TWI738260B - 純化利拉魯肽之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供經改良的純化利拉魯肽之方法。純化利拉魯肽包含兩階段RP-HPLC純化步驟及一鹽交換步驟，其中pH值於第一次及第二次純化步驟中維持恆定。具體而言，前述方法於樣品製備步驟中使用一鹵化溶劑，該溶劑具備較佳溶解度，且可提供適合利拉魯肽粗肽於RP-HPLC純化前脫羧的環境。

Description

純化利拉魯肽之方法
本發明提供經改良的純化利拉魯肽之方法。純化利拉魯肽包含兩階段RP-HPLC純化步驟及一鹽交換步驟，其中pH值於第一次及第二次純化步驟中維持恆定。本申請案主張2019年3月25日提交的美國專利臨時申請案第62/823,147號之權利，該臨時申請案全文內容以引用方式併入本文中。與本申請案相關的序列表，係以文字檔形式取代紙本形式提供，並以引用方式併入本說明書中。
利拉魯肽（商品名胰妥善(Victoza)），係一人源GLP-1的類似物，可作為GLP-1受體促進劑。利拉魯肽為一種飲食和運動添加劑，可改善第2型糖尿病成年患者體內的血糖控制。利拉魯肽包含具有如SEQ ID NO：1的胜肽，以精胺酸取代該胜肽34號位置的離胺酸進行改造後，使該肽與人源GLP-1具有97%的相似性。利拉魯肽進一步由前述改造後的胜肽衍生，其方法為利用一麩胺酸間隔基附加一C-16脂肪酸（棕櫚酸）於26號位置的離胺酸殘基上。由此，基於人源GLP-1改造的前述利拉魯肽，其結構如下所示：
Figure 02_image001
利拉魯肽的分子式為C172 H265 N43 O51 ，分子量為3751.2道爾頓，最初由Novo Nordisk公司開發，於2010年1月經美國食品及藥物管理局（FDA）核准上市，商品名為Victoza。
美國專利公開號2015/0051372 A1揭露一種三步驟方法，用於純化固相合成的利拉魯肽粗肽，包含樣品處理並使用反相高效液相層析法（RP-HPLC）進行三次純化。於樣品處理步驟中，將利拉魯肽粗肽溶於乙腈和水的混合物中（如體積百分比20%的乙腈/80%的水）。將所製備的樣品經第一次RP-HPLC純化，其中流動相A（MPA）為0.1%TFA / 異丙醇 / 水；流動相B（MPB）為0.1%TFA / 乙腈；固定相為辛基矽烷鍵合矽膠；梯度為線性梯度。對第一次純化所得的組份進行第二次RP-HPLC純化，其中MPA為水中含0.05-0.15%過氯酸；MPB為乙腈中含0.05-0.15%過氯酸；固定相為氰基矽烷鍵合矽膠；梯度為線性梯度。最後，對純化後的利拉魯肽進行第三次RP-HPLC純化以脫鹽，其中MPA為0.05%氨水溶液；MPB為乙腈；固定相為辛基矽烷鍵合矽膠；梯度為線性梯度。
美國專利第9,422,330 B2號揭露一種純化透過酵母菌發酵製備的利拉魯肽粗肽的方法。如美國專利第9,422,330號的實例6所述，以水稀釋利拉魯肽粗肽並以RP-HPLC純化，其中固定相為十八烷基-二甲基矽烷基矽膠，該矽膠最初以流動相20 mM 三乙醇胺緩衝液/20%乙醇平衡至pH 7.5。首先使用該平衡溶液洗滌管柱，再以線性梯度沖提，接著以等位梯度及流動相沖提，流動相包括乙醇和20 mM檸檬酸鹽緩衝液、pH為 5.1。接著以包括乙醇和20 mM檸檬酸鹽緩衝液的流動相，以線性pH梯度沖提從pH值由5.1降至4.0沖提目標利拉魯肽產物。管柱溫度維持於60℃。
儘管已有上述純化方法，目前仍需開發更高效並經改良的利拉魯肽純化方法。本揭露滿足此需求且具備相關優點。
根據本發明第一態樣，提供一種純化利拉魯肽的方法。該方法包括： (a)  將利拉魯肽粗肽溶於包含鹵化溶劑的溶液中；及 (b) 將該溶液置於RP-HPLC純化系統中純化，並收集經純化的利拉魯肽組份(fraction)。
根據本發明第二態樣，提供一種純化利拉魯肽的方法。該方法包括： (a)  將利拉魯肽粗肽溶於包含鹵化溶劑的溶液中；及 (b) 將該溶液置於RP-HPLC純化系統中純化，並收集經純化的利拉魯肽組份，其中該RP-HPLC純化系統包括第一次RP-HPLC純化及第二次RP-HPLC純化；及 (c)  使用含鈉鹽、水和乙腈的流動相E對步驟(b)中的組份進行第三次RP-HPLC純化；並收集組份以獲得鹽交換的利拉魯肽。
I. 一般說明
本發明提供改良後的利拉魯肽純化方法。利拉魯肽經過兩階段RP-HPLC純化步驟純化並進行鹽交換步驟，其中pH值在第一次及第二次純化步驟時維持恆定。具體而言，該方法於樣品製備步驟中使用一鹵化溶劑，該溶劑具更佳的溶解度，並提供適合利拉魯肽粗肽在進行RP-HPLC純化前脫羧的環境。表A及表B歸納了本發明相較於已揭露的習知方法的優點或特色。 表A：本發明與US 2015/0051372 之比較
參數 US 2015/0051372 本發明 主張的優點
樣品製備溶劑系統 乙腈和水的混合物 包含鹵化溶劑（例如TFE、HFIP、TFA）的溶液 1. 替利拉魯肽粗肽提供更佳的溶解度和脫羧條件；及 2. 避免RP-HPLC純化過程中發生滯留干擾
固定相 三次RP-HPLC純化中使用兩種 不同的固定相材料：   第一次和第三次純化：辛基矽烷 第二次純化：氰基矽烷 在三次RP-HPLC純化中，僅使用一種 固定相材料：辛基矽烷 操作簡單方便
TFE：三氟乙醇；HFIP：六氟異丙醇；TFA：三氟乙酸。 表B：本發明與US 9,422,330之比較
參數 US 9,422,330 本發明 主張的優點
梯度、pH 以pH梯度沖提利拉魯肽，該梯度與利拉魯肽的pI值接近 在每個純化步驟中，pH均保持恆定（無pH梯度） 1.     於高出利拉魯肽pI值情形下沖提利拉魯肽，可避免利拉魯肽沉澱；及   2.  操作簡單方便
II. 定義
SEQ ID NO：1係指利拉魯肽中經改造肽的氨基酸序列。該序列以下列方式表示：H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys- Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。
「約」一詞係指一數值範圍，其中包括給定值，對本發明技術領域中具通常知識者而言，該數值範圍與該給定值合理近似。在某些具體實施例中，「約」一詞係指位於可接受習知測量方法所測得的一個標準差內。在某些具體實施例中，「約」一詞係指位於該給定值+/- 10%的範圍內。在某些具體實施例中，「約」一詞係指該給定值。
「RP-HPLC」係指反相高效液相層析法。
「銨鹽」係指由一NR4 + 陽離子及一陰離子構成的一類化合物，其中R可為氫或烷基。在一具體實施例中，銨鹽係指由一NH4 + 陽離子及一陰離子構成的一類化合物。本發明使用的銨鹽包括甲酸銨和乙酸銨。
「磷酸鹽」係指由一陽離子及一磷酸根陰離子構成的一類化合物，如磷酸根陰離子（PO4 3- ）、磷酸氫根陰離子（HPO4 2- ）及磷酸二氫根陰離子（H2 PO4 - ）。具有PO4 3- 陰離子的磷酸鹽亦指磷酸三鹽；具有HPO4 2- 陰離子的磷酸鹽亦指磷酸二鹽；具有H2 PO4 - 陰離子的磷酸鹽亦指磷酸單鹽。本發明使用的磷酸鹽包括磷酸三鈉（Na3 PO4 ）、磷酸氫二鈉（Na2 HPO4 ）、磷酸二氫鈉（NaH2 PO4 ）、磷酸三鉀（K3 PO4 ）、磷酸氫二鉀（K2 HPO4 ）、磷酸二氫鉀（KH2 PO4 ）、磷酸三銨（(NH4 )3 PO4 ）、磷酸氫二銨（(NH4 )2 HPO4 ）、磷酸二氫銨（(NH4 )H2 PO4 ）。III. 流程
根據本發明第一態樣，提供一種純化利拉魯肽的方法。該方法包括： (a)  將利拉魯肽粗肽溶於包含鹵化溶劑的溶液中；及 (b) 將該溶液置於RP-HPLC純化系統中純化，並收集經純化的利拉魯肽組份。
在某些具體實施例中，步驟(a)中的鹵化溶劑選自由氟化酸、氟化醇、氯化溶劑及其混合物組成的群組。
在某些具體實施例中，氟化醇選自由2,2,2-三氟乙醇（2,2,2-trifluoroethanol, TFE）、1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol, HFIP）、2,2,3,3-四氟-1-丙醇（2,2,3,3-tetrafluoro-1-propanol）、2,2,3,3,3-五氟-1-丙醇（2,2,3,3,3-pentafluoro-1-propanol）、五氟苯酚（pentafluorophenol）、全氟叔丁醇（nonafluoro-tert-butyl alcohol）、3,3,4,4,4-五氟-1-丁醇（3,3,4,4,4-pentafluoro-1-butanol）、4,4,5,5,5-五氟-1-戊醇（4,4,5,5,5-pentafluoro-1-pentanol）、2,2,3,4,4,4-六氟-1-丁醇（2,2,3,4,4,4-hexafluoro-1-butanol）、1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇（1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-methyl-2-propanol）、1,1,1,3,3,3-六氟-2-苯基-2-丙醇（1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-phenyl-2-propanol）及其混合物組成的群組。
在某些具體實施例中，該氯化溶劑為2,2,2-三氯乙醇。
在某些具體實施例中，該氟化酸為三氟乙酸。
在某些具體實施例中，步驟(a)中的溶液包括體積百分比5-35%的氟化醇和0.1-1%的氟化酸。在某些具體實施例中，步驟(a)中的溶液包括體積百分比15-20%的1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）和0.1-1%的氟化酸。在某些具體實施例中，步驟(a)中的溶液包括體積百分比20-30%的2,2,2-三氟乙醇（TFE）和0.1-1%的氟化酸。在某些具體實施例中，步驟(a)中的溶液包括體積百分比15-20%的1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）和0.1-1%的三氟乙酸。在某些具體實施例中，步驟(a)中的溶液包括體積百分比20-30%的2,2,2-三氟乙醇（TFE）和0.1-1%的三氟乙酸。在某些具體實施例中，步驟(a)中的溶液包括體積百分比15-20%的1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）和0.1-0.3%的三氟乙酸。在某些具體實施例中，步驟(a)中的溶液包括體積百分比20-30%的2,2,2-三氟乙醇（TFE）和0.1-0.3%的三氟乙酸。在某些具體實施例中，步驟(a)中的溶液包括體積百分比約17%的1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）和約0.2%的三氟乙酸。在某些具體實施例中，步驟(a)中的溶液包括體積百分比約25%的2,2,2-三氟乙醇（TFE）和約0.2%的三氟乙酸。
在某些具體實施例中，步驟(b)的RP-HPLC純化系統包括第一次RP-HPLC純化和第二次RP-HPLC純化；第一次RP-HPLC純化於pH>7時進行；第二次RP-HPLC純化於pH>7時進行。
在某些具體實施例中，第一次RP-HPLC純化於pH>7時進行；第二次RP-HPLC純化於pH>約7時進行。在某些具體實施例中，第一次RP-HPLC純化於pH>3時進行；第二次RP-HPLC純化於pH>約7時進行。在某些具體實施例中，第一次RP-HPLC純化於pH>3時進行；第二次RP-HPLC純化於pH>約7.5時進行。
在某些具體實施例中，第一次RP-HPLC純化使用流動相A，其包括三氟乙酸和水；以及流動相B，其包括三氟乙酸和乙腈。
在某些具體實施例中，流動相A及流動相B各包括體積百分比0.1-1%的三氟乙酸。在某些具體實施例中，流動相A及流動相B各包括體積百分比0.1-0.5%的三氟乙酸。在某些具體實施例中，流動相A及流動相B各包括體積百分比0.1-0.3%的三氟乙酸。在某些具體實施例中，流動相A及流動相B各包括體積百分比約0.2%的三氟乙酸。在某些具體實施例中，流動相A為水中含0.2%三氟乙酸的溶液；流動相B為乙腈中含約0.2%三氟乙酸的溶液。
在某些具體實施例中，流動相B於線性梯度下由體積百分比5-25%被沖提至80-100%。在某些具體實施例中，流動相B於線性梯度下由體積百分比5-15%被沖提至90-100%。在某些具體實施例中，流動相B於線性梯度下由體積百分比5-25%被沖提至80-100%，其中流動相A為水中含0.2%三氟乙酸的溶液；流動相B為乙腈中含約0.2%三氟乙酸的溶液。在某些具體實施例中，流動相B於線性梯度下由體積百分比5-15%被沖提至90-100%，其中流動相A為水中含0.2%三氟乙酸的溶液；流動相B為乙腈中含約0.2%三氟乙酸的溶液。在某些具體實施例中，流動相B於線性梯度下由體積百分比約10%被沖提至95%，其中流動相A為水中含0.2%三氟乙酸的溶液；流動相B為乙腈中含約0.2%三氟乙酸的溶液。在某些具體實施例中，流動相B於表1所示線性梯度下由體積百分比約10%被沖提至95%，其中流動相A為水中含0.2%三氟乙酸的溶液；流動相B為乙腈中含約0.2%三氟乙酸的溶液。
在某些具體實施例中，第二次RP-HPLC純化使用流動相C（包括銨鹽或磷酸鹽）以及流動相D（包括乙腈）。在某些具體實施例中，第二次RP-HPLC純化使用流動相C（包括銨鹽）以及流動相D（包括乙腈）。在某些具體實施例中，第二次RP-HPLC純化使用流動相C（包括磷酸鹽）以及流動相D（包括乙腈）。在某些具體實施例中，第二次RP-HPLC純化使用流動相C及流動相D，各包括一銨鹽或磷酸鹽。在某些具體實施例中，第二次RP-HPLC純化使用流動相C以及流動相D，各包括一銨鹽。在某些具體實施例中，第二次RP-HPLC純化使用流動相C（包括銨鹽水溶液）以及流動相D（包括銨鹽水溶液和乙腈）。在某些具體實施例中，第二次RP-HPLC純化使用流動相C（包括磷酸鹽水溶液）以及流動相D（乙腈）。
在某些具體實施例中，流動相C進一步包括體積百分比1%至10%的乙腈。在某些具體實施例中，流動相C進一步包括體積百分比3%至7%的乙腈。在某些具體實施例中，流動相C進一步包括體積百分比約5%的乙腈。
在某些具體實施例中，流動相D進一步包括體積百分比10%至60%的銨鹽水溶液。在某些具體實施例中，流動相D進一步包括體積百分比20%至60%、30%至60%、4%至60%或約50%的銨鹽水溶液。在某些具體實施例中，流動相D進一步包括體積百分比約50%的銨鹽水溶液。
在某些具體實施例中，銨鹽選自由甲酸銨、乙酸銨及其混合物組成的群組。在某些具體實施例中，銨鹽為甲酸銨。
在某些具體實施例中，磷酸鹽選自由磷酸三鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸三鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸三銨、磷酸氫二銨、磷酸二氫銨及其混合物組成的群組。在某些具體實施例中，磷酸鹽選自由磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二銨、磷酸二氫銨及其混合物組成的群組。在某些具體實施例中，磷酸鹽選自由磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀及其混合物組成的群組。在某些具體實施例中，磷酸鹽為磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的混合物。
在某些具體實施例中，流動相C包括在水中濃度為5-50 mM的銨鹽或磷酸鹽。在某些具體實施例中，流動相C包括在水中濃度為10-40 mM的銨鹽或磷酸鹽。在某些具體實施例中，流動相C包括在水中濃度為10-30 mM、15-25 mM或約20 mM的銨鹽或磷酸鹽。在某些具體實施例中，流動相C包括在水中濃度約20 mM的銨鹽或磷酸鹽。在某些具體實施例中，流動相C包括在水中濃度約20 mM的銨鹽。在某些具體實施例中，流動相C包括20 mM的銨鹽水溶液。在某些具體實施例中，流動相C包括在水中濃度為約20 mM的磷酸鹽。在某些具體實施例中，流動相C包括20 mM的磷酸鹽水溶液。
在某些具體實施例中，流動相C的pH值為約7.5至約9.0，或約7.5至約8.5。在某些具體實施例中，流動相C的pH值為約7.5至約8.5。在某些具體實施例中，流動相C的pH值為約8.5。在某些具體實施例中，流動相C的pH值為約7.9。
在某些具體實施例中，流動相C包括甲酸銨水溶液。在某些具體實施例中，流動相C包括20 mM甲酸銨水溶液。在某些具體實施例中，流動相C包括20 mM甲酸銨水溶液，且pH值為約8.5。在某些具體實施例中，流動相C包括乙腈和20 mM甲酸銨水溶液，且pH值為約8.5，其中水溶液和乙腈的體積比為95:5。
在某些具體實施例中，流動相C包括磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的水溶液。在某些具體實施例中，流動相C包括濃度為20 mM的磷酸氫二鉀和磷酸氫二鉀的水溶液。在某些具體實施例中，流動相C包括濃度為20 mM的磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的水溶液，且pH值為約7.9。在某些具體實施例中，流動相C包括乙腈和濃度為20 mM的磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的水溶液，且pH值為約7.9，其中磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的重量比為12:1，水溶液和乙腈的體積比為95:5。
在某些具體實施例中，流動相D的pH值為約7.5至約9.0，或約7.5至約8.5。在某些具體實施例中，流動相D的pH值為約7.5至約8.5。在某些具體實施例中，流動相D的pH值為約8.5。
在某些具體實施例中，流動相D進一步包括甲酸銨水溶液。在某些具體實施例中，流動相D進一步包括20 mM甲酸銨水溶液。在某些具體實施例中，流動相D進一步包括20 mM甲酸銨水溶液，且pH值為約8.5。在某些具體實施例中，流動相D包括20 mM的甲酸銨水溶液和乙腈，且pH值為約8.5，其中水溶液和乙腈的體積比為50:50。
在某些具體實施例中，流動相D為乙腈。
在某些具體實施例中，流動相C包括20 mM甲酸銨水溶液和乙腈，且pH值為約8.5；流動相D包括20 mM甲酸銨水溶液和乙腈，且pH值為約8.5，其中流動相C中的水溶液和乙腈的體積比為95:5，而流動相D中水溶液和乙腈的體積比為50:50。
在某些具體實施例中，流動相C包括乙腈及濃度為20 mM且pH值為約7.9的磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀水溶液；流動相D為乙腈，其中磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的重量比為12:1，而流動相C中的水溶液和乙腈的體積比為95:5。
在某些具體實施例中，流動相D於線性梯度下由體積百分比0-10%被沖提至50-100%。在某些具體實施例中，流動相D於線性梯度下由體積百分比0%被沖提至100%，其中流動相C包括20 mM甲酸銨水溶液和乙腈，且pH值為約8.5；流動相D包括20 mM甲酸銨水溶液和乙腈，且pH值為約8.5，其中流動相C中的水溶液和乙腈的體積百分比為95:5，而流動相D中的水溶液和乙腈的體積比為50:50。在某些具體實施例中，流動相D根據表2的線性梯度由體積百分比0%被沖提至100%，其中流動相C包括20 mM甲酸銨水溶液和乙腈，且pH值為約8.5；流動相D包括20 mM甲酸銨水溶液和乙腈，且pH值為約8.5，其中流動相C中的水溶液和乙腈的體積比為95:5，而流動相D中的水溶液和乙腈的體積比為50:50。在某些具體實施例中，流動相D於線性梯度下由體積百分比5%被沖提至70%，其中流動相C包括乙腈及濃度為20 mM且pH值為約7.9的磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀水溶液；流動相D為乙腈，其中磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的重量比為12:1，而流動相C中的水溶液和乙腈的體積比為95:5。在某些具體實施例中，流動相D根據表3的線性梯度由體積百分比5%被沖提至70%，其中流動相C包括乙腈和濃度為20 mM且pH值為約7.9的磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀水溶液；流動相D為乙腈，其中磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的重量比為12:1，而流動相C中的水溶液和乙腈的體積比為95:5。
在某些具體實施例中，經純化的利拉魯肽組份的pH值為約7.5至約8.5。在某些具體實施例中，經純化的利拉魯肽組份的pH值為約8.0至約8.5。在某些具體實施例中，經純化的利拉魯肽組份的pH值為約7.5至約8.0。
第一次和第二次純化的流速取決於RP-HPLC製備管柱的尺寸。在某些具體實施例中，當管柱的直徑和長度為5 cm × 22  cm至8 cm × 12.6 cm時，第一次純化的流速為約50至200  mL/min。在某些具體實施例中，當管柱的直徑和長度為5 cm × 22  cm至8 cm × 12.6 cm時，第一次純化的流速為約100至160  mL/min。在某些具體實施例中，當管柱的直徑和長度為5 cm × 22  cm時，第一次純化的流速為約104  mL/min。在某些具體實施例中，當管柱的直徑和長度為8 cm × 12.6 cm 時，第一次純化的流速為約152 mL/min。在某些具體實施例中，當管柱的直徑和長度為10 mm × 250 mm 時，第一次純化的流速為4至8 mL/min。在某些具體實施例中，當管柱的直徑和長度為10 mm × 250 mm時，第一次純化的流速為約4.7 mL/min。在某些具體實施例中，當管柱的直徑和長度為5 cm × 22  cm至8 cm × 12.6 cm時，第二次純化的流速為約50至200 mL/min。在某些具體實施例中，當管柱的直徑和長度為5 cm × 22  cm至8 cm × 12.6 cm時，第二次純化的流速為約100至160 mL/min。在某些具體實施例中，當管柱的直徑和長度為8 cm × 12.6 cm 時，第二次純化的流速為約152 mL/min。在某些具體實施例中，當管柱的直徑和長度為4.6 mm × 100 mm時，第二次純化的流速為約0.3至0.5 mL/min。在某些具體實施例中，當管柱的直徑和長度為4.6 mm × 100 mm時，第二次純化的流速為約0.4 mL/min。
在某些具體實施例中，步驟(a)的利拉魯肽粗肽係經由固相合成獲得。
在某些具體實施例中，該方法進一步包括： (c) 使用包含鈉鹽、水和乙腈的流動相E對步驟(b)中的組份進行第三次RP-HPLC純化；並收集組份以取得鹽交換的利拉魯肽。
在某些具體實施例中，鈉鹽為磷酸氫二鈉。
在某些具體實施例中，流動相E包括磷酸氫二鈉水溶液。在某些具體實施例中，流動相E包括濃度為20 mM的磷酸氫二鈉水溶液。在某些具體實施例中，流動相E包括濃度為20 mM的磷酸氫二鈉水溶液，且pH值為約8.0。在某些具體實施例中，流動相E（E1）包括乙腈和濃度為20 mM的磷酸氫二鈉水溶液，且pH值為約8.0，其中水溶液和乙腈的體積比為95:5。在某些具體實施例中，流動相E（E2）包括乙腈和濃度為20 mM的磷酸氫二鈉水溶液，且pH值為約8.0，其中水溶液和乙腈的體積比為50:50。
在某些具體實施例中，使用流動相E1後再使用流動相E2進行步驟(c)，藉以提供鹽交換的利拉魯肽組份。
第三次純化的流速取決於RP-HPLC製備管柱的尺寸。在某些具體實施例中，當管柱的直徑和長度為10 mm × 250mm時，第三次純化的流速為4至8 mL/min。在某些具體實施例中，當管柱的直徑和長度為10 mm × 25 cm時，第一次純化的流速為約4.7 mL/min。
在某些具體實施例中，鹽交換的利拉魯肽組份的pH值為約7.5至約8.0。
在某些具體實施例中，第一次、第二次和第三次RP-HPLC純化有相同的固定相。
根據本發明第二態樣，提供一種純化利拉魯肽的方法。該方法包括： (a) 將利拉魯肽粗肽溶於包含鹵化溶劑的溶液中；及 (b) 將該溶液置於RP-HPLC純化系統中純化，並收集經純化的利拉魯肽組份，其中該RP-HPLC純化系統包括第一次RP-HPLC純化及第二次RP-HPLC純化；及 (c) 使用含鈉鹽、水和乙腈的流動相E對步驟(b)中的組份進行第三次RP-HPLC純化；並收集組份以取得鹽交換利拉魯肽。
執行第二態樣步驟(a)至(c)的合適條件與第一態樣中定義並描述的合適條件相同。IV. 實例
以下實例係用於進一步說明本發明，而非用於限制本發明。實例 1 ：
樣品前處理： 利拉魯肽粗肽係經由固相合成獲得，其純度為44.6%。將30 g利拉魯肽粗肽溶於500 mL三氟乙醇（TFE）溶液（0.2%三氟乙酸中含25%TFE）中。接著將混合物於室溫下攪拌約2小時。
第一次純化：
將所取得的溶液裝載於填充C8，10 μm矽膠的RP-HPLC製備管柱中，管柱直徑和長度為8 cm × 12.6 cm，裝載量為27.1 g。
在以下條件下進行純化循環： (1)  流動相A：水中含0.2%三氟乙酸（TFA）； (2)  流動相B：乙腈（ACN）中含0.2 %TFA； (3)  流速：152 mL/min；及 (4)  沖提梯度表1：
時間 （分：秒） 組成
MPA（%）體積百分比 MPB（%）體積百分比
00:00 90 10
10:00 90 10
40:00 60 40
80:00 45 55
80:06 5 95
100:06 5 95
取得含純度90.58%利拉魯肽的組份後，對其進行第二次純化。
第二次純化：
用33%的銨調整純度90.58%利拉魯肽的組份至pH值8.5，並以20 mM、pH 8.5之甲酸銨稀釋，再將前述組份裝載於填充C8，10 μm矽膠的RP-HPLC管柱中。管柱直徑和長度為8 cm × 12.6 cm，裝載量為6.2 g。
在以下條件下進行純化循環： (1)  流動相C：20 mM甲酸銨（AmF），pH值經調整為8.5，並經乙腈稀釋至體積比95/5（V/V）； (2)  流動相D：20 mM AmF，pH值經調整為8.5，並經乙腈稀釋至體積比50/50（V/V）； (3)  流速：152 mL/min；及 (4)  沖提梯度表2：
時間 （分：秒） 組成
MPC（%）體積百分比 MPD（%）體積百分比
00:00 100 0
05:00 100 0
15:00 45 55
65:00 23 77
75:00 0 100
120:00 0 100
取得含純度98.48%、pH值約8.0-8.5利拉魯肽的組份後，對其進行第三次純化（鹽交換）。
第三次純化（鹽交換）：
將含純度98.48%利拉魯肽的組份裝載於填充C8，10 μm矽膠的RP-HPLC管柱中，管柱直徑和長度為10 mm × 250 mm，流速為4.7 mL/min，裝載量為1.1 g。裝載後，以含5%乙腈的20 mM磷酸氫二鈉溶液（pH = 8.0）沖洗管柱，接著以含50%乙腈的20 mM磷酸氫二鈉溶液（pH = 8.0）進行沖提。由此可獲得pH值約7.5-8.0的鹽交換利拉魯肽，再將所取得的利拉魯肽凍乾，最終取得3.3 g、純度98.48%的利拉魯肽濃縮物。實例 2 ：
樣品前處理：
經由固相合成獲得純度為33.8%利拉魯肽粗肽。將19.5 g利拉魯肽粗肽溶於238 mL六氟異丙醇（HFIP）溶液（0.2% TFA溶液中含17% HFIP）中。接著將混合物於室溫下攪拌約2小時。
第一次純化：
將所取得的溶液裝載於填充C8，10 μm矽膠的RP-HPLC製備管柱中，管柱直徑和長度為5 cm × 22 cm，裝載量為19.5 g。
在以下條件下進行純化循環： (1)  流動相A：水中含0.2%三氟乙酸（TFA）； (2)  流動相B：乙腈（ACN）中含0.2 %TFA； (3)  流速：104 mL/min；及 (4)  沖提梯度表1：
時間 （分：秒） 組成
MPA（%）體積百分比 MPB（%）體積百分比
00:00 90 10
10:00 90 10
40:00 60 40
80:00 45 55
80:06 5 95
100:06 5 95
取得含純度89.65%利拉魯肽的組份後，對其進行第二次純化，管柱裝載量為4.3 g。
第二次純化及第三次純化（鹽交換）：
對含純度89.65%利拉魯肽的組份進行第二次及第三次純化（鹽交換），純化條件及方法同實例1。由此可獲得pH值約7.5-8.0的鹽交換利拉魯肽，再將所取得的利拉魯肽凍乾，最終獲得3.7 g、純度97.23%的利拉魯肽濃縮物。實例 3 ：
樣品前處理：
經由固相合成獲得純度為33.8%利拉魯肽粗肽。將990.3 mg利拉魯肽粗肽溶於11.22 mL六氟異丙醇（HFIP）溶液（0.2%TFA溶液中含17%HFIP）中。接著將混合物於室溫下攪拌約2小時。
第一次純化：
將所取得的溶液裝載於填充C8/10 μm矽膠的RP-HPLC製備管柱中，管柱直徑和長度為10 mm × 25 cm，裝載量為0.99 g。
在以下條件下進行純化循環： (1)  流動相A：水中含0.2%三氟乙酸（TFA）； (2)  流動相B：乙腈（ACN）中含0.2 %TFA； (3)  流速：4.7 mL/min；及 (4)  沖提梯度表1：
時間 （分：秒） 組成
MPA（%）體積百分比 MPB（%）體積百分比
00:00 90 10
10:00 90 10
40:00 60 40
80:00 45 55
80:06 5 95
100:06 5 95
取得含純度92.17%利拉魯肽的組份後，對其進行第二次純化。管柱裝載量為41.1 mg。
第二次純化：
以流動相C稀釋含純度92.17%利拉魯肽的組份，再將前述組份裝載於填充C8/10 μm矽膠的RP-HPLC管柱中。管柱直徑和長度為4.6 mm × 100 mm。
在以下條件下進行純化循環： (1)  流動相C：20 mM磷酸氫二鉀（K2 HPO4 ）/磷酸二氫鉀（KH2 PO4 ） = 12/1，pH值經調整為7.9，並經乙腈以體積比95/5（V/V）稀釋； (2)  流動相D：乙腈； (3)  流速：0.4 mL/min；及 (4)  沖提梯度表3：
時間 （分：秒） 組成
MPC（%）體積百分比 MPD（%）體積百分比
00:00 95 5
10:00 95 5
23:00 80 20
98:00 55 45
98:06 30 70
118:06 30 70
取得含純度97%、pH值約7.5-8.0利拉魯肽的組份後，對其進行第三次純化（鹽交換）。
第三次純化（鹽交換）：
第三次純化（鹽交換）的條件及方法同實例1。由此可取得pH值約7.5-8.0的鹽交換利拉魯肽，再將所取得的利拉魯肽凍乾。
本發明內容已藉由前文的具體實施例及實例詳述，以使概念清晰易懂，但所屬技術領域具通常知識者將了解，可在所附請求項界定的範圍內對本發明進行特定變化和修飾。此外，本文所提供的各參考文獻係以全文方式併入本文中，相當於分別引用及併入各篇參考文獻。本申請案與本文提供的參考文獻內容牴觸時，應以本申請案內容為主。
第1圖顯示根據實例1的第一次純化沖提層析圖（全視圖）。
第2圖顯示第1圖的沖提層析圖（放大圖）。圖中的組份5到13併為1P主組份，於隨後進行第二次純化。
第3圖顯示根據實例2或3的第一次純化沖提層析圖（全視圖）。
第4圖顯示第3圖的沖提層析圖（放大圖）。圖中的組份10到15併為1P主組份，於隨後進行第二次純化。
Figure 12_A0101_SEQ_0001

Claims (23)

  1. 一種純化利拉魯肽的方法，包含：(a)將利拉魯肽粗肽溶於包含鹵化溶劑的溶液中；及(b)將該溶液置於RP-HPLC純化系統中純化，並收集經純化的利拉魯肽組份。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟(a)中的鹵化溶劑選自由氟化酸、氟化醇、氯化溶劑及其混合物組成的群組。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中氟化醇選自由2,2,2-三氟乙醇(2,2,2-trifluoroethanol,TFE)、1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol,HFIP)、2,2,3,3-四氟-1-丙醇(2,2,3,3-tetrafluoro-1-propanol)、2,2,3,3,3-五氟-1-丙醇(2,2,3,3,3-pentafluoro-1-propanol)、五氟苯酚(pentafluorophenol)、全氟叔丁醇(nonafluoro-tert-butyl alcohol)、3,3,4,4,4-五氟-1-丁醇(3,3,4,4,4-pentafluoro-1-butanol)、4,4,5,5,5-五氟-1-戊醇(4,4,5,5,5-pentafluoro-1-pentanol)、2,2,3,4,4,4-六氟-1-丁醇(2,2,3,4,4,4-hexafluoro-1-butanol)、1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-methyl-2-propanol)、1,1,1,3,3,3-六氟-2-苯基-2-丙醇(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-phenyl-2-propanol)及其混合物組成的群組。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該氯化溶劑為2,2,2-三氯乙醇。
  5. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該氟化酸為三氟乙酸。
  6. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中步驟(a)中的溶液包括體積百分比5-35%的氟化醇和0.1-1%的氟化酸。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中步驟(a)中的溶液包含體積百分比15-20%的1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)和0.1-1%的氟化酸。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中步驟(a)中的溶液包括體積百分比20-30%的2,2,2-三氟乙醇(TFE)和0.1-1%的氟化酸。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟(b)中的RP-HPLC純化系統包含第一次RP-HPLC純化和第二次RP-HPLC純化；該第一次RP-HPLC純化於pH小於7時進行；該第二次RP-HPLC純化於pH大於7時進行。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該第一次RP-HPLC純化於pH小於3時進行；且該第二次RP-HPLC純化於pH大於7.5時進行。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該第一次RP-HPLC純化使用流動相A，其包含三氟乙酸和水，以及流動相B，其包含三氟乙酸和乙腈。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該流動相A及該流動相B各包含體積百分比0.1-1%的三氟乙酸。
  13. 如申請專利範圍第11項或第12項所述之方法，其中該流動相B於線性梯度下由體積百分比5-25%被沖提至80-100%。
  14. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該第二次RP-HPLC純化使用包含銨鹽或磷酸鹽的流動相C以及包含乙腈的流動相D。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該銨鹽選自由甲酸銨、乙酸銨及其混合物組成的群組。
  16. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該磷酸鹽選自由磷酸三鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸三鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸三銨、磷酸氫二銨、磷酸二氫銨及其混合物組成的群組。
  17. 如申請專利範圍第14項至第16項任一項所述之方法，其中該流動相C包含在水中濃度為5-50mM的銨鹽或磷酸鹽。
  18. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該流動相C的pH值為7.5至9.0。
  19. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該流動相D於線性梯度下由體積百分比0-10%被沖提至50-100%。
  20. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中經純化的該等利拉魯肽組份的pH值為7.5至8.5。
  21. 如申請專利範圍第9項所述之方法，進一步包含：(c)使用包含鈉鹽、水和乙腈的流動相E對步驟(b)中的組份進行第三次RP-HPLC純化；且收集組份以獲得鹽交換(salt-exchanged)的利拉魯肽。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之方法，其中鈉鹽為磷酸氫二鈉。
  23. 如申請專利範圍第21項或第22項所述之方法，其中鹽交換的該等利拉魯肽組份的pH值為7.5至8.0。
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