LELDKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 15) | 24-35 |
| 15a | NH_{2}-LELDKWASLWNWF- NH_{2} (SEQ ID NO: 16) | 24-36 |
| 15b | FMOC-LELDKWASLWNWF- NH_{2} (SEQ ID NO: 16) | 24-36 |
| 16a | Ac-DKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 17) | 27-35 |
| 16b | FMOC-DKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 17) | 27-35 |
| 17a | NH_{2}-DKWASLWNWF- NH_{2} (SEQ ID NO: 18) | 27-36 |
| 17b | FMOC-DKWASLWNWF- NH_{2} (SEQ ID NO: 18) | 27-36 |
| 18a | FMOC-EKNEQELLELDKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 19) | 17-35 |
Una cualquiera o más de las cadenas secundarias
de los residuos de aminoácidos de los péptidos listados en la
anterior Tabla 3 pueden protegerse con grupos protectores de cadenas
secundarias estándares tales como tBu, trt y Boc, como se ha
descrito antes. Se presentan síntesis representativas de péptidos de
la Tabla 3 en las siguientes Secciones 7 y 8, que utilizan las
técnicas generales discutidas en la siguiente Sección 5.4.
Como se ha comentado antes, algunos de los
fragmentos de péptidos individuales de la invención se hacen
preferiblemente usando técnicas de síntesis en fase sólida, mientras
que otros péptidos de la invención se fabrican preferiblemente
usando una combinación de técnicas de síntesis en fase sólida y en
fase solución, culminando dichas síntesis en la producción de
péptidos T-20 como se ha descrito aquí. Sin embargo,
se entenderá que los fragmentos de péptidos de la invención pueden
sintetizarse o prepararse por técnicas muy conocidas en la técnica.
Véase, por ejemplo, Creighton, 1983, Proteins: Structures and
Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY.
Los péptidos de la invención pueden sintetizarse
alternativamente de tal modo que uno o más de las uniones que
enlazan los residuos de aminoácidos de los péptidos sean uniones no
péptidas. Estas uniones no-péptidas alternativas
pueden formarse utilizando reacciones muy conocidas para ellas en la
técnica, y pueden incluir uniones imino, éster, hidrazida,
semicarbazida y azo, por nombrar sólo unas pocas.
En otra realización todavía de la invención,
pueden sintetizarse péptidos T-20 que comprenden las
secuencias descritas antes con grupos químicos adicionales presentes
en sus términos amino y/o carboxi, de tal modo, por ejemplo, que se
aumente la estabilidad, reactividad y/o solubilidad de los péptidos.
Por ejemplo, pueden añadirse a los términos amino de péptidos grupos
hidrófobos tales como grupos carbobenzoxilo, dansilo, acetilo o
t-butiloxicarbonilo. De manera similar, pueden
ponerse en los términos amino de péptidos un grupo acetilo o un
grupo 9-fluorofenilmetoxi-carbonilo.
(Véase modificación "X" de T-20, descrita
antes). Adicionalmente, el grupo hidrófobo
t-butiloxicarbonilo o un grupo amido pueden añadirse
a los términos carboxi de los péptidos. De modo similar, puede
ponerse un grupo éster de p-nitrobencilo en los
términos carboxi de los péptidos. (Véase modificación "Z" de
T-20, descrita antes). Técnicas para introducir
tales modificaciones son muy conocidas por los expertos en la
técnica.
Además, pueden sintetizarse péptidos
T-20 de tal modo que se altere su configuración
estérica. Por ejemplo, puede usarse el isómero D de uno o más de los
residuos de aminoácidos del péptido, en lugar del isómero L
habitual.
Todavía más, al menos uno de los residuos de
aminoácidos de los péptidos de la invención puede sustituirse por
uno de los residuos de aminoácidos de origen no natural bien
conocidos. Alteraciones tales como éstas pueden servir para aumentar
la estabilidad, reactividad y/o solubilidad de los péptidos de la
invención.
Cualquiera de los péptidos T-20
puede sintetizarse para tener adicionalmente un grupo portador
macromolecular incorporado covalentemente a sus términos amino y/o
carboxi. Tales grupos portadores macromoleculares pueden incluir,
por ejemplo, conjugados de lípido-ácido graso, polietilenglicol,
hidratos de carbono o péptidos adicionales. La modificación "X"
de T-20 descrita antes puede representar por tanto
adicionalmente cualquiera de los grupos portadores macromoleculares
anteriores incorporados covalentemente al término amino de un
péptido, prefiriéndose un grupo péptido adicional. De modo similar,
la modificación "X" de T-20 descrita antes
puede representar adicionalmente cualquiera de los grupos portadores
macromoleculares descritos antes.
Preferiblemente, los fragmentos de péptidos de la
presente invención se sintetizan por técnicas de síntesis de
péptidos en fase sólida (SPPS) usando métodos de FMOC estándares.
Véase, por ejemplo, Carpino et al., 1970, J. Am. Chem.
Soc. 92 (19): 5748-5749; Carpino et al.,
1972, J. Org. Chem. 37 (22): 3404-3409. En
una realización preferida, la síntesis en fasesólida de los
fragmentos de péptidos de la presente invención se realiza en
soportes sólidos supersensibles a ácidos que incluyen resina de
cloruro de 2-clorotritilo (véase, por ejemplo,
Barlos et al., 1989, Tetrahedron Letters 30 (30):
3943-3946) y resina de ácido
4-hidroximetil-3-metoxifenoxibutírico
(véase, por ejemplo, Seiber, 1987, Tetrahedron Letters 28
(49): 6147-6150, y Richter et al., 1994,
Tetrahedron Letters (35 (27): 4705-4706).
Ambas resinas de cloruro de 2-clorotritilo y ácido
4-hidroximetil-3-metoxifenoxibutírico
pueden comprarse de Calbiochem-Novabiochem Corp.,
San Diego, CA.
Se describen aquí procedimientos generales para
producción y carga de resinas que pueden utilizarse en síntesis de
péptidos en fase sólida. La carga de resina puede realizarse, por
ejemplo, mediante las siguientes técnicas: La resina,
preferiblemente una resina supersensible a ácidos tal como resina de
2-clorotritilo, se carga a la cámara de reacción. Se
lava la resina con un disolvente clorado tal como diclorometano
(DCM). Se drena el lecho y se añade una solución de 1,5 equivalentes
de un aminoácido y 2,7 equivalentes de diisopropiletilamina (DIEA)
en aproximadamente 8-10 volúmenes de dicloroetano
(DCE). El término N del aminoácido debe protegerse, preferiblemente
con Fmoc, y la cadena secundaria del aminoácido debe protegerse
cuando sea necesario o apropiado. Se agita la mezcla con burbujeo de
nitrógeno durante 2 horas.
Debe señalarse que se requiere un disolvente
clorado para una hinchazón adecuada de la resina de
2-clorotritilo. Aunque DCE proporciona una eficacia
de carga mayor según fuentes bibliográficas, puede sustituirse por
DCM con poca o nula reducción en la carga.
Después de agitar, el lecho se drena y lava con
DCM. Los lugares activos de la resina se coronan en su extremo con
una solución de MeOH:DIEA 9:1 durante aproximadamente
20-30 minutos. El lecho se drena, se lava 4x con DCM
y se seca con una purga de nitrógeno para dar la resina cargada.
Fmoc es el grupo protector preferido para el
término N del aminoácido. Dependiendo de qué aminoácido se cargue,
su cadena secundaria puede o no protegerse. Por ejemplo, cuando se
carga Trp, su cadena secundaria debe protegerse con Boc. De modo
similar, la cadena secundaria de Gln puede protegerse con trt. Sin
embargo, cuando se carga Gln en la preparación para la síntesis del
fragmento de péptido 1-16, su cadena secundaria
no debe protegerse. No es necesario proteger la cadena
secundaria de Leu.
Los aminoácidos protegidos con FMOC usados en la
carga de la resina y en la síntesis de péptidos están disponibles,
con o sin grupos protectores de cadenas secundarias según se
requiera, de Sean o Genzyme. Como alternativa al procedimiento
anterior, la resina puede comprarse ya cargada con el aminoácido
apropiado.
Los Ejemplos presentados en la siguiente Sección
6 describen ejemplos de preparaciones de resinas.
Las técnicas de síntesis de péptidos en fase
sólida pueden realizarse como, por ejemplo, según las siguientes
técnicas: Se añade la resina cargada a la cámara de reacción y se
acondiciona con un disolvente, preferiblemente cloruro de metileno
(DCM; en preferiblemente alrededor de 10 volúmenes) con agitación
con nitrógeno durante aproximadamente 15 minutos para hinchar las
perlas de resina. Se requiere DCM para una hinchazón adecuada de la
resina de 2-clorotritilo. El volumen de resina será
doble o triple en la cámara de reacción a medida que se hinchan las
perlas y los lugares activos desplegados y hechos accesibles a
reacción. Después de hinchar la resina, se drena el disolvente de la
cámara de reacción.
La separación del grupo protector Fmoc
(9-fluoroenil-metiloxicarbonilo) de
la amina terminal o la resina se consigue tratando la resina con 2
partes alícuotas de una solución al 20% de piperidina en
N-metil-2-pirrolidinona
(NMP) durante aproximadamente diez minutos cada una. El volumen de
la solución al 20% de piperidina en NMP requerido para cada parte
alícuota dependerá de la escala de la reacción en curso. Se lava
después la resina 5-7 veces con partes alícuotas de
NMP (aproximadamente 10 vol.) hasta separar los subproductos de Fmoc
(es decir, dibenzofulveno y su aducto de piperidina) y piperidina
residual.
Puede usarse un ensayo de cloranilo para
determinar si la separación de subproductos de Fmoc y piperidina
residual es completa. La solución de ensayo de cloranilo se prepara
añadiendo una gota de una solución saturada de cloranilo en tolueno
a aproximadamente 1 ml de acetona. Los lavados de NMP pueden
ensayarse añadiendo una gota del lavado a la solución de ensayo de
cloranilo. Un color azul o violeta es una indicación positiva de la
presencia de amina secundaria, indicando que los subproductos de
Fmoc y/o piperidina residual están aún presentes. El lavado de NMP
se repite hasta que no se observa más el color azul o violeta.
Entre tanto, se activa para reacción en su
término carboxi el aminoácido subsiguiente de la secuencia a añadir
a la resina. El término amino de cada aminoácido debe protegerse con
Fmoc. Dependiendo de que aminoácido se añada, su cadena secundaria
puede o no ser protegida. Preferiblemente, las cadenas secundarias
de tyr(Y), The(T), Ser(S) y Asp(P) se
protegen con t-Bu, las cadenas secundarias de
His(H), Gln(Q) y Asn(N) se protegen con trt y
las cadenas secundarias de Lys(K) y Trp(W) se protegen
con Boc. No obstante, como se ha comentado antes, la cadena
secundaria de His debe protegerse. Además, se prefiere no
proteger la cadena secundaria del residuo de Gln en el extremo
carboxi-terminal de los fragmentos
1-16 y 9-16. No es necesario
proteger las cadenas secundarias de Len o Ile.
El aminoácido se activa como sigue. El aminoácido
protegido con Fmoc (1,5 eq.), 1-hidroxibenzotriazol
hidrato (HOBT) (1,5 eq.) y diisopropil-etilamina
(DIEA) (1,5 eq.) se disuelven en NMP (aproximadamente 7,5 vol.) a
temperatura ambiente. Se enfría la solución a 0-5ºC
y se añade después hexafluorofosfato de
O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio
(HBTU) (1,5 eq.) seguido por agitación durante 5-15
minutos para disolver. Es importante que la activación se realice a
baja temperatura para minimizar la racemización del aminoácido. El
HBTU es el último reactivo añadido a la solución fría porque la
activación y racemización no pueden tener lugar en su ausencia.
La solución del aminoácido activado se carga a la
resina drenada, lavando con DCM (aproximadamente 2,5 vol.). Nótese
que la activación del aminoácido se realiza en NMP debido a la
insolubilidad de HBTU en DCM. Sin embargo, se añade a la reacción en
este punto DCM para mantener una hinchazón adecuada de las perlas de
resina. Se agita la reacción con burbujeo de N_{2} durante
aproximadamente 1 hora. Puede vigilarse que se completa el
acoplamiento con un ensayo de ninhidrina cualitativo como se
describe después.
Para comprobar que se ha completado la reacción
usando el ensayo de ninhidrina cualitativo, se retira una muestra de
2-20 mg de la resina y se limpia lavando con
metanol. Se añaden a la muestra 3 gotas de una solución de fenol al
76% en etanol, 4 o 5 gotas de un solución de KCN 0,2 mM en piridina
y 3 gotas de una solución 0,28 M de ninhidrina en etanol. Se diluye
la muestra con etanol hasta un volumen de aproximadamente 0,5 ml y
se pone en un bloque de calor a aproximadamente 75ºC durante
5-10 minutos. Un color azul o violeta es una
indicación positiva de la presencia de aminas libres, indicando que
la reacción no se ha completado aún. Puede diluirse adicionalmente
la muestra hasta un volumen de aproximadamente 3 ml para estimar más
fácilmente el grado de cambio de color en la muestra
concentrada.
Si se observa un ensayo de ninhidrina positivo
después de una hora, se continúa la reacción de acoplamiento durante
una hora más. Si el ensayo de ninhidrina positivo persiste después
de 2 horas, se drena la resina, se lava tres veces en
aproximadamente 10 volúmenes de NMP y se repite la reacción de
acoplamiento usando 1 equivalente de aminoácido activado.
Si ha de guardarse la resina durante la noche
entre ciclos de acoplamiento, el lecho de resina puede drenarse y
cubrirse con DCM bajo atmósfera de nitrógeno. Alternativamente, el
lecho puede drenarse, guardarse bajo atmósfera de nitrógeno y
acondicionarse después con un lavado con DCM antes de proceder con
el siguiente ciclo de acoplamiento. Si el fragmento completado ha de
guardarse durante la noche antes de división, el lecho de resina
debe lavarse con DCM eliminando NMP porque puede tener lugar una
desprotección de Fmoc significativa en NMP.
Después de juzgarse completo el acoplamiento, la
resina se drena y lava con 3 partes alícuotas (aproximadamente 10
vol.) de NMP. Se repite el ciclo durante meros subsiguientes del
fragmento de péptido. Tras la reacción de acoplamiento final, se
lava la resina con 4 partes alícuotas (aproximadamente 10 vol.) de
NMP y después con 4 partes alícuotas (aproximadamente 10 vol.) de
DCM. El péptido unido a resina puede secarse con una purga de
nitrógeno.
Los péptidos sintetizados mediante técnicas de
síntesis en fase sólida pueden dividirse y aislarse según, por
ejemplo, las siguientes técnicas: El péptido puede dividirse de la
resina usando técnicas muy conocidas por los expertos en la técnica.
Por ejemplo, pueden usarse soluciones de ácido trifluoroacético
(TFA) al 1% o 2% en DCM o una combinación de una solución al 1% y
una al 2% de TFA en DCM para dividir el péptido. Puede usarse
también para dividir el péptido ácido acético (HOAc). El reactivo de
división específico, los disolventes y el tiempo requerido para la
división dependerán del péptido particular a dividir. Después de la
división, las fracciones de división se someten a procedimientos de
elaboración estándares para aislar el péptido. Típicamente, las
fracciones de división combinadas se concentran bajo vacío, seguido
por reconstitución con un disolvente tal como etanol, metanol o
heptano. En general, el péptido se precipita por adición de agua y
se recoge por filtración bajo vacío. Alternativamente, el producto
puede triturarse antes del aislamiento del péptido.
Los Ejemplos presentados en las siguientes
Secciones 7.1-7.6 presentan síntesis en fase sólida
de intermedios de péptidos como se muestra en las Tablas 1, 2 y/o
3.
Para la síntesis de péptidos T-20
de longitud completa, pueden acoplarse entre sí los intermedios de
péptidos de la anterior Tabla 1 para producir el péptido
T-20. Por ejemplo, los grupos de intermedios de
péptidos listados en la anterior Tabla 2 pueden acoplarse entre sí
para producir péptido T-20 de longitud completa. Se
presentan ejemplos representativos de tales síntesis de
T-20 de longitud completa a partir de fragmentos de
péptidos intermedios en la siguiente Sección 9, y se representan
esquemáticamente en las Figs. 1-5.
En ciertas realizaciones, puede seguirse un
método de cuatro fragmentos para la síntesis de
T-20. Una síntesis de "método de cuatro
fragmentos" se refiere a un esquema de síntesis de
T-20 que comienza con cuatro fragmentos de péptidos
intermedios de T-20 que se sintetizan y acoplan
usando técnicas de síntesis en fase sólida y líquida en un péptido
T-20 de longitud completa. Los grupos de fragmentos
de péptidos intermedios 5, 6, 8, 9 y 12-15 mostrados
en la anterior Tabla 2 representan grupos preferidos. Las Figs. 1 y
2 representan dos métodos de cuatro fragmentos que utilizan el Grupo
6 de intermedios de péptidos de la Tabla 2 para sintetizar
T-20 de longitud completa. Para este grupo, se
señala que el residuo de aminoácido 36 (el residuo de aminoácido
carboxi 1-terminal de T-20) se
introduce individualmente durante el procedimiento de acoplamiento
del fragmento. La culminación del esquema de síntesis de
T-20 mostrado en la Fig. 1 se demuestra en el
ejemplo presentado en la Sección 9.1.
Además pueden seguirse realizaciones de un método
de tres fragmentos para la síntesis de T-20. Una
síntesis de "método de tres fragmentos" se refiere a un esquema
de síntesis de T-20 que comienza con tres fragmentos
de péptidos intermedios de T-20 que se sintetizan y
acoplan usando técnicas de síntesis en fase sólida y líquida en un
péptido T-20 de longitud completa. Los grupos de
fragmentos de péptidos intermedios 2-4, 7, 10 y 11
mostrados en la anterior Tabla 2 representan grupos de tres
fragmentos preferidos. Las Figs. 3 y 4 representan dos métodos de
tres fragmentos que utilizan el Grupo 3 de intermedios de péptidos
de la Tabla 2 para sintetizar T-20 de longitud
completa. Para este grupo, se señala que el residuo de aminoácido 36
(el residuo de aminoácido carboxi-terminal de
T-20) se introduce individualmente durante el
procedimiento de acoplamiento del fragmento. La culminación del
esquema de síntesis de T-20 mostrado en la Fig. 3 se
demuestra en el ejemplo presentado en la posterior Sección 9.1. La
culminación del esquema de síntesis de T-20 mostrado
en la Fig: 4 se demuestra en los ejemplos presentados en las
posteriores Secciones 9.2-9.5.
En realizaciones adicionales, puede seguirse un
método de dos fragmentos para la síntesis de T-20.
Una síntesis de "método de dos fragmentos" se refiere a un
esquema de síntesis de T-20 que comienza con dos
fragmentos de péptidos intermedios de T-20 que se
sintetizan y acoplan usando técnicas de síntesis en fase sólida y
líquida en un péptido T-20 de longitud completa. Los
grupos de fragmentos intermedios 1 y 16-20 mostrados
en la anterior Tabla 2 representan grupos de dos fragmentos
preferidos. La Fig. 5 representa un método de dos fragmentos que
utilizan el Grupo 20 de intermedios de péptidos de la Tabla 2 para
sintetizar T-20 de longitud completa. Para este
grupo, se señala que el residuo de aminoácido (el residuo de
aminoácido carboxi-terminal de T-20)
se introduce individualmente durante el procedimiento de
acoplamiento del fragmento.
Pueden utilizarse técnicas de síntesis de
péptidos en fase solución muy conocidas por los expertos en la
técnica para la síntesis de los fragmentos intermedios de péptidos
de la invención. Los ejemplos presentados en las Secciones
8.1-8.11 describen ejemplos de síntesis de péptidos
en fase solución de intermedios de péptidos listados en las Tablas
1, 2 y/o 3. Por ejemplo, entre el relleno de columna no cargada con
sílice que presenta un amplio intervalo de pH que incluye valores de
pH mayores que esos, están los vendidos por Tosohaus
(Montgomeryville, PA).
Se describen aquí, en las Secciones
6.1-6.3, ejemplos en los que se sintetizan resinas
de clorotritilo que pueden utilizarse conjuntamente con síntesis en
fase sólida de los péptidos e intermedios de péptidos descritos
aquí.
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| Resina de cloruro de 2-clorotritilo | - - | 1,0 | 25 | 25 | - - |
| Fmoc-Trp(Boc)-OH | - - | 526,60 | 1,5 | 37,5 | 19,7 |
| Diisopropiletilamina (DIEA) | 129,95 | 1,7 | 42,5 | 5,5 | 7,4 |
| Dicloroetano (DCE) | - - | - - | - - | - - | 250 |
| Diclorometano (DCM) | - - | - - | - - | - - | 6 X 250 |
| Metanol:DIEA 9:1 | - - | - - | - - | - - | 200 |
La resina de cloruro de
2-clorotritilo (25 g, 1 eq.) se cargó en una cámara
de péptidos de 500 ml y se lavó con 250 ml de DCM. Se drenó el lecho
y se añadió una solución del
Fmoc-Trp(Boc)-OH (1,5 eq.) y
la DIEA (1,7 eq.) en 10 volúmenes de DCE. Se agitó la mezcla con
burbujeo de nitrógeno durante 2 horas.
Se drenó el lecho y se lavó con 250 ml de DCM.
Los lugares activos en la resina se coronaron en su extremo con 200
ml de una solución de MeOH:DIEA 9:1 durante 20 minutos. El lecho se
drenó, se lavó con 4 x 250 ml de DCM y se secó con una purga de
nitrógeno para dar 34,3 g de resina cargada.
Se realizó un análisis de HPLC cuantitativo
dividiendo el Fmoc-aminoácido de la resina y
ensayando frente a un patrón. El ensayo de HPLC del material mostró
una carga de la resina de 0,68 mmoles/g.
- Columna: Phenomenox Jupiter C18; 300 \ring{A}; 5 \mu
- Caudal: 1 ml/min
- Detección: UV a 260 nm
| Fase móvil: | A: TFA acuoso al 0,1% | |
| B: TFA al 0,1% en acetonitrilo | ||
| 65% de B isocrático |
- Tiempo de retención: \sim 14 minutos
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| Resina de cloruro de 2-clorotritilo | - - | 1,0 | 25 | 25 | - - |
| FmocGlnOH | 368,39 | 1,5 | 37,5 | 13,8 | - - |
| Diisopropiletilamina (DIEA) | 129,25 | 1,7 | 42,5 | 5,5 | 7,4 |
| Dicloroetano (DCE) | - - | - - | - - | - - | 75 |
| N,N-dimetilformamida (DMF) | - - | - - | - - | - - | 200 |
| Diclorometano (DCM) | - - | - - | - - | - - | 6 X 250 |
| Metanol:DIEA 9:1 | - - | - - | - - | - - | 200 |
Se repitió el procedimiento usado en el Ejemplo
presentado en la anterior 6.1, usando una solución de FmocGlnOH (1,5
eq.) y DIEA (1,7 eq.) en una mezcla de 75 ml de DCE y 200 ml de DMF.
La adición de DMF estabiliza el FmocGlnOH. La reacción produjo 33,8
g de resina cargada. Se supuso una carga teórica de la resina de
0,74 mmoles/g y se adelantó el material.
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| Resina de cloruro de 2-clorotritilo | - - | 1,0 | 250 | 250 | - - |
| FmocLeuOH | 353,42 | 1,5 | 375 | 132,5 | - - |
| Diisopropiletilamina (DIEA) | 129,95 | 1,7 | 425 | 55 | 75 |
| Dicloroetano (DCE) | - - | - - | - - | - - | 2000 |
| Diclorometano (DCM) | - - | - - | - - | - - | 6 X 1500 |
| Metanol:DIEA 9:1 | - - | - - | - - | - - | 1500 |
Se cargó la resina en una cámara de péptidos de 3
l y se lavó con 1,5 l de DCM. Se drenó el lecho y se añadió una
solución del FmocLeuOH (1,5 eq.) y la DIEA (1,7 eq.) en 8 volúmenes
de DCE. Se agitó la mezcla con burbujeo de nitrógeno durante 2
horas.
Se drenó el lecho y se lavó con 1,5 l de DCM. Los
lugares activos en la resina se coronaron en su extremo con 1,5 l de
una solución de MeOH:DIEA 9:1 durante 30 minutos. El lecho se drenó,
se lavó con 4 x 1,5 l de DCM y se secó con una purga de nitrógeno
para dar 345 g de resina cargada.
Se realizó un análisis de HPLC cuantitativo
dividiendo el Fmoc-aminoácido de la resina y
ensayando frente a un patrón. El ensayo de HPLC del material mostró
una carga de la resina de 0,72 mmoles/g.
- Columna: Phenomenox Jupiter C18; 300 \ring{A}; 5 \mu
- Caudal: 1 ml/min
- Detección: UV a 260 nm
| Fase móvil: | A: TFA acuoso al 0,1% | |
| B: TFA al 0,1% en acetonitrilo | ||
| 65% de B isocrático |
- Tiempo de retención: \sim 8 minutos
Se presentan seguidamente en las Secciones
7.1-7.6 ejemplos de síntesis de intermedios de
péptidos en fase sólida como se lista en las Tablas 1, 2 y/o 3.
- Fmoc-Tyr(tBu)-Thr-(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-OH (SEQ ID NO: 2)
C_{93}H_{121}N_{10}O_{15}
P.M.
1619,06
\vskip1.000000\baselineskip
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| Fmoc-Leu-resina de 2-clorotritilo | - - | 1,0 | 15,6 | 20,0 | - - |
| Fmoc-aminoácido* | - - | 1,5 | 23,4 | - - | - - |
| 1-Hidroxibenzotriazol (HOBT) hidrato* | 153.15 | 1,5 | 23,4 | 3,6 | - - |
| Hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1- | |||||
| il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU)* | 379,25 | 1,5 | 23,4 | 8,9 | - - |
| Diisopropiletilamina (DIEA)* | 129,25 | 1,5 | 23,4 | 3,0 | 4,1 |
| N-metil-2-pirrolidinona (NMP)* | - - | - - | - - | - - | 150 |
| Cloruro de metileno (DCM)* | - - | - - | - - | - - | 50 |
| Piperidina al 20%/NMP* | - - | - - | - - | - - | 2 x 200 |
(Continuación)
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| NMP para enjuague* | - - | - - | - - | - - | 200 |
| (por lavado) | |||||
| Ácido trifluoroacético (TFA) al 1% en | - - | - - | - - | - - | 300 |
| DCM | |||||
| TFA al 0,5%/DCM | - - | - - | - - | - - | 200 |
| Piridina | - - | - - | - - | - - | |
| Alcohol etílico | - - | - - | - - | - - | 110 |
| Agua | - - | - - | - - | - - | 200 + 100 |
| *por ciclo de acoplamiento |
| Rendimiento teórico: 25,3 g | Rendimiento esperado: 80-90% |
| Rendimiento real: 20,0 g |
Se cargaron 20,0 g de
Fmoc-Leu-resina de
2-clorotritilo en una cámara de reacción de péptidos
de 1 l. Se acondicionó la resina en 200 ml (\sim10 vol.) de DCM
con agitación de nitrógeno durante aproximadamente 15 minutos para
hinchar las perlas y se drenó después.
Se consiguió la separación de Fmoc
(9-fluorofenilmetiloxicarbonilo) de la amina
terminal usando 2 x 200 ml de una solución al 20% de piperidina en
NMP durante 10 minutos cada uno. Se lavó después la resina
5-7 veces con 200 ml (\sim10 vol.) de NMP para
separar subproductos de Fmoc (dibenzofulveno y su aducto de
piperidina) y piperidina residual, determinado por un ensayo de
cloranilo negativo.
Entre tanto, se activó para reacción en el
término carboxilo Fmoc-Ser (tBu), el subsiguiente
aminoácido en la secuencia. El aminoácido protegido con Fmoc (1,5
eq.), el HOBT (1,5 eq.) y la DIEA (1,5 eq.) se disolvieron en 150 ml
(\sim7,5 vol.) de NMP a temperatura ambiente. Se enfrió la
solución a 0-5ºC, se añadió después el HBTU (1,5
eq.) y se agitó 5-15 minutos para disolver. La
solución de ácido activado se cargó a la resina drenada, lavando con
50 ml de DCM (\sim2,5 vol.). Se agitó la reacción con burbujeo de
N_{2} durante 1 hora. Se comprobó la terminación del acoplamiento
con el ensayo de ninhidrina cualitativo. Después de juzgar completa
la reacción de acoplamiento, se drenó la resina y se lavó con 3 x
200 ml (1 vol.) de NMP.
Se repitió el ciclo durante meros subsiguientes
del fragmento protegido usando 1,5 equivalentes cada uno de
aminoácidos protegidos con Fmoc His(trt), Ile, Leu,
Ser(tBu), Thr(tBu) y Tyr(tBu). Tras la reacción
de acoplamiento final, se lavó la resina con 4 x 200 ml (10 vol.) de
NMP y después con 4 x 200 ml (10 vol.) de DCM. Se secó la resina con
una purga de nitrógeno para dar 42 g de péptido unido a resina.
Se dividió el péptido a partir de una cantidad de
21 g de la resina usando 300 ml de TFA al 1% en DCM durante
aproximadamente 2 minutos, seguido por 200 ml de TFA al 0,5% en DCM.
Las fracciones de la división se recogieron en piridina (relación en
volumen 1:1 a TFA). Los lavados de la división se combinaron y
concentraron bajo vacío hasta un volumen de \sim50 ml, y se
reconstituyeron después con 110 ml de etanol mientras se continuó la
concentración para separar DCM residual hasta un volumen final de
\sim250 ml. Se precipitó el producto con la adición de 200 ml de
agua. La suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 30
minutos. Se recogieron los sólidos por filtración bajo vacío y se
lavaron con \sim100 ml de agua. El producto se secó al aire para
dar 20,0 g (79%) de
Fmoc-AA(1-8)-OH
del 95% de pureza por HPLC.
- Columna: Phenomenox Jupiter C18
- Caudal: 1 ml/min
- Detección: UV a 260 nm
| Fase móvil: | A: TFA acuoso al 0,1% | |
| B: TFA al 0,1% en gradiente de acetonitrilo de 80% de B a 99% de B en 20 minutos |
- Tiempo de retención: aproximadamente 23 minutos
- Fmoc-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-OH (SEQ ID NO: 6)
C_{127}H_{129}N_{10}O_{15}
P.M.
1963,39
\vskip1.000000\baselineskip
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| Fmoc-Gln(trt)-resina de 2-clorotritilo | - - | 1,0 | 12,0 | 20,0 | - - |
| Fmoc-aminoácido* | - - | 1,5 | 18,0 | - - | - - |
| 1-Hidroxibenzotriazol (HOBT) hidrato* | 153,15 | 1,5 | 18,0 | 2,8 | - - |
| Hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1- | |||||
| il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU)* | 379,25 | 1,5 | 18,0 | 6,8 | - - |
| Diisopropiletilamina (DIEA)* | 129,25 | 1,5 | 18,0 | 2,3 | 3,1 |
| N-metil-2-pirrolidinona (NMP)* | - - | - - | - - | - - | 150 |
| Cloruro de metileno (DCM)* | - - | - - | - - | - - | 50 |
| Piperidina al 20%/NMP* | - - | - - | - - | - - | 2 x 200 |
| NMP para enjuague* | - - | - - | - - | - - | 200 |
| (por lavado) | |||||
| DCM para división | - - | - - | - - | - - | 160 |
| Ácido acético (HOAc) | - - | - - | - - | 20 | |
| Trifluoroetanol | - - | - - | - - | - - | 20 |
| Heptano | - - | - - | - - | - - | 250 + 250 + 100 |
| Metil t-butiléter | - - | - - | - - | - - | 100 |
| Isopropanol | - - | - - | - - | - - | 60 |
| Agua | - - | - - | - - | - - | 60 + 50 |
| *por ciclo de acoplamiento |
| Rendimiento teórico: 23,6 g | Rendimiento esperado: 89-95% |
| Rendimiento real: 21,1 g |
Se repitió el procedimiento usado en el Ejemplo
presentado en la Sección 7.1 anterior usando 20,0 g de
Fmoc-Gln(trt)-resina de
2-clorotritilo y los aminoácidos protegidos con Fmoc
Asn(trt), Gln(trt), Ser(tBu), Glu(tbu),
Glu(tBu) e Ile.
Tras la reacción de acoplamiento final, se lavó
la resina con 4 x 200 ml (10 vol.) de NMP y después con 4 x 200 ml
(10 vol.) de DCM.
El péptido se dividió de la resina usando 200 ml
de DCM:TFE:HOAc 8:1:1 durante 2 horas, seguido por 2 x 100 ml de
lavados de DCM. Los eluyentes combinados se concentraron bajo vacío
hasta un volumen de \sim100 ml y se reconstituyeron después con
250 ml de heptano mientras se continuaba la concentración para
separar DCM residual hasta un volumen final de \sim250 ml. La capa
de heptano se separó de la mezcla bifásica que se formó. El producto
se precipitó con adición de 250 ml de heptano y 100 ml de MTBE, y se
trituró después durante la noche a temperatura ambiente para dar
material de la consistencia deseada. Se recogieron los sólidos por
filtración bajo vacío y se lavaron con aproximadamente 100 ml de
heptano. El producto se reelaboró para separar ácido acético
residual. Los sólidos filtrados se disolvieron en 60 ml de
isopropanol a 50ºC. Se enfrió la solución en un baño de hielo a
0-5ºC y se añadieron después 60 ml de agua con un
régimen gota a gota rápido. La suspensión de producto se trituró con
agitación durante \sim1 hora en el baño de hielo. Los sólidos se
aislaron por filtración bajo vacío y se lavaron con \sim50 ml de
agua. Se secó al aire el producto para dar 21,1 g (90%) de
Fmoc-AA(9-15)-OH
del 95% de pureza por HPLC.
- Columna: Phenomenox Jupiter C18
- Caudal: 1 ml/min
- Detección: UV a 260 nm
\newpage
| Fase móvil: | A: TFA acuoso al 0,1% | |
| B: TFA al 0,1% en gradiente de acetonitrilo de 80% de B a 99% de B en 20 minutos |
- Tiempo de retención: \sim23 minutos
- Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OH (SEQ ID NO: 4)
C_{199}H_{245}N_{22}O_{32}
P.M.
3457,30
\vskip1.000000\baselineskip
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| Fmoc-Gln-resina de 2-clorotritilo | - - | 1,0 | 24,1 | 32,5 | - - |
| Fmoc-aminoácido* | - - | 1,5 | 36,2 | - - | - - |
| 1-Hidroxibenzotriazol (HOBT) hidrato* | 153,15 | 1,5 | 36,2 | 5,5 | - - |
| Hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1- | |||||
| il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU)* | 379,25 | 1,5 | 36,2 | 13,7 | - - |
| Diisopropiletilamina (DIEA)* | 129,25 | 1,5 | 36,2 | 4,7 | 6,3 |
| N-metil-2-pirrolidinona (NMP)* | - - | - - | - - | - - | 200 |
| Cloruro de metileno (DCM)* | - - | - - | - - | - - | 75 |
| Piperidina al 20%/NMP* | - - | - - | - - | - - | 2 x 250 |
| NMP para enjuague* | - - | - - | - - | - - | 250 |
| (por lavado) | |||||
| Ácido trifluoroacético al 1%/DCM | - - | - - | - - | - - | 4 x 50 |
| Piridina | 79,10 | - - | - - | 4 x 0,5 | |
| Heptano | - - | - - | - - | - - | 150 + 50 |
| Metanol | - - | - - | - - | - - | 50 |
| Agua | - - | - - | - - | - - | 50 + 25 |
| *por ciclo de acoplamiento |
| Rendimiento teórico: 48,9 g | Rendimiento esperado: 85-90% |
Se repitió el procedimiento usado en el Ejemplo
presentado en la Sección 7.1 anterior usando 32,5 g de
Fmoc-Gln-resina de
2-clorotritilo y los aminoácidos requeridos
protegidos con Fmoc. Se efectuó la reacción como se ha descrito en
el Ejemplo presentado en la anterior Sección 6.1, excepto que se
usaron volúmenes de disolventes ligeramente diferentes como se
indica en la sección Materiales anterior.
Tras la reacción de acoplamiento final, se lavó
la resina con 4 x 250 ml (8 vol.) de NMP y después con 4 x 250 ml (8
vol.) de DCM. Se secó la resina bajo una purga de nitrógeno para dar
97,4 g de péptido unido.
A escala de 17,7 g, se dividió de la resina el
péptido unido a resina usando 2 x 190 ml de TFA al 1% en DCM durante
1-2 minutos, seguido por 1 x 120 ml con DCM. Las
fracciones de división se recogieron en piridina (relación en
volumen 1:1 a TFA). Las fracciones y el lavado se combinaron y
concentraron bajo vacío hasta un volumen de \sim50 ml y se
reconstituyeron después con 200 ml de metanol. Se continuó la
concentración para separar DCM residual hasta un volumen final de
\sim50 ml. Se precipitó el producto con adición de 250 ml de agua
y se agitó a temperatura ambiente durante \sim30 minutos. Los
sólidos se recogieron por filtración bajo vacío y se lavaron con
\sim50 ml de agua. El producto se secó al aire para dar 12,8 g
(84%). Se reelaboró el producto para separar sales de piridinio. Los
sólidos filtrados se disolvieron en 150 ml de metanol a temperatura
ambiente. La adición de 200 ml de agua a temperatura ambiente
precipitó el producto. El producto se aisló por filtración bajo
vacío y se lavó con aproximadamente 50 ml de agua. El material se
secó al aire para dar 12,8 g (84%) de
Fmoc-AA(1-16)-OH.
- Columna: Phenomenox Jupiter C18
- Caudal: 1 ml/min
- Detección: UV a 260 nm
| Fase móvil: | A: TFA acuoso al 0,1% | |
| B: TFA al 0,1% en gradiente de acetonitrilo de 75% de B a 99% de B en 20 minutos |
- Tiempo de retención: \sim25 minutos
- Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OH (SEQ ID NO: 4)
C_{156}H_{237}N_{22}O_{31}
P.M.
3274,76
\vskip1.000000\baselineskip
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| Fmoc-Gln-resina de 2-clorotritilo | - - | 1,0 | 24,1 | 32,5 | - - |
| Fmoc-aminoácido* | - - | 1,5 | 36,2 | - - | - - |
| 1-Hidroxibenzotriazol (HOBT) hidrato* | 153,15 | 1,5 | 36,2 | 5,5 | - - |
| Hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1- | |||||
| il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU)* | 379,25 | 1,5 | 36,2 | 13,7 | - - |
| Diisopropiletilamina (DIEA)* | 129,25 | 1,5 | 36,2 | 4,7 | 6,3 |
| N-metil-2-pirrolidinona (NMP)* | - - | - - | - - | - - | 200 |
| Cloruro de metileno (DCM)* | - - | - - | - - | - - | 75 |
| Piperidina al 20%/NMP* | - - | - - | - - | - - | 2 x 250 |
| NMP para enjuague* | - - | - - | - - | - - | 250 |
| (por lavado) | |||||
| Ácido trifluoroacético al 1%/DCM | - - | - - | - - | - - | 4 x 50 |
| Piridina | 79,10 | - - | - - | 4 x 0,5 | |
| Heptano | - - | - - | - - | - - | 150 + 50 |
| Metanol | - - | - - | - - | - - | 50 |
| Agua | - - | - - | - - | - - | 50 + 25 |
| *por ciclo de acoplamiento |
| Rendimiento teórico: 48,9 g | Rendimiento esperado: 85-90% |
Se repitió el procedimiento usado en el Ejemplo
presentado en la Sección 7.1 anterior usando 32,5 g de
Fmoc-Gln-resina de
2-clorotritilo y los aminoácidos requeridos
protegidos con Fmoc y los volúmenes de disolventes indicados en la
sección Materiales anterior.
Tras la reacción de acoplamiento final, se lavó
la resina con 4 x 250 ml (8 vol.) de NMP y después con 4 x 250 ml (8
vol.) de DCM. Se secó la resina bajo una purga de nitrógeno para dar
97,4 g de péptido unido.
A escala de 10 g, se acetiló el péptido unido a
resina con anhídrodo acético y piridina (5 eq. cada uno) en 100 ml
de NMP:DCM 3:1 durante 30 minutos, y se lavó después con 2 x 25 ml
de DCM. Se dividió el péptido de la resina usando 3 x 50 ml de TFA
al 1% en DCM, seguido por 2 x 50 ml lavados de DCM. Las fracciones
de división se recogieron en piridina (relación en volumen 1:1 a
TFA). Las fracciones y el lavado se combinaron y concentraron bajo
vacío hasta un volumen de aproximadamente 100 ml y se
reconstituyeron después con 3 x 50 ml de heptano añadido por
porciones mientras se continuó la concentración para separar DCM
residual hasta un volumen final de \sim150 ml. Se precipitó el
producto inicialmente con una consistencia algo pegajosa, pero se
trituró con agitación durante \sim30 minutos en un baño de hielo a
0-5ºC hasta un sólido filtrable. Los sólidos se
recogieron por filtración bajo vacío y se lavaron con \sim50 ml de
heptano. El producto se reelaboró para separar sales de piridinio.
Los sólidos filtrados se disolvieron en 50 ml de metanol a
temperatura ambiente. Se enfrió la solución en un baño de hielo a
0-5ºC y se añadieron después 50 ml de agua con un
régimen gota a gota rápido. Se precipitó el material inicialmente
como un sólido pegajoso, que se trituró hasta una consistencia
filtrable con agitación durante \sim1 hora en el baño de hielo. El
producto se aisló por filtración bajo vacío y se lavó con \sim25
ml de agua. El producto se secó al aire para dar 7,0 g (90%) de
AcAA(1-16)-OH. Se reelaboró
el producto a continuación como se ha descrito antes para dar 6,2 g
(recuperación del 89%) de material del 96% v de pureza por HPLC.
- Columna: Zorbax LP C8, 100 \ring{A}, 20 \mu
- Caudal: 1 ml/min
- Detección: UV a 220 nm
| Fase móvil: | A: TFA acuoso al 0,1% | |
| B: ACN:IPA 1:1 con gradiente de TFA al 0,05% del 80% de B al 99% de B en 20 | ||
| \; \; minutos |
- Tiempo de retención: \sim15 minutos
- Fmoc-Glu(tBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(tBu)-Gln(trt)-Glu(tBu)-Leu-Leu-Glu(tBu)-Leu-OH (SEQ ID NO: 11)
C_{127}N_{167}N_{13}O_{25}
P.M.
2275,82
\vskip1.000000\baselineskip
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| Fmoc-Gln-resina de 2-clorotritilo | - - | 1,0 | 19,5 | 25,0 | - - |
| Fmoc-aminoácido* | - - | 1,5 | 30,0 | - - | - - |
| 1-Hidroxibenzotriazol (HOBT) hidrato* | 153,15 | 1,5 | 30,0 | 4,6 | - - |
| Hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1- | |||||
| il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU)* | 379,25 | 1,5 | 30,0 | 11,4 | - - |
| Diisopropiletilamina (DIEA)* | 129,25 | 1,5 | 30,0 | 3,9 | 5,2 |
| N-metil-2-pirrolidinona (NMP)* | - - | - - | - - | - - | 200 |
| Cloruro de metileno (DCM)* | - - | - - | - - | - - | 75 |
| Piperidina al 20%/NMP* | - - | - - | - - | - - | 2 x 250 |
| NMP para enjuague* | - - | - - | - - | - - | 250 |
| (por lavado) | |||||
| Ácido trifluoroacético al 1%/DCM | - - | - - | - - | - - | 3 x 400 |
| Piridina | 79,10 | - - | 150 | - - | 3 x 4 |
| Etanol, desnaturalizado | - - | - - | - - | - - | 300 |
| Agua | - - | - - | - - | - - | 300 |
| *por ciclo de acoplamiento |
| Rendimiento teórico: 44,4 g | Rendimiento esperado: 90-105% |
| Rendimiento real: 46,9 (105%) |
Se repitió el procedimiento usado en el Ejemplo
presentado en la Sección 7.1 anterior usando 25,0 g de
Fmoc-Leu-resina de
2-clorotritilo, los aminoácidos requeridos
protegidos con Fmoc y los volúmenes de disolventes indicados en la
sección Materiales anterior.
Tras la reacción de acoplamiento final, se lavó
la resina con 4 x 250 ml (10 vol.) de NMP y después con 4 x 250 ml
(10 vol.) de DCM.
El péptido se dividió de la resina usando 3 x 400
ml (\sim15 vol.) de TFA al 1% en DCM, seguido por 1 x 200 ml (7,5
vol.) de DCM. Las fracciones de división se recogieron en piridina
(relación en volumen 1:1 a TFA) y después se analizó el contenido de
producto de las fracciones y el lavado. Las fracciones que contenían
producto se combinaron y concentraron bajo vacío hasta un volumen de
\sim100 ml y se reconstituyeron después con 300 ml de etanol. Se
continuó la concentración para separar DCM residual hasta un volumen
final de \sim250 ml. Se añadieron a la solución agitada 300 ml de
agua para precipitar el producto. Los sólidos se recogieron por
filtración bajo vacío y se lavaron con \sim50 ml de agua. El
producto se secó al aire para dar 46,4 g (105%) de
Fmoc-AA(17-26)-OH
del 97% de pureza por HPLC.
- Columna: Phenomenox Jupiter C18
- Caudal: 1 ml/min
- Detección: UV a 260 nm
| Fase móvil: | A: TFA acuoso al 0,1% | |
| B: TFA al 0,1% en gradiente de acetonitrilo de 75% de B a 99% de B en 20 minutos |
- Tiempo de retención: \sim25 minutos
- Fmoc-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-OH (SEQ ID NO: 17)
C_{121}H_{148}N_{14}O_{24}
P.M.
2182,61
\vskip1.000000\baselineskip
| Materiales: | P.M.. | eq | mmoles | gramos | ml |
| Fmoc-Trp(Boc)-resina de 2-clorotritilo | - - | 1,0 | 22,4 | 33,0 | - - |
| Fmoc-aminoácido* | - - | 1,5 | 33,6 | - - | - - |
| 1-Hidroxibenzotriazol (HOBT) hidrato* | 153,15 | 1,5 | 33,6 | 5,1 | - - |
| Hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1- | |||||
| il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU)* | 379,25 | 1,5 | 33,6 | 12,7 | - - |
| Diisopropiletilamina (DIEA)* | 129,25 | 1,5 | 33,6 | 4,3 | 5,8 |
| N-metil-2-pirrolidinona (NMP)* | - - | - - | - - | - - | 225 |
| Cloruro de metileno (DCM)* | - - | - - | - - | - - | 75 |
| Piperidina al 20%/NMP* | - - | - - | - - | - - | 2 x 250 |
| NMP para enjuague* | - - | - - | - - | - - | 250 |
| (por lavado) | |||||
| Trifluoroetanol | - - | - - | - - | - - | 30 |
| DCM para división | - - | - - | - - | - - | 240 |
| Etanol, desnaturalizado | - - | - - | - - | - - | 300,100 |
| Agua | - - | - - | - - | - - | 300,150 |
| Ácido trifluoroacético (TFA) al 1% en | - - | - - | - - | - - | 2 x 250 |
| DCM | |||||
| Piridina | 79,10 | - - | - - | - - | 2 x 2,5 |
| *por ciclo de acoplamiento |
| Rendimiento teórico: 48,9 g | Rendimiento esperado: 85-90% |
Se repitió el procedimiento usado en el Ejemplo
presentado en la Sección 7.1 anterior usando 33,0 g de
Fmoc-Trp(Boc)-resina de
2-clorotritilo, los aminoácidos requeridos
protegidos con Fmoc y los materiales indicados en la sección
Materiales anterior.
Tras la reacción de acoplamiento final, se lavó
la resina con 4 x 250 ml (7,5 vol.) de NMP y después con 4 x 250 ml
(7,5 vol.) de DCM.
El péptido se dividió de la resina por
tratamiento con 300 ml (\sim10 vol.) de una solución de
DCM:TFE:HOAc 8:1:1 durante 2 horas. La resina se drenó y lavó con 2
x 250 ml de DCM. La solución de división y los lavados se combinaron
y concentraron hasta un volumen de \sim50 ml, y se reconstituyeron
después con 250 ml de etanol. Se enfrió la solución con agitación en
un baño de hielo a 0-5ºC. Se añadieron a la solución
agitada 125 ml de agua para precipitar el producto. Los sólidos se
recogieron por filtración bajo vacío y se lavaron con \sim50 ml de
agua. El producto se secó al aire para dar 32,0 g (65,4%) de
Fmoc-AA(27-35)-OH
del 95% de pureza por HPLC.
La resina se trató con 2 x 250 ml de una solución
al 1% de TFA en DCM seguido por un lavado con 100 ml de DCM. Las
fracciones de división se recogieron en piridina en una relación en
volumen 1:1 con TFA. Los eluyentes combinados y el lavado se
concentraron hasta un volumen de \sim50 ml. Se añadieron a la
solución 100 ml de etanol y después 150 ml de agua. La suspensión de
producto se filtró bajo vacío produciendo una segunda cosecha de
10,7 g (21,9%) (pureza del 95% por HPLC) para dar un rendimiento
combinado del 87,3%. Se prefiere la división de TFA al 1%/DCM debido
a su mayor eficacia y menores volúmenes.
- Columna: Phenomenox Jupiter C5, 300 \ring{A}, 5 \mu
- Caudal: 0,75 ml/min
- Detección: UV a 260 nm
| Fase móvil: | A: TFA acuoso al 0,05% | |
| B: TFA al 0,1% en gradiente de IPA:MeOH 1:1 de 70% de | ||
| B a 97% de B en 10 minutos |
- Tiempo de retención: \sim25 minutos
Se presentan a continuación, en las Secciones
8.1-8.11 ejemplos de la síntesis en fase solución de
intermedios de péptidos como se listan en las Tablas 1, 2 y/3.
- Fmoc-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (SEQ ID NO: 7)
C_{129}H_{142}N_{13}O_{22}
P.M.
2227,65
\vskip1.000000\baselineskip
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| FmocAA9-15OH | 1963,39 | 1 | 9,7 | 19 | - - |
| HBrGlnOPNB (BaChem, 50979) | 362,19 | 1,1 | 10,6 | 3,85 | - - |
| HOAT | 136 | 1,1 | 10,6 | 1,45 | - - |
| HBTU | 379,25 | 1,1 | 10,6 | 4,04 | - - |
| EtPr_{3}N (d = 0,755) | 129,25 | 2,1 | 20,3 | 2,62 | 3,48 |
| NMP | - - | - - | - - | - - | 200 |
| HCl 0,5 N | - - | - - | - - | - - | 250 |
| Acetato de etilo | - - | - - | - - | - - | 250 |
| Hexano | - - | - - | - - | - - | 250 |
| Rendimiento teórico: 21,5 g | Rendimiento esperado: 90-105% |
Se combinaron en un matraz de fondo redondo de 1
l que contenía una barra de agitación magnética
FmocAA9-15OH (como se sintetizó en la Sección 7.2
anterior), HBrGlnOPNB, HOAT y EtPr_{2}N y se añadió NMP (200 ml).
La solución resultante se puso bajo atmósfera de nitrógeno y se
enfrió a 0-5ºC con agitación. Se añadió a la
solución fría HBTU. Se agitó la solución durante 15 minutos a
0-5ºC, se retiró el baño de hielo y se continuó la
agitación durante 2,5 horas (nota 1).
La mezcla de reacción se enfrió a
0-5ºC y se añadió HCl acuoso 0,5 N (250 ml) para
precipitar el péptido protegido. Los sólidos se recogieron por
filtración bajo vacío y se secaron en el matraz de filtro para
producir 24 g de FmocAAP-16OPNB crudo. El sólido se
disolvió en acetato de etilo (250 ml), se secó sobre sulfato
magnésico (10 g), se filtró y se concentró hasta un volumen de 100
ml. La solución se enfrió a 0-5ºC y se añadió hexano
(250 ml) para precipitar el péptido. El sólido se recogió por
filtración bajo vacío y se secó, proporcionando 21,5 g de
FmocAA9-16OPNB con el 100% de rendimiento y una
pureza del 91-94% por HPLC (nota 2).
- 1.
- Control del procedimiento dentro (IPC) por cromatografía de capa fina (TLC).
- cloroformo/etanol 90/10
- UV, detección de yodo
- Rt FmocAA)-15OH 0,46
- Rt FmocAA)-16OPNB 0,57
\vskip1.000000\baselineskip
- 2.
- Phenomenox Jupiter C5, 5 \mu, 300 \ring{A}
- 0,75 ml/min, 260 nm
- A H_{2}O/TFA al 0,05%
- B IPA al 50%/MeOH/TFA al 0,05%
- 70-97% de B durante 10 min, 97% de B durante 8 min
- Tiempo de retención: 13,3 minutos
- HCl H-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (SEQ ID NO: 7)
C_{144}H_{131}ClN_{13}O_{20}
P.M.
2041,02
\vskip1.000000\baselineskip
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| FmocAA9-16OPNB | 2227,65 | 1 | 9,43 | 21 | - - |
| Piperidina | - - | - - | - - | - - | 10 |
| THF | - - | - - | - - | - - | 190 |
| Metilterbutiléter (MTBE) | - - | - - | - - | - - | 250 |
| Hexano | - - | - - | - - | - - | 350 |
| Metanol | - - | - - | - - | - - | 150 |
| HCl 0,5 N | - - | - - | - - | - - | 100 |
| 2-Propanol | - - | - - | - - | - - | 50 |
| Rendimiento teórico: 19,2 g | Rendimiento esperado: 85-105% |
Se cargó un matraz de fondo redondo de 1 l que
contenía una barra de agitación magnética
FmocAA9-16OPNB (como se sintetizó en la Sección 8.1
anterior) y tetrahidrofurano/piperidina 20:1. La solución resultante
se agitó bajo atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente durante
60 minutos (nota 1). Se añadió hexano (350 ml) para precipitar el
péptido. Se decantó el disolvente del sólido pegajoso. El sólido se
trituró con MTBE (200 ml) a temperatura ambiente durante 18 horas.
El sólido se recogió por filtración bajo vacío y se secó para dar
18,9 g de HAA9-16OPNB (nota 2).
El sólido se disolvió en metanol (150 ml) y se
enfrió a 0-5ºC con agitación. Se añadió para
precipitar el péptido ácido clorhídrico acuoso 0,5 N (100 ml). Los
sólidos se recogieron por filtración bajo vacío, se lavaron con agua
(50 ml) y después 2-propanol (50 ml), y se secaron
para dar 17,7 g de HCl HAA9-16OPBN con el 92% de
rendimiento y una pureza del 92% por HPLC (nota 3).
- 1.
- Control del procedimiento dentro, HPLC
- Phenomenox Jupiter C5, 5 \mu, 300 \ring{A}
- 0,75 ml/min, 260 nm
- A H_{2}O/TFA al 0,05%
- B IPA al 50%/MeOH/TFA al 0,05%
- 70-97% de B durante 10 min, 97% de B durante 8 min
- Tiempo de retención: FmocAA9-16OPNB, 13,3 minutos; HAA9-16OPNB, 10,7 minutos
\vskip1.000000\baselineskip
- 2.
- El HAA)-16OPNB aislado en este punto contiene cantidades de trazas de piperidina y el aducto de bencilfulveno piperidina. Ambos se separan antes de acoplar con RAA1-8OH
\vskip1.000000\baselineskip
- 3.
- Phenomenox Jupiter C5, 5 \mu, 300 \ring{A}
- 0,75 ml/min, 260 nm
- A H_{2}O/TFA al 0,05%
- B IPA al 50%/MeOH/TFA al 0,05%
- 80-100% de B durante 10 min, 100% de B durante 5 min
- Tiempo de retención: HAA9-16OPNB 7,2 minutos
\vskip1.000000\baselineskip
- Condiciones de TLC:
- Diclorometano/etanol 90/10
- UV, detección de yodo
- Rf: HAA9-16OPNB, 0,64
- Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (SEQ ID NO: 4)
C_{194}H_{246}N_{23}O_{34}
P.M.
3427,43
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| AcAA1-8OH | 1440,86 | 1,3 | 0,13 | 0,186 | - - |
| HCI HAA9-16OPNB | 2041,02 | 1 | 0,10 | 0,204 | - - |
| HBTU | 379,25 | 1,1 | 0,11 | 0,042 | - - |
| HOAT | 136,1 | 1,1 | 0,11 | 0,015 | - - |
| EtPr_{2}N | 129,25 | 2,1 | 0,21 | 0,027 | 0,036 |
| DMF | - - | - - | - - | - - | 4,5 |
| DMSO | - - | - - | - - | - - | 0,5 |
| Agua | - - | - - | - - | - - | 7 |
| MTBE | - - | - - | - - | - - | 3,5 |
| Rendimiento teórico: 0,38 \hskip1cm Rendimiento esperado: 85-105% |
Se cargó un matraz de fondo redondo de 25 ml que
contenía una barra de agitación magnética con
AA1-8OH (como se sintetizó en la Sección 7.1
anterior), HCl HAA9-16OPNB (como se sintetizó en la
Sección 8.2 anterior) y HOAT. Los sólidos se disolvieron en DMF:DMSO
9:1 (5 ml) que contenía EtPr_{2}N y se enfriaron a
0-5ºC bajo atmósfera de nitrógeno (nota 1). Se
añadió HTBU a la solución fría. La mezcla de reacción se agitó a
0-5ºC durante 15 minutos, y se calentó después a
temperatura ambiente y se agitó 60 minutos más (nota 2). El péptido
se precipitó de la solución por adición de agua (7 ml). Los sólidos
se recogieron por filtración bajo vacío, se lavaron con agua (10 ml)
y se secaron para dar 0,36 g de AcAA1-16OPNB crudo.
El sólido se trituró con MTBE (3,5 ml) durante 1,5 horas a
temperatura ambiente, se recogió por filtración bajo vacío y se secó
para dar 0,335 g de AcAA-16OPNB con un rendimiento
del 88% y una pureza del 82% por HPLC (nota 3).
- 1.
- Es importante que todos los sólidos estén en solución antes de enfriar a 0-5ºC y añadir HBTU.
\vskip1.000000\baselineskip
- 2.
- Control del procedimiento dentro, TLC, HPLC
- Phenomenox Jupiter C5, 5 \mu, 300 \ring{A}
- 0,75 ml/min, 260 nm
- A H_{2}O/TFA al 0,05%
- B IPA al 50%/MeOH/TFA al 0,05%
- 80-100% de B durante 10 min, 100% de B durante 5 min
- Tiempo de retención: HAA9-16OPNB, 7,2 minutos (Ac1-8OH no tiene absorbancia a 260 nm)
- Tiempo de retención: AcAA1-16OPNB, 12,45
\vskip1.000000\baselineskip
- Condiciones de TLC
- cloroformo/metanol 90/10
- UV, detección de yodo
- Rf: HAA9-16OPNB, 0,64
- Rf: Ac1-8OH, 0,35
- Rf: Ac1-16OH, 0,48
\vskip1.000000\baselineskip
- 3.
- Phenomenox Jupiter C5, 5 \mu, 300 \ring{A}
- 0,75 ml/min, 260 nm
- A H_{2}O/TFA al 0,05%
- B IPA al 50%/MeOH/TFA al 0,05%
- 70-97% de B durante 10 min, 97% de B durante 8 min
- Tiempo de retención: Ac1-16OPNB, 16,4
\newpage
- Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (SEQ ID NO: 4)
C_{207}H_{253}N_{23}O_{34}
P.M.
3607,49
\vskip1.000000\baselineskip
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| FmocAA1-8OH | 1620,92 | 1 | 7,84 | 12,7 | - - |
| HCI HAA9-16OPNB | 2041,02 | 1 | 7,84 | 16,0 | - - |
| HBTU | 379,25 | 1,2 | 9,42 | 3,57 | - - |
| HOAT | 136,1 | 1,2 | 9,42 | 1,28 | - - |
| EtPr_{2}N (d = 0,755) | 129,25 | 2,5 | 19,6 | 2,55 | 3,36 |
| DMF | - - | - - | - - | - - | 250 |
| Cloruro sódico al 10%/agua (p/v) | - - | - - | - - | - - | 450 |
| Metanol | - - | - - | - - | - - | 200 |
| Agua | - - | - - | - - | - - | 100 |
| Rendimiento teórico: 28,3 g | Rendimiento esperado: 85-100% |
Se cargó un matraz de fondo redondo de 1 l que
contenía una barra de agitación magnética con
FmocAA1-8OH (como se sintetizó en la Sección 7.1
anterior), HCl HAA9-16OPNB (como se sintetizó en la
Sección 8.2 anterior), HOAT y DMF (250 ml). Se añadió a la solución
EtPr_{2}N. Se enfrió la solución a 0-5ºC y se
añadió HBTU. La mezcla de reacción se agitó a 0-5ºC
durante 15 minutos, se calentó después a temperatura ambiente y se
agitó 70 minutos más (nota 1). Se enfrió la mezcla de reacción a
0-5ºC y se añadió cloruro sódico al 10%/agua (200
ml) para precipitar el péptido. Los sólidos se recogieron por
filtración bajo vacío, se lavaron con agua (50 ml) y se secaron para
dar 27 g de FomcAA1-16OPNB crudo. El sólido se
disolvió en metanol (200 ml) y se añadió a una solución agitada de
cloruro sódico en agua (10% p/v, 300 ml). Los sólidos se recogieron
por filtración bajo vacío, se lavaron con agua (50 ml) y se secaron
para dar 26 g de FmocAA1-16OPNB con un rendimiento
del 92% y una pureza del 90% por HPLC
(nota 1).
(nota 1).
- 1.
- Control del procedimiento dentro, HPLC
- Phenomenox Jupiter C5, 5 \mu, 300 \ring{A}
- 0,75 ml/min, 260 nm
- A H_{2}O/TFA al 0,05%
- B IPA al 50%/MeOH/TFA al 0,05%
- 80-100% de B durante 10 min, 100% de B durante 5 min
- Tiempo de retención: HAA9-16OPNB, 7,2 minutos, FmocAA1-8OH, 7,9 minutos
- Tiempo de retención: FmocAA1-16OPNB, 14,5 minutos
\newpage
- H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (SEQ ID NO: 4)
C_{192}H_{243}N_{23}O_{32}
P.M.
3384,41
\vskip1.000000\baselineskip
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| FmocAA1-16OPNB | 3607,49 | 1 | 0,28 | 1,0 | - - |
| Piperidina | - - | - - | - - | - - | 0,6 |
| Diclorometano | - - | - - | - - | - - | 11,4 |
| Hexano | - - | - - | - - | - - | 45 |
| Rendimiento teórico: 0,94 g | Rendimiento esperado: 90-105% |
Se cargó un matraz de fondo redondo de 50 ml que
contenía una barra de agitación magnética con
FmocAA1-16OPNB (como se sintetizó en la Sección 8.4
anterior), diclorometano (11,4 ml) y piperidina (0,6 ml). La
solución se agitó a temperatura ambiente bajo atmósfera de nitrógeno
durante 90 minutos (nota 1). Se añadió hexano (45 ml) a la mezcla de
reacción y el volumen de disolvente se redujo a 25 ml por
destilación bajo vacío. Los sólidos resultantes se recogieron por
filtración bajo vacío y se secaron para dar 0,96 g de
HAA1-16OPNB con el 102% de rendimiento. El análisis
de HPLC del sólido indicó 72% de HAA1-16OPNB y 18%
de fulveno y aducto de piperidina-
fulveno.
fulveno.
- 1.
- Phenomenox Jupiter C5, 5 \mu, 300 \ring{A}
- 0,8 ml/min, 260 nm
- A H_{2}O/TFA al 0,05%
- B IPA al 50%/MeOH/TFA al 0,05%
- 80-100% de B durante 10 min, 100% de B durante 5 min
- Tiempo de retención: FmocAA1-16OPNB, 14,1 min
- Tiempo de retención HAA1-16OPNB, 11,6 minutos
- Tiempo de retención: fulveno y aducto de piperidina-fulveno, 5,5 y 4,8 min
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
- Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (SEQ ID NO: 4)
C_{194}H_{246}N_{23}O_{34}
P.M.
3427,43
\vskip1.000000\baselineskip
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| HAA1-16OPNB | 3384,41 | 1 | 0,28 | 0,95 | - - |
| Anhídrido acético (d = 1,08) | 102,09 | 3 | 0,84 | 0,086 | 0,080 |
| Piridina (d = 0,978) | 79,1 | 3 | 0,84 | 0,67 | 0,068 |
| DMF | - - | - - | - - | - - | 10 |
| Agua | - - | - - | - - | - - | 30 |
| MTBE | - - | - - | - - | - - | 10 |
| Hexano | - - | - - | - - | - - | 10 |
| Rendimiento teórico: 0,96 g | Rendimiento esperado: 80-100% |
Se cargó un matraz de fondo redondo de 50 ml que
contenía una barra de agitación magnética con
HAA1-16OPNB (como se sintetizó en la Sección 8.5
anterior), DMF (10 ml), anhídrido acético y piridina. La mezcla de
reacción se calentó a temperatura ambiente bajo atmósfera de
nitrógeno durante 60 min (nota 1). Se añadió agua (20 ml) para
precipitar el péptido. Los sólidos se recogieron por filtración bajo
vacío, se lavaron con agua (10 ml) y se secaron para dar 0,87 g de
AcAA1-16OPNB. Para separar fulveno y aducto de
piperidina-fulveno residuales, se trituró el sólido
con MTBE/hexano 1:1 (20 ml) durante 4,5 horas a temperatura
ambiente. Los sólidos se recogieron por filtración bajo vacío y
secaron para dar 0,82 g de AcAA1-16OPNB con un
rendimiento del 85% y una pureza por encima del 90% por HPLC (nota
1).
- 1.
- Control del procedimiento dentro, HPLC
- Phenomenox Jupiter C5, 5 \mu, 300 \ring{A}
- 0,8 ml/min, 260 nm
- A H_{2}O/TFA al 0,05%
- B IPA al 50%/MeOH/TFA al 0,05%
- 80-100% de B durante 10 min, 100% de B durante 15 min
- Tiempo de retención: HAA1-16OPNB, 11,6 minutos
- Tiempo de retención: AcAA1-16OPNB, 12,1 minutos
\vskip1.000000\baselineskip
- TLC, etanol al 10% en diclorometano
- UV, detección de yodo
- Rf AcAA1-16OPNB, 0,69
- Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OH (SEQ ID NO: 4)
C_{187}H_{241}N_{22}O_{32}
P.M.
3276,4
\vskip1.000000\baselineskip
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| AcAA1-16OPNB | 3424,86 | 1 | 0,23 | 0,80 | - - |
| Pd al 10%/C, Degussa, 50% de agua | - - | - - | - - | 0,30 | - - |
| Formiato amónico | 63,06 | 15 | 3,5 | 0,22 | - - |
| DMF | - - | - - | - - | - - | 15 |
| Agua | - - | - - | - - | - - | 120 |
| Acetato de etilo | - - | - - | - - | - - | 100 |
| Hexano | - - | - - | - - | - - | 44 |
| Metanol | - - | - - | - - | - - | 10 |
| NaCl ac. saturado | - - | - - | - - | - - | 5 |
| MTBE | - - | - - | - - | - - | 4 |
| Rendimiento teórico: 0,76 g | Rendimiento esperado: 70-85% |
Se cargó un matraz de fondo redondo de 25 ml que
contenía una barra de agitación magnética con
AcAA1-16OPNB (como se sintetizó en la Sección 8.6
anterior) y DMF (10 ml). Se añadió a esta solución una solución de
formiato amónico en agua (0,5 ml) y después paladio sobre carbono
húmedo (Degussa, 10%, 50% de agua). La suspensión se agitó bajo
atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente durante 120 minutos
(nota 1). Se filtró la suspensión a través de un lecho relleno
estrechamente de celite en 90 ml de agua. La torta del filtro se
lavó con DMF (5 ml). La suspensión acuosa se lavó con acetato de
etilo (100 ml). El acetato de etilo se concentró después hasta un
volumen de 20 ml (nota 2). Se añadió hexano (40 ml) para completar
la precipitación y el disolvente se decantó de los sólidos. Los
sólidos se disolvieron en metanol (10 ml) y se añadió agua/cloruro
sódico acuoso saturado (25 ml) para precipitar el péptido. Los
sólidos se recogieron por filtración bajo vacío, se lavaron con agua
(10 ml) y se secaron para dar 0,62 g de AcAA1-16OK.
Los sólidos se trituraron con MTBE al 50%/hexano (8 ml) a
temperatura ambiente durante 15 horas, se recogieron y se secaron
para dar 0,59 g de AcAA1-16OH con un rendimiento del
77% y una pureza del 90% por HPLC (nota 3).
- 1.
- Control del procedimiento dentro, TLC
- diclorometano/etanol 80/20
- UV, detección de yodo
- Rf: AcAA1-16OPNB, 0,90
- Rf: Ac1-16OH, 69
\vskip1.000000\baselineskip
- 2.
- El AcAA1-16OH puede comenzar a precipitar a medida que se reduce el volumen de disolvente
\vskip1.000000\baselineskip
- 3.
- Phenomenox Jupiter C5, 5 \mu, 300 \ring{A}
- 0,8 ml/min, 260 nm
- A H_{2}O/TFA al 0,05%
- B IPA al 50%/MeOH/TFA al 0,05%
- 80-100% de B durante 10 min, 100% de B durante 5 min
- Tiempo de retención: AcAA1-16OH, 10,73 minutos
- Fmoc-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH_{2} (SEQ ID NO: 18)
C_{130}H_{159}N_{16}O_{24}
P.M.
2329,64
\vskip1.000000\baselineskip
| Materiales: | P.M.. | eq | mmoles | gramos | ml |
| FmocAA27-35OH | 2182,61 | 1 | 18,4 | 40,2 | - - |
| HPheNH_{2} | 162,21 | 1,2 | 22,1 | 3,6 | |
| HBTU | 379,25 | 1,2 | 22,1 | 8,4 | |
| HOAT | 136,1 | 1,2 | 22,1 | 3,0 | |
| EtPr_{2}N (d = 0,755) | 129,25 | 2,1 | 38,7 | 5,0 | 6,6 |
| DMF | 500 |
| Rendimiento teórico: 42,8 g | Rendimiento esperado: 90-105% |
Se cargó un matraz de fondo redondo de 2 l que
contenía una barra de agitación magnética con
FmocAA27-35OH (como se sintetizó en la Sección 7.6
anterior), HOAT, HPheNH_{2} y DMF (500 ml). Se añadió EtPr_{2}N
y la solución se enfrió a 0-5ºC y se añadió después
HBTU.. La mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos a
0-5ºC y se calentó después a temperatura ambiente y
agitó durante 70 minutos más (nota 1). Se enfrió la solución a
0-5ºC y se añadió agua (500 ml) para precipitar el
péptido.. Los sólidos se recogieron por filtración bajo vacío, se
lavaron con agua (100 ml) y se secaron para dar 43 g de
FmocAA27-36NH_{2} con un rendimiento del 100% y
una pureza del 93% por HPLC (nota 2).
- 1.
- Control del procedimiento dentro, TLC
- diclorometano/etanol 88/12
- UV, detección de yodo
- Rf: FmocAA27-35OH, 0,49
- Rf: FmocAA27-36NH_{2}, 0,63
\vskip1.000000\baselineskip
- 2.
- Phenomenox Jupiter, C18, 5 \mu, 300 \ring{A}
- 1,0 ml/min, 260 nm
- A H_{2}O/TFA al 0,1%
- B ACN
- 75-99% de B durante 20 min, 99% de B durante 5 min
- Tiempo de retención: 29,4 minutos
- H-Asq(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-NH_{2} (SEQ IF NO: 17)
C_{115}H_{148}N_{16}O_{22}
P.M.
2106,56
\vskip1.000000\baselineskip
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| FmocAA(27-36)-NH_{2} | 2328,8 | 1,0 | 9,3 | 21,7 | - - |
| Piperidina | 85,15 | 5,0 | 46,6 | 4,0 | 4,6 |
| Cloruro de metileno (DCM) | - - | - - | - - | - - | 100 |
| Agua | - - | - - | - - | - - | 2 x 100 |
| Metil t-butil éter (MTBE) | - - | - - | - - | - - | 100 + 30 |
| Rendimiento teórico: 19,6 g | Rendimiento esperado: 85-95% |
Se cargó a un matraz de fondo redondo de 250 ml
equipado con un agitador magnético y atmósfera de nitrógeno el
Fmoc-fragmento sintetizado en la Sección 8.8
anterior, el cloruro de metileno (\sim5 vol.) y la piperidina. Se
obtuvo una solución y se agitó a temperatura ambiente durante 1,5
horas (nota 1).
Se lavó la solución con 2 x 100 ml de agua. Se
separaron las capas y la capa orgánica se concentró bajo vacío hasta
aproximadamente la mitad del volumen original. Se añadió por
porciones MTBE, 2 x 50 ml, mientras se continuó la concentración
para separar DCM hasta un punto de precipitación considerable y un
volumen contenido final de aproximadamente 150 ml.
La suspensión de producto se agitó y enfrió en un
baño de hielo a 0-5ºC durante aproximadamente una
hora. Los sólidos se aislaron por filtración bajo vacío y se lavaron
con 2 x 15 ml de MTBE. El producto se secó al aire para dar 17,6 g
(89,6%) de
H-AA(27-36)NH_{2}
del 95% de pureza por HPLC (nota 2).
- 1)
- Se controla por HPLC que se ha completado la reacción:
- Columna: Phenomenox Jupiter C18; 300 \ring{A}; 5 \mu
- Caudal: 1 ml/min
- Detección: UV a 260 nm
| Fase móvil: | A: TFA acuoso al 0,1% | |
| B: TFA al 0,1% en acetonitrilo | ||
| gradiente del 75% de B al 99% de B en 20 minutos |
- Tiempo de retención: aproximadamente 18 minutos
- 2)
- Se separan eficazmente en la elaboración ambos subproductos de Fmoc, el dibenzofulveno y su aducto de piperidina; sin embargo, debe realizarse un ensayo de uso antes de continuar con el material. Si el material falla el ensayo de uso, se repite el procedimiento de elaboración disolviendo el sólido en DCM (5 vol.) y continuando después con el procedimiento descrito antes.
\newpage
- Fmoc-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH_{2} (SEQ ID NO: 12)
C_{242}H_{311}N_{29}O_{46}
P.M.
4364,38
\vskip1.000000\baselineskip
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| FmocAA17-26OH | 2275,82 | 1 | 9,5 | 21,6 | |
| HAA27-36NH_{2} | 2106,56 | 1 | 9,5 | 20 | |
| HOAT | 136,1 | 1,2 | 11,4 | 1,55 | |
| HBTU | 379,25 | 1,2 | 11,4 | 4,33 | |
| EtPr_{2}N (d = 0,755) | 129,25 | 2 | 19,0 | 2,46 | 3,25 |
| DMF | 400 | ||||
| Agua | 600 | ||||
| 2-Propanol | 1100 |
| Rendimiento teórico: 41,5 g | Rendimiento esperado: 80-85% |
Se cargó un matraz de fondo redondo de 2 l que
contenía una barra de agitación magnética con
FmocAA17-26OH (como se sintetizó en la Sección 7.5
anterior), HAA27-36NH_{2} (como se sintetizó en la
Sección 8.9 anterior), HOAT y DMF (400 ml). Se añadió EtPr_{2}N,
la solución agitada se enfrió a 0-5ºC bajo atmósfera
de nitrógeno y se añadió HBTU. La mezcla de reacción se agitó a
0-5ºC durante 15 minutos, se calentó después a
temperatura ambiente y se agitó 2,5 horas más (nota 1). Se añadió
agua (500 ml) a la mezcla de reacción para precipitar el péptido
(nota 2). La suspensión resultante se agitó durante 45 minutos, los
sólidos se recogieron por filtración bajo vacío, se lavaron con agua
(100 ml) y se secaron. Se devolvieron los sólidos al matraz de fondo
redondo de 2 l que contenía una barra de agitación magnética y se
añadió 2-propanol (1,1 l) a 60ºC. La suspensión se
agitó bajo atmósfera de nitrógeno a medida que se enfriaba a
temperatura ambiente (durante la noche). Los sólidos se recogieron
por filtración bajo vacío y se secaron para dar 37,5 g de
FmocAA17-36NH_{2} con un rendimiento del 90% y una
pureza del 95,5% por HPLC (nota 1).
- 1
- Control del procedimiento dentro, HPLC
- Phenomenox Jupiter C5, 5 \mu, 300 \ring{A}
- 0,75 ml/min, 260 nm
- A H_{2}O/TFA al 0,05%
- B IPA al 50%/MeOH/TFA al 0,05%
- 80-100% de B durante 10 min, 100% de B durante 25 min
- Tiempo de retención: FmocAA17-26OH, 8,2 minutos, HAA26-36NH_{2}, 8,4 minutos
- Tiempo de retención: FmocAA17-36NH_{2}, 13,3 minutos
\vskip1.000000\baselineskip
- 2
- La mezcla de reacción calentada a 38ºC en la adición del agua
\newpage
- H-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-NH_{2} (SEQ ID NO: 19)
C_{227}H_{303}N_{29}O_{44}
HCl
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| FmocAA17-(17-36)-NH_{2} | 4364,36 | 1,0 | 5,2 | 22,5 | - - |
| NaOH (ac.) 5 N | - - | - - | - - | - - | 55 |
| Tetrahidrofurano (THF) | - - | - - | - - | - - | 170 |
| HCl 1 N | - - | - - | - - | - - | 13 |
| NaCl (ac.) saturado | - - | - - | - - | - - | 2 x 55 |
| Heptano | - - | - - | - - | - - | 3 x 25 + 50 |
| 200 + 50 |
| Rendimiento teórico: 21,6 g | Rendimiento esperado: 95-100% |
Se cargó a un matraz de fondo redondo de 250 ml
equipado con un agitador de aire y atmósfera de nitrógeno el
Fmoc-fragmento sintetizado en la Sección 8.10
anterior, el THF(aproximadamente 7,5 vol.) y el NaOH 5 N
(\sim2,5 vol.). Se obtuvo una solución de dos fases y se agitó a
temperatura ambiente durante 10-15 minutos (nota
1).
Se separaron las capas y la se ajustó la fase
orgánica en pH 2-3 con HCl 1 N. Se lavó después la
solución con una solución de salmuera saturada, 2 x 55 ml (2,5 vol.)
(nota 2). Se separaron las capas y la capa orgánica se concentró
bajo vacío a 15-20ºC hasta aproximadamente ½ del
volumen original. Se añadió por porciones heptano, 3 x 25 ml,
mientras se continuó la concentración para separar THF hasta un
punto de precipitación considerable y un volumen contenido final de
aproximadamente 100 ml (nota 2).
La suspensión de producto se agitó a temperatura
ambiente durante aproximadamente 2 horas. Los sólidos se aislaron
por filtración bajo vacío y se lavaron con aproximadamente 50 ml de
heptano. El producto se secó al aire para dar 21,0 g (97,5%) de
H-AA(17-36)NH_{2}.
Puede realizarse una reelaboración para separar
subproducto dibenzofulveno residual. El producto se suspendió a
temperatura ambiente en 200 ml de heptano durante 3 horas. El
material se filtró, se lavó con aproximadamente 50 ml de heptano y
se secó al aire produciendo 20,8 g (96,6%) de producto de más del
95% de pureza por HPLC.
- 1)
- Se controla por HPLC que se ha completado la reacción:
- Columna: Zorbax LP C8; 1 OOA; 2011 Caudal: 1 ml/min
- Detección: UV a 260 nm
| Fase móvil: | A: TFA acuoso al 0,1% | |
| B: TFA al 0,05% en ACN:IPA 1:1 | ||
| gradiente del 80% de B al 99% de B en 20 minutos |
- Tiempo de retención: aproximadamente 18 minutos
\vskip1.000000\baselineskip
- 2)
- Los sólidos precipitan inicialmente como una goma cerosa que permanece agitable y se tritura con concentración adicional hasta un sólido filtrable.
Se presentan aquí, en las siguientes Secciones
9.1-9.5, ejemplos de la utilización de los
fragmentos intermedios de péptidos para producir péptidos
T-20 de longitud completa.
\newpage
El Ejemplo presentado en esta Sección demuestra
el acoplamiento con éxito de técnicas de síntesis en fase sólida y
fase solución para producir un péptido T-20 de
longitud completa a partir de fragmentos intermedios de
péptidos.
La vía de síntesis descrita aquí representa la
culminación de los métodos de cuatro fragmentos de
T-20 representados esquemáticamente en las Figs. 1 y
3. En los casos en que se sintetiza AcAA1-16OH
mediante técnicas en fase sólida, se sigue el método de la Fig. 1, y
en los casos en que se sintetiza AcAA1-16OH mediante
técnicas en fase solución, se sigue el método de la Fig. 3. Se ha de
señalar que el péptido de longitud completa T-20
sintetizado aquí tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,
con una modificación de acetilo en su término amino (es decir,
"X") y una modificación de amido en su término carboxilo (es
decir, "Z").
- Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH_{2} (SEQ ID NO: 1)
C_{414}H_{543}N_{51}O_{74}
P.M.
7411,95
\vskip1.000000\baselineskip
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| AcAA1-1OH | 3276,4 | 1 | 0,24 | 0,79 | |
| HClHAA17-36NH_{2} | 4178,56 | 1 | 0,24 | 1,0 | |
| HOAT | 136,1 | 1,1 | 0,26 | 0,036 | |
| HBTU | 379,25 | 1,0 | 0,95 | 0,25 | |
| EtPr_{2}N (d = 0,755) | 129,25 | 2,8 | 0,67 | 0,087 | 0,115 |
| DMF | 20 | ||||
| Agua | 25 | ||||
| NaCl saturado | 5 | ||||
| MTBE | 10 | ||||
| Hexano | 10 |
| Rendimiento teórico: 1,77 g | Rendimiento esperado: 85-100% |
Se cargó un matraz de fondo redondo de 100 ml que
contenía una barra de agitación magnética con
AcAA1-16OH (como se sintetizó en la Sección 7.4
anterior, mediante técnicas en fase sólida o en la Sección 8.7
anterior mediante técnicas en fase solución), HOAT, DMF (20 ml) y
después EtPr_{2}N (0,074 ml). La solución se enfrió a
0-5ºC bajo atmósfera de nitrógeno y se añadió HBTU.
La solución se agitó durante 15 minutos a 0-5ºC y se
añadió HClHAA17-36NH_{2} (como se sintetizó en la
Sección 8.11 anterior), seguido por 0,041 ml adicionales de
EtPr_{2}N. Se retiró el baño de enfriamiento y se agitó la mezcla
de reacción durante 2 horas (nota 1). Para precipitar el péptido, se
añadieron agua (25 ml) y cloruro sódico acuoso saturado (5 ml). Los
sólidos se recogieron por filtración bajo vacío, se lavaron con agua
(10 ml) y se secaron para dar 1,74 g de
AcAA1-36NH_{2} crudo (nota 2). Los sólidos se
trituraron con MTBE al 50%/hexano a temperatura ambiente durante 2,5
horas, se recogieron por filtración bajo vacío y se secaron para dar
1,70 g con 96% de rendimiento y una pureza del 92% por HPLC.
- 1)
- Control del procedimiento dentro, HPLC
- Phenomenox Jupiter C5, 5 \mu, 300 \ring{A}
- 0,8 ml/min, 260 nm
- A H_{2}O/TFA al 0,05%
- B IPA al 50%/MeOH/TFA al 0,05%
- 80-100% de B durante 10 min, 100% de B durante 15 min
- Tiempo de retención: AcAA1-16OH, 11,8 minutos,
- Tiempo de retención: HCl HAA17-36NH_{2}, 12,7 minutos
- Tiempo de retención: AcAA1-36NH_{2}, 22,9 minutos
\vskip1.000000\baselineskip
- 2)
- El goteo de agua produce un precipitado muy fino. Puede requerirse una doble filtración.
El Ejemplo presentado en esta Sección demuestra
el acoplamiento con éxito de técnicas de síntesis en fase sólida y
líquida para producir un péptido T-20 a partir de
fragmentos intermedios de péptido. En particular, la vía de síntesis
descrita aquí representa el método de tres fragmentos de
T-20 representado esquemáticamente en la Fig. 4
hasta el punto de la figura en el que se sintetiza
FmocAA1-36NH_{2}.
- Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH_{2} (SEQ ID NO: 1)
C_{127}H_{551}N_{51}O_{75}
P.M.
7593,01
\vskip1.000000\baselineskip
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| FmocAA1-16OH | 3453,89 | 1 | 0,12 | 0,41 | - - |
| HClHAA17-36NH_{2} | 4174,88 | 1 | 0,12 | 0,50 | |
| HOAT | 136,1 | 1,25 | 0,15 | 0,020 | |
| HBTU | 379,25 | 1,25 | 0,15 | 0,057 | |
| EtPr_{2}N (d = 0,755) | 129,25 | 2,5 | 0,30 | 0,039 | 0,051 |
| DMF | 10 | ||||
| Agua | 18 | ||||
| 2-Propanol | 14 |
| Rendimiento teórico: 0,91 g | Rendimiento esperado: 85-100% |
Se cargó un matraz de fondo redondo de 25 ml que
contenía una barra de agitación magnética con
FomcAA1-16OH (como se sintetizó en la Sección 7.3
anterior), HCl HAA17-36NH_{2} (como se sintetizó
en la Sección 8.11 anterior), HOAT, DMF (10 ml) y se añadió después
EtPr_{2}N. La solución se enfrió a 0-5ºC bajo
atmósfera de nitrógeno y se añadió HBTU. La mezcla de reacción se
agitó a 0-5ºC durante 15 minutos, se calentó después
a temperatura ambiente y se agitó durante 1,5 horas (nota 1). Se
añadió agua para precipitar el péptido y los sólidos se recogieron
por filtración bajo vacío y se secaron. Los sólidos se trituraron
con 2-propanol (14 ml) durante 15 horas a
temperatura ambiente y se añadió después agua (3 ml) para sacar de
solución el producto deseado. Los sólidos se recogieron por
filtración bajo vacío y se secaron para dar 0,80 g de
FmocAA1-36NH_{2} con 88% de rendimiento y una
pureza del 85% por HPLC.
- 1)
- Control del procedimiento dentro, HPLC
- Phenomenox Jupiter, C5, 5 \mu, 300 \ring{A}
- 0,8 ml/min, 260 nm
- A H_{2}O/TFA al 0,05%
- B IPA al 50%/MeOH/TFA al 0,05%
- 80-100% de B durante 10 min, 100% de B durante 15 min
- Tiempo de retención: FmocAA1-16OH, 11,4 minutos,
- Tiempo de retención: HCl HAA17-36NH_{2}, 12 minutos
- Tiempo de retención: FmocAA1-36NH_{2}, 20,4 minutos
\vskip1.000000\baselineskip
- TLC, diclorometano/etanol 9/1
- UV, detección de yodo
- Rft, FmocAA1-36NH_{2}, 0,71.
El Ejemplo presentado en esta Sección demuestra
el acoplamiento con éxito de técnicas de síntesis en fase sólida y
líquida para producir un péptido T-20 a partir de
fragmentos intermedios de péptido. En particular, la vía de síntesis
descrita aquí representa el método de tres fragmentos de
T-20 representado esquemáticamente en la Fig. 4
hasta el punto de la figura en el que se sintetiza
H-AA1-36-NH_{2}.
- H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH_{2} (SEQ ID NO: 1)
C_{412}H_{541}N_{51}O_{73}
P.M.
7370,94
\vskip1.000000\baselineskip
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| FmocAA1-36NH_{2} | 7593,01 | 1 | 0,105 | 0,80 | |
| Piperidina | 0,5 | ||||
| DMF | 9,5 | ||||
| Agua | 20 | ||||
| NaCl acuoso saturado | 5 | ||||
| MTBE | 5 | ||||
| Hexano | 5 |
| Rendimiento teórico: 0,77 g | Rendimiento esperado: 85-95% |
Se cargó un matraz de fondo redondo de 25 ml que
contenía una barra de agitación magnética con
FomcAA1-36NH_{2} (como se sintetizó en la Sección
9.2 anterior), DMF (9,5 ml) y piperidina (0,5 ml). La solución se
agitó a temperatura ambiente bajo atmósfera de nitrógeno durante 2
horas (notas 1,2). Se añadieron agua (20 ml) y cloruro sódico acuoso
saturado (5 ml) para precipitar el péptido protegido. Los sólidos se
recogieron por filtración bajo vacío y se secaron para dar 0,77 g de
HAA1-36NH_{2} contaminado con fulveno y el aducto
de piperidina-fulveno. Los sólidos se trituraron con
MTBE al 50%/hexano a temperatura ambiente durante 15 horas para
separar el fulveno y el aducto de
piperidina-fulveno. Los sólidos se recogieron por
filtración bajo vacío y se secaron para dar 0,73 g de
HAA1-36NH_{2} con 95% de rendimiento y una pureza
del 90% por HPLC.
- 1)
- Control del procedimiento dentro, HPLC
- Phenomenox Jupiter C5, 5 \mu, 300 \ring{A}
- 0,8 ml/min, 260 nm
- A H_{2}O/TFA al 0,05%
- B IPA al 50%/MeOH/TFA al 0,05%
- 80-100% de B durante 10 min, 100% de B durante 15 min
- Tiempo de retención: FmocAA1-36OH, 20,4 minutos,
- Tiempo de retención: HCl HAA1-36NH_{2}, 19,9 minutos
- Tiempo de retención: fulveno y aducto de piperidina-fulveno, 5 minutos
\vskip1.000000\baselineskip
- TLC, diclorometano/etanol 9/1
- UV, detección de yodo
- Rt: FmocAA1-36NH_{2}, 0,71.
\vskip1.000000\baselineskip
- 2)
- El producto y el material de partida no se separan bien en TLC o HPLC de fase inversa. Se siguió la formación de producto observando el fulveno y el aducto de piperidina-fulveno.
El Ejemplo presentado en esta Sección demuestra
el acoplamiento con éxito de técnicas de síntesis en fase sólida y
líquida para producir un péptido T-20 a partir de
fragmentos intermedios de péptido. En particular, la vía de síntesis
descrita aquí representa el método de tres fragmentos de
T-20 representado esquemáticamente en la Fig. 4
hasta el punto de la figura en el que se sintetiza
Ac-AA1-36-NH_{2}.
- Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH_{2} (SEQ ID NO: 1)
C_{414}H_{543}N_{51}O_{74}
P.M.
7411,95
\vskip1.000000\baselineskip
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| HAA1-36NH_{2} | 7370,94 | 1 | 0,096 | 0,71 | |
| Anhídrido acético (d = 1,08) | 102,09 | 3 | 0,29 | 0,029 | 0,027 |
| Piridina (d = 0,978) | 79,1 | 6 | 0,58 | 0,046 | 0,046 |
| DMF | 10 | ||||
| Agua | 17,5 | ||||
| NaCl acuoso saturado | 7,5 |
| Rendimiento teórico: 0,71 g | Rendimiento esperado: 85-100% |
Se cargó un matraz de fondo redondo de 25 ml que
contenía una barra de agitación magnética con
HAA1-36NH_{2} (como se sintetizó en la Sección 9.3
anterior), DMF (10 ml), piridina (0,046 ml) y anhídrido acético
(0,027 ml) (nota 1). La solución se agitó a temperatura ambiente
bajo atmósfera de nitrógeno durante 4 horas (nota 2). Se añadieron
agua (7,5 ml) y cloruro sódico acuoso saturado (7,5 ml) para
precipitar el péptido protegido. Los sólidos se recogieron por
filtración bajo vacío, se lavaron con agua (10 ml) y se secaron para
dar 0,65 g de AcAA1-36NH_{2} con 91% de
rendimiento y una pureza del 90% por HPLC (nota 3).
- 1)
- Puede utilizarse también diclorometano como disolvente para esta reacción
\vskip1.000000\baselineskip
- 2)
- Control del procedimiento dentro, HPLC
- Phenomenox Jupiter C5, 5 \mu, 300 \ring{A}
- 0,8 ml/min, 260 nm
- A H_{2}O/TFA al 0,05%
- B IPA al 50%/MeOH/TFA al 0,05%
- 80-100% de B durante 10 min, 100% de B durante 15 min
- Tiempo de retención: HAA1-36OH, 23,3 minutos,
- Tiempo de retención: AcAA1-36NH_{2}, 22,7 minutos
\vskip1.000000\baselineskip
- 3)
- El producto y el material de partida no se separan bien en TLC o HPLC de fase inversa.
El Ejemplo presentado en esta Sección demuestra
el acoplamiento con éxito de técnicasde síntesis en fase sólida y
líquida para producir un péptido T-20 a partir de
fragmentos intermedios de péptido. En particular, la vía de síntesis
descrita aquí representa el método de tres fragmentos de
T-20 representado esquemáticamente en la Fig. 4.
- Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH_{2} (SEQ ID NO: 1)
C_{414}H_{543}N_{51}O_{74}
P.M.
4492,1
\vskip1.000000\baselineskip
| Materiales: | P.M.. | eq. | mmoles | gramos | ml |
| AcAA1-36NH_{2} | 7411,95 | 1 | 0,035 | 0,26 | |
| Ácido trifluoroacético | 2,25 | ||||
| Agua | 15,1 | ||||
| Ditiotreitol | 0,12 | ||||
| MTBE | 170 | ||||
| Acetonitrilo | 15 |
| Rendimiento teórico: 157 mg | Rendimiento esperado: 25-50% |
Una solución de ácido
trifluoroacético/agua/ditiotreitol 90:5:5 (v/v/p %) se desgasificó
con nitrógeno y se enfrió a 0-5ºC. A la solución
enfriada se añadió AcAA1-36NH_{2} (como se
sintetizó en la Sección 9.4 anterior). La suspensión se agitó a
0-5ºC hasta disolverse los sólidos (\sim5 minutos)
y se calentó después a temperatura ambiente y agitó durante 2,5
horas. La solución se añadió a MTBE a 0-5ºC (70 ml)
para precipitar el péptido. La suspensión se centrifugó en una
centrífuga durante cinco minutos a 2200 rpm y se decantó el MTBE de
los sólidos. Se suspendieron de nuevo los sólidos en MTBE (50 ml),
se centrifugó en una centrífuga durante cinco minutos a rpm y se
decantó el MTBE. Este procedimiento se repitió una vez más y se
disolvieron después los sólidos en agua/acetonitrilo 1:1 (30 ml) que
contenía 1% vol. de ácido acético y se guardó a temperatura ambiente
durante 24 horas (nota 1). Se congeló la solución y se liofilizó
después usando un liofilizador para dar 155 mg de
T-20 crudo. La purificación por HPLC preparativa
proporciona 55 mg del péptido T-20 de longitud
completa con una pureza del 95% por HPLC (nota 2).
- 1)
- La cadena secundaria tBu de Trp(Boc) se separa rápidamente dejando TrpCOOH. La descarboxilación del TrpCOOH requiere un mínimo de 24 horas a temperatura ambiente en ácido acético acuoso.
\vskip1.000000\baselineskip
- 2)
- HPLC preparativa
- YMC 5,08 cm, 120 A, 10 \mu, C18
- 220 nm, 50 ml/min
- A H_{2}O/TFA al 0-1%
- B ACN/TFA al 0,1%
- 39-49% B/40 minutos
El Ejemplo presentado aquí describe métodos por
los que pueden purificarse péptidos T-20 en
condiciones que aumentan en gran medida el rendimiento total de
purificación del péptido.
Columna usada: 20 x 30 cm rellena con partículas
de 35 \mum de Amberchrom CG-300S (Tosohaus;
Montgomeryville, PA).
- Tampón A = Acetato amónico 100 mM ajustado en pH 8,5 con NH_{4}OH.
- Tampón B = acetonitrilo.
- 1.
- Columna con aproximadamente 6 volúmenes de columna de 20% de B.
- 2.
- Se disuelve T-20 en 50-100 ml de 85% de A/15% de B por gramo de péptido. Se ajusta el pH en 8-10 con K_{2}CO_{3} 2 M. La concentración de acetonitrilo en la muestra de T-20 no supera el 15-20%.
- 3.
- Se carga solución de T-20 a razón de 500 ml/min, comprobando la presión de la columna.
- 5.
- Se controla el eluato de la columna a 303 nm, y se recoge el eluato durante el procedimiento de carga completo. La longitud de onda o atenuación se ajusta durante la prueba para mantener el pico en escala. La absorbancia es función de la longitud de onda y de la longitud de la trayectoria de células.
- 6.
- El funcionamiento del gradiente se comienza como sigue (1,6% de cambio en B/hora), comprobándose la presión durante la prueba completa
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Tiempo (min) \+ \hskip2cm \+ % de B \+
\hskip2cm \+ Flujo (ml/min)\cr 0 \+ \+ 15 \+ \+ 330\cr
788 \+ \+ 36 \+ \+
330\cr}
- 7.
- Se recogen fracciones de 10 min (3,3 l) cuando el pico principal comienza a eluir. Todo el T-20 debe eluirse por 35% de B. Como media, se recogen 35-40 fracciones. Se guardan las fracciones a 0-5ºC hasta hacer una determinación de qué fracción a agrupar.
- 8.
- Se recogen fracciones hasta que la absorbancia del detector es menos de 0,1 AU o hasta que se alcanza un punto de inflexión principal después de eluir el pico principal.
- 9.
- Se controla la pureza de cada fracción por HPLC de fase inversa analítica.
El péptido T-20 es mucho más
soluble a intervalos de pH mayores de 7. Los soportes de columna
usados comúnmente para purificar péptidos se basan en sílice y, por
tanto, sólo pueden usarse a ciertos intervalos de pH porque el
soporte de sílice tiende a disolverse a intervalos de pH más
altos.
El método descrito aquí utiliza un soporte de
resina basado en poliestireno que es estable en un amplio intervalo
de pH (1-14). Este método aumenta en gran medida la
capacidad de la columna porque el rendimiento total de
T-20 aumentó de 10 g hasta 250-450 g
(para una columna de 20,32 cm de diámetro x 30 cm).
Puede cargarse FmocTrp(Boc)OH en
resina 2-CTC muy activa en niveles de 1,2 mmoles/g
de resina de partida o superiores. Con niveles por encima de 1,1
mmoles de FmocTrp(Boc)OH por gramo de resina de
partida (por encima de 0,72 mmoles/g en resina cargada), es difícil
obtener ensayos de ninhidrina negativos para los últimos tres
aminoácidos del fragmento. De manera similar, resulta difícil
preparar FmocAA17-26O-resina cuando
el FmocLeuO-resina está cargado más de 0,85 mmoles/g
y AcAA1-16O-resina cuando
FmocGlnOH-resina está cargado más de 0,75
mmoles/g.
Al recibir la resina del vendedor, se realiza un
ensayo de uso con aproximadamente 1 g de resina
2-CTC con cada aminoácido a cargar. El propósito del
ensayo de uso es determinar la cantidad de aminoácido a usar durante
la carga para obtener el intervalo de carga deseado. Se usan 0,8,
1,0 y 1,5 equivalentes de FmocGlnOH, 1,0, 1,2 y 1,5 equivalentes de
FmocTrp(Boc)OH y 0,8, 1,0 y 1,5 equivalentes de
FmocLeuOH con 0,5 equivalentes en exceso de DIEA para cada uno (con
relación a la actividad indicada de la resina). Si 1 mol de
FmocLeuOH no puede cargarse en 1 kg de resina 2-CTC,
no debe aceptarse la 2-CTC del vendedor.
Seguidamente hay una descripción de la carga de resina fijada como
objetivo para FmocLeuOH, FmocGlnOH y
FmocTrp(Boc)OH.
Pueden cargarse de 1,0 a 1,1 moles de FmocLeuOH
en cada kg de resina 2-CTC. Teniendo en cuenta la
pérdida de HCl, el peso seco de la resina después de cargar
FmocLeuOH debe ser de 1,32 a 1,35 veces el peso de resina de partida
y la carga medida debe ser de 0,75 a 0,81 mmoles/g.
Pueden cargarse de 0,8 a 1,0 moles de FmocGlnOH
en cada kg de resina 2-CTC. Teniendo en cuenta la
pérdida de HCl, el peso seco de la resina después de cargar
FmocGlnOH debe ser de 1,27 a 1,33 veces el peso de resina de partida
y la carga medida debe ser de 0,63 a 0,75.
Pueden cargarse de 0,9 a 1,1 moles de
FmocTrp(Boc)OH en cada kg de resina
2-CTC. Teniendo en cuenta la pérdida de HCl, el peso
seco de la resina después de cargar FmocTrp(Boc)OH
debe ser de 1,44 a 1,54 veces el peso de resina de partida y la
carga medida debe ser de 0,63 a 0,72.
Para un análisis de aumento de peso preciso, debe
determinarse la pérdida por secado (LOD) de la resina de partida. No
debe superar el 1%. Si no se separa completamente disolvente
residual (o DIEA/HCl) de la resina durante el secado (después de la
carga), la masa aislada será más alta y la carga medida más baja.
Sin embargo, los moles totales cargados (carga medida en veces de
masa) debe estar en los intervalos mencionados antes. Si se supera
el nivel de carga extremo alto (o moles totales cargados por kg de
resina de partida) para cualquiera de los aminoácidos mencionados,
en más del 10%, se efectúa un ensayo de uso usando menos aminoácido.
Esto es particularmente importante para FmocGlnOH.
El propósito de la siguiente sección es realizar
una carga a gran escala de resinas adecuadas para preparación de
altas cantidades de péptidos para síntesis de péptidos en fase
sólida (SPPS). La resina se carga con cada uno de los siguientes:
FmocTrp(Boc)OH, FmocGln(Boc)OH y
FmocLeu(Boc)OH. Cada residuo de partida se cargó en
aproximadamente 4 kg de resina 2-CTC.
| AA cargado | 2-CTC | Masa cargada | Sustitución | Moles totales |
| (kg) | (kg) | (mmoles/g)^{1} | cargados^{1} | |
| FmocTrp(Boc)OH | 3,7 | 4,493 | 0,56 | 2,52 |
| (0,56) | (2,52) | |||
| FmocLeu(Boc)OH | 2,2 | 2,436 | 1,07 | 2,6 |
| (0,647) | (1,58) | |||
| FmocGln(Boc)OH | 3,65 | 3,856 | 0,55 | 2,12 |
| (0,52) | (2,0) |
1. El primer número se calculó a partir de un
ensayo de HPLC basado en peso frente a un patrón de
Fmoc-AA. El valor entre paréntesis se calculó a
partir del aumento de peso teniendo en cuenta una LOD del 12% en la
resina 2-CTC de partida.
Se compró la resina 2-CTC de
partida de Colorado BioTech con una carga indicada de 1,4 meq./g. Se
usó el procedimiento de carga estándar, 1,5 eq. de
FmocTrp(Boc)OH, 1,7 eq. de DIEA en DCM (5 vol.),
temperatura ambiente durante 2 horas, partiendo de 3,7 kg de
2-CTC. Esto proporcionó 4,493 kg de
FmocTrp(Boc)O-resina que tenía una
carga calculada en 0,56 mmoles/g (2,52 moles totales) por el ensayo
de HPLC basado en peso de FmocTrp(Boc)OH después de
dividir de la resina. Por aumento de peso de la resina, se calcula
que la carga es 0,36 mmoles/g para un total de 1,62 moles
preparados. Sin embargo, si se tiene en cuenta la LOD del 12% en la
resina 2-CTC de partida, la carga calculada por
aumento de peso es la misma de 0,56 mmoles/g para un total de 2,52
moles, bastante insuficiente de la carga fijada como objetivo de 4
moles de FmocTrp(Boc)OH por 4 kg de resina.
Se preparó un total de 4,59 kg de
FmocLeuO-resina a partir de 3,9 kg de
2-CTC en dos pruebas usando procedimientos de carga
estándares.
Sin embargo, se obtuvo una carga sustancialmente
más baja de la que se anticipó. El primer lote tenía una carga
calculada de 1,07 mmoles/g por análisis de HPLC bajo en peso de
FmocLeuOH después de división de la resina. Esto es claramente
imposible porque la carga calculada por aumento de peso teniendo en
cuenta el 12% de LOD en la resina 2-CTC de partida
es (500 g) 0,647 mmoles/g. La carga real es probablemente próxima a
0,647 mmoles/g para un total de 1,577 moles cargados.
Un segundo lote de
FmocLeu-O-resina preparada (2,154
kg) a partir de 1,7 kg de 2-CTC tenía una carga
calculada de 0,68 mmoles/g frente a una carga de aumento de peso de
0,66 mmoles/g.
Se preparó un total de 3,856 kg de
FmocGlnO-resina en un lote simple partiendo de 3,65
kg de 2-CTC usando 0,8 eq. de FmocGlnOH y 1 eq. de
DIEA en 7 volúmenes de DMF/DCM 5/2. La sustitución calculada por
ensayo de HPLC basado en peso fue 0,55 mmoles/g para un total de
2,12 moles de FmocGlnO-resina. La carga calculada
por aumento de peso teniendo en cuenta el 12% de LOD de la resina
2-CTC de partida es 0,52 mmoles/g para un total de
2,0 moles de FmocGlnO-resina.
Generalmente, la carga por aumento de peso debe
ser mayor que o igual que la carga calculada por un ensayo de HPLC
basado en peso frente al AA cargado o fulveno separado. La
2-CTC de partida debe tener menos del 1% de LOD y el
FmocAAOresina aislado tendrá probablemente una pequeña cantidad de
NMP, sal y/o FmocAAOH
residual.
residual.
La resina de cloruro de
2-clorotritilo sensible al aire (1 eq., 3,7 kg, 5,18
moles) se añade a una cámara de SPPS y se lava con 5 volúmenes de
DCM. Se drena el disolvente y se añade una solución de
FmocTrp(Boc)OH o de FmocLeu(Boc)OH (1,5
eq.) y DIEA (1,7 eq.) en DCM (5 vol.) (nota 1). La suspensión se
agita durante 2 horas. Se drena el disolvente y los lugares activos
restantes de la resina se coronan en su extremo con MeOH:DIEA 9:1 (5
vol.) durante 30 minutos. Se drena el disolvente y se lava la resina
con 6 x 5 volúmenes de DCM. Se seca la resina hasta peso constante,
y se muestrea y analiza después para carga (nota 2). Se usa el mismo
procedimiento para cargar Fmoc
LeuOH.
LeuOH.
La resina 2-CTC sensible al aire
(3,65 kg, 1,4 mmoles/g) se carga en una cámara de SPPS de 40 l bajo
atmósfera de nitrógeno y se lava con DCM (5 vol.). Se carga un
reactor de 20 l con FmocGlnOH (1,506 kg, 0,8 eq.), DMF (5 vol.) y
DIEA (1,0 eq.). La cámara de SPPS se drena y se añade la solución de
DMF. El reactor se enjuaga con DCM (2 vol.) y el enjuague se añade a
la cámara de SPPS. Se agita la resina en la cámara de SPPS bajo
atmósfera de nitrógeno durante 2 horas y se drena. Todos los lugares
activos restantes de la resina se coronan con Metanol:DIEA 9:1 (5
vol.) durante 30 minutos. Se drena la resina, se lava con DCM (6 x 5
vol.) y se seca hasta peso constante (3,856 kg). Se muestrea la
resina y se ensaya el nivel de carga (nota 2).
- 1.
- La resina de cloruro de 2-clorotritilo es muy sensible a la humedad. El agua corona la resina y produce HCl. Mientras el disolvente esté seco, hay poca diferencia entre DCE y DCM.
\vskip1.000000\baselineskip
- 2.
- La carga de resina se determina dividiendo el Fmoc aminoácido de la resina y ensayando frente a un patrón con un análisis de HPLC p/p cuantitativo.
- Phenomenox Jupiter C18, 300 \ring{A}, Sm
- 1 ml/min, 260 nm
- A: TFA acuoso al 0,1%* B: TFA al 0,1% en acetonitrilo
- 65% de B, isocrático
- Tiempo de retención: aproximadamente 8 minutos
La determinación de la carga por aumento de peso
de la resina puede ser imprecisa porque el número de lavados usado
antes de secar la resina puede no ser suficiente para separar
completamente NMP de la resina. El cálculo es:
(Masa de
Fmoc-AA-OH-resina -
Masa de 2-CTC de partida)/Masa de
Fmoc-AA-OH-resina
(PM de AA cargado - PM HCl)
(PM de AA cargado - PM HCl)
Se observó que guardar los fragmentos de péptidos
de la presente invención durante períodos de tiempo prolongados
(días) en DCM produce una división sustancial de la resina. Por
ejemplo, durante el transcurso de la construcción de
FmocAA17-26OH, el fragmento construido parcialmente
se guardó durante el fin de semana dos veces en DCM. Se obtuvo un
rendimiento del 8% de FmocAA17-26OH después de
completar la síntesis y separación de la resina. Se sospecha que
trazas de HCl en el DCM dividían lentamente el fragmento
parcialmente construido de la resina durante el almacenamiento de
fin de semana.
Se dejó permanecer en DCM e IPA a temperatura
ambiente durante 1 semana muestras de
FmocAA17-260-resina,
AcAA1-160-resina y
FrmoAA27-350-resina. El sobrenadante
para cada uno se analizó por HPLC. Aunque no se obtuvieron
resultados cuantitativos, todos los fragmentos se dividieron de la
resina en una extensión significativa en DCM, mientras que no se
observó división en IPA. Si se necesita guardar durante unos pocos
días (más del fin de semana) fragmentos parcialmente construidos, es
mejor enjuagar los sólidos con NMP, drenar el lecho y dejarlos
permanecer saturados con NMP bajo atmósfera de nitrógeno.
Se sustituyó DCM por IPA para los lavados finales
de FmocLeuO-resina, FmocGlnO-resina,
FmocTrp(Boc)O-resina,
FmocAA17-260-resina,
AcAA1-160-resina y
FrmoAA27-350-resina. Los
FmocLeuO-resina, FmocGlnO-resina y
FmocTrp(Boc)O-resina saturados de IPA
se secaron a 40ºC. Los
FmocAA17-260-resina,
AcAA1-160-resina y
FrmoAA27-350-resina se construyeron
a partir de las resinas cargadas, que se secaron a 4ºC. Tras
completarse la síntesis, los fragmentos unidos a resina se lavaron
con DCM seguido por IPA. Los fragmentos unidos a resina saturados de
IPA se dividieron y secaron a temperatura ambiente y a 40ºC. Los
fragmentos se dividieron de la resina y se analizaron por HPLC. No
se observaron diferencias en la pureza de los fragmentos. El secado
de los fragmentos unidos a resina saturados de IPA a 40ºC no tiene
consecuencias en la calidad o cantidad del fragmento aislado.
Se examinó la SPPS de los fragmentos en DMF en
oposición a NMP/DCM (1 g de resina se hincha hasta 5 ml en ambos
sistemas de disolventes). El fragmento FmocAA27-35OH
se sintetizó usando DMF como disolvente y TBTU frente a HBTU como
reactivo de acoplamiento. El FmocAA27-35OH se aisló
con un 77% de rendimiento y una pureza del 89,5%.
El protocolo de elaboración para los fragmentos
FmocAA17-36NH_{2} y
AcAA1-36NH_{2} separa los fragmentos no acoplados.
La acetilación (coronación de extremos) de estos fragmentos en
lugares de supresión durante la síntesis en fase sólida asegura que
los fragmentos de supresión no se acoplan en los acoplamientos en
fase solución. Los fragmentos no acoplados en la síntesis de
FmocAA17-36NH_{2} y
AcAA1-36NH_{2} deben separarse en las
elaboraciones con IPA y ACN.
La preparación a gran escala por SPPS de
fragmento AcAA1-16OH se realizó en dos pruebas
produciendo un total de 7,941 kg de fragmento unido a resina a
partir de 3,53 kg de FmocGlnOH-resina. El valor de
carga para el FmocGlnOH-resina de partida en ambas
pruebas fue el valor algo sobrestimado de 0,55 mmoles/g obtenido de
un ensayo de HPLC basado en peso en lugar del más preciso 0,52
mmoles/g obtenido por aumento de peso teniendo en cuenta 12% de LOD
en la 2-CTC de partida. Además de tener la carga de
resina más baja de la deseada, se usó durante la SPPS un exceso del
6% de cada aminoácido.
La SPPS usó 2,5 equivalentes del primero
FmocGln(trt)OH en la resina, y 1,7 equivalentes de
cada uno de los aminoácidos subsiguientes en el fragmento (con
relación a la carga de 0,55 mmoles/g). Las reacciones de
acoplamiento se efectuaron en 8 volúmenes de NMP:DCM 3:1 y todas
salvo dos de los 32 reacciones de acoplamiento (acetilación
incluida) llegaron a completarse en 2 horas. Todos los lavados se
hicieron con 5 volúmenes de NMP.
El fragmento unido a resina se lava con 5 a 6
veces en 3,4 volúmenes (con relación al peso del
AcAA1-16O-resina seco) de TFA al
1%/DCM a 0-5ºC, 5 minutos por lavado. Cada lavado se
recoge en 1,36 volúmenes de NaHCO_{3} ac. 0,33 M para neutralizar
el TFA. Se combinan los lavados trifásicos y se añade agua (2 vol.).
El DCM se separa por destilación dejando un precipitado filtrable en
el bicarbonato sódico acuoso. Durante el transcurso de la
destilación, la suspensión multifásica se hace viscosa y cremosa
antes de colapsar en una suspensión filtrable cuando se separa lo
último del DCM. Se enfría la suspensión a 0-5ºC y se
ajusta el pH en 3,0 con HCl 0,1 N. Se agita la suspensión a
0-5ºC durante 1-2 horas, se recoge
por filtración, se lava y se seca. En las pruebas restantes se
recogieron los sólidos, se devolvieron al reactor y se trituraron
con agua durante 1-2 horas, se recogieron después y
secaron.
La división de AcAA1-16OH de la
resina se consiguió en cuatro pruebas usando TFA al 1% en DCM. Se
produjo un total de 4,814 kg de AcAA1-16OH a partir
de 3,53 kg de FmocGln-resina del
93-96% de pureza. El rendimiento global basado en la
carga de 0,52 mmoles/g determinada por aumento de peso teniendo en
cuenta el 12% de LOD de la 2-CTC de partida (5,83 kg
teóricos) es 83%.
La sal sódica de AcAA1-16OH es
insoluble en DMF y NMP, por tanto, es necesario el ajuste de pH para
protonar el término carboxilo. El lavado con agua asegura la
separación del trifluoroacetato sódico del producto. Una cantidad
muy
pequeña de trifluoroacetato sódico en base p/p interferirá con el acoplamiento en fase solución con HAA17-36NH_{2}.
pequeña de trifluoroacetato sódico en base p/p interferirá con el acoplamiento en fase solución con HAA17-36NH_{2}.
Este fragmento debe secarse a temperatura
ambiente. Un estudio de estabilidad examinando el secado de
AcAA1-16OH húmedo a 40ºC mostró una degradación de
aproximadamente el 4% en 3 días. De modo interesante, el sólido seco
es estable a 80ºC durante 24 horas.
Se añade a una cámara de péptidos de 40 l el
FmocGlnOH unido a resina (1,53 kg, 0,55 mmoles/g, 0,84 moles). La
resina se acondiciona con DCM (5 vol.) bajo nitrógeno con agitación
durante 15 minutos y se drena después. Se añade una solución de
piperidina al 20% en NMP (5 vol.) y la suspensión se agita bajo
nitrógeno durante 20 minutos. Se drena la solución y se repite el
procedimiento. Se lava la resina 5 veces con 5 volúmenes de NMP para
separar dibenzofulveno y piperidina como se determina por un ensayo
de cloranilo (nota 1).
Mientras la resina se está limpiando de
piperidina, el aminoácido subsiguiente de la secuencia (1,5 eq.),
HOBT (1,5 eq.) y DIEA (1,5 eq.) se combinan en NMP
(6-7 vol.) y se enfrían a 0ºC. Se añade a la
solución fría HBTU (1,5 eq.) y se agita la solución durante
10-15 minutos para disolver el HBTU. La solución
enfriada de aminoácido activado se añade a la resina, seguido por un
enjuague con DCM (2,5 vol.) (nota 2). Se agita la suspensión bajo
purga de nitrógeno durante 2 horas, y se separa después una muestra
de la resina para un ensayo de ninhidrina cualitativo (nota 3). Si
el ensayo de ninhidrina es negativo, se drena el recipiente, se lava
con 3 veces 5 volúmenes de NMP (nota 4) y se repite el ciclo con el
siguiente aminoácido de la secuencia. Si el ensayo es positivo, se
agita la suspensión durante una hora más y se vuelve a ensayar. Si
la ninhidrina es negativa, se procede al siguiente ciclo. Si la
ninhidrina permanece positiva, se reacopla con un eq. del aminoácido
y reactivos. Si la ninhidrina es positiva después de una hora, se
coronan extremos con Seq de anhídrido acético y Seq de piridina en
NMP (10 vol.) durante una hora.
Cuando se completa la síntesis de fragmentos, se
separa el Fmoc del último aminoácido como se ha descrito y se agita
la resina en una solución de anhídrido acético y piridina (5 eq.
cada uno) en NMP:DCM 3:1 (10 vol.) durante 20-30
minutos o hasta obtener un ensayo de ninhidrina negativo. Se drena
la resina, se lava con 2 x 5 volúmenes de NMP, 5 veces con 5
volúmenes de DCM y se seca produciendo 3,49 kg de
AcAA1-16O-resina.
La cámara de SPPS de 40 l se carga con el
AcAA1-16 unido a resina, secado (3,49 kg). El
péptido unido a resina se divide de la resina usando 6 x 3,4
volúmenes de TFA al 1%/DCM (nota 7). Cada lavado de división se
recoge en 1,36 volúmenes de bicarbonato sódico ac. 0,33 M. Las
fracciones bifásicas se combinan y diluyen con 2 volúmenes de agua.
La mezcla bifásica se concentra bajo presión reducida (381 mmHg,
20ºC) para separar DCM. Se añade agua adicional (2 volúmenes)
durante la destilación según se necesite para mantener la agitación
(nota 6). Cuando se separa el DCM (varias horas), se enfría la
suspensión a 0ºC y se ajusta el pH en 3 con HCl ac. 1 N. La
suspensión se agita a 0ºC durante 1 h y se recoge. El sólido todavía
húmedo se devuelve al recipiente de reacción y se tritura con agua
(7 volúmenes) para separar TFA y trifluoroacetato sódico residuales.
Los sólidos se recogen por filtración bajo vacío y se secan hasta
peso constante (1,12 kg, 95%). El rendimiento de
AcAA1-16OH en base a una carga de 0,52 mmoles/g es
del 86% (nota 7).
- 1.
- A aproximadamente 1 ml de acetona se añade 1 gota de una solución saturada de cloranilo en tolueno, seguido por una gota de efluente. Un color azul o violeta es una indicación positiva de la presencia de una piperidina. A medida que aumenta la altura del lecho, se necesitarán volúmenes mayores de NMP para lavar la piperidina.
- 2.
- Se añade DCM para asegurar una hinchazón adecuada de la resina.
- 3.
- Es adecuado un ensayo de ninhidrina cuantitativo para comprobar la eficacia de acoplamiento. Se retira una muestra de 2-20 mg de la resina y se limpia lavando con metanol. Se añaden a la muestra 3 gotas de fenol al 76% en etanol, 4 gotas de KCN 0,2 mM en piridina y 3 gotas de ninhidrina 0,28 M en etanol. La solución se diluye hasta 0,5-1 ml con etanol y se pone en un bloque de calor a 75ºC durante 5-10 minutos. Un color azul o violeta indica aminas libres (positivo). Transparente o azul pálido es un resultado negativo. Protocol for Quantitative Ninhydrin Test References: Serin, V.K., Kent, S.B.H., Tam, J.P. & Merrifield, R.B. (1981) Analytical Biochem. iii, 147-157.
- 4.
- Si la resina ha de guardarse durante la noche, se lava con 2 veces 5 volúmenes de NMP, se drena y se guarda bajo nitrógeno. No guardar bajo DCM. Esto puede producir división del péptido de la resina y una pérdida de masa sustancial.
- 5.
- Se ensaya en cada fracción el contenido de producto por visualización de TLC a 254 nm. La mayoría del producto se separa en los primeros 5 lavados.
- 6.
- A medida que se separa el DCM, la reacción adquiere la consistencia de crema blanda. Según continúa la destilación, la suspensión se vuelve gradualmente una suspensión sólida. Es importante separar el DCM lentamente para evitar salida de aceite del producto.
- 7.
- Vydac C8, 5 \mu, 300 \ring{A}
- 1 ml/min, 30ºC, 230 nm
- A agua/TFA 1000:1
- B IPA:ACN:TFA 800:200:1
- 60-95% de B/30 min
- Tiempo de retención; 13,1 minutos
Se preparó un total de 5,3 kg de
FmocAA17-26O-resina a partir de 2,4
kg de FmocLeu-resina en dos pruebas de igual tamaño.
Los 5,3 kg de FmocLeu-resina se dividieron de la
resina en cuatro pruebas de igual tamaño produciendo 3,184 kg de
FmocAA17-26OH que promediaban 94,4% de pureza y 90%
de rendimiento.
Las reacciones se realizaron usando 1,5
equivalentes de cada aminoácido con relación al factor de carga,
produciendo el uso de un exceso del 65% de aminoácido para cada
ciclo de acoplamiento. Todas las reacciones de acoplamiento fueron
completas (ensayo de ninhidrina negativo) en 2 horas.
El grupo protector Fmoc se separó con piperidina
al 20% en NMP (5 volúmenes) durante 20 minutos y se repitió. La
piperidina se lavó de la resina con lavados de NMP de 5 x 5
volúmenes. Las reacciones de acoplamiento se realizaron en 8
volúmenes de NMP:DCM 3:1. Se drenó la solución de acoplamiento y se
limpiaron los sólidos con tres lavados de NMP de 5 volúmenes. Se
repitió el ciclo con el siguiente aminoácido de la secuencia. Al
completarse el fragmento, el lecho de resina se lavó con 2 x 5
volúmenes de NMP y 5 x 5 volúmenes de DCM, y se secó hasta
peso
constante.
constante.
Se usaron varios lavados de TFA al 1% en DCM para
separar el fragmento de la resina. No es necesario el enfriamiento
de la solución de TFA al 1% en DCM porque la estabilidad de este
fragmento en TFA al 1%/DCM (1%/día) es mucho mayor que
AcAA1-16OH. Como contienen producto, se recogen
lavados de DCM ácidos y se neutralizan con piridina. Los lavados
combinados se destilan para separar DCM y se añade etanol para
mantener una solución así como para sacar el DCM restante durante la
destilación. Después de separar el DCM (determinado por un aumento
de la temperatura del destilado que se separa), se añade agua para
precipitar el fragmento. Se recogió el sólido por filtración bajo
vacío (menos de 60 minutos). El sólido todavía húmedo se transfirió
de vuelta al reactor y se trituró con etanol/agua 80/20 (5 vol.) a
0-5ºC durante 60 minutos. El
FmocAA17-26OH precipitado se recogió por filtración
bajo vacío, se lavó con una cantidad mínima de etanol/agua 80/20 y
se secó (vacío, sin calor, 10 días).
Una cámara de SPPS de 40 l se carga con
FmocLeuO-resina (1,2 kg, 0,776 moles) seguido por
DCM (5 vol.) para hinchar la resina. El DCM es necesario para
asegurar una hinchazón completa de la resina de partida secada. Se
agita la suspensión durante 20-30 minutos y se
drena. Se añade una solución de piperidina al 20% en NMP (5 vol.) y
se agita la solución durante 20 minutos. Se drena el disolvente y se
repite el procedimiento. Se drena el disolvente y el lecho de resina
se lava con 5 x 5 volúmenes de NMP para separar piperidina (nota
1).
Mientras se desprotege, un matraz de fondo
redondo de 20 l con agitador mecánico se carga con el siguiente
aminoácido de la secuencia (1,95 eq.), HOBT (1,95 eq.), DIEA (1,95
eq.) y NMP (6 vol.). Se agita la solución hasta disolver los
sólidos, se enfría después a 0-5ºC y se añade HBTU
(1,95 eq.). Se agita la solución hasta disolverse el HBTU o
liberarse la resina de piperidina (cualquiera que sea primero) y se
añade después a la resina. Se lava el reactor con DCM (2 vol.) y
esto se transfiere al reactor de SPPS. Nota: la estequiometría de
aminoácido y reactivos debe ser 1,5 equivalentes.
Se suspende la resina en solución de acoplamiento
con agitación suave. Después de dos horas, se retira una muestra de
resina de la cámara de SPPS y se realiza un ensayo de ninhidrina
cualitativo (nota 2). Si el ensayo de ninhidrina es negativo, se
drena el recipiente, se lava con 3 veces 5 volúmenes de NMP y se
repite el ciclo con el siguiente aminoácido de la secuencia (la
hinchazón con DCM se usa sólo para el primer aminoácido
cargado).
Si el ensayo es positivo, se agita la suspensión
durante una hora más y se vuelve a ensayar. Si el ninhidrina es
negativo, se procede al siguiente ciclo. Si el ninhidrina permanece
positivo, se reacopla con un eq. del aminoácido y reactivos. Si el
ninhidrina es positivo después de una hora, se coronan extremos con
5 eq. de anhídrido acético y 5 eq. de piridina en NMP (10 vol.)
durante una hora.
Al completarse la síntesis del fragmento, la
resina se drena, se lava con 2 x 5 volúmenes de NMP y 5 x 5
volúmenes de DCM, y se seca produciendo 2,67 kg de
FmocAA17-26O-resina.
Se divide FmocAA17-26OH de la
resina (1,33 kg) usando 5-6 x 1,7 volúmenes de TFA
al 1% en DCM, 5 minutos cada vez. Los lavados con TFA al 1%/DCM se
recogen en un matraz que contiene piridina (relación en volumen 1:1
con el TFA en el lavado). Los lavados que contienen producto se
combinan (aproximadamente 14 l) y se separa el DCM por destilación
hasta un volumen contenido mínimo (aproximadamente un tercio del
volumen original). Se ajusta el vacío para mantener una temperatura
del recipiente de 15-25ºC. Se añade etanol (6,5
vol.) y se continúa la destilación hasta separar el DCM (determinado
por la temperatura del destilado, nota 3). Se ajusta de nuevo el
vacío para mantener una temperatura del recipiente de
15-20ºC. El volumen contenido final debe ser
aproximadamente 8-10 volúmenes. Se enfría la
solución a 5-10ºC y se añade agua (6,5 vol.) durante
30 minutos para precipitar el FmocAA17-26OH. El
sólido se recoge por filtración bajo vacío y se lava con agua
(2-3 vol.). Para separar piridina y/o sales
residuales, el sólido todavía húmedo se carga de vuelta al reactor
y se añade etanol/agua 80/20 (5 vol.), preenfriado a 0ºC. Se agita
la suspensión a 0ºC durante 60 minutos, se recogen los sólidos por
filtración bajo vacío, se lavan con una cantidad mínima de
etanol/agua 80/20 y se secan hasta peso constante para dar 0,806 kg
de FmocAA17-26OH con un rendimiento del 90,6% y una
pureza del 96% (nota 4).
- 1.
- A 1 ml de acetona se añade 1 gota de una solución saturada de cloranilo en tolueno, seguido por 1 gota de efluente. Un color azul o violeta indica la presencia de piperidina.
- 2.
- Es adecuado un ensayo de ninhidrina cuantitativo para comprobar la eficacia de acoplamiento. Se retira una muestra de 2-20 mg de la resina y se limpia lavando con metanol. Se añaden a la muestra 3 gotas de fenol al 76% en etanol, 4 gotas de KCN 0,2 mM en piridina y 3 gotas de ninhidrina 0,28 M en etanol. La solución se diluye hasta 0,5-1 ml con etanol y se pone en un bloque de calor a 75ºC durante 5-10 minutos. Un color azul o violeta indica aminas libres (positivo). Transparente o azul pálido es un resultado negativo.
- 3.
- La temperatura de cabeza durante la destilación bajo vacío de DCM fue 10-15ºC. La temperatura de cabeza subió hasta 35ºC cuando se separó el DCM.
- 4.
- Vydac, C8, 5 \mu, 300 \ring{A}
- 1 ml/min, 262 nm, 30ºC,
- A agua/TFA al 0,1%
- B ACN/TFA al 0,1%
- 80-99% de B/20 min
- Tiempo de retención; 15,2 minutos
Se sintetizó un total de 4,694 kg de
FmocAA27-35OH a partir de 4,45 kg de
FmocTrp(Boc)O-resina. La síntesis en
fase sólida se realizó en dos lotes y la división de la resina fue
en cuatro lotes. El FmocAA27-35OH resultante de un
lote era aproximadamente 5% menos puro que el material del otro
lote. Esto es debido a una impureza del 5% no identificada que se
separó elaborando a FmocAA17-36NH_{2}. La cantidad
total de FmocTrp(Boc)OH cargado en la resina fue 2,5
moles. La síntesis en fase sólida transcurrió como se esperaba para
resina cargada en aproximadamente el 63% de capacidad. Todos los
acoplamientos fueron completos en el primer punto de control de 2
horas. La volúmenes de reacción y enjuagues usados para la SPPS y la
división fueron los mismos que los usados en la síntesis de
FmocAA17-26OH. La división de la resina fue como se
ha descrito antes. La filtración fue rápida (15 min). El secado del
sólido después de la trituración con etanol/agua 90/10 llevó 3 días
(vació, sin calor). El fragmento es estable al secado a 40ºC.
Se carga DCM (5 vol.) a una cámara de SPPS que
contenía FmocTrp(Boc)-resina (1 eq., 2,2 kg,
1,23 moles). Se agita la suspensión durante 15 minutos y se drena.
Se añade una solución de piperidina al 20% en NMP (5 volúmenes) y se
agita la suspensión durante 10-15 minutos para
separar el grupo protector Fmoc. Este procedimiento se repite y la
resina se lava con 5-7 x NMP (5 vol.) hasta un
ensayo de cloranilo negativo (nota 1).
El aminoácido subsiguiente (1,5 eq.), HOBT (1,5
eq.) y DIEA (1,7 eq.) se combinan en NMP (6 vol.), y se enfría
después a 0-5ºC (nota 2). Se añade HBTU y se agita
la solución durante 10-15 minutos hasta disolver. La
solución de aminoácido activado se añade a la resina. Se usa DCM (2
vol.) para lavar el reactor y se añade después a la resina (nota 3).
La suspensión se agita bajo atmósfera de nitrógeno durante
1-2 horas. Se comprueba que se completa el
acoplamiento con un ensayo de ninhidrina cualitativo (nota 4). Si el
ensayo de ninhidrina es negativo, se drena el recipiente, se lava 3
veces con 5 vol. de NMP y se repite el ciclo con el siguiente
aminoácido de la secuencia (la hinchazón con DCM se usa sólo para el
primer aminoácido cargado).
Si el ensayo es positivo, se agita la suspensión
durante una hora más y se vuelve a ensayar. Si el ninhidrina es
negativo, se procede al siguiente ciclo. Si el ninhidrina permanece
positivo, se reacopla con un eq. del aminoácido y reactivos. Si el
ninhidrina es positivo después de una hora, se coronan extremos con
5 eq. de anhídrido acético y 5 eq. de piridina en NMP (10 vol.)
durante una hora.
Al completarse la síntesis del fragmento, la
resina se drena, se lava con 2 x 5 volúmenes de NMP y 5 x 5
volúmenes de DCM, y se seca produciendo 4,11 kg de
FmocAA27-35O-resina.
Se divide el fragmento de la resina (2,05 kg)
usando 6 x 1,7 volúmenes de TFA al 1% en DCM, 5 minutos cada vez.
Los lavados con TFA al 1%/DCM se recogen en un matraz que contiene
piridina (relación en volumen 1:1 con el TFA en el lavado). Los
lavados que contienen producto se combinan y se separa el DCM por
destilación (vacío ajustado para mantener una temperatura del
recipiente de aproximadamente 15ºC) hasta aproximadamente la mitad
del volumen contenido original. Se introduce gradualmente etanol 5
vol.) y se continúa la destilación (vacío ajustado para mantener una
temperatura del recipiente de aproximadamente 20ºC) hasta separar
el DCM (determinado por la temperatura del destilado, nota 5). El
volumen contenido debe ser 6-7 volúmenes. Se enfría
la solución turbia a 10-15ºC y se añade agua (3,5
vol.) durante 30 minutos con agitación rápida para precipitar el
FmocAA27-35OH. Los sólidos se recoge por filtración
bajo vacío (15 minutos) y se lavan con agua (1 vol.). Para separar
piridina residual, el sólido húmedo se devuelve al reactor y se
añade etanol/agua 90/10 preenfriado a 0-5ºC (10
vol). Se agita la suspensión a 0-5ºC durante 60
minutos, se recoge el sólido por filtración bajo vacío, se lava con
etanol/agua 90/10 (0,5 vol.) y se seca hasta peso constante dando
1,19 kg de FmocAA27-35OH con un rendimiento del 89%
y una pureza del 89,2% (nota 6).
Este protocolo puede elaborarse triturando el
sólido con 15 volúmenes de etanol/agua 9:1 con agitación durante 12
horas, seguido por recogida y secado.
- 1.
- A 1 ml de acetona se añade 1 gota de una solución saturada de cloranilo en tolueno, seguido por 1 gota de efluente. Un color azul o violeta indica la presencia de piperidina.
- 2.
- Se añaden los reactivos menos HBTU a temperatura ambiente para ayudar a la disolución. Se añade HBTU a la solución enfriada para minimizar la racemización.
- 3.
- La activación se realiza en NMP porque HBTU no es soluble en DCM. Se usa DCM para lavar el reactor y se añade a la resina para mantener una hinchazón de resina adecuada.
- 4.
- Es adecuado un ensayo de ninhidrina cuantitativo para comprobar la eficacia de acoplamiento. Se retira una muestra de 2-20 mg de la resina y se limpia lavando con metanol. Se añaden a la muestra 3 gotas de fenol al 76% en etanol, 4 gotas de KCN 0,2 mM en piridina y 3 gotas de ninhidrina 0,28 M en etanol. La solución se diluye hasta 0,5-1 ml con etanol y se pone en un bloque de calor a 75ºC durante 5-10 minutos. Un color azul o violeta indica aminas libres (positivo). Transparente o azul pálido es un resultado negativo.
- 5.
- La temperatura de cabeza durante la destilación bajo vacío de DCM fue 10-15ºC. La temperatura de cabeza subió hasta 35ºC cuando se separó el DCM.
- 6.
- Vydac, C8, 5 \mu, 300 \ring{A}
- 1 ml/min, 262 nm, 30ºC,
- A agua/TFA al 0,1%
- B ACN/TFA al 0,1%
- 80-99% de B/20 min
- Tiempo de retención; 15,3 minutos
Se preparó un total de 5,226 kg de
FmocAA27-36NH_{2} en cuatro pruebas a partir de
4,676 kg de FmocAA27-35OH. Los reactivos de
acoplamiento o el disolvente justifican el mayor, por tanto
rendimiento 100%. Estos se separan en la siguiente fase.
Se citó la adherencia de sólidos a la pared del
reactor después del goteo de agua como un problema significativo en
esta fase. El aislamiento del sólido crudo por filtración bajo vacío
duró 30 minutos. El tiempo de secado medio (vacío, sin calor) para
las pruebas fue 8 días. El sólido necesita comprimirse en el filtro
para separar agua en exceso antes de ir al horno. El fragmento es
estable al secado a 40ºC y no necesitan calentarse los hornos de
vacío.
Se hace un ensayo de uso en una escala de 0,5 a 1
gramos con la partida/lote de materiales de partida a usar para
ayudar a establecer calidad e identidad. Se usan cromatografía de
capa fina (TLC) y HPLC para comprobar la conversión de material de
partida a producto. La impureza principal a observar en el fragmento
FmocAA27-35OH es ácido trifluoroacético (o una sal
de él). La activación y reacción de ácido trifluoroacético presente
en el FmocAA27-35OH con la amida de fenilalanina es
un procedimiento rápido. Puede usarse un pequeño exceso de amida de
fenilalanina para consumir todo ácido trifluoroacético presente. Una
cuestión de calidad más significativa es con la amida de
fenilalanina comprada. Muchos vendedores venden ésta como la sal de
HCl. Varios lotes de la sal de HCl de amida de fenilalanina han
producido una impureza (5-15%) que concluye con el
material de partida en HPLC. La impureza puede separarse del
fragmento de partida y el producto por TLC. La impureza es
FmocAA27-35NH_{2} resultante del cloruro a, único
presente en la sal de HCl de amida de fenilalanina.
Se carga un reactor encamisado de 40 l con un
agitador mecánico con FmocAA27-35OH (1 eq., 1,185
kg), HOAT (1,1 eq.), HCl.HPheNH_{2} (1,15 eq.) y DMF (12,5 vol.).
Se añade DIEA (2,1 eq.), la solución se enfría a
0-5ºC y se añade HBTU (1,2 eq.). La mezcla de
reacción se agita durante 15 minutos a 0-5ºC, se
calienta después a temperatura ambiente y se agita 70 minutos más
(nota 1, HPLC usado para control del procedimiento dentro). Después
de juzgarse la reacción completa por HPLC, se añade agua (12,5 vol.)
durante 15-30 minutos para precipitar el péptido. La
suspensión se agita durante 15 minutos a temperatura ambiente. Los
sólidos se recogen por filtración bajo vacío, se lavan con agua (3
vol.) y se secan para dar FmocAA27-36NH_{2} (1,357
kg con un rendimiento del 107% y una pureza del 87,1% por HPLC (nota
2).
La reacción puede reelaborarse por trituración
del sólido con 15 volúmenes de acetonitrilo/agua 9:1 con agitación
durante 12 horas, recogida y secado.
- 1.
- Control del procedimiento dentro, TLC:
- diclorometano/metanol 88/12
- UV, detección de yodo
- Rf: FmocAA27-35OH, 0,49
- Rf: FmocAA27-36NH_{2}, 0,63
- VydacC8, 5 \mu, 300 \ring{A}
- 30ºC, 1 ml/min, 262 nm
- A H_{2}O/TFA al 0,1%
- B ACN/TFA al 0,15%
- 80-99% de B/20 min
- Tiempo de retención: FmocAA27-35OH, 15,8
- Tiempo de retención: FmocAA27-36NH_{2}, 17,12
\vskip1.000000\baselineskip
- 2.
- Se obtiene generalmente un rendimiento mayor que el teórico salvo que el sólido aislado se devuelva al reactor y se triture con agua.
Se preparó un total de 3,897 kg de
HAA27-36NH_{2} a partir de 5,221 kg de
FmocAA27-36NH_{2} en cuatro pruebas con un
rendimiento medio de 2 etapas del 86,4%. El intervalo de rendimiento
observado para las pruebas, 74-97%, refleja
presumiblemente suma de una prueba a la siguiente.
La elaboración y aislamiento de producto en esta
fase funciona muy bien. Se aumenta la pureza del producto si se deja
la cantidad correcta de DCM en el MTBE, y las propiedades físicas
del sólido conducen a una filtración y secado rápidos. Este
procedimiento de aislamiento del producto se ha incorporado a la
nueva fase descrita en la siguiente Sección 11.6.2.
DCM es el disolvente usado durante la
desprotección de FmocAA27-36NH_{2}. Al completarse
la desprotección, la solución orgánica se lava con agua dos veces
para separar buena parte de la piperidina en exceso, y se concentra
después hasta aproximadamente un tercio del volumen original. Se
añade MTBE para precipitar el fragmento. Se continúa la destilación
para separar la mayoría del DCM restante y completar la
precipitación del fragmento. Es importante separar buena parte del
DCM para evitar pérdida de masa en la precipitación. También es
importante dejar algo de DCM en el MTBE para asegurar la limpieza
del producto. Dibenzofulveno, aducto de piperidina/fulveno y
piperidina residual son solubles en MTBE. El
HAA27-36NH_{2} se recoge y seca. Si es necesario,
una segunda trituración del sólido (12 horas) con MTBE separará
dibenzofulveno residual y lo que es más importante el aducto de
piperidina/fulveno que pueda estar presente en el
HAA27-36NH_{2}. Una trituración con hexano
separará dibenzofulveno, pero no el aducto de piperidina/fulveno.
El tiempo de secado del sólido aislado de MTBE es 1 día.
\newpage
Debido a la alta solubilidad de
HAA27-36NH_{2} e impurezas relacionadas en
DCM/MTBE, se deseaba un método analítico para determinar con
precisión el punto final del intercambio de disolvente. Se ha
desarrollado un método de GC para ensayar DCM en MTBE. La
destilación es completa cuando el contenido de DCM en el MTBE es
inferior
\hbox{al 6%.}
Se carga un reactor encamisado de vidrio de 40 l
con un agitador mecánico y termómetro con
FmocAA27-36NH_{2} (1 eq., 1,356 kg), DCM (5 vol.)
y piperidina (0,2 vol.). Se agita la solución a temperatura ambiente
durante 1,5 horas (nota 1). La solución orgánica se lava con agua (2
x 5 vol.). El volumen de la capa orgánica se reduce a
aproximadamente un tercio del volumen original por destilación
(aproximadamente 25 mmHg, temperatura de la camisa menor de 45ºC
para evitar la fusión del sólido). Se introduce gradualmente MTBE (5
vol.) en el recipiente de reacción mientras continúa la
concentración hasta un punto de precipitación considerable y el
volumen contenido es aproximadamente 5 volúmenes. Se detiene el
intercambio de disolvente cuando el contenido de DCM es inferior al
6%. Se enfría la suspensión a 0-5ºC, se agita
durante 60 minutos y se recoge después por filtración bajo vacío
(rápida). Los sólidos se lavan con MTBE (2 x 0,5 vol.) y se secan
hasta peso constante para dar 1,022 kg de
HAA27-36NH_{2} con un rendimiento del 89,2% (2
etapas) y una pureza del 91% (nota 1).
La reacción puede reelaborarse por trituración
con MTBE (12,5 vol.) a 23ºC durante 13 horas, recogida por
filtración bajo vacío y secado.
- 1.
- IPC y pureza medida por HPLC:
- VydacC8, 5 \mu, 300 \ring{A}
- 1 ml/min, 262 nm, 30ºC*
- A agua/TFA al 0,1%
- B ACN/TFA al 0,1%
- 80-99% de B/20 minutos
- Tiempo de retención: FmocAA27-36NH_{2}, 16,5. HAA27-36NH_{2}, 8,4
Se ha desarrollado un nuevo procedimiento que
combina las Secciones 11.5 a 11.6.1, que toma
FmocAA25-35OH a HAA27-36NH_{2}
directamente. Este nuevo procedimiento elimina problemas asociados
con el aislamiento de FmocAA27-36NH_{2} y un
tiempo de secado largo. Se da seguidamente una descripción
detallada. El nuevo procedimiento elimina un tiempo de secado largo
y una fase de la vía sintética.
Se añaden FmocAA27-35OH (5,0 g, 1
eq.), HOAT (0,459 g, 1,2 eq.) y Phe-NH_{2} (0,389
g, 1,2 eq.) a un matraz de fondo redondo de 100 ml equipado con un
agitador magnético y una entrada de nitrógeno. Se añaden al matraz
10 volúmenes de NMP (50 ml) y DIEA (0,45 g, 1,5 eq.) y se agita bajo
atmósfera de nitrógeno hasta disolverse los sólidos. Se enfría la
solución entre 0 y 5ºC y se añade después HBTU (1,04 g, 1,2 eq.). Se
agita bajo atmósfera de nitrógeno entre 0 y 5ºC durante 30 minutos.
Se calienta la mezcla de reacción a 20ºC y se continúa agitando. Se
realiza un control del procedimiento dentro (IPC) 90 minutos después
de añadir el HBTU (nota 1).
Después de que el control del procedimiento
dentro (IPC) muestra que es completa la reacción, se añade
piperidina (1,379 g, 7 eq.) a la mezcla de reacción y se agita bajo
atmósfera de nitrógeno durante 1,5 horas. Se realiza un IPC (nota
1). Si la separación de Fmoc no es completa, se agita 30 minutos más
y se realiza el IPC.
Cuando se completa, se añade la mezcla de
reacción a ácido acético acuoso al 5% a una velocidad que no se
supere una temperatura de 35ºC (30 vol.). Se agita la suspensión
resultante durante 1 a 2 horas y se recoge por filtración bajo vacío
(nota 2). Se lava el sólido con 10 volúmenes (50 ml) de agua.
Se devuelve el sólido húmedo al reactor, se
añaden 20 volúmenes de agua (100 ml) y se agita a temperatura
ambiente durante 1 a 2 horas. Se recogen los sólidos por filtración
bajo vacío, se lavan con 10 volúmenes de agua (50 ml) y se
secan.
El sólido secado (nota 4) se tritura con MTBE (20
vol.) a temperatura ambiente durante 2 a 5 horas para separar
dibenzofulveno y aducto de
dibenzofulveno-piperidina. Se recoge el sólido por
filtración bajo vacío y se seca hasta peso constante produciendo
4,55 gramos (94,3%) de HAA27-36NH_{2} con una
pureza del 85-90% (nota 1).
\newpage
Los subproductos de Fmoc (dibenzofulveno y su
aducto con piperidina) se separan generalmente en este protocolo; no
obstante, si es necesaria una reelaboración, se agita el sólido en
10 volúmenes de MTBE a 20ºC durante 2 a 3 horas, se recoge y se
seca.
- 1.
- Control del procedimiento dentro (IPC) por HPLC de fase inversa:
- Columna Vydac C8, 300 \ring{A}, 5 \mu, 30ºC
- Caudal 1 ml/min
- Detección UV a 262 nm
| Fase móvil | A. Agua/TFA al 0,1% | |
| B Acetonitrilo/TFA al 0,1% |
- Método 80 a 99% de B durante 20 minutos
- Tiempos de retención
- FmocAA27-36NH_{2}, (16,5 min.) HAA27-36NH_{2} (8,4 min)
\vskip1.000000\baselineskip
- 2.
- El tiempo de filtración total fue 10 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
- 3.
- La torta del filtro húmeda debe devolverse al reactor para un lavado con agua inmediatamente a fin de evitar el aceitado o engomado de los sólidos.
\vskip1.000000\baselineskip
- 4.
- El producto crudo debe secarse completamente para asegurar que la trituración con MTBE separará los subproductos de dibenzofulveno.
Se preparó un total de 5,115 kg de
FmocAA17-36NH_{2} a partir de 2,993 kg de
HAA27-36NH_{2} y 3,176 kg de
FmocAA17-26OH en cuatro pruebas. El rendimiento
medio fue 84,3%. La filtración del sólido crudo después del goteo de
agua de la mezcla de reacción duró una media de
40-50 minutos.
Se hace un ensayo de uso en una escala de
1-2 g, ensayando ambos fragmentos y el HBTU a usar
antes de realizar la reacción de acoplamiento. La estequiometría de
los materiales de partida y reactivos se determina a partir del
ensayo de uso. Se anota también en el ensayo de uso la solubilidad
de los materiales de partida. Una solución turbia puede indicar la
presencia de sales en FmocAA17-26OH y justificar un
lavado con agua en el fragmento. Es imperativo que todos los
componentes de la mezcla de reacción estén claramente en solución
antes de añadir el HBTU para asegurar una conversión completa de los
materiales de partida a producto con racemización y formación de
subproductos mínima.
La pureza de FmocAA17-36NH_{2}
crudo aislado del goteo de agua se aumenta significativamente por
precipitación en IPA. El FmocAA17-36NH_{2} es
parcialmente soluble en IPA. La trituración de
FmocAA17-36NH_{2} con aproximadamente 15 volúmenes
de IPA/agua 95/5 precalentado a 60-70ºC seguida por
agitación mientras se enfría a temperatura ambiente durante varias
horas aumenta la pureza del fragmento. Ambos materiales de partida
así como la amida de piperidina de FmocAA17-26OH y
el aducto de enamina-urea de
HAA27-36NH_{2} son solubles en IPA al 95%. La
trituración del FmocAA17-36NH_{2} crudo con IPA al
95% a temperatura ambiente durante períodos extensos de tiempo no es
tan eficaz en la separación de impurezas. Se ha completado un
estudio de estabilidad a 60-70ºC. El fallo al
calentar la solución de IPA más allá de 52ºC parece tener un impacto
mínimo en la calidad del producto aislado.
Un reactor encamisado de 40 l equipado con un
agitador mecánico y una entrada de nitrógeno se carga con
FmocAA17-26OH (1 eq., 0,770 kg),
HAA27-36NH_{2} (1 eq., 0,720 kg), HOAT (1,5 eq.) y
DMF (12,5 volúmenes con relación a FmocAA17-26OH).
Se añade EtPr_{2}N (1,5 eq.) y se agita la suspensión a
temperatura ambiente hasta disolverse los sólidos (visualmente). Se
enfría la solución a 0-5ºC bajo atmósfera de
nitrógeno y se añade HBTU (1-1,05 eq.). La mezcla de
reacción se agita a 0-5ºC hasta disolverse el HBTU
(visualmente, aproximadamente 15 minutos). Se calienta la mezcla de
reacción a 25ºC y se agita durante 2 horas (nota 1). La solución de
DMF se enfría a 0-5ºC y se añade agua de
procedimiento fría (12,5 vol.) a una velocidad tal que no exceda de
25ºC. La suspensión resultante se agita durante 1-24
horas, y los sólidos se recogen por filtración bajo vacío y se
lavan con agua (3 x 4 vol.). Los sólidos se secan en el filtro
durante 16-24 horas hasta aproximadamente 2 veces
la masa teórica. El reactor de 40 l se carga con isopropanol/agua
95/5 (25 vol.) y se calienta a 45ºC. El
FmocAA17-36NH_{2} semiseco se añade a la solución
de IPA con agitación rápida. Se calienta la suspensión a 52ºC, y se
agita después durante 12-16 horas a medida que se
enfría a temperatura ambiente (nota 2). Los sólidos se recogen por
filtración bajo vacío, se lavan con una cantidad mínima de IPA y se
secan para dar 1,261 kg de FmocAA17-36NH_{2} con
un rendimiento del 85% y una pureza del 90,6% por HPLC (nota 1). La
reacción puede reelaborarse repitiendo la trituración con IPA/agua
95/5.
- 1.
- Control del procedimiento dentro y pureza, HPLC
- Vydac, C8, 5 \mu, 300 \ring{A}
- 1 ml/min, 262 nm, 30ºC
- A Agua/TFA al 0,1%
- B IPA/ACN 80/20/TFA al 0,1%
- 60-95% de B/20 minutos
| Tiempos de retención: | HAA27-36NH_{2}, 6,73 minutos | |
| FmocAA17-26OH, 10,67 minutos | ||
| FmocAA17-36NH_{2}, 20,2 minutos |
\vskip1.000000\baselineskip
- 2.
- El FmocAA17-36NH_{2} no se disuelve completamente en este volumen a esta temperatura. Antes de recoger los sólidos, se detiene la agitación y se permite a los sólidos sedimentar. Se retira una muestra del filtrado y se analiza por HPLC. Si el filtrado contiene una cantidad significativa de FmocAA17-36NH_{2}, se enfría a 0ºC antes de recoger los sólidos.
Se preparó un total de 4,965 kg de
HAA17-36NH_{2} a partir de 5,112 kg de
FmocAA17-36NH_{2} en cuatro pruebas. El
rendimiento aislado y trazas en HPLC indican la presencia de
dibenzofulveno y quizás disolvente. El dibenzofulveno presente no
interferirá con la siguiente reacción de acoplamiento porque se
separó con carbonato potásico, no piperidina, por tanto, el aducto
con piperidina de dibenzofulveno no es un problema químicamente.
Hay varios problemas asociados con este
procedimiento. La reacción se efectúa en 12 volúmenes de DMF. La
base que separa el grupo Fmoc es 1 volumen de carbonato potásico 1,1
M., que es incapaz de formar un aducto con dibenzofulveno básico,
difícil de separar. La desprotección transcurre en aproximadamente
90 minutos a temperatura ambiente.
Una solución de cloruro sódico:agua acuosa
saturada 1:1 preenfriada a 0ºC se añade para coprecipitar el
fragmento y dibenzofulveno. Esto genera un sólido lechoso fino que
tarda horas (5-8) en filtrar. Una vez aislado, el
sólido húmedo ha de secarse completamente (menos de 1% de LOD) para
separar la impureza dibenzofulveno. El secado tarda 10 días (vacío,
no calor). Una vez seco, el sólido se devuelve al reactor y se
tritura con heptano:MTBE 3:1 (20 vol.) a temperatura ambiente
durante 18 horas para separar el dibenzofulveno. Tiempos de
trituración más cortos no lo separan completamente y, si hay algo de
agua en los sólidos, no se separa. Puede usarse una reelaboración
con heptano:MTBE 3:1 (20 vol.) si persiste el dibenzofulveno.
Para resolver estos problemas, se desarrolló el
siguiente nuevo procedimiento. Se añaden
FmocAA17-36NH_{2} (2,0 g, 1 eq.) y heptano (8
vol.) a un matraz de fondo redondo de 100 ml equipado con un
agitador mecánico, controlador de temperatura y condensador de
reflujo. Se añaden 2 volúmenes de MTBE (4 ml) y se calienta la
suspensión a 45-50ºC (nota 1). Se añade la
piperidina (1,0 eq.). Se agita bajo atmósfera de nitrógeno a
45-50ºC durante 24-36 horas (nota
2). Se filtra en caliente la mezcla de reacción a
45-50ºC (nota 3) y se lava después la torta con 5
volúmenes (10 ml) de heptano:MTBE 60:40.
- 1.
- Resultará una reacción más lenta si se permite escapar MTBE del reactor cambiando por ello la relación heptano:MTBE. Temperaturas de reacción mayores de 50ºC pueden producir engomado de los sólidos de reacción. El Fmoc se separa en gran medida en 5 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
- 2.
- Se compruebe por RP-HPLC que se completa la reacción:
| Columna | Vydac C8, 300 \ring{A},5 \mu, 30ºC | |
| Caudal | 1 ml/min | |
| Detección | UV a 262 nm | |
| Fase móvil | A. Agua/TFA al 0,1% | |
| B IPA:ACN 80:20/TFA al 0,1% | ||
| Método | 60 a 95% de B durante 30 minutos |
\vskip1.000000\baselineskip
- 3.
- La filtración en caliente ayuda en la separación del aducto con piperidina de dibenzofulveno.
Un reactor encamisado de 40 l se carga con
FmocAA17-36NH_{2} (1 eq., 1,26 kg) y DMF (12 vol.)
a temperatura ambiente. Se añade de una vez una solución de
carbonato potásico acuoso 1,11 M (nota 1). Se agita la mezcla de
reacción a temperatura ambiente durante 3,5 horas (nota 2). La
mezcla de reacción se añade lentamente a una solución 1:1 de cloruro
sódico acuoso saturado/agua (10 volúmenes) preenfriada a 0ºC a tal
velocidad que no se supere una temperatura de 10ºC (aproximadamente
1-2 horas). El sólido se recoge por filtración bajo
vacío usando una chapa de caucho para comprimir agua de la torta del
filtro (nota 3). La torta húmeda se transfiere de vuelta al
recipiente de reacción y se tritura (agita) con agua (10 vol.)
durante 1-2 horas para separar sales inorgánicas
residuales. El sólido se recoge por filtración bajo vacío, se
comprime con una chapa de caucho y se transfiere después a un horno
de vacío y se seca hasta peso constante. El sólido seco (nota 4) se
tritura (agita) con heptano:MTBE 3:1 (20 vol.) durante un mínimo de
14 horas a temperatura ambiente para separar dibenzofulveno. El
sólido se recoge por filtración bajo vacío, se lava con heptano (2
vol.) y se seca para dar 1,20 kg de HAA17-36NH_{2}
con 99,5% de rendimiento y una pureza del 75%. El
HAA17-36NH_{2} contiene 5% de dibenzofulveno. Se
reelabora la reacción repitiendo la trituración con
heptano:MTBE.
- 1.
- La solución se vuelve turbia cuando se añade el carbonato potásico acuoso, pero se aclara con agitación continuada. Se notó una exotermicidad de 4-5ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
- 2.
- Se usó HPLC para IPC y pureza.
- Vydac C8, 260 nm
- 1 ml/min, 262 nm, 30ºC
- A. Agua/TFA al 0,1%
- B IPA/acetonitrilo 80/20/TFA al 0,1%
- 60 a 95% de B/30 minutos
\vskip1.000000\baselineskip
- 3.
- El producto precipita con un tamaño de partículas fino produciendo una filtración lenta.
\vskip1.000000\baselineskip
- 4.
- El material debe estar exento de agua para el heptano a fin de separar eficazmente el dibenzofulveno.
El AcAA1-16OH se disolvió en DMF
con HOAT y DIEA, se enfrió a 0ºC y se añadió HBTU. Esto se agitó
durante 15 minutos, o hasta disolverse el HBTU, y se añadió después
HAA17-36NH_{2}. La preactivación de
AcAA1-16OH en ausencia de HAA17- 36NH_{2}era una
precaución que se encontró más tarde no necesaria. Además, la
disolución de HAA17-36NH_{2} en la solución de
DMF a 0ºC que contiene el AcAA1-16OH activado probó
ser lenta a escala
mayor.
mayor.
Se preparó un total de 6,972 kg de
AcAA1-36NH_{2} a partir de 3,92 kg de
AcAA1-16OH y 4,96 kg de
HAA17-36NH_{2} en cuatro pruebas que promediaban
un 80,1% de rendimiento. Dos pruebas de esta fase promediaron 87% de
rendimiento y dos pruebas promediaron 73% de rendimiento.
Se hace un ensayo de uso en una escala de
1-2 g, ensayando ambos fragmentos y el HBTU a usar
antes de realizar la reacción de acoplamiento. La estequiometría de
los materiales de partida y reactivos se determina a partir del
ensayo de uso. Se anota también en el ensayo de uso la solubilidad
de los materiales de partida. Una solución turbia puede indicar la
presencia de sales en AcAA1-16OH y justificar un
lavado con agua en el fragmento. Es imperativo que todos los
componentes de la mezcla de reacción estén claramente en solución
antes de añadir el HBTU para asegurar una conversión completa de los
materiales de partida a producto con racemización y formación de
subproductos
mínima.
mínima.
Los fragmentos, AcAA1-16OH y
HAA17-36NH_{2}, y los reactivos HOAT y DIEA se
disolvieron en DMF, se enfriaron a 0ºC y se añadió HBTU. Una de las
pruebas requirió un equivalente adicional de DIEA para recoger HCl
en HAA17-36NH_{2}. El producto crudo se aisló de
la mezcla de reacción con un goteo de agua (tiempo de filtración, 10
minutos). El sólido todavía húmedo se devolvió a un reactor que
contenía acetonitrilo precalentado a 55ºC, y se agitó después
rápidamente mientras se enfriaba a 35ºC durante 3 horas y después a
20ºC durante la noche. La suspensión se enfría a
0-5ºC, se agita 1-2 horas más y se
recoge el sólido por filtración. Durante este procedimiento, el
AcAA17-36NH_{2} casi pasa a solución a 55ºC. A
medida que se enfría la solución, el
AcAA17-36NH_{2} precipita (aceites) de la
solución. A medida que se enfría la solución, el aceite solidifica
y se transforma eventualmente en un sólido muy blanco. Durante el
transcurso de esta transformación, puede tener lugar una deposición
considerable de sólido en la pared del reactor y el eje del
agitador. Mucha de ésta se desprende a medida que se agita la
suspensión durante la noche a 20ºC. Después de recoger el sólido, se
llena el reactor con suficiente agua para cubrir todo el sólido
pegado a las paredes del reactor o el eje. Se agita la suspensión
hasta que todo el sólido restante se ha desprendido de las paredes y
el eje (aproximadamente 1 hora) y se usa después como lavado en la
torta del filtro. El lavado con acetonitrilo separa materiales de
partida no reaccionados y todos los fragmentos truncados de menos de
20 aminoácidos.
Se carga un reactor de 40 l con
AcAA1-16OH (938 g, 1 eq.),
HAA17-36NH_{2} (1,19 kg, 1 eq.), HOAT (1 eq.), DMF
(19 vol., con relación a AcAA1-16OH) y DIEA (1 eq.).
Se agita la suspensión hasta disolverse los sólidos, se enfría
después a 0-5ºC y se añade HBTU (1,03 eq.). Se agita
la solución a 0-5ºC durante 15 minutos o hasta
disolverse los sólidos, se calienta a 20ºC y se agita durante 2
horas. Se muestrea la mezcla de reacción para un IPC (nota 1).
Cuando se juzga completa la reacción, se añade agua (19 vol.) a una
velocidad tal que no se superen 35ºC (nota 2).
Se agita la suspensión durante
1-24 horas y se recoge después el sólido por
filtración bajo vacío (10 minutos) y se lava con agua (2 x 3 vol.).
La torta del filtro se comprime para separar la mayor agua posible.
Entre tanto, se carga el reactor con acetonitrilo al 95%/agua (30
volúmenes con relación a la carga de AcAA1-16OH) y
se calienta a 55ºC con agitación.
El sólido húmedo se añade al reactor en porciones
para evitar aglutinación. Se agita la suspensión mientras se enfría
a 35ºC durante 3 horas y después a 20ºC durante la noche. Se enfría
a 0-5ºC, se agita durante 2 horas, se detiene la
agitación y se muestrea la solución.
Se recoge el sólido por filtración bajo vacío. Se
lavan el reactor y las tuberías con acetonitrilo al 90%/agua (3,6
vol.).
Se carga el reactor con una cantidad suficiente
de agua para cubrir todo el sólido pegado a las paredes del reactor
o el eje del agitador (aproximadamente 30 vol.). Se agita a
temperatura ambiente hasta no estar más pegados los sólidos a las
paredes del reactor y el eje (aproximadamente 1 hora). Se recoge el
sólido con el resto y se seca hasta peso constante (1,83 kg,
rendimiento 86%).
Se repite la trituración en el sólido seco usando
acetonitrilo/agua 90/10.
- 1.
- IPC y pureza, HPLC
- YMC ODS-A, 150 x 4,6 mm, 5 \mu, 120 \ring{A}
- 1 ml/min, 260 nm, 30ºC
- A. Agua/TFA al 0,1%
- B THF/TFA al 0,1%
- 60-90% de B/30 min, 90-95% de B/1 min, 95% de B/5 min.
| AcAA1-16OH | 6,37 minutos | |
| HAA17-36NH_{2} | 8,91 minutos | |
| AcAA1-36NH_{2} | 18,07 minutos |
\vskip1.000000\baselineskip
- 2.
- Si la temperatura supera 35ºC durante la adición de agua, los sólidos que precipitan pueden fundir conduciendo a aglutinaciones y/o deposición en las paredes del reactor.
El objetivo de este experimento era cambiar la
velocidad de adición de MTBE en la precipitación para mantener la
temperatura por debajo de 20ºC y también aislar y descarboxilar
T-20 sólido crudo (es decir, eliminar la
descarboxilación en solución).
El T-20 crudo se aisló por
precipitación de ACN/agua como un sólido antes de cargar en una
columna de HPLC. El contenido porcentual de T-20 del
sólido se determinó por un ensayo de HPLC basado en peso.
Después de separar los grupos protectores de
cadenas secundarias en el TFA/agua/ditiotreitol 90/5/5, se enfría la
solución a 0ºC y se añade MTBE (45 vol. con relación a la carga de
AcAA1-36NH_{2}). Ésta es una cantidad mínima de
MTBE requerida para asegurar una precipitación completa de
T-20. Hay una exotermicidad al mezclar y los
primeros 5 volúmenes deben añadirse lentamente para mantener la
temperatura por debajo de 20ºC (aproximadamente 60 minutos). Cuanto
más MTBE se añade, puede aumentarse la velocidad de adición. El
mantenimiento de la temperatura por debajo de 20ºC durante la
precipitación impide la aglutinación del sólido a medida que
precipita de la solución.
El protocolo de división/purificación actual
implica realizar la desprotección a una escala que se acomode a la
purificación cromatográfica. El T-20 crudo aislado
del cóctel de desprotección como sal de TFA se disolvió en
acetonitrilo/agua a pH 5, se filtró y se dejó permanecer durante 15
horas para efectuar la descarboxilación de los índoles de
triptófano. Después de completarse la descarboxilación, la solución
se diluyó y transfirió al grupo de purificación para cargarse en la
columna. Durante la dilución, la solución se vuelve siempre nebulosa
y la solución turbia se bombea a la columna. Esto produjo deposición
del sólido en la cabeza de la columna y erosión gradual del
funcionamiento de la columna durante las pruebas de purificación.
Permitir a T-20 descarboxilarse en acetonitrilo/agua
a pH 5 durante varias horas conduce a la formación de agregados
altamente insolubles.
Se ha desarrollado un método para evitar la
descarboxilación en solución. El T-20 crudo, aislado
como sal de TFA de la precipitación con MTBE, se descarboxilará bajo
vacío a temperatura ambiente durante aproximadamente
5-7 días. Se encontró que la descrboxilación fue
completa en tres días a 40ºC bajo vacío. El contenido de TFA del
sólido aislado fue 9%. El material puede guardarse durante hasta un
mes a 0ºC con una pérdida del 1% p/p.
Puede realizarse un intercambio de sal en
etanol/agua (1:9) con HOAc después de aislar
T-20-TFA de MTBE. La sal acetato de
T-20 crudo es significativamente más estable y puede
preferirse. Cualquier método de aislamiento permitirá realizar la
desprotección de cadenas secundarias a mayor escala y el
T-20 no estará expuesto a las condiciones de
acetonitrilo/agua/HOAc usadas para descarboxilación que se sabe que
causan agregación.
Se prepara una solución de TFA/agua/ditiotreitol
90/5/5 (13 vol.) y se purga con nitrógeno durante 3 minutos. Se
añade en porciones AcAA1-36NH_{2} a
TFA/agua/ditiotreitol 90/5/5 (13 vol.) a temperatura ambiente bajo
atmósfera de nitrógeno. Una vez en solución, se agita a temperatura
ambiente durante 4 horas y se enfría después a 0ºC. Para precipitar
el T-20, se añade gota a gota MTBE (45 vol.),
enfriado a 0-5ºC, con una velocidad lenta
manteniendo inicialmente una temperatura por debajo de 20ºC (tiempo
de adición aproximadamente 1-2 horas). El sólido se
recoge por filtración bajo vacío (nota 1). El reactor, las tuberías
y la torta del filtro se lavan inmediatamente con 3 x 5 volúmenes de
MTBE. Se separa el sólido, se muestrea para IPC t = 0 (nota 2) y se
seca bajo vacío durante 5 días, o hasta que la HPLC no muestra
cambios.
- 1.
- Evitar tracción de aire a través del sólido durante esta filtración porque la solución de desprotección es higroscópica. La tracción de aire a través del sólido antes de que se haya lavado la solución de TFA puede producir un sólido pegajoso o aceitoso.
\vskip1.000000\baselineskip
- 2.
- Se usa el método de HPLC TM2-0003-01 (método de TFA). El método de acetato amónico (TM2-0006-01) no separa los diversos intermedios carboxilados.
Se desprotegió un total de 7,226 kg de
AcAA1-36NH_{2} en 12 pruebas. Sólo se prepararon
6,972 kg de AcAA1-36NH_{2} sugiriendo que el
intermedio puede ser higroscópico. El sólido aislado del goteo de
MTBE se disolvió en 10 volúmenes de ACN/agua 1:1, se filtró y se
ajustó en pH 3,5 con bicarbonato sódico. Se añadió ácido acético
(1,5% en volumen) (pH 4,5 a 5) y la solución se agitó a temperatura
ambiente durante 15 horas para efectuar descarboxilación. La
solución se diluyó con 25 volúmenes de agua para dar un total de 40
volúmenes de una solución de agua/ACN 85/15. La solución era turbia
en todos los casos y en algunos tenía un sólido fino
(T-20 agregado). Se tomó una muestra para IPC y la
solución se transfirió al grupo de purificación. Se calcularon los
rendimientos de T-20 crudo para las pruebas usando
un ensayo de HPLC p/p.
La desprotección de
AcAA1-36NH_{2} es completa en TFA/agua/DTT 90/5/5
a temperatura ambiente después de 4-5 horas. A las 8
horas, ha tenido lugar una degradación evidente (2%). En el mismo
cóctel a 5ºC, la desprotección no es completa a las 8 horas, pero lo
es a las 23 horas. No hay diferencia de pureza del
T-20 crudo obtenido después de 5 horas a temperatura
ambiente frente a 23 horas a 5ºC. Puesto que el volumen de
aislamiento (aproximadamente 55 vol.) es mucho mayor que el volumen
de reacción (desprotección) (13 vol.), es necesario disolver el
AcAA1-36NH_{2} en la solución de TFA en una
garrafa de 20 l, y transferir después la solución a un reactor de 40
l.
El aislamiento del T-20
carboxilado crudo (como sal de TFA) del cóctel de desprotección se
consigue por precipitación con MTBE. La cantidad de MTBE necesaria
para precipitar el péptido es 3-4 veces la cantidad
de cóctel de desprotección. El uso de MTBE en dos veces el volumen
(o menos) del cóctel de división deja detrás péptido. La adición del
MTBE al cóctel de división produce un sólido filtrado fácilmente,
mientras que añadir el cóctel de MTBE produce un precipitado fino
que es difícil de filtrar. Hay una elevación de temperatura de 5ºC a
40-45ºC durante la adición de MTBE a la solución de
TFA. El aumento de temperatura no tiene efecto en la pureza del
T-20 crudo aislado (187/117,119). Hubo alguna
aglutinación de los sólidos durante la adición de MTBE. La
suspensión se agitó durante 1-2 horas para romper
las aglutinaciones. Mantener una temperatura por debajo de 20ºC
durante la adición de MTBE produce un sólido más uniforme que se
filtra mejor (196/31). La velocidad de adición del MTBE se
controlará en el futuro. Se recogió T-20 crudo por
filtración bajo atmósfera de nitrógeno. El sólido se hará pegajoso
si se expone a aire húmedo durante la filtración antes de lavar el
TFA. Después de lavar el TFA, el sólido es estable al aire.
Se prepara una solución de TFA/agua/ditiotreitol
90/5/5 (13 vol.) en una garrafa de 20 l y se purga después con
nitrógeno durante 3 minutos. Se añade
AcAA1-36NH_{2} (650 g) en porciones para evitar
aglutinación. Una vez que el sólido está en solución, se transfiere
la solución a un reactor de 70 l. La garrafa y las tuberías se lavan
con una cantidad mínima de TFA/agua/ditiotreitol 90/5/5. La solución
se agita a temperatura ambiente bajo atmósfera de nitrógeno durante
4 horas y se enfría después a 0-5ºC. Se añade MTBE
(45 vol.) a una velocidad tal que la temperatura interna sea
inferior a 30ºC. El sólido se recoge por filtración bajo vacío bajo
una corriente de nitrógeno. El reactor, las tuberías y el sólido se
lavan con 2 x 2 volúmenes de MTBE y se seca hasta peso constante
(594 g, 70%).
El sólido (594 g) se disuelve en ACN al 50%/agua
(8 volúmenes con relación a la carga de
AcAA1-36NH_{2}) y se filtra. El recipiente y las
tuberías se lavan con ACN al 50%/agua (2 vol.). El pH de la solución
se ajusta en 3,5-4,0 con bicarbonato sódico y se
añade después ácido acético (0,18 vol.) llevando el pH a 4,9. La
solución se agita a temperatura ambiente durante 15 horas (IPC, nota
1) y se ajusta después el pH en 9-9,5 con carbonato
potásico 1 M. Se diluye la solución a agua/ACN 85/15 añadiendo agua
(25 vol.). La solución turbia resultante se muestrea para análisis
de HPLC p/p y se transfiere al grupo de purificación.
- 1.
- Método TM2-0003-01.
- 2.
- Método TM2-0006-01.
La purificación, liofilización y envasado se
clasifican en tres fases:
% p/p = 100 - % de impurezas - % de acetato - %
de agua - % de TFA. El contenido de acetato en los lotes fue
6-8%.
Un total de 2,08 kg de T-20
(neto) se aisló de 6,97 kg de AcAA1-36NH_{2}. Esto
representa un rendimiento del 49,3% de
AcAA1-36NH_{2}. El rendimiento medio en la
purificación cromatográfica fue 55%. Los rendimientos para pruebas
individuales variaron del 41 al 55%. Los rendimientos más bajos
fueron resultado de fallos de columna o bombas, conduciendo a
pasadas múltiples. En general, si la cromatografía funcionó, los
rendimientos estuvieron en el intervalo del 50-55%.
La pureza del T-20 aislado fue
93-95%.
Se examinaron cuatro gradientes durante la
purificación para comparar métodos con el objetivo de minimizar el
tiempo de prueba:
- 1.
- 15-22% de ACN/60 minutos, 22-36% de ACN/525 minutos a 330 ml/min.
- 2.
- 16-26% de ACN/60 minutos, 26-40% de ACN/525 minutos a 330 ml/min.
- 3.
- Segundo gradiente de Trimeris. 15-36% de ACN/1788 minutos a 330 ml/min.
- 4.
- Gradiente de Trimeris original 20-23% de ACN/112 minutos, 23-36% de ACN/488 minutos a 330 ml/min.
Una columna de veinte centímetros (cm) se rellenó
(compresión axial) con la resina Amberchrom (altura de lecho 35 cm).
Se desprotegieron y descarboxilaron en solución lotes de
500-700 g de AcAA1-36NH_{2}. Esta
escala produce una materia prima de alimentación a la columna que
contiene aproximadamente 400 gramos de péptido (aproximadamente 75%
de T-20). La solución materia prime es típicamente
nebulosa y puede contener sólidos suspendidos. La solución turbia se
carga en la columna a razón de 500 ml/min usando 15% de B. No hubo
aumento de presión durante la carga de la columna para cualquiera de
las pruebas. Se reduce el caudal a 330 l/min y se prueba el
gradiente especificado durante la cantidad indicada de tiempo. Se
recogen las fracciones y se agrupan las que contienen más del 78% de
T-20 (100-110 l) y se diluyen con
agua para llevar el contenido de acetonitrilo a aproximadamente
15-20% (aproximadamente 140 litros). Se lava la
columna y se equilibra después con 15% de B. La solución que
contiene T-20 se carga de vuelta a la columna de 20
cm a razón de 900 ml/min. El % de B se aumenta al 50% y se saca
T-20 de la columna en aproximadamente 25 l.
La solución se congela en campanas de vidrio de
un litro y se liofiliza a un polvo. El T-20 aislado
es típicamente del 92-94% por HPLC y contiene
6-8% de acetato y 3-4% de agua.
Una solución de T-20 en
agua/acetonitrilo 85/15 (27 l) a pH 9,2 se bombeó a una columna de
HPLC de veinte centímetros a razón de 500 ml/min. El caudal se
redujo a 330 ml/min durante 30 minutos (en incrementos de
30-40 ml/min cada 5 minutos). Se inicia un gradiente
lineal que va de 20% de B a 36% de B durante 600 minutos. Se recogen
fracciones hasta que la absorbancia cae por debajo de 0,2 AUFS. Se
analiza el contenido de las fracciones por HPLC (nota 1). Se lava la
columna con 80% de B a razón de 900 ml/min durante 10 minutos, y se
lleva después de vuelta a 15% de B y se equilibra a 900 ml/min. Se
agrupan las fracciones que contienen más del 78% de
T-20 (113 l) y se diluyen con tampón (28,2 l) para
llevar la concentración de acetonitrilo al 15-20%.
Se bombea la solución a la columna a razón de 900 ml/min. El % de B
se aumenta al 50% y se eluye T-20 de la columna a
razón de 900 ml/min en aproximadamente 25 l. La concentración de
T-20 es aproximadamente 9-10 mg/ml.
La solución se transfiere a campanas de liofilización de un litro,
se congela y se liofiliza para dar 216,29 g de T-20
con un rendimiento del 54,9% y una pureza del 94,1%.
- 1.
- Se analizan por HPLC el contenido y la pureza de fracciones.
- YMC ODS-A, 150 x 4,6 mm, 5\mum, 120 \ring{A}
- 1 ml/min, 220nm, 30ºC
- A NH_{4}OAc 50 mM a pH 7 (ajuste con NH_{4}OH): ACN 70/30
- B NH_{4}OAc 50 mM a pH 7 (ajuste con NH_{4}OH): ACN 5/95
- 0-15% de B/50 min, 15-100% de B/2 min, 100% de B/3 min
- Tiempo de retención de T-20, 29,0 minutos.
Se realizó una serie de experimentos para
caracterizar la estabilidad térmica de los fragmentos de
T-20 intermedios. Los fragmentos de
T-20 se saturaron con agua, se filtraron y se
pusieron después en recipientes cerrados y se expusieron a
temperaturas elevadas. En varios puntos de tiempo se recogen
muestras y se analizan por métodos de HPLC para tener acceso a los
cambios de pureza. También se caracterizó la estabilidad de los
fragmentos de T-20 secos por análisis
termogravimétrico (TGA).
Todos los fragmentos pueden secarse a 40ºC
durante 3 días salvo AcAA1-16OH. Sólo se observa una
degradación moderada después de 24 horas a 80ºC en dos fragmentos,
FmocAA27-35OH (3%) y
FmocAA27-36NH_{2} (1,4%). El fragmento
AcAA1-16OH era inicialmente del 97% de pureza.
Después de 3 días a 40ºC, era del 93,4% de pureza y seco. Después de
24 horas adicionales a 80ºC, permanecía en el 93,9%. El
AcAA1-16OH húmedo debe secarse a temperatura
ambiente.
El punto del estudio de estabilidad fue
determinar si los fragmentos pueden secarse a 40ºC en lugar de a
temperatura ambiente. El estudio indica que los fragmentos son
estables al secado a 40ºC. Esto reducirá en gran medida los tiempos
de secado.
Se ha completado un estudio diseñado para
examinar la estabilidad de los fragmentos
Ac(1-16)-OH,
Fmoc(27-35)-OH,
Fmoc(17-26)-OH,
Fmoc(27-36)-NH_{2},
Fmoc(17-36)-NH_{2},
H(17-36)-NH_{2} y
Ac(1-36)-NH_{2}, bajo
diversas condiciones de disolvente y temperatura que imitan su
aislamiento y purificación. Todos los fragmentos son estables, la
estabilidad se designa con una X, en los sistemas de disolventes de
los que se aíslan y/o purifican:
\newpage
| Tiempo | ||||||
| Intermedio | Solución de almacenamiento | Inicial | 1 hora | 6 horas | 1 día | 3 días |
| F(27-35)-OH | EtOH:H_{2}O 9:1, 40ºC | X | X | X | X | X |
| F(17-26)-OH | EtOH/H_{2}O 80:20, 40ºC | X | X | X | X | X |
| F(27-36)-NH_{2} | NMP/H_{2}O 1:1, 40ºC | X | X | X | X | X |
| Ac(1-16)-OH | HCl 0,01 M, 5-10ºC | X | X | X | X | X |
| F(17-36)-NH_{2} | IPA al 95%/H_{2}O, 60-65ºC | X | X | X | X | X |
| H_{2}O al 50%/NMP, 50ºC | X | X | X | X | X | |
| EtOH/H_{2}O 90:10, 40ºC | X | X | X | X | X | |
| H(17-36)-NH_{2} | H_{2}O/DMF 1,5:1, 40ºC | X | X | X | X | X |
| Ac(1-36)-NH_{2} | ACN/H_{2}O 9:1, 50ºC | X | X | X | X | X |
| H_{2}O al 50%/NMP, 50ºC | X | X | X | X | X | |
| EtOH:H_{2}O 85:15, 70ºC | X | X | X | X | X | |
| X = contenido e impurezas por HPLC, control de apariencia visual |
Claims (29)
1. Un método para la síntesis de un péptido que
tiene la fórmula
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 1),
que
comprende:
- (a)
- hacer reaccionar un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLEL-COOH (SEQ ID NO: 11)
- con un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- NH_{2}-DKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 18)
- para producir un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 12);
- (b)
- desproteger el término amino del péptido producido en (a);
- (c)
- hacer reaccionar el péptido producido en (b) con un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4)
- para producir un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 1);
- (d)
- modificar el término amino del péptido producido en (c) en una modificación de acetilo; y
- (e)
- desproteger las cadenas secundarias del péptido protegido en sus cadenas secundarias de (d) para producir un péptido de fórmula:
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 1).
2. Un método para la síntesis de un péptido que
tiene la fórmula
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 1),
que
comprende:
- (a)
- hacer reaccionar un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLEL-COOH (SEQ ID NO: 11)
- con un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- NH_{2}- DKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 18)
- para producir un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 12);
- (b)
- desproteger el término amino del péptido producido en (a);
- (c)
- hacer reaccionar el péptido producido en (b) con un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4)
- para producir un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 1); y
\newpage
- (d)
- desproteger las cadenas secundarias del péptido protegido en sus cadenas secundarias de (c) para producir un péptido de fórmula:
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 1).
3. Un método para la síntesis de un péptido que
tiene la fórmula:
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 1),
que
comprende:
- (a)
- desproteger el término amino de un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 12);
- (b)
- hacer reaccionar el péptido producido en (a) con un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4)
- para producir un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 1);
- (c)
- desproteger el término amino del péptido producido en (b);
- (d)
- modificar el término amino del péptido producido en (c) en una modificación de acetilo; y
- (e)
- desproteger las cadenas secundarias del péptido protegido en sus cadenas secundarias de (c) para producir un péptido de fórmula:
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 1).
4. Un método para la síntesis de un péptido que
tiene la fórmula
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 1),
que
comprende:
- (a)
- desproteger el término amino de un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 12);
- (b)
- hacer reaccionar el péptido producido en (a) con un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4)
- para producir un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 1);
- (c)
- desproteger las cadenas secundarias del péptido protegido en sus cadenas secundarias de (b) para producir un péptido de fórmula:
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 1).
5. El método de las reivindicaciones 3ª o 4ª, en
el que el péptido protegido en sus cadenas secundarias de
fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 12)
se sintetiza por un método que
comprende:
- (a)
- hacer reaccionar un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-DKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 17)
- con HPheNH_{2} para producir un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-DKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 18);
- (b)
- desproteger el término amino del péptido producido en (a); y
- (c)
- hacer reaccionar el péptido producido en (b) con un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLEL-COOH (SEQ ID NO: 11)
- para producir el péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 12).
6. El método de las reivindicaciones 3ª o 4ª, en
el que el péptido protegido en sus cadenas secundarias de
fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 12)
se sintetiza por un método que
comprende:
- (a)
- hacer reaccionar un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-LELDKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 15)
- con HPheNH_{2} para producir un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-LELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 16);
- (b)
- desproteger el término amino del péptido producido en (a); y
- (c)
- hacer reaccionar el péptido producido en (b) con un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-EKNEQEL-COOH (SEQ ID NO: 10)
- para producir el péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 12).
7. El método de las reivindicaciones 3ª o 4ª, en
el que el péptido protegido en sus cadenas secundarias de
fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 12)
se sintetiza por un método que
comprende:
- (a)
- desproteger el término amino del péptido:
- Fmoc-DKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 18); y
- (b)
- hacer reaccionar el péptido producido en (a) con un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLEL-COOH (SEQ ID NO: 11)
- para producir el péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 12).
8. El método de las reivindicaciones 3ª o 4ª, en
el que el péptido protegido en sus cadenas secundarias de
fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 12)
se sintetiza por un método que
comprende:
- (a)
- hacer reaccionar un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 19)
- con HPheNH_{2} para producir el péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 12).
9. El método de las reivindicaciones 1ª o 3ª, en
el que el péptido protegido en sus cadenas secundarias de
fórmula
- Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4)
se sintetiza por un método que
comprende:
- (a)
- desproteger el término amino del péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-IEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 7); y
- (b)
- hacer reaccionar el péptido protegido en sus cadenas secundarias producido en (a) con un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-YTSLIHSL-COOH (SEQ ID NO: 2)
- para producir el péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4).
10. El método de las reivindicaciones 2ª o 4ª, en
el que el péptido protegido en sus cadenas secundarias de
fórmula
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4)
se sintetiza por un método que
comprende:
- (a)
- hacer reaccionar un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-IEESQNQ-COOH (SEQ ID NO: 6)
- con HGlnOPNB para producir un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-IEESQNQQ-OPNB (SEQ ID NO: 7);
- (b)
- desproteger el término amino del péptido protegido en sus cadenas secundarias producido en (a);
- (c)
- hacer reaccionar el péptido protegido en sus cadenas secundarias producido en (b) con un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Ac-YTSLIHSL-COOH (SEQ ID NO: 2)
- para producir un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OPNB (SEQ ID NO: 4);
- (d)
- desproteger el término carboxilo del péptido protegido en sus cadenas secundarias producido en (c) para producir el péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4).
11. El método de las reivindicaciones 1ª o 3ª, en
el que el péptido protegido en sus cadenas secundarias de
fórmula
- Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4)
se sintetiza por un método que
comprende:
- (a)
- hacer reaccionar un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQ-COOH (SEQ ID NO: 3)
- con HGlnOPNB para producir el péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-OPNB (SEQ ID NO: 4); y
- (b)
- desproteger el término carboxilo del péptido producido en (a) para producir el péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4).
12. Un método para la síntesis de un péptido de
fórmula:
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 1),
que
comprende:
- (a)
- desproteger el término amino de un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 9)
- (b)
- hacer reaccionar el péptido producido en (a) con un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQ-COOH (SEQ ID NO: 3),
- para producir un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 1),
- (c)
- modificar el término amino del péptido producido en (b) en una modificación de acetilo; y
- (d)
- desproteger las cadenas secundarias del péptido protegido en sus cadenas secundarias de (c) para producir el péptido de fórmula:
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 1).
13. El método de la reivindicación 12ª, en el que
el péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 9)
se sintetiza por un método que
comprende:
- (a)
- hacer reaccionar un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNW-NH_{2} (SEQ ID NO: 8)
- con HPheNH_{2} para producir el péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 9).
14. Un método para la síntesis de un péptido de
fórmula:
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 1),
que
comprende:
- (a)
- desproteger el término amino de un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 14)
- (b)
- hacer reaccionar el péptido producido en (a) con un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEK-COOH (SEQ ID NO: 5),
- para producir un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 1),
- (c)
- modificar el término amino del péptido producido en (b) en una modificación de acetilo; y
- (d)
- desproteger las cadenas secundarias del péptido protegido en sus cadenas secundarias de (c) para producir el péptido de fórmula:
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 1).
15. El método de la reivindicación 14ª, en el que
el péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 14)
se sintetiza por un método que
comprende:
- (a)
- hacer reaccionar un péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-NEQELLELDKWASLWNW-NH_{2} (SEQ ID NO: 13)
- con HPheNH_{2} para producir el péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 14).
16. El método de las reivindicaciones 1ª, 2ª, 3ª,
4ª, 12ª o 14ª, en el que el péptido protegido en sus cadenas
secundarias de fórmula:
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 1),
se produce en una cantidad de
aproximadamente uno o más
kilogramos.
17. El método de las reivindicaciones 1ª o 2ª, en
el que el péptido protegido en sus cadenas secundarias de
fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQID NO: 12)
se produce en una cantidad de
aproximadamente uno o más
kilogramos.
18. El método de la reivindicación 5ª, en el que
el péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 12)
se produce en una cantidad de
aproximadamente uno o más
kilogramos.
19. El método de la reivindicación 6ª, en el que
el péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 12)
se produce en una cantidad de
aproximadamente uno o más
kilogramos.
20. El método de la reivindicación 7ª, en el que
el péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 12)
se produce en una cantidad de
aproximadamente uno o más
kilogramos.
21. El método de la reivindicación 8ª, en el que
el péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 12)
se produce en una cantidad de
aproximadamente uno o más
kilogramos.
22. El método de la reivindicación 9ª, en el que
el péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4)
se produce en una cantidad de
aproximadamente uno o más
kilogramos.
23. El método de la reivindicación 10ª, en el que
el péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4)
se produce en una cantidad de
aproximadamente uno o más
kilogramos.
24. El método de la reivindicación 11ª, en el que
el péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4)
se produce en una cantidad de
aproximadamente uno o más
kilogramos.
25. El método de la reivindicación 13ª, en el que
el péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 9)
se produce en una cantidad de
aproximadamente uno o más
kilogramos.
26. El método de la reivindicación 15ª, en el que
el péptido protegido en sus cadenas secundarias de fórmula:
- Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 14)
se produce en una cantidad de
aproximadamente uno o más
kilogramos.
27. Un grupo de fragmentos de péptidos que
comprende un grupo seleccionado del grupo constituido por:
- (a)
- YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO: 4),
- EKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 12);
- (b)
- YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO: 4),
- EKNEQELLEL (SEQ ID NO: 11),
- QEKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 8);
- (c)
- YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO: 4),
- EKNEQELLEL (SEQ ID NO: 11),
- DKWASLWNW (SEQ ID NO: 17);
- (d)
- YTSLIHSL (SEQ ID NO: 2),
- IEESQNQ (SEQ ID NO: 6),
- EKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 12);
- (e)
- YTSLIHSL (SEQ ID NO: 2),
- IEESQNQ (SEQ ID NO: 6),
- EKNEQELLEL (SEQ ID NO: 11),
- DKWASLWNWF (SEQ ID NO: 18);
- (f)
- YTSLIHSL (SEQ ID NO: 2),
- IEESQNQ (SEQ ID NO: 6),
- EKNEQELLEL (SEQ ID NO: 11),
- DKWASLWNW (SEQ ID NO: 17);
- (g)
- YTSLIHSL (SEQ ID NO: 2),
- IEESQNQQ (SEQ ID NO: 7),
- EKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 12);
- (h)
- YTSLIHSL (SEQ ID NO: 2),
- IEESQNQQ (SEQ ID NO: 7),
- EKNEQELLEL (SEQ ID NO: 11),
- DKWASLWNWF (SEQ ID NO: 18);
- (i)
- YTSLIHSL (SEQ ID NO: 2),
- IEESQNQQ (SEQ ID NO: 7),
- EKNEQELLEL (SEQ ID NO: 11),
- DKWASLWNW (SEQ ID NO: 17);
- (j)
- YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO: 4),
- EKNEQEL (SEQ ID NO: 10),
- LELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 16);
- (k)
- YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO: 4),
- EKNEQEL (SEQ ID NO: 10),
- LELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 15);
- (l)
- YTSLIHSL (SEQ ID NO: 2),
- IEESQNQ (SEQ ID NO: 6),
- EKNEQEL (SEQ ID NO: 10),
- LELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 16);
- (m)
- YTSLIHSL (SEQ ID NO: 2),
- IEESQNQ (SEQ ID NO: 6),
- EKNEQEL (SEQ ID NO: 10),
- LELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 15);
- (n)
- YTSLIHSL (SEQ ID NO: 2),
- IEESQNQQ (SEQ ID NO: 7),
- EKNEQEL (SEQ ID NO: 10),
- LELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 16);
- (o)
- YTSLIHSL (SEQ ID NO: 2),
- IEESQNQQ (SEQ ID NO: 7),
- EKNEQEL (SEQ ID NO: 10),
- LELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 15);
- (p)
- YTSLIHSLIEESQNQ (SEQ ID NO: 3),
- QEKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 8);
- (q)
- YTSLIHSLIEESQNQ (SEQ ID NO: 3),
- QEKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 9);
- (r)
- YTSLIHSLIEESQNQQEK (SEQ ID NO: 5),
- NEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 14);
- (s)
- YTSLIHSLIEESQNQQEK (SEQ ID NO: 5),
- NEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 13); y
- (t)
- YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO: 4),
- EKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 19).
28. El uso de un fragmento de péptido para
síntesis de péptidos según alguna de las reivindicaciones 1ª-26ª,
en el que el fragmento de péptido se selecciona del grupo
constituido por:
- YTSLIHSL (SEQ ID NO: 2);
- IEESQNQ (SEQ ID NO: 6);
- IEESQNQQ (SEQ ID NO: 7);
- QEKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 8);
- EKNEQEL (SEQ ID NO: 10);
- EKNEQELLEL (SEQ ID NO: 11);
- NEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 13);
- LELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 15);
- LELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 16);
- DKWASLWNW (SEQ ID NO: 17);
- DKWASLWNWF (SEQ ID NO: 18);
- y
- EKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 19).
29. Un péptido protegido seleccionado del grupo
constituido por:
- Ac-YTSLIHSL-COOH (SEQ ID NO: 2);
- FMOC-YTSLIHSL-COOH (SEQ ID NO: 2);
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OPNB (SEQ ID NO: 4);
- FMOC-YTSLIHSLIEESQNQQ-OPNB (SEQ ID NO: 4);
- Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4);
- FMOC-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4);
- Ac-IEESQNQ-COOH (SEQ ID NO: 6);
- FMOC-IEESQNQ-COOH (SEQ ID NO: 6);
- NH_{2}-IEESQNQQ-OPNB (SEQ ID NO: 7);
- FMOC-IEESQNQQ-OPNB (SEQ ID NO: 7);
- Ac-EKNEQEL-COOH (SEQ ID NO: 10);
- FMOC-EKNEQEL-COOH (SEQ ID NO: 10);
- Ac-EKNEQELLEL-COOH (SEQ ID NO: 11);
- FMOC-EKNEQELLEL-COOH (SEQ ID NO: 11);
- NH_{2}-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 12);
- FMOC-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 12);
- Ac-LELDKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 15);
- FMOC-LELDKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 15);
- NH_{2}-LELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 16);
- FMOC-LELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 16);
- Ac-DKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 17);
- FMOC-DKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 17);
- NH_{2}-DKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 18);
- FMOC-DKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO: 18); y
- FMOC-EKNEQELLELDKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 19).
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