ES2332142T3

ES2332142T3 - Sintesis de peptidos t-20 usando fragmentos peptidicos intermedios.

Info

Publication number: ES2332142T3
Application number: ES05823175T
Authority: ES
Inventors: Yeun-Kwei Han; David A. Johnston; Hiralal N. Khatri
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2004-12-30
Filing date: 2005-12-22
Publication date: 2010-01-27
Anticipated expiration: 2025-12-22
Also published as: KR20070111463A; CA2593864A1; EP1960423A2; CN101133078A; EP1960423B1; DE602005017206D1; CN101133078B; MX2007007916A; WO2006069727A3; IL184081A; JP2008526697A; ATE445637T1; IL184081A0; JP4886701B2; CA2593864C; WO2006069727A2; US20070213504A1

Abstract

Un método para preparar un péptido que tiene la secuencia Ac-YTSLIHSLIEEQNQQEKNEQELLELDK WASLWNWF-NH2 (SEQ ID NO:1) que comprende las etapas de: (a) aporte de una resina soporte de síntesis en fase sólida de fórmula Z-E-(SUP), en la que la (SUP) es la resina soporte, E es un residuo de ácido glutámico, y Z es el grupo protector del extremo NH2, y donde Z-E está presente en (SUP) en un factor de carga de 0,5 o menos; (b) acoplar aminoácidos a Z-E-(SUP) para lograr el Z-YTSLIHSLIEESQNQQE-(SUP); (c) tratar Z-YTSLIHSLIEESQNQQE-(SUP)para conseguir el producto de escisión Ac-YTSLIHSLIEESQNQ QE (SEQ ID NO:2); y (d) utilizar Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE-OH(SEQ ID NO:2) para la síntesis de Ac-YTSLIHSLIEEQNQQEK NEQELLELDKW ASLWNWF-NH2 (SEQ ID NO:1).

Description

Síntesis de péptidos T-20 usando fragmentos peptídicos intermedios.

La presente invención se refiere a métodos para preparar péptidos T-20 usando procesos en fase sólida y en solución además de fragmentos peptídicos intermedios T-20 que se pueden utilizar en estos métodos. Más en particular, la invención se refiere a la preparación de péptidos T-20 usando dos fragmentos que son sintetizados usando un método de fase sólida.

Muchos métodos para la síntesis de péptidos se han descrito en la literatura (por ejemplo, ver patente americana nº 6.015.881; Mergler y cols. (1988) Tetrahedron Letters 29: 4005-4008; Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29: 4009-4012; Kamber et al. (eds), Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden (1992) 525-526; Riniker y cols. (1993) Tetrahedron Letters 49: 9307-9320; Lloyd-Williams y cols. (1993) Tetrahedron Letters 49: 11065-11133; y Andersson y cols. (2000) Biopolymers 55: 227-250. Los diversos métodos de síntesis se distinguen por el estado físico de la fase en la cual tiene lugar la síntesis, es decir la fase líquida o la fase sólida.

En la síntesis de péptidos (SPPS) en fase sólida, un grupo aminoácido o peptídico se une a una resina soporte sólida. Luego, sucesivos grupos de aminoácidos o péptidos se acoplan al péptido unido al soporte hasta que se forma el material peptídico de interés. El péptido unido al soporte es posteriormente separado del mismo y sometido a un tratamiento y/o purificación adicionales. En algunos casos, la síntesis en fase sólida da lugar a un producto peptídico maduro; en otros casos, el péptido separado del soporte (es decir, un "fragmento de producto peptídico intermedio") se utiliza en la preparación de un producto peptídico maduro, más grande.

Los fragmentos intermedios peptídicos generados en los procesos en fase sólida se pueden acoplar juntos en un proceso sintético en fase líquida (al que aquí se hace referencia como "síntesis en solución"). La síntesis en solución puede ser especialmente útil en los casos en los que la síntesis de un péptido maduro útil en fase sólida es imposible o no práctica. Por ejemplo, en la síntesis en fase sólida, los péptidos más largos pueden adoptar eventualmente una conformación irregular mientras se mantienen unidos al soporte sólido, lo que conduce a una pérdida total o parcial de la actividad en el producto final. Es decir, a medida que la cadena de péptidos se hace más larga en la resina soporte, la eficacia de las etapas del proceso como el acoplamiento y la desprotección pueden verse comprometidas. Esto, en cambio, puede dar lugar a tiempos de tratamiento más largos para compensar estos problemas, junto con unas pérdidas crecientes en los materiales de partida, como los aminoácidos activables, los co-reactivos y los disolventes. Estos problemas pueden aumentar a medida que la longitud del péptido aumenta, y por lo tanto, es relativamente poco frecuente hallar péptidos maduros de más de 30 aminoácidos de longitud sintetizados usando solamente un procedimiento en fase sólida.

En el acoplamiento en solución, dos fragmentos peptídicos intermedios o bien un fragmento intermedio peptídico y un aminoácido reactivo se acoplan en un disolvente apropiado, y generalmente en presencia de reactivos adicionales que promueven la eficacia y la calidad de la reacción de acoplamiento. Los fragmentos peptídicos intermedios se disponen de manera que el grupo terminal N de un fragmento se acopla al grupo terminal C de otro fragmento, o viceversa. Además, los grupos protectores de la cadena lateral que están presentes durante la síntesis en fase sólida son retenidos frecuentemente en los fragmentos durante el acoplamiento de la fase en solución para garantizar la reactividad específica de los extremos terminales de los fragmentos. Estos grupos protectores de las cadenas laterales habitualmente no se eliminan hasta que se ha formado un péptido maduro.

Para la síntesis de péptidos muy grandes, es frecuente que se lleven a cabo múltiples etapas de acoplamiento en la fase en solución utilizando tres o cuatro o más fragmentos intermedios peptídicos. Mientras que el concepto general de las reacciones de acoplamiento extremo a extremo en las reacciones en solución es en general teóricamente sencillo cuando se utilizan múltiples fragmentos peptídicos intermedios, en la práctica esto no suele ser así. Diversos factores, como las impurezas y el rendimiento peptídico, pueden tener un efecto significativo en la calidad y el rendimiento de un péptido de longitud completa. Por lo tanto, la síntesis peptídica que utiliza esquemas híbridos a menudo da que pensar, y en muchos casos, es difícil de predecir que problemas son inherentes en un esquema de síntesis hasta que se lleva a cabo la verdadera síntesis.

En algunos casos, la síntesis en solución puede verse afectada por una falta de pureza de los fragmentos intermedios peptídicos posterior a la síntesis en fase sólida. A este respecto, puede ser necesario someter los fragmentos intermedios peptídicos a una etapa de purificación previa al acoplamiento de los fragmentos en un proceso en solución. La purificación, en cambio, puede causar una reducción en el rendimiento de los fragmentos intermedios peptídicos, y de acuerdo con ello, en el producto peptídico final.

Es decir, el rendimiento del péptido maduro es inversamente proporcional al número de etapas en solución que se requieren para sintetizar el péptido maduro. En algunos casos, se requieren tres, cuatro o más de cuatro etapas en solución que utilizan productos peptídicos intermedios para generar un péptido maduro. Cada etapa de acoplamiento adicional de la fase en solución puede dar lugar a una devolución reducida del producto peptídico de longitud completa. Por lo tanto, para mejorar el rendimiento global, en general se desea minimizar las etapas implicadas en el acoplamiento.

\newpage

Ligeras mejorías en una o más etapas en el esquema global sintético pueden dar lugar a una mejoría significativa en la preparación de péptidos maduros. Dichas mejorías podrán significar un ahorro global en tiempo y reactivos e incluso la mejora de la pureza y el rendimiento del producto final.

Mientras que la discusión sobre la importancia de las mejoras en la síntesis híbrida se puede aplicar a cualquier tipo de péptidos fabricados usando estos procedimientos, tiene una importancia especial en el contexto de los péptidos que son útiles desde el punto de vista terapéutico y que se fabrican a una escala para el uso médico comercial. Mientras que la síntesis de fármacos de moléculas pequeñas puede ser relativamente barata, el coste de la síntesis de fármacos compuestos por biomoléculas más grandes, como los péptidos terapéuticos, puede ser mucho mayor. Debido al coste de los reactivos y al tiempo de síntesis, además de otros factores, los escasos avances en el proceso sintético de estos fármacos compuestos por biomoléculas pueden tener un impacto significativo sobre si es factible o no fabricar dicho fármaco. Dichas mejoras o avances se deben necesariamente a los elevados costes de producción y todo ello viene respaldado por el hecho de que en muchos casos existen pocas o casi ninguna alterativa terapéutica adecuada para estos tipos de fármacos de biomoléculas grandes.

Esto se puede ver claramente en el caso de péptidos terapéuticos que se utilizan para el tratamiento de enfermedades de inmunodeficiencia causadas por la inyección retrovírica. Los péptidos que tienen actividad antirretrovírica pueden actuar de diferente modo, lo que incluye el impedir la fusión de la partícula vírica con la célula inmunitaria huésped. Existe una gran necesidad de estos péptidos terapéuticos nuevos y eficaces porque, en muchos casos, los antivíricos utilizados tradicionalmente son ineficaces para el tratamiento de estas enfermedades debido a la resistencia vírica por mutación.

Una clase prometedora de péptidos terapéuticos útiles para combatir las enfermedades de inmunodeficiencia son los inhibidores de la fusión. Este tipo de péptidos terapéuticos puede reducir el valor vírico, y mejorar de forma significativa la calidad de vida en pacientes que tienen enfermedades de inmunodeficiencia. Por ejemplo, el péptido FUZEON® (también conocido como enfuvirtida o T-20), que es un péptido sintético, de 36 aminoácidos, el péptido híbrido T-1249, y los derivados y los homólogos de estos péptidos han demostrado ser buenos como inhibidores de la fusión en el tratamiento del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). El péptido FUZEON® y sus derivados son los primeros inhibidores del VIH que demuestran una actividad potente y constante en las personas infectadas con VIH. Kilby y cols (1998) Nat Med 4:1302 and Kilby y cols. (2002) AIDS Res Hum Retroviruses 18:685.

Los inhibidores de la fusión como por ejemplo los péptidos T-20 y T-1249 se unen a una región de la envoltura vírica del VIH-1 de la glucoproteína 41 que se ve implicada en la fusión de los virus con la membrana de la célula huesped CD4+. Wild y cols.(1993) AIDS Res.Hum. Retroviruses 9:1051. Los inhibidores de fusión se mantendrán fuera de la célula y bloquearán el VIH-1 antes de que entre en la célula. El péptido FUZEON® y sus derivados minimizan las interacciones de los fármacos, los efectos secundarios y la citotoxicidad inhibiendo de forma potente y selectiva el VIH-1 in vitro.

Además de estas preocupaciones, los aspectos relacionados con la recuperación y la pureza del producto para la producción de péptidos a gran escala, así como el manejo, almacenamiento y la eliminación de reactivos, pueden impactar enormemente en la viabilidad del esquema de la síntesis de péptidos. Por consiguiente, existe una necesidad continua de procesos de síntesis de péptidos capaces de fabricar de forma eficaz materiales peptídicos de interés comercial en grandes cantidades con mejores rendimientos. La recuperación de péptidos arrancados de una resina soporte después de la síntesis en fase sólida del péptido es un aspecto de la síntesis en el que se requieren mejoras.

La presente invención hace referencia a la preparación de péptidos T-20 que son sintetizados utilizando un método de fase sólida y en solución ("híbrido"). En general, el método incluye sintetizar dos fragmentos diferentes intermedios T-20 (SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 o los homólogos de los mismos) usando la química de la fase sólida. De acuerdo con algunos aspectos de la invención, se ha averiguado que tras la síntesis en fase sólida, estas secuencias intermedias específicas T-20 tienden fácilmente a unas etapas de acoplamiento en solución. Además, se ha averiguado que las etapas en fase sólida que conducen a la formación de estos fragmentos intermedios peptídicos pueden ser modificadas para mejorar de forma significativa el rendimiento y la pureza de estos fragmentos intermedios. Este rendimiento y pureza mejorados se lleva a cabo en las etapas de acoplamiento en solución, mejorando con ello todo el proceso sintético.

Los métodos de la invención y los fragmentos intermedios peptídicos aquí descritos son realmente una ventaja, en particular porque hacen que el proceso de síntesis del T-20 sea más eficaz. En particular, las etapas para la síntesis en fase sólida que conducen a la formación de los productos intermedios peptídicos T-20 SEQ ID NO:2 o bien SEQ ID NO:3 utilizan una resina soporte que tiene un primer aminoácido acoplado al soporte en un factor de carga que es inferior a lo que tradicionalmente se utiliza en las técnicas de fase sólida estándar. Favorablemente, se ha descubierto que usando este factor de carga inferior, los productos intermedios peptídicos T-20 SEQ ID NO: 2 o bien SEQ ID NO:3, que son largos fragmentos sintetizados de forma atípica en fase sólida, se pueden fabricar con una pureza y un rendimiento muy mejorados.

La pureza y el rendimiento mejorados mejoran de forma significativa las condiciones para las etapas de acoplamiento en solución, por lo que se mejora la síntesis global del T-20.

Hasta ahora, los métodos de síntesis del T-20 de mayor éxito han utilizado el acoplamiento en solución por lo que tres o más de los tres fragmentos intermedios peptídicos se han preparado mediante la síntesis en fase sólida; estos fragmentos intermedios son utilizados luego en las reacciones de acoplamiento en solución para preparar el producto maduro T-20 final. Aunque puede verse una ventaja en un método de tres (o más) fragmentos con respecto a una mayor calidad de la síntesis en fase sólida de los productos intermedios, una desventaja es que el método de tres (o más) fragmentos implica más etapas de aislamiento y purificación en comparación con un método de dos fragmentos, y estas etapas adicionales generalmente incrementan el tiempo de tratamiento y pueden reducir posteriormente el rendimiento global de la reacción de síntesis.

Debido a que la presente invención solamente utiliza dos fragmentos intermedios peptídicos por medio de la síntesis en fase sólida, una ventaja clara es que los tiempos de tratamiento se reducen y la eliminación de las etapas de tratamiento puede dar lugar a un uso más eficaz de materiales y reactivos. Sin embargo, un inconveniente importante con un método de dos fragmentos es que la síntesis de fragmentos intermedios más largos mediante la síntesis en fase sólida se puede complicar y a menudo conduce a problemas serios en pureza y/o recuperación. Debido a esto, tal como se ha indicado, la presente invención demuestra que el método para elegir fragmentos peptídicos intermedios que tienen una secuencia a base de SEQ ID NO: 2 o bien SEQ ID NO: 3 y luego sintetiza estos fragmentos en una síntesis en fase sólida usando un factor de carga de resina bajo, permite que los fragmentos intermedios puedan ser fabricados con éxito con un buen rendimiento y pureza. Realmente este logro es notable a la vista de los métodos convencionales para sintetizar péptidos usando métodos combinados de fase sólida y en solución.

La invención es también una ventaja ya que mejoran otros aspectos de la pureza de los péptidos. En particular, los fragmentos peptídicos intermedios que tienen una secuencia conforme a SEQ ID NO:2 o bien SEQ ID NO:3 no incluyen un Residuo de ácido glutámico (E) aminoterminal. Hasta el punto que cualquier fragmento intermedio incluye un Residuo de ácido glutámico, mientras el Residuo esté colocado dentro de la secuencia o en el extremo C del fragmento intermedio. Se ha descubierto que la pureza de los fragmentos intermedios puede ser bastante superior cuando se utilizan fragmentos que tienen estas disposiciones secuenciales generales de los aminoácidos (como en SEQ ID NO:2 o bien SEQ ID NO:3), ya que un fragmento con ácido glutámico en el extremo N tiende a incluir más impurezas de ácido piroglutámico.

Por lo tanto, en algunos aspectos, la invención proporciona un método para preparar un fragmento intermedio peptídico para la síntesis de un péptido T-20 que incluya las etapas de (a) aportar una resina soporte para la síntesis en fase sólida que tenga un primer aminoácido acoplado al Residuo que es el ácido glutámico E, donde el ácido glutámico se acople a un factor de carga de 0,5 o menos; preferiblemente el ácido glutámico se acopla a un factor de carga entre 0,2 y 0,5; (b) acoplar los aminoácidos posteriores al primer aminoácido en el soporte acoplado con el fin de lograr la secuencia siguiente: Ac-YTSLIHSLIEESQN-QQE-(Soporte); (c) eliminar el producto intermedio Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE (SEQ ID NO:2) del soporte en una reacción de separación; y luego utilizar el producto intermedio Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE (SEQ ID NO:2) para la síntesis de un péptido que tenga todo o parte de Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO:1).

En otros aspectos, la invención permite preparar un fragmento peptídico intermedio para la síntesis de un péptido T-20, lo que incluye las etapas de a) proporcionar una resina soporte para la síntesis en fase sólida que tenga un primer aminoácido acoplado al Residuo que es el triptófano (W), donde el triptófano se acopla con un factor de carga de 0,5 o menos; preferiblemente, el triptófano se acopla con un factor de carga entre 0,2 y 0,5; b) acoplamiento de posteriores aminoácidos al primer aminoácido sobre el soporte acoplado para conseguir la siguiente secuencia: KNEQELLELDKWASLWNW-(soporte); c) retirar el intermedio peptídico KNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO:3) del soporte en una reacción de separación; y luego utilizar el intermedio peptídico KNEQELLELDK
WASLWNW (SEQ ID NO:3) para la síntesis de un péptido que tiene toda o una parte de Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE
KNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO:1).

Más preferiblemente, la invención proporciona un método para preparar un péptido T-20 que incluya las etapas de a) aportar fragmentos intermedios peptídicos que tengan las secuencias Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE (SEQ ID NO: 2) y KNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO:3), donde los fragmentos intermedios peptídicos hayan sido sintetizados sobre soportes sólidos que utilizan un factor de carga de 0,5 o menos; preferiblemente un factor de carga entre 0,2 y 0,5; b) la reacción en solución del péptido KNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO:3) con un Residuo de fenilalaninamida para dar la secuencia KNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO:4); y c) la reacción en solución del péptido Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE (SEQ ID NO: 2) con el péptido KNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO:4) para tener el péptido Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ NO.1).

En otros aspectos, en la etapa de acoplamiento el primer aminoácido está presente en el soporte con un factor de carga inferior a 0,5. En otros aspectos, en la etapa de acoplamiento el primer aminoácido está presente sobre el soporte con un factor de carga del orden de 0,2-0,45, o bien de 0,25-0,40.

Todavía en otros aspectos, la síntesis en fase sólida se lleva a cabo acoplando los aminoácidos a la cadena peptídica activa en una cantidad entre 1 y 1,5 equivalentes.

En otros aspectos, la invención proporciona un polipéptido que tiene la secuencia Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE (SEQ ID NO: 2). La SEQ ID NO:2 puede ser sintetizada por una síntesis en fase sólida usando un factor de carga de 0,5 o menos.

En otros aspectos, la invención proporciona un polipéptido que tiene la secuencia KNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO: 3). La SEQ ID NO: 3 puede ser sintetizada mediante una síntesis en fase sólida usando un factor de carga de 0,5 o bien inferior.

Las configuraciones de la presente invención descritas a continuación no pretenden ser exhaustivas o limitar la invención a las formas precisas reveladas en la siguiente descripción detallada. Más bien, las configuraciones se eligen y describen para que otros expertos en el tema puedan apreciar y comprender los principios y las prácticas de la presente invención.

La terminología aquí utilizada no pretende limitar el alcance de la invención. A través del texto, lo que incluye a las reivindicaciones, las formas singulares "a", "an" y "the" incluyen la referencia al plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, una referencia a un "Residuo aminoácido" es una referencia a uno o más Residuos aminoácidos e incluye equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la materia. En esta invención, se usan ciertos términos con frecuencia y se incluye su significado. A menos que se defina lo contrario, los términos aquí utilizados tienen el mismo significado que el utilizado por el experto en la materia en este campo de tecnología. Algunos términos se podrán ver con más detalle posteriormente en la especificación.

La presente invención va dirigida a los métodos para mejorar la síntesis del T-20 (conocido también como enfuvirtida) y de sus homólogos, y en particular para mejorar los aspectos de la síntesis respecto a la síntesis en fase sólida de los fragmentos intermedios peptídicos del T-20. La metodología de la presente invención es útil para fabricar el péptido T-20 y sus homólogos utilizando solamente dos fragmentos peptídicos sintetizados en fase sólida. Mientras que la invención va dirigida generalmente a la síntesis del T-20, sus enseñanzas se pueden aplicar también a la síntesis de otros péptidos, en particular de aquellos que son sintetizados usando una combinación de métodos en fase sólida y en solución. La invención es también aplicable a la síntesis de fragmentos de productos intermedios peptídicos asociados a impurezas, en particular a las impurezas del piroglutamato. Los métodos aquí descritos son especialmente apropiados para mejorar los aspectos de la síntesis ampliada de los péptidos T-20. Los procedimientos ampliados se realizan habitualmente para proporcionar una cantidad de péptido útil para la distribución. Por ejemplo, la cantidad de péptido en un procedimiento ampliado puede ser de 500 g, o de 1 kg por lote o más, y más típicamente de cientos de kg por lote o más. Esto implica cantidades de reactivos como resinas, disolventes, aminoácidos y productos químicos para varias etapas en el proceso de síntesis, en un tamaño que permita la producción de péptidos en cantidades, por ejemplo, del orden de 100-500 kilogramos o más.

Los métodos aquí descritos son especialmente adecuados para mejorar los aspectos de la síntesis de péptidos, en particular para métodos ampliados. En configuraciones preferidas, los métodos de la invención pueden proporcionar mejoras en el tiempo de tratamiento (síntesis), en el rendimiento de los productos, en la pureza de los productos y una reducción en la cantidad de reactivos y material de partida requerido.

El T-20 es un péptido que corresponde a los residuos de aminoácidos 638 a 673 de la proteína transmembrana gp41 procedente del aislado HIV-1_{L}Al y tiene una secuencia de 36 aminoácidos. La secuencia del péptido T-20 (SEQ ID NO 1) se muestra a continuación:

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO.1).

El T-20 es un fármaco antirretrovírico que se utiliza para el tratamiento de la infección por VIH-1. El T-20 se encarga de bloquear la fusión de la partícula vírica VIH-1 con células huésped mediante el bloqueo de los cambios conformacionales requeridos para la fusión de la membrana. Los péptidos que tienen este tipo de actividad se dice que tienen la actividad T-20.

La síntesis del T-20 utiliza normalmente tanto métodos en fase sólida como en solución para sintetizar y combinar grupos de fragmentos peptídicos específicos para dar el enfurtivida (Bray, B.L., Nature Rev., 2:587-593 (2003)). La presente invención proporciona métodos para la síntesis mejorada del enfurtivida y de los derivados del enfurtivida. Los métodos de la invención incluyen también la síntesis de péptidos que tienen la actividad del enfurtivida y derivados peptídicos utilizados para preparar los péptidos que tienen la actividad del enfurtivida. Los péptidos que tienen la actividad del enfurtivida se han descrito en la patente americana nº 5.464.933 y 5.656.480 y en la publicación PCT nº 96/19495.

La invención se aplica también a la síntesis de los homólogos del T-20, lo que incluye los homólogos del T-20 de longitud completa y los homólogos intermedios T-20. Tal como aquí se indica, un "homólogo T-20" hace referencia a un compuesto derivado del T-20 o a un fragmento intermedio del T-20. Los homólogos peptídicos incluyen pero no se limitan a los análogos peptídicos, al péptido T-20 o al fragmento intermedio T-20. Los homólogos peptídicos incluyen pero no se limitan a los análogos peptídicos, a los derivados peptídicos, a los compuestos de la fusión y similares. Por lo tanto, cuando se hace referencia a los fragmentos intermedios peptídicos del T-20 que tienen las secuencias SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3, sus homólogos incluyen, por ejemplo, los análogos peptídicos, los derivados peptídicos, los compuestos de fusión de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3, respectivamente.

Tal como aquí se utiliza, un análogo peptídico se refiere generalmente a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos modificada por una o más sustituciones de aminoácidos, inversiones, anulaciones y/o adiciones respecto a otro péptido o homólogo peptídico. Las sustituciones pueden ser preferiblemente conservadoras o altamente conservadoras. Una sustitución conservadora se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro que generalmente tiene la misma carga electrónica neta y generalmente el mismo tamaño y forma. Por ejemplo, los aminoácidos con cadenas laterales de aminoácidos alifáticas sustituidas o alifáticas tienen aproximadamente el mismo tamaño cuando el número total de carbones y heteroátomos en sus cadenas laterales difiere en no más de cuatro. Tienen aproximadamente la misma forma cuando el número de ramificaciones en sus cadenas laterales difiere en no más de una o dos. Se considera que los aminoácidos con grupos fenilo o fenilo sustituidos en sus cadenas laterales tienen aproximadamente el mismo tamaño y forma. A continuación se muestran cinco grupos de aminoácidos. Reemplazar un aminoácido en un compuesto por otro aminoácido del mismo grupo da lugar generalmente a una sustitución conservadora.

\vskip1.000000\baselineskip

Grupo I: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteina, metionina y aminoácidos que se producen de forma no natural con cadenas laterales alifáticas C_{1}-C_{4} sustituidas por un grupo alifático o bien hidroxilo (cadena recta o monoramificada).

Grupo II: ácido glutámico, ácido aspártico y aminoácidos de origen no natural con cadenas laterales alifáticas C_{1}-C_{4} sustituidas por ácido carboxílico (no ramificadas o con ramificación en un punto).

Grupo III: listina, ornitina, arginina y aminoácidos de origen no natural con cadenas laterales alifáticas C_{1}-C_{4} sustituidas por grupos amina o guanidino (no ramificadas o con una ramificación).

Grupo IV: glutamina, asparagina y aminoácidos de aparición no natural con cadenas laterales alifáticas C_{1}-C_{4} sustituidas por grupos amidas (sustituidas no ramificadas o con una ramificación).

Grupo V: fenilalanina, fenilglicina, tirosina y triptófano.

\vskip1.000000\baselineskip

Una "sustitución altamente conservadora" es la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tenga el mismo grupo funcional en la cadena lateral y casi el mismo tamaño y forma. Los aminoácidos con cadenas laterales de aminoácidos alifáticas sustituidas o alifáticas tienen casi el mismo tamaño cuando tienen el mismo número de ramas en sus cadenas laterales. Ejemplos de sustituciones altamente conservadoras incluyen la valina para la leucina, la treonina para la serina, el ácido aspártico para el ácido glutámico y la fenilglicina para la fenilalanina.

Un derivado peptídico se refiere en general a un péptido, un análogo peptídico, o bien otro homólogo peptídico que presente una modificación química de uno o más grupos laterales, átomos de carbono alfa, grupos amino terminales y/o grupo ácido carboxilo terminal. A modo de ejemplo, una modificación química incluye, pero no se limita a, añadir mitades químicas, creando nuevos enlaces y/o eliminando las mitades químicas. Las modificaciones de los grupos laterales de aminoácidos incluyen, sin limitación alguna, la acilación de grupos e-amino de lisina, la n-alquilación de arginina, histidina o lisina, la alquilación de grupos de ácido glutámico o aspártico carboxílico, y la desamidación de glutamina o asparagina. Las modificaciones del grupo amino terminal incluyen, sin limitación alguna, las modificaciones des-amino, N-alquilo inferior, N-dialquilo inferior, y N-acilo (por ejemplo, alquilo -co-inferior). Las modificaciones del grupo carboxi terminal incluyen, sin limitación alguna, modificaciones en el éster de alquilo inferior, en la dialquilamida, amida del grupo alquilo inferior y en la amida. Por tanto, los péptidos parcial o totalmente protegidos constituyen derivados peptídicos.

Se hace referencia al siguiente conjunto de péptidos, que incluye el T-20 y los fragmentos intermedios del T-20, tal como se indica en la tabla 1.

TABLA 1

1

Para tener una visión de conjunto, en base a los métodos de la invención, el esquema sintético global para el péptido T-20 es el siguiente. El T-20 (SEQ ID NO:1) se prepara mediante las etapas que incluyen la síntesis en fase sólida de los fragmentos intermedios peptídicos del T-20 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE (SEQ ID NO:2) y KNEQELLELDK
WASLWNW (SEQ ID NO:3). Estos péptidos son sintetizados usando los métodos aquí descritos y luego se separan de la resina de fase sólida en forma protegida de cadena lateral. Un Residuo de fenilalaninamida se acopla luego al intermedio peptídico KNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO:3) en solución para dar el KNEQELLELDK
WASLWNWF (SEQ ID NO:4). El KNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO:4) se acopla luego al Ac-YTS
LIHSLIEESQNQQE (SEQ ID NO:2) en solución para producir el Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE KNEQELLELDK
WASLWNWF (SEQ ID NO:1).

De acuerdo con la presente invención, las técnicas de síntesis en fase sólida se utilizan para preparar un primer fragmento peptídico del T-20 (fragmento intermedio 1) que tiene (fragmento intermedio 1) la secuencia de 17 aminoácidos de Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE (SEQ ID NO: 2) o un homólogo de la misma. Con respecto a un método preferido de la síntesis en fase sólida, el Residuo (E) de ácido glutámico con un grupo amino terminal (es decir, número de Residuo 17 de SEQ ID NO:2), que está presente en la parte del extremo C del péptido, es el primer Residuo aminoácido que se acopla a la resina de fase sólida y constituye por eso el alfa aminoácido del fragmento en cuanto a su posición con respecto a la resina soporte sólida. En este método preferido, la síntesis en fase sólida tiene lugar añadiendo consecutivamente Residuos aminoácidos del término amino al término carboxilo, añadiendo a modo de secuencia aminoácidos según la secuencia deseada. La síntesis del fragmento intermedio peptídico se ha completado después de haber añadido el Residuo terminal del extremo N (por ejemplo, la tirosina aminoterminal (Y) de la SEQ ID NO: 2) a la cadena peptídica activa. Las técnicas de síntesis en fase sólida se utilizan también para preparar un segundo fragmento peptídico del T-20 (fragmento 2 intermedio) que tiene la secuencia de 18 aminoácidos del KNEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO: 3) o bien de su homólogo. Con respecto a un método preferido de la síntesis en fase sólida, el residuo del triptófano amino-terminal (por ejemplo, el residuo 18 de la SE ID NO:3, o el residuo número 35 del SEQ ID NO:1) es el primer residuo aminoácido que se acopla a la resina en fase sólida y constituye así el alfa-aminoácido del fragmento en cuanto a su posición con respecto a la resina soporte sólida. En este método preferido la síntesis en fase sólida también actúa añadiendo de forma consecutiva Residuos aminoácidos del término amino al término carboxilo, añadiendo aminoácidos de forma secuencial de acuerdo con la secuencia deseada. La síntesis del fragmento intermedio peptídico finaliza después de que el residuo terminal del extremo N (por ejemplo, la lisina aminoterminal (K)(Y) de la SEQ ID NO:3) se haya añadido a la cadena peptídica activa.

De forma ventajosa, ni el fragmento intermedio 1 ni el fragmento intermedio 2 incluyen un residuo de ácido glutámico aminoterminal. Hasta el punto que el fragmento intermedio incluye un residuo de ácido glutámico, de manera que el residuo está colocado dentro de la secuencia o en el extremo C del fragmento intermedio. Se ha descubierto que la pureza de los fragmentos intermedios puede ser notablemente superior cuando se utilizan fragmentos que tienen estas secuencias generales de aminoácidos, ya que un fragmento con ácido glutámico en el extremo N tiende a incluir más impurezas de ácido piroglutámico.

También se ha observado que cada uno de los fragmentos intermedios 1 y 2 incluye los residuos de al menos 17 aminoácidos. Se trata de fragmentos peptídicos más bien grandes en el contexto de la síntesis en fase sólida, incluso los principios de la presente invención permiten que dichos fragmentos grandes y el T-20 resultante sean sintetizados con elevado rendimiento y pureza.

De acuerdo con la invención, se ha descubierto mediante el control apropiado de la cantidad relativa de péptido sintetizado en la resina en fase sólida, que se pueden obtener efectos ventajosos con respecto al rendimiento y a la pureza de los fragmentos intermedios peptídicos. La cantidad relativa de péptido sintetizado se puede controlar mediante el factor de carga, que hace referencia a la cantidad de alfa-aminoácido acoplada a una cantidad de resina, que se expresa típicamente como milimoles de alfa-aminoácido por gramo de resina en fase sólida. Por ejemplo, un factor de carga de 0,25 correspondería a 25 mmol de alfa-aminoácido que se acoplan realmente a 100 g de resina en fase sólida. Se entiende que la reacción que acopla el primer aminoácido a la resina de fase sólida puede no ser totalmente eficaz, y por lo tanto la cantidad real que se acopla puede ser menor a una cantidad teórica basada en una eficacia de acoplamiento del 100% y las cantidades de reactivos de partida. La cantidad real de material acoplado se puede determinar una vez ha tenido lugar la reacción. Para determinar el acoplamiento real, el péptido se puede separar de la resina y se puede analizar utilizando, por ejemplo, el análisis HPLC frente a un estándar. Los métodos para determinar la cantidad real del primer Residuo aminoácido acoplado se han descrito a continuación.

Conforme a la invención, se ha descubierto que el rendimiento y la pureza de un fragmento peptídico relativamente largo (como los fragmentos intermedios peptídicos, secuencias SEQ ID NO:2 Y SEQ ID NO:3) y de ahí el rendimiento y la pureza del péptido T-20 resultante, tiende a ser superior para unos factores de carga relativamente inferiores, como de 0,5 o menos. Sin embargo, si el factor de carga es, por ejemplo, de 0,2, entonces la producción del producto puede verse restringida. Equilibrando estos aspectos, el factor de carga con respecto a al menos los fragmentos 1 y 2, se sitúa entre 0,2 y 0,50, preferiblemente entre 0,2 y 0,45, y más preferiblemente entre 0,2 y 0,4. Por ejemplo, en la práctica lo ideal sería un factor de carga de 0,34.

Para ilustrar este aspecto, se puede realizar el procedimiento siguiente en fase sólida. Se obtiene y se prepara una resina adecuada lavando en un disolvente apropiado. A continuación, se añade a la resina lavada una solución que contiene el primer aminoácido de forma protegida y activable. Para conseguir un factor de carga dentro del margen deseado, se puede elegir la cantidad y/o la concentración de aminoácido y/o otros factores de reacción, como la presencia y la concentración de co-reactivos como el HOBT, la duración de la reacción de acoplamiento, la temperatura de la reacción de acoplamiento y así sucesivamente.

La síntesis en fase sólida que utiliza la química Fmoc se puede utilizar para preparar un fragmento intermedio del T-20 (como los fragmentos intermedios peptídicos que incluyen las SEQ ID NO:2 Y SEQ ID NO:3) acoplados a una resina. Una vez sintetizado el fragmento intermedio peptídico en la resina, se separaba usando un reactivo de separación para generar un fragmento intermedio peptídico en solución que está en forma protegida. El fragmento intermedio peptídico se separa luego de la resina. En algunos casos, el fragmento intermedio peptídico se pone en contacto con un agente de precipitación como medida para purificar el fragmento intermedio peptídico antes de realizar el acoplamiento de la fase en solución.

Los métodos para la síntesis de péptidos que utilizan un método en fase sólida son bien conocidos. De acuerdo con ello, la invención contempla el uso de cualquier método sintético en fase sólida que utilice un factor de carga mínimo para preparar un fragmento intermedio peptídico que se pueda utilizar en la preparación de un producto final del T-20.

Por ejemplo, los fragmentos intermedios peptídicos del T-20 aquí descritos pueden ser sintetizados mediante técnicas SSPS usando protocolos FMOC estándar. Ver, por ejemplo, Carpin y cols (1970), J. Am. Chem. Soc. 92(19): 5748-5749; Carpin y cols. (1972), J. Org. Chem. 37(22): 3404-3409, "Fmoc Solid Phase Peptide Syntehsis", Weng C. Chan and Peter D. White Eds. (2000) Oxford University Press Oxford Eng.

Cualquier tipo de soporte apropiado en la práctica de la síntesis de péptidos en fase sólida es útil. En las configuraciones preferidas, el soporte comprende una resina que puede estar compuesto por uno o más polímeros, copolímeros o combinaciones de polímeros como la poliamida, polisulfamida, polietilenos sustituidos, polietilenglicol, resinas fenólicas, polisacáridos, o poliestireno. El soporte polimérico puede ser también cualquier sólido que sea suficientemente insoluble e inerte a los solventes utilizados en la síntesis peptídica. El soporte sólido incluye normalmente una mitad enlazante a la cual se acopla el péptido que crece durante la síntesis y que se puede separar en las condiciones deseadas para liberar el péptido del soporte. Los soportes sólidos adecuados pueden tener conectores fotoescindibles, descomponibles por el ácido trifluoracético, fluorhídrico, ión fluoruro, por reducción; escindibles por Pd(O); escindibles nucleofílicamente o radicalmente. Las mitades enlazantes preferidas son escindibles en unas condiciones tales que el péptido escindido es globalmente protegido.

En un método preferido de la síntesis, los fragmentos peptídicos intermedios sintetizados en un soporte sólido sensible en medio ácido que incluye grupos tritilo, y más preferiblemente en una resina que incluye grupos tritilo que tienen grupos cloro colgantes, por ejemplo, una resina (2-CTC) de cloruro 2-clorotritilo (Barlos y cols., (1989) Tetrahedron Letters 30(30):3943-3946). Los ejemplos también incluyen la resina de cloruro de tritilo, una resina de cloruro de 4-metoxitritilo, una resina de 4-aminobutano-1-ol-2-clorotritilo, una resina de 4-aminometilbenzoil-2-clorotritilo, una resina de 3-aminobutano-1-ol-2-clorotritilo, una resina de ácido bromoacético-2-clorotritilo, una resina de ácido cianoacético-2-clorotritilo, una resina de ácido 4-cianobenzoico-2-clorotritilo, una resina de glicinol-2-clorotritilo, una resina de propiónico-2-clorotritilo, una resina de etilenglicol-2-clorotritilo, una resina de N-FMOC hidroxilamina-2-clorotritilo, y una resina de hidracina-2-clorotritilo. Algunos soportes sólidos preferidos incluyen el poliestireno, que puede ser copolimerizado con divinilbenceno para formar el material soporte al que se enganchan los grupos reactivo.

El material peptídico se engancha normalmente a las microesferas de resina tanto en la superficie de la microesfera como dentro de ella. El péptido protegido por la cadena lateral o por FMOC se escinde fácilmente en un estado protegido de esta resina usando reacciones ácidas como el ácido trifluoracético diluido en diclorometano o el ácido acético.

Otras resinas que se utilizan en la síntesis en fase sólida incluyen las resinas "Wang", que comprenden un copolímero de estireno y divinilbenceno con grupos de anclaje 4-hidroximetilfeniloximetilo (Wang, S.S. 1973, J. Am. Chem. Soc.) y una resina del ácido 4-hidroximetil-3-metoxifenoxibutírico (Richter y cols. (1994), Tetrahedron Letters 35(27): 4705-4706). El cloruro 2-clorotritilo y las resinas del ácido 4-hidroximetil-3-metoxifenoxibutírico se pueden comprar, por ejemplo, en Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, California.

Para lograr un soporte que tenga un primer aminoácido acoplado, la resina se prepara, por ejemplo, mediante un lavado y luego una incubación con una solución que contiene un aminoácido protegido, activado. El primer aminoácido y posteriores aminoácidos que se acoplan a la resina incluyen típicamente un grupo protector aminoterminal, un grupo protector de cadena lateral (dependiendo del aminoácido específico) y un grupo que es reactivo con un grupo que cuelga de la resina, o bien un grupo que es reactivo con el aminoácido colgante.

En los aspectos preferidos, el primer aminoácido se acopla al soporte en el extremo del grupo carboxilo, mientras que el extremo N y las cadenas laterales quedan protegidos de forma apropiada por los grupos protectores. Una descripción a modo de ejemplo, la síntesis en fase sólida del fragmento intermedio peptídico Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE (SEQ ID NO:2) se lleva a cabo en la dirección desde el extremo C hasta el extremo NH_{2}, cargando primero un Residuo de ácido glutámico protegido en una resina de cloruro de 2-clorotritilo (2-CTC).

La naturaleza y el uso de grupos protectores son bien conocidos. En general, un grupo protector adecuado es cualquier grupo que pueda ayudar a impedir que el átomo o el elemento al cual se adhiere, por ejemplo, oxígeno o nitrógeno, no participe en reacciones no deseadas durante el tratamiento y la síntesis. Los grupos protectores incluyen grupos protectores de cadenas laterales y grupos protectores aminoterminales. Los grupos protectores pueden impedir también la reacción o el enlace de ácidos carboxílicos, tioles y similares.

Un grupo protector de cadenas laterales equivale a una fracción química acoplada a la cadena lateral (es decir, grupo R en la fórmula general del aminoácido H_{2}N-C(R)(H)-COOH) de un aminoácido que ayuda a prevenir que una parte de la cadena lateral reaccione con los productos químicos utilizados en las etapas de síntesis, tratamiento de péptidos, etc. La elección de un grupo protector de cadena lateral puede depender de varios factores, por ejemplo, del tipo de síntesis realizada, del tratamiento al que se ve sometido el péptido, y del producto intermedio deseado o producto final. La naturaleza del grupo protector de cadena lateral depende de la naturaleza del propio aminoácido. En general, se elige un grupo protector de cadena lateral que no se elimina durante la desprotección de los grupos alfa-amino durante la síntesis en fase sólida. Por lo tanto, el grupo protector alfa-amino y el grupo protector de cadena lateral no suelen ser el mismo.

En algunos casos y dependiendo del tipo de reactivos utilizados en la síntesis en fase sólida y en otros tratamientos de péptidos, un aminoácido puede no requerir la presencia de un grupo protector de cadena lateral. Dichos aminoácidos no suelen incluir un oxígeno reactivo, nitrógeno u otra fracción reactiva en la cadena lateral.

Los ejemplos de grupos protectores de cadena lateral incluyen los grupos acetilo (Ac), benzoilo (Bz), tert-butilo, trifenilmetil(tritilo), tetrahidropiranilo, éter bencílico (Bzl) y 2,6-diclorobencilo (DCB), t-butoxicarbonilo (BOC), nitro, p-toluenosulfonilo (Tos), adamantiloxicarbonilo, xantilo(Xan), bencilo, 2,6-diclorobencilo, metilo, ester etílico y t-butílico, benziloxicarbonilo(Z), 2-clorobenziloxicarbonilo (2-Cl-Z), Tos, t-amiloxicarbonilo (Aoc) y grupos protectores tipo uretano alifáticos o aromáticos, grupos fotolábiles como el nitroveritriloxicarbonilo (NVOC); y grupos lábiles de fluoruro como el trimetilsililoxicarbonilo (TEOC).

Los grupos protectores de cadena lateral preferidos incluyen el grupo t-Bu para Residuos aminoácidos Tyr(Y), Thr(T), Ser(S) y Asp(D); el grupo trt para Residuos aminoácidos His(H), Gin(Q) y Asn(N); y el grupo Boc para Residuos aminoácidos Lys(K) y Trp(W).

Por ejemplo, una o más cadenas laterales de los residuos aminoácidos de los fragmentos peptídicos mencionados en la tabla 1 puede protegerse con grupos protectores estándar como el t-butilo (t-Bu), tritilo (trt) y t-butoxicarbonilo (Boc). El grupo t-Bu es el grupo protector de cadena lateral preferido para los Residuos aminoácidos Tyr(Y), Thr(T), Ser(S) y Asp(D); el grupo trt es el grupo protector de cadena lateral preferido para los residuos aminoácidos Tyr(Y), Thr(T), Ser(S) y Asp(D); el grupo trt es el grupo protector de cadena lateral preferido para los Residuos aminoácidos Lys(K) y Trp(W).

Durante la síntesis de los fragmentos intermedios peptídicos del T-20 que incluyen la histidina, la cadena lateral del residuo de histidina se protege preferiblemente con un grupo protector tritilo (trt). Si no se protege, el ácido utilizado para escindir el fragmento peptídico de la resina y/o para escindir el FMOC u otro grupo protector N-terminal durante la síntesis podría reaccionar perjudicialmente con un Residuo de histidina no protegido, causando la degradación del fragmento peptídico. Con bastante posibilidad, si la histidina no se protege no se podría producir la fijación de otro aminoácido. Un tiempo de escisión prolongado puede también eliminar un grupo protector como el trt de la histidina y hacer que un lote satisfaga las especificaciones de calidad típicas.

Preferiblemente, todos los residuos de asparagina de cada fragmento peptídico de la invención se encuentran protegidos. Además, se prefiere que el Residuo del triptófano se proteja con un grupo Boc.

Un grupo protector aminoterminal incluye una porción química acoplada al grupo alfa-amino de un aminoácido. Habitualmente, el grupo protector amino-terminal se retira en una reacción de desprotección antes de que el siguiente aminoácido se añada a la cadena peptídica creciente, pero puede mantenerse cuando el péptido se escinde del soporte. La elección de un grupo protector aminoterminal puede depender de varios factores, por ejemplo, del tipo de síntesis realizada y del producto intermedio deseado o del producto final.

Ejemplos de grupos protectores aminoterminales incluyen (1) grupos protectores tipo acilo, como el formilo, acrililo (Acr), benzoilo (Bz) y acetilo (Ac); (2) grupos protectores aromáticos tipo uretano, como el benciloxicarbonilo (Z) y Z sustituido, como el p-cloro benciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, p-bromobenciloxicarbonilo, p-metoxibenciloxicarbonilo; (3) grupos protectores alifáticos tipo uretano, como el t-butiloxicarbonilo (BOC), diisopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo, aliloxicarbonilo; (4) grupos protectores cicloalquilo tipo uretano, como el 9-fluorenil-metiloxicarbonilo (Fmoc), ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo y ciclohexiloxicarbonilo; y (5) grupos protectores tipo tiouretano, como el feniltiocarbonilo. Los grupos protectores preferidos incluyen el 9-fluorenil-metiloxicarbonilo (Fmoc), 2-(4-bifenilil)-propil(2)oxicarbonilo (Bpoc), 2-fenilpropil(2)-oxicarbonilo (Poc) y t-butiloxicarbonilo (Boc).

De acuerdo con la invención, los grupos protectores son retenidos típicamente en los fragmentos peptídicos intermedios durante la síntesis en fase sólida y también en y durante la reacción de acoplamiento en solución. Generalmente, una vez completada la etapa de acoplamiento en solución, se realiza una etapa de desprotección para eliminar uno o más grupos protectores del péptido.

Ejemplos específicos de los primeros aminoácidos que tienen grupos de protección específicos que se pueden acoplar a la resina para la síntesis de fragmentos intermedios peptídicos que tienen SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3 pueden ser el FmocGlu (OtBu)OH y FmocTrp(Boc)OH, respectivamente.

Para preparar una resina para la síntesis en fase sólida, la resina se puede lavar previamente en un disolvente. Por ejemplo, una resina en fase sólida como una resina 2-CTC se añade a una cámara peptídica y se lava previamente con un disolvente adecuado. El lavado se puede realizar para preparar a la resina en su contacto con el primer aminoácido que se acoplará a la resina. Básicamente, se realiza un pre-lavado para promover el acoplamiento eficaz del primer aminoácido con la resina. El disolvente del prelavado se puede elegir en base al tipo de disolvente (o mezcla de disolventes) que se utiliza normalmente en la reacción de acoplamiento, o viceversa.

Los disolventes que son adecuados para el lavado y también la reacción de acoplamiento posterior incluyen el diclorometano (DCM), dicloroetano (DCE), la dimetilformamida (DMF), el cloruro de metileno y similares, así como mezclas de estos reactivos. Otros disolventes útiles incluyen DMSO, piridina, cloroformo, dioxano, tetrahidrofurano, acetato de etilo, N-metilpirrolidona y mezclas de los mismos. En algunos casos, el acoplamiento se puede realizar en un sistema de disolventes binario, como la mezcla de DMF y DCM.

Tal como aquí se ha descrito, se desea controlar el factor de carga del primer alfa-aminoácido en la resina que se situará entre 0,2 y 0,50, preferiblemente en 0,2 hasta aproximadamente 0,45, y más preferiblemente en 0,2 hasta 0,40. Por lo tanto, se prepara una solución que tenga una cantidad de aminoácido que aporte un factor de acoplamiento del orden previsto. Esto se puede calcular conociendo la eficacia de acoplamiento para una reacción en particular. Por ejemplo, cuando se desea tener un factor de carga de 0,34 y se sabe que la eficacia de acoplamiento es de aproximadamente un 80%, entonces se debería utilizar una solución de acoplamiento que contenga 0,425 mmol de aminoácido por cada gramo de resina (0,34/0,8).

La reacción de acoplamiento puede efectuarse en presencia de uno o más compuestos que incrementen o mejoren la reacción de acoplamiento. Los compuestos que pueden incrementar la velocidad de reacción y reducir el ritmo de las reacciones laterales incluyen las sales de fosfonio y uronio que pueden convertir los aminoácidos protegidos en especies activadas (por ejemplo, BOP, PyBOPO, HBTU y TBTU todas generan ésteres NOBt) en presencia de una base terciaria, por ejemplo, diisopropiletilamina (DIEA) y trietilamina (TEA). Otros reactivos ayudan a prevenir la racemización aportando un reactivo protector. Estos reactivos incluyen las carbodiimidas (por ejemplo, DCC o WSCDI) con un nucleófilo auxiliar añadido (por ejemplo, 1-hidroxi-benzotriazol (HOBt), 1-hidroxi-azabenzotriazol (HOAt), o bien HOSu). Otro reactivo que se puede utilizar es el TBTU. También se utiliza el método anhídrido mixto, que utiliza cloroformato de isobutilo, con o sin un nucleófilo auxiliar añadido, así como el método azida, debido a la escasa racemización asociada al mismo. Estos tipos de compuestos pueden aumentar también el ritmo de acoplamientos mediados por carbodiimidas, así como prevenir la deshidratación de Residuos Asn y Gin.

El completar el acoplamiento puede ser controlado con un ensayo de ninhidrina cualitativo tal como aquí se ha descrito. Una vez se establece que el acoplamiento ha finalizado, la mezcla de reacción de acoplamiento se lava con un disolvente, y el ciclo de acoplamiento se repite para cada uno de los residuos aminoácidos posteriores del material peptídico. Después del ciclo de acoplamiento final, la resina se lava con un disolvente como el NMP, y luego se lava con un segundo disolvente inerte como el DCM.

Para acoplar el siguiente aminoácido, la retirada del grupo protector aminoterminal (por ejemplo, un grupo Fmoc) se realiza habitualmente mediante el tratamiento con un reactivo que incluye un 20-50% (sobre una base ponderal) de piperidina en un disolvente, como la N-metilpirrolidona (NMP) o dimetilformamida (DMF). Después de retirar el grupo protector Fmoc, se efectúan varios lavados para eliminar la piperidina residual y los productos secundarios de Fmoc (como el dibenzofulveno y su aducto de piperidina).

Una vez acoplado el primer aminoácido a la resina con un factor de carga deseado y tras la retirada del grupo protector aminoterminal, se pueden añadir los aminoácidos siguientes para preparar los fragmentos intermedios peptídicos. Los aminoácidos posteriores se pueden utilizar en un exceso estequiométrico de aminoácidos en relación con el factor de carga. Sin embargo, se ha averiguado que la síntesis en fase sólida de los fragmentos intermedios específicos del T-20 aquí descritos no requiere que se utilice un gran exceso de aminoácidos (y reactivos correspondientes) en la síntesis en fase sólida de estos fragmentos. En general, la cantidad de aminoácidos utilizada en la etapa de acoplamiento es al menos equivalente al factor de carga del primer aminoácido en la resina (1 equivalente o más). Preferiblemente, la cantidad de aminoácidos utilizados en la etapa de acoplamiento es equivalente a 1,3 (exceso de 0,3) o más, y más preferiblemente de aproximadamente 1,5 (exceso de 0,5). En algunos casos, por ejemplo, la etapa de acoplamiento utiliza una cantidad equivalente de aminoácidos en la gama situada entre 1 y 1,5 (mayor a 1 e inferior a
1,5).

Se ha descubierto que este exceso de aminoácidos (por ejemplo, aproximadamente un 1,5) es suficiente para que la reacción de acoplamiento se complete. Este exceso puede ayudar también a que la reacción tolere una base de exceso del reactivo desprotector.

Las etapas de acoplamiento, lavado, desprotección del grupo desprotector aminoterminal y lavado se puede repetir hasta que se forme el producto intermedio T-20 deseado.

Después de la síntesis en fase sólida y para retirar los péptidos intermedios de T-20 de la resina, se lleva a cabo un tratamiento de escisión de manera que los péptidos intermedios T-20 escindidos de la resina todavía sean sometidos a los grupos protectores terminales y de cadena lateral. Colocar los grupos protectores en su sitio permitirá que se evite el acoplamiento no deseado o bien otras reacciones no deseadas de los fragmentos peptídicos durante o después de la escisión. En el caso en que se utilice FMOC o una química similar para sintetizar el péptido, se puede llevar a cabo la escisión protegida de cualquier forma utilizando un reactivo ácido relativamente débil como el ácido acético o el ácido trifluoracético diluido en un disolvente como el DMC, que también puede hinchar la resina, siendo útil para el proceso de escisión y separación. Se prefiere el uso de un 0,5 a un 10% en peso, preferiblemente un 1 a un 3% en peso de ácido trifluoracético en DMC. Ver, por ejemplo, la patente americana nº 6.281.335.

Las etapas de escisión del fragmento intermedio peptídico de la resina en fase sólida pueden llevarse a cabo siguiendo las líneas del proceso a modo de ejemplo. Sin embargo, se puede usar aquel proceso adecuado que efectivamente escinda el fragmento intermedio peptídico de la resina. Por ejemplo, aproximadamente 5 a 20, preferiblemente unos 10 volúmenes de un disolvente que contiene un reactivo de escisión ácido se añadirán al recipiente. Las microesferas de resina se introducen en el reactivo como consecuencia de ello. La reacción de escisión se produce cuando se agita el contenido líquido a una temperatura adecuada durante un periodo de tiempo apropiado. La agitación evita que las microesferas formen grumos. Las condiciones adecuadas de tiempo y temperatura dependerán de factores como el reactivo ácido, la naturaleza del péptido, la naturaleza de la resina, y otros. Como líneas generales, la agitación tiene lugar entre -15 y 5ºC, preferiblemente entre -10 y 0ºC durante unos 5 minutos hasta 2 horas, preferiblemente, lo apropiado sería entre aproximadamente 25 y 45 minutos. El tiempo de escisión se puede situar en el intervalo comprendido entre 10 minutos y 2 horas. Para una producción a gran escala, el tiempo preferido se sitúa entre 15 y 50 minutos. La escisión se realiza preferiblemente en un margen de temperatura que se ajusta a una reacción exoterma que normalmente tiene lugar durante la reacción. Además, la temperatura inferior de la reacción de escisión impide que los grupos protectores de cadena lateral sensibles a los ácidos como los grupos trt, sean eliminados en esta
etapa.

Al final del tratamiento de escisión, la reacción se ha enfriado. Esto se logra, por ejemplo, añadiendo una base adecuada al recipiente como la piridina o similares, y si se continúa agitando durante un periodo adicional como de 5 minutos hasta 2 horas, preferiblemente de unos 20 hasta 40 minutos. El añadir la base y seguir agitando hace que la temperatura del contenido del recipiente aumente. Al final de la agitación, el contenido del recipiente puede estar a una temperatura entre 0 y 15ºC, preferiblemente entre 5 y 10ºC.

Los factores como el hinchamiento y la contracción de la resina para mejorar los aspectos de la recuperación peptídica se pueden incorporar de modo opcional al proceso global de síntesis.

Por ejemplo, después de la escisión, el soporte se puede lavar una o más veces con un reactivo de hinchamiento para extraer el péptido escindido en el lavado resultante y dicho lavado se recoge para efectuar la recuperación del péptido tras estos lavados. Por ejemplo, la escisión de un péptido de la resina 2-CTC usando ácido trifluoracético diluido en DCM constituiría todo o parte del tratamiento de hinchamiento. Tras la escisión, y finalizado el tratamiento de hinchamiento, el soporte se puede someter a uno o más lavados opcionales de encogimiento o contracción que permitirán la recuperación de cantidades adicionales de péptido de dichos lavados así como incrementarán la capacidad de recuperar péptidos adicionales de uno o más lavados de hinchamiento opcionales posteriores. Los posteriores lavados opcionales de hinchamiento que constituyen un tratamiento de hinchamiento adicional pueden ser llevados a cabo tras finalizar el tratamiento de contracción.

Ya que un solvente de hinchamiento como el DCM se puede utilizar como un constituyente en el reactivo de escisión, el tratamiento de escisión pasa a ser un primer tratamiento de hinchamiento en el cual una cantidad significativa de péptido escindido es extraída en el líquido. El volumen de microesferas hinchadas con ácido trifluoracético (TFA) en DCM tiende a ser más grande al inicio del tratamiento. Las microesferas seguirán hinchadas pero su volumen disminuye a medida que el péptido es extraído en el líquido.

Después del enfriamiento rápido, se vacía el recipiente y se recoge su contenido para recuperar el péptido extraído en el lavado. La presión se puede utilizar para forzar el paso de la mezcla líquida que contiene el material peptídico trasportado por el líquido a través del filtro y fuera del recipiente. Las microesferas que se quedan en el recipiente contendrán el DCM residual y todavía estarán hinchadas. Una cantidad significativa de péptido residual tiende a quedar retenida en las microesferas, y el posterior tratamiento de contracción e hinchamiento ayuda a recuperar una parte significativa del péptido residual.

Como una opción, se puede optar por lavar con agua el reactivo de escisión recogido antes de su concentración por destilación. Se piensa que el lavado con agua después de la escisión es útil para aumentar la calidad del péptido y, por lo tanto, su rendimiento. Por ejemplo, un periodo de contacto largo con el TFA y otros ingredientes en el reactivo de escisión puede dañar la calidad del péptido por ditritilación en His 6 y/o esterificación del péptido. El lavado con agua será útil para eliminar el TFA residual y sus productos secundarios. Después del tratamiento de lavado con agua/extracción, la mezcla líquida es transferida a un aparato de destilación, donde la mezcla se concentra al eliminar, por ejemplo, el DCM o similares.

Una vez vaciado el recipiente y recogida la mezcla para la recuperación de péptidos, el contenido del recipiente se somete a uno o más lavados de hinchamiento en los cuales se extraerá y luego recuperarán los péptidos adicionales. Estos lavados adicionales ayudan a lavar el recipiente y a retirar los reactivos de limpieza residuales y los productos secundarios. Dichos ingredientes son retirados antes de proceder al tratamiento de contracción de manera que el líquido de contracción no reaccione con ellos. Por ejemplo, es preferible eliminar el TFA del recipiente antes de añadir un líquido de contracción que contenga etanol ya que el etanol puede reaccionar con el TFA. Un tratamiento típico de lavado tiene lugar al agitar durante un periodo de tiempo, entre 2 minutos y 2 horas, preferiblemente entre 10 y 50 minutos. Finalizado el lavado, se retira del recipiente y luego se añade al recipiente de destilación con los otros lavados de hinchamiento. Opcionalmente, antes de ser añadidos al recipiente de destilación, estos lavados adicionales pueden ser sometidos a un tratamiento de extracción de agua para eliminar impurezas.

En algunos aspectos, se pueden preparar fragmentos intermedios peptídicos para el acoplamiento en solución llevando a cabo una etapa para incrementar su pureza, por ejemplo, por cristalización. Uno o más de los fragmentos peptídicos intermedios del T-20 pueden ser tratados con una solución que contiene IPA, como una mezcla de IPA y DCM, o bien IPA y agua, para cristalizar los fragmentos intermedios peptídicos.

Después de la síntesis en fase sólida, la escisión de la resina y cualquier lavado o purificación de los intermedios peptídicos, se hace reaccionar el fragmento intermedio peptídico que tiene la secuencia KNEWELLELDK
WASLWNW (SEQ ID NO:3) con un Residuo de fenilalaninamida (F-NH_{2}) para producir un fragmento intermedio peptídico que tenga la secuencia KNEWELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO:4). Esta reacción en solución puede realizarse en una solución de reacción adecuada, tal como se ha descrito. Este producto intermedio peptídico se puede precipitar en un no solvente, por ejemplo, agua, y se lava para mejorar la pureza.

Los fragmentos intermedios peptídicos protegidos de cadena lateral protegida del T-20, el Ac-YSTSLIHSLIEESQ
NQQE (SEQ ID NO:2) y el KNEWELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO:4) se unen en solución para formar un péptido T-20 de longitud completa que tenga la secuencia Ac-YSTSLIHSLIEESQNQQEKNEWELLELDKWASLWN
WF (SEQ ID NO:1). Estos fragmentos intermedios peptídicos donde el extremo N del fragmento intermedio peptídico KNEWELLELDKWASLWNWF se acopla al extremo C del Ac-YSTSLIHSLIEESQNQQE.

Preferiblemente, los péptidos pasan a la reacción de acoplamiento con un nivel de pureza del 80% o superior, o más preferiblemente de 82,5%, y más preferiblemente del 85% o superior en base al perfil HPLC. Según los métodos de la invención, la síntesis en fase sólida que utiliza un factor de carga mínimo es un aspecto significativo para preparar los fragmentos peptídicos intermedios del T-20 que tengan un nivel de pureza superior.

Las reacciones de acoplamiento peptídico son revisadas en, por ejemplo, New Trends in Peptide Coupling Reagents; Albericio Fernando; Chinchilla, Rafeal; Dodsworth, David J.; y Najera, Armen; Organic Preparations and Procedures International (2003), 33(3), 203-303.

El acoplamiento de fragmentos intermedios peptídicos puede efectuarse usando reactivos de acoplamiento in situ, por ejemplo, BOP, o-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio hexafluorfosfato (HBTU), HATU, diciclohexilcarbodiimida (DCC), carbodiimidas solubles en agua (WSCDI), o bien o-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio tetrafluorborato (TBTU). Otras técnicas de acoplamiento utilizan esteres activos preformados como la hidroxisuccinimida (HOSu) y el ésteres de p-nitrofenol (HONp); anhídridos simétricos preformados; N-carboxianhídridos (NCAs); o haluros ácidos como el fluoruro de acilo así como el cloruro de acilo.

En la reacción de acoplamiento se puede utilizar un disolvente de acoplamiento apropiado. Se entiende que el (los) disolvente(s) de acoplamiento utilizados pueden influir en el grado de racemización del enlace peptídico formado; la solubilidad del péptido y/o de los fragmentos peptídicos; y la velocidad de la reacción de acoplamiento.

En algunas configuraciones, la reacción de acoplamiento incluye un disolvente miscible en agua. Ejemplos de disolventes miscibles en agua son, por ejemplo, el DMSO, la piridina, el cloroformo, dioxano, tetrahidrofurano, acetato de etilo, N-metipirrolidona, dimetilformamida, dioxano o mezclas de los mismos.

En otras configuraciones, la reacción de acoplamiento incluye un disolvente no miscible en agua. Un ejemplo de un disolvente no miscible en agua es el cloruro de metileno. En estas configuraciones, el disolvente no miscible en agua es preferiblemente compatible con la reacción de desprotección, por ejemplo. Si preferiblemente se utiliza un disolvente no miscible en agua, esto no influye en la reacción de desprotección.

Una vez los fragmentos intermedios peptídicos se han acoplado para producir un péptido T-20, el producto puede ser sometido a una etapa de desprotección para eliminar los grupos protectores de cadena lateral.

La eliminación de grupos protectores de cadena lateral mediante un proceso global de desprotección utiliza una solución de desprotección que incluye un agente acidolítico para separar o escindir los grupos protectores de cadena lateral. Los reactivos acidolíticos frecuentemente utilizados para la desprotección global incluyen ácido trifluoracético puro (TFA), HCl, ácidos de Lewis como el BF_{3}Et_{2}O o bien Me_{3}SiBr, ácido fluorhídrico líquido (HF), bromuro de hidrógeno (HBr), ácido trifluormetanosulfúrico y combinaciones de los mismos. La solución de desprotección incluye además uno o más antioxidantes catiónicos adecuados, por ejemplo, el ditiotreitol, anisol, p-cresol, etanoditiol, o sulfuro de dimetilo. La solución de desprotección puede incluir también agua. Tal como aquí se utiliza, cantidades de reactivos presentes en la composición de desprotección se expresan típicamente en un porcentaje, en el que la cantidad de un componente individual se expresa como un numerador en "partes", como "partes en peso", "partes en volumen" y el denominador en el número total de partes en la composición. Por ejemplo, una solución de desprotección que contiene TFA:H_{2}O:DDT en un porcentaje de 90:5:5 (peso/peso/peso) tiene un TFA para 90/100 partes en peso, H_{2}O en 5/100 partes en peso, y DTT en 5/100 partes por peso.

En algunas configuraciones, la reacción de desprotección se puede efectuar de tal forma que la cantidad de agente acidolítico, preferiblemente TFA, en la composición de desprotección sea mayor de 90/100 partes en peso. Otras composiciones de desprotección preferidas incluyen una cantidad de agente acidolítico de 93/100 partes en peso o mayor, o bien una cantidad del orden de 93/100 a 95/100 partes en peso.

Una vez desprotegido el T-20, y como en una forma final, el lote de péptidos puede someterse a un procedimiento que desagregue los péptidos agregados que puedan estar presentes en esta etapa en el esquema global sintético.

La desagregación se puede realizar disolviendo muestras de péptidos en base acuosa y luego acidificando la mezcla acuosa para precipitar el péptido en presencia de al menos una sal y un co-disolvente. Preferiblemente, tanto una sal como un codisolvente están presentes en la solución de desagregación. La desagregación puede efectuarse precipitando el péptido rápidamente (al menos en una primera etapa de acidificación en la cual el pH del medio alcalino se reduce a un pH del orden de 6 a 7,5, después de lo cual se puede producir la acidificación a un pH final deseado, por ejemplo, 3 a 6, de forma más lenta) a una temperatura relativamente baja.

Para la desagregación, la solución alcalina, tamponada acuosa procede generalmente de ingredientes que comprenden agua, al menos una sal, y una cantidad suficiente de al menos una base par conseguir el pH de la disolución deseado. El péptido T-20 y los diversos ingredientes que constituyen la solución alcalina, tamponada, acuosa se pueden combinar de cualquier manera. En la práctica, la solución se prepara a partir de sus ingredientes y luego se añade el péptido a la solución ya preparada. Actuando de otra forma, se puede añadir el péptido a una solución acuosa que comprenda la sal donde la solución tenga un pH demasiado bajo para que se produzca la disolución. Luego se añade una base a esta mezcla para elevar el pH a un valor al cual se producirá la disolución. Otra alternativa posible será añadir la sal a la solución antes, durante y/o después de la disolución. En general, sin embargo, la sal se incorpora a la solución antes de que el pH disminuya para que el péptido precipite tal como se describe a continuación.

La concentración del péptido en la solución puede variar notablemente. Como líneas generales, la concentración peptídica del T-20 en la solución puede situarse entre unos 3 g/L y 6 g/L.

Una variedad de una o más bases se podrán incorporar a la solución para conseguir el pH deseado. Ejemplos representativos de las bases adecuadas incluyen bases de hidróxido como el NaOH y el bicarbonato y bases de carbonato como el bicarbonato de sodio o de potasio o el carbonato de sodio o de potasio. Se prefiere el hidróxido sódico, en particular el NaOH 0,5 N a 1 N. La base se utiliza para ajustar el pH a un valor deseado y a ese pH el péptido se disolverá en la solución en una cantidad razonable de tiempo. Para muchos péptidos, esto corresponde a un pH de disolución entre 8 y 11.

La sal constituyente de la solución mejora las características de disolución del péptido precipitado resultante. De un modo específico, un péptido soluble que se disuelve rápidamente en una solución acuosa a un pH menor se prepara de forma más uniforme cuando existe una sal en una concentración apropiada.

Una variedad de sales sería útil en la práctica de la presente invención. Los ejemplos incluyen el carbonato de sodio, acetato de sodio, carbonato de amonio, acetato de amonio, bicarbonato de sodio, bicarbonato de amonio, versiones de sodio y potasio de estos, combinaciones de éstos y otros. El más preferido es el acetato de amonio.

La concentración de la sal en la solución puede variar dentro de una amplia gama. Un ejemplo de una concentración de sal adecuada puede ser el uso de 1 a 200 mM equivalentes de sal. En la práctica se prefiere que el intervalo sea de 5 a 50 mM, más preferiblemente de una concentración 10 mM de sal, especialmente de acetato de amonio.

La temperatura de disolución hace referencia generalmente a la temperatura de la solución acuosa en la cual se disuelve el péptido. La disolución puede llevarse a cabo a una temperatura adecuada. En general, se prefiere disolver el péptido en una solución que se mantiene a una o más temperaturas entre 10 y 30ºC, preferiblemente a unos 10ºC hasta 25ºC, más preferiblemente a 15ºC hasta 20ºC.

Preferiblemente se incorpora un disolvente en la solución de manera que la precipitación posterior del péptido tiene lugar en presencia del codisolvente. El codisolvente se puede añadir a la solución antes, durante y/o después de la disolución, pero preferiblemente se añade puntualmente después de la disolución del péptido. El codisolvente hace referencia a uno o más disolventes adicionales en los cuales el péptido es soluble al pH de la disolución. Preferiblemente, el péptido es también soluble en el codisolvente a 25ºC y a un pH fisiológico cuando el péptido es desagregado de tal forma que el peso molecular medido del péptido respecto al peso molecular teórico del péptido se sitúa en el intervalo entre 2:1 y 1:1. Ejemplos de codisolventes incluyen el acetonitrilo, metanol y combinaciones de los mismos.

En las configuraciones preferidas de la invención, una cantidad suficiente de codisolvente se añadirá a la solución de tal forma que la solución contenga entre un 2 y un 50% en volumen, preferiblemente entre un 5 y un 30% en volumen y más preferiblemente entre un 10 y un 20% en volumen de codisolvente.

Tras la disolución, y después de la adición del codisolvente, el pH de la solución se incrementa al añadir base adicional para facilitar la posterior desagregación de péptidos si se desea. Luego se filtra la solución. Lo adecuado sería un filtrado a presión a través de un filtro de 0,2 micras. El filtrado es desgasificado al vacío, después de lo cual la solución se deja reposar durante un periodo de tiempo apropiado antes de un posterior tratamiento para completar el proceso de desagregación. En general, el tiempo total que el péptido se encuentra a un pH elevado (lo que incluye el tiempo de reposo, filtrado, desgasificado, etc.) oscila entre 5 minutos y unas 6 horas, más preferiblemente entre 30 minutos y unas 2 horas. Tras el reposo, la solución se puede filtrar de nuevo.

El pH de la solución se reduce, por ejemplo, se acidifica, en unas condiciones efectivas para hacer que el péptido precipite. Como directrices generales, podría ser apropiado un pH final entre 3 y 6, preferiblemente entre 4 y 6.

El pH de la solución se reduce preferiblemente añadiendo uno o más ácidos a la solución. Ejemplos de ácidos son el HCl, ácido sulfúrico, ácido acético, ácido oxálico, combinaciones de estos y similares. El ácido acético es el preferido. Por ejemplo, la solución de ácido acético acuosa, al 5% o 10% ha resultado ser la apropiada.

En algunas prácticas, el producto peptídico con unas propiedades de disolución excelentes se podrá obtener si el ácido se añade relativamente rápido para disminuir el pH solamente a un pH intermedio. Tras esta adición inicial, relativamente rápida de ácido, el ácido se añade en un segundo, el pH se va reduciendo de forma mucho más lenta hasta el pH final deseado. Los valores de pH intermedios adecuados se sitúan en el intervalo de 6 a 8, más preferiblemente entre 6,0 y 7,5. Lo deseable es un descenso inicial rápido del pH en un periodo de tiempo inferior a una hora, preferiblemente 30 minutos o menos, más preferiblemente 15 minutos o menos.

Por ejemplo, una forma de práctica adecuada implica reducir el pH de una solución de T-20 inicialmente a un pH de 11. Se añade una cantidad suficiente de ácido rápidamente durante un periodo de 10 minutos para reducir el pH a un valor intermedio de aproximadamente 6,0. Luego el ácido se añade más lentamente de 10 a 20 minutos para reducir el pH a 5,3 hasta 5,5.

La mezcla se agita bien durante el transcurso de la adición para provocar la precipitación del péptido. Como líneas generales, se prefiere agitar la mezcla mientras se añade el ácido mientras se deja un margen de seguridad suficiente para evitar la espumación de la mezcla.

La adición de ácido para causar la precipitación del péptido se puede llevar a cabo con la solución a una temperatura adecuada. Como directrices generales, lo ideal sería realizar la precipitación a una temperatura en el intervalo de 10 a 30ºC, preferiblemente de 15 a 25ºC, más preferiblemente de 16 a 18ºC.

Después de la precipitación, el péptido se aisla y seca antes de combinarse con otros ingredientes, se liofiliza, envasa, almacena, se procesa de nuevo y/o se manipula de algún modo. Esto se efectúa del modo adecuado. De acuerdo con un método apropiado, el péptido se recoge a través del filtrado, lavado con muchos lavados de agua hasta reducir el contenido final en sales a un nivel adecuado y luego se seca.

Si el péptido precipita de forma no apropiada para la filtración (por ejemplo, si el precipitado es "tipo gel"), el precipitado se puede someter a un proceso con una agitación deseable, en el cual las partículas peptídicas se aglomerarán hasta endurecerse.

En una configuración práctica preferida, este tratamiento de endurecimiento implica que el péptido sea tratado con agitación en el transcurso de un tratamiento de enfriamiento/calefacción/enfriamiento. Este mejora las características de filtrado del péptido sin dañar la estructura terciaria del péptido. En un tipo de configuración práctica específica, el tratamiento implicaba el envejecimiento de las partículas en una mezcla acuosa durante 5 minutos a 48 horas, preferiblemente 30 minutos a 8 horas, más preferiblemente 30 minutos a 2 horas a una primera temperatura por debajo de la temperatura ambiente, preferiblemente del orden de más de 0ºC hasta unos 20ºC, preferiblemente entre 10 y 20ºC, más preferiblemente alrededor de 16ºC. La agitación se utiliza para garantizar que las partículas se dispersan bien durante la maduración.

A continuación, se eleva la temperatura de la mezcla unos 2ºC hasta 30ºC, preferiblemente unos 5ºC hasta unos 15ºC, a una temperatura moderadamente más caliente, de manera que la transición a la temperatura más caliente se produce con agitación durante un periodo entre 1 minuto y 48 horas, preferiblemente 5 minutos y 8 horas, más preferiblemente 20 minutos y 2 horas. Preferiblemente, la temperatura nueva, moderadamente más caliente es la temperatura ambiente o una algo inferior. En un modo de práctica específico, aumentar la temperatura de 16 a 21ºC en aproximadamente una hora podía ser adecuado. La agitación continúa durante esta transición. Luego la mezcla madura a la temperatura más caliente durante un periodo de 5 minutos a 8 horas, preferiblemente de 20 minutos a 4 horas, más preferiblemente alrededor de 3 horas, con agitación.

Después de esta etapa de maduración, la temperatura de la mezcla se reduce en aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 30ºC, preferiblemente unos 5ºC hasta 15ºC, a una temperatura moderadamente más fría, en la que se produce la transición a una temperatura más fría con agitación durante un periodo de tiempo de 1 minuto a aproximadamente 48 horas, preferiblemente 5 minutos a 8 horas, más preferiblemente 20 minutos a 4 horas. Preferiblemente, la temperatura nueva, moderadamente más fría, se sitúa en el intervalo entre 3 y 18ºC, más preferiblemente unos 10ºC. En un tipo de práctica específica, disminuir la temperatura de 21ºC a 10ºC en unas dos horas aproximadamente resultó ser lo adecuado. La mezcla se deja madurar luego a la temperatura más fría preferiblemente durante un periodo de tiempo entre 5 minutos y 48 horas, más preferiblemente unas 6 horas.

Este tratamiento de maduración mejora las características del filtrado de las partículas precipitadas en el proceso de filtración y la separación de las partículas peptídicas del filtrado tiene lugar más fácilmente sin cambiar excesivamente la estructura secundaria del péptido.

Por consiguiente, después de esta maduración, se filtra el precipitado, filtrado a presión preferiblemente como con 1 psig N_{2}. La torta de filtro se puede lavar una o más veces con agua previamente enfriada a una temperatura entre 2 y 20ºC, preferiblemente 5 y 15ºC, más preferiblemente de unos 10ºC. Esto ayudará a disminuir el contenido en sales de la torta. La torta de filtro se seca luego total o parcialmente, haciendo pasar nitrógeno por la torta con nitrógeno a una temperatura adecuada durante un periodo de tiempo adecuado, como de 1 minuto a 48 horas, preferiblemente 5 minutos a 8 horas, más preferiblemente unas 6 horas. Lo ideal es utilizar nitrógeno a temperatura ambiente. La torta se puede agitar periódicamente para facilitar el secado. El secado opcionalmente se podrá completar en un aparato de secado aparte. Dicho secado opcional tiene lugar preferiblemente al vacío, por ejemplo a menos de 30 mm Hg, a una temperatura moderada para no degradar el péptido, por ejemplo, a una temperatura inferior a unos 30ºC, preferiblemente inferior a unos 28ºC.

Los principios de la presente invención se ilustran a continuación con respecto a los ejemplos ilustrativos siguientes.

Ejemplos

Para los ejemplos siguientes, se han adoptado los reactivos estándares y la nomenclatura siguientes:

Prueba de cloranilo: La prueba de cloranilo se ha preparado añadiendo una gota de una solución saturada de cloranilo al tolueno a aproximadamente 1 ml de acetona. Los lavados de NMP se estudiaban añadiendo una gota del lavado a la prueba de cloranilo. Un color azul o violeta es una indicación positiva de la presencia de aminas secundarias, lo que indica que los productos secundarios desprotegidos de Fmoc y/o la piperidina residual todavía se encuentran presentes.

Prueba de Ninhidrina (Kaiser): En el ensayo cualitativo de ninhidrina, se extraía una muestra de 2-20 mg de resina y se lavaba con NMP y posteriormente DCM o metanol. Estas gotas de una solución del 76% de fenol en etanol, seis gotas de una solución 0,2 mM de KCN en piridina, y tres gotas de una solución 0,28M de ninhidrina en etanol se añadían a la muestra, y la muestra se colocaba en un bloque calefactor a aproximadamente 100ºC durante unos 5 minutos. La muestra se extraía e inmediatamente se diluía con una solución de etanol/agua (9:1). Un color azul o violeta es una indicación positiva de la presencia de aminas libres, lo que incluye que la reacción de acoplamiento no ha finalizado. Si transcurrida una hora de la reacción de acoplamiento todavía la prueba de ninhidrina era positiva, la reacción de acoplamiento continuaba durante una hora más. Si la prueba de ninhidrina era positiva al cabo de tres horas, se drenaba el recipiente y se repetía la reacción de acoplamiento usando un equivalente de aminoácido activado y de reactivos.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1 Preparación de la resina de 2-CTC cargada con Fmoc-Glu(OtBu)

Un reactor de 5 L se purgaba con nitrógeno y luego se cargaba con 200 g de resina 2-CTC y 2 L de DCM. La mezcla de resina-DCM se agitaba a 25\pm2ºC durante 30 minutos. Mientras tanto, 38,0 g de Fmoc-Glu(OtBu)OH, 1,4 L de DMF, 200 ml de DCM y 24,5 g de DIEA se introducían en un frasco de 2 L. El contenido del frasco se agitaba a temperatura ambiente para disolver el sólido.

Una vez drenado el DCM del reactor, la mezcla que contiene el Fmoc-Glu(OtBu)OH se cargaba en el reactor con la resina y se agitaba durante 2 horas bajo nitrógeno a 25 \pm 2ºC. Después de 2 horas, el reactor se drenaba.

Los puntos activos en la resina se tapaban con una mezcla de DIEA: MeOH(200:1800 ml). Luego se agitaba la mezcla a 25 \pm 2ºC durante una hora. El lecho se drenaba, se lavaba una vez con 2 L de DMF, una vez con 1 L de DMF, cuatro veces con 2 L de DMC, y una vez con 1 L de DCM. El último lavado mostraba un ensayo UV negativo.

Luego la resina se lavaba dos veces con 2 L de isopropanol (IPA), respectivamente. La resina se secaba al vacío hasta un peso constante a 40 \pm 2ºC para dar 230,13 g de resina cargada.

El análisis cualitativo de HPLC se realizaba mediante la escisión del aminoácido de la resina y su análisis frente a un estándar. El análisis en HPLC del material mostraba una carga de la resina de 0,38 mmol/g.

Columna:: Zorbax SB-CN, 5 micras, 3,0x250 mm

Velocidad de flujo:: 0,5 ml/min

Detección:: UV a 220 nM

Fase móvil:: A: 0,01 M TEA-P

\quad: B: acetonitrilo

Tiempo de retención:: aproximadamente 17 minutos

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Síntesis en fase sólida del fragmento intermedio del T-20 Ac-AA(1-17)OH(SEQ ID NO:2)

Se llevaba a cabo la síntesis en fase sólida para generar la resina Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-O-2-CTC (fragmento Ac-AA(1-17)O-2-CTC-resina).

La resina de Fmoc-Glu(OtBu)-O-2-CTC (20,0 g) tal como se ha descrito en el ejemplo 1, se cargaba a un reactor para la síntesis en fase sólida junto con 200 ml de DCM. La mezcla se agitaba durante 30 minutos a 30\pm3ºC. La cámara se drenaba y el lecho de resina se lavaba tres veces con 100 ml de NMP. (Para todos los lavados la cantidad de líquido utilizada es la cantidad de líquido por lavado).

El reactor se cargaba con 100 ml de piperidina al 20% en NMP que luego se agitaba a 30\pm3ºC durante 30 minutos. El reactor se drenaba y luego se cargaba con 100 ml de piperidina del 20% en NMP. La mezcla se agitaba durante 30 minutos a 30\pm3ºC y el reactor se drenaba.

El orden del acoplamiento iba del Residuo #16 al Residuo #1:

Q\rightarrowQ\rightarrowN\rightarrowQ\rightarrowS\rightarrowE\rightarrowE\rightarrowI\rightarrowL\rightarrowS\rightarrowH\rightarrowI\rightarrowL\rightarrowS\rightarrowT\rightarrowY.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #16). A continuación se cargaban en el frasco 9,81 g de Fmoc-Gln(Trt)OH, 2,48 g de HOBT monohidrato, 2,33 g de DIEA y 80 ml de NMP. El contenido se agitaba a temperatura ambiente para disolver los sólidos que luego se enfriaban a 10ºC.

A continuación se cargaban en un frasco aparte 6,08 g de HBTU y 40 ml de NMP. La mezcla se agitaba a temperatura ambiente para disolver los sólidos y luego se enfriaba a 10ºC. La solución de HBTU enfriada se añadía luego a la solución de Fmoc-Gln(Trt)OH y la mezcla se cargaba al reactor de fase sólida. El frasco se lavaba entonces con 40 ml de DcM y el lavado se cargaba al reactor SPSS. La mezcla se agitaba a 30\pm3ºC durante 3 horas. Se recogían muestras de microesferas de resina para completar la reacción mediante un ensayo de Kaiser. Una vez finalizada la reacción, el reactor se drenaba y el lecho de resina se lavaba con 100 ml de NMP.

A continuación se cargaban en el reactor 100 ml de piperidina del 20% en NMP que luego se agitaban a 30\pm3ºC durante 30 minutos. El reactor se drenaba y se añadían 100 ml de piperidina del 20%. La mezcla se agitaba a 30\pm3ºC durante 30 minutos y luego se drenaba el reactor. El lecho de resina se lavaba entonces cuatro veces con 100 ml de NMP. Se recogían muestras del último lavado para averiguar los niveles de piperidina mediante la prueba cualitativa de Ninhidrina.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #15). A continuación se cargaban en el frasco 9,84 g de Fmoc-Gln(Trt)OH, 2,49 g de HOBT monohidrato, 2,32 g de DIEA y 80 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

A continuación se cargaban en un frasco aparte 6,14 g de HBTU y 40 ml de NMP. El contenido se disolvía, enfriaba, mezclaba con la resina, acoplaba, analizaba y lavaba tal como se ha indicado en la primera etapa. Después de la etapa de acoplamiento, la resina se trataba con la solución de piperidina, se lavaba y se analizaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #14). A continuación se cargaban en el frasco 8,19 g de Fmoc-Asn(Trt)OH, 2,13 g de HOBT monohidrato, 2,09 g de DIEA y 80 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

A continuación se cargaban en un frasco aparte 5,18 g de HBTU y 40 ml de NMP. El contenido se disolvía, enfriaba, mezclaba con la resina, acoplaba, analizaba y lavaba tal como se ha indicado en la primera etapa. Después de la etapa de acoplamiento, la resina se trataba con la solución de piperidina, se lavaba y se analizaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #13). A continuación se cargaban en el frasco 8,42 g de Fmoc-Gln(Trt)OH, 2,20 g de HOBT monohidrato, 2,08 g de DIEA y 80 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #12). A continuación se cargaban en el frasco 5,23 g de Fmoc-Ser(OtBu)OH, 2,12 g de HOBT monohidrato, 2,07 g de DIEA y 80 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

A continuación se cargaban en un frasco aparte 5,20 g de HBTU y 40 ml de NMP. El contenido se disolvía, enfriaba, mezclaba con la resina, acoplaba, analizaba y lavaba tal como se ha indicado en la primera etapa. Después de la etapa de acoplamiento, la resina se trataba con la solución de piperidina, se lavaba y se analizaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #11). A continuación se cargaban en el frasco 5,86 g de Fmoc-Glu(OtBu)OH, 2,15 g de HOBT monohidrato, 1,99 g de DIEA y 80 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

A continuación se cargaban en un frasco aparte 5,21 g de HBTU y 40 ml de NMP. El contenido se disolvía, enfriaba, mezclaba con la resina, acoplaba, analizaba y lavaba tal como se ha indicado en la primera etapa. Después de la etapa de acoplamiento, la resina se trataba con la solución de piperidina, se lavaba y se analizaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #10). A continuación se cargaban en el frasco 5,85 g de Fmoc-Glu(OtBu)OH, 2,16 g de HOBT monohidrato, 2,04 g de DIEA y 80 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

A continuación se cargaban en un frasco aparte 5,17 g de HBTU y 40 ml de NMP. El contenido se disolvía, enfriaba, mezclaba con la resina, acoplaba, analizaba y lavaba tal como se ha indicado en la primera etapa. Después de la etapa de acoplamiento, la resina se trataba con la solución de piperidina, se lavaba y se analizaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #9). A continuación se cargaban en el frasco 4,85 g de Fmoc-Ile-OH, 2,16 g de HOBT monohidrato, 2,04 g de DIEA y 80 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

A continuación se cargaban en un frasco aparte 5,22 g de HBTU y 40 ml de NMP. El contenido se disolvía, enfriaba, mezclaba con la resina, acoplaba, analizaba y lavaba tal como se ha indicado en la primera etapa. Después de la etapa de acoplamiento, la resina se trataba con la solución de piperidina, se lavaba y se analizaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #8). A continuación se cargaban en el frasco 4,87 g de Fmoc-Leu-OH, 2,14 g de HOBT monohidrato, 2,04 g de DIEA y 80 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #7). A continuación se cargaban en el frasco 5,28 g de Fmoc-Ser(OtBu)-OH, 2,14 g de HOBT monohidrato, 1,98 g de DIEA y 80 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #6). A continuación se cargaban en el frasco 10,05 g de Fmoc-His(Trt)-OH, 2,54 g de HOBT monohidrato, 2,33 g de DIEA y 80 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

A continuación se cargaban en un frasco aparte 6,12 g de HBTU y 40 ml de NMP. El contenido se disolvía, enfriaba, mezclaba con la resina, acoplaba, analizaba y lavaba tal como se ha indicado en la primera etapa. Después de la etapa de acoplamiento, la resina se trataba con la solución de piperidina, se lavaba y se analizaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #5). A continuación se cargaban en el frasco 5,72 g de Fmoc-Ile-OH, 2,53 g de HOBT monohidrato, 2,33 g de DIEA y 80 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

A continuación se cargaban en un frasco aparte 6,11 g de HBTU y 40 ml de NMP. El contenido se disolvía, enfriaba, mezclaba con la resina, acoplaba, analizaba y lavaba tal como se ha indicado en la primera etapa. Después de la etapa de acoplamiento, la resina se trataba con la solución de piperidina, se lavaba y se analizaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #4). A continuación se cargaban en el frasco 5,72 g de Fmoc-Leu-OH, 2,52 g de HOBT monohidrato, 2,29 g de DIEA y 80 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

A continuación se cargaban en un frasco aparte 6,15 g de HBTU y 40 ml de NMP. El contenido se disolvía, enfriaba, mezclaba con la resina, acoplaba, analizaba y lavaba tal como se ha indicado en la primera etapa. Después de la etapa de acoplamiento, la resina se trataba con la solución de piperidina, se lavaba y se analizaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #3). A continuación se cargaban en el frasco 6,21 g de Fmoc-Ser(OtBu)-OH, 2,54 g de HOBT monohidrato, 2,29 g de DIEA y 80 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #2). A continuación se cargaban en el frasco 6,40 g de Fmoc-Ser(OtBu)-OH, 2,52 g de HOBT monohidrato, 2,29 g de DIEA y 80 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

A continuación se cargaban en un frasco aparte 6,13 g de HBTU y 40 ml de NMP. El contenido se disolvía, enfriaba, mezclaba con la resina, acoplaba, analizaba y lavaba tal como se ha indicado en la primera etapa. Después de la etapa de acoplamiento, la resina se trataba con la solución de piperidina, se lavaba y se analizaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #1). A continuación se cargaban en el frasco 7,51 g de Fmoc-Tyr(OtBu)-OH, 2,55 g de HOBT monohidrato, 2,29 g de DIEA y 80 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

Seguidamente se introducían en un frasco 4,10 g de anhídrido acético, 5,20 g de DIEA y 80 ml de NMP. La solución se mezclaba y enfriaba a 10ºC. La solución de anhídrido acético enfriada se añadía al reactor de SPPS y el frasco se lavaba con 40 ml de NMP y se añadía al reactor. La mezcla luego se agitaba a 30\pm3ºC durante 1 hora. Se recogían muestras de microesferas de resina para completar la reacción mediante el test de Kaiser. Una vez completa, el reactor se drenaba y lavaba cuatro veces con 100 ml de NMP. El lecho de resina se lavaba luego cuatro veces con 200 ml de DMC y cuatro veces con 100 ml de isopropanol. La resina se secaba luego al vacío a 40\pm2ºC.

El producto de péptido después de la síntesis en fase sólida era de 51,74 g.

Ejemplo 3 Escisión y purificación de Ac-AA(1-17)OH(SEQ ID NO:2) de la resina en fase sólida

Se ha llevado a cabo la escisión del péptido Ac-AA(1-17)OH activo de la resina CTC, tal como se ha preparado en el ejemplo 2.

Para escindir el péptido de la resina se han combinado 29,90 g de resina acoplada al péptido con 120 ml de DCM en el reactor. La resina y el DCM se agitaban a temperatura ambiente durante unos 5 minutos. Luego el rector se drenaba y el lavado DCM se repetía una vez más. (Para todos los lavados la cantidad de líquido utilizada es la cantidad de líquido por lavado). Luego el reactor se enfriaba a -10\pm5ºC.

Seguidamente, se preparaba una solución de 4,39 g de ácido trifluoracético y 118 ml de DCM a 0\pm5ºC.

La solución de TFA enfriada se cargaba luego al reactor y toda la mezcla se agitaba durante 20 minutos a 0\pm5ºC. Seguidamente se añadían 4,08 g de piridina al reactor y se agitaba durante otros 5 minutos a 0\pm5ºC. El reactor se drenaba luego y el lecho de resina se lavaba siete veces con 100 ml de DCM a temperatura ambiente. El lecho de resina se lavaba luego con 100 ml de isopropanol, 100 ml de DCM y 100 ml de isopropanol. La solución de DCM se concentraba hasta aproximadamente 100 ml de volumen y se lavaba con 100 ml de agua. La solución de DCM se concentraba luego a un volumen de 23 ml y se añadían 270 ml de isopropanol. El DCM se destilaba hasta que el nivel de DCM era inferior al 1%. La solución se enfriaba luego a 10\pm5ºC. El producto se filtraba y lavaba con isopropanol a 0ºC (23 ml) y se secaba al vacío a 40\pm2ºC, lo que daba lugar a 16,94 g (98%) de producto.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Preparación de resina 2-CTC cargada con FmocTrp(Boc)

Un reactor de 5 L se purgaba con nitrógeno y luego se cargaba con 200 g de resina 2-CTC y 2 L de DCM. La mezcla de resina-DCM se agitaba a 25\pm2ºC durante 30 minutos. Mientras tanto, 51,8 g de Fmoc-Trp(OtBu)OH, 1,4 L de DMF, 200 ml de DCM y 26,66 g de DIEA se introducían en un frasco de 2 L. El contenido del frasco se agitaba a temperatura ambiente para disolver el sólido.

Una vez drenado el DCM del reactor, la mezcla que contiene el Fmoc-Trp(OtBu)OH se cargaba en el reactor con la resina y se agitaba durante 2 horas bajo nitrógeno a 25 \pm 2ºC. Después de 2 horas, el reactor se drenaba.

Los puntos activos en la resina se tapaban con una mezcla de DIEA: MeOH(200:1800 ml). Luego se agitaba la mezcla a 25 \pm 2ºC durante una hora. El lecho se drenaba, se lavaba una vez con 2 L de DMF, una vez con 1 L de DMF y cuatro veces con 2 L de DMC. El último lavado con 2L de DCM mostraba un ensayo UV negativo.

Luego la resina se lavaba tres veces con 2 L de N-metil-pirrolidona (NMP) y luego se trataba con 2,75 L de piperidina del 20% en NMP, agitando a 28 \pm 2ºC durante 30 minutos. El reactor se drenaba luego y el tratamiento con piperidina se repetía. El lecho se drenaba y lavaba cinco veces con 3 L de NMP, y luego cinco veces con 3 L de DMF. La resina se deshinchaba mediante el lavado con 3x1,5 LIPA. La resina se secaba al vacío hasta un peso constante a 40 \pm 2ºC para dar 220,06 g de resina cargada.

El análisis cualitativo de HPLC se realizaba mediante la escisión del aminoácido de la resina y su análisis frente a un estándar. El análisis en HPLC del material mostraba una carga de la resina de 0,37 mmol/g.

Columna:: Betabasic-18, 150x4,6 mm, tamaño de partícula 3 \mum,

\quad: Tamaño de poro 150 \ring{A}

Velocidad de flujo:: 1,25 ml/min

Detección:: UV a 260 nM

Fase móvil:: A: 10 nM TEAP en agua

\quad: B: acetonitrilo

Tiempo de retención:: aproximadamente 13 minutos

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Síntesis en fase sólida, escisión y purificación del fragmento intermedio del T-20 Fmoc-AA(18-35)OH(SEQ ID NO:3)

Se llevaba a cabo la síntesis en fase sólida para generar la resina Fmoc-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-O-2-CTC (fragmento Fmoc-AA(18-35)O-2-CTC-resina).

La resina H-Trp(Boc)-O-2-CTC (15,0 g) tal como se ha preparado en el ejemplo 4) y 180 ml de DCM se combinaban en una cámara de reacción de fase sólida. La mezcla se agitaba durante 30 minutos a 30\pm3ºC. La cámara se drenaba y el lecho de resina se lavaba tres veces con 90 ml de NMP. (Para todos los lavados la cantidad de líquido utilizada es la cantidad de líquido por lavado).

El orden del acoplamiento iba del Residuo #34 al Residuo #18 (respecto a la numeración de aminoácidos de la secuencia madura del T-20):

W\rightarrowN\rightarrowW\rightarrowL\rightarrowS\rightarrowA\rightarrowW\rightarrowK\rightarrowD\rightarrowL\rightarrowE\rightarrowL\rightarrowL\rightarrowE\rightarrowQ\rightarrowE\rightarrowN\rightarrowK

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #34). A continuación se cargaban en el frasco 8,60 g de Fmoc-Asn(Trt)OH, 2,22 g de HOBT monohidrato, 2,22 g de DIEA y 67,5 ml de NMP y el contenido se agitaba a temperatura ambiente para disolver los sólidos que luego se enfriaban a 10ºC.

A continuación se cargaban en un frasco aparte 5,51 g de HBTU y 40 ml de NMP. La mezcla se agitaba a temperatura ambiente para disolver los sólidos y luego se enfriaba a 10ºC. La solución de HBTU enfriada se añadía luego a la solución de Fmoc-Asn(Trt)OH y esta solución se cargaba al reactor SPPS. El frasco se lavaba entonces con 36 ml de DCM y el lavado se cargaba al reactor SPSS. La mezcla se agitaba a 30\pm3ºC durante 3 horas. Se recogían muestras de microesferas de resina para completar la reacción mediante un ensayo de Kaiser. Una vez finalizada la reacción, el reactor se drenaba y el lecho de resina se lavaba con 90 ml de NMP.

A continuación se cargaban en el reactor 90 ml de piperidina del 20% en NMP que luego se agitaban a 30\pm3ºC durante 30 minutos. El reactor se drenaba y se añadían 90 ml de piperidina del 20%. La mezcla se agitaba a 30\pm3ºC durante 30 minutos y luego se drenaba el reactor. El lecho de resina se lavaba entonces tres veces con 90 ml de NMP. Se recogían muestras del último lavado para averiguar los niveles de piperidina mediante la prueba cualitativa de Ninhidrina.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #33). A continuación se cargaban en el frasco 7,58 g de Fmoc-Trp(Boc)OH, 2,25 g de HOBT monohidrato, 2,23 g de DIEA y 67,5 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

En un frasco aparte se combinaban 5,48 g de HBTU y 40 ml de NMP. El contenido se disolvía, enfriaba, mezclaba con la resina, acoplaba, analizaba y lavaba tal como se indica en la primera etapa. Después de la etapa de acoplamiento, la resina se trataba con la solución de piperidina, se lavaba, y se analizaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #32). A continuación se cargaban en el frasco 5,10 g de Fmoc-Leu-OH, 2,25 g de HOBT monohidrato, 2,23 g de DIEA y 67,5 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #31). A continuación se cargaban en el frasco 5,59 g de Fmoc-Ser(tBu)-OH, 2,22 g de HOBT monohidrato, 2,19 g de DIEA y 67,5 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

En un frasco aparte se combinaban 5,50 g de HBTU y 40 ml de NMP. El contenido se disolvía, enfriaba, mezclaba con la resina, acoplaba, analizaba y lavaba tal como se indica en la primera etapa. Después de la etapa de acoplamiento, la resina se trataba con la solución de piperidina, se lavaba, y se analizaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #30). A continuación se cargaban en el frasco 4,77 g de Fmoc-Ala-OH, 2,26 g de HOBT monohidrato, 2,21 g de DIEA y 67,5 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

En un frasco aparte se combinaban 5,49 g de HBTU y 40 ml de NMP. El contenido se disolvía, enfriaba, mezclaba con la resina, acoplaba, analizaba y lavaba tal como se indica en la primera etapa. Después de la etapa de acoplamiento, la resina se trataba con la solución de piperidina, se lavaba, y se analizaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #29). A continuación se cargaban en el frasco 7,64 g de Fmoc-Trp(Boc)OH, 2,25 g de HOBT monohidrato, 2,17 g de DIEA y 67,5 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

En un frasco aparte se combinaban 5,47 g de HBTU y 40 ml de NMP. El contenido se disolvía, enfriaba, mezclaba con la resina, acoplaba, analizaba y lavaba tal como se indica en la primera etapa. Después de la etapa de acoplamiento, la resina se trataba con la solución de piperidina, se lavaba, y se analizaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #28). A continuación se cargaban en el frasco 6,80 g de Fmoc-Lys(Boc)OH, 2,24 g de HOBT monohidrato, 2,21 g de DIEA y 67,5 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

En un frasco aparte se combinaban 5,46 g de HBTU y 40 ml de NMP. El contenido se disolvía, enfriaba, mezclaba con la resina, acoplaba, analizaba y lavaba tal como se indica en la primera etapa. Después de la etapa de acoplamiento, la resina se trataba con la solución de piperidina, se lavaba, y se analizaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #27). A continuación se cargaban en el frasco 6,02 g de Fmoc-Asp(OtBu)OH, 2,24 g de HOBT monohidrato, 2,17 g de DIEA y 67,5 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #26). A continuación se cargaban en el frasco 5,10 g de Fmoc-Leu-OH, 2,27 g de HOBT monohidrato, 2,19 g de DIEA y 67,5 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

En un frasco aparte se combinaban 5,54 g de HBTU y 40 ml de NMP. El contenido se disolvía, enfriaba, mezclaba con la resina, acoplaba, analizaba y lavaba tal como se indica en la primera etapa. Después de la etapa de acoplamiento, la resina se trataba con la solución de piperidina, se lavaba, y se analizaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #25). A continuación se cargaban en el frasco 6,20 g de Fmoc-Glu(OtBu)OH, 2,27 g de HOBT monohidrato, 2,19 g de DIEA y 67,5 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #24). A continuación se cargaban en el frasco 5,12 g de Fmoc-Leu-OH, 2,25 g de HOBT monohidrato, 2,18 g de DIEA y 67,5 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #23). A continuación se cargaban en el frasco 5,12 g de Fmoc-Leu-OH, 2,25 g de HOBT monohidrato, 2,17 g de DIEA y 67,5 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #22). A continuación se cargaban en el frasco 6,23 g de Fmoc-Glu(OtBu)OH, 2,25 g de HOBT monohidrato, 2,19 g de DIEA y 67,5 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

En un frasco aparte se combinaban 5,51 g de HBTU y 40 ml de NMP. El contenido se disolvía, enfriaba, mezclaba con la resina, acoplaba, analizaba y lavaba tal como se indica en la primera etapa. Después de la etapa de acoplamiento, la resina se trataba con la solución de piperidina, se lavaba, y se analizaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #21). A continuación se cargaban en el frasco 8,84 g de Fmoc-Gln(trt)-OH, 2,25 g de HOBT monohidrato, 2,25 g de DIEA y 67,5 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

En un frasco aparte se combinaban 5,53 g de HBTU y 40 ml de NMP. El contenido se disolvía, enfriaba, mezclaba con la resina, acoplaba, analizaba y lavaba tal como se indica en la primera etapa. Durante el análisis, la prueba de Kaiser indicaba que la reacción era incompleta. El re-acoplamiento se efectuaba drenando el reactor y usando un 50% de los reactivos durante 1,5 horas. Una vez finalizada la etapa de acoplamiento, la resina se trataba con la solución de piperidina, se lavaba, y se trataba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #20). A continuación se cargaban en el frasco 8,21 g de Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 3,03 g de HOBT monohidrato, 2,87 g de DIEA y 67,5 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

En un frasco aparte se combinaban 7,30 g de HBTU y 40 ml de NMP. El contenido se disolvía, enfriaba, mezclaba con la resina, acoplaba, analizaba y lavaba tal como se indica en la primera etapa. Después de la etapa de acoplamiento, la resina se trataba con la solución de piperidina, se lavaba, y se analizaba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #19). A continuación se cargaban en el frasco 11,50 g de Fmoc-Asn(trt)-OH, 3,07 g de HOBT monohidrato, 2,93 g de DIEA y 67,5 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

En un frasco aparte se combinaban 7,30 g de HBTU y 40 ml de NMP. El contenido se disolvía, enfriaba, mezclaba con la resina, acoplaba, analizaba y lavaba tal como se indica en la primera etapa. Durante el análisis, la prueba de Kaiser indicaba que la reacción era incompleta. El re-acoplamiento se efectuaba drenando el reactor y usando un 50% de los reactivos durante 1,5 horas. Una vez finalizada la etapa de acoplamiento, la resina se trataba con la solución de piperidina, se lavaba, y se trataba tal como se indica en la primera etapa.

\vskip1.000000\baselineskip

(Residuo #18). A continuación se cargaban en el frasco 9,00 g de Fmoc-Lys(Boc)-OH, 3,07 g de HOBT monohidrato, 2,93 g de DIEA y 67,5 ml de NMP. El contenido se disolvía y enfriaba tal como se indica en la primera etapa.

En un frasco aparte se combinaban 7,30 g de HBTU y 40 ml de NMP, se agitaba a temperatura ambiente para disolver los sólidos y se enfriaba a 10ºC. La solución enfriada de HBTU se añadía a la solución de Fmoc-Lys(Boc)-OH y la mezcla se cargaba al reactor SPPS. El frasco se lavaba con 36 ml de DMC y el lavado se cargaba al reactor SPPS. Luego la mezcla se agitaba a 30\pm3ºC durante 3 horas. Las microesferas de resina se analizaban para comprobar si la reacción era completa usando para ello el ensayo de Kaiser. Una vez finalizada la reacción, el reactor se drenaba y el lecho de resina se lavaba tres veces con 90 ml de NMP, respectivamente. El lecho de resina se lavaba luego cinco veces con 90 ml de DCM, y cuatro veces con 90 ml de isopropanol. La resina se secaba luego al vacío y a 40 \pm 2ºC, dando 47,13 g de producto.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Escisión y purificación de Fmoc-AA(18-35)OH(SEQ ID NO:3) de la resina en fase sólida

Se ha llevado a cabo la escisión del péptido Fmoc-AA(18-35)OH activo de la resina CTC, tal como se ha preparado en el ejemplo 5. Para escindir el péptido de la resina se han combinado 20,15 g de resina acoplada al péptido con 90 ml de DCM en el reactor. La resina y el DCM se agitaban a temperatura ambiente durante unos 5 minutos. Luego el rector se drenaba y el lavado DCM se repetía dos veces más. (Para todos los lavados la cantidad de líquido utilizada es la cantidad de líquido por lavado). Luego el reactor se enfriaba a -10\pm5ºC.

Seguidamente, se preparaba una solución de 2,28 g de ácido trifluoracético y 75,4 ml de DCM a 0\pm5ºC.

La solución de TFA enfriada se cargaba luego al reactor y toda la mezcla se agitaba durante 30 minutos a 0\pm5ºC. Seguidamente se añadían 2,13 g de piridina al reactor y se agitaba durante otros 5 minutos a 0\pm5ºC. El reactor se drenaba luego y el lecho de resina se lavaba seis veces con 90 ml de DCM a temperatura ambiente.

El lecho de resina se lavaba luego con 98 ml de isopropanol, 90 ml de DCM y dos veces con 98 ml de isopropanol. La solución de DCM se concentraba hasta aproximadamente 100 ml de volumen y se lavaba con 100 ml de agua. La solución de DCM se concentraba luego a un volumen de 25 ml, se enfriaba a 10ºC y luego se añadían 90 ml de agua. La solución se enfriaba luego a 0ºC y se dejaba que reposara durante una hora. El producto se filtraba y lavaba con 25 ml de agua a 5ºC. El producto se secaba al vacío a 40\pm2ºC, lo que daba lugar a 14,63 g (88,9%).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7 Síntesis en solución de H-AA(18-36)NH_{2} (SEQ ID NO:4)

El fragmento intermedio del T-20 H-AA(18-36)NH_{2} se preparaba mediante el acoplamiento en solución de PheNH_{2} a Fmoc-AA(18-35)OH.

El Fmoc-AA(18-35)OH, tal como se ha descrito en el ejemplo 6, (12,0 g, 2,83 mmol, 1.0 eq), PheNH_{2}-HCl(0,74 g, 3,68 mmol, 1,3 eq) y 6-cloro HOBT (0,96 g, 5,66 mmol, 2,0 eq) se disolvían en DMF (100 ml, 8,3 vol.). La solución se enfriaba a -10ºC y se añadía DEIA (1,4 ml, 7,92 mmol, 2,8 eq) en DMF (5 ml, 3,6 vol.). Se añadía TBTU (1.2 g, 3,68 mmol, 1.3 eq.) en una porción y a ello seguía un lavado con DMF (15 ml). La mezcla de reacción se agitaba a -10ºC durante la noche y se calentaba a temperatura ambiente. La agitación continuaba durante otras 4 horas. El final de la reacción se controlaba mediante el análisis en HPLC que mostraba que quedaba un 0,4% del Fmoc-AA(18-35)OH de partida. Se añadía piperidina (1,23 ml, 14,43 mmol, 5,1 eq.) y la solución se agitaba a 30ºC durante 3 horas. La eliminación completa de Fmoc se controlaba mediante el análisis en HPLC que mostraba una cantidad <1% de Fmoc-AA(18-35)NH_{2}. Se añadía agua (100 ml, 8,3 vol.) para precipitar el producto. El sólido se recogía mediante filtración por succión, y se lavaba con agua. El secado durante la noche a temperatura ambiente daba lugar a 11,85 g (101% AN HPLC).

\newpage

A continuación se llevaba a cabo un procedimiento en H-AA(18-36)NH_{2}. El H-AA(18-36)NH_{2} (11,85 g) se suspendía en EtOH:Agua (200 ml, 17 vol.). La mezcla se agitaba a temperatura ambiente durante 2 horas. La filtración por succión y el secado hasta un peso constante daban lugar a 11,6 g (rendimiento del 98,9% para ambas etapas) con una pureza del 80,0% (AN HPLC). El equipo y los parámetros siguientes se utilizaban para analizar el producto.

Columna:: Zorbax-ACE, 3 \mum, C18,3.0 x 100 mm

Detector:: UV @220 nm

Velocidad de flujo:: 0,6 ml/min

Fase móvil:: A: 0,10% TFA/agua/40% IPA

\quad: B: 0,07% TFA/acetonitrilo/40% IPA

Gradiente:: 0 min 70%B, 8 min 80%B, 15-16 min 90%B

\quad: 16.1-20 min 70%B

Tiempo de retención:: aproximadamente 8 minutos

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8 Síntesis en solución de Ac-AA(1-36)NH_{2} (SEQ ID NO:1)

El producto final T-20 se preparaba mediante el acoplamiento en solución de Ac-AA(1-17)OH con H-AA(18-36)NH_{2} para dar el fragmento Ac-AA(1-36)NH_{2} (SEQ ID NO:1).

H-AA(18-36)NH_{2} (2,0 g, 0,5 mmol, 1eq.), Ac=AA(1-17)OH (1,87 g, 0,5 mmol, 1 eq), y 6-cloro HOBT (0,13 g, 0,76 mmol, 1,5 eq) se disolvían en DMF (40 ml, 20 vol., 30 minutos). La solución se enfriaba a 0\pm5ºC y se añadían DEIA (0,12 g, 0,95 mmol, 1,85 eq) seguidos de HBTU (0,23 g, 0,6 mmol, 1,2 eq). Después de agitar toda la noche a 0ºC, se añadía agua (50 ml) gota a gota. La mezcla resultante se agitaba a temperatura ambiente durante 3-4 horas y el producto se aislaba por filtración por succión. El secado durante la noche en un horno al vacío a 45º daba lugar a 3,75 g (98,2%) de Ac-AA(1-36)NH_{2} con una pureza del 63,5% (AN HPLC). EL equipo HPLC y los parámetros se utilizaban para analizar el producto.

Columna:: Zorbax-ACE, 3 \mum, C18,3.0 x 100 mm

Detector:: UV @220 nm

Velocidad de flujo:: 0,6 ml/min

Fase móvil:: A: 0,10% TFA/agua/40% IPA

\quad: B: 0,07% TFA/acetonitrilo/40% IPA

Gradiente:: 0 min 70%B, 8 min 80%B, 15-16 min 90%B,

\quad: 16.1-20 min 70%B

Tiempo de retención:: aproximadamente 8 minutos

<110> F.Hoffmann-La Roche AG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Síntesis mejorado usando Fragmentos Intermedios peptídicos III

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> Caso 22974

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/640822

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2004-12-30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> Patente versión 3.3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400>1

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm2

\hskip1cm3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400>4

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm6

Claims

1. Un método para preparar un péptido que tiene la secuencia Ac-YTSLIHSLIEEQNQQEKNEQELLELDK
WASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:1) que comprende las etapas de:

(a): aporte de una resina soporte de síntesis en fase sólida de fórmula Z-E-(SUP), en la que la (SUP) es la resina soporte, E es un residuo de ácido glutámico, y Z es el grupo protector del extremo NH_{2}, y donde Z-E está presente en (SUP) en un factor de carga de 0,5 o menos;

(b): acoplar aminoácidos a Z-E-(SUP) para lograr el Z-YTSLIHSLIEESQNQQE-(SUP);

(c): tratar Z-YTSLIHSLIEESQNQQE-(SUP)para conseguir el producto de escisión Ac-YTSLIHSLIEESQNQ QE (SEQ ID NO:2); y

(d): utilizar Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE-OH(SEQ ID NO:2) para la síntesis de Ac-YTSLIHSLIEEQNQQEK NEQELLELDKW ASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:1).

\vskip1.000000\baselineskip

2. El método de la reivindicación 1, donde en la etapa(a) (SUP) comprende grupos tritilo.

3. El método de la reivindicación 2, donde en la etapa(a) (SUP) comprende grupos cloro-tritilo.

4. El método de las reivindicaciones 1 a 3, donde Z es un grupo Fmoc.

5. El método de la reivindicación 1, donde en la etapa (a) Z-E está presente en (SUP) en un factor de carga inferior a 0,5.

6. El método de la reivindicación 5, donde en la etapa (a) Z-E está presente en (SUP) en un factor de carga entre 0,2 y 0,5.

7. El método de la reivindicación 1, donde en la etapa (b) los aminoácidos se acoplan a Z-E(SUP) en una cantidad entre 1 y 1,5 equivalentes.

8. El método de la reivindicación 1, donde en la etapa (d), el Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE-OH (SEQ ID NO:2) reacciona con un péptido que tiene la secuencia H-KNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:4) para conseguir que el péptido tenga la secuencia Ac-YTSLIHSLIEEQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:1).

9. El método de la reivindicación 8, donde H-KNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:4) se forma al reaccionar el péptido Z-KNEQELLELDKWASLWNW-OH(SEQ ID NO:3) con fenilalaninamida.

\vskip1.000000\baselineskip

10. Un método para preparar un péptido que tiene la secuencia Ac-YTSLIHSLIEEQNQQEKNEQELLELDK
WASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:1) y comprende las etapas de:

(a): aporte de una resina soporte de síntesis en fase sólida de fórmula Z-W-(SUP), en la que la (SUP) es la resina soporte, W es un residuo de triptófano, y Z es el grupo protector de extremo NH_{2}, y donde Z-W está presente en (SUP) en un factor de carga de 0,5 o menos;

(b): acoplamiento de aminoácidos a Z-W-(SUP) para lograr Z-KNEQELLELDKWASLWNW-(SUP);

(c): tratar Z-KNEQELLELDKWASLWNW-(SUP) para conseguir el producto de escisión Z-KNEQELLELDK WASLWNW-OH (SEQ ID NO:3); y

(d): utilizar Z-KNEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO:3) para la síntesis de Ac-YTSLIHSLIEEQNQ QEKNEQELLELDKW ASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:1).

\vskip1.000000\baselineskip

11. El método de la reivindicación 10, donde en la etapa (d), Z-KNEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO:3) reacciona con fenilalaninamida para formar H-KNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:4).

12. El método de las reivindicaciones 10 ó 11 donde H-KNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:4) reacciona con Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE-OH (SEQ ID NO:2) para dar Ac-YTSLIHSLIEEQNQQEKNEQELLELDK
WASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:1).

\newpage

13. Un método para preparar un péptido que tenga la secuencia Ac-YTSLIHSLIEEQNQQEKNEQELLELDK
WASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:1) que comprenda las etapas de:

(a): conseguir fragmentos intermedios peptídicos de las secuencias Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE-OH (SEQ ID NO:2) y Z-KNEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO:3) , donde los fragmentos intermedios peptídicos han sido sintetizados sobre soportes sólidos que utilizan un factor de carga de 0,5 o menos;

(b): reacción en solución del péptido Z-KNEQELLELDKWASLWNW-OH (SEQ ID NO:3) con un residuo de fenilalaninamida para conseguir la secuencia H-KNEQELLELDKWASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:4); y

(c): reacción en solución de Ac-YTSLIHSLIEESQNQQE-OH (SEQ ID NO:2) con la H-KNEQELLELDK WASLWNWF-NH_{2} (SEQ ID NO:4) para lograr Ac-YTSLIHSLIEEQNQQEKNEQELLELDKW ASLWN WF-NH_{2} (SEQ ID NO:1).

14. El método de la reivindicación 13, donde en la etapa (a) los fragmentos intermedios peptídicos han sido sintetizados sobre soportes sólidos utilizando un factor de carga inferior a 0,5.

15. El método de la reivindicación 14, donde en la etapa (a) los fragmentos intermedios peptídicos han sido sintetizados sobre soportes sólidos utilizando un factor de carga entre 0,2 y 0,5.

16. El método de la reivindicación 13, donde en la etapa (b) los fragmentos intermedios peptídicos han sido sintetizados sobre soportes sólidos utilizando aminoácidos que han sido acoplados al soporte en una cantidad entre 1 y 1,5 equivalentes.