ES2341588T3 - Sintesis de peptidos insulinotropicos. - Google Patents
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Abstract
Un método para obtener un péptido insulinotrópico, que comprende los siguientes pasos de a) a f): a) proporcionar un primer fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10 (Id. de Sec. Nº 6), en la que X8 y X10 son cada uno residuos de un aminoácido aquiral, incluyendo opcionalmente cada uno de H y E la protección de la cadena lateral; b) proporcionar un segundo fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos TFTSDVX17-18YLEG (Id. de Sec. Nº 8) en la que el residuo denotado mediante el símbolo X17-18 es un residuo dipeptídico de pseudoprolina, incluyendo opcionalmente dichos residuos de aminoácidos de la secuencia la protección de la cadena lateral; c) acoplar el primer fragmento al segundo fragmento para proporcionar un tercer fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10TFTSDVX17-18YLEG (Id. de Sec. Nº 11), incluyendo opcionalmente dichos residuos de aminoácidos de la secuencia la protección de la cadena lateral; d) proporcionar un cuarto fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX35 (Id. de Sec. Nº 9), en el que X35 es un residuo de un aminoácido aquiral, incluyendo opcionalmente dichos residuos de aminoácidos de la secuencia la protección de la cadena lateral; e) acoplar el cuarto fragmento peptídico a arginina para proporcionar un quinto fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX35R (Id. de Sec. Nº 12), incluyendo opcionalmente dichos residuos de la secuencia la protección de la cadena lateral; y f) acoplar el quinto fragmento al tercer fragmento para proporcionar un péptido insulinotrópico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10TFTSDVX17-18YLEGQAAKEFIAWLVK X35R (Id. de Sec. Nº 13), incluyendo opcionalmente dichos residuos de la secuencia la protección de la cadena lateral.
Description
Síntesis de péptidos insulinotrópicos.
La invención se refiere a métodos para la
preparación de péptidos insulinotrópicos, particularmente del
péptido similar al glucagón 1 (GLP-1) y los
homólogos del mismo, utilizando procesos en fase sólida y en
solución. La presente invención además se refiere a los fragmentos
de péptido intermedios que pueden utilizarse en estos métodos.
Se han descrito en la bibliografía muchos
métodos para la síntesis de péptidos (por ejemplo, véase la Patente
Estadounidense Nº 6.015.881; Mergler et al. (1988)
Tetrahedron Letters 29:4005-4008; Mergler et
al. (1988) Tetrahedron Letters 29:4009-4012;
Kamber et al. (eds), Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM,
Leiden (1992) 525-526; Riniker et al. (1993)
Tetrahedron Letters 49:9307-9320;
Lloyd-Williams et al. (1993) Tetrahedron
Letters 49:11065-11133; y Andersson et al.
(2000) Biopolymers 55:227-250. Estos diferentes
métodos de síntesis se distinguen por el estado físico de la fase
en la que la síntesis tiene lugar, es decir fase líquida o fase
sólida.
En la síntesis de péptidos en fase sólida
(SPFS), se une un aminoácido o grupo peptídico a un soporte sólido
de resina. Posteriormente, se unen sucesivos aminoácidos o grupos
peptídicos al péptido unido al soporte hasta que el material
peptídico de interés se ha formado. Entonces normalmente el péptido
unido al soporte se escinde del soporte y se somete a un procesado
y/o purificación posterior. En algunos casos, la síntesis en fase
sólida proporciona un producto peptídico maduro; en otros casos el
péptido escindido del soporte (es decir, un "fragmento de péptido
intermedio") se utiliza en la preparación de un producto
peptídico maduro más grande.
Los fragmentos de péptido intermedios generados
en los procesos de fase sólida pueden acoplarse en un proceso
sintético de fase sólida o de fase líquida (referido de ahora en
adelante como "síntesis en fase en solución"). La síntesis en
fase en solución puede ser particularmente útil en los casos en los
que la síntesis de un péptido maduro útil en fase sólida es
imposible o no es práctica. Por ejemplo, en la síntesis en fase
sólida, los péptidos largos, pueden adoptar eventualmente una
conformación irregular mientras aún están unidos al soporte sólido,
haciendo difícil la adición de aminoácidos o material peptídico a la
cadena creciente. A medida que la cadena de péptido se hace más
larga en el soporte de resina, la eficiencia de los pasos del
proceso, como el acoplamiento y la desprotección, pueden estar
comprometidos. Esto, a su vez, puede resultar en tiempos de
procesado más largos para compensar estos problemas, además del
incremento de las pérdidas de materiales de partida, como los
aminoácidos activables, co-reactivos y disolventes.
Estos problemas pueden aumentar a medida que la longitud del
péptido aumenta.
Por lo tanto, relativamente poco común encontrar
péptidos maduros mayores de 30 aminoácidos de longitud sintetizados
en un único fragmento utilizando solamente un procedimiento de fase
sólida. En lugar de esto, pueden sintetizarse fragmentos
individuales de forma separada en fase sólida, y después acoplarse
en fase sólida y/o en solución para conseguir el producto peptídico
deseado. Esta aproximación requiere una cuidadosa selección de los
fragmentos candidatos. Aunque algunos principios generales pueden
servir de guía en la selección de fragmentos, a menudo son
necesarias pruebas empíricas de los fragmentos candidatos.
Estrategias de fragmentos que funcionan en un contexto pueden no
funcionar en otros. Aún cuando se encuentran fragmentos candidatos
razonables, todavía pueden ser necesarias innovaciones del proceso
para que la estrategia de síntesis para que funcione bajo
condiciones razonables a nivel comercial. Por lo tanto, la síntesis
de péptido utilizando esquemas híbridos es a menudo un reto, y en
muchos casos es difícil predecir los problemas inherentes en un
esquema de síntesis hasta que se realiza la síntesis real.
En el acoplamiento en fase en solución, se
acoplan dos fragmentos de péptido intermedios, o un fragmento
intermedio de péptido y un aminoácido reactivo, en un solvente
apropiado, normalmente en presencia de reactivos adicionales que
promueven la eficiencia y la calidad de la reacción de acoplamiento.
Los fragmentos de péptido intermedios están dispuestos de forma
reactiva de forma que el extremo N-terminal de un
fragmento se acopla al extremo C-terminal del otro
fragmento o viceversa. Además, los grupos protectores de cadenas
laterales, que están presentes durante la síntesis en fase sólida,
comúnmente se retienen en los fragmentos durante la fase de
acoplamiento en solución para asegurar la reactividad específica de
los extremos terminales de los fragmentos. Estos grupos protectores
de cadenas laterales normalmente no se eliminan hasta que se ha
formado un péptido maduro.
Pequeñas mejoras en uno o más pasos en el
esquema sintético general pueden proporcionar una mejora
significativa en la preparación del péptido maduro. Tales mejoras
pueden resultar en un gran ahorro general de tiempo y reactivos, y
también puede mejorar significativamente la pureza y el rendimiento
del producto final.
Mientras la discusión de la importancia de las
mejoras en la síntesis híbrida es aplicable a cualquier tipo de
péptido producido utilizando estos procedimientos, esto es de una
particular importancia en el contexto de los péptidos que son
terapéuticamente útiles y que están elaborados a una escala para uso
médico comercial. La síntesis de fármacos biomoleculares mayores,
como los péptidos terapéuticos, puede ser muy cara. Debido al coste
de los reactivos, el tiempo de síntesis, muchos pasos de síntesis,
además de otros factores, pequeñas mejoras en el proceso sintético
de estos fármacos biomoleculares grandes pueden tener un impacto
significativo en sí es económicamente factible producir este
medicamento. Tales mejoras son necesarias debido a estos altos
costes de producción para medicamentos biomoleculares grandes como
se sostiene en el hecho de que, en muchos casos, existen pocas
alternativas terapéuticas adecuadas, si las hay, para estos tipos de
fármacos biomoleculares grandes.
\newpage
Esto se aprecia claramente en el caso del
péptido similar al glucagón-1
(GLP-1) y sus homólogos. Estos péptidos se han
implicado como posibles agentes terapéuticos en el tratamiento de
diabetes mellitus no insulino-dependiente de tipo 2
así como en los trastornos metabólicos relacionados, como la
obesidad. Gutniak, M.K. et al., Diabetes Care
1994:17:1039-44.
López et al. han determinado que el
GLP-1 nativo tiene una longitud de 37 residuos
aminoacídicos. López L. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA., 80:5485-5489 (1983). Esta determinación se
confirmó con el trabajo de Uttenthal, L. O. et al., J. Clin.
Endocrinal. Metabol., 61:472-479 (1985). El
GLP-1 nativo puede representarse mediante la
anotación GLP-1(1-37). Esta
anotación indica que el péptido posee todos los aminoácidos desde
el 1 (N-terminal) hasta el 37
(C-terminal). El GLP-1 nativo posee
la secuencia de aminoácidos de acuerdo con el Id. de Sec. Nº 1:
HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG
Se ha descrito que el GLP-1
nativo (1-37) es generalmente incapaz de mediar en
la biosíntesis de insulina, pero fragmentos biológicamente
importantes de este péptido poseen propiedades insulinotrópicas. Por
ejemplo, el péptido
GLP-1(7-37) nativo de 31
aminoácidos de longitud de acuerdo con el Id. de Sec. Nº 2:
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG
es insulinotrópico y posee los
aminoácidos desde la posición 7 (N terminal) a la 37 (C terminal)
del GLP-1 nativo. EL GLP-1
(7-37) posee una glicina terminal. Cuando esta
glicina está ausente, el péptido resultante es aún
insulinotrópicamente activo y se denomina
GLP-1(7-36) de acuerdo con el
Id. de Sec. Nº
3:
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR
El
GLP-1(7-36) a menudo se
encuentra con la arginina C-terminal en su forma
amidada, y esta forma puede representarse mediante la anotación
GLP-1(7-36)-NH_{2}.
El
GLP-1(1-37) generalmente se
convierte in vivo en un homólogo insulinotrópicamente activo
del mismo. Por ejemplo, el
GLP-1(1-37) se convierte
naturalmente en el
GLP-1(7-37) in vivo.
Este péptido, a su vez, puede también sufrir un procesado adicional
mediante la eliminación proteolítica de la glicina
C-terminal para producir el
GLP-1(7-36), que a menudo
existe en la forma amidada
GLP-1(7-36)-NH_{2}.
De acuerdo con lo anterior, los tratamientos terapéuticos pueden
involucrar la administración del
GLP-1(1-37) o un homólogo del
mismo, esperando que se forme un derivado insulinotrópicamente
activo del mismo in vivo. Más comúnmente, no obstante, los
tratamientos terapéuticos en investigación involucran la
administración de los fragmentos insulinotrópicamente activos de
GLP-1 en sí mismos.
De acuerdo con la US 6.887.849, la actividad
insulinotrópica de
GLP-1(7-37),
GLP-1(7-36) y
GLP-1(7-36)-NH_{2}
parece ser específica para las células pancreáticas beta, en las
que estos péptidos parecen inducir la biosíntesis de insulina. Esto
hace útiles a estos péptidos, y a sus homólogos farmacéuticamente
aceptables, en el estudio de la patogénesis de la aparición de la
diabetes mellitus en adultos, una enfermedad caracterizada por la
hiperglicemia en la que la dinámica de secreción de insulina es
anormal. Además, estos péptidos similares al glucagón serán útiles
en la terapia y el tratamiento de esta enfermedad, y en la terapia y
tratamiento de la hiperglicemia. De acuerdo con la PE 1137667B1,
estos péptidos u sus homólogos farmacéuticamente aceptables también
pueden ser útiles para el tratamiento de otros tipos de diabetes,
obesidad, glucagonomas, trastornos de secreción de las vías
respiratorias, trastornos metabólicos, artritis, osteoporosis,
enfermedad del sistema nervioso central, restenosis, enfermedad
neurodegenerativa, fallo renal, fallo cardíaco congestivo, síndrome
nefrótico, cirrosis, edema pulmonar, hipertensión y/o trastornos en
los que se desea una reducción de la ingesta de comida.
El GLP-1
nativo(1-37) y sus homólogos
insulinotrópicamente activos nativos de acuerdo con los Id. de Sec.
Nº 1 a 3 son metabólicamente inestables y poseen una vida media en
plasma de sólo 1 a 2 minutos in vivo. El
GLP-1 administrado de forma externa también se
degrada de forma rápida. Esta inestabilidad metabólica ha limitado
el potencial terapéutico del GLP-1 nativo y de los
fragmentos nativos del mismo.
Se han desarrollado homólogos sintéticos de los
péptidos de GLP-1 con una estabilidad mejorada. Por
ejemplo, el péptido de acuerdo con el Id. de Sec. Nº 4 se describe
en la PE 1137667 B1:
HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR
Este péptido es similar al GLP-1
nativo(7-36), con la excepción que el residuo
aquiral del ácido alfa-aminoisobutírico (mostrado
de forma esquemática con la abreviatura Aib) aparece en las
posiciones 8 y 35 en lugar de los aminoácidos nativos
correspondientes en estas posiciones. El ácido
alfa-aminoisobutírico aquiral también es conocido
como metilalanina. Este péptido puede denominarse mediante la
fórmula
(Aib^{8,35})GLP-1(7-36)-NH_{2}.
La EP 1137667 expone que el péptido de acuerdo
con el Id. de Sec. Nº 4 y sus homólogos pueden obtenerse como un
único fragmento utilizando técnicas de fase sólida. La aproximación
de síntesis de fragmentos únicos sugerida en la EP 1137667 es
problemática. Uno de los problemas es que esta aproximación puede
llevar a altos niveles de epimerización en el acoplamiento final de
aminoácidos, por ejemplo, histidina en el caso de
(Aib^{8,35})GLP-1(7-36).
Además las impurezas pueden ser difíciles de eliminar durante la
purificación cromatográfica y el rendimiento puede tender a ser
demasiado bajo. En consecuencia, son necesarias estrategias
mejoradas para la síntesis de péptidos de acuerdo con el Id. de
Sec. Nº 4 para poder fabricar este péptido y sus homólogos con
rendimientos, purezas y cantidades comercialmente aceptables.
Además de estas preocupaciones, problemas
relacionados con la recuperación del producto y la pureza del
producto para la producción a gran escala de péptidos, así como la
manipulación de reactivos, almacenamiento y deshecho, pueden
influir enormemente en que un esquema de síntesis del péptido sea
factible. Por lo tanto, existe la necesidad continua de procesos de
síntesis de péptidos capaces de producir eficientemente los
materiales peptídicos de interés comercial en cantidades a gran
escala con rendimientos mejorados.
La presente invención se refiere a la
preparación de péptidos insulinotrópicos que están sintetizados
utilizando una aproximación de fase sólida y en solución
("híbrida"). Generalmente, la aproximación incluye la síntesis
de tres fragmentos de péptido intermedios diferentes utilizando la
química de fase sólida. La química de fase en solución se utiliza
entonces para añadir material de aminoácidos adicional a uno de los
fragmentos. Los fragmentos se acoplan entonces en fase sólida y en
solución. El uso de una pseudoprolina en uno de los fragmentos
facilita la síntesis en fase sólida de este fragmento y también
facilita la posterior fase de acoplamiento en solución de este
fragmento a otros fragmentos. La presente invención es muy útil para
obtener péptidos insulinotrópicos como el GLP-1,
GLP-1(7-36) y los homólogos
naturales y no naturales de estos, particularmente el
GLP-1(7-36) y sus homólogos
naturales y no naturales.
En un aspecto, la presente invención se refiere
a un método para realizar un péptido insulinotrópico, que comprende
los pasos de:
a) la preparación de un fragmento peptídico que
incluye la secuencia de aminoácidos HX^{8}EX^{10} (Id. de Sec.
Nº 6) en la que X^{8} y X^{10} son ambos residuos de un
aminoácido aquiral, o dicho fragmento es un homólogo del mismo que
incluye los residuos X^{8} y X^{10}, tanto H como E, X^{8} y
X^{10} incluyen de forma opcional protección de la cadena
lateral; y
b) la incorporación del fragmento peptídico en
un péptido insulinotrópico.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente, X^{8} es un residuo de
aminoácido que corresponde a metilalanina (Aib). X^{10} es
preferiblemente un residuo de aminoácido que corresponde a
glicina.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
fragmento peptídico que posee la secuencia de aminoácidos
HX^{8}EX^{10} (Id. de Sec. Nº 6), en la que X^{8} y X^{10}
son ambos residuos de un aminoácido aquiral, y tanto H como E,
X^{8} y X^{10} incluyen opcionalmente la protección de la cadena
lateral. Preferiblemente, X^{8} es un residuo de aminoácido que
corresponde a Aib y X^{10} es un residuo de aminoácido que
corresponde a glicina.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un método para elaborar un péptido insulinotrópico, que
comprende los pasos de:
a) la preparación de un fragmento peptídico o un
homólogo del mismo que incluye la secuencia de aminoácidos
TFTSDVX^{17-18}YLEG (Id. de Sec. Nº 8) en la que
el residuo denotado mediante el símbolo X^{17-18}
es un residuo dipeptídico de pseudoprolina; y
b) la incorporación del fragmento peptídico en
un péptido insulinotrópico.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un péptido o un homólogo del mismo que incluye la
secuencia de aminoácidos TFTSDVX^{17-18}YLEG (Id.
de Sec. Nº 8) en la que el residuo denotado mediante el símbolo
X^{17-18} es un residuo dipeptídico de
pseudoprolina; y dichos residuos de aminoácidos incluyen
opcionalmente la protección de la cadena lateral.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un método para elaborar un péptido insulinotrópico de
acuerdo con la reivindicación 1, que comprende el paso de:
a) el acoplamiento del primer fragmento
peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos HX^{8}EX^{10}
(Id. de Sec. Nº 6), en la que X^{8} y X^{10} son ambos residuos
de un aminoácido aquiral, tanto H como E incluyen opcionalmente la
protección de la cadena lateral, con el segundo fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos
TFTSDVX^{17-18}YLEG (Id. de Sec. Nº 8), en la que
el residuo denotado mediante el símbolo X^{17-18}
es un residuo dipeptídico de pseudoprolina, y dichos residuos de
aminoácidos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de
la cadena lateral, para proporcionar un tercer fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos
HX^{8}EX^{10}TFTSDVX^{17-18}YLEG (Id. de Sec.
Nº 11), y dichos residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen
opcionalmente la protección de la cadena lateral; y
b) la incorporación del fragmento peptídico en
un péptido insulinotrópico.
\newpage
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un método para elaborar un péptido insulinotrópico, que
comprende los pasos de:
a) la preparación de un fragmento peptídico o un
homólogo del mismo que incluye la secuencia de aminoácidos
QAAKEFIAWLVKX^{35} (Id. de Sec. Nº 9), en la que X^{35} es un
residuo de un aminoácido aquiral, y dichos residuos de la secuencia
incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; y
b) la incorporación del fragmento peptídico en
un péptido insulinotrópico.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un método para elaborar un péptido insulinotrópico, que
comprende uno o más pasos de:
a) proporcionar un primer fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos HX^{8}EX^{10} (Id. de
Sec. Nº 6), en los que X^{8} y X^{10} son ambos residuos de un
aminoácido aquiral, y tanto H como E incluyen opcionalmente la
protección de la cadena lateral;
b) proporcionar un segundo fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos
TFTSDVX^{17-18}YLEG (Id. de Sec. Nº 8) en la que
el residuo denotado mediante el símbolo X^{17-18}
es un residuo dipeptídico de pseudoprolina, y dichos residuos de
aminoácidos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de
la cadena lateral;
c) el acoplamiento del primer fragmento al
segundo fragmento para proporcionar un tercer fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos
HX^{8}EX^{10}TFTSDVX^{17-18}YLEG (Id. de Sec.
Nº 11), y dichos residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen
opcionalmente la protección de la cadena lateral;
d) proporcionar un cuarto fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX^{35} (Id.
de Sec. Nº 9), en la que X^{35} es un residuo de un aminoácido
aquiral, y dichos residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen
opcionalmente la protección de la cadena lateral;
e) el acoplamiento del cuarto fragmento
peptídico a una arginina para proporcionar un quinto fragmento
peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos
QAAKEFIAWLVKX^{35}R (Id. de Sec. Nº 12), y dichos residuos de la
secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral;
y
f) el acoplamiento del quinto fragmento al
tercer fragmento para proporcionar un péptido insulinotrópico que
incluye la secuencia de aminoácidos
HX^{8}EX^{10}TFTSDVX^{17-18}YLEGQAAKEFIAWLVKX^{35}R
(Id. de Sec. Nº 13), y dichos residuos de la secuencia incluyen
opcionalmente la protección de la cadena lateral.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente, la presente invención se
refiere al método para elaborar un péptido insulinotrópico, que
comprende los pasos de:
a) proporcionar un primer fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos HX^{8}EX^{10} (Id. de
Sec. Nº 6), en los que X^{8} y X^{10} son ambos residuos de un
aminoácido aquiral, y tanto H como E incluyen opcionalmente la
protección de la cadena lateral;
b) proporcionar un segundo fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos
TFTSDVX^{17-18}YLEG (Id. de Sec. Nº 8) en la que
el residuo denotado mediante el símbolo X^{17-18}
es un residuo dipeptídico de pseudoprolina, y dichos residuos de
aminoácidos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de
la cadena lateral;
c) el acoplamiento del primer fragmento al
segundo fragmento para proporcionar un tercer fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos
HX^{8}EX^{10}TFTSDVX^{17-18}YLEG (Id. de Sec.
Nº 11), y dichos residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen
opcionalmente la protección de la cadena lateral;
d) proporcionar un cuarto fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX^{35} (Id.
de Sec. Nº 9), en la que X^{35} es un residuo de un aminoácido
aquiral, y dichos residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen
opcionalmente la protección de la cadena lateral;
e) el acoplamiento del cuarto fragmento
peptídico a arginina para proporcionar un quinto fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX^{35}R (Id.
de Sec. Nº 12), y dichos residuos de la secuencia incluyen
opcionalmente la protección de la cadena lateral; y
f) el acoplamiento del quinto fragmento al
tercer fragmento para proporcionar un péptido insulinotrópico que
incluye la secuencia de aminoácidos
HX^{8}EX^{10}TFTSDVX^{17-18}YLEGQAAKEFIAWLVKX^{35}R
(Id. de Sec. Nº 13), y dichos residuos de la secuencia incluyen
opcionalmente la protección de la cadena lateral.
\newpage
En otro aspecto, la invención se refiere al
método tal y como se ha descrito hasta aquí, que comprende otro paso
de:
g) eliminación de los grupos protectores de la
cadena lateral para proporcionar un péptido insulinotrópico que
incluye la secuencia de aminoácidos
HX^{8}EX^{10}TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX^{35}R (Id. de Sec. Nº
5) y homólogos de la misma, en que cada uno de los símbolos X en las
posiciones 8, 10 y 35 independientemente denotan un residuo de
aminoácido aquiral, estéricamente obstaculizado de forma
opcional.
La eliminación de los grupos protectores de la
cadena lateral se lleva a cabo preferiblemente empleando una de
solución de desprotección que comprende al menos un reactivo
acidolítico y al menos un neutralizador de cationes. Los reactivos
acidolíticos para la desprotección global están seleccionados
preferiblemente de entre el grupo que consiste en ácido
trifluoroacético (TFA), HCl, ácidos de Lewis como BF_{3} Et_{2}O
o Me_{3}SiBr, ácido fluorhídrico líquido (HF), bromuro de
hidrógeno (HBr), ácido trifluorometano-sulfónico y
combinaciones de los mismos. Los neutralizadores de cationes
adecuados se seleccionan preferiblemente de entre ditiotreitol
(DTT), anisol, p-cresol, etanoditiol y dimetil
sulfuro. La solución de desprotección puede también incluir
agua.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un método para elaborar un péptido insulinotrópico, que
comprende los pasos de:
a) proporcionar un primer fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos HX^{8}EX^{10} (Id. de
Sec. Nº 6), en la que X^{8} y X^{10} son ambos residuos de un
aminoácido aquiral, y tanto H como E, X^{8} y X^{10} incluyen
opcionalmente la protección de la cadena lateral;
b) proporcionar un segundo fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos
TFTSDVX^{17-18}YLEG (Id. de Sec. Nº 8) en la que
el residuo denotado mediante el símbolo X^{17-18}
es un residuo dipeptídico de pseudoprolina, y dichos residuos de
aminoácidos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de
la cadena lateral;
c) el acoplamiento del primer fragmento al
segundo fragmento para proporcionar un tercer fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos
HX^{8}EX^{10}TFTSDVX^{17-18}YLEG (Id. de Sec.
Nº 11), y dichos residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen
opcionalmente la protección de la cadena lateral;
d) proporcionar un cuarto fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX^{35} (Id.
de Sec. Nº 9), en la que X^{35} es un residuo de un aminoácido
aquiral, y dichos residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen
opcionalmente la protección de la cadena lateral;
e) el acoplamiento del cuarto fragmento
peptídico a arginina para proporcionar un quinto fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX^{35}R (Id.
de Sec. Nº 12), y dichos residuos de la secuencia incluyen
opcionalmente la protección de la cadena lateral; y
f) el acoplamiento del quinto fragmento al
tercer fragmento para proporcionar un péptido insulinotrópico con la
fórmula (Id. de Sec. Nº 5)
HX^{8}EX^{10}TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX^{35}R y homólogos de la
misma, en las que los símbolos X en las posiciones 8, 10 y 35
denotan independientemente un residuo de aminoácido aquiral,
estéricamente obstaculizado de forma opcional; y en la que uno o más
de los residuos de aminoácidos incluyen de forma opcional la
protección de la cadena lateral.
La Fig. 1 es un diagrama esquemático de un
esquema de síntesis de acuerdo con la presente invención.
El fragmento 12 es un fragmento peptídico que
incluye la secuencia de aminoácidos HX^{8}EX^{10} (Id. de Sec.
Nº 6). El fragmento 14 es un fragmento peptídico que incluye la
secuencia de aminoácidos
T^{11}FTSD^{15}VX^{17-18}YL^{20}EG (Id. de
Sec. Nº 8). El fragmento 16 es un fragmento peptídico que incluye la
secuencia de aminoácidos
Q^{23}AA^{25}KEFIA^{30}
WLVKX^{35} (Id. de Sec. Nº 9). El fragmento intermedio 18 es un fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos H^{7}X^{8}EX^{10}TFTSD^{15-}VX^{17-18}YL^{20}EG (Id. de Sec. Nº 11). El fragmento peptídico intermedio 20 es un péptido que incluye la secuencia de aminoácidos Q^{23}AA^{25}KEFIA^{30}WLVKX^{35}R (Id. de Sec. Nº 12). El producto 11 es el péptido protegido deseado H^{7}X^{8}EX^{10}TFTS-D^{15}VX^{17-18}YL^{20}EGQAA^{25}KEFIA^{30}WLVKX^{35}R (Id. de Sec. Nº 13) en el que las Ser-Ser de las posiciones 17 y 18 están aún en la forma de pseudoprolina protegida. El diagrama se describe en más detalle a continuación.
WLVKX^{35} (Id. de Sec. Nº 9). El fragmento intermedio 18 es un fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos H^{7}X^{8}EX^{10}TFTSD^{15-}VX^{17-18}YL^{20}EG (Id. de Sec. Nº 11). El fragmento peptídico intermedio 20 es un péptido que incluye la secuencia de aminoácidos Q^{23}AA^{25}KEFIA^{30}WLVKX^{35}R (Id. de Sec. Nº 12). El producto 11 es el péptido protegido deseado H^{7}X^{8}EX^{10}TFTS-D^{15}VX^{17-18}YL^{20}EGQAA^{25}KEFIA^{30}WLVKX^{35}R (Id. de Sec. Nº 13) en el que las Ser-Ser de las posiciones 17 y 18 están aún en la forma de pseudoprolina protegida. El diagrama se describe en más detalle a continuación.
Las realizaciones de la presente invención
descritas más adelante no pretenden ser exhaustivas o limitar la
invención a las formas precisas descritas en la siguiente
descripción detallada. En lugar de ello, las realizaciones se han
escogido y se describen para que otros expertos en la materia puedan
apreciar y entender los principios y prácticas de la presente
invención.
La presente invención está dirigida a los
métodos sintéticos para elaborar péptidos como el péptido similar
al glucagón 1 (GLP-1) y sus homólogos naturales y no
naturales insulinotrópicamente activos, utilizando técnicas en fase
sólida y/o en solución. Las moléculas peptídicas de la invención
pueden estar protegidas, no protegidas o parcialmente protegidas.
La protección puede incluir protección del extremo
N-terminal, protección de la cadena lateral y/o
protección de C-terminal. Mientras la invención está
generalmente dirigida a la síntesis de estos péptidos similares al
glucagón, sus homólogos, fragmentos y sus homólogos y productos de
fusión y sus homólogos, los presentes ejemplos de la invención
también pueden aplicarse a la síntesis de otros péptidos,
particularmente a aquellos que se sintetizan utilizando una
combinación de aproximaciones en fase sólida y en solución. La
invención se puede aplicar también a la síntesis de fragmentos de
péptido intermedios asociados con impurezas, particularmente
impurezas de piroglutamato. Las moléculas útiles de
GLP-1 preferidas en la práctica de la presente
invención incluyen al
GLP-1(7-36) natural y no
natural, y los homólogos del mismo.
Tal y como se utiliza aquí, el término "que
incluye la secuencia de aminoácidos" preferiblemente significa
"que posee la secuencia de aminoácidos".
Tal y como se utiliza aquí, un "homólogo"
se refiere a los análogos naturales y no naturales, derivados,
compuestos de fusión, sales o similares de un péptido. Tal y como
se utiliza aquí, un análogo de péptido generalmente se refiere a un
péptido que posee una secuencia modificada de aminoácidos con una o
más sustituciones de aminoácidos, deleciones, inversiones y/o
adiciones relacionadas con otro péptido o péptido homólogo. Las
sustituciones pueden involucrar uno o más aminoácidos naturales o
no naturales. Las sustituciones pueden ser preferiblemente
conservativas o altamente conservativas. Una sustitución
conservativa se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro
que posee generalmente la misma carga electrónica neta y
generalmente el mismo tamaño y forma. Por ejemplo, los aminoácidos
con cadenas laterales alifáticas o alifáticas sustituidas poseen
aproximadamente el mismo tamaño cuando el número total de carbonos
y heteroátomos en sus cadenas laterales difieren en menos de
cuatro. Poseen aproximadamente la misma forma cuando el número de
ramas en sus cadenas laterales difieren en no más de una o dos. Los
aminoácidos con grupos fenilo o grupos fenilo sustituidos en su
cadena lateral se considera que tienen el mismo tamaño y forma. A
continuación se listan cinco grupos de aminoácidos. Sustituyendo un
aminoácido en un compuesto con otro aminoácido del mismo grupo
generalmente resulta en una sustitución conservativa.
Grupo I: glicina, alanina, valina, leucina,
isoleucina, serina, treonina, cisteína, metionina y aminoácidos que
no existen de forma natural con cadenas laterales alifáticas
C_{1}-C_{4} o alifáticas
C_{1}-C_{4} sustituidas por hidroxilo (cadenas
sencillas o mono-ramificadas).
Grupo II: ácido glutámico, ácido aspártico y
aminoácidos que no existen de forma natural con cadenas laterales
alifáticas C_{1}-C_{4} sustituidas con ácido
carboxílico (no ramificadas o un punto de ramificación).
Grupo III: lisina, ornitina, arginina y
aminoácidos que no existen de forma natural con cadenas laterales
alifáticas C_{1}-C_{4} sustituidas con amina o
guanidina (no ramificadas o un punto de ramificación).
Grupo IV: glutamina, asparagina y aminoácidos
que no existen de forma natural con cadenas laterales alifáticas
C_{1}-C_{4} sustituidas con amida (no
ramificadas o un punto de ramificación).
Grupo V: fenilalanina, fenilglicina, tirosina y
triptófano.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal y como se utiliza aquí, el término
"homólogo" más preferiblemente se refiere a las sales de los
péptidos o a los derivados de los mismos que están amidados en el
extremo C-terminal.
Una "sustitución altamente conservativa" es
la sustitución de un aminoácido con otro aminoácido que posee el
mismo grupo funcional en la cadena lateral y casi el mismo tamaño y
forma. Los aminoácidos con cadenas laterales alifáticas o
alifáticas sustituidas poseen casi el mismo tamaño cuando el número
total de carbonos y heteroátomos en sus cadenas laterales difieren
en menos de dos. Poseen casi la misma forma cuando poseen el mismo
número de ramificaciones en sus cadenas laterales. Ejemplos de
sustituciones altamente conservativas incluyen valina por leucina,
treonina por serina, ácido aspártico por ácido glutámico y
fenilglicina por fenilalanina.
Un "derivado peptídico" generalmente se
refiere a un péptido, a un análogo de péptido u otro homólogo de
péptido que posee una modificación química de uno o más de sus
grupos laterales, átomos de carbono alfa, grupo amino terminal y/o
grupo ácido carboxilo terminal. A modo de ejemplo, una modificación
química incluye, pero no se limita a, la adición de porciones
químicas, creación de nuevos enlaces y/o eliminación de porciones
químicas. Las modificaciones en los grupos laterales de los
aminoácidos incluyen, sin limitación, la acilación de los grupos
e-amino de la lisina, N-alquilación
de arginina, histidina o lisina, alquilación de los grupos ácido
carboxílico del glutámico o aspártico y de
s-amidación de glutamina o asparagina. Las
modificaciones del grupo amino terminal incluyen, sin limitación,
modificaciones de desaminación, N-alquilo inferior,
N-dialquilo inferior y N-acilo (por
ejemplo, -CO-alquilo inferior). Las modificaciones
del grupo carboxi terminal incluyen, sin limitación, las
modificaciones amida, alquilamida inferior, dialquilamida y
alquiléster inferior. Los derivados preferidos son aquellos
derivados que están amidados en el grupo carboxi terminal, por
ejemplo, la amida, alquilamida inferior o dialquilamida del péptido.
Así, los péptidos parcial o totalmente protegidos constituyen
derivados de los péptidos.
En la práctica de la presente invención, un
compuesto posee una actividad "insulinotrópica" si es capaz de
estimular, provocar la estimulación o ayuda a provocar la
estimulación de la síntesis o expresión de la hormona insulina. En
las formas de práctica preferidas, la actividad insulinotrópica
puede demostrarse de acuerdo con los ensayos descritos en las Pat.
Estadounidenses Nº 6.887.849 y 6.703.365.
\newpage
En las realizaciones preferidas, la presente
invención proporciona metodologías para sintetizar péptidos
sintéticos (X^{8}, X^{10}, X^{35}) GLP-1
(7-36) que poseen la siguiente fórmula (Id. de Sec.
Nº 5):
HX^{8}EX^{10}TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX^{35}R
y homólogos de la misma, en la que
cada uno de los símbolos X en las posiciones 8, 10 y 35
independientemente denotan un aminoácido aquiral, obstaculizado
estéricamente de forma opcional. Cualquiera de los residuos
X^{8}, X^{10} y/o X^{35} pueden incluir opcionalmente grupos
protectores de cadenas laterales. Los péptidos de acuerdo con esta
fórmula difieren del
GLP-1(7-36) nativo en que al
menos los residuos aquirales, obstaculizados estéricamente de forma
opcional X^{8} y X^{35} están sustituidos por los residuos de
aminoácidos nativos en las posiciones 8 y 35. El residuo X^{10}
puede derivarse de la glicina aquiral nativa u otro aminoácido
aquiral. El uso de los aminoácidos aquirales X^{8}, X^{10}, y
X^{35} no sólo ayuda a estabilizar el péptido resultante, sino
que también se acaba de descubrir que el uso de estos aminoácidos
como bloques de construcción facilita la ruta de síntesis sencilla
de la presente invención que se muestra en la Fig. 1 y se describe
en detalle más
adelante.
Una realización particularmente preferida de un
péptido (X^{8}, X^{10}, X^{35}) GLP-1
(7-36) que puede sintetizarse de acuerdo con los
principios de la presente invención incluye un péptido de acuerdo
con la fórmula (Id. de Sec.
Nº 4):
Nº 4):
HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR
y homólogos de la misma, que
preferiblemente están amidados en C-terminal. Este
péptido utiliza el residuo aquiral del ácido
alfa-aminoisobutírico (o metilalanina, mostrado de
forma esquemática mediante la abreviatura Aib) como en X^{8} y
X^{35}, que preferiblemente poseen una amida en
C-terminal, o utiliza un residuo de G nativa en la
posición 10, y puede designarse mediante la fórmula (Aib^{8,35})
GLP-1(7-36)-NH_{2}.
Esta notación indica que un residuo de aminoácido que corresponde
al aminoácido "Aib" aparece en las posiciones 8 y 35 en lugar
de la alanina nativa. El ácido alfa-aminoisobutírico
aquiral, también se conoce como metilalanina. El péptido de acuerdo
con el Id. de Sec. Nº 4 se describe en la PE 1137667 B1. La
presencia de residuos de Aib en las posiciones 8 y 35 ralentiza la
degradación metabólica en el cuerpo, haciendo que este péptido sea
mucho más estable en el cuerpo que el péptido
GLP-1(7-36)
nativo.
La presente invención proporciona metodologías
mejoradas para obtener péptidos
GLP-1(7-36) como el
(Aib^{8,35})
GLP-1(7-36)-NH_{2}.
A modo de ejemplo, la Fig. 1 muestra de forma esquemática el esquema
ilustrativo 10 para sintetizar péptidos
GLP-1(7-36) y sus homólogos.
El esquema 10 de la Fig. 1 se cree que es particularmente adecuado
para el escalado de síntesis de los péptidos
GLP-1(7-36). Los
procedimientos de escalado normalmente se realizan para
proporcionar una cantidad de péptido útil para su distribución
comercial. Por ejemplo la cantidad de péptido en un procedimiento
de escalado puede ser de 500 g o 1 kg por lote, y más normalmente
de decenas a cientos de kg por lote o más. En las realizaciones
preferidas, los métodos de la invención pueden proporcionar mejoras
como la reducción en el tiempo de procesado (síntesis), mejoras en
el rendimiento de los productos, mejoras en la pureza del producto
y/o reducción en la cantidad de reactivos y materiales de partida
necesarios.
El esquema de síntesis 10 mostrado en la Fig. 1
utiliza una combinación de técnicas en fase sólida y en solución
para preparar el producto peptídico 11.
Como se muestra en la Fig. 1, el esquema 10
involucra la síntesis de los fragmentos intermedios del péptido 12,
14 y 16 en la fase sólida. El fragmento 12 es un fragmento peptídico
que incluye los residuos de aminoácido de acuerdo con el Id. de
Sec. Nº 6:
HX^{8}EX^{10}
en el que X^{8} y X^{10} son
como se ha definido antes, o es un homólogo de la misma, lo que
incluye los residuos X^{8} y X^{10}. Uno o más de los residuos
de aminoácidos puede incluir grupos protectores de las cadenas
laterales de acuerdo con las prácticas convencionales. En algunas
realizaciones, el fragmento peptídico 12 puede estar enlazado a una
resina a través del extremo C-terminal. Este
fragmento puede llevar opcionalmente grupos protectores en
N-terminal y/o C-terminal. Se ha
encontrado que el Fmoc es un grupo protector de
N-terminal particularmente útil en la síntesis en
fase sólida del fragmento
peptídico.
El fragmento 12 incluye los 4 residuos de
aminoácido que corresponden a los aminoácidos en las posiciones de 7
a 10 del péptido GLP-1(7-36)
nativo, y por lo tanto puede representarse mediante la notación
(X^{8}, X^{10})
GLP-1(7-10). En las
realizaciones preferidas, X^{8} es Aib y X^{10} es glicina, de
acuerdo con el Id. de Sec. Nº 7:
H^{7}AibEG^{10}
o es un homólogo del mismo que
incluye el residuo Aib en la posición 10. El fragmento peptídico de
acuerdo con el Id. de Sec. Nº 7 puede representarse mediante la
notación
(Aib^{8})GLP-1(7-10)
para indicar la sustitución de Aib por la alanina nativa en la
posición 8 del GLP-1(7-10)
nativo.
La síntesis en fase sólida se lleva a cabo
generalmente en dirección de C-terminal a
N-terminal del fragmento 12. Así, el aminoácido
X^{10}, que está presente en la porción C-terminal
del fragmento, es el primer residuo de aminoácido que está acoplado
al soporte de resina en fase sólida. La síntesis en fase sólida
continúa entonces mediante la adición consecutiva de los residuos
de aminoácido de la forma correspondiente a la secuencia deseada.
La síntesis del fragmento del péptido intermedio se completa después
de que el residuo N-terminal (por ejemplo, el
residuo histidina (H) N-terminal) se haya añadido a
la cadena de péptido naciente.
La selección y uso de un fragmento peptídico de
acuerdo con los Id. de Sec. Nº 6 y 7 proporciona ventajas
significativas dentro del esquema 10. Primero, la H tiende a ser un
residuo de aminoácido difícil de añadir a la cadena de péptido
naciente debido a, al menos en parte, problemas de epimerización. No
obstante, el fragmento 12 es suficientemente pequeño para minimizar
estos problemas en su mayor parte. Aún así, el fragmento 12 es
suficientemente largo para tener dos centros quirales. Por lo tanto,
una única cristalización permite purificar al fragmento. Si el
fragmento 12 termina en Aib, el fragmento poseerá solo un centro
quiral y será, en consecuencia, más difícil de purificar de forma
racémica. Situando la G aquiral en posición
C-terminal también evita los problemas de
racemización que de otro modo serían preocupantes si el fragmento 12
acabara en C-terminal con E quiral. En resumen, la
selección del fragmento 12 como un bloque de construcción del
péptido hace más fácil la construcción, la purificación y el
acoplamiento del fragmento a otro material peptídico. La selección
de este fragmento también proporciona una baja racemización de H.
Sorprendentemente, puede añadirse la H a este fragmento con un
nivel muy bajo de epimerización, por ejemplo, alrededor del 3% en
peso en algunas formas de la práctica.
El fragmento 14 es un fragmento peptídico que
incluye residuos de aminoácido de acuerdo con el Id. de Sec. Nº
8:
T^{11}FTSD^{15}VX^{17-18}YL^{20}EG
en el que el residuo denotado
mediante el símbolo X^{17-18} es un residuo
dipeptídico de pseudoprolina, definida en detalle más adelante, o
es un homólogo del mismo que incluye el X^{17-18}
en las posiciones 17 y 18. El fragmento 14 incluye los residuos de
aminoácido que generalmente corresponden a los residuos de
aminoácido en las posiciones 11 a 22 del péptido
GLP-1(7-36) nativo, excepto
que se utiliza el residuo dipéptido de pseudoprolina
X^{17-18} en lugar de los residuos SS
(Ser-Ser) que ocupan las posiciones correspondientes
17 y 18 del GLP-1(7-36)
nativo.
Uno o más de los residuos de aminoácido del
fragmento 14 puede incluir grupos protectores de cadenas laterales
de acuerdo con las prácticas convencionales. En algunas
realizaciones, el fragmento peptídico 14 puede estar unido a resina
a través del extremo C-terminal. Este fragmento
puede llevar opcionalmente grupos protectores en
N-terminal y/o C-terminal. Se ha
encontrado que Fmoc es un grupo protector de
N-terminal particularmente útil para la síntesis en
fase sólida del fragmento peptídico. El fragmento peptídico de
acuerdo con el Id. de Sec. Nº 8 puede estar referido mediante la
notación (X^{17-18})
GLP-1(11-22) para indicar la
sustitución por los residuos de pseudoprolina
X^{17-18} de los residuos Ser-Ser
en las posiciones 17 y 18.
Tal y como se utiliza en la práctica de la
presente invención, el término pseudoprolina se refiere a un
dipéptido que incluye un residuo de un aminoácido con función
hidroxilo como la Ser o Thr en las que la cadena lateral con la
función hidroxilo está protegida con un unillo oxazolidina, lábil a
TFA, similar a prolina entre el amino alfa y la cadena lateral
hidroxilo. Como consecuencia del anillo oxazolidina, el dipéptido
funciona como un mimético de prolina reversible.
Generalmente, un residuo típico de pseudoprolina
tal como se incorpora en un péptido puede representarse mediante la
fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
en la que \Phi representa un
residuo de cualquier aminoácido y tanto R^{1} como R^{2} son
independientemente una porción de unión divalente adecuada. A
menudo, R^{1} es una porción divalente de
fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
en la que cada uno de R^{3} y
R^{4} son independientemente una porción monovalente tal como H, o
un alquilo inferior como metilo. R^{3} y R^{4} también pueden
ser co-miembros de una estructura en anillo. Es
deseable que tanto R^{3} como R^{4} sea metilo. En el caso de
una Ser protegida por un anillo oxazolidinina, R^{2} es la
porción divalente CH_{2}, mientras que en el caso de la Thr,
R^{2} es la porción divalente
(CH_{3})CH.
El término "alquilo inferior" se refiere a
un radical alquilo monovalente de cadena sencilla o ramificada de
uno a seis átomos de carbono, preferiblemente de uno a cuatro átomos
de carbono. Este término se ejemplifica además mediante radicales
como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo,
n-butilo, s-butilo, isobutilo,
t-butilo, n-pentilo,
3-metilbutilo, n-hexilo,
2-etilbutilo y similares. Los residuos de alquilo
inferior preferibles son metilo y etilo, siendo metilo
especialmente preferido.
Durante la desprotección, la porción R^{1} se
escinde para proporcionar un residuo dipeptídico de acuerdo con la
siguiente fórmula:
en la que \Phi y R^{2} son como
se ha definido anteriormente. Aplicado al fragmento 14, el residuo
de pseudoprolina preferiblemente corresponde a un residuo
Ser-Ser en el que la Ser que está más proximal al
C-terminal está protegida con el anillo oxazolidina
y posee la siguiente
estructura:
La cadena lateral con un hidroxilo de la Ser más
cercana al N-terminal esta protegida, por ejemplo
mediante el grupo de protección t-Bu. Cuando se
rompe la estructura del anillo oxazolidina y t-Bu
protectora, aparece el residuo Ser-Ser.
La utilización de este mimético de prolina como
un bloque de construcción en la síntesis del fragmento 14
proporciona ventajas significativas en el contexto de la presente
invención. Primero, la síntesis en fase sólida del fragmento 14 se
facilita enormemente. Cuando la pseudoprolina no se utiliza durante
el curso de la síntesis en fase sólida del fragmento 14, puede
haber problemas significativos con las eliminaciones de Fmoc de los
residuos 13 al 11. Se cree que esta dificultad puede ser debida a la
formación de láminas beta. El uso de la pseudoprolina hace que
estas eliminaciones de Fmoc sean más fáciles, se cree que mediante
la reducción del grado de formación de láminas beta. Segundo, el
posterior acoplamiento en fase sólida del fragmento 14 al fragmento
12 para formar el fragmento 18, descrito más abajo, se facilita
enormemente. En ausencia del residuo de pseudoprolina, la
solubilidad del fragmento 18 en los solventes de acoplamiento
típicos en fase en solución es muy pobre. La pseudoprolina aumenta
las características de solubilidad del fragmento 18, facilitando el
acoplamiento de este fragmento al fragmento 20 en fase en solución
(Véase discusión de la Fig. 1, a continuación).
La síntesis en fase sólida se lleva a cabo
generalmente en dirección de C-terminal a
N-terminal del fragmento 14. Así, el aminoácido G,
que está presente en la porción C-terminal del
fragmento, es el primer residuo de aminoácido que está acoplado al
soporte de resina de fase sólida. La síntesis en fase sólida
continúa entonces mediante la adición consecutiva de residuos de
aminoácido de la forma correspondiente a la secuencia deseada. Sin
embargo, se añade el dipéptido pseudoprolina
X^{17-18} a la cadena creciente en una posición
que corresponde a las posiciones 17 y 18 del
GLP-1(7-36) en lugar de
añadir de forma consecutiva un par de residuos Ser nativos en estas
posiciones 17 y 18. La síntesis del fragmento de péptido intermedio
se completa después de que el residuo N-terminal
(por ejemplo, el residuo treonina (T) N-terminal) se
haya añadido a la cadena de péptido naciente.
El fragmento 16 es un fragmento de péptido, u
homólogo del mismo, que incluye los residuos de aminoácido de
acuerdo con el Id. de Sec. Nº 9:
Q^{23}AA^{25}KEFIA^{30}WLVKX^{35}
en el que X^{35} es como se ha
definido anteriormente, o es un homólogo del mismo que incluye el
residuo X^{35}. Uno o más de los residuos de aminoácido pueden
incluir grupos protectores de cadenas laterales de acuerdo con las
prácticas convencionales. El fragmento 16 incluye los residuos de
aminoácido que corresponden a los aminoácidos en las posiciones de
23 a 35 del péptido
GLP-1(7-36) nativo, excepto
que en la posición 35 está el X^{35} en lugar del aminoácido
nativo en esa posición. El fragmento 16 puede estar representado
mediante la notación (X^{35})
GLP-1(23-35).
En algunas realizaciones, el fragmento peptídico
16 puede estar unido a la resina a través del extremo
C-terminal. Este fragmento puede llevar
opcionalmente grupos protectores de la cadena lateral,
N-terminal y/o C-terminal. Se ha
encontrado que el Fmoc es un grupo protector de
N-terminal particularmente útil para la síntesis en
fase sólida del fragmento peptídico.
En realizaciones preferidas, X^{35} es Aib de
acuerdo con el Id. de Sec. Nº 10:
Q^{23}AA^{25}KEFIA^{30}WLVKAib^{35}
o un homólogo del mismo que incluye
el Aib en la posición 35. El fragmento peptídico de acuerdo con el
Id. de Sec. Nº 10 puede estar representado por la notación
(Aib^{35}) GLP-1(23-35)
para indicar la sustitución de Aib por el aminoácido nativo en la
posición 35 del GLP-1(7-36)
nativo.
Nótese que el fragmento 16 de acuerdo con los
Id. de Sec. Nº 9 y 10 no incluye todavía el residuo R (Arg) en la
posición 36 en C-terminal. La Arg se acopla
posteriormente en C-terminal del fragmento 16 en la
fase en solución, preferiblemente utilizando Arg sin la protección
de la cadena lateral. Esta estrategia proporciona ventajas
significativas dentro del esquema 10 de la Fig. 1, debido a que
evita reacciones adversas no deseadas que tienden a ocurrir como
consecuencia de utilizar Arg protegida. Por ejemplo, tras la
desprotección de la Arg protegida, los productos secundarios de la
desprotección tienden a reaccionar con otros constituyentes del
péptido, por ejemplo, el triptófano. Esto reduce la cantidad de
péptido crudo deseado disponible para la purificación.
La síntesis en fase sólida se lleva a cabo
generalmente en dirección desde C-terminal a
N-terminal del fragmento 16. Así, el aminoácido
X^{35}, que está presente en la porción C-terminal
del fragmento, es el primer residuo de aminoácido que se acopla al
soporte de resina en fase sólida. La síntesis en fase sólida
continúa entonces mediante la adición consecutiva de residuos de
aminoácido de la forma correspondiente a la secuencia deseada. La
síntesis del fragmento de péptido intermedio se completa cuando el
residuo N-terminal (por ejemplo, el residuo
glutamina (Q) N-terminal) se ha añadido a la cadena
naciente de péptido. Cualquiera de los aminoácidos utilizados en la
síntesis del fragmento 16 puede incluir protección de la cadena
lateral de acuerdo con las prácticas convencionales.
Debido a la obstaculización estérica proximal en
el soporte de resina cargado con X^{35}, el acoplamiento de
lisina (34) y valina (33) en la cadena de péptido creciente puede
ser problemática. Aún con un exceso de aminoácido, es difícil de
forzar estas reacciones de acoplamiento hasta su finalización. La
elección del solvente y/o la protección del extremo puede ayudar a
mitigar este problema. Se ha descrito que la naturaleza del
solvente de acoplamiento puede impactar en el grado en el que
finaliza el acoplamiento. En un grupo de experimentos, por ejemplo,
las reacciones de acoplamiento se llevaron a cabo con NMP/DCM 3:1,
NMP/DCM 1:1, DMF/DCM 1:1 y DMF/DCM 3:1. Las proporciones en estas
combinaciones de solventes se realizaron en base a su volumen. NMP
se refiere a N-metilpirrolidona, DCM se refiere a
diclorometano y DMF se refiere a dimetilformamida. Se encontró que
las reacciones de acoplamiento continúan más allá en su finalización
cuando se utiliza DMF/DCM 1:1.
También se puede utilizar la protección del
extremo después de cada uno de los acoplamientos de lisina y valina
para prevenir posteriores reacciones de acoplamiento del material
unido a la resina que no ha reaccionado. El material protegido en
el extremo se elimina más fácilmente durante la purificación si se
desea. Se pueden utilizar las técnicas convencionales de protección
de extremos.
En referencia a la Fig. 1, los fragmentos 12, 14
y 16, junto con Arg, se ensamblan para completar el péptido 11
deseado. Para conseguir esto, el fragmento 12 se añade al fragmento
14 en esta fase sólida para producir el fragmento intermedio 18 más
largo, que incorpora los residuos de aminoácido de acuerdo con el
Id. de Sec. Nº 11:
H^{7}X^{8}EX^{10}TFTSD^{15}VX^{17-18}YL^{20}EG
en el que X^{8}, X^{10} y
X^{17-18} son como se ha definido anteriormente.
En una realización preferida, X^{8} es Aib, X^{10} es la G
nativa, y X^{17-18} es un residuo dipeptídico de
pseudoprolina como se ha definido antes. Este intermedio del
fragmento peptídico puede estar representado por la notación
(X^{8}, X^{10}, X^{17-18})
GLP-1
(7-22).
La Fig. 1 muestra además que se añade la Arg en
el extremo C-terminal del fragmento 16 en la fase en
solución para proporcionar el fragmento peptídico intermedio 2 0
más largo, que incorpora los residuos de aminoácido de acuerdo con
el Id. de Sec. Nº 12:
Q^{23}AA^{25}KEFIA^{30}WLVKX^{35}R
en el que X^{35} es como se ha
definido anteriormente y es preferiblemente Aib. Preferiblemente,
la Arg añadida al fragmento peptídico de esta forma no incluye la
protección de la cadena lateral. Este del fragmento peptídico
intermedio 20 puede estar representado por la notación
(X^{35})GLP-1(23-36).
Los fragmentos peptídicos 18 y 20 se acoplan entonces en la fase en
solución para proporcionar el péptido protegido 11 deseado de
acuerdo con el Id. de Sec. Nº 13 en el que la
Ser-Ser en las posiciones 17 y 18 está todavía en
forma de pseudoprolina
protegida:
H^{7}X^{8}EX^{10}TFTSD^{15}VX^{17-18}YL^{20}EG
QAA^{25}KEFIA^{30}WLVKX^{35}R
El péptido 11 puede estar designado por la
notación (X^{8}, X^{10}, X^{17-18},
X^{35})GLP-1(7-36).
En el caso de que el resto de aminoácidos lleven la protección de
la cadena lateral, es deseable mantener esta protección a lo largo
de este
paso.
paso.
Al llevar a cabo el esquema de reacción de la
Fig. 1, las síntesis en fase sólida y en solución pueden llevarse a
cabo mediante métodos estándar conocidos en la industria. En las
formas representativas de la práctica, los péptidos se sintetizan
en fase sólida utilizando la química mediante la que los aminoácidos
se añaden de C-terminal a
N-terminal. Así, el aminoácido o grupo peptídico
proximal a C-terminal de un fragmento particular
es el primero en añadirse a la resina. Esto sucede al reaccionar la
función en C-terminal del aminoácido o grupo
peptídico con la función complementaria en el soporte de resina. La
parte N-terminal del aminoácido o grupo peptídico
está enmascarada para prevenir reacciones adversas no deseadas. Es
deseable que el aminoácido o grupo peptídico también incluya
protección de la cadena lateral. A continuación, se unen sucesivos
aminoácidos o grupos peptídicos al material peptídico unido al
soporte hasta que el péptido de interés se haya formado. La mayoría
de éstos también incluyen protección de cadenas laterales de acuerdo
con las prácticas convencionales. Con cada acoplamiento sucesivo,
se elimina el grupo de enmascaramiento en el extremo
N-terminal del material peptídico unido a la
resina. Éste se hace reaccionar con el extremo
C-terminal del siguiente aminoácido, cuyo extremo
N-terminal está enmascarado. El producto de la
síntesis en fase sólida es así un péptido unido a un soporte de
resina.
Puede utilizarse cualquier tipo de soporte
adecuado en la práctica de la síntesis de péptidos en fase sólida.
En las realizaciones preferidas, el soporte comprende una resina que
puede elaborarse a partir de uno o más polímeros, copolímeros o
combinaciones de polímeros como poliamida, polisulfamida,
polietilenos sustituidos, polietileneglicol, resinas fenólicas,
polisacáridos o poliestireno. El soporte polimérico puede ser
también cualquier sólido que sea suficientemente insoluble e inerte
en los solventes utilizados en las síntesis de péptidos. El soporte
sólido normalmente incluye una porción de unión a la que el péptido
creciente se acopla durante la síntesis y que puede ser escindido
bajo las condiciones deseadas de liberación del péptido del
soporte. Los soportes sólidos adecuados pueden ser enlazantes que
sean fotoescindibles, escindibles con TFA, escindibles con HF,
escindibles con ion fluoruro, escindibles reductivamente,
escindibles con Pd(O), escindibles con nucleófilos o
escindibles con radicales. Las porciones de unión preferidas son
escindibles bajo condiciones en las que los grupos de las cadenas
laterales del péptido escindido aún estén sustancialmente
protegidos en su totalidad.
En un método de síntesis preferido, los
fragmentos de péptido intermedios se sintetizaron en un soporte
sólido sensible al ácido que incluye grupos tritilo, y más
preferiblemente en una resina que incluye grupos tritilo que tienen
grupos cloro expuestos, por ejemplo una resina de cloruro de
2-clorotritilo (2-CTC) (Barlos et
al. (1989) Tetrahedron Letters
30(30):3943-3946). Los ejemplos también
incluyen la resina de cloruro de tritilo, resina de cloruro de
4-metiltritilo, resina de cloruro de
4-metoxitritilo, resina de
4-aminobutan-1-ol
2-clorotritilo, resina de
4-aminometilbenzoil 2-clorotritilo,
resina de
3-aminopropan-1-ol
2-clorotritilo, resina de ácido bromoacético
2-clorotritilo, resina de ácido cianoacético
2-clorotritilo, resina de ácido
4-cianobenzoico 2-clorotritilo,
resina de glicinol 2-clorotritilo, resina de ácido
propiónico 2-clorotritilo, resina de etilenglicol
2-clorotritilo, resina de N-Fmoc
hidroxilamina 2-clorotritilo, resina de hidrazina
2-clorotritilo. Algunos soportes sólidos preferidos
incluyen el poliestireno, que puede co-polimerizarse
con divinilbenceno para formar el material de soporte al que se
pueden anclar los grupos reactivos.
Otras resinas que se utilizan en la síntesis en
fase sólida incluyen las resinas "Wang", que comprenden un
copolímero de estireno y divinilbenceno con grupos de anclaje
4-hidroximetilfenil-oximetilo (Wang,
S.S. 1973, J. Am. Chem. Soc.) y las resinas de ácido
4-hidroximetil-3-metoxifenoxibutírico
(Richter et al. (1994), Tetrahedron Letters
35(27):4705-4706). Las resinas de Wang,
cloruro de 2-clorotritilo y
4-hidroximetil-3-metoxifenoxi
ácido butírico pueden obtenerse de, por ejemplo,
Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego,
California.
Para preparar una resina para la síntesis en
fase sólida, la resina puede prelavarse en solvente(s)
adecuado(s). Por ejemplo, una resina de fase sólida como la
resina 2-CTC se añade a una cámara peptídica y se
prelava con un solvente adecuado. El solvente de prelavado puede
elegirse en función del tipo de solvente (o mezcla de solventes)
que se utilizan en la reacción de acoplamiento, o viceversa. Los
solventes que son adecuados para el lavado, y también para la
posterior reacción de acoplamiento incluyen el diclorometano (DCM),
dicloroetano (DCE), dimetilformamida (DMF) y similares, así como
las mezclas de estos reactivos. Otros solventes útiles incluyen el
DMSO, piridina, cloroformo, dioxano, tetrahidrofurano, acetato de
etilo, N-metilpirrolidona y mezclas de los mismos.
En algunos casos el acoplamiento puede realizarse en un sistema de
solvente binario, como una mezcla de DMF y DCM en una proporción en
volumen en el rango de 9:1 a 1:9, más comúnmente de 4:1 a 1:4.
La síntesis de la presente invención
preferiblemente se lleva a cabo en presencia de grupos protectores
apropiados a menos que se especifique de otra manera. La naturaleza
y utilización de los grupos protectores es bien conocida en la
materia. Generalmente, un grupo protector adecuado es cualquier tipo
de grupo que pueda ayudar a prevenir la participación del átomo o
la porción al que está unido, por ejemplo oxígeno o nitrógeno, en
reacciones no deseadas durante el procesado y la síntesis. Los
grupos protectores incluyen los grupos protectores de cadenas
laterales y los grupos protectores amino- o
N-terminal. Los grupos protectores pueden también
prevenir la reacción o unión de ácidos carboxílicos, tioles y
similares.
Un grupo protector de cadena lateral se refiere
a una porción química acoplada a la cadena lateral (es decir, un
grupo R en la fórmula general de los aminoácidos
H_{2}N-C(R)(H)-COOH) de un
aminoácido que ayuda a prevenir que una porción de la cadena
lateral reaccione con los reactivos utilizados en los pasos de
síntesis del péptido, procesado, etc. La elección de un grupo
protector de cadena lateral puede depender de varios factores, por
ejemplo, del tipo de síntesis realizada, el procesado al que se
someterá el péptido y el producto intermedio o producto final
deseado. La naturaleza del grupo protector de la cadena lateral
también depende de la naturaleza del aminoácido en sí.
Generalmente, se elige un grupo protector de cadena lateral que no
se elimine durante la desprotección de los grupos
\alpha-amino durante la síntesis en fase sólida.
Por lo tanto el grupo protector \alpha-amino y el
grupo protector de la cadena lateral no son normalmente el
mismo.
En algunos casos, y dependiendo del tipo de
reactivos utilizados en la síntesis en fase sólida y del resto de
procesado del péptido, puede no ser necesaria la presencia de un
grupo protector de la cadena lateral de un aminoácido. Tales
aminoácidos normalmente no incluyen un oxígeno reactivo, nitrógeno u
otra porción reactiva en la cadena lateral.
Ejemplos de grupos protectores de cadenas
laterales incluyen acetilo (Ac), benzoilo (Bz),
terc-butilo, trifenilmetilo (tritilo),
tetrahidropiranilo, éter de bencilo (Bzl) y
2,6-diclorobencilo (DCB),
t-butoxicarbonilo (Boc), nitro,
p-toluenosulfonilo (Tos), adamantiloxicarbonilo,
xantilo (Xan), bencilo, 2,6-diclorobencilo, metilo,
etilo y éster de t-butilo, benciloxicarbonilo (Z),
2-clorobencil-oxicarbonilo
(2-Cl-Z),
t-amiloxi-carbonilo (Aoc) y los
grupos protectores de tipo uretano aromáticos o alifáticos, los
grupos fotolábiles como el nitro veratrilo oxicarbonilo (NVOC) y
los grupos lábiles al fluoruro como el trimetilsilil oxicarbonilo
(TEOC).
Los grupos protectores de cadenas laterales
preferidos para los aminoácidos comúnmente utilizados para
sintetizar los péptidos GLP-1 en la práctica de la
presente invención se muestran en la siguiente Tabla A:
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Un grupo protector
amino-terminal incluye una porción química acoplada
al grupo amino alfa de un aminoácido. Normalmente, el grupo
protector amino-terminal se elimina en una reacción
de desprotección antes de la adición del siguiente aminoácido a
añadir a la cadena de péptido creciente, pero puede mantenerse
cuando el péptido se escinde del soporte. La elección de un grupo
protector amino terminal puede depender de varios factores, por
ejemplo, del tipo de síntesis realizada y del producto intermedio o
producto final deseado.
Ejemplos de grupos protectores
amino-terminales incluyen (1) los grupos protectores
de tipo acilo, como formilo, acrililo (Acr), benzoilo (Bz) y
acetilo (Ac); (2) los grupos protectores de tipo uretano aromático,
como benciloxicarbonilo (Z) y Z sustituido, como
p-clorobenciloxicarbonilo,
p-nitrobenciloxicarbonilo,
p-bromobenciloxicarbonilo,
p-metoxibenciloxicarbonilo; (3) los grupos
protectores uretano alifáticos, como
t-butiloxicarbonilo (Boc),
diisopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo,
aliloxicarbonilo; (4) los grupos protectores de tipo uretano
cicloalquilo, como
9-fluorenil-metiloxicarbonilo
(Fmoc), ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, y
ciclohexiloxicarbonilo; y (5) los grupos protectores de tipo
tiouretano, como feniltiocarbonilo. Los grupos protectores
preferidos incluyen
9-fluorenil-metiloxicarbonilo
(Fmoc),
2-(4-bifenilil)-propil(2)oxi-carbonilo
(Bpoc),
2-fenilpropil(2)-oxicarbonilo
(Poc) y t-butiloxicarbonilo (Boc).
La química con Fmoc o parecida a Fmoc es
altamente preferible para la síntesis de péptidos en fase sólida,
considerando que la escisión del péptido resultante en un estado
protegido es relativamente fácil de llevar a cabo utilizando
agentes de escisión medianamente acídicos. Este tipo de reacción de
escisión es relativamente limpia en términos de productos
secundarios resultantes, impurezas, etc., haciendo que sea
técnicamente y económicamente factible la recuperación del péptido
a gran escala a partir de ambos lavados de expansión y contracción,
aumentando el rendimiento. Tal y como se utiliza aquí, "a gran
escala" referido a la síntesis de péptido incluye generalmente
la síntesis de péptidos en el rango de al menos 500 g, y más
preferiblemente al menos 2 kg, por lote. La síntesis a gran escala
se realiza normalmente en recipientes de reacción grandes, como un
tanque de reacción de acero, que puede acomodar cantidades de los
reactivos como las resinas, solventes, aminoácidos, reactivos para
las reacciones de acoplamiento y de desprotección, que se ajustan
para permitir la producción de péptidos en el rango de ente
kilogramos y
toneladas.
toneladas.
De forma adicional, el grupo protector Fmoc
puede escindirse selectivamente de un péptido en relación a los
grupos protectores de la cadena lateral, de forma que la protección
de la cadena lateral permanece en su lugar cuando se escinde el
Fmoc. Este tipo de selectividad es importante durante el
acoplamiento de aminoácidos para minimizar las reacciones de la
cadena lateral. De forma adicional, los grupos protectores de la
cadena lateral pueden escindirse de forma selectiva para eliminarlos
respecto al Fmoc, permaneciendo el Fmoc en su lugar. Los esquemas
de purificación descritos en profundidad a continuación se basan de
forma muy ventajosa en esta última selectividad.
La reacción de acoplamiento en fase sólida puede
realizarse en presencia de uno o más compuestos que aumenten o
mejoren la reacción de acoplamiento. Los compuestos que pueden
incrementar la tasa de reacción y reducir la tasa de reacciones
secundarias incluyen las sales de fosfonio y uronio que en presencia
de una base terciaria, por ejemplo diisopropiletilamina (DIEA) y
trietilamina (TEA), pueden convertir los aminoácidos protegidos en
especies activadas (por ejemplo, BOP, PyBOPO, HBTU y TBTU, todas
generan ésteres de HOBt). Otros reactivos ayudan a prevenir la
racemización proporcionando un reactivo de protección. Estos
reactivos incluyen las carbodiimidas (por ejemplo, DCC o WSCDI) con
un nucleófilo auxiliar añadido (por ejemplo,
1-hidroxi-benzotriazol (HOBt),
1-hidroxi-azabenzotriazol (HOAt) o
HOSu). También puede utilizarse el método de anhídrido mezclado, que
utiliza cloroformato de isobutilo, con o sin un nucleófilo auxiliar
añadido, así como el método de azida, debido a la baja racemización
asociada con él. Estos tipos de compuestos pueden también aumentar
la tasa de acoplamientos mediados por carbodiimida, así como
prevenir la deshidratación de los residuos Asn y Gln.
Después de determinar la finalización del
acoplamiento, la mezcla de reacción de acoplamiento se lava con un
solvente y el ciclo de acoplamiento se repite para cada uno de los
residuos de aminoácido subsiguientes del material peptídico. Para
acoplar el siguiente aminoácido, normalmente se logra la eliminación
del grupo protector en N-terminal (por ejemplo, un
grupo Fmoc) del material unido a la resina mediante el tratamiento
con un reactivo que incluye un 20-50% (en base al
peso) de piperidina en un solvente como la
N-metilpirrolidona (NMP) o dimetilformamida (DMF).
Tras la eliminación del grupo protector de Fmoc, normalmente se
realizan varios lavados para eliminar los productos secundarios
residuales de la piperidina y el Fmoc (como dibenzofulveno y su
aducto de piperidina).
Los siguientes aminoácidos pueden utilizarse en
un exceso estequiométrico de aminoácidos en relación al factor de
carga del material peptídico en el soporte de resina. Generalmente,
la cantidad de aminoácidos utilizados en el paso de acoplamiento es
al menos equivalente al factor de carga del primer aminoácido en la
resina (1 equivalente o más). Preferiblemente la cantidad de
aminoácidos utilizados en el paso de acoplamiento es de al menos
1,3 equivalentes (0,3 de exceso) o más, y más preferiblemente
alrededor de 1,5 equivalentes (0,5 de exceso) o más. En algunos
casos, por ejemplo, el paso de acoplamiento utiliza una cantidad de
equivalentes de aminoácido en el rango de entre 1 y 3.
Después del ciclo final de acoplamiento, la
resina se lava con un solvente como NMP, y después se lava con un
segundo solvente inerte como el DCM. Para eliminar el material
peptídico sintetizado de la resina, se lleva a cabo un tratamiento
de escisión de forma que el material peptídico escindido todavía
tiene suficientes grupos protectores de la cadena lateral y
terminal. La permanencia de los grupos protectores en su lugar
ayuda a prevenir acoplamientos no deseados u otras reacciones no
deseables de los fragmentos de péptido durante o tras la escisión
de la resina. En el caso de utilizar Fmoc o un reactivo similar para
sintetizar el péptido, se puede conseguir una escisión protegida de
cualquier forma deseada, por ejemplo utilizando un reactivo ácido
relativamente débil como el ácido acético o TFA diluido en un
solvente como el DCM. Normalmente se utiliza TFA en DCM entre un
0,5 y 10 por ciento en peso, preferiblemente entre 1 y 3 por ciento
en peso. Véase, por ejemplo, la Pat. Estadounidense Nº
6.281.335.
Los pasos de escisión del fragmento de péptido
intermedio de la resina en fase sólida pueden darse de forma
similar a las de un proceso de ejemplo como sigue. No obstante,
puede utilizarse cualquier proceso adecuado que escinda de forma
efectiva el fragmento de péptido intermedio de la resina. Por
ejemplo, pueden añadirse aproximadamente de 5 a 20, preferiblemente
alrededor de 10 volúmenes de un solvente que contenga un reactivo
de escisión acídico al recipiente que contiene el material peptídico
unido a la resina. La resina, normalmente en forma de cuentas,
queda sumergida en el reactivo como consecuencia. La reacción de
escisión sucede cuando el contenido líquido se agita a una
temperatura adecuada durante un periodo de tiempo adecuado. La
agitación ayuda a evitar la aglutinación de las cuentas. Las
condiciones de tiempo y temperatura adecuadas dependerán de varios
factores como el reactivo ácido que se vaya a utilizar, la
naturaleza del péptido, la naturaleza de la resina y similares.
Como una guía general, será adecuada una agitación de entre
alrededor de -15ºC y alrededor de 5ºC, preferiblemente entre
alrededor de -10ºC y alrededor de 0ºC durante entre alrededor de 5
minutos y dos horas, preferiblemente durante entre alrededor de 25
minutos y alrededor de 45 minutos. El tiempo de escisión puede
estar en el rango de alrededor de 10 minutos a alrededor de 2 horas
o incluso tanto como un día. La escisión se lleva acabo
deseablemente en dicho rango de temperaturas frías para acomodar la
reacción exotérmica que normalmente ocurre durante la reacción.
Además, la temperatura baja de la reacción de escisión evita que
los grupos protectores de las cadenas lateral sensibles al ácido,
como los grupos tritilo, sean eliminados en esta fase.
Al final del tratamiento de escisión, la
reacción se detiene. Esto se puede lograr, por ejemplo, combinando
el reactivo de escisión con una base adecuada, como la piridina o
similares, y continuando la agitación durante un periodo adicional
de entre 5 minutos y 2 horas, preferiblemente entre alrededor de 20
minutos y alrededor de 40 minutos. Añadir la base y continuar con
la agitación provoca un aumento de temperatura del contenido del
recipiente. Al final de la agitación, el contenido del recipiente
puede estar a una temperatura en el rango de entre alrededor de 0ºC
y alrededor de 15ºC, preferiblemente entre alrededor de 5ºC y
alrededor de 10ºC.
Factores tales como la expansión y contracción
de la resina para mejorar aspectos de la recuperación del péptido
puede incorporarse opcionalmente en el proceso global de síntesis.
Estas técnicas se describen, por ejemplo, en la Publicación de Pat.
Estadounidense Nº 2005/0164912 A1.
En algunos aspectos, los fragmentos de péptido
escindido pueden prepararse para un acoplamiento en fase en
solución a otros fragmentos de péptido y/o aminoácidos. Las
reacciones de acoplamiento de péptidos en fase en solución se
revisan en, por ejemplo, New Trends in Peptide Coupling
Reagents; Albericio, Fernando; Chinchilla, Rafael; Dodsworth,
David J.; y Najera, Carmen; Organic Preparations and Procedures
International (2003), 33(3), 203-303.
El acoplamiento de los fragmentos de péptido
intermedios con otros fragmentos o aminoácido(s) en la fase
en solución puede llevarse a cabo utilizando reactivos de
acoplamiento in situ, por ejemplo hexafluorofosfato de
2-(1H-benzotriazol-1-il)tris(dimetilamino)fosfonio
(BOP), hexafluorofosfato de
o-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
(HBTU), hexafluorofosfato de
o-(7-azobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(HATU), diciclohexilcarbodiimida (DCC), carbodiimida soluble en
agua (WSCDI) o tetrafluoroborato de
o-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
(TBTU). Otras técnicas de acoplamiento utilizan ésteres activos
preformados como la hidroxisuccinimida (HOSu) y ésteres de
p-nitrofenol (HONp), anhídridos simétricos
preformados, anhídridos no simétricos como
N-carboxianhídridos (NCAs) o haluros de ácido como
el fluoruro de acilo, así como el cloruro de acilo.
Un solvente de acoplamiento adecuado puede
utilizarse en la reacción de acoplamiento en fase en solución. Se
entiende que el(los) solvente(s) de acoplamiento
utilizado(s) puede afectar al grado de racemización del
enlace peptídico formado; la solubilidad del péptido y/o fragmentos
peptídicos; y a la tasa de la reacción de acoplamiento. En algunas
realizaciones, el solvente de acoplamiento incluye uno o más
reactivos miscibles en agua. Ejemplos de solventes miscibles en
agua incluyen, por ejemplo, DMSO, piridina, cloroformo, dioxano,
tetrahidrofurano, acetato de etilo,
N-metilpirrolidona, dimetilformamida, dioxano o
mezclas de los mismos.
En otras realizaciones, la reacción de
acoplamiento puede incluir uno o más reactivos no miscibles en agua.
Un ejemplo de solvente no miscible en agua es el cloruro de
metileno. En estas realizaciones, el solvente no miscible en agua
es preferiblemente compatible con la reacción de desprotección; por
ejemplo, si se utiliza un solvente no miscible en agua,
preferiblemente no afectará de forma adversa a la reacción de
desprotección.
Después de la formación del péptido 11, el
producto puede someterse a la desprotección, purificación,
liofilización, posterior procesado (por ejemplo, reacción con otro
péptido para formar una proteína de fusión), combinaciones de estos
y/o similares, como se prefiera.
Por ejemplo, de acuerdo con la invención, los
grupos protectores de cadenas laterales están normalmente retenidos
en los fragmentos de péptido intermedios a lo largo de la síntesis
en fase sólida y también a través de las reacciones de acoplamiento
en fase en solución. Generalmente, tras finalizar el paso de
acoplamiento en fase en solución, se pueden realizar uno o más
pasos de desprotección para eliminar uno o más grupos protectores
del péptido.
La eliminación de grupos protectores de cadenas
laterales mediante la desprotección global normalmente utiliza una
solución de desprotección que incluye un agente acidolítico para
escindir los grupos protectores de las cadenas laterales. Los
reactivos acidolíticos utilizados comúnmente para la desprotección
global incluyen el ácido trifluoroacético puro (TFA), HCl, ácidos
de Lewis como BF_{3}Et_{2}O o Me_{3}SiBr, ácido fluorhídrico
líquido (HF), bromuro de hidrógeno (HBr), ácido
trifluorometanosulfónico y combinaciones de los mismos. La solución
de desprotección también incluye uno o más neutralizadores de
cationes adecuados, por ejemplo, ditiotreitol (DTT), anisol,
p-cresol, etanoditiol o sulfuro de dimetilo. La
solución de desprotección también puede incluir agua. Tal y como se
utiliza aquí, las cantidades de reactivos presentes en la
composición de desprotección se expresan normalmente en una
proporción, en la que la cantidad de un componente individual se
expresa como un numerador en "partes", como "partes de
peso" o "partes de volumen" y el denominador es el número
de partes totales en la composición. Por ejemplo, una solución de
desprotección que contiene TFA: H_{2}O: DTT en una proporción de
90:5:5 (peso/peso/peso) posee TFA a 90/100 partes en peso, H_{2}O
a 5/100 partes en peso, y DTT a 5/100 partes en peso.
En algunas realizaciones, la reacción de
desprotección puede realizarse con una cantidad del agente
acidolítico, preferiblemente TFA, en la composición de
desprotección que es superior a 90/100 partes en peso. Otras
composiciones de desprotección preferidas incluyen una cantidad de
agente acidolítico en una proporción de 93/100 partes en peso o
superior, o en una cantidad en el rango de entre 93/100 partes en
peso y 95/100 partes en peso.
La precipitación se realiza normalmente
utilizando un éter, por ejemplo, dietil éter o MTBE (Metil Terc
Butil Éter). Tras la precipitación, preferiblemente se aísla el
péptido y se seca antes de combinarse con otros ingredientes,
liofilizarse, empaquetarse, almacenarse, procesarse y/o manipularse
de otro modo. Esto se puede lograr de cualquier forma adecuada. De
acuerdo con una aproximación adecuada, el péptido se recoge mediante
filtración, se lava mediante generosos lavados con MTBE para
reducir el contenido final de sales hasta un nivel adecuado y
después se seca.
La presente invención también proporciona
técnicas útiles para purificar un amplio rango de péptidos, que
incluye los péptidos GLP-1 y sus homólogos.
Un proceso de purificación particularmente
preferido involucra al menos dos pasos de purificación a través de
medio cromatográfico, en que al menos el primer paso ocurre a un
primer pH y al menos un segundo paso ocurre a un segundo pH. Más
preferiblemente, el primer paso ocurre a un pH acídico, mientras que
el segundo paso ocurre a un pH básico. En realizaciones preferidas,
ocurre al menos un paso bajo condiciones acídicas previamente a un
paso bajo condiciones básicas. Una forma ilustrativa de poner en
práctica esta aproximación de purificación se describe en el
contexto ilustrativo de la purificación del péptido 11 completamente
protegido resultante del esquema 10 que se muestra en la Fig. 1.
Inicialmente, el péptido está totalmente desprotegido. Tanto los
grupos protectores de las cadenas laterales como de
N-terminal se han escindido. Se llevó a cabo un
primer paso cromatográfico en un gradiente de agua/ACN
(acetonitrilo), utilizando suficiente TFA para proporcionar un pH
de entre alrededor de 1 y 5, preferiblemente de alrededor de 2.
Entonces se lleva a cabo un segundo paso en un gradiente de
agua/ACN utilizando un poco de amoníaco y/o acetato amónico o
similares, para proporcionar un pH de entre alrededor de 8 y 9,
preferiblemente de entre 8,5 y 8,9.
Los valores de pH, ya sean ácidos o básicos,
promueven la uniformidad, en el sentido que especies iónicas
uniformes están presentes en cada caso. Así, el pH acídico deseado
es suficientemente bajo para que sustancialmente todos los residuos
de aminoácido en el material peptídico estén protonados. El pH
básico deseado es suficientemente alto para que sustancialmente
todos los residuos de aminoácido en el material peptídico estén
desprotonados. La cromatografía ácida y básica puede llevarse a
cabo en cualquier orden. Es conveniente realizar la cromatografía
básica al final cuando el acetato de péptido es el producto deseado
considerando que el acetato pueda ser el producto de la
cromatografía.
Los principios de la presente invención se
ilustrarán en detalle a continuación mediante los siguientes
ejemplos ilustrativos. A partir de este momento, los porcentajes y
proporciones están expresados en volumen a menos que se especifique
de otra manera.
\newpage
Inicialmente, se preparó la resina 2CTC cargada
con Fmoc-Gly. Las cantidades de reactivos utilizados
se listan en la siguiente tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
La resina de 2-CTC se cargó en
un reactor peptídico de 500 mL y se expandió con 400 mL de DCM
durante 3 0 min. a 25ºC. El lecho se drenó y se añadió una solución
de Fmoc-Gly-OH y DIEA en 8 volúmenes
de DMF: DCM (87,5:12,5). La mezcla se agitó bajo nitrógeno durante
2 horas a una temperatura de 25ºC.
El lecho se drenó y se lavó una vez con 350 mL
de DMF y una vez con 175 mL de DMF. Posteriormente, los sitios
activos restantes en la resina de 2-CTC se
protegieron en el extremo con 350 mL de solución MeOH: DIEA (9:1)
durante 1 hora. El lecho se drenó, se lavó con 250 mL de DMF dos
veces y después con 350 mL de DCM cuatro veces. La resina se
contrajo mediante lavados con 3 X 350 mL de IPA. La resina se secó
hasta peso constante para proporcionar 38,20 g de resina cargada.
El análisis mostró un factor de carga de 0,18 mmol/g.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis en fase sólida se llevó a cabo
comenzando con 20,0 g de resina de 2-CTC cargada
con Fmoc-Gly a 0,18 mmol/g como se preparó en la
Parte A de este Ejemplo 1. La resina se expandió en DCM (200 mL)
durante 30 min. a 25ºC. El solvente DCM se drenó y la resina se lavó
tres veces con NMP (5 vol. cada lavado).
La resina se trató entonces dos veces con
piperidina al 20% en volumen en NMP (5 vol. cada tratamiento) para
eliminar los grupos protectores de Fmoc. Tras el segundo tratamiento
con piperidina al 20% /NMP, la resina se lavó cinco veces con NMP
(5 vol. cada lavado) hasta una prueba de cloranilo negativa.
Para preparar la solución de acoplamiento, se
pesaron el aminoácido (2,85 equiv.) y
6-cloro-1-hidroxibenzotriazol
(6-Cl-HOBT, 2,85 equiv.), se
disolvieron en 2,55 volúmenes de NMP y después se combinaron con
DIEA (3,25 equiv.) a entre 5ºC y 10ºC. El TBTU (2,85 equiv.) se
disolvió en 1,3 volúmenes de NMP a entre 5ºC y 10ºC. Entonces se
combinaron las dos soluciones. La solución resultante se añadió al
recipiente de reacción. El recipiente se enjuagó con 1,3 volúmenes
de DCM añadido al reactor, que se agitó entonces durante
2-3 horas a entre 25ºC y 27ºC. La muestra se
extrajo para un ensayo Kaiser para comprobar la finalización de la
reacción. Si la reacción de acoplamiento resultaba incompleta tras
3 horas (ensayo Kaiser positivo), el recipiente de reacción se
drenaba y se realizaba un re-acoplamiento con una
nueva solución de aminoácido activado. Tras completar la reacción
de acoplamiento, la solución de acoplamiento se drenó y la resina se
lavó con NMP 4 veces (5 vol. cada lavado). La eliminación del grupo
protector Fmoc y el ciclo de reacción de acoplamiento se repitió
para los restantes aminoácidos en el fragmento (es decir, en el
orden de Glu(OtBu)\rightarrow Aib\rightarrow
His(trt)).
Debido a la dificultad de la reacción de
acoplamiento entre la
Fmoc-His(trt)-OH activada y
la
H-Aib-Glu(OtBu)-Gly-2-CTC,
y la inestabilidad de la
Fmoc-His(trt)-OH activada, se
forzó la finalización de la reacción de acoplamiento mediante el
drenaje de la solución de reacción tras una hora y realizando
inmediatamente la reacción de re-acoplamiento con
una segunda nueva solución activada de
Fmoc-His(trt)-OH.
Todos los reactivos utilizados en la Parte B de
este ejemplo se listan en la siguiente tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento peptídico unido a la resina se lavó
con NMP (5 vol.) 4 veces, DCM (6 vol.) 5 veces e IPA (5 vol.) 3
veces. La resina contraída se secó entonces a 35ºC al vacío para
proporcionar 22,58 g de resina con péptido unido a la resina.
\vskip1.000000\baselineskip
La resina obtenida en la Parte B anterior se
expandió en DCM (12,5 volúmenes en relación al peso de la resina
utilizada; 12,5 ml de DCM por g de resina o 12,5 litros por kg)
durante 30 min. a 25ºC y después se lavó con DCM 2 veces (6,25 vol.
cada lavado) para eliminar cualquier residuo de NMP. La resina se
enfrió con el último lavado de DCM hasta -5ºC. El DCM se drenó y se
añadió una solución fría de TFA/DCM al 1% (10 vol. a entre -5ºC y
-10ºC) y se agitó durante 30 min. a 0ºC. Se añadió piridina (1,3
equiv. de TFA) al reactor para neutralizar el TFA. La solución de
escisión se separó por filtración y se recogió en un recipiente.
Mientras el recipiente se calentaba hasta 25ºC, la resina se lavó
con DCM 7 veces (7,5 vol.). Los lavados se combinaron con la
solución de escisión. La solución de escisión de DCM se combinó con
agua (7,5 vol.). La mezcla resultante se destiló bajo presión
reducida para eliminar el DCM (350 torr a 28ºC). El fragmento
peptídico se separó del agua por precipitación cuando se eliminó el
DCM. El fragmento se lavó con agua y se secó a
30ºC-35ºC al vacío. Se obtuvieron un total de 4,73 g
de
Fmoc-(Aib^{8})GLP-1(7-10)-OH.
Se preparó la resina de 2-CTC
cargada con Fmoc-Gly. Las cantidades de reactivos
utilizados se listan en la siguiente tabla:
La resina de 2-CTC se cargó en
un reactor peptídico de 500 mL y se expandió con 400 mL de DCM
durante 30 min. a 25ºC. La resina se drenó y se añadió una solución
de Fmoc-Gly-OH y DIEA en 8 volúmenes
de DMF: DCM (87,5:12,5). La mezcla se agitó bajo nitrógeno durante 2
horas a una temperatura de 25ºC.
El lecho de resina se drenó y se lavó una vez
con 400 mL de DMF y una vez con 200 mL de DMF. Posteriormente, los
sitios activos restantes en la resina de 2-CTC se
protegieron en el extremo con 390 mL de solución de MeOH: DIEA (9:1
en volumen) durante 1 hora. El lecho se drenó de nuevo, se lavó con
350 mL de DMF dos veces, y se lavó con 350 mL de DCM cuatro veces.
La resina se contrajo entonces mediante lavados con 3 X 350 mL de
IPA. La resina se secó a 35ºC al vacío hasta un peso constante para
proporcionar 48,51 g de resina cargada. El análisis mostró un
factor de carga de 0,54 mmol/g.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis en fase sólida se llevó a cabo
comenzando con 27,59 g de resina de 2-CTC cargada
con Fmoc-Gly a 0,54 mmol/g. La resina se expandió en
DCM (300 mL) durante 30 min. a 25ºC. El solvente de DCM se drenó y
la resina se lavó tres veces con NMP (5 vol. cada lavado).
La resina se trató luego dos veces con
piperidina al 20% en volumen en NMP (5 vol. cada tratamiento) para
eliminar los grupos protectores Fmoc. Tras el segundo tratamiento
con piperidina al 20%/NMP, la resina se lavó seis veces con NMP (5
vol. cada lavado) hasta una prueba de cloranilo negativa.
Para preparar la solución de acoplamiento, se
pesaron el aminoácido (1,7 equiv.) y el
6-cloro-1-hidroxibenzotriazol
(6-Cl-HOBT, 1,7 equiv.), se
disolvieron en 4,6 volúmenes de NMP y después se combinaron con DIEA
(1,9 equiv.) a entre 5ºC y 10ºC. El TBTU (1,7 equiv.) se disolvió
en 2,28 volúmenes de NMP a entre 5ºC y 10ºC. Entonces se combinaron
las dos soluciones. La solución resultante se añadió al recipiente
de reacción. El recipiente se enjuagó con los 2,28 volúmenes de DCM
añadidos al reactor, que se agitó entonces durante
2-3 horas a 25ºC-27ºC. Se extrajo
una muestra para un ensayo Kaiser para comprobar la finalización de
la reacción. Tras completar la reacción de acoplamiento, se drenó
la solución de acoplamiento y la resina se lavó con NMP 4 veces (5
vol. cada lavado). La eliminación del grupo Fmoc y el ciclo de
reacción de acoplamiento se repitieron para los restantes
aminoácidos del fragmento (es decir, en el orden
Glu(OtBu)\rightarrow Aib\rightarrow
His(trt)).
Todos los reactivos utilizados en este ejemplo
se listan en la siguiente tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
La resina obtenida se lavó con NMP (5 vol.) 6
veces y después con DCM (6 vol.) 8 veces para eliminar el residuo
de NMP. La resina se enfrió en el último lavado con DCM hasta -5ºC.
Después del drenaje de DCM, se añadió una solución fría (entre -5ºC
y -10ºC) de TFA al 1%/ DCM (10 vol.), y la mezcla resultante se
agitó durante 30 min. a 0ºC. Se cargó piridina (1,3 equiv., de TFA)
en el reactor para neutralizar el TFA. La solución de escisión se
recogió en el recipiente. Mientras el recipiente se calentaba hasta
25ºC, la resina se lavó con DCM (7,5 vol.) 11 veces y se añadió a
la solución de escisión. La solución de DCM se combinó con agua (10
vol.). La mezcla resultante se destiló bajo presión reducida para
eliminar el DCM (350 torr a 28ºC). El fragmento se separó del agua
por precipitación cuando se eliminó el DCM. El fragmento se lavó con
agua y se secó a 30ºC-35ºC al vacío. Se obtuvieron
un total de 11,12 g de Fmoc-(Aib^{8})GLP-1
(7-10)-OH (rendimiento del
78,8%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó la resina de 2-CTC
cargada con Fmoc-Gly. Las cantidades de reactivos
utilizados se listan en la siguiente tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
La resina de 2-CTC se cargó en
un reactor peptídico de 500 mL y se expandió con 400 mL de DCM
durante 30 min. El lecho se drenó y se añadió una solución de
Fmoc-Gly-OH y DIEA en 8 volúmenes de
DMF: DCM (87,5: 12,5). La mezcla se agitó bajo nitrógeno durante 2
horas a una temperatura de 25ºC.
El lecho se drenó y se lavó una vez con 400 mL
de DMF y una vez con 200 mL de DMF. Posteriormente, los sitios
activos restantes en la resina de 2-CTC se
protegieron en el extremo con 390 mL de solución de MeOH: DIEA
(9:1) durante 1 hora. El lecho se drenó, se lavó con 350 mL de DMF
dos veces y después con 350 mL de DCM cuatro veces. La resina se
contrajo entonces mediante lavados con 4 X 250 mL de IPA. La resina
se secó a 35ºC al vacío hasta un peso constante para proporcionar
52,02 g de resina cargada. El análisis mostró un factor de carga de
0,72 mmol/g.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis en fase sólida se llevó a cabo
comenzando con los 24,43 g de resina de 2-CTC
cargada con Fmoc-Gly a 0,72 mmol/g. La resina se
expandió en DCM (250 mL) durante 30 min. a 25ºC. El solvente de DCM
se drenó y la resina se lavó tres veces con NMP (5 vol. cada
lavado).
La resina se trató entonces dos veces con
piperidina al 20% en NMP (5 vol. cada tratamiento) para eliminar los
grupos protectores de Fmoc. Tras el segundo tratamiento con
piperidina al 20%/NMP, la resina se lavó seis veces con NMP (5 vol.
cada lavado) hasta una prueba de cloranilo negativa.
Para preparar la solución de acoplamiento, se
pesaron el aminoácido y el
6-cloro-1-hidroxibenzotriazol
(6-Cl-HOBT), se disolvieron en NMP
y después se combinaron con DIEA a 10ºC-5ºC. El TBTU
(1,7 equiv.) se disolvió en 2,28 volúmenes de NMP a entre 5ºC y
10ºC. Entonces se combinaron las dos soluciones. La solución
resultante se añadió al recipiente de reacción. El recipiente se
enjuagó con el DCM añadido al reactor (véanse las cantidades en la
siguiente tabla), que se agitó entonces durante 2-6
horas a 25ºC-27ºC. Se extrajo muestra para un ensayo
Kaiser para comprobar la finalización de la reacción. Si la
reacción de acoplamiento estaba incompleta tras 3 horas (ensayo
Kaiser positivo), el recipiente de reacción se drenaba y se
realizaba un reacoplamiento con una nueva solución de aminoácido
activado. Tras completar la reacción de acoplamiento, la solución de
acoplamiento se drenó y la resina se lavó con NMP 4 veces (5 vol.
cada lavado). La eliminación del grupo protector Fmoc y el ciclo de
reacción de acoplamiento se repitieron para los restantes
aminoácidos del fragmento (es decir, en el orden de
Glu(OtBu)\rightarrow Aib\rightarrow
His(trt)).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Todos los reactivos utilizados en este ejemplo
se listan en la siguiente tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La resina obtenida se lavó con NMP (5 vol.) 6
veces y después con DCM (6 vol.) 7 veces para eliminar la NMP. La
resina se enfrió con el último lavado de DCM hasta -5ºC. El DCM se
drenó y el lecho de la resina se lavó con una solución fría (entre
-5ºC y -10ºC) de TFA al 1%/DCM (11,26 vol.) durante 5 min. a 0ºC. La
solución de escisión se recogió en el recipiente, al que se le
había añadido piridina (1,3 equiv. de TFA total) para neutralizar el
TFA. Entonces, se añadió una segunda porción de TFA al 1%/DCM fría
(6,14 vol.) al reactor y se agitó durante 2 min. La segunda
solución de escisión se añadió de nuevo en el recipiente recolector.
Mientras el recipiente se calentaba hasta 25ºC, la resina se lavó
con DCM 9 veces (8,2 vol.) y se añadió a la solución de escisión. La
solución de DCM se combinó con agua (8,2 vol.). La mezcla
resultante se destiló bajo presión reducida para eliminar el DCM
(350 torr a 28ºC). El fragmento se separó del agua por
precipitación cuando se eliminó el DCM. El fragmento se lavó con
agua y se secó a 30ºC-35ºC al vacío. Se obtuvieron
un total de 14,02 g de
Fmoc-(Aib^{8})GLP-1(7-10)-OH
(rendimiento del 86,6%) de acuerdo con el Id. de Sec. Nº 7. El
análisis mostró una pureza del 94,3% AN.
Se preparó la resina de 2-CTC
cargada con Fmoc-Aib. Las cantidades de reactivos
utilizados se listan en la siguiente tabla:
La resina de 2-CTC se cargó en
un reactor peptídico de 500 mL y se expandió con 400 mL de DCM
durante 30 min. El lecho se drenó y se añadió una solución de
Fmoc-Aib-OH y DIEA en 8 volúmenes de
DMF: DCM (87,5:12,5). La mezcla se agitó bajo nitrógeno durante 2
horas a una temperatura de 25ºC.
El lecho se drenó y se lavó una vez con 400 mL
de DMF y otra con 200 mL. Posteriormente, los sitios activos
restantes en la resina de 2-CTC se protegieron en el
extremo con 400 mL de solución de MeOH: DIEA (9:1) durante 1 hora.
El lecho se drenó. La resina se lavó una vez con 450 mL de
DMF/MeOH/DIEA (4: 0,9: 0,1), una vez con 200 mL de DMF y después
cuatro veces con 350 mL de DCM. La resina se contrajo mediante
lavados con 3 x 350 mL de IPA. La resina se secó hasta peso
constante para proporcionar 45,15 g de resina cargada. El análisis
mostró un factor de carga de 0,24 mmol/g.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cargaron 10,01 g de resina de
CTC-2 con Fmoc-Aib con factor de
carga de 0,24 mmol/g en un recipiente de reacción y se expandieron
en DCM (120 mL) durante 30 min. a 25ºC. El solvente de DCM se drenó,
y la resina se lavó tres veces con NMP (6 vol. cada lavado).
La resina se trató entonces dos veces con
piperidina al 5% en NMP (6 vol. cada tratamiento) para eliminar los
grupos protectores Fmoc. Tras el segundo tratamiento con piperidina
al 5%/NMP, la resina se lavó cuatro veces con NMP (6 vol. cada
lavado).
Para preparar la solución de acoplamiento, se
disolvieron el aminoácido (1,875 equiv.) y
1-hidroxi-benzotriazol monohidrato
(HOBT hidrato, 2,07 equiv.) en 3,5 volúmenes de NMP a
5ºC-10ºC y después se combinaron con una solución
de 16,1 mL de HBTU (2,0 equiv.) en NMP (1,5 vol.). Después se
añadieron 2,2 ml de DIEA (2,63 equiv.) al recipiente de activación
a 10ºC-5ºC. La solución resultante se transfirió al
recipiente de reacción. El recipiente de activación se enjuagó con
1,5 volúmenes de DCM añadido al reactor, que se agitó entonces
durante 2 horas a 25ºC. El recipiente de reacción se drenó. La
reacción de acoplamiento se repitió una vez más con nueva solución
de aminoácido activado (1,875 equiv.). Tras completar la segunda
reacción de acoplamiento, la solución de acoplamiento se drenó y la
resina se lavó con NMP 4 veces (6 vol. cada lavado). Después, la
eliminación del grupo Fmoc y el ciclo de reacción de acoplamiento se
repitieron para los restantes aminoácidos en el fragmento (es decir,
en el orden de Lys(Boc)\rightarrow Val\rightarrow
Leu\rightarrow Trp(Boc)\rightarrow
Ala\rightarrow Ile\rightarrow Phe\rightarrow
Glu(OtBu)\rightarrow
Lys(Boc)\rightarrow Ala\rightarrow
Ala\rightarrow Gln(trt)).
Todos los reactivos utilizados en este ejemplo
se listan en la siguiente tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
La resina obtenida se aisló lavando 4 veces con
NMP (6 vol.), 4 veces con DCM (6 vol.) y 3 veces con isopropanol
(IPA, 6 vol.). La resina obtenida se secó a 35ºC al vacío. Se
obtuvieron 14,3 g de la resina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se expandieron 6,6 g de la resina obtenida en el
paso anterior en 10 volúmenes de DCM durante 30 min., y se enfrió
hasta -10ºC. El DCM se drenó y se añadió una solución fría de TFA al
1%/DCM (12 vol. a entre -5ºC y -10ºC) y se agitó durante 30 min. a
0ºC. La solución de escisión se recogió en un recipiente que
contenía piridina (2-3 equiv. de TFA). Mientras se
calentaba a 25ºC, la resina se agitó con TFA al 1%/ DCM (10 vol.)
durante 5 min. y se añadió piridina (2-3 equiv.).
Tras otros 5 minutos, se recogió la solución. La resina se lavó con
DCM 4 veces (10 vol.). Todos los lavados de DCM se combinaron con
agua (agua/DCM = 1/4). La mezcla resultante se destiló bajo presión
reducida para eliminar el DCM (350 torr a 28ºC). El fragmento se
separó del agua por precipitación cuando se eliminó el DCM. El
fragmento se lavó con agua y se secó a 30ºC-35ºC al
vacío. EL procedimiento de escisión se repitió una vez más. Se
obtuvieron un total de 2,36 g de Fmoc-(Aib^{35})
GLP-1(23-35)-OH
(rendimiento del 92%).
\newpage
Se preparó la resina de 2-CTC
cargada con Fmoc-Aib. Las cantidades de reactivos
utilizados se listan en la siguiente tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La resina de 2-CTC se cargó en
un reactor peptídico de 500 mL y se expandió con 400 mL de DCM
durante 30 min. El lecho se drenó y se añadió una solución de
Fmoc-Aib-OH y DIEA en 8 volúmenes de
DMF: DCM (87,5: 12,5). La mezcla se agitó bajo nitrógeno durante 2
horas a una temperatura de 25ºC.
El lecho se drenó y se lavó con 400 mL de DMF.
Posteriormente, cualquier sitio activo restante en la resina de
2-CTC se protegió en el extremo con 400 mL de
solución de MeOH: DIEA (9:1) durante 1 hora. El lecho se drenó, se
lavó una vez con 400 mL de DMF, una vez con 200 mL de DMF y cuatro
veces con 350 mL de DCM. La resina se contrajo mediante lavados con
3 x 350 mL de IPA. La resina se secó hasta peso constante para
proporcionar 45,32 g de resina cargada. El análisis mostró un
factor de carga de 0,30 mmol/g.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis en fase sólida se llevó a cabo
comenzando con 15,0 g de resina de CTC-2 con
Fmoc-Aib cargada a 0,24 mmol/g. La resina se
expandió en DCM (150 mL) durante 30 min. a 25ºC. El solvente de DCM
se drenó, y la resina se lavó dos veces con NMP DCM (6 vol. cada
lavado) y tres veces con NMP (6 vol. cada lavado).
La resina se trató entonces dos veces con
piperidina al 20% en NMP (6 vol. cada tratamiento) para eliminar los
grupos protectores Fmoc. Tras el segundo tratamiento con piperidina
al 20%/NMP, la resina se lavó seis veces con NMP (6 vol. cada
lavado) hasta un ensayo cloranilo negativo.
Para preparar la solución de acoplamiento, se
pesaron el aminoácido (1,7 equiv.) y el
6-cloro-1-hidroxibenzotriazol
(6-Cl-HOBT, 1,7 equiv.), se
disolvieron en 2,6 volúmenes de NMP a 10ºC-5ºC, y
después se combinaron con DIEA (de 1,9 a 3,0 equiv.). Se disolvió
TBTU o HBTU (1,7 equiv.) en 1,33 volúmenes de NMP a
10ºC-5ºC. Después se combinaron las dos soluciones.
La solución resultante se añadió a un recipiente de reacción. El
recipiente de mezclado se enjuagó con 1,33 volúmenes de DCM en el
reactor, que se agitó entonces con resina durante
2-3 horas a 25ºC-27ºC. Se extrajo
muestra para un ensayo Kaiser para comprobar la finalización de la
reacción. Si la reacción de acoplamiento estaba incompleta tras 3
horas (ensayo Kaiser positivo), el recipiente de reacción se
drenaba y se realizaba un re-acoplamiento con nueva
solución de aminoácido activado. Tras completar la reacción de
acoplamiento, la solución de acoplamiento se drenó y la resina se
lavó con NMP 4 veces (6 vol. cada lavado). Entonces, la eliminación
del grupo Fmoc y el ciclo de reacción de acoplamiento se repitió
para los restantes aminoácidos en el fragmento (es decir, en el
orden Lys(Boc)\rightarrow Val\rightarrow
Leu\rightarrow Trp(Boc)\rightarrow
Ala\rightarrow Ile\rightarrow Phe\rightarrow
Glu(OtBu)\rightarrow
Lys(Boc)\rightarrow Ala\rightarrow
Ala\rightarrow Gln(trt)).
Debido a un posible efecto de refuerzo entre la
2-metilalanina (Aib) y la resina de
2-CTC, es considerablemente difícil forzar hasta la
finalización las primeras dos reacciones de acoplamiento de
aminoácidos (Lys(Boc)-34 y
Val-33). Por lo tanto, ambas reacciones de
acoplamiento de (Lys(Boc)-34,
Val-33) se realizaron tres veces (es decir, tras el
acoplamiento se realizaron dos re-acoplamientos).
Además, se utilizó anhídrido acético para proteger el extremo del
material unido a la resina que no ha reaccionado tras las reacciones
de acoplamiento de Lys(Boc)-34 y
Val-33. Esto ha mejorado la eficiencia de las
posteriores purificaciones separando las impurezas del producto
deseado durante la purificación cromatográfica.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los reactivos utilizados en este ejemplo
se listan en la siguiente tabla:
La resina obtenida anteriormente se lavó con DCM
7 veces (6 vol. cada lavado) para eliminar el residuo de NMP, y la
resina se enfrió con el último lavado de DCM hasta -5ºC. El DCM se
drenó, y se añadió una solución fría de TFA al 1%/DCM (12 vol. a
entre -5ºC y -10ºC) y se agitó durante 30 min. a 0ºC. La solución de
escisión se recogió en un recipiente que contenía piridina (1,3
equiv. de TFA). Mientras el recipiente se calentó hasta 25ºC, la
resina se lavó con DCM 9 veces (10 vol.) y se añadió a la solución
de escisión. La solución de DCM se combinó con agua (6 vol.). La
mezcla resultante se destiló bajo presión reducida para eliminar el
DCM (350 torr a 28ºC). El fragmento se separó del agua por
precipitación cuando se eliminó el DCM. El fragmento se lavó con
agua y se secó a 30ºC-35ºC al vacío. En este ejemplo
el procedimiento de escisión se repitió una vez más. Se obtuvieron
un total de 6,78 g de Fmoc-(Aib^{35})
GLP-1(23-35)-OH
(rendimiento del 68,1%) con una pureza del 87,3% AN.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó la resina de 2-CTC
cargada con Fmoc-Aib. Las cantidades de reactivos
utilizados se listan en la siguiente tabla:
La resina de 2-CTC se cargó en
un reactor peptídico de 500 mL y se expandió con 400 mL de DCM
durante 30 min. El lecho se drenó y se añadió una solución de
Fmoc-Aib-OH y DIEA en 8 volúmenes de
DMF: DCM (87,5:12,5). La mezcla se agitó bajo nitrógeno durante 2
horas a una temperatura de 25ºC.
El lecho se drenó y se lavó con 400 mL de DMF.
Posteriormente, cualquier sitio activo restante en la resina
2-CTC se protegió en el extremo con 400 mL de
solución de MeOH: DIEA (9:1) durante 1 hora. El lecho se drenó, se
lavó una vez con 400 mL de DMF, una vez con 200 mL de DMF y cuatro
veces con 350 mL de DCM. La resina se contrajo mediante lavados con
3 x 350 mL de IPA. La resina se secó hasta peso constante para
proporcionar 47,56 g de resina cargada. El análisis mostró un
factor de carga de 0,37 mmol/g.
\newpage
La síntesis en fase sólida se llevó a cabo
comenzando con 25,0 g de resina de CTC-2 con
Fmoc-Aib cargada con 0,37 mmol/g. La resina se
expandió en DCM (250 mL) durante 30 min. a 25ºC. El solvente de DCM
se drenó, y la resina se lavó dos veces con DCM (6 vol. cada
lavado) y tres veces con NMP (6 vol. cada lavado).
La resina se trató luego dos veces con
piperidina al 20% en NMP (6 vol. cada tratamiento) para eliminar los
grupos protectores Fmoc. Tras el segundo tratamiento con piperidina
al 20%/NMP, la resina se lavó seis veces con NMP (6 vol. cada
lavado) hasta un ensayo cloranilo negativo.
Para preparar la solución de acoplamiento, se
pesaron el aminoácido y el
6-cloro-1-hidroxibenzotriazol
(6-Cl-HOBT), se disolvieron en 3,2
volúmenes de NMP (o DMF para Lys-34,
Val-33 y Gln-23) y después se
combinaron con DIEA a entre 10ºC y 5ºC. Se disolvió TBTU en 1,6
volúmenes de NMP (o DMF para Lys-34,
Val-33 y Gln-23) a
10ºC-5ºC. Después se combinaron las dos soluciones.
La solución resultante se añadió a un recipiente de reacción, y el
recipiente se enjuagó con 1,6 volúmenes de DCM en el reactor, que se
agitó entonces con la resina durante 2-3 horas a
entre 25ºC y 27ºC. Se extrajo muestra para un ensayo Kaiser para
comprobar la finalización de la reacción. Si la reacción de
acoplamiento estaba incompleta tras 3 horas (ensayo Kaiser
positivo), el recipiente de reacción se drenaba y se realizaba un
re-acoplamiento con nueva solución de aminoácido
activado. Tras completar la reacción de acoplamiento, la solución de
acoplamiento se drenó y la resina se lavó con NMP 4 veces (6 vol.
cada lavado). Entonces, la desprotección del grupo Fmoc y el ciclo
de reacción de acoplamiento se repitieron para los restantes
aminoácidos del fragmento (es decir, en el orden
Lys(Boc)\rightarrow Val\rightarrow
Leu\rightarrow Trp(Boc)\rightarrow
Ala\rightarrow Ile\rightarrow Phe\rightarrow
Glu(OtBu)\rightarrow
Lys(Boc)\rightarrow Ala\rightarrow
Ala\rightarrow Gln(trt)).
Debido a un posible efecto de refuerzo entre la
2-metilalanina (Aib) y la resina de
2-CTC, existe una dificultad considerable en forzar
hasta su finalización las primeras dos reacciones de acoplamiento de
aminoácidos (Lys(Boc)-34 y
Val-33). Las condiciones de acoplamiento de
(Lys(Boc)-34, Val-33) se
modificaron para aumentar la utilización de ambos aminoácidos y el
6-Cl-HOBT de 1,7 Equiv. a 2,5 Equiv.
y la DIEA de 1,9 Equiv. a 3,0 Equiv. El solvente para la reacción
de acoplamiento también se cambió de NMP a DMF para forzar la
finalización de la reacción de acoplamiento. Además, en este
ejemplo se utilizó anhídrido acético para proteger el extremo del
material unido a la resina que no ha reaccionado tras las reacciones
de acoplamiento de Lys(Boc)-34 y
Val-33. Esto ha mejorado la eficiencia de la
posterior purificación separando las impurezas del producto deseado
durante la purificación cromatográfica.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los reactivos utilizados en este ejemplo
se listan en la siguiente tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La resina obtenida anteriormente se lavó con DCM
6 veces (6 vol. cada lavado) para eliminar la NMP, y la resina se
enfrió con el último lavado de DCM a -5ºC. El DCM se drenó y se
añadió una solución fría de TFA al 1%/DCM (10 vol. a entre -5ºC y
-10ºC) y se agitó durante 30 min. a 0ºC. La solución de escisión se
recogió en un recipiente que contenía piridina (1,3 equiv. de TFA).
Mientras el recipiente se calentaba a 25ºC, la resina se lavó con
DCM 7 veces (6 vol.) y se añadió a la solución de escisión. La
solución de DCM se combinó con agua (10 vol.). La mezcla resultante
se destiló bajo presión reducida para eliminar el DCM (350 torr a
28ºC). El fragmento se separó del agua por precipitación cuando se
eliminó el DCM. El fragmento se lavó con agua y se secó a
30ºC-35ºC al vacío. En este ejemplo el
procedimiento de escisión se repitió una vez más para conseguir una
escisión completa. Se obtuvieron un total de 12,3 6 g de
Fmoc-(Aib^{35})
GLP-1(23-35)-OH
(rendimiento del 59,35%) con una pureza del 84,3% AN.
Empezando con la resina de
Fmoc-Gly-O-2-CTC
precargada (cargada de 0,18 a 0,65 mmol/g), o de
Fmoc-Aib-O-2-CTC
precargada (cargada de 0,25 a 0,65 mmol/g), se aplicó la química
estándar de Fmoc. La resina se expandió primero en 10 volúmenes de
DCM durante 30-60 min. Después se drenó el DCM y la
resina se lavó 3-5 veces (5 min. cada vez) con 10
volúmenes de NMP.
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando una resina lavada de acuerdo con la
Sección A de este Ejemplo 7, se logró la eliminación de Fmoc
mediante dos tratamientos con una solución \sim10x de piperidina
al 20% en NMP (v/v). Los tratamientos duraron 15-30
min. cada uno. La solución de piperidina/NMP se drenó tras cada
tratamiento. La resina se lavó entonces con NMP 4-5
veces (10 volúmenes, 5 min. cada uno).
Para preparar la solución de acoplamiento, se
pesaron el aminoácido protegido con Fmoc (AA) y el HOBt (a
1,5-2,0 equiv.), se disolvieron en 4 volúmenes de
NMP a 10ºC y se combinaron con DIEA (1,5-2,0
equiv.). Se disolvió HBTU (1,5-2,0 equiv) en 3
volúmenes de NMP a 10ºC. Las dos soluciones se combinaron y se
mezclaron con 3 volúmenes de DCM durante 1-2 min.
La solución resultante se añadió al recipiente de reacción y se
mezcló con la resina bajo agitación durante 1,5-5
horas. Se extrajo una muestra para el ensayo de Kaiser para
comprobar la finalización de la reacción. El acoplamiento
incompleto se re-acopló. Tras finalizar la reacción
de acoplamiento, la solución de acoplamiento se drenó y la resina
se lavó con NMP 5 veces (10 volúmenes, 5 min. cada uno).
\vskip1.000000\baselineskip
A. Siguiendo el procedimiento de síntesis
general, el fragmento
Fmoc-GLP-1(11-22)-2-CTC
con la secuencia nativa se construyó paso a paso utilizando el
mismo procedimiento de síntesis general, y se acopló un fragmento de
acuerdo con el Id. de Sec. Nº 7 con el fragmento
Fmoc-GLP-1(11-22)-2-CTC
resultante preparado en esta Sección A utilizando el procedimiento
de síntesis general.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Siguiendo el procedimiento de síntesis
general, el fragmento Fmoc-GLP-1
(11-22)-2-CTC se
construyó paso a paso. No obstante, las condiciones de eliminación
de Fmoc se cambiaron por una solución de piperidina al 10% y DBU al
2% en NMP (v/v) en lugar de piperidina al 20% en NMP (v/v). Además,
los tiempos de tratamiento en la posición de AA14
[Fmoc-Ser(tBu)-] y la posición de AA13
[Fmoc-Thr(tBu)-] se extendieron a 1,5 h para
finalizar la reacción. Utilizando el mismo procedimiento de
síntesis general, se acopló un fragmento de acuerdo con el Id. de
Sec. Nº 7 con el
Fmoc-GLP-1(11-22)-2-CTC
resultante utilizando el procedimiento de síntesis general.
\vskip1.000000\baselineskip
C. Siguiendo el procedimiento de síntesis
general, con la solución de eliminación de Fmoc de piperidina al
10% y DBU al 2% en NMP (v/v), se construyó el fragmento
Fmoc-(X^{17-18})
GLP-1(11-22)-2-CTC
paso a paso. Después se acopló el fragmento de acuerdo con el Id. de
Sec. Nº 7 con el Fmoc-(X^{17-18})
GLP-1(11-22)-2-CTC
resultante utilizando el procedimiento de síntesis general.
\vskip1.000000\baselineskip
D. Siguiendo el procedimiento de síntesis
general, se construyó el fragmento
Fmoc-(X^{17-18})
GLP-1(11-22)-2-CTC
paso a paso. Después se acopló el fragmento de acuerdo con el Id.
de Sec. Nº 7 con el Fmoc-(X^{17-18})
GLP-1(11-22)-2-CTC
resultante utilizando el procedimiento de síntesis general.
\vskip1.000000\baselineskip
E. Siguiendo el procedimiento de síntesis
general de la sección D anterior, y con la excepción de las
diferencias descritas en la siguiente tabla, se construyó un
fragmento Fmoc-(X^{17-18})
GLP-1(11-22)-2-CTC
paso a paso. Después se acopló el fragmento de acuerdo con el Id.
de Sec. Nº 7 al fragmento Fmoc-(X^{17-18})
GLP-1(11-22)-2-CTC
resultante utilizando el procedimiento de síntesis general.
\newpage
La siguiente tabla resume los detalles de los
procedimientos de A a E de este Ejemplo:
\vskip1.000000\baselineskip
Para lograr la escisión de fragmento con
respecto a cualquiera de los fragmentos peptídicos sintetizados en
este Ejemplo, la resina de péptido obtenida se expande en 10
volúmenes de DCM durante 30 min. y se enfría hasta -10ºC. El DCM se
drena y se añade una solución de TFA al 1%/DCM (10 volúmenes) y se
agita durante 30 min. La solución de escisión se recoge en un
recipiente que contiene piridina (2-3 equiv. en
relación a TFA). Mientras se calienta a 25ºC, la resina se trata
con TFA al 1%/DCM (10 volúmenes) durante 5 min., y después se añade
piridina (2-3 equiv. a TFA). Tras otros 5 min. de
agitación, se recoge la solución. La resina se lava entonces 4
veces con 10 volúmenes de DCM (5 min. cada uno). Las soluciones de
todos los lavados y de la escisión se combinan y se mezclan con agua
(proporción de agua/DCM = \sim1/4 en volumen). La mezcla
resultante se destila a una presión reducida para eliminar el DCM
(350 torr/28ºC). El fragmento peptídico se separó del agua por
precipitación cuando se elimina el DCM, y se filtra. El fragmento
peptídico se lava con agua y se seca a 30ºC al vacío.
\vskip1.000000\baselineskip
Un fragmento (Aib^{35})
GLP-1(23-35) (que lleva
protección de la cadena lateral de acuerdo con la Tabla A y es
portador de protección Fmoc en N-terminal (9,11 g,
3,94 mmol) se disolvió en DMSO (90 mL). A esta solución, se
añadieron HOBt (2,42 g, 4 equiv.), HBTU (5,98 g, 4 equiv.), DIEA
(3,44 mL, 5 equiv.) y H-Arg
(2HCl)-NH2 (3,88 g, 4 equiv.) junto con 10 mL de
DMSO. La reacción se agitó y se monitorizó mediante HPLC. Tras 4
horas, la reacción no había finalizado, por lo que se añadieron 2 mL
de DIEA. La reacción se dejó toda la noche. Posteriormente se
añadió piperidina (5 mL) a la mezcla de reacción. La eliminación de
Fmoc se realizó en 2 horas. La mezcla de reacción se paró con agua
helada (800 mL) y se agitó durante 40 min. El sólido blanco formado
se filtró, se lavó con agua (400 mL) y se secó durante toda la noche
para proporcionar el fragmento (Aib^{35})
GLP-1(23-36) (9,65 g,
rendimiento en peso del 109%).
El fragmento (Aib^{8},
X^{17-18})
GLP-1(7-22) (7,73 g, 2,88
mmol) que contiene grupos de protección de las cadenas laterales de
acuerdo con la Tabla A y protección Fmoc en el extremo
N-terminal se disolvió en DMSO (65 mL).
A esta solución, se le añadieron HOBt (0,73 g,
4,77 mmol), HBTU (1,46 g, 3,85 mmol), DIEA (0,71 mL, 7,40 mmol), y
el fragmento (Aib^{35})
GLP-1(23-36) (8,5 g, 3,45
mmol) junto con 20 mL de DMSO. La reacción se agitó y monitorizó
mediante HPLC. Tras 3 horas el acoplamiento se había completado.
Entonces se añadió piperidina (5 mL) a la mezcla de reacción. La
eliminación de Fmoc se realizó en 2 horas. La mezcla de reacción se
detuvo con agua helada (800 mL) y se agitó durante 30 min. El sólido
blanco formado se filtró, se lavó con agua (400 mL) y se secó
durante toda la noche par dar lugar al péptido protegido (Aib^{8},
X^{17-18}; Aib^{35})
GLP-1(7-36).
\vskip1.000000\baselineskip
Un péptido preparado de acuerdo con el Ejemplo 9
(16,24 g) se trató con una solución de TFA/DTT/Agua (100 mL/5 g/2,0
mL) durante 2 horas y la solución resultante se vertió en MTBE (800
mL) en un baño de hielo. Tras 30 min. en agitación, el sólido blanco
formado se filtró, se lavó con MTBE (400 mL) y se secó para
proporcionar el producto peptídico crudo (16,0 g, rendimiento en
peso del 138%). El péptido desprotegido resultante se denomina a
partir de este momento péptido "crudo".
\vskip1.000000\baselineskip
La purificación del péptido crudo se realizó en
un Kromasil® C4, columna de 10 micras, 2,0 x 25 cm y resultó en
péptido purificado con una pureza del 98+% y un rendimiento del
\sim60% contenido/contenido. La purificación involucra un primer
paso de purificación cromatográfica a pH 2, seguida de un segundo
paso a pH 9. Tras esta purificación, el péptido purificado puede
manipularse o procesarse posteriormente de varias formas. Por
ejemplo, la colección purificada resultante del segundo paso puede
liofilizarse o pasarse a través de una columna de concentración y
aislarse por precipitación. Ambos aislamientos darán lugar al
péptido deseado (acetato).
Como resumen del proceso de dos pasos, se
disolvió péptido crudo a 5 mg/ml (en base a contenido) en una
mezcla de acetonitrilo 10%/agua (ácido acético 0,2 M). Se realizaron
inyecciones replicadas de 1000 mg (en base a contenido) utilizando
un gradiente de acetonitrilo/THF/agua/TFA, y se agruparon las
fracciones de una pureza de \sim95%. También se agrupó una
"fracción reciclada" a una pureza de \sim70% que representa
una recuperación del \sim34%. La fracción reciclada se
re-inyectó utilizando el mismo gradiente de
acetonitrilo/THF/agua/TFA, y una colección de una pureza del
\sim85% se combinó con la colección principal. El rendimiento de
contenido a contenido para el primer paso de purificación
cromatográfica es del 70%.
La colección combinada del primer paso (pH 2) se
purificó entonces posteriormente en un segundo paso en la misma
columna Kromasil® C4 pero utilizando un gradiente de
acetonitrilo/THF/agua/acetato amónico (pH 8,8). Las fracciones se
combinaron para dar lugar a una pureza del 98+% con una recuperación
del \sim85% en el segundo paso. El rendimiento global de ambos
pasos de purificación será del 60% (contenido/contenido).
La colección del segundo paso combinada (pH 8,8)
se concentró entonces utilizando la misma columna Kromasil® C4 pero
utilizando un paso de gradiente de metanol/agua/acetato amónico. Las
fracciones se combinaron y estaban listas para su aislamiento.
8 g de péptido crudo se disolvieron en 500 ml de
una solución de ácido acético 0,2N 90%/acetonitrilo 10%. La
solución se filtró, una vez a través de un filtro de 0,45 micras
Durapore (diámetro 47 mm) (Millipore) y luego a través de un filtro
apilador de micra en disco Supor EKV (0,65/ diámetro 0,2 mm) (Pall
Filters). La solución de inyección cruda se analizó mediante HPLC y
se encontró que contenía 5,02 mg (% peso) de péptido contenido por
ml. (500 ml x 5,02 mg/ml = 2512 mg péptido contenido).
Se realizaron cuatro inyecciones replicadas con
la solución cruda bajo las siguientes condiciones:
Columna: Fabricada por Kromasil con un
empaquetamiento de C4, 10 micras y las dimensiones 2,0 x 25 cm
Detector: Detector de ultravioleta fijado a 280
nm (ancho de banda 8 nm, 350/20 nm ref.)
Temperatura de la columna: ambiente
Tasa de flujo: 13,0 ml/min. (contrapresión
\sim50 bar)
Fase móvil:
A = mezcla de ácido trifluoroacético
0,1%/acetonitrilo 15% agua 85%
B = mezcla de ácido trifluoroacético
0,1%/tetrahidrofurano 15%/acetonitrilo 70%/agua 15%
Gradiente: El gradiente empieza con la fase
móvil A 100% y se mantiene durante 0,1 minutos. Entonces la muestra
se carga manualmente en la columna mediante la bomba C (véase a
continuación la descripción de la bomba C). Tras la carga de la
muestra, se realiza un gradiente lineal de A 100% a A 83% durante 1
minuto. Entonces la fase móvil se mantiene con A 83% durante los
próximos 11 minutos. Luego se realiza un segundo gradiente lineal
con A 73% durante 10 minutos. Entonces la fase móvil se mantiene con
A 73% durante los siguientes 15 minutos. Entonces se ha completado
el proceso y se continúa con un aclarado de 10 minutos con B 100%
seguido de un re-equilibrado de la columna de 20
minutos con A 100%.
La muestra se cargó utilizando una bomba
isocrática HP 1100 separada a 9,0 ml/min. (bomba C). Las impurezas
eluídas inicialmente se separan del pico principal mediante un
mantenimiento isocrático inicial de 11 minutos con A 83% seguido de
un gradiente lineal con A 73% durante los siguientes 10 minutos. El
pico de péptido principal se eluye entonces durante el
mantenimiento de 15 minutos con A 73%. Las fracciones se agrupan
durante este mantenimiento de 15 minutos con A 73%.
\vskip1.000000\baselineskip
La colección reciclada se obtiene de las
fracciones en las que se ha determinado que tiene una pureza
inferior a la que permite añadirlas a la colección combinada. Estas
fracciones se combinaron de forma separada y se diluyeron con un
volumen igual de agua. Se realizó una inyección de reciclado de
nuevo en la columna a partir de esta colección combinada de forma
separada. Se utilizaron las mismas condiciones cromatográficas y
las fracciones con una pureza aceptable se combinaron, se diluyeron
con un volumen igual de agua, y se añadieron a la colección
combinada del primer paso.
La carga con inyecciones de reciclado es
significativamente inferior que con inyecciones crudas debido al
aumento de impurezas que se eluyen cerca del pico del péptido. De
promedio se realiza una inyección de reciclado por cada dos
inyecciones crudas.
\vskip1.000000\baselineskip
La colección combinada final del primer paso se
purificó posteriormente mediante la re-cromatografía
a pH 8,8. Utilizando el pH 8,8 en el segundo paso cambia
significativamente el orden de elución de las impurezas, lo que
permite una mayor limpieza en recuperaciones superiores. Las
condiciones utilizadas para este segundo paso de cromatografía
fueron las siguientes:
Columna: Fabricada por Kromasil con un
empaquetamiento de C4, 10 micras y las dimensiones 2,0 x 25 cm
Detector: Detector de ultravioleta fijado a 280
nm (ancho de banda 8 nm, 350/20 nm ref.)
Temperatura de la columna: ambiente
Tasa de flujo: 13,0 ml/min. (contrapresión
\sim50 bar)
Fase móvil:
A = mezcla de acetonitrilo 15%/agua 85% que
contiene 2 gramos por litro de acetato amónico y 1 mL por litro de
hidróxido amónico concentrado
B = mezcla de tetrahidrofurano 15%/acetonitrilo
60%/agua 25% que contiene 2 gramos por litro de acetato amónico y 1
mL por litro de hidróxido amónico concentrado.
Gradiente: El gradiente empieza con la fase
móvil A 100% y se mantiene durante 0,1 minutos. Entonces la muestra
se carga manualmente en la columna mediante la bomba C. Tras la
carga de la muestra, se realiza un gradiente lineal de A 100% a A
67% durante 2 minutos. Entonces la fase móvil se mantiene con A 67%
durante los próximos 33 minutos. Entonces se ha completado el
proceso y se continúa con un aclarado de 5 minutos con B 100%
seguido de un re-equilibrado de la columna de 15
minutos con A 100%.
La muestra se cargó utilizando una bomba
isocrática HP 1100 separada a 9,0 ml/min. (bomba C). Tras los 30
minutos del paso de carga, se realizó un gradiente corto con A 100%
a A 67% de los 30,2 a 32 min. El pico de péptido principal se eluyó
durante el mantenimiento de 33 minutos con A 67%. Las fracciones se
recogieron a partir de los 20 minutos tras la carga de la columna y
finalizó después de la completa elución del pico principal. Las
fracciones se recogieron durante aproximadamente 15 minutos. Las
fracciones aceptables se agruparon y diluyeron con un volumen igual
de agua. En esta etapa de la purificación es posible un reciclado
pero las fracciones descartadas generalmente no contienen suficiente
péptido para garantizar una inyección de reciclado. Esto puede ser
factible si se realizan un gran número de inyecciones y se agrupan
las fracciones descartadas para el reciclado.
La colección combinada final del segundo paso se
cargó en la misma columna y se eluyeron rápidamente utilizando una
fase móvil diferente para concentrar el péptido para su aislamiento.
Las condiciones utilizadas para este paso fueron las siguientes:
Columna: Fabricada por Kromasil con un
empaquetamiento de C4, 10 micras y las dimensiones 2,0 x 25 cm
Detector: Detector de ultravioleta fijado a 280
nm (ancho de banda 8 nm, 350/20 nm ref.)
Temperatura de la columna: ambiente
Tasa de flujo: 13,0 ml/min. (contrapresión
\sim50 bar)
Fase móvil:
A = mezcla de metanol 10%/acetato amónico 20 mM
90%
B = mezcla de metanol 90%/acetato amónico 20 mM
10%
Gradiente: El gradiente empieza con la fase
móvil A 100% y se mantiene durante 0,1 minutos. Entonces la muestra
se carga manualmente en la columna mediante la bomba C. Tras la
carga de la muestra, la fase móvil se mantiene con A 100% durante 5
minutos. Entonces la fase móvil se cambia inmediatamente a B 100%
durante los próximos 20 minutos. Entonces se ha completado el
proceso y se continúa con un reequilibrado de la columna de 15
minutos con A 100%.
La muestra se cargó utilizando una bomba
isocrática HP 1100 separada a 9,0 ml/min. (bomba C). Tras los 45
minutos del paso de carga, se realizó un mantenimiento corto con A
100% durante 5 minutos, luego se realizó un paso de gradiente con B
100% durante 20 minutos para eluir el péptido. El pico de péptido
principal empezó a eluirse 2 minutos tras el gradiente con B 100%.
Los siguientes 12 minutos de fracciones contenían péptido y se
agruparon para su aislamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se taró una botella de 1 litro de boca ancha de
FLPE. A esta botella se le añadió la colección purificada (210 ml)
de acetato de (Aib^{8}, X^{17-18} Aib^{35})
GLP-1(7-36) en acetonitrilo
acuoso/acetato amónico. El contenedor se enjuagó con agua
desionizada 3 x 5 mL y los enjuagues se añadieron a la colección.
Esta solución se agitó para homogeneizarla y luego se tapó y se
congeló en nitrógeno líquido. La botella congelada se destapó y la
boca se cubrió con un Kimwipe doblado sujeto con una banda de goma.
La botella se situó en un vacutainer en el liofilizador y se
liofilizó. Temperatura del condensador -89ºC, presión 19 micras.
Después de 24 h el vacutainer se aireó para
comprobar el progreso; aún había una bola de hielo audible presente.
Se reinició la liofilización.
Después de 18 h más la botella se extrajo del
liofilizador y se comprobó el peso. El peso fue inestable, con un
rápido aumento debido a la naturaleza higroscópica del producto. El
producto estático se transfirió rápidamente a un vial de centelleo
tarado y se pesó, se obtuvieron 0,822 g de péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
En un recipiente, una solución de 100,5 mg de
acetato de (Aib^{8}, X^{17-18}, Aib^{35})
GLP-1 (7-36) puro en 2 mL de
acetato amónico 20 mM en MeOH/agua (9:1 en volumen) se diluyó con 1
mL de acetato amónico 20 mM en MeOH/agua (9:1 en volumen) Con
agitación, se añadieron lentamente 20 mL de isopropanol (IPA) al
recipiente a entre 20ºC y 25ºC. Esta mezcla se puso turbia tras la
adición de 15 mL de IPA. La agitación continuó durante toda la
noche a entre 20ºC y 25ºC. El producto precipitado se filtró y se
lavó mediante 5 mL de IPA y luego se secó a 25ºC bajo vacío hasta
un peso constante. Se obtuvieron 90,9 mg de péptido (una
recuperación del 90,42%).
\vskip1.000000\baselineskip
En un recipiente, una solución de 497,7 mg de
acetato de (Aib^{8}, X^{17-18}, Aib^{35})
GLP-1 (7-36) puro en 10 mL de
acetato amónico 20 mM en MeOH/agua (9:1) se diluyó con 6 mL de
acetato amónico 20 mM en MeOH/agua (9:1). Con agitación, 40 mL
isopropanol (IPA) se añadieron lentamente en el recipiente a entre
20ºC y 25ºC durante 35 min. Esta mezcla se puso turbia tras la
adición de 2 mL de IPA. La agitación continuó durante una hora a
entre 20ºC y 25ºC. El producto precipitado se filtró y se lavó
mediante 5 mL de IPA y luego se secó a 25ºC bajo vacío hasta un
peso constante. Se obtuvieron 458,4 mg de péptido (una recuperación
del 92%).
\vskip1.000000\baselineskip
En un recipiente, se añadieron lentamente 900 mL
de IPA en una solución en agitación de \sim1000 mg de acetato de
(Aib^{8}, X^{17-18}, Aib^{35})
GLP-1 (7-36) purificado en 150 mL de
acetato amónico 20 mM en MeOH/ agua (9:1) a través de una columna
de concentración a entre 20ºC y 25ºC. Esta addición se completó a
los 45 min. Esta mezcla se puso turbia tras la adición de 260 mL de
IPA. La agitación continuó durante 40 min a entre 20ºC y 25ºC. El
producto precipitado se filtró y se lavó mediante 5 mL de IPA y
luego se secó a entre 20ºC y 25ºC bajo vacío hasta un peso
constante. Se obtuvieron 746 mg de péptido (una recuperación del
74,6%).
<110> F. Hoffmann-La Roche
AG
\hskip1cm Roberts, Christopher R.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> SÍNTESIS DE UN PÉPTIDO
INSULINOTRÓPICO UTILIZANDO UNA COMBINACIÓN DE TÉCNICAS EN FASE
SÓLIDA Y EN SOLUCIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Caso 23831
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/815,919
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<151>
2006-06-23
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<160> 13
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<170> PatentIn versión 3.4
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<210> 1
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<211> 37
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
\hskip0,6cm30
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<210> 2
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<211> 31
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 2
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 30
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> fragmento peptídico químicamente
sintetizado
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<222> (2)..(2)
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<223> Xaa es Aib
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<222> (29)..(29)
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<223> Xaa es Aib
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Fragmento peptídico químicamente
sintetizado
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<220>
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<222> (2)..(2)
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<223> Xaa es un aminoácido aquiral
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<222> (4)..(4)
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<223> Xaa es un aminoácido aquiral
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<222> (29)..(29)
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<223> Xaa es un aminoácido aquiral
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Fragmento peptídico químicamente
sintetizado
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<222> (4)..(4)
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<223> Xaa es un aminoácido aquiral
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<400> 6
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Fragmento peptídico químicamente
sintetizado
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<222> (2)..(2)
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<223> Xaa es Aib
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Fragmento peptídico químicamente
sintetizado
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<220>
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<222> (7)..(7)
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<223> Xaa es un aminoácido de un
dipéptido de pseudoprolina (residuos 7-8)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es un aminoácido de un
dipéptido de pseudoprolina (residuos 7-8)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 8
\hskip0,6cm37
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 13
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<212> PRT
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<220>
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<223> Fragmento peptídico químicamente
sintetizado
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<220>
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<222> (13)..(13)
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<223> Xaa es un aminoácido aquiral
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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<210> 10
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<211> 13
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<213> Secuencia artificial
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<223> Fragmento peptídico químicamente
sintetizado
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<222> (13)..(13)
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<223> Xaa es Aib
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Fragmento peptídico químicamente
sintetizado
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<222> (2)..(2)
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<223> Xaa es un aminoácido aquiral
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<222> (4)..(4)
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<223> Xaa es un aminoácido aquiral
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<220>
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<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es un aminoácido de un
dipéptido de pseudoprolina (residuos 11-12)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es un aminoácido de un
dipéptido de pseudoprolina (residuos 11-12)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Fragmento peptídico químicamente
sintetizado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<222> (13)..(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es un aminoácido aquiral
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<400> 12
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<210> 13
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<211> 30
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento peptídico químicamente
sintetizado
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<222> (2)..(2)
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<223> Xaa es un aminoácido aquiral
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
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<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es un aminoácido aquiral
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es un aminoácido de un
dipéptido de pseudoprolina (residuos 11-12)
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es un aminoácido de un
dipéptido de pseudoprolina (residuos 11-12)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (29)..(29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es un aminoácido aquiral
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
Claims (19)
1. Un método para obtener un péptido
insulinotrópico,
que comprende los siguientes pasos de a) a
f):
a) proporcionar un primer fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos HX^{8}EX^{10} (Id. de
Sec. Nº 6), en la que X^{8} y X^{10} son cada uno residuos de un
aminoácido aquiral, incluyendo opcionalmente cada uno de H y E la
protección de la cadena lateral;
b) proporcionar un segundo fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos
TFTSDVX^{17-18}YLEG (Id. de Sec. Nº 8) en la que
el residuo denotado mediante el símbolo X^{17-18}
es un residuo dipeptídico de pseudoprolina, incluyendo
opcionalmente dichos residuos de aminoácidos de la secuencia la
protección de la cadena
lateral;
lateral;
c) acoplar el primer fragmento al segundo
fragmento para proporcionar un tercer fragmento peptídico que
incluye la secuencia de aminoácidos
HX^{8}EX^{10}TFTSDVX^{17-18}YLEG (Id. de Sec.
Nº 11), incluyendo opcionalmente dichos residuos de aminoácidos de
la secuencia la protección de la cadena lateral;
d) proporcionar un cuarto fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX^{35} (Id.
de Sec. Nº 9), en el que X^{35} es un residuo de un aminoácido
aquiral, incluyendo opcionalmente dichos residuos de aminoácidos de
la secuencia la protección de la cadena lateral;
e) acoplar el cuarto fragmento peptídico a
arginina para proporcionar un quinto fragmento peptídico que
incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX^{35}R (Id. de
Sec. Nº 12), incluyendo opcionalmente dichos residuos de la
secuencia la protección de la cadena lateral; y
f) acoplar el quinto fragmento al tercer
fragmento para proporcionar un péptido insulinotrópico que incluye
la secuencia de aminoácidos
HX^{8}EX^{10}TFTSDVX^{17-18}YLEGQAAKEFIAWLVK
X^{35}R (Id. de Sec. Nº 13), incluyendo opcionalmente dichos
residuos de la secuencia la protección de la cadena lateral.
2. El método de acuerdo con las reivindicación
1, que comprende otro paso de:
g) eliminar los grupos protectores de la cadena
lateral para proporcionar un péptido insulinotrópico que incluye la
secuencia de aminoácidos
HX^{8}EX^{10}TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX^{35}R (Id. de Sec. Nº
5) y los homólogos de la misma, en la que cada uno de los símbolos
X en las posiciones, 8, 10 y 35 independientemente indican un
residuo de aminoácido aquiral, opcionalmente obstaculizado
estéricamente.
3. Un método para obtener un péptido
insulinotrópico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende
los pasos de:
a) proporcionar un primer fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos HX^{8}EX^{10} (Id. de
Sec. Nº 6), en los que X^{8} es un residuo de aminoácido que
corresponde a Aib y X^{10} es un residuo de aminoácido que
corresponde a glicina, e incluyendo opcionalmente cada uno de H y E
la protección de la cadena lateral;
b) proporcionar un segundo fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos
TFTSDVX^{17-18}YLEG (Id. de Sec. Nº 8) en la que
el residuo denotado mediante el símbolo X^{17-18}
es un residuo dipeptídico de pseudoprolina, incluyendo
opcionalmente dichos residuos de aminoácido de la secuencia la
protección de la cadena
lateral;
lateral;
c) acoplar el primer fragmento al segundo
fragmento para proporcionar un tercer fragmento peptídico que
incluye la secuencia de aminoácidos HX^{8}EX^{10} TFTSDV
X^{17-18}YLEG (Id. de Sec. Nº 11), incluyendo
opcionalmente dichos residuos de aminoácido de la secuencia la
protección de la cadena lateral;
d) proporcionar un cuarto fragmento peptídico
que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX^{35} (Id.
de Sec. Nº 9), en los que X^{35} es un residuo de aminoácido que
corresponde a Aib, incluyendo opcionalmente dichos residuos de
aminoácido de la secuencia la protección de la cadena lateral;
e) acoplar el cuarto fragmento peptídico a
arginina para proporcionar un quinto fragmento peptídico que
incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX^{35}R (Id. de
Sec. Nº 12), incluyendo opcionalmente dichos residuos de la
secuencia la protección de la cadena lateral; y
f) acoplar el quinto fragmento al tercer
fragmento seguido de la eliminación de los grupos protectores de la
cadena lateral para proporcionar un péptido insulinotrópico de
fórmula HX^{8}EX^{10}TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX^{35}R (Id. de
Sec. Nº 5) y los homólogos de la misma, en la que X^{8} y X^{35}
son residuos de aminoácido que corresponden a Aib, y X^{10} es un
residuo de aminoácido que corresponde a glicina.
4. El método de acuerdo con las reivindicaciones
1 o 3, en el que X^{8} es un residuo de aminoácido que
corresponde a metilalanina.
5. El método de acuerdo con las reivindicaciones
1 o 3, en el que X^{10} es un residuo de aminoácido que
corresponde a glicina.
6. Un fragmento peptídico con la secuencia de
aminoácidos HX^{8}EX^{10} (Id. de Sec. Nº 6), en el que X^{8}
y X^{10} son cada uno residuos de un aminoácido aquiral, tanto H
como E, X^{8} y X^{10} incluyen opcionalmente la protección de
la cadena lateral.
7. El fragmento peptídico de la reivindicación
6, en el que X^{8} es un residuo de aminoácido que corresponde a
Aib y X^{10} es un residuo de aminoácido que corresponde a
glicina.
8. El método de acuerdo con reivindicación 1, en
el que el péptido insulinotrópico incluye la secuencia de
aminoácidos (Id. de Sec. Nº 5)
HX^{8}EX^{10}TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWKVKX^{35}R
y los homólogos de la misma, en la
cada uno de los símbolos X en las posiciones 8, 10 y 35 indican de
forma independiente un residuo de aminoácido aquiral, opcionalmente
obstaculizado estéricamente; y en la que uno o más de los residuos
de aminoácido incluye opcionalmente la protección de la cadena
lateral.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8,
en el que al menos uno de entre X^{8} y X^{35} es un residuo
de Aib.
10. El método de acuerdo con la reivindicación
8, en el que X^{10} es un residuo de glicina.
11. El método de acuerdo con la reivindicación
1, en el que X^{17-18} tiene la fórmula
en la que \Phi representa el
residuo de cualquier aminoácido que opcionalmente incluye protección
de la cadena lateral, y cada uno de R^{1} y R^{2} es
independientemente una porción de unión divalente
adecuada.
12. El método de acuerdo con la reivindicación
11, en el que \Phi representa un residuo de Ser que incluye
opcionalmente la protección de la cadena lateral.
13. El método de acuerdo con la reivindicación
11, en el que R^{2} es -CH_{2}-.
14. El método de acuerdo con la reivindicación
11, en el que R^{1} es
en donde cada uno de R^{3} y
R^{4} es independientemente una porción monovalente seleccionada
de entre H o alquilo inferior; o R^{3} y R^{4} pueden ser
también co-miembros de una estructura en
anillo.
15. El método de acuerdo con la reivindicación
14, en el que cada uno de R^{3} y R^{4} es metilo.
16. Un péptido o un homólogo del mismo que
incluye la secuencia de aminoácidos
TFTSDVX^{17-18}YLEG (Id. de Sec. Nº 8) en la que
el residuo denotado mediante el símbolo X^{17-18}
es un residuo dipeptídico de pseudoprolina; incluyendo
opcionalmente dichos residuos de aminoácidos la protección de la
cadena lateral.
17. El método de acuerdo con la reivindicación
1, en el que X^{35} es un residuo de aminoácido de
metilalanina.
18. El método de acuerdo con las
reivindicaciones de 1 a 2, en el que el péptido insulinotrópico
posee la secuencia de aminoácidos (Id. de Sec. Nº 4)
HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR
y homólogos de la
misma.
19. El método de acuerdo con la reivindicación
18, en el que el péptido insulinotrópico posee la secuencia de
aminoácidos (Id. de Sec. Nº 4)
HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR
y homólogos de la misma, que está
amidada en el extremo
C-terminal.
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