DE2460753A1

DE2460753A1 - Verfahren zur herstellung von humaninsulin

Info

Publication number: DE2460753A1
Application number: DE19742460753
Authority: DE
Inventors: Rainer Dr Obermeier
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1974-12-21
Filing date: 1974-12-21
Publication date: 1976-06-24
Also published as: GB1521919A; US4029642A; DK580975A; JPS5191288A

Description

Herstellung von Humaninsulin

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Human insulin, dadurch gekennzeichnet, daß man Des-B₂..,_-, „-Oktapeptid-Schweineinsulin der allgemeinen Formel (I)

A,

A-Kette

Asn

-J

-OH

(I)

B-Kette

Arg

-OH

22

in- der R eine protonensolvolytisch oder durch ß-Eliminierung abspaltbare Aminoschutzgruppe wie den tert-Butyloxycarbonyi-(Boc), den tert-Äitiyloxycarbonyl-(Äoc) oder den Methylsulfonyläthyloxycarbonyl-(Msc)-rest bedeutet₇ mit einem Peptid der Formel (II)

H-Gly-Phe-Phe*-Ty"r-(X) -Thr (X) -?ro-Lys (BOG ) -Thr (Bu ) OBu

(II)

in der X für Wasserstoff oder den tert-Butylrest steht, kondensiert und die Schutsgruppen durch Behandeln mit Trifluoressigsäure oder ggf. Alkali abspaltet.

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Die Verwendung von Bruchstücken aus natürlich vorkommenden Peptiden oder Proteinen zur Senisynthese von Peptiden ist verschiedentlich vorgeschlagen worden. So wurde z.B. in Science (19 72), Seite 623 die Umwandlung von Schweineinsulin in Humaninsulin beschrieben.

Diese beiden Insuline unterscheiden sich nur in der C-terminalen Aminosäure der B-Kette. Da sich im C-terminalen Bereich der B-Kette eine durch Trypsin spaltbare Arginyl-Glycin-Bindung befindet, lag der Gedanke nahe, das bereits bekannte Des-B₂2_3Q peptid-Insulin (Schwein) (Biochim. Biophys. Äcta 133 (1967), Seite 219) als Ausgangsprodukt zu benützen und anstelle des abgespaltenen Oktapeptids ein synthetisch hergestelltes Derivat einzuführen, das der Aminosäuresequenz des Humaninsulins mit Threonin statt Alanin in Position B₃₀ entspricht, wie in Science Vff ^s· 623 beschrieben.

Nach dem damaligen Stand der Technik der Peptidsynthese mußten funktioneile Gruppen, insbesondere Carboxyl- u. Aminogruppen die nicht in Reaktion treten durften, in geeigneter Weise reversibel geschützt werden.

Der Schutz der Aminogruppen Δ, und B-, im Des-B^-._o₍-_l~Oktapeptid-Insulin sowie der Schutz funktioneller Gruppen im synthetisch hergestellten Oktapeptid sind nicht problematisch. Des-B-p^ ^₀"-Oktapeptid-Insulin enthält jedoch neben der Carboxylgruppe am Arginin B₃₉ fünf weitere Carboxylgruppen, an denen Könkurrenzreaktionen zu erwarten waren. Diese hätten zu einem untrennbaren

Gemisch verschiedener Derivate geführt und mußten deshalb für das bekannte Verfahren in geschützter Form vorliegen.

Um diese zu erreichen, wurde Schv/eineinsulin in bekannter Weise (Biochera. J. <53 (1961), Seite 114) mit Diazomethan in den Hexamethyl ester überführt.

609826/0983

Anschließend wurde die Arginyl-Glycin -Verbindung durch. Trypsin gespalten. Hierbei wurde ausschließlich die Carboxylgruppe
am Arg-ß' freigesetzt. Nach dem Schutz der Aminogruppen des
-Oktapeptid-Insulin-pentamethylesters durch tert.-

23-30
Butyloxycarbonyl-Reste wurde mit der Aminogruppe des synthetisch hergestellten, geschützten Oktapeptids mit der Sequenz des Humaninsulins kondensiert. Nach Abspaltung der Schutzgruppen und
alkalischer Verseifung lag rohes Humaninsulin vor.

Dieser hier beschriebene Syntheseweg konnte jedoch bisher nicht mit dem angegebenen Ergebnis reproduziert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt nun die Semisynthese von

Humaninsulin auf einem völlig neuartigen und überraschenden Wege.

Cy A-i C-/. Bi
Das N ^v I₁ N^ -'•-Bis-BOC-Derivat des bekannten Des-B₂₃__3Q-Oktapeptid-Schweineinsulins (Formel I; R = Boc) wird direkt mit 1
Äquivalent Oktapeptid der Humaninsulinsequenz (Formel II) umgesetzt, wobei als Kondensationsmittel"Dicyclohexylcarbodiimid im geringen Unterschuß in Anwesenheit von 1-Hydroxybenzotriazol dient,

Völlig überraschend entsteht bei dieser Reaktion 20 - 30 °/o des
Humaninsulin-Derivates. Ein Teil des Desokta-peptid-Insulins
bleibt unumgesetzt. Als Nebenprodukt entsteht ein Peptid mit 59 Aminosäuren (Pentacontapeptid) bei dem eine zusätzliche Kondensation des Oktapeptids mit der Carboxylgruppe von Asparagin A₁

eingetreten sind.

Das Überraschende der Reaktion besteht derin, daß zunächst ausschließlich die Carboxylgruppe von Arginin B₂₂ in Reaktion tritt. Erst danach und wesentlich, langsamer reagiert die Carboxylgruppe von Asparagin A₂-,. Die weiteren vier Carboxylgruppen im Insulin reagieren unter diesen Bedingungen nicht in erkennbarem Umfang.

6 G 9 8 2 6 / 0 9 8 3 /u

2Α6Π753

Da bei der erfindungsgemäßen Reaktion kein Schutz der Carboxylgruppen erforderlich ist, entfällt auch die Schädigung des Insulins sowohl bei der Veresterung als auch bei der alkalischen Verseifung. Nicht umgesetztes Desoktapeptid und das Pentacontapeptid sind auf Grund der unterschiedlichen Molekülgröße und Ladungszahl leicht
durch Verteilungschromatographie an Sephadex ^ - LH 20 im Systemn-Butanol-Eisessig-Wasser (2:1:10) oder durch Gelchrcmatographie an Sephadex ^ - G 75 oder G 50 "superfine" abtrennbar. Unter Berücksichtigung des zurückgewonnenen Desoktapeptids beträgt die
Ausbeute an Humaninsulin 30 ~ 40 %.

Zur Abspaltung der tert-Butylschutzgruppen muß das Reaktionsprodukt nur mit Trifluoressigsäure während 30 - 60 Minuten bei
Raumtemperatur behandelt werden. Diese Reaktion schädigt Insulin nichtc Wählt man als N-Schutzgruppe den llethylsulfonyläthyl-oxycarbonylrest, so ist zwar zur Abspaltung durch ß-Eliminierung eine Alkalibehandlung notwendig. Die Reaktionsbedingungen sind aber so (0,1 N NaOH, 0 ,5 sek), daß Insulin dabei nicht geschädigt wird. Das als Ausgangsprodukt verwendete N ^Al, N ^--BiS-BOC-DeS-Bp_3- -Oktapeptid-Insulin vom Schwein stellt man auf folgendem Wege her:
Schweineinsulin wird in einer Mischung aus Dimethylformamid, Di-

methylsulfoxid und wasser in Anwesenheit von K-Äthylmorpholin mit überschüssigem tert. -Butyloxycarbonyl-N-hydroxysucciniiriidos ter
umgesetzt. Dabei entsteht das zu erwartende N** ^A1 , N^¹³I , ^B29-Tris-BOC-Insulin.

3 8?G/09 83 /·,

246D753

Man gibt nun zu der Lösung dieser Verbindung in Dimethylformamid und Tris-Puffer (pH 7,5) Trypsin in kleinen Portionen so lange zu, bis in der Elektrophorese kein Ausgangsprodukt mehr zu erkennen ist«, Das N^Cx" 1, N⁰^ ¹^BiS-BOC-DeS-B,,.- ,„-Oktapeptid-Insulin wird durch Verteilungschromatographie an Sephadex^ -

LH 20 im System n-Butanol-Sisessig-Wasser (2:1:10) gereinigt. Diese Verbindung wird nun mit einem Mol des Peptids der Formel II, das in an sich bekannter- Weise nach den Methoden der Peptidchemie hergestellt wird, 1-2 Moll, 1-Hydroxybenzotriazol und etwa 0,9 Moll. Dicyclohexylcarbodiimid in Dimethylformamid bei etwa pH 7 - 8 zur Reaktion gebracht (vgl. Chem. Ber. IQ^ (197O), Seite 788,

Das Rohprodukt wird in der oben beschriebenen Weise durch Verteilungschromatographie gereinigt und durch Behandeln mit Trifluoressigsäure/Anisol (5 + 1) während 60 Minuten bei Raumtemperatur von den Schutzgruppen befreit. Nach Fällung mit Äther, isoelektrischer Fällung-aus-Wasser bei pH 5,4 und Chromatographie

(R)

an Sephadejc^-^ - G 75 oder G 50 superfine ist die Verbindung elektrophoretisch rein und kann in bekannter V/eise zur Kristallisation gebracht werden. Das so gewonnene Humaninsulin ist biologisch voll aktiv.

Das erfindungsgemäß hergestellte Humaninsulin dient als Arzneimittel zur Behandlung des Diabetes mellitvts, z.B. in Fällen, in denen Resistenz gegen Rinder- und Schweineinsulin besteht.

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/6

Beispiel

Er stellung von Kumaninsulin

5 gr Schweineinsulin werden in 40 ml Dimethylformamid, 25 ml Dirnethyisulfoxid, 0,5 ml N-Äthylmorpliolin und 2,5 ml Wasser gelöst. Unter Rühren gibt man bei Raumtemperatur 1,5 gr tert-Butyloxycarbonyl-N-hydroxysuccinimid zu und läßt 6 Stunden reagieren. Dann wird durch Zugabe eines Tropfens Eisessig gestoppt, das Produkt mit Äther gefällt und abfiltriert. Der Rückstand wird in 360 ml Dimethylformamid gelöst und mit 320 ml Tris-Puffer (0,05 M, 0,01 M an GaGl₂, pH 7,5) verdünnt. Bei 36 werden im Abstand von je 1 Stunde Portionen von 20 mg Tryps in zugegeben.

Nach insgesamt 12 Zugaben stellt man mit Essigsäure auf pH 4,5 und dampft die Lösung ein. Die anschließende Reinigung des Materials an einer Sephadex^-LH 20-Säule (8 χ 200 cm) mittels Verteilungschromatographie im System n-Butanol-Eisessig-Wasser (2;l:10) ergibt 3,25 gr N^ ^Al, N^-^ ^Bl-Bis-BOC-Des-B₂₃_₃₀-Oktapeptid-Insulin (Schwein), das in der sauren und basischen Elektrophorese kein Ausgangsmaterial mehr zeigt. Die Aminosäureanalyse der Substanz ist korrekt. Nach einer probeweisen Abspaltung der BOC-Gruppen ist keine Insulinaktivität mehr zu finden. Dieses Material (3,25 gr) wird in 30 ml Dimethylformamid zusammen mit 100 mg 1-Hydroxybenzotriazol, 750 mg HCl.Gly~Phe-Phe-Tyr(Bu^t)-'i^!hr-Pro-Lys(BOC)-Thr(Bu^t)--OBu^t und 0,5 ml N-Athylmorpholin gelöst. Dann gibt man bei Raumtemperatur 120 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt die Reaktion. 24 Stunden. Der abgeschiedene Dicyclohexy!harnstoff wird abfiltriert, das Produkt durch Ätherzugabe gefallt«

6 0 9-8-2 6·/09 8 3

Den Niederschlag filtriert man ab, wäscht mit Äther und trocknet. Die Substanz v/ird durch Verteilungschromatographie an Sephadex ^-LH 20 im obigen System vorgereinigt. 2,6 gr Material aus dem Hauptpeak isoliert man durch Fällung mit Aceton/Äther. Das getrocknete, noch geschützte Derivat läßt man mit einem Gemisch aus 5 ml Trifluoressigsäure und 1 ml Anisol 60 Minuten bei Raumtemperatur reagieren. Aus der mit Eis gekühlten Lösung fällt man anschließend die Rohsubstanz durch Zugabe von Äther. Den getrockneten Niederschlag löst man in Wasser,präzipitiert mit wäßrigem Ammoniak bei pH 5,4 und zentrifugiert. Die Reinigung des Produktes erfolgt in 10%iger Essigsäure über Sephadex ^-G 50 superfine oder G 75. Aus den Fraktionen des gewünschten Peaks kann man das Humaninsulin durch Gefriertrocknung isolieren. (Ausbeute nach Kristallisation: 1,2 gr). Das so gewonnene Humaninsulin zeigt im biologischen Test 24 IE/mg.

Die Herstellung des Oktapeptids der Formel II erfolgt gemäß folgenedem Kondensationsschema nach üblichen Peptid-Kondensationsmethoden:

6 Ü: S ? 6 / 0 9 8 3 _/8

Syntheseschema für das Oktapeptid der Formel (II)

Phe

Tyr

Thr Pro

Lys

Thr

Z-OH H
DCC/HOBt

Z-OH

H- OBu¹

DCC/HOBt

TFE

OBu'

OBu^ Z-OH H-OMe

OBu* Z

OH H-DCC/HOB

Bu'

,Bu OH

DCC/HOB

H₂/Pd

Bu¹

NaOH

Bu^

Bu¹

OMe

OMe Z

OH H DCC/HOB Z-

OH H
DCC/H0B1

BOC ÖH

H-OBu

DCC/HOBt BOG

H₂/Pd BOC

BOC

H₂/Pd

BOC

Bu*, 'OBu

Bu ^ OBu¹

'OBu¹

OBu

H₂/Pd

Bu¹ BOG

Aminosäure- und Elementaranalyse entsprechen der Theorie

609826/0983 /9

Claims

Patentanspruch

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON HUMANINSULIN

Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin, dadurch gekennzeichnet, daß man Des-B₂₃_₃₀-0ktapeptid-Schweineinsulin der allgemeinen Formel (I)

21

A-Kette

Asn

-OH

B-Kette

Arg

-OH

22

in der R eine protonensolvolytisch oder durch ß-Eliminierung abspaltbare Aminoschutzgruppe wie den tert-Butyloxycarbonyl-(Boc), den tert-Amyloxycarbonyl-(Aoc) oder den Methylsulfonyläthyloxycarbonyl-(Msc)-rest bedeutet, mit einem Peptid der Formel (II)

H-GIy-Phe-Phe-Tyr(X)-Thr(X)-Pro-Lys(BOC)-Thr(B^)0Bu^fc (II)

in der X für Wasserstoff oder den tert-Butylrest steht, kondensiert und die Schutzgruppen durch Behandeln mit Trifluoressigsäure oder ggf* Alkali abspaltet.

609826/0983