JP3962430B2 - 脂肪酸アシル化蛋白質のゲル化削減法 - Google Patents

Description

発明の背景
１．発明の分野
本発明は広義には脂肪酸でアシル化した蛋白質、特に脂肪酸アシル化プロインスリン、脂肪酸アシル化インスリンまたは脂肪酸アシル化インスリン類似体、の加工処理および精製の間に開始するかまたは発生するゲル化を削減する方法を目指すものである。さらに特定的には本発明はクエン酸緩衝剤の存在下におけるアシル化されたプロインスリン、インスリンおよびインスリン類似体、および最も具体的にはＮ−パルミトイル−Ｌｙｓ^B29ヒトインスリンの加工処理および精製方法に関する。
２．関連技術の記載
正常な人間での内因性インスリン分泌様式を模倣することがインスリン療法の以前からの目標であった。日常のインスリンに対する生理的要求は変動するが、それは二相に分けられる：（ａ）食事に関連する血糖急増を始末するためにインスリンの短時間適用を必要とする吸収相、および（ｂ）最適な空腹時血糖グルコースを維持するための肝臓グルコース流出量を調節するためのインスリンの維持量を必要とする吸収後相である。従って、一般に有効な治療法は外因性インスリン２種類の組合せ使用を含んでいる：すなわち、大量注射によって提供される速効性ある食事時用インスリンおよび毎日１回または２回の注射によって投与される長時間作用する基礎インスリンである。
最近、一群のアシル化インスリンが長時間作用する基礎インスリン療法剤としての使用に有望であることが証明された。これらのアシル化インスリンはプロインスリン、正常インスリンおよびある種のインスリン類似体を包含する単量体インスリンの遊離アミノ基を活性化脂肪酸誘導体で選択的にアシル化することによって製造される。有用な脂肪酸誘導体には鎖の長さが少なくとも６個の炭素原子を有する反応性の脂肪酸型化合物、特にその鎖に８個から２１個までの炭素原子を有する脂肪酸のもの、を包含する。パルミチン酸誘導体でアシル化したモノアシル化正常ヒトインスリンは特に有望な候補である。このカテゴリーに属するインスリンは日本特許出願１−２５４６９９号に記載されている。
これらの脂肪酸アシル化インスリンで遭遇する課題の一つはそれらが製造後、特に後続する精製および濃縮の間、に通常に遭遇する条件下に著しいゲル化傾向を示すことである。このゲル化現象に寄与する原因は解明されていないが、これらの脂肪酸アシル化インスリンの溶液、特にＮ−パルミトイル−Ｌｙｓ^B29ヒトインスリンの水性アセトニトリル溶液は、たとえばグリシンおよび酢酸のような通常使用される緩衝液の存在下、通常に使用される温度、ｐＨおよび蛋白質濃度の条件下、目に見える物質的な変化を起こすことが観察されている。例えば、Ｎ−パルミトイル−Ｌｙｓ^B29ヒトインスリンの水溶液は４ｍｇ／ｍＬより高い濃度で２０〜３０％以上のアセトニトリルを含むと緩衝剤としての２０ｍＭ−グリシンの存在下に室温で迅速にゲル化する強い傾向を示した。発生するゲル化は正常な加工処理および蛋白質の究極的な精製および濃縮をかなり妨害する。実際、この状況が起きるとその物体に吸引またはその他の操作をすることが不可能とは言えないまでも困難になる。これで装置および器具の使用に損失が起きる。正常インスリンを加工処理する時にもしばしば同様なゲル化現象に遭遇したが、賢明な工程管理手段を使用して一般には回避してきた。不幸なことには、この脂肪酸アシル化インスリンはもっと寛容度が少なく、ゲル化現象がこれらの脂肪酸アシル化蛋白質の商業的規模での加工処理に重大な課題を提起すると思われる。
本発明はこれらの脂肪酸アシル化インスリンの作業工程、殊にたとえばアセトニトリルのような極性有機溶媒を含有する作業工程、における一次緩衝剤としてのクエン酸緩衝剤存在下に加工処理することによって、これらの脂肪酸アシル化インスリン、特にＮ−パルミトイル−Ｌｙｓ^B29ヒトインスリン、のゲル化傾向が大いに削減されるという驚くべき発見に基づく。
それ故、本発明はそのような脂肪酸アシル化インスリンの水性溶液をクエン酸緩衝剤が不在なら適当な筈のものよりもさらに高い蛋白質濃度において、また、さらに少ない温度管理により加工処理する方法を提供する。本発明はまたゲル化する傾向が弱い脂肪酸アシル化蛋白質の水性溶液も提供する。
本発明に関する記載
この明細書で使用するアミノ酸の略号は３７ＣＦＲ§１．８２２（Ｂ）（２）に記載がある通りに全て米国特許商標庁が承認したものである。
本明細書で使用する用語「インスリン」および「正常インスリン」はヒトのインスリン、ブタのインスリンまたはウシのインスリンを意味する。インスリンは遊離アミノ基を３個有する：すなわちＢ¹−フェニルアラニン、Ａ¹−グリシンおよびＢ²⁹−リジンである。Ａ¹およびＢ¹の位置にある遊離アミノ基はα−アミノ基である。Ｂ²⁹位置にある遊離アミノ基はε−アミノ基である。
本明細書で使用する用語「プロインスリン」は式：
Ｂ−Ｃ−Ａ
［式中：
ＡはインスリンのＡ鎖またはその機能的誘導体である。
ＢはインスリンのＢ鎖またはその機能的誘導体であって、ε−アミノ基を持つものである。
Ｃはプロインスリンの結合ペプチドである］
で示される固有の交差結合をしている蛋白質である。好ましいプロインスリンはヒトインスリンのＡ鎖、ヒトインスリンのＢ鎖を持ち、およびＣは天然の結合ペプチドである。プロインスリンが天然配列である時は、プロインスリンは遊離アミノ基３個を持つ：すなわち、フェニルアラニン（１）（α−アミノ基）、リジン（２９）（ε−アミノ基）およびリジン（６４）（ε−アミノ基）である。
本明細書で使用する用語「インスリン類似体」は式：
Ａ−Ｂ
［式中：
ＡはインスリンのＡ鎖またはインスリンＡ鎖の機能的誘導体である。および
ＢはインスリンのＢ鎖またはインスリンＢ鎖の機能的誘導体であって、ε−アミノ基を持つものである。
ＡまたはＢの少なくとも１個は天然配列から修飾されたアミノ酸修飾を含む］で示される固有の交差結合をしており、インスリン活性を示す蛋白質である。
好適なインスリン類似体には次のようなインスリンを包含する：すなわち
Ｂ²⁸位のアミノ酸残基がＡｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＡｌａである；
Ｂ²⁹位のアミノ酸残基がＬｙｓまたはＰｒｏである；
Ｂ¹⁰位のアミノ酸残基がＨｉｓまたはＡｓｐである；
Ｂ¹位のアミノ酸残基がＰｈｅ、Ａｓｐであるか、または単独で欠失しているか、Ｂ²位の残基の欠失と組合せて欠失している；
Ｂ³⁰位のアミノ酸残基がＴｈｒ、Ａｌａであるか、または欠失している；
および
Ｂ⁹位のアミノ酸残基がＳｅｒまたはＡｓｐである；
但し、Ｂ²⁸位またはＢ²⁹位のいずれかがＬｙｓであるものとする。
通常に熟練した専門家に知られている標準的生化学の常識では、好適なインスリン類似体はＬｙｓ^B28Ｐｒｏ^B29−ヒトインスリン（Ｂ²⁸がＬｙｓであり、Ｂ²⁹がＰｒｏである）；Ａｓｐ^B28−ヒトインスリン（Ｂ²⁸がＡｓｐである）；Ａｓｐ^B1−ヒトインスリン、Ａｒｇ^B31，^B32−ヒトインスリン、Ａｓｐ^B10−ヒトインスリン、Ａｒｇ^A0−ヒトインスリン、Ａｓｐ^B1Ｇｌｕ^B13−ヒトインスリン、Ａｌａ^B26−ヒトインスリン、およびＧｌｙ^A21−ヒトインスリンである。
用語「アシル化」は蛋白質の遊離アミノ基に共有結合的に結合するアシル基の１個またはそれ以上を導入することを意味する。
用語「脂肪酸」は飽和または不飽和のＣ₆〜Ｃ₂₁脂肪酸を意味する。用語「活性脂肪酸エステル」は、たとえばここにその開示を参考のために引用するＭｅｔｈｏｄｓ・ｏｆ・Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２５巻：４９４〜４９９頁（１９７２年）およびＬａｐｉｄｏｔなど、Ｊ．ｏｆ・Ｌｉｐｉｄ・Ｒｅｓ．、８巻：１４２〜１４５頁（１９６７年）に記載されているような、一般的技術を使用して活性化されている脂肪酸を意味する。好適な脂肪酸は飽和されており、ミリスチン酸（Ｃ₁₄）、ペンタデカン酸（Ｃ₁₅）、パルミチン酸（Ｃ₁₆）、ヘプタデシル酸（Ｃ₁₇）およびステアリン酸（Ｃ₁₈）を含む。最も好ましくは、脂肪酸はパルミチン酸である。活性化脂肪酸エステルにはたとえばヒドロキシベンゾトリアジド（ＨＯＢＴ）、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドおよびその誘導体のような試薬の誘導体を包含する。好適な活性化エステルはパルミチン酸Ｎ−サクシンイミジルエステルである。
用語「交差結合」はシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を意味する。固有の交差結合をしたプロインスリン、インスリンまたはインスリン類似体はジスルフィド橋を３個含む。第一のジスルフィド橋はＡ鎖の６位と１１位にあるシステイン残基の間で形成される。第二のジスルフィド橋はＡ鎖の７位にあるシステイン残基をＢ鎖の７位にあるシステイン残基に結合する。第三のジスルフィド橋はＡ鎖の２０位にあるシステイン残基をＢ鎖の１９位にあるシステイン残基に結合する。
用語「水性」は共溶媒系ならびに溶媒として水のみの使用を含む。
本発明は脂肪酸アシル化蛋白質、特に脂肪酸アシル化プロインスリン、脂肪酸アシル化インスリンまたは脂肪酸アシル化インスリン類似体、をゲル化の発生を削減しながら加工処理するための改善された方法に関する。本発明は殊にゲル化発生を削減した蛋白質修飾、蛋白質豊富化または濃縮および蛋白質精製操作による脂肪酸アシル化蛋白質の加工処理法に関する。本発明はクエン酸緩衝剤を有する水性溶液を使用して行うアシル化蛋白質の加工処理、特に前記修飾、濃縮および精製操作、を有すること、および／または適当なら、クエン酸緩衝剤を有する水溶液の存在下に行なわれる操作を有すること、によって特徴付けられる。本発明の方法を使用して加工処理される好適なアシル化蛋白質にはＮ−アシル化−Ｌｙｓ^B29ヒトインスリン、好ましくはＮ−パルミトイル−Ｌｙｓ^B29ヒトインスリンおよびＢ２８−Ｎ^ε−アシル化Ｌｙｓ^B28Ｐｒｏ^B29−ヒトインスリン（Ｂ２８がアシル化Ｌｙｓであり、Ｂ２９がＰｒｏである）、好ましくはＢ２８−Ｎ^ε−パルミトイルＬｙｓ^B28Ｐｒｏ^B29−ヒトインスリンを含む。
本発明はまた脂肪酸アシル化蛋白質およびクエン酸緩衝剤を、脂肪酸アシル化蛋白質のゲル化を遅延させるために十分な量で含む、ゲル化に抵抗性のある脂肪酸アシル化蛋白質溶液に関する。
本発明が主体とする焦点である脂肪酸アシル化蛋白質の製造に使用するプロインスリン、インスリンおよびインスリン類似体は古典的（溶液）方法、固相法、半合成法、および最近の組換えＤＮＡ法を含む種々の認められているペプチド合成技術のいずれによっても製造できる。例えば、Ｃｈａｎｃｅなどの米国特許出願第０７／３８８２０１号、欧州特許公開第３８３４７２号、Ｂｒａｎｇｅなどの欧州特許２１４８２６号およびＢｅｌａｇａｊｅなどの米国特許第５３０４４７３号は様々なプロインスリンおよびインスリン類似体の製造を開示しており、ここに参考のために引用する。本発明のインスリン類似体に含まれるＡ鎖およびＢ鎖は組換えＤＮＡ技術を使用してプロインスリン様前駆体分子を経て製造してもよい。ここに参考のために引用するＦｒａｎｋなど、「ペプチド：合成−構造−機能（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、第７回米国ペプチドシンポジウム報告集、Ｄ．ＲｉｃｈおよびＥ．Ｇｒｏｓｓ編（１９８１年）参照。
一般に、プロインスリン、インスリンおよびインスリン類似体はたとえば活性脂肪酸エステルのような活性化脂肪酸誘導体と反応させることによってアシル化する。正常インスリンの脂肪酸によるアシル化は日本特許出願１−２５４６９９号に開示されている。Ｈａｓｈｉｍｏｔｏなど、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６巻：１７１〜１７６頁（１９８９年）も参照。これらの開示は参考のために本明細書に開示するものである。
好ましくは、このアシル化は極性溶媒中で塩基性条件下、すなわちｐＨ９．０またはそれ以上、好ましくは約１０．５のｐＨで行う。この反応は全部有機性極性溶媒の中で１０．７５に等しいかまたはそれ以上の水性ｐＫａを有する塩基を使用して実施できるが、本発明者は一般に有機溶媒と水性溶媒との混合物を反応媒体として選択する。好適な塩基はテトラメチルグアニジン、ジイソプロピルエチルアミン、または水酸化テトラブチルアンモニウムである。特に適切な溶媒の一つはアセトニトリルおよび水であって、アセトニトリルを約５０％含有するものであった。その他の極性溶媒にはジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、その他を含む。共溶媒系にはアセトンと水、イソプロピルアルコールと水、およびエタノールと水も含む。この反応を行うために適切な時間および温度条件は狭く限定されてはいない。０℃から４０℃までの温度および１５分間から２４時間までの反応時間は一般的に適当であろう。特にこのような脂肪酸アシル化インスリンを製造する好適な方法は共出願している１９９４年１１月１７日出願の米国特許出願第０８／３４１２３１号に記載されており、ここにその開示を参考のために引用する。
アシル化反応が完了すると典型的には反応混合物を水で希釈し、本発明の一つの態様にしたがってクエン酸を添加してアルカリ性を中和できる。得られるクエン酸は後続する濃縮および精製操作を含む加工処理のための緩衝剤として作用する。この態様では、クエン酸はアシル化蛋白質に水溶液として加え、溶液のｐＨをアシル化インスリンの等電点（等電点ｐＨ）以下にするために役立てる。通常は蛋白質はこの点で、後続する加工処理のために固有に緩衝された水性溶液中にある。そのような加工処理は殊に、たとえば逆相クロマトグラフィーまたは疎水性クロマトグラフィーのような標準的クロマトグラフィー法、クロスフロー濾過による濃縮、限外濾過による溶媒交換、その他による精製を含む。
アシル化プロインスリン、アシル化インスリンおよびアシル化インスリン類似体、殊にＮ−パルミトイル−Ｌｙｓ^B29ヒトインスリンおよびＢ２８−Ｎ^ε−パルミトイルＬｙｓ^B28Ｐｒｏ^B29−ヒトインスリンのためには、必要な水性クエン酸を使用してｐＨを通常は約３．０またはそれ以下、好ましくは約１．５と２．５の間に調整すべきである。必要ならば、たとえば水酸化ナトリウムのような塩基で所望の範囲内に保持するようにｐＨを再調整できる。Ｎ−パルミトイル−Ｌｙｓ^B29ヒトインスリンを加工処理するためには約２．５のｐＨが適当であることが見出されている。
本発明の広義の実践では、アシル化蛋白質は、たとえば蛋白質組成物を精製するためのクロマトグラフィー処理およびクロスフロー濾過および化学的処理および酵素的処理を含む広範囲な種類の化学的処理、物理的分離および精製操作に付されることができることが企図されている。そのような操作は全てを本発明のクエン酸緩衝剤の存在下に行ってゲル化の発生を削減することが好ましい。本発明が企図する蛋白質の加工処理には殊に、たとえば逆相クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、その他のような標準的クロマトグラフィー法による精製および限外濾過および同様な方法による蛋白質の濃縮を含む。蛋白質の加工処理にはそのような精製および濃縮段階のために蛋白質溶液を保存タンクその他の製造装置内に保存することも含めることも意図している。
本発明に従えば、クエン酸緩衝剤はたとえばアシル化反応から回収した脂肪酸アシル化インスリン溶液のような希アルカリ性溶液をたとえば塩酸または酢酸のようなその他の酸で中和し、続いてクエン酸塩を添加することによってアシル化インスリン水性溶液中で作製することもできる。適当なクエン酸塩には、例えばクエン酸一ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、クエン酸一アンモニウム、およびクエン酸二アンモニウムを含む。本明細書に使用する用語「クエン酸緩衝剤」には該蛋白質の水性溶液にクエン酸イオンを誘導する化合物を包含する。
アシル化インスリン溶液にゲル化遅延性を与えるために、溶液にはクエン酸イオン濃度を最低約２５ｍＭ、好ましくは約５０ｍＭで混入すべきであろう。さらに高い濃度も使用できるが、本発明者は複雑な加工処理の選択および起こりうべき精製段階を回避するために実用的上限として約１．０Ｍを推薦する。同様に、最良な性能発揮のためには加工処理の間は溶液のｐＨを約１．５と３．０の範囲内に維持すべきである。一般には約２．５のｐＨが適当であろう。
その後、ゲル化の見込みを削減するために、脂肪酸アシル化蛋白質溶液、特にアセトニトリルのような有機極性溶媒を含む脂肪酸アシル化インスリン水性溶液の加工処理は種々の蛋白質精製および蛋白質濃縮段階を含め、全てクエン酸緩衝液の存在下に行う。そのような加工処理段階は一般にたとえば脂肪酸アシル化インスリンのようなアシル化蛋白質の乾燥粉末としての究極的な単離を指向するものである。
例えば、脂肪酸アシル化インスリン反応生成物は粉末生成物の回収に先立ってクロマトグラフィーおよび限外濾過の逐次的段階を経て精製され、濃縮される。これらの加工処理の間のゲル化の発生率を削減するために、これらの精製段階はクエン酸緩衝剤の存在下に水性溶液中で行う。
例えばクロマトグラフィー的分離の場合には、アシル化反応から回収した蛋白質溶液は、有機溶媒中にあることもあるが、これをクロマトグラフィーカラムに負荷でき、次に少なくとも２５ｍＭのクエン酸緩衝剤、好ましくは約５０ｍＭのクエン酸緩衝剤を含有する水性移動相または水性溶離液を使用して展開するのが良いであろう。当技術分野の熟練者が認識するように、カラムからの蛋白質溶離を促進するために溶離液は濃度をカラムの展開の間に変化させた（勾配溶離）、たとえばアセトニトリルのような有機極性溶媒を包含させるであろう。必須ではないが、分離すべき蛋白質溶液はクエン酸緩衝液を含む溶液としてカラムに負荷することは好適なことである。
限外濾過操作の場合は、インスリン溶液をクエン酸緩衝液中にある限外濾過膜に入れるのに加えて、限外濾過洗浄液も全てに少なくとも２５ｍＭのクエン酸緩衝剤、好ましくは５０ｍＭのクエン酸、を含有させるべきである。
精製および濃縮段階の後に、精製脂肪酸アシル化蛋白質、特に脂肪酸アシル化プロインスリン、脂肪酸アシル化インスリンまたは脂肪酸アシル化インスリン類似体の水性溶液を加工処理して可溶性蛋白質を粉末として回収できる。本発明の広義の実施においては、リオフィリゼーション（凍結乾燥）、結晶化または沈降技術を含めてアシル化蛋白質を粉末として回収する操作はいずれも使用できる。本発明は該アシル化蛋白質を粉末型で分離する方法および回収する方法には限定されるものではない。
本発明の製法を使用して製造したものでもよいアシル化インスリンおよびアシル化インスリン類似体の粉末はインスリン療法で使用する医薬組成物、すなわち必要とする患者（すなわち高血糖症患者）に投与するための医薬組成物、を製造するために有用である。このような医薬組成物は有効量の脂肪酸アシル化インスリンまたは脂肪酸アシル化インスリン類似体を医薬的に許容される添加剤または担体の１種またはそれ以上と組合せて成分の一つとしてクエン酸緩衝剤を含有する水溶液中に含有してもよい。この目的のためには、医薬的組成物は典型的には１ｍＬ当り約１００単位または類似の濃度の脂肪酸アシル化インスリンまたは脂肪酸アシル化インスリン類似体の有効量を含むように製剤化してもよい。これらの組成物は、必須ではないが典型的には本質的に非経口用であって当技術分野でよく知られている非経口用製品のための通常の添加剤または担体を使用する種々な技術のいずれかによって製造してもよい。例えば、ここに参考のために引用する「レミントンの製剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ・Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ・Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１７版、Ｍａｃｋ出版社、米国ベンシルバニア州イーストン（１９８５年）を参照。例えば、非経口投与のための用量剤型は所望量のインスリン粉末をたとえば水性基剤のような注射剤に適する非毒性液体基剤に懸濁または溶解し、懸濁剤または液剤を滅菌することによって調製してもよい。あるいは、秤量された量のインスリン粉末をバイアルに入れ、そのバイアルと内容物を滅菌して、密封してもよい。付随するバイアルまたは基剤を投与に先立って混合する目的で提供できる。
非経口投与に適応する医薬的組成物には、たとえば水およびたとえばグリセリンのような水混合性有機溶媒、ゴマ油、南京豆油、水性プロピレングリコール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、およびその他のような希釈剤、添加剤および担体を採用する。そのような医薬的組成物の例はインスリンの無菌等張性水性食塩水溶液であって、医薬的に許容される緩衝液で緩衝でき、さらに発熱性物質不含のものを包含する。これに加えて、非経口医薬製剤はたとえばメタクレゾールのような保存剤、たとえば水酸化ナトリウムまたは塩酸のような最終生産物のｐＨを調製するその他の薬剤、およびたとえば亜鉛塩のような安定化剤を含有してもよい。
以下の実施例は本発明を例示し、説明するために提供する。本発明をＮ−パルミトイル−Ｌｙｓ^B29ヒトインスリン溶液の加工処理を参照しつつ例示するが、本発明の範囲が実施例に限定されると考えるべきではない。特段の記載がない限り、部および百分率の記載はすべて重量に基づき、温度は全部摂氏で表示する。
実施例１
約１２．５容量％のアセトニトリルと１２．５ｍＭ−ホウ酸とを含有するｐＨ２．５の脂肪酸アシル化生合成ヒトインスリン（Ｎ−パルミトイル−Ｌｙｓ^B29ヒトインスリン）の水溶液を温度を４℃として、低圧の逆相クロマトグラフィーカラムに負荷した。このカラムはＭｉｔｓｕｂｉｓｉから購入でき、ＳＰ２０ＳＳ樹脂を充填してあり、あらかじめ１０容量％のアセトニトリルおよび５０ｍＭ−クエン酸を含むｐＨ２．５の水溶液で平衡させ、温度を４℃とした。アシル化インスリンを充填した樹脂１リットル当りインスリン７ｇの割合で樹脂上に負荷した。カラムに負荷後、カラムを１カラム容の２５容量％アセトニトリルおよび５０ｍＭ−クエン酸を含むｐＨ２．５の水性緩衝溶液で洗浄した。負荷したカラムを次に２５容量％から５５容量％までの直線性勾配アセトニトリルを含有し、ｐＨ２．５を示す５０ｍＭ−クエン酸水溶液で４℃で溶離した。カラムを５カラム容の溶離液で溶離した。画分を集めて順次に貯蔵した。
得られた主成分の一部を２週間４℃に保ち、他の部分の一部を２５℃に１２〜１６時間保持したが、どちらの溶液にもゲル化の兆候は目視できなかった。
比較実施例１
約１２．５容量％のアセトニトリルと１２．５ｍＭ−ホウ酸とを含有するｐＨ２．５の脂肪酸アシル化生合成ヒトインスリン（Ｎ−パルミトイル−Ｌｙｓ^B29ヒトインスリン）の同様な水性溶液を温度を４℃として、低圧逆相クロマトグラフィーカラムに負荷した。この場合、カラムにはＳＰ２０ＳＳ樹脂を充填し、あらかじめ１０容量％のアセトニトリルおよび２０ｍＭ−グリシンを含むｐＨ２．８〜３．２の水性溶液に代えたものと平衡させた。同じインスリン負荷率、洗浄操作および溶離プロトコルを使用して画分を集めて順次に貯蔵した。この場合、得られた主成分の一部を４℃に保ったものは３日以内にゲル化したが、２５℃に保った別の主成分は１時間以内にゲル化した。異なる緩衝液で集めた実施例１および比較実施例１の主成分の純度は有意に異なるものではなかった。
実施例２
約３２容量％のアセトニトリルと５０ｍＭ−クエン酸塩とを含むｐＨ２．４５の脂肪酸アシル化生合成ヒトインスリン（Ｎ−パルミトイル−Ｌｙｓ^B29ヒトインスリン）の水性溶液を経膜圧１０から４０ｐｓｉで、５℃〜１３℃の範囲内の温度で、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社５０００分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）膜（１平方フィート）を通して交差流速１．５から２．０Ｌ／分で限外濾過して、濃度を４．０ｍｇ／ｍＬから約１５ｍｇ／ｍＬまで上昇させた。限外濾過の間にゲル形成がなかったのみでなく、アシル化インスリン１５ｍｇ／ｍＬおよび約３２容量％のアセトニトリルを含有するこの透析液を５℃で２週間貯蔵したがゲル形成の兆候は見られなかった。
比較実施例２
３２％のアセトニトリルおよび２０ｍＭ−グリシンを含有するｐＨ２．５の脂肪酸アシル化生合成ヒトインスリン（Ｎ−パルミトイル−Ｌｙｓ^B29ヒトインスリン）の水性溶液を浸透物を再循環して容器に入れて溶液が濃縮されないようにしながら、実施例２と同じ流速と経膜圧条件を使用して９℃〜１６℃の範囲内の温度で、蛋白質濃度４．５ｍｇ／ｍＬで限外濾過した。この溶液をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社５０００分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）膜（１平方フィート）を通して１時間濾過した。４．５ｍｇ／ｍＬのアシル化インスリンを含有するこの透析液を５℃で２日間貯蔵したところゲルの大きな凝集塊が見られた。限外濾過装置で加工処理しなかった原溶液の試料は同じ貯蔵条件下にゲル化しなかった。
実施例３
約３５から４０容量％のアセトニトリルと５０ｍＭ−クエン酸を含むｐＨ２．４５の脂肪酸アシル化生合成ヒトインスリン（Ｎ−パルミトイル−Ｌｙｓ^B29ヒトインスリン）の水性溶液を交差流速約１．５から２．０Ｌ／分、経膜圧１０から４０ｐｓｉ、および５℃〜１３℃の範囲内の温度でＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社５０００分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）膜（１平方フィート）を通して限外濾過し、その濃度を７．５ｍｇ／ｍＬから約７０ｍｇ／ｍＬまで上昇させた。限外濾過の間にゲルは形成しなかった。
比較実施例３
約３５から４０容量％のアセトニトリルおよび２０ｍＭ−グリシンを含有する脂肪酸アシル化生合成ヒトインスリン（Ｎ−パルミトイル−Ｌｙｓ^B29ヒトインスリン）の水性溶液をｐＨ２．５でＡｍｉｃｏｎ社３０００ＭＷＣＯ限外濾過膜を通して実施例３と類似の交差流速と経膜圧条件を使用して５℃〜１０℃の範囲内の温度で限外濾過して濃度を１．５ｍｇ／ｍＬから上昇させた。アシル化インスリン濃度が約６ｍｇ／ｍＬに達した時、溶液が曇り始めた。濃度が１０ｍｇ／ｍＬに達した時、溶液がゲル化した。最初のアシル化インスリン溶液に約２０容量％までアセトニトリルを加えて希釈すると、ゲル化なしに１０ｍｇ／ｍＬまで蛋白質を濃縮することができた。
本発明の原理、好適な態様および操作の態様を以上のこの明細書に記載した。本明細書により保護を求める発明は開示した特定の型は説明を目的とするものであって、限定を目的とするものではないので、それらに限定されると理解すべきではない。当技術分野の熟練者には本発明の本質から逸脱することなしに様々な変種および変化ができる。例えば、本発明は脂肪酸アシル化プロインスリン、脂肪酸アシル化インスリンおよび脂肪酸アシル化インスリン類似体の精製および究極的回収の関係について、特にＮ−パルミトイル−Ｌｙｓ^B29ヒトインスリンの加工処理に関し、特定的に記載したが、本発明はその他の脂肪酸アシル化蛋白質にも摘要できるであろうと思われる。

Claims (5)

1. 脂肪酸アシル化蛋白質およびクエン酸緩衝剤を含むゲル化に抵抗性のある脂肪酸アシル化蛋白質の水性溶液であって、該脂肪アシル化蛋白質が脂肪酸アシル化インスリンおよび脂肪酸アシル化インスリン類似体から構成される群から選択され、該クエン酸緩衝剤が該脂肪酸アシル化蛋白質のゲル化を遅延させるに十分な濃度で存在する水性溶液。
2. 脂肪酸アシル化蛋白質が、Ｂ３０位のアミノ酸残基がＴｈｒもしくはＡｌａであるか、または欠失している脂肪酸アシル化インスリン類似体である請求項１に記載の溶液。
3. 脂肪酸が、ミリスチン酸である請求項２に記載の溶液。
4. 請求項１−３のいずれか１つに記載の水性溶液を用いて脂肪酸アシル化蛋白質を溶離することを特徴とする、クロマトグラフィー分離によって脂肪酸アシル化蛋白質を精製する方法。
5. 脂肪酸アシル化蛋白質を請求項１−３のいずれか１つに記載の水性溶液として濾過膜に供給することを特徴とする、クロスフロー濾過によって脂肪酸アシル化蛋白質の溶液を濃縮する方法。