ES2332418T3

ES2332418T3 - Sintesis del peptido t-20 empleando fragmentos intermedios del peptido.

Info

Publication number: ES2332418T3
Application number: ES05824259T
Authority: ES
Inventors: Yeun-Kwei Han; David A. Johnston; Hiralal N. Khatri
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2004-12-30
Filing date: 2005-12-22
Publication date: 2010-02-04
Anticipated expiration: 2025-12-22
Also published as: WO2006069728A1; IL184080A0; CN101133077B; EP1833843B1; IL184080A; ATE445636T1; KR20070103400A; JP4886702B2; CA2592438C; CN101133077A; DE602005017188D1; JP2008526698A; CA2592438A1; US20060276624A1; MX2007007917A; EP1833843A1; KR101243013B1

Abstract

Un método para la preparación de un péptido que tiene la secuencia: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2 que comprende los pasos de: (SEQ ID NO:1), (a) suministro de una resina soporte de síntesis en fase sólida de fórmula Z-Q-[SUP], en donde [SUP] es la resina soporte, Q es un radical de glutamina, y Z es un grupo protector del terminal NH 2, y en donde Z-Q está presente sobre [SUP] como un factor de carga de 0,5 ó inferior; (b) copulación de los aminoácidos con Z-Q-[SUP] para proporcionar Z -YTSLIHSLIEESQNQQ-[SUP] ; (c) tratamiento del Z-YTSLIHSLIEESQNQQ-[SUP] para proporcionar un producto de escisión Ac-YTSLIHS LIEESQNQQ-OH (SEQ ID NO:2); y (d) empleo del Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH (SEQ ID NO:2) para la síntesis del Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE KNEQELLELDKWASLWNWF-NH 2 (SEQ ID NO:1).

Description

Síntesis del péptido T-20 empleando fragmentos intermedios del péptido.

La invención se refiere a métodos para la preparación de péptidos T-20 empleando procedimientos en fase sólida y en fase de solución, además de los fragmentos intermedios de péptidos T-20 que pueden emplearse en estos métodos. Más particularmente, la invención se refiere a la preparación de péptidos T-20 empleando dos fragmentos que se sintetizan empleando un método de fase sólida.

En la literatura, están descritos muchos métodos para la síntesis de péptidos (por ejemplo, ver la patente U.S. nº 6.015.881; Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29: 4005-4008; Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29: 4009-4012; Kamber et al. (eds), Peptides, Chemistry and Biology ("Péptidos, Química y Biología"), ESCOM, Leiden (1992) 525-526; Riniker et al. (1993) Tetrahedron Letters 49: 9307-9320; Lloyd-Williams et al. (1993) Tetrahedron Letters 49: 11065-11133, y Andersson et al. (2000) Biopolymers ("Biopolímeros") 55: 227-250. Los distintos métodos de síntesis se diferencian por el estado físico de la fase en la cual tiene lugar la síntesis, a saber, fase líquida o fase sólida.

En la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS), un aminoácido o un grupo peptídico se une a un soporte sólido de resina. A continuación, sucesivos aminoácidos con grupos peptídicos se unen al péptido unido a un soporte hasta que se forma el material peptídico deseado. A continuación, el péptido unido al soporte, se escinde típicamente de dicho soporte y se somete a otro procedimiento y/o purificación. En algunos casos, la síntesis en fase sólida produce un producto peptídico maduro; en otros casos el péptido escindido del soporte (es decir, un "fragmento peptídico intermedio") se emplea en la preparación de un gran producto peptídico maduro.

Los fragmentos peptídicos intermedios generados a partir de procedimientos en fase sólida pueden ser copulados juntamente en un procedimiento de síntesis de fase líquida (denominado en la presente como "síntesis en fase de solución"). La síntesis en fase de solución puede ser particularmente útil en casos en los que la síntesis de un péptido útil maduro mediante fase sólida es o bien imposible o bien no es práctica. Por ejemplo, en la síntesis en fase sólida, los péptidos más grandes pueden adoptar eventualmente una configuración irregular mientras siguen unidos todavía a un soporte sólido, con lo cual se obtiene como resultado una pérdida parcial o completa de actividad en el producto final. Así pues, como la cadena del péptido se vuelve cada vez más larga sobre la resina soporte, la eficiencia de los pasos del procedimiento tales como la copulación y la desprotección puede verse comprometida. Esto, a la vez, puede dar por resultado unos tiempos de procesado más largos para compensar estos problemas, además de las pérdidas de incremento en los materiales de partida, tales como los aminoácidos activables, como reactivos, y disolventes. Estos problemas pueden aumentar cuando la longitud del péptido aumenta y por lo tanto, es relativamente inusual encontrar péptidos maduros mayores de 30 aminoácidos de longitud, sintetizados empleando solamente un procedimiento en fase sólida.

En la copulación en fase de solución, dos fragmentos intermedios de péptido, o un fragmento intermedio de péptido, y un aminoácido reactivo se copulan en un disolvente apropiado y normalmente en presencia de reactivos adicionales que promueven la eficiencia y calidad de la reacción de copulación. Los fragmentos intermedios de péptido se preparan reactivamente de manera que el terminal N de un fragmento se copula con el terminal C de otro fragmento, o viceversa. Además los grupos protectores de la cadena, que están presentes durante la síntesis en fase sólida, están habitualmente retenidos sobre los fragmentos durante la copulación en fase de solución para asegurar la reactividad específica de los extremos terminales de los fragmentos. Estos grupos protectores de la cadena lateral no se eliminan típicamente hasta que el péptido maduro ha sido formado.

Para la síntesis de péptidos muy grandes no es inusual para los pasos múltiples de copulación en fase de solución, que éstos se efectúen empleando tres o cuatro o más fragmentos peptídicos intermedios. Mientras el concepto general de las reacciones de copulación extremo-con-extremo en las reacciones en fase de solución es en general teóricamente sencillo cuando se emplean fragmentos peptídicos intermedios múltiples, en la práctica esto sucede muy raramente. Varios factores, tales como las impurezas y el rendimiento del péptido, pueden tener un efecto significativo sobre la calidad y el rendimiento del péptido de longitud completa. Por lo tanto, la síntesis peptídica empleando esquemas híbridos son a menudo estimulados, y en muchos casos es difícil predecir qué problemas van a ser inherentes en un esquema de síntesis hasta que se efectúa la síntesis real.

En algunos casos, la síntesis en fase de solución puede estar afectada por una falta de pureza de los fragmentos peptídicos intermedios siguiendo la síntesis en fase sólida. A este respecto, puede ser necesario someter los fragmentos peptídicos intermedios a un paso de purificación antes de copular los fragmentos en un procedimiento en fase de solución. La purificación, a su vez, puede ocasionar una reducción del rendimiento del fragmento peptídico intermedio, y en consecuencia en el producto peptídico final.

También, el rendimiento del péptido maduro es inversamente proporcional al número de pasos en fase de solución que son necesarios para la síntesis del péptido maduro. En algunos casos, pueden ser necesarios tres, cuatro o más de cuatro, pasos en fase de solución, utilizando productos peptídicos intermedios, para generar un péptido maduro. Cada paso de copulación de la fase de solución adicional, puede dar por resultado un retroceso disminuido en la producción de producto peptídico de longitud completa. Por lo tanto para mejorar el rendimiento global, es generalmente deseable minimizar los pasos que están involucrados en la copulación.

Moderadas mejoras en uno o más pasos en el esquema sintético global, pueden ocasionar mejoras significativas en la preparación del péptido maduro. Estas mejoras pueden proporcionar un gran ahorro global de tiempo y reactivos y pueden mejorar también significativamente la pureza y rendimiento del producto final.

Mientras la discusión de la importancia de las mejoras en la síntesis de híbridos es aplicable a cualquier clase de péptido producido empleando estos procedimientos, es de particular importancia en el contexto de los péptidos que son terapéuticamente útiles y que se fabrican a una escala para el empleo médico comercial. Mientras la síntesis de los productos farmacéuticos de molécula pequeña puede ser relativamente económica, el coste de la síntesis de productos farmacéuticos biomoleculares más grandes, como los péptidos terapéuticos, puede ser en comparación mucho más grande. Debido al coste de los reactivos, el tiempo de síntesis, además de otros factores, muy pocas mejoras en el proceso sintético de estos productos farmacéuticos biomoleculares más grandes puede tener un impacto significativo sobre si es económicamente factible producir dicho producto farmacéutico. Dichas mejoras son necesarias debido a estos altos costes de producción para los productos farmacéuticos biomoleculares más grandes, como se confirma por el hecho de que en muchos casos hay pocas, si es que hay alguna, alternativas terapéuticas adecuadas para este tipo de productos farmacéuticos biomoleculares más grandes.

Esto se ha visto claramente en el caso de péptidos terapéuticos que se emplean para el tratamiento de enfermedades de inmunodeficiencia causadas por una infección retrovírica. Los péptidos que tiene una actividad anti-retrovírica pueden actuar de diferentes maneras, incluyendo la fusión preventiva de las partículas víricas con la célula anfitriona inmune. Existe una gran necesidad de estos nuevos y efectivos péptidos terapéuticos debido a que, en muchos casos, los antivíricos tradicionales empleados se vuelven ineficaces para el tratamiento de estas enfermedades a causa de la resistencia vírica debida a una mutación.

Una prometedora clase de péptidos terapéuticos de utilidad para combatir las enfermedades de la inmunodeficiencia son los inhibidores de la fusión. Este tipo de péptidos terapéuticos puede reducir el título vírico, y aumentar significativamente la calidad de vida de los pacientes que tienen enfermedades inmunodeficientes. Por ejemplo, el péptido FUZEON® conocido también como infuvirtido ó T-20), el cual es un péptido sintético, de 36 aminoácidos, el péptido híbrido T-1249, derivados y contrapartidas de estos péptidos, han demostrado que son beneficios como inhibidores de la fusión en el tratamiento del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) y el síndrome adquirido de inmunodeficiencia (AIDS). El péptido FUZEON® y sus derivados son los primeros inhibidores del HIV que demostraron una consistencia, potente actividad, en personas infectadas con el HIV. Kilby et al., (1998) Nat Med 4:1302, y Kilby et al., (2002) AIDS Res Hum Retroviruses 18:685.

Los inhibidores de fusión, tales como los péptidos T-20 y T-1249, se unen a una región de la cubierta de la glico-proteína 41 del HIV tipo 1 (HIV-1), que está implicada en la fusión del virus con la membrana de la célula anfitriona CD4+. Wild et al., (1993) AIDS Res. Hum. Retroviruses 9: 1051. Dos inhibidores de la fusión permanecen fuera de la célula y bloquean el HIV-1 antes de que el HIV-1 entre en la célula. El péptido FUZEON® y sus derivados minimizan las interacciones de los fármacos, efectos colaterales y citoxicidad por la potencialmente y selectivamente inhibición del HIV-1 in vitro.

Además de estos asuntos, cuestiones en relación con la recuperación del producto y la pureza del producto para la producción a gran escala de péptidos, así como también la manipulación de reactivos, almacenamiento y venta, pueden impactar de forma importante la viabilidad del esquema de la síntesis de péptidos. Así, existe una continua necesidad de procedimientos de síntesis de péptidos capaces de producir eficientemente materiales peptídicos de interés comercial en grandes cantidades de partidas con los mejores rendimientos. La recuperación de los péptidos escindidos a partir de una resina de soporte, después de la síntesis en fase sólida del péptido, es un aspecto de la síntesis en el cual se necesita un perfeccionamiento.

La presente invención se refiere a la preparación de péptidos T-20 que se sintetizan empleando un método de una fase sólida y una fase en solución ("método híbrido"). En general, el método incluye la síntesis de dos diferentes fragmentos intermedios del péptido-20 (SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3 ó contrapartidas de los mismos) empleando la química en fase sólida. De acuerdo con algunos aspectos de la invención, se ha descubierto que después de la síntesis en fase sólida, estas secuencias intermedias específicas del T-20 se prestan por si mismas particularmente bien a los pasos de copulación en fase de solución. Además, se ha descubierto también que los pasos en fase sólida que conducen a la formación de estos fragmentos intermedios de los péptidos pueden ser modificados según la invención para mejorar significativamente el rendimiento y la pureza de estos fragmentos intermedios. Este rendimiento y pureza mejorados perduran en los pasos de acoplamiento en fase de solución, con lo cual se mejora todo el procedimiento sintético.

Los métodos de la invención y los fragmentos intermedios de los péptidos descritos en la presente son particularmente ventajosos, especialmente hacen que el procedimiento de síntesis del T-20 sea más eficiente en un número de caminos. En particular, los pasos de síntesis en fase sólida que conducen a la formación de productos intermedios del péptido T-20, SEQ ID NO: 2 ó SEQ ID NO: 3, utiliza una resina de soporte que tiene un primer aminoácido copulado a un soporte con un factor de carga que es inferior al que tradicionalmente se emplea en las técnicas estándar de fase sólida. Se ha descubierto favorablemente, que empleando este bajo factor de carga, los productos intermedios de los péptidos SEQ ID NO: 2 ó SEQ ID NO: 3, los cuales son fragmentos sintetizados en fase sólida atípicamente largos, pueden producirse con un mejor rendimiento y una mejor pureza.

La pureza y el rendimiento mejorados, mejoran significativamente las condiciones para los pasos de copulación en fase de solución, con lo cual resulta una mejora para la síntesis global del T-20.

Hasta ahora, la mayor parte de métodos de síntesis con éxito del T-20, han utilizado la copulación en fase de solución, en donde tres o más de tres fragmentos intermedios de péptidos, se preparan mediante síntesis de fase sólida; estos fragmentos intermedios se emplean a continuación en reacciones de copulación en fase de solución para preparar el producto T-20 maduro final. Aunque pueda verse como una ventaja que el método de tres (o más) fragmentos pueda resultar en una calidad más alta de la síntesis en fase sólida de los fragmentos intermedios, una desventaja es que el método de tres (o más) fragmentos implica más pasos de aislamiento y purificación, comparado con un método de dos fragmentos, y estos pasos adicionales generalmente aumenta en el tiempo de procesado y pueden reducir por lo tanto el rendimiento global de la reacción de síntesis.

Debido a que la presente invención emplea solamente dos fragmentos intermedios del péptido preparados por vía de síntesis en fase sólida, una clara ventaja es que los tiempos de procesado se reducen y la eliminación de los pasos de pro-cesado puede dar por resultado un empleo más eficiente de los materiales y reactivos. Sin embargo, una potencial desventaja con el método de dos fragmentos es que la síntesis de fragmentos intermedios más largos mediante la síntesis de fase sólida puede complicarse y a menudo conduce a serios problemas de pureza y yo de recuperación. A pesar de esto, como se ha indicado, la presente invención demuestra que el método para escoger los fragmentos de péptidos intermedios que tengan una secuencia basada en SEQ ID NO:2 ó SEQ ID NO:3 y a continuación sintetizando estos fragmentos mediante la síntesis en fase sólida empleando un bajo factor de carga de resina, permite que se produzcan con éxito los fragmentos intermedios con un buen rendimiento y pureza. Este resultado es más importante a la vista de los métodos convencionales para la síntesis de péptidos empleando los métodos combinados de fase sólida y fase en solución.

En consecuencia, en algunos aspectos, la invención proporciona un método para la preparación de un fragmento intermedio del péptido para la síntesis de un péptido T-20 que incluye los pasos de (a) suministro de una resina soporte de la síntesis en fase sólida que tenga un primer aminoácido copulado con el radical que es la glutamina (Q), en donde la glutamina se copula con un factor de carga de 0,5 ó menos; de preferencia la glutamina se copula con un factor de carga entre 0,2 y 0,5; (b) copulación de los subsiguientes aminoácidos con el primer aminoácido del soporte copulado para proporcionar la siguiente secuencia: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-[soporte]; (c) eliminación del péptido intermedio Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO:2) a partir del soporte en una reacción de escisión; y a continuación empleo del péptido intermedio Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO:2) para la síntesis de un péptido que tiene todo o una parte del Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF
(SEQ ID NO:1).

En otros aspectos, la invención proporciona la preparación de un fragmento intermedio del péptido para la síntesis de un péptido T-20 que incluye los pasos de (a) preparación de una resina soporte de síntesis en fase sólida que tiene un primer aminoácido copulado con el radical triptófano (W), en donde el triptófano se copula con un factor de carga de 0,5 ó inferior; de preferencia el triptófano se copula con un factor de carga entre 0,2 y 0,5; (b) copulación de los subsiguientes aminoácidos al primer aminoácido sobre el soporte copulado para proporcionar la siguiente secuencia EKNEQELLELDKWASLWNW-[soporte]; (c) eliminación del intermedio del péptido EKNEQELLELDK
WASLWNW (SEQ ID NO:3) a partir del soporte en una reacción de escisión; y a continuación empleo del intermedio del péptido EKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO:3) para la síntesis de un péptido que tiene todo o una parte del Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO:1).

Con la máxima preferencia, la invención proporciona un método para la preparación de un péptido T-20 que incluye los pasos de (a) suministro de los fragmentos intermedios del péptido, que tienen las secuencias Ac-YTS
LIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO:2) y EKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO:3), en donde los fragmentos intermedios del péptido han sido sintetizados sobre soportes sólidos empleando un factor de carga de 0,5 ó menos; de preferencia utilizando un factor de carga entre 0,2 y 0,5, (b) en fase de solución, reacción del péptido EKNEQE
LLELDKWASLWNW (SEQ ID NO:3) con un radical de fenil-alaninamida para proporcionar la secuencia EKNEQE
LLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO:4); y (c) en fase de solución, haciendo reaccionar el péptido Ac-YTSLIHS
LIEESQNQQ (SEQ ID NO:2) con el péptido EKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO:4) para proporcionar el péptido Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO:1).

En otros aspectos, en el paso de copulación, el primer aminoácido está presente sobre un soporte con un factor de carga inferior a 0,5. En otros aspectos, en el paso de copulación del primer aminoácido está presente sobre un soporte con un factor de carga en el margen de 0,2-0,45, ó un factor de carga en el margen de 0,25-0,40.

Todavía en otros aspectos, la síntesis en fase sólida se efectúa mediante la copulación de aminoácidos a la naciente cadena de péptidos en una cantidad entre 1 y 1,5 equivalentes.

En otros aspectos la invención proporciona un polipéptido que tiene la secuencia EKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO:3). La SEQ ID NO:3 puede sintetizarse mediante la síntesis en fase sólida empleando un factor de carga de 0,5 ó menos.

Las versiones de la presente invención descritas más adelante, no se pretende que sean exhaustivas o que limiten la invención a formas precisas descritas en la siguiente descripción detallada. Más bien, las versiones se escogen y describen de manera que otras personas expertas en la técnica puedan apreciar y comprender los principios y prácticas de la presente invención.

La terminología empleada en la presente no pretende limitar el ámbito de la invención. A través del texto, incluyendo las reivindicaciones del apéndice, las formas singulares "un", "uno" y "el" , incluyen una referencia plural, a no ser que el contexto indique claramente otra cosa. Así por ejemplo, una referencia a "un radical aminoácido", es una referencia a uno o más radicales aminoácidos e incluye equivalentes de los mismos conocidos por los expertos de la técnica. En esta invención, ciertos términos se emplean con frecuencia, cuyos significados se proporcionan en la presente. A no ser que se indique otra cosa, los términos empleados en la presente tienen el mismo significado que se da corrientemente por una persona normalmente experta en la técnica en este campo de la tecnología. Algunos términos pueden también explicarse con gran detalle más tarde en la especificación.

La presente invención se refiere a métodos para perfeccionar la síntesis del T-20 (conocido también como "enfuvirtide"), y contrapartidas del T-20, y en particular para perfeccionar aspectos de la síntesis con referencia a la síntesis en fase sólida de los fragmentos intermedios del péptido T-20. La metodología de la presente invención es útil para la preparación del péptido T-20 y contrapartidas del mismo, empleando solamente dos fragmentos del péptido sintetizados en fase sólida. A la vez que la invención se refiere generalmente a la síntesis del T-20, las enseñanzas inventivas de la presente pueden ser también aplicables a la síntesis de otros péptidos, particularmente aquellos que se sintetizan empleando una combinación de los métodos en fase sólida y en fase de solución. La invención es también aplicable a la síntesis de fragmentos intermedios del péptido asociados con impurezas, particularmente impurezas de piroglutamato.

Los métodos descritos en la presente son particularmente adecuados para el perfeccionamiento de aspectos de la síntesis a mayor escala de los péptidos T-20. Los procedimientos a mayor escala se efectúan típicamente para proporcionar una cantidad de péptido útil para la distribución. Por ejemplo, la cantidad de péptido en un procedimiento a mayor escala puede ser de 500 g, ó de 1 kg por partida o más, y más típicamente decenas de kgs a centenas de kgs por partida o más. En los procedimientos sintéticos a mayor escala, tales como la síntesis a gran escala pueden emplearse uno o más grandes recipientes de reacción. Estos pueden contener cantidades de reactivos tales como resinas, disolventes, aminoácidos, y productos químicos para varios pasos en el procedimiento de síntesis, en un tamaño que permite la producción de péptidos en cantidades por ejemplo, en el margen de 100-500 kilogramos o más.

Los métodos descritos en la presente son particularmente adecuados para el perfeccionamiento de aspectos de la síntesis de péptidos, particularmente para procedimientos a mayor escala. En las versiones preferidas, los métodos de la invención, pueden proporcionar mejoras tales como la reducción en el tiempo de procesado (síntesis), mejoras en el rendimiento de los productos, mejoras en la pureza del producto, de reducción de la cantidad de reactivos y materiales de partida necesarios.

El T-20 es un péptido que corresponde a los radicales aminoácidos 638 a 673 de la proteína transmembránica gp41 del aislado de HIV-1LAI, y tiene una secuencia de 36 aminoácidos. La secuencia del péptido T-20 (SEQ ID NO 1), se muestra a continuación:

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLBLDKWASLWNWF

(SEQ ID NO:1).

El T-20 es un fármaco anti-retrovírico que se emplea para el tratamiento de la infección con el HIV-1. El T-20 funciona para bloquear la fusión de la partícula vírica HIV-1 con células anfitrionas mediante el bloqueo de los cambios conformacionales requeridos para la fusión de la membrana. Los péptidos que tienen este tipo de actividad están referidos en la presente como que tienen actividad T-20.

La síntesis del T-20 emplea típicamente procedimientos tanto en fase sólida como en fase líquida para sintetizar y combinar grupos de fragmentos específicos de péptido para producir el producto "enfuvirtide" (Bray, B.L., Nature Rev., 2:587-593 (2003)). La presente invención proporciona métodos para la síntesis perfeccionada tanto de los intermedios del péptido "enfuvirtide" como de los productos "enfuvirtide" de longitud completa. Los métodos de la invención incluyen también la síntesis de péptidos que tienen actividad "enfuvirtide" e intermedios de péptido empleados para preparar péptidos que tienen actividad "enfuvirtide". Los péptidos que tienen actividad "enfuvirtide" están descritos en las patentes U.S. n^{os}. 5.464.933 y 5.656.480 y la publicación PCT nº WO 96/19495.

La invención es también aplicable a la síntesis de contrapartidas del T-20, incluyendo las contrapartidas del T-20 de longitud completa y las contrapartidas de los intermedios del péptido T-20. Como se emplea en la presente, una "contrapartida del T-20" se refiere a un compuesto derivado del T-20 ó un fragmento intermedio del T-20. Las contra-partidas de los péptidos incluyen, pero no están limitadas a, los análogos de péptidos, derivados de péptidos, compuestos de fusión, y similares. En consecuencia, cuando se refiere a fragmentos intermedios del péptido T-20, que tienen las secuencias SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 3, sus contrapartidas incluyen por ejemplo, análogos del péptido, derivados del péptido, compuestos de fusión de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente.

Como se emplea en la presente, un análogo de péptido se refiere generalmente a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos modificada por ejemplo con una o más substituciones de aminoácidos, supresiones, inversiones, y/o adiciones relativas a otro péptido o de otra contrapartida de péptido. Las substituciones pueden ser de preferencia conservadoras o altamente conservadoras. Una substitución conservadora se refiere a la substitución de un aminoácido con otro que tiene generalmente la misma carga electrónica neta y generalmente el mismo tamaño y forma. Por ejemplo, los aminoácidos con cadenas laterales alifáticas o aminoácidos alifáticos substituidos, tiene aproximadamente el mismo tamaño cuando el número total de carbonos y heteroátomos en sus cadenas laterales difieren no más de aproximadamente cuatro. Tienen aproximadamente la misma forma cuando el número de ramas de sus cadenas laterales difiere en no más de aproximadamente una o dos. Los aminoácidos con grupos fenilo o grupos fenilo substituidos en sus cadenas laterales se considera que tienen aproximadamente el mismo tamaño y forma. Relacionados más adelante se muestran cinco grupos de aminoácidos. Reemplazando un aminoácido de un compuesto con otro aminoácido del mismo grupo, generalmente da como resultado una substitución conservadora.

Grupo I: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteína, metionina y los aminoácidos que no se encuentran en la naturaleza, con cadenas laterales alifáticas de uno a cuatro átomos de carbono o cadenas laterales alifáticas de uno a cuatro átomos de carbono substituidas con hidroxilo (cadena recta o monoramificada).

Grupo II: ácido glutámico, ácido aspártico y aminoácidos que no se encuentran en la naturaleza con cadenas laterales alifáticas de 1 a 4 átomos de carbono substituidas con ácido carboxílico (sin ramificar o con un punto de ramificación).

Grupo III: lisina, ornitina, arginina y aminoácidos que no se encuentran en la naturaleza, con amina o cadenas laterales alifáticas de uno a cuatro átomos de carbono substituidas con guanidino (sin ramificar o con un punto de ramificación).

Grupo IV: glutamina, asparagina y aminoácidos que no se encuentran en la naturaleza, con cadenas laterales alifáticas de uno a cuatro átomos de carbono substituidas con amida (sin ramificar o con un punto de ramificación).

Grupo V: fenilalanina, fenilglicina, tirosina y triptófano.

Una "substitución altamente conservadora" es el reemplazamiento de un aminoácido con otro aminoácido que tiene el mismo grupo funcional en la cadena lateral y casi el mismo tamaño y forma. Los aminoácidos con cadenas laterales de aminoácidos alifáticos o aminoácidos alifáticos substituidos tienen casi el mismo tamaño cuando el número total de carbonos y heteroátomos de sus cadenas laterales difieren en no más de dos. Tienen casi la misma forma cuando tienen el mismo número de ramas en sus cadenas laterales. Ejemplos de substituciones altamente conservadoras incluyen la valina por la leucina, la treonina por la serina, y el ácido aspártico por el ácido glutámico y la fenilglicina por la fenilalanina.

Un derivado peptídico se refiere generalmente a un péptido, un análogo de péptido, u otra contrapartida de péptido, que tiene una modificación química de uno o más de sus grupos laterales, átomos de carbono alfa, grupos amino terminales, y/o un grupo terminal de ácido carboxílico. A título de ejemplo, una modificación química incluye, pero no está limitada a, la adición de grupos químicos, creación de nuevos enlaces, y/o eliminación de grupos químicos. Las modificaciones en los grupos laterales de aminoácidos incluyen, sin limitación, la acilación de grupos e-amino de lisina, la N-alquilación de arginina, histidina o lisina, la alquilación de los grupos de ácido carboxílico glutámico o aspártico, y la desamidación de la glutamina o asparagina. Las modificaciones del grupo amino terminal incluyen, sin limitación, las modificaciones de desaminación, del N-alquilo inferior, del N-di-alquilo inferior, y del N-acilo (por ejemplo, -CO-alquilo inferior). Las modificaciones del grupo carboxilo terminal incluyen, sin limitar, las modificaciones de amida, alquilamida inferior, dialquilamida, y alquiléster inferior. Así pues, los péptidos parcialmente o completamente protegidos constituyen derivados de los péptidos.

Se hace referencia al siguiente grupo de péptidos, el cual incluye el T-20 y fragmentos intermedios del T-20, como se indica en la tabla 1.

TABLA 1

1

Para proporcionar una visión general, basada en los métodos de la invención, el esquema sintético global para el péptido T-20 es como sigue. Se prepara el T-20 (SEQ ID NO:1) mediante los pasos que incluyen las síntesis en fase sólida de los fragmentos intermedios del péptido T-20 Ac-YTSLIHSLIEE-SQNQQ (SEQ ID NO:2), y EKNEQE
LLELDKWASLWNW (SEQ ID NO:3). Estos péptidos se sintetizan empleando los métodos descritos en la presente y a continuación se separan de la resina de fase sólida en forma de cadena lateral protegida. A continuación se copula un radical fenilalaninamida con el intermedio del péptido EKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO:3) en solución, para producir el EKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO:4). A continuación se copula el EKNEQE
LLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO:4) al Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO:2) en solución, para producir el Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO:1).

De acuerdo con la presente invención, las técnicas de la síntesis en fase sólida se emplean para preparar un primer fragmento de péptido del T-20 (fragmento intermedio 1) que tiene la secuencia de 16 aminoácidos Ac-YTSLIHS
LIEBSQNQQ (SEQ ID NO:2) ó una contrapartida de la misma. Para referencia con respecto al método preferido de la síntesis en fase sólida, el radical amino terminal de la glutamina (Q) (es decir el radical número 16 de la SEQ ID NO:2), el cual está presente en la parte del C-terminal del péptido, es el primer radical aminoácido que está copulado con la resina de fase sólida, y así constituye el aminoácido alfa del fragmento en términos de su posición con respecto a la resina soporte sólida. En este método preferido de síntesis en fase sólida se procede por lo tanto mediante la adición consecutiva de radicales aminoácido a partir del amino terminal al carboxilo terminal, añadiendo secuencialmente aminoácidos de una manera correspondiente a la secuencia deseada. La síntesis del fragmento intermedio del péptido se completa después de que el radical N-terminal (por ejemplo, el N-terminal de la tirosina (Y) de la SEQ ID NO: 2) ha sido añadido a la cadena del péptido naciente.

Las técnicas de síntesis en fase sólida se emplean también para preparar un segundo fragmento de péptido del T-20 (fragmento intermedio 2), que tiene la secuencia de 19 aminoácidos EKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO:3) ó una contrapartida de la misma. Por referencia con respecto al método preferido de la síntesis de fase sólida, el radical amino terminal triptófano (W) (es decir, el radical 19 de la SEQ ID NO:3), ó el radical número 35 de la SEQ ID NO:1) es el primer radical aminoácido que se copula a la resina en fase sólida y así constituye el alfa aminoácido del fragmento en términos de su posición con respecto a la resina soporte sólida. En este método preferido de síntesis en fase sólida se procede también por adición consecutiva de radicales aminoácido a partir del amino terminal al carboxilo terminal, añadiendo secuencialmente aminoácidos de manera correspondiente a la secuencia deseada. La síntesis del fragmento intermedio de péptido, se completa después del radical N-terminal (por ejemplo el N-terminal del ácido glutámico (E) de la SEQ ID NO: 3) ha sido añadido a la cadena de péptido naciente.

Se ha observado también que cada uno de los fragmentos intermedios 1 y 2, incluye los radicales de por lo menos 16 aminoácidos. Estos son más bien fragmentos de péptido grandes en el contexto de la síntesis en fase sólida, en que todavía los principios de la presente invención permiten fragmentos de tal longitud y el resultante T-20 se sintetiza con un alto rendimiento y pureza.

De acuerdo con la invención, se ha descubierto mediante un control apropiado de la cantidad relativa de péptido sintetizado sobre la resina de fase sólida, que pueden obtenerse efectos beneficiosos con respecto al rendimiento y a la pureza de los fragmentos intermedios de péptido. La cantidad relativa de péptido sintetizado puede controlarse mediante el factor de carga, el cual se refiere a la cantidad de aminoácido alfa copulado con una cantidad de resina, típicamente expresada como milimoles de aminoácido alfa por gramo de resina de fase sólida. Por ejemplo, un factor de carga de 0,25 correspondería a 25 mmoles de aminoácido alfa que se copula realmente con 100 g de resina de fase sólida. Se comprende que la reacción que copula el primer aminoácido a la resina de fase sólida puede no ser completamente eficiente, y por lo tanto la cantidad real que se copula puede ser inferior a la cantidad teórica basada en el 100% de eficiencia de copulación, y las cantidades de los reactivos de partida. La cantidad real de material copulado puede determinarse después de que la reacción haya tenido lugar. Con el fin de determinar la copulación real, el péptido puede separarse de la resina y analizarse empleando por ejemplo el análisis HPLC frente a un estándar. Métodos para la determinación de la cantidad real del primer radical aminoácido copulado se describen en la presente.

De acuerdo con la invención, se ha descubierto que el rendimiento y la pureza de un fragmento de péptido relativamente largo (como por ejemplo las secuencias SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3 de los fragmentos intermedios del péptido), y por lo tanto el rendimiento y la pureza del péptido T-20 resultante, tienen tendencia a ser más altos con factores de carga relativamente más bajos, como por ejemplo 0,5 ó menos. Sin embargo, si el factor de carga es, por ejemplo, inferior a 0,2, entonces el producto obtenido puede ser acortado. Equilibrando estos conceptos, el factor de carga con respecto a por lo menos uno de los fragmentos 1 y 2, de preferencia ambos fragmentos 1 y 2, está entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 0,50, de preferencia en el margen de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,45, y con más preferencia en el margen de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,40. Por ejemplo, en una modalidad representativa de la práctica, sería apropiado emplear un factor de carga de aproximadamente 0,34.

Para ilustrar este aspecto, puede efectuarse el siguiente procedimiento en fase sólida. Se obtiene una resina adecuada y se prepara lavándola en un disolvente apropiado. A continuación, se añade una solución que contiene el primer aminoácido en una forma activable y protegida, a la resina lavada. Para lograr un factor de carga dentro del margen deseado, pueden escogerse la cantidad y/o concentración de aminoácido, y/o otros factores de la reacción, como por ejemplo la presencia y concentración de co-reactivos tales como el HOBT, la duración de la reacción de copulación, la temperatura de la reacción de copulación, etc..

La síntesis en fase sólida empleando la química del Fmoc, puede emplearse para preparar un(os) fragmento(s) intermedio(s) del T-20 (como por ejemplo fragmentos intermedios de péptido que incluyen las SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3), copulados a una resina. Después de que el fragmento intermedio del péptido se ha sintetizado sobre la resina, se separa empleando un reactivo de escisión para generar un fragmento de péptido intermedio en solución que está en forma protegida. El fragmento de péptido intermedio se separa a continuación de la resina. En algunos casos, el fragmento de péptido intermedio se pone en contacto con un agente precipitante como una medida para purificar el fragmento de péptido intermedio antes de efectuar la copulación en fase de solución.

Los métodos para la síntesis de péptidos empleando un método en fase sólida son ya bien conocidos en la técnica. En consecuencia, la invención contempla el empleo de cualquier método sintético en fase sólida, empleando un factor de carga bajo para la preparación de fragmentos de péptidos intermedios que pueden emplearse en la preparación de un producto final T-20.

Por ejemplo, los fragmentos intermedios del péptido T-20 descritos en la presente pueden sintetizarse mediante técnicas SSPS empleando protocolos de FMOC estándar. Véase por ejemplo, Carpin et al., (1970), J. Am. Chem. Soc. 92(19): 5748-5749; Carpin et al., (1972), J. Org. Chem. 37 (22): 3404-3409, "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis" ("Síntesis Fmoc de péptidos en fase sólida"), Weng C. Chan y Peter D. White Eds. (2000) Oxford University Press Oxford Eng.

Puede emplearse cualquier tipo de soporte adecuado en la práctica de la síntesis de péptidos en fase sólida. En las versiones preferidas el soporte comprende una resina que puede obtenerse a partir de uno o más polímeros, copolímeros o combinaciones de polímeros como por ejemplo la poliamida, polisulfamida, polietilenos substituidos, polietilenglicol, resinas fenólicas, polisacáridos, o poliestireno. El soporte de polímero puede ser también cualquier sólido que sea suficientemente insoluble e inerte a los disolventes empleados en la síntesis del péptido. El soporte sólido incluye típicamente un grupo de unión al cual el péptido creciente se copula durante la síntesis y el cual puede ser escindido en condiciones deseadas para liberar el péptido del soporte. Soportes sólidos adecuados pueden tener agentes de unión que son foto-escindibles, TFA-escindible, HF-escindible, ión fluoruro escindible, escindible por reducción; Pd(O)-escindible; nucleofílicamente escindible; o radicalmente escindible. Los grupos de unión preferidos son escindibles en condiciones tales que el péptido escindido está todavía substancialmente globalmente
protegido.

En un método de síntesis preferido, los fragmentos intermedios del péptido se sintetizan sobre un soporte sólido sensible a los ácidos que incluye grupos tritilo, y con mayor preferencia sobre una resina que incluye grupos tritilo con grupos cloruro colgantes, por ejemplo una resina de cloruro de 2-clorotritilo (2-CTC) (Barlos et al., (1989) Tetrahedron Letters 30(30): 3943-3946). Otros ejemplos incluyen, la resina de cloruro de tritilo, resina de cloruro de 4-metiltritilo, resina de cloruro de 4-metoxitritilo, resina de 4-aminobutan-1-ol 2-clorotritilo, resina de 4-aminometil-benzoil 2-clorotritilo, resina de 3-aminopropan-1-ol 2-cloro-tritilo, resina de ácido bromacético 2-clorotritilo, resina de ácido cianoacético 2-clorotritilo, resina de 4-ácido cianobenzoico 2-clorotritilo, resina de glicinol 2-cloro-tritilo, resina de propionico 2-clorotritilo, resina de etilenglicol 2-clorotritilo, resina de N-Fmoc hidroxilamina 2-clorotritilo, resina de hidracina 2-clorotritilo. Algunos soportes sólidos preferidos incluyen el poliestireno, el cual puede ser copolimerizado con divinilbenceno, para formar un material de soporte en el cual están anclados los grupos reactivos.

El material peptídico está típicamente unido a las perlas de resina tanto en la superficie de las perlas como en el interior de las mismas. El FMOC y el péptido protegido de cadena lateral, se escinde fácilmente en un estado protegido a partir de esta resina empleando reactivos de carácter suavemente ácido tales como el TFA diluido en DCM o ácido acético.

Otras resinas que se emplean en la síntesis de fase sólida incluye las resinas "Wang", las cuales comprenden un copolímero de estireno y divinilbenceno con grupos de anclaje 4-hidroximetilfeniloximetilo (Wang, S.S. 1973,J. Am. Chem. Soc.), y resina de ácido 4-hidroximetil-3-metoxifenoxibutírico (Richter et al. (1994), Tetrahedron Letters 35 (27): 4705-4706). Las resinas Wang, el cloruro de 2-clorotritilo, y el ácido 4-hidroximetil-3-metoxifenoxibutírico pueden adquirirse por ejemplo, en Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, California.

Con el fin de proporcionar un soporte que tenga un primer aminoácido copulado, la resina puede prepararse, por ejemplo, lavando, y a continuación incubando con una solución que contiene un aminoácido activado, protegido. El primer aminoácido y los aminoácidos subsiguientes que se copulan con la resina incluyen típicamente un grupo protector N-terminal, un grupo protector de una cadena lateral (en función del aminoácido específico), y un grupo que es reactivo con un grupo colgante de la resina o un grupo que es reactivo con un aminoácido colgante.

En aspectos preferidos, el primer aminoácido está ligado a un soporte en el extremo carboxilo, mientras que el terminal N y los grupos de cadenas laterales están protegidos, como es apropiado, mediante grupos de protección. Como descripción ejemplar, la síntesis en fase sólida del fragmento intermedio del péptido Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO:2), se efectúa a partir del carboxilo terminal hacia la dirección del NH_{2} terminal cargando en primer lugar un radical de glutamina protegido sobre una resina de cloruro de 2-clorotritilo (2-CTC).

La naturaleza y empleo de los grupos de protección son ya bien conocidos en la técnica. Generalmente un grupo de protección adecuado es cualquier clase de grupo que puede ayudar a prevenir al átomo o al grupo al cual está ligado, por ejemplo, oxígeno o nitrógeno, de la participación en reacciones no deseadas durante el procesado y la síntesis. Grupos de protección incluyen grupos de protección de cadena lateral y grupos de protección amino- ó N-terminal. Los grupos de protección pueden prevenir también la reacción o unión de ácidos carboxílicos, tioles, y similares.

Un grupo de protección de cadena lateral se refiere a un grupo químico copulado a la cadena lateral (es decir, un grupo R en la fórmula general de aminoácido H_{2}N-C(R)(H)-COOH) de un aminoácido que ayuda a prevenir que una parte de la cadena lateral reaccione con productos químicos empleados en los pasos de la síntesis de péptidos, procesado, etc.. La elección de un grupo de protección de cadena lateral puede depender de varios factores, por ejemplo el tipo de síntesis realizado, procesado al cual el péptido será sometido, y el producto intermedio deseado o producto final. La naturaleza del grupo de protección de cadena lateral depende también de la naturaleza del propio aminoácido. Generalmente un grupo de protección de cadena lateral se escoge de manera que no es eliminado durante la desprotección de los grupos amino durante la síntesis en fase sólida. Por consiguiente el grupo protector amino y el grupo protector de cadena lateral no son típicamente los mismos.

En algunos casos, y en función del tipo de reactivos empleados en la síntesis de fase sólida y otros procesados del péptido, un aminoácido puede no requerir la presencia de un grupo protector de cadena lateral. Estos aminoácidos típicamente no incluyen un oxígeno reactivo, nitrógeno, u otro grupo reactivo en la cadena lateral.

Ejemplos de grupos de protección de cadena lateral incluyen el acetilo (Ac), benzoilo (Bz), terc-butilo, trifenilmetilo (tritilo), tetrahidropiranilo, benciléter (Bzl), y 2,6-diclorobencilo (DCB), t-butoxicarbonilo (BOC), nitro, p-toluensulfonilo (Tos), adamantiloxicarbonilo, xantilo (Xan), bencilo, 2,6-diclorobencilo, metilo, éster de etilo y t-butilo, benciloxicarbonilo (Z), 2-clorobenciloxicarbonilo (2-Cl-Z), Tos, t-amiloxicarbonilo (Aoc), y grupos de protección del tipo uretano aromáticos o alifáticos, grupos foto-lábiles tales como el nitro veritril oxicarbonilo (NVOC); y grupos fluoruro lábiles tales como el trimetilsilil oxicarbonilo (TEOC).

Los grupos de protección de cadena lateral preferidos incluyen el grupo t-Bu para los radicales de aminoácidos Tyr (Y), Thr (T), Ser (S) y Asp (D); el grupo trt para los radicales aminoácidos His (H), Gln (Q) y Asn (N); y el grupo Boc para los radicales de aminoácido Lys (K) y Trp (W).

Por ejemplo, alguna o más de las cadenas laterales de los radicales de aminoácido de fragmentos de péptido listados en la tabla 1 pueden estar protegidas con grupos de protección estándar tales como el t-butilo (t-Bu), tritilo (trt) y t-butiloxicarbonilo (Boc). El grupo t-Bu es el grupo de protección de cadena lateral preferido para los radicales aminoácidos Tyr (Y), Thr (T), Ser (S) y Asp (D); el grupo trt es el grupo de protección de cadena lateral preferido para los radicales de aminoácido His (H), Gln (Q) y Asn (N), y el grupo Boc es el grupo protector de cadena lateral preferido para los radicales de aminoácido Lys (K) y Trp (W).

Durante la síntesis de los fragmentos intermedios del péptido T-20, que incluye la histidina, la cadena lateral del radical histidina es deseablemente protegida, de preferencia con un grupo de protección tritilo (trt). Si no está protegida, el ácido empleado para escindir el fragmento de péptido de la resina y/o para escindir el Fmoc u otros grupos de protección N-terminales durante la síntesis podrían reaccionar perjudicialmente con un radical histidina sin proteger, causando la degradación del fragmento del péptido. Muy posiblemente ninguna otra ligazón de otro aminoácido podría ocurrir si la histidina no está protegida. Un tiempo de escisión prolongado puede también eliminar un grupo de protección tal como el trt de la histidina y puede causar que una partida no satisfaga las especificaciones típicas de calidad.

De preferencia, todos los radicales de asparagina de cada fragmento del péptido de la invención están protegidos. Además se prefiere que el residuo de triptófano esté protegido con un grupo Boc.

Un grupo de protección amino-terminal incluye un grupo químico copulado al grupo alfa amino de un aminoácido. Típicamente, el grupo de protección amino-terminal se elimina en una reacción de desprotección antes de la adición del próximo aminoácido para ser añadido a la cadena de péptido creciente, pero puede ser mantenida cuando el péptido es escindido de un soporte. La elección de un grupo de protección amino terminal puede depender de varios factores, por ejemplo, del tipo de síntesis efectuada y del producto intermedio deseado o del producto final.

Ejemplos de grupos de protección amino terminal incluyen (1) grupos de protección tipo acilo, tales como el formilo, acrililo (Acr), benzoilo (Bz) y acetilo (Ac); (2) grupos de protección tipo uretano aromáticos, tales como el bencil-oxicarbonilo (Z) y Z substituido, tales como el p-cloro-benciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, p-bromobencil-oxicarbonilo, p-metoxibenciloxicarbonilo; (3) grupos de protección uretano alifáticos, tales como el t-butiloxicarbonilo (BOC), diisopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo, aliloxicarbonilo; (4) grupos protectores tipo cicloalquiluretano, tales como el 9-fluorenil-metiloxicarbonilo (Fmoc), ciclopentiloxicarbonilo, adamantíloxicarbonilo, y ciclohexiloxicarbonilo; y (5) grupos de protección tipo tiouretano, tales como el feniltíocarbonilo. Grupos de protección preferidos incluyen el 9-fluorenil-metiloxicarbonilo (Fmoc), 2-(4-bifenilil)-propil(2)oxicarbonilo (Bpoc), 2-fenil propil (2)-oxicarbonilo (Poc) y t-butiloxicarbonilo (Boc).

De acuerdo con la invención, los grupos de protección están retenidos típicamente sobre los fragmentos intermedios del péptido a través de la síntesis en fase sólida y también dentro y a través de la reacción de copulación en fase de solución. (Generalmente, después de un paso de copulación en fase de solución se efectúa un paso de desprotección para eliminar uno o más grupos de protección del péptido).

Ejemplos específicos de los primeros aminoácidos que tienen grupos de protección específico que pueden ser copulados con la resina para la síntesis de fragmentos intermedios del péptido que tienen SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3, pueden ser FmocGln(OtBu)OH y FmocTrp(Boc)OH, respectivamente.

Con el fin de preparar una síntesis en fase sólida de una resina, la resina puede ser prelavada en un disolvente. Por ejemplo, una resina en fase sólida tal como una resina 2-CTC, se añade a una cámara de péptidos, y se efectúa un prelavado con un disolvente adecuado. El lavado puede efectuarse para preparar la resina para entrar en contacto con el primer aminoácido que ha de copularse a la resina. En esencia, puede efectuarse un prelavado para promover una eficiente copulación del primer aminoácido a la resina. El disolvente del prelavado puede escogerse en base al tipo de disolvente (o mezcla de disolventes) que se emplea en la reacción de copulación, o viceversa.

Los disolventes que son adecuados para el lavado, y también la reacción de copulación subsiguiente, incluyen el diclorometano (DCM), dicloroetano (DCE), dimetilformamida (DMF), cloruro de metileno, y similares, así como también mezclas de estos reactivos. Otros disolventes útiles incluyen el DMSO, piridina, cloroformo, dioxano, tetrahidrofurano, acetato de etilo, N-metilpirrolidona, y mezclas de los mismos. En algunos casos la copulación puede efectuarse en un sistema de disolventes binario, tal como una mezcla de DMF y DCM.

Como se ha descrito en la presente, es deseable controlar el factor de carga del primer alfa aminoácido en la resina para que esté en el margen de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,50, de preferencia aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,45 y con mayor preferencia aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,40. Por lo tanto, se prepara una solución que tiene una cantidad de aminoácido que proporcionará un factor de copulación en el margen requerido. Este puede determinarse conociendo generalmente que la eficiencia de la copulación es para una reacción en particular. Por ejemplo, cuando se desea tener un factor de carga diana de aproximadamente 0,34, y si se conoce que la eficiencia de la copulación es aproximadamente del 80%, entonces debería emplearse una solución de copulación conteniendo 0,425 mmoles de aminoácido por cada gramo de resina (0,34/0,8).

La reacción de copulación puede efectuarse en presencia de uno o más compuestos que potencian o mejoran la reacción de copulación. Los compuestos que pueden aumentar la velocidad de reacción y reducir la velocidad de las reacciones secundarias incluyen las sales de fosfonio y uronio, que pueden, en presencia de una base terciaria, por ejemplo la diisopropiletilamina (DIEA) y trietilamina (TEA), convertir los aminoácidos protegidos en especies activadas (por ejemplo, BOP, PyBOPO, HBTU y TBTU todos los ésteres HOBt generados). Otros reactivos ayudan a prevenir la racemización proporcionando un reactivo de protección. Estos reactivos incluyen las carbodiimidas (por ejemplo, DCC ó WSCDI) con adición de un nucleófilo auxiliar (por ejemplo, 1-hidroxi-benzotriazol (HOBt), 1-hidroxi-azabenzotriazol (HOAt), ó HOSu). Otro reactivo que puede utilizarse es el TBTU. El método de anhídrido mixto, empleando el cloroformiato de isobutilo, con o sin adición de un nucleófilo auxiliar se utiliza también como por ejemplo el método de la azida, debido a la baja racemización asociada con el mismo. Estos tipos de compuestos pueden también aumentar la velocidad de copulación mediada por la carbodiimida, así como también prevenir la deshidratación de los radicales Asn y Gln.

El final de la copulación puede monitorizarse con un ensayo cualitativo de ninhidrina como se describe en la presente. Una vez se ha determinado que la copulación ha sido completa, la mezcla de reacción de copulación se lava con un disolvente, y el ciclo de copulación se repite para cada uno de los subsiguientes radicales aminoácidos del material peptídico. A continuación del final del ciclo de copulación, la resina se lava con un disolvente como por ejemplo la NMP, y seguidamente se lava con un segundo disolvente inerte como por ejemplo el DCM.

Con el fin de copular el siguiente aminoácido, se efectúa típicamente la eliminación del grupo protector N-terminal (por ejemplo, un grupo Fmoc), mediante el tratamiento con un reactivo que incluye el 20-50% (sobre la base del peso) de piperidina en un disolvente tal como la N-metilpirrolidona (NMP) ó la dimetilformamida (DMF). Después de la eliminación del grupo de protección Fmoc, se efectúan típicamente varios lavados para eliminar la piperidina residual y los subproductos de Fmoc (tales como el dibenzofulveno y su aducto de piperidina).

Después de que el primer aminoácido ha sido copulado a la resina con un factor de carga deseado y el grupo de protección N-terminal ha sido eliminado, pueden añadirse los subsiguientes aminoácidos para preparar los fragmentos intermedios del péptido. Los subsiguientes aminoácidos pueden utilizarse con un exceso estequiométrico de aminoácidos en relación con el factor de carga. Sin embargo se ha descubierto que la síntesis en fase sólida de los fragmentos intermedios específicos del T-20 descritos en la presente, no requieren un gran exceso de aminoácidos (y los correspondientes reactivos) para emplear la síntesis en fase sólida de estos fragmentos. En general, la cantidad de aminoácidos empleada en el paso de copulación es por lo menos equivalente al factor de carga del primer aminoácido sobre la resina (1 equivalente o más). De preferencia la cantidad de amino-ácidos empleada en el paso de copulación es de 1,3 equivalentes (0,3 en exceso) o más, y con la máxima preferencia aproximadamente 1,5 equivalentes (0,5 en exceso). En algunos casos por ejemplo, el paso de copulación emplea una cantidad de equivalentes de aminoácidos en el margen entre 1 y 1,5 (mayor de 1 y menor de 1,5).

Se ha descubierto que este exceso de aminoácidos (por ejemplo aproximadamente 1,5), es suficiente para que la reacción de copulación transcurra hasta el final. Este exceso puede también ayudar a la reacción a tolerar la base en exceso del reactivo de desprotección.

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Los pasos de copulación, lavado, desprotección del grupo de desprotección del N-terminal, y lavado, pueden repetirse hasta que se ha formado el producto intermedio T-20 deseado.

Después de la síntesis en fase sólida y con el fin de eliminar los péptidos intermedios del T-20 de la resina, se efectúa un tratamiento de escisión, de una manera tal que los péptidos intermedios T-20 escindidos llevan todavía suficiente cadena lateral y grupos de protección de términos. Dejando los grupos de protección en su lugar, ayuda a prevenir el copulado indeseable u otras reacciones indeseables de los fragmentos de péptido durante o después de la escisión. En el caso de que se emplee el FMOC ó una química similar para sintetizar el péptido, puede efectuarse la escisión protegida de cualquier manera preferible, como por ejemplo empleando un reactivo ácido relativamente débil tal como el ácido acético ó TFA diluido en un disolvente tal como el DCM, el cual puede también hinchar la resina, por lo que es útil para el proceso de escisión y separación. Se prefiere el empleo de 0,5 a 10 por ciento en peso, de preferencia del 1 al 3 por ciento en peso de TFA en DCM. Ver por ejemplo la patente U.S. nº 6.281.335.

Los pasos de escisión del fragmento intermedio del péptido a partir de la resina en fase sólida, pueden efectuarse siguiendo las líneas del procedimiento del ejemplo que sigue. Sin embargo, puede emplearse cualquier procedimiento adecuado que escinda efectivamente el fragmento intermedio de péptido de la resina. Por ejemplo, se añade al recipiente aproximadamente de 5 a 20, de preferencia aproximadamente 10 volúmenes, de un disolvente que contiene un reactivo de escisión de carácter ácido. Como consecuencia, las perlas de resina se sumergen en el reactivo. La reacción de escisión tiene lugar cuando el contenido del líquido se agita a una temperatura adecuada durante un período de tiempo adecuado. La agitación ayuda a prevenir que las perlas se apelotonen. El tiempo adecuado y las condiciones de temperatura adecuadas dependerán de factores como por ejemplo el reactivo ácido que se emplea, la naturaleza del péptido, la naturaleza de la resina, y similares. Como norma general la agitación desde aproximadamente -15ºC hasta aproximadamente 5ºC, de preferencia desde aproximadamente -10ºC hasta aproximadamente 0ºC durante aproximadamente 5 minutos a dos horas, de preferencia aproximadamente 25 minutos a aproximadamente 45 minutos, podría ser adecuada. La duración de la escisión puede estar en el margen desde aproximadamente 10 minutos hasta aproximadamente 2 horas. Para una producción a gran escala, una duración preferida está en el margen desde aproximadamente 15 hasta 50 minutos. La escisión se efectúa de preferencia en un margen bajo de temperatura para facilitar una reacción exotérmica que podría típicamente ocurrir durante la reacción. Además, la baja temperatura de la reacción de escisión evita que los grupos de protección de la cadena lateral sensibles al ácido, tales como los grupos trt sean eliminados en esta etapa.

Al final del tratamiento de escisión, la reacción se interrumpe. Esto puede lograrse por ejemplo, añadiendo al recipiente una base adecuada tal como la piridina o similar, continuando la agitación y removiendo durante un período adicional como por ejemplo de 5 minutos a 2 horas adicionales, de preferencia aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 40 minutos. Al añadir la base y continuar la agitación ocasiona que la temperatura del contenido del recipiente también aumente. Al final de la agitación, el contenido del recipiente puede estar a una temperatura en el margen desde aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 15ºC, de preferencia desde aproximadamente 5ºC hasta aproximadamente 10ºC.

Opcionalmente pueden incorporarse al procedimiento de síntesis global, factores tales como el hinchamiento y encogimiento, con el fin de mejorar los aspectos de la recuperación del péptido.

Por ejemplo, después de la escisión, el soporte puede opcionalmente lavarse una o más veces con un reactivo que lo esponje, para extraer el péptido escindido en el(los) líquido(s) de lavado resultante(s), y se recoge(n) el(los) líquido(s) de lavado para recuperar el péptido a partir de dicho(s) lavado(s). Por ejemplo, la escisión de un péptido a partir de la resina 2-CTC empleando TFA diluido en DCM constituiría además todo o una parte de un tratamiento de esponjamiento. Una vez se ha completado la escisión y después del tratamiento de esponjamiento, el soporte puede someterse a uno, y opcionalmente más lavados de encogimiento, que permiten recuperar cantidades adicionales de péptido de dichos líquidos de lavado de encogimiento así como también potenciar la capacidad para recuperar el péptido adicional a partir de uno o más subsiguientes opcionales lavados de esponjamiento. El(los) lavado(s) de esponjamiento subsiguiente(s) constituye(n) un tratamiento adicional de esponjamiento, y puede(n) efectuarse después de que el tratamiento de encogimiento se haya completado.

Debido a que el disolvente de esponjamiento, como por ejemplo el DCM, puede emplearse como un constituyente del reactivo de escisión, el tratamiento de escisión puede también constituir un primer tratamiento de esponjamiento en el cual una cantidad significativa de péptido escindido puede ser extraído del líquido. Cuando el esponjamiento se efectúa con TFA en DCM, el volumen de las perlas tenderá a ser el más grande al comienzo del tratamiento de escisión. Las perlas todavía se esponjarán, pero su volumen irá disminuyendo a medida que el péptido se extraiga del líquido.

Después de enfriar, el contenido del recipiente se vacía y se recoge para recuperar el péptido extraído en el lavado. Puede emplearse presión para forzar la mezcla de líquidos que contiene el material de péptido llevado por el líquido a través del filtro fuera del recipiente. Las perlas que quedan en el recipiente contendrán todavía restos de DCM y todavía se esponjarán en un cierto grado. Una cantidad significativa del péptido residual tiende también a ser retenido en las perlas, y los subsiguientes tratamientos de encogimiento y esponjamiento ayudan a recuperar partes significativas del péptido residual.

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Como una opción, puede ser deseable lavar con agua el reactivo de escisión recogido, antes de la concentración por destilación o similar, habitualmente después de que haya tenido lugar excepcionalmente una cierta concentración. El lavado con agua después de la escisión se cree que es útil para potenciar la calidad del péptido y, por lo tanto, un cierto aumento en el rendimiento. Por ejemplo un mayor tiempo de contacto con el TFA y otros ingredientes del reactivo de escisión podría perjudicar la calidad como por ejemplo una destritilación en el His 6 y/o la esterificación del péptido. El lavado con agua se cree que es útil en la eliminación de restos de TFA y sus productos secundarios. Después del tratamiento de lavado/extracción con agua, la mezcla de líquidos puede ser transferida a un aparato de destilación, en donde la mezcla se concentra eliminando además, por ejemplo el DCM o similar.

Después de que la mezcla de escisión se ha vaciado del recipiente y se ha recogido para la recuperación del péptido, el contenido del recipiente puede someterse a uno o más lavados adicionales de esponjamiento en los cuales puede ser extraído el péptido adicional, y a continuación ser recuperado. Estos lavados adicionales de esponjamiento ayudan también a lavar el recipiente y eliminar los reactivos de escisión residuales y los subproductos. Estos ingredientes se eliminan de preferencia antes de proceder con el tratamiento de encogimiento de manera que el líquido de encogimiento no reaccionará con los mismos. Por ejemplo, es deseable eliminar el TFA del recipiente antes de añadir un líquido de encogimiento que contenga etanol, dado que el etanol puede reaccionar con el TFA. Un tratamiento de lavado de esponjamiento típico puede tener lugar con agitación durante un período de tiempo de aproximadamente 2 minutos hasta 2 horas, de preferencia desde aproximadamente 10 minutos hasta aproximadamente 50 minutos. Después de efectuar el lavado, se retira el líquido de lavado del recipiente y a continuación puede añadirse al recipiente de destilación con los otros lavados de esponjamiento. Opcionalmente, antes de ser añadidos al recipiente de destilación, estos lavados de esponjamiento adicionales, si es que existen, pueden ser sometidos a un tratamiento de extracción con agua para eliminar las impurezas.

En algunas versiones, los fragmentos intermedios del péptido se preparan para la copulación en fase de solución, efectuando un paso para potenciar su pureza, por ejemplo mediante cristalización. Pueden tratarse uno o más fragmentos intermedios del péptido T-20, con una solución que contiene IPA, tal como una mezcla de IPA y DCM, ó IPA y agua, para cristalizar los fragmentos intermedios del péptido.

Después de la síntesis en fase sólida, de la escisión de la resina, y de todos los lavados o purificación de los intermedios del péptido, el fragmento intermedio del péptido, que tiene la secuencia EKNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO:3) se hace reaccionar con un radical de fenilalaninamida (F-NH_{2}) para producir un fragmento intermedio del péptido que tiene la secuencia EKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO:4). Esta reacción en fase de solución puede efectuarse en una solución adecuada de la reacción en fase de solución, como ya se ha descrito en la presente. Este producto intermedio del péptido puede precipitarse en un no disolvente, por ejemplo, agua, y lavarse, para aumentar la pureza.

Los fragmentos intermedios del péptido con la cadena lateral protegida T-20, Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO:2) y EKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO:4), se copulan juntamente en solución para formar un péptido T-20 de longitud completa que tiene la secuencia Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO:1). Estos fragmentos intermedios del péptido químicamente dispuestos en donde el terminal N del fragmento intermedio del péptido EKNEQELLELDKWASLWNWF está copulado con el terminal C del fragmento de péptido Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ.

De preferencia, los péptidos se suministran a la reacción de copulación con un nivel de pureza del 80% ó superior, o con más preferencia del 82,5% y con la máxima preferencia del 85% ó superior, basado en un perfil de HPLC. De acuerdo con los métodos de la invención, la síntesis en fase sólida utilizando un bajo factor de carga es un aspecto significativo para la preparación de los fragmentos intermedios del péptido T-20, con un alto nivel de pureza.

Las reacciones de copulación de péptidos están revisadas en, por ejemplo, New Trends in Peptide Coupling Reagents ("Nuevas tendencias en los reactivos de copulación de péptidos"); Albericio, Fernando; Chinchilla, Rafael; Dodsworth, David J.; y Najera, Armen; Organic Preparations and Procedures International ("Preparaciones y procedimientos orgánicos internacionales"), (2003), 33(3), 203-303.

La copulación de fragmentos intermedios de péptidos puede efectuarse empleando in situ reactivos de copulación, por ejemplo, BOP, o-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio hexafluorfosfato (HBTU), HATU, diciclohexilcarbodiimida (DCC, carbodiimida soluble en agua (WSCDI), u o-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio tetrafluorborato (TBTU). Otras técnicas de copulación emplean ésteres activos preformados, tales como los ésteres de hidroxisuccinimida (HOSu) y de p-nitrofenol (HONp); anhídridos simétricos reformados; N-carboxianhídridos (NCAs); ó haluros de ácido tales como el fluoruro de acilo así como también el cloruro de acilo.

Puede emplearse un disolvente de copulación adecuado en la reacción de copulación. Se comprende que el(los) disolvente(s) empleado(s) puede(n) afectar el grado de racemización del péptido unido formado; la solubilidad del péptido y/o fragmentos del péptido; y la velocidad de reacción de copulación.

En algunas versiones, la reacción de copulación incluye un(os) disolvente(s) miscibles en agua. Ejemplos de disolventes miscibles en agua incluyen por ejemplo, DMSO, piridina, cloroformo, dioxano, tetrahidrofurano, acetato de etilo, N-metilpirrolidona, dimetilformamida, dioxano, o mezclas de los mismos.

En otras versiones, la relación de copulación incluye un disolvente no miscible en agua. Un ejemplo de disolvente no miscible en agua es el cloruro de metileno. En estas versiones el disolvente no miscible en agua es de preferencia compatible con la reacción de desprotección; por ejemplo, si se emplea un disolvente no miscible en agua, de preferencia no afecta de forma adversa la reacción de desprotección.

Después de que los fragmentos intermedios del péptido han sido copulados para producir un péptido T-20, el producto puede someterse a un paso de desprotección para eliminar los grupos protectores de cadena lateral.

La eliminación de los grupos protectores de cadena lateral mediante la desprotección global, emplea típicamente una solución de desprotección que incluye un agente ácido-lítico para escindir los grupos de protección de cadena lateral. Los reactivos acidolíticos empleados corrientemente para la desprotección global incluyen ácido trifluoracético puro (TFA), HCl, ácidos Lewis tales como BF3Et2O ó Me3SiBr, ácido fluorhídrico líquido (HF), bromuro de hidrógeno (HBr), ácido trifluorometansulfúrico, y combinaciones de los mismos. La solución de desprotección incluye también uno o más enmascaradores de cationes adecuados, por ejemplo, el ditiotreitol, anisol, p-cresol, etanoditiol o sulfuro de dimetilo. La solución de desprotección puede incluir también, agua. Como se emplea en la presente, las cantidades de reactivos presentes en la composición de desprotección se expresan típicamente en un ratio, en donde el numerador es la cantidad de un componente individual expresado en "partes" tal como "partes en peso" o "partes en volumen", y el denominador es el total de partes de la composición. Por ejemplo, una solución de desprotección que contiene TFA:H_{2}O:DTT en un ratio de 90:5:5 (peso/peso/peso), tiene TFA en 90/100 partes en peso, H_{2}O en 5/100 partes en peso, y DTT en 5/100 partes en peso.

En algunas versiones, la reacción de desprotección puede realizarse cuando la cantidad de agente acidolítico, de preferencia TFA, en la composición de desprotección es mayor de 90/100 partes en peso. Otras composiciones de desprotección preferidas incluyen una cantidad de agente ácidolítico en una cantidad de 93/100 partes en peso o superior, o en una cantidad en el margen desde 93/100 en peso hasta 95/100 partes en peso.

Después de que el péptido T-20 ha sido desprotegido y está en una forma final, la partida del péptido puede someterse opcionalmente a un procedimiento que desagrega el péptido agregado que pueda estar presente en esta etapa del esquema sintético global.

La desagregación puede efectuarse disolviendo muestras de péptido en una base acuosa y a continuación acidificando la mezcla acuosa para precipitar el péptido en presencia de por lo menos una sal y un co-disolvente. De preferencia tanto una sal como un co-disolvente, están presentes en la solución de desagregación. La desagregación puede efectuarse mediante la precipitación del péptido con relativa rapidez (por lo menos en una primera etapa de la acidificación en la cual el pH del medio alcalino se reduce a un pH en el margen de 6 a 7,5 después de lo cual, puede tener lugar más lentamente la acidificación a un pH final deseado, por ejemplo 3 a 6), a una temperatura relativamente baja.

Para la desagregación, la solución alcalina acuosa, tamponada, está generalmente derivada a partir de ingredientes que comprenden agua, por lo menos una sal, y una cantidad suficiente de por lo menos una base para proporcionar el pH de disolución deseado. El péptido T-20 y los diferentes ingredientes que constituyen la solución alcalina acuosa, tamponada, pueden combinarse en cualquier orden. En una modalidad de la práctica, la solución se prepara a partir de sus ingredientes constituyentes y a continuación se añade el péptido a la solución ya preparada. En otra modalidad de la práctica, el péptido puede añadirse a una solución acuosa que comprende la sal en donde la solución tiene un pH que es demasiado bajo para que tenga lugar la disolución. A continuación, se añade una base a esta mezcla con el fin de aumentar el pH a un valor en el cual tenga lugar la disolución. Todavía en otra alternativa, la sal puede añadirse a la solución antes, durante, y/o después de la disolución. En general, sin embargo, la sal se incorpora a la solución antes de que el pH disminuya de una manera que ocasione que el péptido precipite como se describe además más adelante.

La concentración del péptido en la solución puede variar dentro de un amplio margen. Como norma general, la concentración del péptido T-20 en la solución puede estar en el margen desde aproximadamente 3 g/litro hasta aproximadamente 6 g/litro.

Puede incorporarse a la solución una variedad de una o más bases, para proporcionar el pH deseado. Ejemplos representativos de bases adecuadas incluyen las bases hidróxido tales como las bases NaOH y el bicarbonato y el carbonato tales como el bicarbonato de sodio o de potasio o el carbonato de sodio o de potasio. El hidróxido de sodio es el preferido, especialmente el NaOH 0,5 N a 1 N. La base se emplea para ajustar el pH a un valor deseado al cual el péptido se disolverá en la solución en una razonable cantidad de tiempo. Para muchos péptidos esto corresponde a un pH de disolución en el margen desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 11.

El(los) constituyente(s) de la sal de la solución mejora(n) las características de disolución del péptido precipitado resultante. Específicamente, un péptido soluble que se disuelve fácilmente en una solución acuosa a un bajo pH, se prepara más consistentemente cuando la sal está presente en una concentración apropiada.

Una variedad de sales sería útil en la práctica de la presente invención. Los ejemplos incluyen el carbonato de so-dio, acetato de sodio, carbonato de amonio, acetato de amonio, bicarbonato de sodio, bicarbonato de amonio, versiones de sodio y potasio de los mismos, combinaciones de los mismos y similares. El acetato de amonio es el más preferido.

La concentración de sal en la solución puede variar en un amplio margen. El empleo de 1 a 200 mM equivalentes de sal es un ejemplo de un margen de concentración de sal que sería adecuado. En una modalidad específica de la práctica, el empleo aproximadamente de 5 mM a aproximadamente 50 mM, con más preferencia aproximadamente 10 mM equivalentes de sal, especialmente acetato de amonio, se ha acreditado como adecuado.

La(s) temperatura(s) de disolución se refiere(n) generalmente a la(s) temperatura(s) de la solución acuosa en la cual se disuelve el péptido. La disolución puede efectuarse a cualquier temperatura adecuada. En general, se prefiere la disolución del péptido en una solución mantenida a una o más temperaturas en un margen desde aproximadamente 10ºC a aproximadamente 30ºC, de preferencia desde aproximadamente 10ºC hasta aproximadamente 25ºC, con más preferencia desde aproximadamente 15ºC hasta aproximadamente 20ºC.

De preferencia, se incorpora un co-disolvente a la solución de manera que tiene lugar la subsiguiente precipitación del péptido en presencia del co-disolvente. El co-disolvente puede añadirse a la solución antes, durante y o después de la disolución, pero de preferencia se añade rápidamente después de la disolución del péptido. El co-disolvente se refiere a uno o más disolventes adicionales en los cuales el péptido es soluble al pH de la disolución. De preferencia, el péptido es también soluble en el co-disolvente a 25ºC y al pH fisiológico cuando el péptido está suficientemente desagregado de forma que el ratio entre el peso molecular medido del péptido y el peso molecular teórico del péptido está dentro del margen desde aproximadamente 2:1 hasta aproximadamente 1:1. Ejemplos de co-disolventes incluyen el acetonitrilo, el metanol y combinaciones de los mismos, y similares.

En versiones preferidas de la invención, se añade una cantidad suficiente de co-disolvente a la solución de manera que la solución contiene desde aproximadamente 2 hasta 50 volúmenes por ciento, de preferencia desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 30 volúmenes por ciento, y con más preferencia desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 20 volúmenes por ciento del co-disolvente.

Después de la disolución, y de preferencia después de la adición del co-disolvente, se aumenta opcionalmente el pH de la solución, añadiendo una base adicional con el fin de facilitar además la desagregación del péptido, si se desea. La solución se filtra a continuación de preferencia rápidamente. La presión de filtrado a través de un filtro de 0,2 micras debe ser la adecuada. El filtrado se desgasifica opcionalmente al vacío, después de lo cual la solución puede envejecer durante un período de tiempo adecuado antes de que sea procesada con el fin de completar el proceso de desagregación. En general, el envejecimiento, de forma que el tiempo total en que el péptido está a un pH elevado (incluyendo no solamente el tiempo de envejecimiento, sino también el tiempo de filtrado, el tiempo de desgasificado, etc.), está dentro del margen desde aproximadamente 5 minutos hasta aproximadamente 6 horas, con más preferencia desde aproximadamente 30 minutos hasta aproximadamente 2 horas. Después del envejecimiento, la solución puede opcionalmente filtrarse de nuevo.

Después del envejecimiento, se disminuye el pH de la solución, por ejemplo acidificando, bajo condiciones efectivas para ocasionar que el péptido precipite. Como norma general un pH final en el margen desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 6, de preferencia desde 4 hasta aproximadamente 6, puede ser adecuado.

El pH de la solución se disminuye de preferencia mediante la adición de uno o más ácidos a la solución. Ejemplos de ácidos incluyen el HCl, ácido sulfúrico, ácido acético, ácido oxálico, combinaciones de éstos, y similares. El ácido acético es el preferido. Por ejemplo, una solución acuosa del 5% ó 10% de ácido acético se ha encontrado que es adecuada.

En algunas modalidades de práctica, el producto péptido con excelentes propiedades de disolución puede todavía obtenerse si se añade con relativa rapidez el ácido para disminuir el pH solamente a un pH intermedio. Después de esta inicial relativamente rápida adición de ácido, el ácido se añade a una segunda velocidad relativamente más lenta a un pH más bajo de la solución hasta el pH final deseado. Los valores intermedios de pH adecuados estarían en el margen de este aproximadamente 6 hasta aproximadamente 8, con más preferencia desde aproximadamente 6,0 hasta aproximadamente 7,5. Deseablemente la rápida disminución inicial del pH tiene lugar en un periodo de tiempo inferior a aproximadamente una hora, de preferencia 30 minutos o menos, con más preferencia 15 minutos o menos.

Por ejemplo, una modalidad de práctica adecuada implica la disminución del pH de una solución de T-20 inicialmente a un pH de 11. Una cantidad suficiente de ácido se añade con relativa rapidez durante un período de 10 minutos para disminuir el pH a un valor intermedio de aproximadamente 6,0. A continuación el ácido se añade más lentamente durante 10 a 20 minutos para disminuir el pH entre 5,3 y 5,5.

La mezcla se mezcla deseablemente bien durante el curso de la adición del ácido para causar la precipitación del péptido. Como norma general, se prefiere agitar la mezcla mientras se añade el ácido tan vigorosamente como sea posible mientras se deja un suficiente margen de seguridad para evitar la formación de espuma en la mezcla.

La adición de ácido para ocasionar la precipitación del péptido, puede efectuarse con la solución a cualquier temperatura adecuada. Como norma general, efectuando la precipitación a una temperatura dentro del margen de 10ºC a 30ºC, de preferencia de 15ºC a 25ºC, con la mayor preferencia de 16ºC a 18ºC, sería lo adecuado.

Después de la precipitación, el péptido se aísla de preferencia y se seca antes de ser combinado con otros ingredientes, liofilizado, envasado, almacenado, procesado posteriormente, y/o de otra manera manipulado. Esto puede efectuarse de cualquier forma adecuada. De acuerdo con un método adecuado, el péptido se recoge mediante filtración, se lava con abundante agua para reducir el contenido final de sal a un nivel adecuado, y a continuación se seca.

Si el péptido precipita en una forma inadecuada para la filtración (por ejemplo si el precipitado es del "tipo gel"), el precipitado puede someterse a un proceso de envejecimiento, de preferencia con agitación, en el cual las partículas de péptido se aglomeran para "endurecer" las partículas.

En una modalidad de práctica preferida, este tratamiento de endurecido por envejecimiento implica el envejecimiento del péptido con agitación en el curso de un tratamiento de enfriamiento/calentamiento/enfriamiento. Este mejora las características de filtrado del péptido sin perjudicar indebidamente la estructura terciaria del péptido. En una modalidad específica de práctica, el tratamiento implica el envejecimiento de las partículas en mezcla acuosa durante 5 minutos a 48 horas, de preferencia de 30 minutos a 8 horas, con más preferencia de 30 minutos a 2 horas a una primera temperatura por debajo de la temperatura ambiente, de preferencia en el margen de más de 0ºC a aproximadamente 20ºC, de preferencia de 10ºC a 20ºC, con mayor preferencia alrededor de 16ºC. De preferencia, se emplea la agitación para asegurar que las partículas están bien dispersadas durante el envejecimiento.

A continuación, la temperatura de la mezcla se aumenta aproximadamente de 2ºC a aproximadamente 30ºC, de preferencia aproximadamente de 5ºC a aproximadamente 15ºC a una temperatura moderadamente más elevada, en donde la transición a la temperatura más elevada tiene lugar con agitación durante un período de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 48 horas, de preferencia de 5 minutos a 8 horas, con más preferencia de 20 minutos a 2 horas. De preferencia la nueva temperatura moderadamente más elevada es todavía la del ambiente o inferior. En una modalidad específica de práctica, aumentando la temperatura desde 16ºC hasta 21ºC en aproximadamente una hora se encontró que era adecuada. De preferencia, se continúa agitando durante esta transición de temperaturas. La mezcla se envejece a continuación a la temperatura más elevada durante un período desde 5 minutos hasta 8 horas, de preferencia 20 minutos a 4 horas, con más preferencia aproximadamente 3 horas, con agitación.

Después de este paso de envejecimiento, la temperatura de la mezcla se disminuye en aproximadamente 2ºC a aproximadamente 30ºC, de preferencia aproximadamente 5ºC a aproximadamente 15ºC a una temperatura moderadamente más baja, en donde la transición de la temperatura más baja tiene lugar de preferencia con agitación durante un período desde aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 48 horas, de preferencia desde 5 minutos hasta 8 horas, con más preferencia desde 20 minutos a 4 horas. De preferencia la nueva temperatura moderadamente más baja está en el margen desde por encima de aproximadamente 3ºC hasta aproximadamente 18ºC, con mayor preferencia aproximadamente 10ºC. En una modalidad específica de práctica, la disminución de la temperatura de 21ºC a 10ºC en aproximadamente dos horas, se encontró que era adecuada. La mezcla se envejece a continuación a la temperatura más baja, de preferencia durante un período desde aproximadamente 5 minutos a 48 horas, con más preferencia aproximadamente 6 horas.

Este tratamiento de envejecimiento mejora las características de filtración de las partículas precipitadas, en donde el filtrado y la separación de las partículas de péptido a partir del filtrado tienen lugar más fácilmente sin cambiar excesivamente la estructura secundaria del péptido.

De esta forma, después de este envejecimiento, el precipitado se filtra, de preferencia a presión como por ejemplo 1 psig de N_{2}. La torta del filtrado puede lavarse una o más veces con agua, de preferencia previamente enfriada por ejemplo a una temperatura en el margen desde aproximadamente 3ºC hasta aproximadamente 20ºC, de preferencia desde 5ºC hasta aproximadamente 15ºC, con más preferencia aproximadamente 10ºC. Esto ayuda a disminuir el contenido de sal de la torta. La torta del filtrado puede a continuación secarse parcialmente o totalmente, pasando nitrógeno a través de la torta a una temperatura adecuada durante un período de tiempo adecuado, como por ejemplo desde 1 minuto hasta 48 horas, de preferencia desde 5 minutos hasta 8 horas, con mayor preferencia aproximadamente 6 horas. El empleo de nitrógeno aproximadamente a temperatura ambiente es conveniente y adecuado. La torta puede ser periódicamente mezclada para facilitar el secado. El secado puede ocasionalmente completarse en un aparato de secado separado. Este secado opcional tiene lugar de preferencia al vacío, por ejemplo inferior a 30 mm de Hg, a una temperatura moderada para no degradar el péptido, por ejemplo a una temperatura inferior a aproximadamente 30ºC, de preferencia inferior a aproximadamente 28ºC.

Los principios de la presente invención se ilustran además con respecto a los siguientes ejemplos ilustrativos.

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Ejemplos

Para los siguientes ejemplos, se adoptan los siguientes reactivos y nomenclatura estándar:

Ensayo del cloranilo: la solución para el ensayo del cloranilo, se preparó mediante la adición de una gota de una solución saturada de cloranilo en tolueno hasta aproximadamente 1 ml de acetona. Los lavados con NMP se ensayaron añadiendo una gota del lavado a la solución de ensayo de cloranilo. Un color azul o violeta es una indicación positiva de la presencia de una amina secundaria indicando que los productos secundarios desprotegidos del Fmoc y/o la piperidina residual están todavía presentes.

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Ensayo de la ninhidrina (Keiser): en el ensayo cualitativo de la ninhidrina, se retira una muestra de 2-20 mg de la resina y se lava con NMP y subsiguientemente con DCM ó metanol. Se añaden a la muestra tres gotas de una solución al 76% de fenol en etanol, seis gotas de una solución 0,2 mM de KCN en piridina, y tres gotas de una solución 0,28 M de ninhidrina en etanol, y la muestra se coloca en un bloque calefactor a aproximadamente 100ºC durante aproximadamente 5 minutos. La muestra se retira e inmediatamente se diluye con una solución de etanol/agua (9:1). Un color azul o violeta es una indicación positiva de la presencia de aminas libres, indicando que la reacción de copulación todavía no es completa. Si se observa un ensayo de ninhidrina positivo después de una hora de reacción de copulación, la reacción de copulación se continúa durante una hora adicional. Si se observa un ensayo de ninhidrina positivo después de 3 horas de reacción de copulación, se drena el recipiente y se repite la copulación empleando aproximadamente un equivalente de aminoácido activado y reactivos.

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Ejemplo 1 Síntesis en fase sólida del fragmento intermedio del T-20, Ac-AA(1-16)OH (SEQ ID NO:2)

Se efectuó la síntesis en fase sólida para generar la resina Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-O-2-CTC [resina del fragmento Ac-AA1(1-16)O-2-CTC].

La resina Fmoc-Gln(OyBu)-O-2-CTC (20,0 g) se cargó en un reactor de síntesis en fase sólida juntamente con 240 ml de DCM. La mezcla se agitó durante 30 minutos a 25ºC. La cámara se drenó y el lecho de resina se lavó tres veces con 120 ml de NMP (para todos los lavados, la cantidad de líquido empleado es la cantidad de líquido por lavado).

Se cargaron en el reactor 120 ml de piperidina al 5% en NMP y a continuación se agitaron a 30 \pm 2ºC durante 30 minutos. El reactor se drenó y a continuación se cargó con 100 ml de piperidina al 5% en NMP. La mezcla se agitó durante 30 minutos a 30 \pm 3ºC y el reactor se drenó. La mezcla se lavó a continuación tres veces con 120 ml de NMP. El último lavado se muestreó a continuación para determinar los niveles de piperidina mediante el ensayo cualitativo de la ninhidrina; se efectuó un cuarto lavado si los niveles de piperidina fueron de 3500 ppm o superiores.

El orden de copulación tuvo lugar a partir del radical #15 hasta el radical #1: Q -> Q -> N -> Q -> S -> E -> E -> I -> L -> S -> H -> I -> L -> S -> T -> Y.

La copulación se efectuó añadiendo 1,5 equivalentes del aminoácido apropiado, 1,5 equivalentes del hidrato HOBt, y 90 ml de NMP. El contenido se agitó para disolver los sólidos y a continuación se añadieron 1,7 equivalentes de DIEA. Después de homogeneizar la solución, se enfrió a 0-5ºC en un baño de hielo durante 15 minutos. A continuación, se añadió una solución de 1,5 equivalentes de HBTU en 54 ml de NMP a la solución enfriada de aminoácido seguido de 48 ml de DCM. La solución de aminoácido activado se añadió a continuación al reactor que contenía la resina. La mezcla se agitó a 30 \pm 3ºC durante 3 horas. Las perlas de resina se muestrearon a continuación para determinar la finalización de la reacción mediante un ensayo Keiser. Cuando la reacción fue completa, el reactor se drenó y el lecho de resina se lavó con 120 ml de NMP.

Los pasos de desprotección y copulación empleando el aminoácido apropiado se efectuaron secuencialmente para generar la resina Ac-AA(1-16)O-2-CTC.

A continuación se preparó una solución de 5 equivalentes de anhídrido acético en 120 ml de NMP. Se añadieron 5 equivalentes de DIEA a la solución. La solución de anhídrido acético se añadió al reactor de la mezcla se agitó a continuación a 30 \pm 3ºC durante 1-3 horas. Las perlas de resina se muestrearon a continuación para determinar la finalización de la reacción mediante el ensayo de Keiser.

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Ejemplo 2 Escisión y purificación de Ac-AA(1-16)OH (SEQ ID NO:2) a partir de la resina en fase sólida

Se efectuó la escisión del péptido naciente Ac-AA(1-16)OH, a partir de la resina CTC, como se ha preparado en el ejemplo 2.

Con el fin de escindir el péptido de la resina, la resina copulada con el péptido (como se preparó en el ejemplo 1) se lavó tres veces con 100 ml de NMP seguido por cinco lavados con 200 ml de DCM. Para el último lavado con NMP, el reactor se enfrió a -5ºC.

A continuación, se preparó una solución de 4 ml de ácido trifluoracético y 196 ml de DCM, y se enfrió a -10ºC y se añadió al reactor y se agitó durante 30 minutos a 0 \pm 5ºC. A continuación se añadieron 1,2 equivalentes de piridina (4,8 ml), y la resina se calentó a 5ºC y se añadió la solución de escisión a 100 ml de agua con filtración. La resina se lavó con 100 ml de DCM el cual estaba combinado con DCM/agua. El DCM/agua se agitó durante 15 minutos, se separaron las capas, y el DCM se lavó con 100 ml de agua. Después de separar el segundo lavado con agua de la capa de DCM, el DCM se separó a presión reducida hasta recoger aproximadamente 200 ml de destilado. A continuación se añadieron 100 ml de agua al DCM.

La resina se lavó dos veces con DCM y los lavados se combinaron con la mezcla DCM/agua. La mezcla se agitó durante 30 minutos y las capas se separaron. La capa de agua se volvió a extraer con 100 ml de DCM. Todos los lavados con DCM se combinaron.

La solución del fragmento/DCM se separó a presión reducida hasta que quedaron aproximadamente 80 ml de la solución. La solución de DCM se añadió en cuatro porciones a 375 ml de heptano. Después de cada adición de la solución fragmento/DCM, la mezcla se separó hasta recoger aproximadamente 40 ml de destilado. Después de que toda la solución de DMC había sido transferida, se añadieron de nuevo 80 ml de heptano adicional juntamente con 20 g de DCM empleado para lavar el recipiente. La dispersión de heptano/DCM se filtró y se lavó con 24 ml de heptano. Una vez el lavado fue completo, el fragmento se secó al vacío.

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Ejemplo 3 Preparación de la resina 2CTC cargada con Fmoc Trp(Boc)

Un reactor con 5 litros de péptido se purgó con nitrógeno y a continuación se cargó con 200 g de resina 2-CTC y 2 l de DCM. La mezcla de resina-DCM se agitó a 25 \pm 2ºC durante 30 minutos. Entretanto se cargaron 51,8 g de Fmoc-Trp (Boc)OH, 1,4 litros de DMF, 200 ml de DCM y 26,66 g de DIEA, en un matraz de 2 litros. El contenido del matraz se agitó a temperatura ambiente para disolver los sólidos.

Después de drenar el DCM del reactor, se cargó la mezcla conteniendo el Fmoc-Trp(Boc)OH en el reactor con la resina y se agitó durante 2 horas en atmósfera de nitrógeno a 25 \pm 2ºC. Después de 2 horas se drenó el reactor.

Los sitios activos sobre la resina fueron bloqueados en los extremos con una mezcla de DIEA:MeOH (200:1800 ml). Esta mezcla se agitó a continuación a 25 \pm 2ºC durante una hora. El lecho se drenó, se lavó una vez con 2 litros de DMF, una vez con 1 litro de DMF, y cuatro veces con 2 litros de DCM. Los últimos 2 litros de lavado con DCM demostraron un ensayo UV negativo.

La resina se lavó a continuación tres veces con 2 litros de N-metil-pirrolidona (NMP) y a continuación se trató con 2,75 litros de piperidina al 20% en NMP con agitación a 28 \pm 2ºC durante 30 minutos. El reactor se drenó a continuación y se repitió el paso del tratamiento con piperidina. El lecho se drenó y se lavó cinco veces con 3 litros de NMP, y a continuación cinco veces con 3 litros de DMF. La resina se encogió mediante un lavado 3x con 1,5 litros de IPA. La resina se secó al vacío a un peso constante de 40 \pm 2ºC, para dar 220,06 g de resina cargada.

Se efectuó un análisis cuantitativo de HPLC mediante la escisión del aminoácido a partir de la resina y efectuando el ensayo frente a un estándar. El ensayo HPLC del material mostró una carga de resina de 0,37 mmoles/g.

Columna:: Betabasic-18, 150 x 4,6 mm, 3 \mum de tamaño de partícula, 150 \ring{A} de tamaño de poro.

Velocidad de flujo:: 1,25 ml/minuto

Detección:: UV a 260 nM

Fase móvil:: A: 10 nm de TEAP en agua

\quad: B: acetonitrilo

Tiempo de retención:: aproximadamente 13 minutos.

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Ejemplo 4 Síntesis en fase sólida del fragmento intermedio de T-20, Fmoc-AA(17-35)(SEQ ID NO:2)

Se efectuó la síntesis en fase sólida para generar la resina Fmoc-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-O-2-CTC [resina del fragmento Fmoc-AA(17-35)O-2-CTC].

La resina H-Trp(Boc)-O-2-CTC (10,15 g; como se preparó en el ejemplo 3) y 122 ml de DCM se combinaron en una cámara de reacción en fase sólida. La mezcla se agitó durante 30 minutos a 30 \pm 3ºC. A continuación se drenó el reactor, el lecho de resina se lavó tres veces con 61 ml de NMP (para todos los lavados la cantidad de líquido empleado es la cantidad de líquido por lavado).

El orden de copulación tuvo lugar a partir del radical #34 hasta el radical #18 (referido a la numeración de aminoácidos de la secuencia del T-20 maduro): W -> N -> W -> L -> S -> A -> W -> K -> D -> L -> E -> L -> L ->
E -> Q -> E -> N -> K -> E).

A continuación del (radical #34), se combinaron en un matraz, 7,24 g de Fmoc-Asn(Trt)OH, 1,86 g de HOBT monohidrato, 1,79 g de DIEA y 25,1 ml de NMP, y el contenido se agitó a temperatura ambiente para disolver los sólidos, y a continuación se enfrió la solución a 10ºC.

A continuación, en un matraz separado, se combinaron 4,58 g de HBTU y 15 ml de NMP, se agitaron a temperatura ambiente para disolver los sólidos y se enfrió a 10ºC. La solución de HBTU se añadió a la solución de Fmoc-Asn(Trt)OH y esta solución se cargó en el reactor SPPS. El matraz se lavó con 13 ml de DCM y el lavado se cargó en el reactor SPPS. A continuación, la mezcla se agitó a 30 \pm 3ºC durante 3 horas. A continuación, se muestrearon las perlas de resina para de-terminar si la reacción era completa (ensayo de Keiser). Una vez la reacción fue completa, el reactor se drenó y el lecho de resina se lavó cuatro veces con 120 ml de NMP.

A continuación, se cargan 61 ml de piperidina al 20% en NMP en el reactor y se agitan a 30 \pm 3ºC durante 30 minutos. El reactor se drena y se añaden al mismo, 61 ml de piperidina al 20% en NMP. A continuación la mezcla se agita a 30 \pm 3ºC durante 30 minutos y el reactor se drena. El lecho de resina se lava a continuación cinco veces con 61 ml de NMP. El último lavado se muestreó para determinar los niveles de piperidina mediante el ensayo cualitativo de ninhidrina.

A continuación del (radical #33) se cargaron en un matraz, 6,39 g de Fmoc-Trp(Boc)OH, 1,87 g de HOBT monohidrato, 1,82 g de DIEA y 25,1 ml de NMP. El contenido se disolvió y se enfrió como se ha indicado en el primer paso.

En un matraz separado, se combinan 4,60 g de HBTU y 15 ml de NMP. El contenido se disuelve, se enfría, se mezcla con la resina, se copula, se analiza, y se lava como se ha indicado en el primer paso. Una vez se ha completado la reacción de copulación, la resina se trata con la solución de piperidina, se lava, y se analiza como se ha indicado en el primer paso, con la excepción de que el lecho de resina se lava seis veces con 61 ml de NMP.

A continuación del (radical #32), se cargaron en un matraz, 4,27 g de Fmoc-Leu-OH, 1,86 g de HOBT monohidrato, 1,83 g de DIEA y 25,1 ml de NMP. El contenido se disolvió y se enfrió como se ha indicado en el primer paso.

En un matraz separado, se combinaron 4,60 g de HBTU y 15 ml de NMP. El contenido se disolvió, se enfrió, se mezcló con la resina, se copuló, se analizó, y se lavó como se ha indicado en el primer paso. Una vez finalizada la reacción de copulación, la resina se trató con la solución de piperidina, se lavó, y se analizó como se indicado en el primer paso.

A continuación del (radical #31), se cargaron en un matraz, 4,65 g de Fmoc-Ser(tBu)-OH, 1,86 g de HOBT monohidrato, 1,81 g de DIEA y 25,1 ml de NMP. El contenido se disolvió y se enfrió como se ha indicado en el primer paso.

En un matraz separado, se combinaron 4,60 g de HBTU y 15 ml de NMP. El contenido se disolvió, se enfrió, se mezcló con la resina, se copuló, se analizó, y se lavó como se ha indicado en el primer paso. Una vez finalizó la reacción de copulación la resina se trató con la solución de piperidina, se lavó, y se analizó como se ha indicado en el primer paso.

A continuación del (radical #30), se cargaron en un matraz, 4,00 g de Fmoc-Ala-OH, 1,87 g de HOBT monohidrato, 1,78 g de DIEA y 25,1 ml de NMP. El contenido se disolvió y se enfrió como se indicado en el primer
paso.

En un matraz separado se combinaron 4,59 g de HBTU y 15 ml de NMP. El contenido se disolvió, se enfrió, se mezcló con la resina, se copuló, se analizó, y se lavó como se ha indicado en el primer paso. Una vez finalizada la reacción de copulación la resina se trató con la solución de piperidina, se lavó, y se analizó como se ha indicado en el primer paso.

A continuación del (radical #29), se cargaron en un matraz, 6,39 g de Fmoc-Trp(Boc)-OH, 1,86 g de HOBT mono-hidrato, 1,78 g de DIEA y 25,1 ml de NMP. El contenido se disolvió y se enfrió como se ha indicado en el primer paso.

En un matraz separado se combinaron 4,59 g de HBTU y 15 ml de NMP. El contenido se disolvió, se enfrió, se mezcló con la resina, se copuló, se analizó, y se lavó como se ha indicado en el primer paso. Una vez finalizada la reacción de copulación, la resina se trató con la solución de piperidina, se lavó, y se analizó como se indicado en el primer paso.

A continuación del (radical #28), se cargaron en un matraz, 5,71 g de Fmoc-Lys(Boc)-OH, 1,86 g de HOBT monohidrato, 1,81 g de DIEA y 25,1 mililitros de NMP. El contenido se disolvió y se enfrió como se ha indicado en el primer paso.

En un matraz separado se combinaron 4,58 g de HBTU y 15 ml de NMP. El contenido se disolvió, se enfrió, se mezcló con la resina, se copuló, se analizó, y se lavó como se ha indicado en el primer paso. Una vez finalizada la reacción de copulación, la resina se trató con la solución de piperidina, se lavó, y se analizó como se ha indicado en el primer paso con la excepción de que el lecho de resina se lavó seis veces con 61 ml de NMP.

A continuación del (radical #27), se cargaron en un matraz, 4,98 g de Fmoc-Asp (OtBu)-OH, 1,92 gramos de HOBT monohidrato, 1,78 g de DIEA, y 25,1 ml de NMP. El contenido se disolvió y se enfrió como se ha indicado en el primer paso.

En un matraz separado se combinaron 4,58 g de HBTU y 15 ml de NMP. El contenido se disolvió, se enfrió, se mezcló con la resina, se copuló, se analizó, y se lavó como se ha indicado en el primer paso. Una vez finalizada la reacción de copulación la resina se trató con la solución de piperidina, se lavó, y se analizó como se ha indicado en el primer paso.

A continuación del (radical #26), se cargaron en un matraz 4,27 g de Fmoc-Leu-OH, 1,86 g de HOBT monohidrato, 1,80 g de DIEA y 25,1 ml de NMP. El contenido se disolvió y se enfrió como se ha indicado en el primer paso.

A continuación del (radical #25), se cargaron en un matraz 5,15 g de Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 1,88 g de HOBT monohidrato, 1,80 g de DIEA y 25,1 ml de NMP. El contenido se disolvió y se enfrió como se ha indicado en el primer paso.

A continuación del (radical #24), se cargaron en un matraz 4,28 g de Fmoc-Leu-OH, 1,88 g de HOBT monohidrato, 1,77 g de DIEA y 25,1 ml de NMP. El contenido se disolvió y se enfrió como se ha indicado en el primer paso.

A continuación del (radical #23), se cargaron en un matraz 4,27 g de Fmoc-Leu-OH, 1,88 g de HOBT monohidrato, 1,77 g de DIEA y 25,1 ml de NMP. El contenido se disolvió y se enfrió como se ha indicado en el primer paso.

En un matraz separado se combinaron 4,60 g de HBTU y 15 ml de NMP. El contenido se disolvió, se enfrió, se mezcló con la resina, se copuló, se analizó, y se lavó como se ha indicado en el primer paso. Una vez finalizada la reacción de copulación la resina se trató con la solución de piperidina, se lavó, y se analizó como se ha indicado en el primer paso con la excepción de que el lecho de resina se lavó seis veces con 61 ml de NMP.

A continuación del (radical #22), se cargaron en un matraz 5,16 g de Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 1,88 g de HOBT monohidrato, 1,76 g de DIEA y 25,1 ml de NMP. El contenido se disolvió y se enfrió como se ha indicado en el primer paso.

A continuación del (radical #21), se cargaron en un matraz 8,38 g de Fmoc-Gln(trt)-OH, 2,13 g de HOBT monohidrato, 2,01 g de DIEA y 25,1 ml de NMP. El contenido se disolvió y se enfrió como se ha indicado en el primer paso.

En un matraz separado se combinaron 5,22 g de HBTU y 15 ml de NMP. El contenido se disolvió, se enfrió, se mezcló con la resina, se copuló, se analizó, y se lavó como se ha indicado en el primer paso. El ensayo de Kaiser mostró una reacción incompleta. La re-copulación se efectuó drenando el reactor y re-copulando empleando un 50% de reactivos durante 1,5 horas. Una vez finalizada la reacción, se drenó el reactor y el lecho de resina se lavó cuatro veces con 120 ml de NMP. Una vez finalizada la reacción, la resina se trató con la solución de piperidina, se lavó, y se analizó como se ha indicado en el primer paso.

A continuación del (radical #20), se cargaron en un matraz 5,84 g de Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 2,15 g de HOBT monohidrato, 2,05 g de DIEA y 25,1 ml de NMP. El contenido se disolvió y se enfrió como se ha indicado en el primer paso.

En un matraz separado se combinaron 5,21 g de HBTU y 15 ml de NMP. El contenido se disolvió, se enfrió, se mezcló con la resina, se copuló, se analizó, y se lavó como se ha indicado en el primer paso. Una vez finalizada la reacción de copulación la resina se trató con la solución de piperidina, se lavó, y se analizó como se ha indicado en el primer paso.

A continuación del (radical #19), se cargaron en un matraz 8,44 g de Fmoc-Asn(Trt)-OH, 2,18 g de HOBT monohidrato, 2,09 g de DIEA y 25,1 ml de NMP. El contenido se disolvió y se enfrió como se ha indicado en el primer paso.

En un matraz separado se combinaron 5,36 g de HBTU y 15 ml de NMP. El contenido se disolvió, se enfrió, se mezcló con la resina, se copuló, se analizó, y se lavó como se ha indicado en el primer paso. Una vez finalizada la reacción de copulación la resina se trató con la solución de piperidina, se lavó, y se analizó como se ha indicado en el primer paso.

A continuación del (radical #18), se cargaron en un matraz 6,43 g de Fmoc-Lys(Boc)-OH, 2,11 g de HOBT monohidrato, 2,09 g de DIEA y 25,1 ml de NMP. El contenido se disolvió y se enfrió como se ha indicado en el primer paso.

En un matraz separado se combinaron 5,20 g de HBTU y 15 ml de NMP. El contenido se disolvió, se enfrió, se mezcló con la resina, se copuló, se analizó, y se lavó como se ha indicado en el primer paso. Una vez finalizada la reacción, el reactor se drenó y la resina se lavó tres veces con 101,5 ml de NMP. Una vez finalizada la reacción de copulación, se trató la resina con la solución de piperidina, se lavó, y se analizó como se ha indicado en el primer paso.

A continuación del (radical #17), se cargaron en un matraz 3,18 g de Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 1,28 g de HOBT monohidrato, 1,11 g de DIEA y 25,1 ml de NMP. El contenido se disolvió y se enfrió como se ha indicado en el primer paso.

En un matraz separado se combinaron 2,38 g de HBTU y 15 ml de NMP. El contenido se disolvió, se enfrió, se mezcló con la resina, se copuló, se analizó, y se lavó como se ha indicado en el primer paso. El lecho de resina se lavó a continuación cinco veces con 120 ml de DCM y cuatro veces con 120 ml de isopropanol. La resina se secó al vacío a 40 \pm 2ºC obteniéndose un rendimiento de 20,77 g.

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Ejemplo 5 Escisión y purificación del Fmoc-AA(17-35) (SEQ ID NO:3) a partir de la resina en fase sólida

Se efectuó la escisión del péptido naciente Fmoc-AA(17-35) a partir de la resina CTC, como se había efectuado en el ejemplo 4.

Con el fin de escindir el péptido de la resina, se combinaron 20,76 g de la resina copulada con el péptido, con 208 ml de DCM en el reactor. La resina y el DMC se agitaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos. A continuación el reactor se drenó y el lavado del DCM se repitió dos veces más con 137 ml de DCM (para todos los lavados la cantidad de líquido empleado es la cantidad de líquido por lavado) el reactor se enfrió a continuación a -10 \pm 5ºC. A continuación, se preparó una solución de 2,81 g de ácido trifluoracético y 201 ml de DCM, y se enfrió a 0 \pm 5ºC.

La solución de TFA enfriada, se cargó a continuación en el reactor y la dispersión se agitó durante 30 minutos a 0 \pm 5ºC. A continuación se añadieron 2,81 g de piridina al reactor y se agitó durante 5 minutos adicionales a 0 \pm 5ºC. A continuación se drenó el reactor y el lecho de resina se lavó siete veces con 137 ml de DCM a temperatura ambiente. Los lavados con DCM combinados se lavaron con 137 ml de agua y el DCM se separó por destilación al vacío hasta sequedad. A continuación el residuo se disolvió en 35 ml de DCM. A continuación se añadieron 137 ml de isopropanol, seguido por una concentración al vacío a aproximadamente 75 ml de volumen, enfriando a 10ºC, y a continuación añadiendo 100 ml de agua. La suspensión se enfrió a continuación a 0ºC y se envejeció durante 1 hora. El producto se filtró y se lavó con 25 ml de agua a 5ºC. El producto se secó al vacío a 40 \pm 2ºC, obteniéndose 12,9 g de producto (69,1%).

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Ejemplo 6 Síntesis en fase de solución del H-AA(17-36)NH_{2} (SEQ ID NO:4)

El fragmento intermedio del T-20, H-AA(17-36)NH_{2}, se preparó mediante copulación en fase de solución, del PheNH_{2} con el Fmoc-AA(17-35)OH.

El Fmoc-AA(17-35)OH (12,0 g, 2,83 mmoles, 1,0 equivalentes), PheNH_{2}.HCl (0,74 g, 3,68 mmoles, 1,3 equivalentes), 6-cloro-HOBT (0,96 g, 5,66 mmoles, 2,0 equivalentes), se disolvieron en DMF (100 ml, 8,3 vol.). La solución se enfrió a -10ºC y se añadió DIEA (1,4 ml,7,92 mmoles, 2,8 equivalentes) en DMF (5 ml, 3,6 vol.). Se añadió TBTU (1,2 g, 3,68 mmoles, 1,3 equivalentes), en una porción seguido de lavado con DMF (15 ml). La mezcla de reacción se agitó a -10ºC durante la noche y se calentó a temperatura ambiente. La agitación se continuó durante 4 horas adicionales. La finalización de la reacción se monitorizó mediante análisis HPLC el cual mostró un 0,4% residual del Fmoc-AA(17-35)OH de partida. Se añadió piperidina (1,23 ml, 14,43 mmoles, 5,1 equivalentes), y la solución se agitó a 30ºC durante 3 horas. La finalización de la eliminación del Fmoc se monitorizó mediante análisis HPLC el cual mostró < 1% de Fmoc-AA(17-36)NH_{2}. Se añadió agua (100 ml, 8,3 vol.) para precipitar el producto. El sólido se recogió mediante filtración por succión, y se lavó con agua. El secaje durante la noche a temperatura ambiente proporcionó 11,85 g (101%, % AN HPLC).

El H-AA(17-36)NH_{2} (11,85 g) se suspendió en 1:EtOH: agua (200 ml, 17 vol.). La suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La filtración por succión y el secaje hasta peso constante proporcionó 11,6 g (98,8% de rendimiento para ambos pasos) con una pureza del 80,0% (AN HPLC).

Condiciones de la HPLC:

Columna:: Zorbax-ACE, 3 \mum, C18, 3,0 x 100 mm de

Detector:: UV @ 220 nm

Velocidad del flujo:: 0,6 ml/minuto

Fase móvil:: A = 0,10% de TFA/agua/40% de IPA

\quad: B = 0,07% de TFA/acetonitreilo/40% de IPA

Gradiente:: 0 minutos 70% de B, 8 minutos 80% de B, 15-16 minutos 90% de B, 16,1-20 minutos 70% de B

Tiempo de retención:: aproximadamente 8 minutos

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Ejemplo 7 Síntesis en fase de solución del Ac-AA (1-36)NH_{2} (SEQ ID NO:1)

Se prepara el producto final T-20 mediante copulación en fase de solución, del Ac-AA (1-16)OH con el H-AA(17-36)NH_{2} para dar el fragmento Ac-AA (1-36)NH_{2} (SEQ ID NO:1).

Se disuelven H-AA (17-36)NH_{2} (1 equivalente), Ac-AA (1-16)OH (1 equivalente), y 6-cloro HOBT (1,5 equivalentes) en 20 volúmenes de DMF durante 30 minutos. La solución se enfría a 0 \pm 5ºC, y se añade DIEA (1,85 equivalentes) seguido de HBTU (1,2 equivalentes). Después de agitar durante la noche a 0ºC se añade agua (50 ml) gota a gota. La dispersión resultante se agita a temperatura ambiente durante 3-4 horas y el producto se aísla mediante filtración por succión. El producto se seca durante la noche en un horno al vacío, a 45ºC.

<110> F. Hoffmann-La Roche AG

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<120> Síntesis perfeccionada empleando fragmentos intermedios del péptido II

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<130> Case 22972

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<150> US 60/640711

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<151> 2004-12-30

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<160> 4

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<170> versión patentIn 3.3

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<210> 1

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<211> 36

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<212> PRT

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<213> artificial

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<220>

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<223> sintético

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<400> 1

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2

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<210> 2

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> artificial

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<220>

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<223> sintético

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<400> 2

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3

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<210> 3

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> artificial

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<220>

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<223> sintético

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<400> 3

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4

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<210> 4

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> sintético

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<400> 4

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5

Claims

1. Un método para la preparación de un péptido que tiene la secuencia:

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:1),

que comprende los pasos de:

(a) suministro de una resina soporte de síntesis en fase sólida de fórmula Z-Q-[SUP], en donde [SUP] es la resina soporte, Q es un radical de glutamina, y Z es un grupo protector del terminal NH_{2}, y en donde Z-Q está presente sobre [SUP] como un factor de carga de 0,5 ó inferior;

(b) copulación de los aminoácidos con Z-Q-[SUP] para proporcionar Z -YTSLIHSLIEESQNQQ-[SUP] ;

(c) tratamiento del Z-YTSLIHSLIEESQNQQ-[SUP] para proporcionar un producto de escisión Ac-YTSLIHS
LIEESQNQQ-OH (SEQ ID NO:2); y

(d) empleo del Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH (SEQ ID NO:2) para la síntesis del Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE
KNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:1).

2. El método de la reivindicación 1, en donde en el paso (a), [SUP] comprende grupos tritilo.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en donde en el paso (a), [SUP], comprende grupos clorotritilo.

4. El método de las reivindicaciones 1 a 3, en donde Z es un grupo Fmoc.

5. El método de la reivindicación 1, en donde en el paso (a), Z-Q está presente en [SUP] con un factor de carga inferior a 0,5.

6. El método de la reivindicación 5, en donde en el paso (a), Z-Q está presente en [SUP] con un factor de carga entre 0,2 y 0,5.

7. El método de la reivindicación 1, en donde en el paso (b) los aminoácidos están copulados con el Z-Q-[SUP] en una cantidad entre 1 y 1,5 equivalentes.

8. El método de la reivindicación 1, en donde en el paso (d), el Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH (SEQ ID NO:2) se hace reaccionar con un péptido que tiene la secuencia H-EKNEQELLELDKWASL WNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:4); para proporcionar el péptido que tiene la secuencia Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:1).

9. El método de la reivindicación 8, en donde el H-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:4) se forma haciendo reaccionar el Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO:3) con fenilalaninamida.

10. Un método para la preparación de un péptido que tiene la secuencia Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE
LLELDKWASLWN WF-NH_{2} (SEQ ID NO:1) que comprende los pasos de:

(a) suministro de una resina soporte, de síntesis en fase sólida, de fórmula Z-W-[SUP], en donde [SUP] es la resina soporte, W es un radical de triptófano, y Z es un grupo protector del terminal NH_{2}, y en donde Z-W está presente sobre [SUP] con un factor de carga de 0,5 ó inferior;

(b) copulación de los aminoácidos con Z-W-[SUP] para proporcionar el Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-[SUP];

(c) tratamiento del Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-[SUP] para proporcionar un producto de escisión Z-EK
NEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO:3); y

(d) empleo del Z-KNEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO:3) para la síntesis del Ac-YTSLIHSLIEESQN
QQEKNEQELLELDKWASLW NWF-NH_{2} (SEQ ID NO:1).

11. El método de la reivindicación 10, en donde, en el paso (d), el Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO:3) se hace reaccionar con fenilalaninamida para formar el H-EKNEQELL ELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:4).

12. El método de la reivindicación 10 u 11, en donde el H-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:4) se hace reaccionar con el Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH (SEQ ID NO:2) para proporcionar el Ac-YTSLIHS
LIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:1).

13. Un método para la preparación de un péptido que tiene la secuencia Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE
LLELDKWASLWN WF-NH_{2} (SEQ ID NO:1), el cual comprende los pasos de:

(a) suministro de los fragmentos intermedios del péptido de las secuencias Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH (SEQ ID NO:2) y Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO:3), en donde los fragmentos intermedios del péptido han sido sintetizados sobre soportes sólidos empleando un factor de carga de 0,5 ó inferior:

(b) en fase de solución, reacción del Z-EKNEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO:3) con un radical de fenilalanin-amida para proporcionar la secuencia H-EKNEQELLELDKWASL WNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:4); y

c) en fase de solución, reacción del Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OH (SEQ ID NO:2) con el H-EKNEQELLELDK
WASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:4) para proporcionar el Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK WASLWN
WF-NH_{2} (SEQ ID NO:1).

14. El método de la reivindicación 13, en donde, en el paso (a) los fragmentos intermedios del péptido han sido sintetizados sobre soportes sólidos empleando un factor de carga inferior a 0,5.

15. El método de la reivindicación 13 ó 14, en donde, en el paso (a) los fragmentos intermedios del péptido han sido sintetizados sobre soportes sólidos empleando un factor de carga entre 0,2 y 0,5.

16. El método de la reivindicación 13, en donde, en el paso (b) los fragmentos intermedios del péptido han sido sintetizados sobre soportes sólidos empleando aminoácidos que han sido copulados en el soporte en una cantidad entre 1 y 1,5 equivalentes.