DE2428412A1

DE2428412A1 - Verfahren zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten

Info

Publication number: DE2428412A1
Application number: DE19742428412
Authority: DE
Inventors: Rolf Dr Geiger; Rainer Dr Obermeier
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1974-06-12
Filing date: 1974-06-12
Publication date: 1976-01-15
Also published as: SE7506695L; BE830186A; CA1044227A; IL47443A0; FR2274605B3; DK263175A; JPS5811427B2; US4014861A; JPS5123290A; LU72693A1; CH613185A5; GB1516515A; AU8203875A; IL47443A; FR2274605A1; NL7506754A

Description

HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT •

Ak t e nz e i ehe η i

HOE

164

Datum: 10. Juni

Dr. HG/vL

Veirfahren zur Herstellung von Insulin, Insulin-Analogen und - Derivaten

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Insulin, Insulin-Analogen und -Derivaten, das dadurch, gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel I

	Υ~	Ly s	Insulin-B-Kette


Ί Ι

Insulin-Α-Kette

έ s ' 1 ? f

in der Y H oder einen Acylrest und

O=C

oder

•Met

'CO-Met-

bedeutet, worin Met den Methionylrest und η die Zahl 1 - k bedeutet und ein GH_p durch 0 ersetzt sein kann, mit Bx-omcyan

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im sauren Medium behandelt.

Nach Biochem Biophys. Res. Commun. J>J5(1973) Seite 60, kann Insulin aus seinen Ketten dadtirch hergestellt werden, daß man die <£-Aminogruppe der A-Kette und die £-Aminogruppe der B-Kette über eine ff » ¹^ '-Diaminodicarbonsäure miteinander verbindet, durch Dehydrierung die Disulfidbrücken des Insulins formelgerecht schließt und anschließend die £ » «£'-Diaminodicarbonsäure durch Edraan-Abbau heraus spalte t.

Mit diesem Verfahren konnten erstmals die beiden Ketten des Insulins in hoher Ausbeute vereinigt werden. Auch der Edman-Abbau gelang, jedoch war ein gewisser Abfall der Ausbeute unvermeidlich.

Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet nun die Vereinigung der beiden Ketten in derselben Ausbeute.Beim Herausspalten des Brückenreagens liegt die Ausbeute jedoch höher. Die Abspaltung kann außerdem in einer einzigen Reaktion geschehen. Während der Edman-Abbau über zwei Stufen,.nämlich die Reaktion der Aminogruppen mit Phenylsenföl und die Abspaltung der Thiocarbamoylverbindung z.B. in Trifluoressigsäure, verläuft, läuft die Bromcyanspaltung ohne Isolierung von Zwischenprodukten ab. Sie führt ferner zu weniger Nebenprodukten als der Edman-Abbau, wodurch die Reinigung der Reaktionsprodukte einfacher wird.

!fahrend beim Edman-Abbau auch die erste Aminosäure der B-Kette, z.B. Phenylalanin, gleichzeitig abgespalten wird, wenn die «(-Aminogruppe nicht mit einer Schutzgruppe versehen ist, ist dies bei Anwendung der Bromcyanspaltung nicht der Fall, jedoch kann es auch hier für einen glatten Reaktionsablauf vorteilhaft sein, die'C-Aminogruppe der B-Kette zu schützen.

Das Prinzip der Reaktion bei der Herstellung der Verbindungen ' der allgemeinen Formel I durch Aufeinanderfolge der Verknüpfungen des bifunktionelleii Brückengliedes JR mit der A- bzw. B-Kette des Insulins ist bereits in

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der oben genannten Literatursteile, sowie in der Deutschen Offen legungsschrift 2 252 157 beschrieben.

Zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel 1 wird eine Insulin-A-Kette, deren SH-Gruppen durch eine der bekannten S-Schutzgruppen wie z.B. Trityl, Diphenylmethyl, S-Alkyl mit 1 _ k C-Atomen, Picolyl, Acetamidomethyl oder SuIfonat blockiert ist, mit überschüssigem Reagens der allgemeinen Formel II

OV

(II)

umgesetzt, in der R die angegebene Bedeutung besitzt und OV den Rest eines aktiven Esters der Methioninkomponente, z.B. des N-Hydroxysuccinimidesters-, Nitrophenyl-, TrAchlorphenyl-, Penta chlorphenyl-, Pentafluorphenyl- oder 1-HydiOxybenzotriazolesters darstellt.

Dabei entstehen Verbindungen der allgemeinen Formel III

/^V JX γ Insulin-A-Ke 11e

SX SX

(in)

in der X eine S-Schutzgruppe bedeutet. Als Lösungsmittel für diese Reaktion verwendet man bevorzugt Dimethylsulfoxid (dMSO) oder ein Dialkylcarboiisäureamid, insbesondere Dimethylformamid (DMF) oder Phosphorsäuretrisdimethylamid. Die Umsetzung läuft bei Raumtemperatur ab, jedoch kann auch leicht erhöhte Temperatur angewandt werden.

In entsprechender Weise setzt man dann die Verbindung der allgemeinen Formel III mit einer Insulin-B-JCette bei einem pH von etwa 8 - 11 bzw, unter Zusatz einer tert. organischen Base wie N-Äthylmorpholin in DMSO oder DMF um und.erhält Verbindungen

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/k ■

dar allgemeinen Formel IV

SX SX	GIy-	Insulin-A-Kette	Y-	Phe-	Ly,	Insulin-B-Kette

SX SX SX SX

in der R und Y die oben genannte Bedeutung besitzen. Als N-N-Schutzgruppe (γ) kommen z.B. tert.-Butyloxycarbonyl (Boc)-, Phtaloyl- oder Trifluoracetylreste in Betracht.

Wenn Y eine N-Schutzgruppe ist, kann die beschriebene Reaktionsfolge auch in der umgekehrten Reihenfolge, d.h. zunächst Verknüpfung mit der B-Kette und anschließend Verknüpfung mit der A~Kette, vorgenommen werden.

Man nimmt das Reaktionsprodukt, ggf. nach Abspaltung noch vorhandener Schutzgruppen und evtl. chromatographischer Reinigung, in 8 M wässriger Harnstofflösung oder Fässer von pH 5-9 auf. Wenn X z.B. -SO H ist, versetzt man unter Stickstoff bei 0 - 60 mit einem 50 - 100-fachen Überschuß an Thioglycol oder der 1 - 5-faohen berechneten Menge an Trialkylphosphin, z.B. Tributylphosphin, fällt nach beendeter Reduktion mit essigsaurem Aceton, zentrifugiert u. wäscht mehrmals mit essigsaurem Aceton. Dann löst man in möglichst wenig wässrigem NH„ und verdünnt mit 0.05 M (NH^)HCO , eingestellt auf pH 10 - 10.6, auf eine Peptidkonzentration von 0.01 - 1 mg/ml, und rührt über Nacht bei ο - 20 im langsamen Luftstrom. Man kann auch bei niedrigerem pH, z.B. 8 - 10, arbeiten, benötigt dann aber längere Reaktionszeiten bis ca. 150 h. Der MetHionin-Schwefel wird unter diesen Reaktionsbedingungen im allgemeinen nicht oxydiert. Ggf. setzt' man einen schwerflüchtigen Thioäther, z.B. Methylphenylsulfid oder auch Methionin zu. Anschließend stellt man.mit 1 η Essigsäure auf pH k - 5*5 ein und lyophilisiert oder dampft die

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erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel I im Vakuum zur Trockene ein.

Zur Reinigung wird in 1 bis Zn Essigsäure über Sephadex-G 50® oder G 75 in einer Säule von 1 bis 2 m Länge chromatographiert. Der "Jnsulinpeak" (bis ca. 7O $) wird wie folgt weiterverarbeitet, falsch kombiniertes Produkt (bis ca. 30 $) nacli Reduktion erneut der Rekombination zugeführt.

Die erfindungsgemäße Abspaltung des Restes R aus den Verbindungen der allgemeinen Formel I erfolgt durch Eromcyanspaltung in saurem Medium. .

Man löst die Verbindungen der allgemeinen Formel I "bei einem pH von etwa 0 - 3 in einer wässrigen anorganischen oder organischen Saure. Als anorganische Säuren kommen z.B. Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure in Frage. Hinreichend saure organische Säuren sind z.B. Ameisensäure, Essigsäure, Chloressigsäure, Tri~ fluoressigsäure oder eine Sulfosäure wie z.B. Benzol- oder Toluol sulf ons äure. Um die Löslichkeit der Verbindungen der allgemeinen Formel I zu erhöhen, kann die organische Säure in hoher Konzentration, z#B. 4o - 90 fo_f verwendet werden, oder man setzt der Lösung mit Wasser mischbare, hinreichend säurestabile organische Lösungsmittel wie z.B. aliphatisch^ Alkohole mit 1 - Λ C-Atomen, Carbonsäureamide wie z.B. N~Methylpyrrolidin, Dimethylformamid, Dimethylsülfoxid oder Dioxan zu, Dann versetzt man mit einem Überschuß Bromcyan* Vorteilhaft beträgt dieser Überschuß etwa 30 - 200 Moleküle Bromcyan auf einen Methioninrest. Man läßt die Reaktion bei etwa 0 - 35 ablaufen; die Reaktionszeit beträgt in Abhängigkeit von der Temperatur etwa 2 - 50 Stunden.

Die Aufarbeitung erfolgt beispielsweise so, daß man das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert oder bei Verwendung hochsiedender Lösungsmittel nach Abdestillieren des Wassers im Vakuum die" Reaktionsprodtikte mit Äther oder Essigester ausfällt. Den Rückstand bzw. den Niederschlag nimmt man in wenig .verdünnter Essig-CD ® säure aLif und chromatographiert an Sephadex G 50 oder G 75·

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Man eluiert mit verdünnter Essigsäure, vereinigt die insulinhaltigen Fraktionen und stellt das pH auf 5.2. Dabe'i kristallisiert das zunächst amorph, ausgefallene Insulin innerhalb einiger Stunden ο
Ausb etwa 4θ fo, bezogen auf eingesetzte Insulin-Α- bzw. B-Kette»

Das kristallisierte, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Insulin besitzt- bei der Bestimmung der biologischen Wirkung durch Messen der Blutzuckersenkung am Kaninchen Zh I.E./mg. Die Aminosäureanalyse ist korrekt.

Außer Insulin selbst können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch Insulin-Analoga und -Derivate hergestellt werden. Unter Insulin-Analoga werden Verbindungen verstanden, in denen eine oder mehrere Aminosäuren gegen, andere, vorzugsweise einfachere Aminosäuren ausgetauscht sind, ferner Insuline mit veränderter, ¹Orzugsweise verkürzter Kettenlänge.

So können, wie bereits aus der Literatur bekannt ist, z.B. in der A-Kette Gin⁹ und GIn ^D durch GIu, Ser , Tyr , Asn und Asn durch Ala, VaI durch Leu oder eine andere hydrophobe Amino-

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säure, ferner Tyr durch Phe ersetzt sein.

1 2 3 4 5

In der B-Kette ist der Ersatz von Phe , VaI , Asn , GIn , His ,

9 10 27 28

Ser , His , Thr und Pro durch einfachere Aminosäuren, vorzugsweise Alanin, möglich. Die Aminsäuren 1 bis K und 30 können auch eliminiert sein. !
durch AIa ist möglich.

Δ *7

auch eliminiert sein. Selbst der Ersatz von Cys und Cys

Als Insulin-Derivate gelten Verbindungen, die substituierte funktioneile Gruppen tragen. So kann z.B. die c£-Aminogruppe der B-Kette durch einen Acylrest analog DOS 2 θ42 299 substituiert sein. Dasselbe gilt für die oben definierten Insulin-Analoga.

Da die Substitution der cC -Aminogruppe der Insulin-B-Kette durch einen beliebigen Rest Y hinsichtlich der biologischen Wirkung nicht kritisch ist, kann Y nicht nur eine der typischen

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/7

N~Schutzgruppen der Peptidchemie sein, sondern einen beliebigen, physiologisch verträglichen Acylrest darstellen, der allerdings in seiner räumlichen Ausdehnung begrenzt sein muß* Diese Grenze liegt z,B. bei aliphatischen Alkanoyl- oder Alkyloxycarbonylresten bei etwa 6 C-Atomen, bei einem Cycloalkanoylrest oder dem Rest einer aromatischen oder heterocyclischen Carbonsäure bei etwa 10 C-Atomen. Y kann auch Aminoacylreste der natürlich vorkommenden J^-Aminosäuren oder deren D-Enantiomeren und U) -Aminocarbonsäuren bis etwa 6 C-Atomen bedeuten, sowie deren N-Alkanoyl- oder N-Alkyloxycarbonylverbindungen bis etwa k C-Atomen, Cycloalkanoyl oder die Reste aromatischer oder heterocyclischer Carbonsäuren bis etwa 7 C-Atomen.

Voraussetzung bei solchen Substitutionen ist stets, daß die biologische Wirkung der Insuline nicht oder nicht wesentlich verringert wird. Dabei ist unter "biologischer Wirkung" nicht nur die Senkung des Blutzuckers zu verstehen, sondern z.B. auch die Fähigkeit solcher Verbindungen, als Haptene für vorhandene Antikörper zu dienen. .

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Insulin oder seine Analogen und Derivate werden anstelle des aus Pankreas gewonnenen Materials zur Behandlung des Diabetes mellitus eingesetzt bzw. ganz allgemein verwendet, wenn der Blutzucker, z.B. zur Erzeugung eines Schocks, gesenkt werden soll.

Die Insulin-Α- und B-Ketten werden nach einem der zahlreichen in der Literatur beschriebenen Verfahren hergestellt. Zur Demonstration des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es einfacher,' von natürlichen Ketten auszugehen, die z.B. durch Sulfitolyse leicht aus Insulin erhalten werden können. Die durch Synthese hergestellten Insulinketten verhalten sich -wie das natürliche Material. Dies gilt auch für abgewandelte Ketten, sofern diese Ketten noch die entscheidenden strukturellen Merkmale für die biologische Wirkung des aus ihnen hergestellten Insulins besitzen.

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Vie Reagentien der allgemeinen Formel II werden z.B., durch Umsatz von Methionin-alkylester, bevorzugt -methylester mit einem

Derivat der Kohlensäure oder aktivierten Dicarbonsäuren, Verseifen des Alkylesters und Überführen in einen aktiven Ester erhaltene Die folgenden Reaktionsschemata beschreiben diese Reaktionsfolge:

.Met-OCH OH" ^,Met-OH ^Met-OCH^ \Met-OH

a.) 2 H-Met-OCH +

+ 2HONSu ν + 2DCCI '

O=C

Met-ONSu

\Met-ONSu

b.) H-Met-OCH +

CH₂—CO

CO-Me t-OCH

H-Met-OCH, DCCI

CH -CO-Met-OCH
ti.

CH„-CO-Met-

OCH,

OH

CH -CO-Met-OH

+ 2 HONSu + 2 DCCI

■»■r

H₂-C0-Met-0NSu

CH -CO-Met-ONSu

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■■-*- 2A28412

Beispiel 1

Herstellung von Brückenreagentien ·

a) Bernsteinsäure-bis-L-methioninmethyIester

Man löst 4.0 g L-Methionin-methylester-hydrochlorid in 60 ml Dimethylformamid unter Zugabe von 2.8 ml Triäthylamin. Nach. Zusatz von 2.0 g Bernsteinsäureanhydrid rührt man 2 h, gibt nochmals 4.0 g L-Methioninmethylester-hydrochlorid und 2.8 ml Triäthylamin zu und versetzt nach 30 Min. mit 2.7 g 1-Hydroxybenzotriazol und 4.4 g Dicyclohexylcarbodiimid, rührt 4 h, engt im Vakuum auf ein kleines Volumen ein und nimmt den Rückstand in Essigester auf. Nach Waschen der Lösung mit wässrigem KHSO; , NaHCO und Wasser trocknet man über Na SO. und destilliert den

J ti H-

Essigester im Vakuum ab. Man löst den Rückstand in Toluol, filtriert und versetzt bis zur beginnenden Trübung mit Petroläther. Beim Stehen über Nacht (-20 ) fallen 4.8 g amorphes Material aus.

b) Bernsteinsäure-bis-L-methionin

3·5 g des Bis-methylesters (la) werden in 80 ml Dioxan/Wasser (iti) gelöst. Man verseift bei pH 11.5-12 mit 8.9 ml SN NaOH, gibt nach beendeter Reaktion dieselbe Menge 2N HCl zu und bringt im Vakuum zur Trockne. Der Rückstand wird in Isopropanol aufgenommen, von NaCl abfiltriert und nach Abdestillieren des Isopropanols zweimal aus Essigester umkristallisiert. Ausbeute 2.8. g Schmp. 125 *· 135°.

Zur Charakterisierung der Säure wird das Dicyclohexylaminsalz hergestellt und aus Acetonotril/lsopropanol (1:1) umkristallisiert. Schmp. 184 - 185 · Elementaranalyse korrekt.

c) Bernsteinsäure-bis-L-methionin"N-hydroxysuccinimidester Man stellt aus 4.0 g der nach b) gewonnenen Säure, 2.4 g N-hydroxysuccinimid und 4.2 g DCCI in Dioxan in bekannter Weise den Bis-N-hydroxysuccinimidester her, filtriert von ausgefallenem Dicyclohexylharnstoff ab, und destilliert das Lösungsmittel im Vakuum ab. Der Aktivester ist harzig und wird ohne weitere Rei-r nigung verwendet.

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d) Glutarsäure-bis-L-methionin-N-hydroxysucclnimidester Man stellt die Verbindung analog a) bis c) her. Der Aktivester ist auch hier ein Harz und wird ohne weitere Reinigung eingesetzt. Schmp. der Säure 66 - ¹JO , Dicyclohexylaminsalz 187 ~ Elementaranalyse korrekt.

Beispiel 2 Rinder-Insulin

a) Rinderinsulin-A-Ke ft en-tetrasulfonat

Die Herstellung aus Rinderinsulin erfolgt in bekannter Weise, z.B. nach Z. Naturforsch. 18b (I963), Seite 978.

b) N -Trifluoracetyl-B-Ketten-disulfonat (Rind)

B1
Herstellung durch Sulfitolyse von N -Trifluoracetyl-insulin (Rind) in bekannter Weise. Dieses Ausgangsprodukt wird wie folgt gewonnen:

N"*- ,N^- -Bis-Boc-insulin, hergestellt nach Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chera. 352 (1971), Seite 1487, wird in Dimethylformamid gelöst und mit ca. 5 Äquival. Trifluoressigsäure-methylester umgesetzt. Dabei entsteht N^ , N * -Bis-Boc -N trifluoracety1-insulin (Rind). Nach Abspalten der Boc-Gruppen durch 45 Min. Behandeln mit Trifluoressigsäure wird das Pro-

dukt durch Verteilung-schromatographie an Sephadex LH-20 im System n-Butanol-Eisessig-Wasser (2:1:10) gereinigt.

c) Rinderinsulin

2.82 g des nach 2^ hergestellten A-Ketten-tetrasulfonats werden in20O ml Dimethylsulfoxid unter Zugabe von 1.11 ml N-Äthylmorpholin auf pH^9 gebracht und mit 1,8 g des nach Beispiel 1c) hergestellten N-Hydroxysuccinimidesters gerührt. Nach 20 h wird mit Äther/Methanol (iOji) gefällt.

Nun nimmt man wieder in 200 ml Dirnethylsulfoxid auf, gibt 3.45 g des nach 2.b) hergestellten N -Trifluoracetyl-B-Ketten-disulfonats und 1.1 ml N-Athylmox-pholin zu und rührt 6 - 24 h bei Raumtemperatur. Dann wird mit Äther/Methanol (1O:1) gefällt.

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Ausbeute 5*3 S*

Nach. Saulench.romatograph.ie an Sephadex G 50 (Säule: l=*!m, 0=4cm) in 0.05 M (NH^)HCO -Puffer pH 8.5 - 9, und Gefriertrocknung wird das Produkt (3· 3 s) iⁿ 0.25 1 Wasser von pH aufgenommen. Man setzt 50 nil Thioglycol zu, bewahrt 6 h unter Stickstoff auf, fällt mit der 10 - 20-fachen Menge essigsaurem Aceton, zentrifugiert und wäscht mit essigsaurem Aceton frei von Thioglycol. Dann löst man in wenig 1N NH„, vei-dünnt auf 25. 1» stellt auf pH 9 und rührt in Anwesenheit von 1 g Methyl-phenylsulfid etwa 100 h im .leichten Luftstrom bei Raumtemperatur.

Unter diesen Bedingungen wird gleichzeitig die Trifluoracetylgruppe abgespalten. Man stellt mit Essigsäure auf pH 5·5 und lyophilisiert.

Der Rückstand wird in 50 ml 10 ^iger Essigsäure oder Ameisen-

® säure gelöst und über eine Säule 4 χ 200 cm Sephadex G 50 oder G 75» fine, chromatographiert. Auch Verteilungschromatographie an Sephadex LH 20 im System n-Butanol-Essigsäure-Wasser (2:1:10) ergibt eine gute Reinigung (Säule k χ 100 bis k χ 200). Die Säulen werden mit vernetztem Insulin geeicht. Nach einem Vorpeak wird nach J.Amer.Chem.Soc. £3_C¹97¹)» Seite 3080,mit 1. 4-Dith.iothreitol in flüssigem NH_ oder mit Tributylphosphin .in verdünntem wässrigem NH„ bei pH 8-10 reduziert und wie oben in Wasser bei pH 9 oxydiert.

Zur Abspaltung des Vernetzungsreagens löst man in 100 ml 70 ^iger Ameisensäure, gibt 15 g BrCN zu und engt nach 15 h auf ein kleines Volumen ein* Man gibt sofort auf eine Säule Sephadex G (100 χ 4 cm) und eluiert mit 1 ^iger Essigsäure." Man vereinigt die Insulin enthaltenden Fraktionen, engt im Vakuum auf ca. hü ml ein, stellt das pH unter Zugabe von etwas ZnCl auf ein und läßt 1 Tag bei Raumtemperatur stehen. Die gebildeten Kristalle werden durch Abschleudern von nichtkristallisxerendem Material getrennt, und die Kristallisation wiederholt. Ausb. 2.3 g (3.8 °/o). Biologische Wirkung des Insulins Zk I.E. /mg.

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Claims

hoe 74/f 164 Patentansprüche

1.)Verfahren zur Herstellung von Insulin, Insulin-Analogen und -Derivaten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel I

Insulin-A-Ke tte

Insulin-B-Kette

in der Y H oder einen Acylrest und R

O=C

oder

CO-Met-

■Met

bedeutet, worin Met den Methionylrest und η die Zahl 1-4 bedeutet und ein CH durch 0 ersetzt sein kann, mit Bromcyan im sattren Medium behandelt.

2.)Insulin-Derivat der allgemeinen Formel I

,S-

R-

Insulin-A-Kette

Insulin-B-Kette

T S

Lys

(D

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- 13 - HOE 74/F

in der Y H oder einon Acylrest und R

JAe t O=C oder (CH )

bedeutet, worin Met den Methionylrest und η die Zahl 1-4 bedeutet und ein CII₉ durch im sauren Medium behandelt.

deutet und ein CII₉ durch 0 ersetzt sein kann» mit Bromcyan

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