JPS59134732A - フイブロネクチン・生理活性物質複合体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規フィブロネクチン・生理を占性物員複合体
の製造法に関する。さらに詳しくは障害を受けた組織、
新生物細胞増殖部位等の疾患部への親和性の商いフィブ
ロネクチンにこれらの組織、部位を保護し、１ビ復する
生理活性物質を・結合させたフィブロネクチン・生理活
ｉ！１１１．物質複合体の製造方法に関する。

名神の生理活性物質を全身的に投与し、月１１員部の化
１＃を防止したり、炎征部の修復を促進したり、がんＭ
ＩＩＷを外紙させたりすることは通常の方法である。こ
の場合、生理活性物質か全身的に分布するため、効果を
発揮するに十分な閾友を得るためには火星投与せざるを
得ないのか現状である。

持にこのことは、抗ＩＪｍ　４％性動物質みるとき明ら
かで、／Ａ来が発現する投与量と副作用が発現する投与
量が近接していることが多く、効果か期待されるにも抱
らず、副作用の発現により′投与を中止せざるを得ない
ことになり、不辛な結果となることが多い。これらを防
止するためには、換言すれば、効果の発現濃度と副作用
発現夢反に差をつけるためには、創傷部位、炎症部位等
のＶ、ｉ：ｌ害を受けた組織、あるいは新生物細胞増殖
部位などの疾患部に生理活性物質を特異的に集積させる
ことが必須である。発明者等は局所に特異的に生理活性
物質を集積するためには、ｉＩ！Ｉ傷部位、炎症部位、
新生物細胞増殖部位等の疾患部位に親和性の高い物質を
Ｍｌｊｌ１体とし、治辿薬を高濃度に局所に運搬□させ
るべきと考え、研９Ｙｌを重ねてきた。

ところで、かかる運搬体としては抗腫瘍性物質の運搬体
として例えばかん特異抗体を用いる例は既に知られてい
る。この場合、目的とするがんが運搬体として用いた抗
体に対して特異的な抗原を保持していなければ、特異的
な集積は生じない。

すなわち、非″帛に限定されたものしか自相性を発挿し
ない火点がある。抗菌性物質においては運搬体を用いて
いる明ｔな例はない。しかし、自効濃度を得るために大
型投与したがゆえに意思な紬作用が生じた端聞な例はク
ロラム？エニコールである。この揚台でも少ない投与量
で効果の発現がみられるなら制作用を回遊することがで
きる。Ｍ、炎症剤においても抗菌性物質と同体のことか
生じる。特に後二者については疾患部位において抗体−
抗原反応といった特異性がなく、ａ仔技術では特別の運
搬体はなく持與集債を試みられなかったものである。

本発明者らは人為的に投与したフィブロネクチンか創部
部位、炎症部位、新生物ａ胞増殖部位などの疾患部位に
特異的に集積することを見出し、これを運搬体とすれば
、生体側における特異抗体といった特異性に関係なく治
療薬が目的とする疾患部位に集積されると考え、各柿扶
思の治療に用いられている生理活性物質をフィブロネク
チンに結、合させ、各棟のフィブロネクチン・生理活性
物質複合体（以下「複合体」という）を製し、その疾患
部位の親和性を確かめて本発明を完成させたものである
。

従って、本発明は、生理活性物質とフィブロネクチンと
を結合させることを特徴とする疾患部位−親和性の畠い
フィブロネクチン・生理活性物質複合体である。

フィブロネクチンは研究者により抑々の名称がある。柄
Ｄｆ＆Ｊ６−：蛋白質・核酵・酵素。２５巻１０号、８
９０−９０５頁、１９８６年にみられるようにｃｏｌｄ
　１ｎｓｏｌｕｂｌｅ　ｇｌｏｂｕｌｉｎ、　ＩＪ、Ｔ
Ｆ３　ｐｒｏｔｅｉｎ。

ｏｐｓｏｎｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ｃｅｌｌ　５ｕｒｆ
ａｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ等の別呼称があるが１本発明に
使用し得るフィブロネクチンはどの名称で呼ばれている
ものでも良い。フィブロネクチンは、たとえは細胞表面
、細胞外基質内および血漿内に存在しているもので、一
般にこれらより採取精製されたもので、ダイマーが主た
る成分であり、モノマーも含んでいる。その性状等は次
の】１ｌＮ１りである。

主幽分の易動度：α２−グロブリン、主分画の分子量：
４．８〜４．５Ｘ１０５．等斑点：５．３〜６．０゜糖
含量：約５％、基質蛋白質としての性質：Ｆａｃ−ｔ　
ｏ　ｒ　Ｘｌ［因子によりフィブロネクチン相互間及び
フィブリンα釦との間に架橋を形成する。

本発明に便用しうる生理活性ｔｆ／／Ｊ質は、抗帥賜性
、抗菌性、抗炎症性を期待する薬剤で、それ自体で、又
は蛋白質と結合し得る基（たとえば、アミノ基、カルボ
キシル基）を導入することによってフィブロネクチンと
結合可能なもの、さらには蛍白架橋剤の仔在下にフィブ
ロネクチンと反応しうるものなどである。実施例・実験
例では、タウノマイシノ、マイトマイシン、セファロチ
ン、ペニシリンＧ、セクレチンなどを例示したが必すし
もこれらに限られるものではない。

俊合体の製造は特に好ましくは既に知られている蛋白架
橋剤、例えばグルタルアルデヒド、カルボジイミド、ヘ
キサメチレンジイソシアネート等を用いて行なわれる。

当該方法としては、フィブロネクチンと蛍白架橋剤と生
理活性物質を同時に屁台し反応させる方法、フィブロネ
クチンと蛍白架橋剤を反応させたのち、生理粘性物質を
反応させる方法、生理活性物質に蛍白架橋剤を反応させ
たのち、フィブロネクチンを反応させる方法の、三方法
か使用できる。反応は、１月５〜８の水溶液咀より好ま
しくは級匍欣中でおこなう。反応１Ｍ度は、１０〜３０
°Ｃ１就中室温が好ましい。また反応時間は通Ｔ８ｆＪ
１〜２４時間である。いずれの反応においても添加する
物質のモル比は既に知られている一般蛍白の架塙法に槃
じて行なうことが出来る。むろん、フィブロネクチンに
比して、より多くの生理活性物質を添加することが好ま
しい。

反応後、俵合体は公卸の方法、たとえば、透析、ゲル口
過、塩析、アルコール会則、口過、カラムクロマトグラ
フィー、側縮、凍結乾燥等を適宜組み合わせて精製され
、採取される。

複合体の障害組織への集積と治療効果をみるためにＤａ
ｖｉｄらの方法に翠じ、固定化１ａｃｔｏｐｅｒ−ｏｘ
ｉｄａｓｅ法（Ｇｒａｙ　Ｓ　、　１）ａｖｉｃｌ　：
、Ｂ’ｉ　ｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　０ｏｎｏｎｕｎｉｃａｔｉｏｎ　、
　４８（２）、４６２．１９７２）により　　Ｎａｌを
用いて標識した１２５１−フィブロネクチンを製し、Ｉ
Ｍ　ａｒｍ　Ｎ合体を製した。製造方法は実施例に準拠
して行ない、その規模は実施例の１／１０〜１／２０で
実施した。表１はその結果を示す。なお、フィブロネク
チン・マイトマイシン複合体は実施例２に準じて調製し
た。いずれの複合体も比放射活性は４０Ｘ１０’ＣＰ　
ｍｌＭＹ以上で、病態を作成した動物はいずれもラット
である。担）Ｍ病態では吉田丙連訓胞をラット当り１０
６コ反下に移植し移植５臼目の担癌動物を用いた。劇場
病態では腹部をメスで切開し、黄色ぶどう状藺を塗布し
たのち軽＜耐い合せた。そして切開１日後の動物を用い
た。胃槓娼病態ではＣ１ａｍｐ　ｉｎｇ−Ｏｏ　ｒ　ｔ
　ｉ　ｓ　ｏｎｅ法（田林忠綱二日本消化器病学会誌、
６２巻、１２号、１５８Ｂ頁、１９６５年）により作成
した潰瘍発症動物を用いた。

標識複合体を尾静脈から投与し、投与１日後に薬殺し、
障害部位を採取し、常法に従い放射能をカウントした。

対照としては無処置の正常動物を用いた。試験成績は正
常組織の腹壁への分布量を１としたときの相対比で示し
た。明らかに局所への集積が認められている。

表１　複合体の集積 使用動物：ラット（１群５匹） 病　　態：（１）吉田内頓皮下移植 （２）腹部切開創傷 （８）水浸法ストレスによる潰瘍 測定日：標識複合体投与２４時間目 治療効果は表２に示した。使用動物及び病態は集積実験
に用いたのと同様である。担癌病態においてはｙＭａｌ
Ｉ視移４ｍ舎日より毎日１回連投５日Ｆ闇、尾静脈より
フィブロネクチン・ダウノマイシン複合体、フィブロネ
クチン・マイトマイシン複合体、ダウノマイシンのみま
たはマイトマイシンのみを投与し、（いずれもダウノマ
イシンとして１．０啼／ｋｑ　、マイトマイシンとして
０．８０　ｒｌｆ／／ｋｑ）生死を観察し、常法に従い
生命延長率（ＩＬＬ）を求めた。８ｉｌｌ錫′３丙１ｂ
では飽す倦作成日当日より迎日５日間、尾静脈よりフィ
ブロネクチン・セファロチン仮台体またはセファロチン
のみを投与しくいずれもセファロチンとして１０　Ｍ！
７ｋｔｉ　）、創面ｆの化脚の万態を観察した。冑蹟賜
病１＆では積場作成１臼俊より迎日７日間、尾靜ＩＮよ
りフィブロネクチン・セクレチン僅合体またはセクレチ
ンのみを投与しくいずれもセクレチンとして０．７単位
／匈）、９日日に薬殺し、びらん、浮呻、井孔の有゛無
を観察した。

（以下余白） 表２　治療効果 本発明に関する複合体は、経口的又は丼ン１ミ目的に投
与されるが、好ましくは非経口的に投与され、当該生理
活性物質自体を投与する場合に比較して、少ない投与量
で十分な治療効果を発揮するものである。

実施例１ フィブロネクチン１ｇを０．０５ｍリン酸ナトリウム緩
悔欣（ｐＨ７，４）５０屏ｌに加え、３１°Ｃ〜３７°
Ｃで約１０分間加温し、俗解する。溶解液に０．１％ゲ
ルタールアルデヒド水溶液８ｍｌ及びダウノマイシン１
５ｍｆ／を加え、ゆるやかに撹拌する。

室温で約６時間静かに攪拌し反応液を製する。この反応
液を１５〜２０°Ｃで１昼夜大嵐の水を用いて透析する
。透析内液をメンブレンフィルター（０，８μｍ　）で
ろ過したのち、１５〜２０°ＣでセファデックスＧ−２
００カラムを用いてケルろ過を行なう。流出する自分を
２８０　ｎｍでモニターし、有効画分を採取する。待ら
れた有効画分に倍量の水を加えてメンブレンフィルター
（Ｑｏ、４５μｍ）・でろ過したのち、凍結乾燥し、フ
ィブロネクチン・ダウノマイシン複合体を得た（収率８
５．６Ｓ）。

分析イ直二 １　ダウノマイシンのフィブロネクチンへの結合率（１
）、１．２ １１　　低分子画分含量（分子量２０Ｘ１０’以下）（
２）５％以下 Ｉｌｌ　　抗ヒトフィブロネクチンウサギ［Ｉｌｌ清に
対する抗原性　−性 （１）結合率はダウノマイシンのλｍａｘ：４９５ｎｍ
Ｂｌ二　：２０６、フィブロネクチンのＡｍ＆Ｘ：　２
８　ＯｎＩｎ、　ｕ’：：　１２．８を用いてＡ４９５
　のＥｌ、Ｒ／λ２８０のＥ）二より算出 １％ （２）　　Ｗａｔｅｒｓ　Ｐｒｏｔｅｉ’ｎ　Ｃｏｌｕ
ｍｎ　ｌ−２５０を用いた湖速欣体クロマトグラフィー
にて分析した。

実施例２ フィブロネクチンＩｆを０．０５Ｍリン酸ナトリウム氷
斐衝液（ｐＨ７，４）　５０ｍｌにガロえ３１〜３７°
Ｃで約１０分間加温し、俗解する。溶解液に１−エチル
−８−（８−ジメルアミノプロビル）カルボジイミドの
塙陰塩５〜を加え、約３時間室温で攪拌する。別にマイ
トマイシンＣの０．０４％リン酸ナトリウム緩＃欣溶欣
を調製する。マイトマイシンＣ浴［２０ゴを先の故に加
え、室温で３時間ゆるやかに攪拌する。その後これを１
０〜１６°Ｃで昼夜大量の水を用いて透析する。透析内
液をろ紙でろ過したのち１０〜１６°Ｃでセファデック
スＧ−２００カラムを用いてゲルろ過を行なう。）、。

流出する自分を２８ｏｎＩｎでモニターし、有効画分を
採取する。得られた有効画分をメンブレンフィルター（
００，４５μｍ）でろ過したのち、凍結乾燥し、フィブ
ロネクチン・マイトマイシン複合体を得た。（収率６５
％） 分析値： Ｉ　マイトマイシンのフィブロネクチンへの結合率、１
０ １１　　低分子画分含量 ％以下 １１１　　抗ヒトフィブロネクチンウサギ血清に対する
抗原性、物性 実施例３ ０．１％ゲルタールアルデヒド水浴７’５１０　ｍｌに
マイトマイシンＣの０．１％、０．２Ｍリン酵ナトリウ
ム緩衝欣溶故１　ｍｌを加え、室温で８時間放置する。

別に調製したフィブロネクチンの２％、０．０５Ｍリン
酸ナトリウム緩砺液溶液５０ゴに先のゲルタールアルデ
ヒド・マイトマイシン反応液４ｉＪを加え、室温で５時
間ゆるやかに攪拌する。これを反応液とし、以下実施例
１と同種に保作し、フィブロネクチン・ダウノマイシン
複合体を得た（収率７０．２％）。

分析値： Ｉ　ダウノマイシンのフィブロネクチンへの結合率、１
．４ １１　　低分子画分含量（分子量２０Ｘ１０’以下）、
５％以下 １１１　　抗ヒトフィブロネクチンウサギ血清に対する
抗原性、陽性 実施例４ フィブロネクチン１１を０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩
悔欣（ｐＨ７，４）　５０鹸に加え、３１〜３７℃で約
１０分間加温し、俗解する。この溶解液に、ペニシリン
Ｇカリウム１０〜を水３ＯＮｔに俗かし、ＩＮＮ塩酸試
合用いｐＨ５，０〜６．５に調整した剤液及びｌ−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド現酸塩１０〃ヂを加え、室温で約３時間ゆるやかに攪
拌する。この反応液を１０〜１５°Ｃで一昼夜大量の水
を用いて透析する。透析内液を孔径０．４５μｍのメン
ブレンフィルターで沖過したのち、Ｔｏｙｏ　Ｓ　ｏｄ
ａ　５Ｗ−３０００カラムを用いた高速液体クロマトグ
ラフイー上で分１１シ、分画分子量２０万〜６０万に相
当する部分を分取する。得られた有効画分を孔径０．４
５μｍのメンブレンフィルターで濾過したのち、凍結乾
燥し、フィブロネクチン−ペニシリンＧ１合体を得た（
収率６３％）。

分析値： １　ペニシリンＧのフィブロネクチンへの結合ｊｉ（８
）、　７．５　ｒｎｏｌｅ／ｍｏｌｅ１１　　低分子量
（分含量（分子１量２０万以下）ゝ：′）、　５％未簡 （１１抗ヒトフィブロネクチンウサギ血清に対する抗原
性、陽性 （３）結合重は、複合体の平均分子量を４４万とし、複
合体中のベニシリしＧ舖を、ペニシリンＧ抗体を用いた
抗原抗体反応より典１定し、算出した。

実施例５ フィブロネクチン１ｇを０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩
ｔＩ液（ｐＨ７，４）　５０ｔｘｔに加え、３１〜３７
°Ｃで約１０分間加温し、溶解する。別にセファロチン
・ナトリウム４０■を水１Ｏｙｎｌに溶解し、ｌＮ塩酸
試液を用いｐ　Ｈ４，０〜６．０とした溶液を調製する
。このセクレチン複合体及びｌ−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミドｍ酸１４０７＋
１１１７を先のフィブロネクチンｍＨに加え、室温で約
３時向ゆるやかに攪拌する。この、反応液を１０〜１５
°Ｃで二昼夜大鍬のボを用いて透析する。透析内液を孔
径０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過したのち
、Ｔｏｙｏ　５ｏｄａ　Ｓ　Ｗ　−３０００カラムを用
いた高ｆＭ体りロマトグラフィー上で分賦し、分幽分子
蛍２０万〜６０万に相当する部分を分取する。得られた
有効画分を孔径０゜４５μｍのメンブレンフィルターで
濾過したのち、凍結乾燥し、フィブロネクチン−セファ
ロチン複合体を得た（収率２５％）。

分析値： １　セファロチンのフィブロネクチンへの結合１ｉｉ（
４）、　　１０　ｍｏｌｅ／ｒｎｏｌｅＩＩ　　低分子
画分含量（分子量２０万以下）、５％未満 １１１　　抗ヒトフィブロネクチンウサギ血清に対する
抗原性、陽性 （４）結合量は、複合体の平均分子量を４４万とし、複
合体中のセファロチン量を、セファロチン抗体を用いた
抗原・抗体反応より測定し、算出した。

実施例６ フィブロネクチンｌｙを０．０５Ｍリン酸ナトリウム鞍
向Ｄ　（ｐ　Ｈ７，５）　５０　ｍｌに加え２０〜３０
°Ｃで約１０分間加熱し、俗解した。このフィブロネク
チン俗Ｍ　（２０ＭＹ／　ｍｌ　）に水后性のカルボジ
イミド〔１−エチル−，９−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド塩岐塩〕を５　Ｑ　＋Ｉ％Ｉ加え
１８°Ｃで３時間ゆるやかに撹拌したのちセントリフロ
ー（ＣＦ２５、アミコン社製）にて大部分の未反応カル
ボジイミドを除く、別にセクレチン（５００単位）を上
記０．０５Ｍリン酸緩鉤液１０罰に溶解し、このｍＨで
先のセントリフロー内のフィブロネクチン−カルボジイ
ミド複合体を含む画分とあわせ、室温下で約５時間時々
振す混ぜ、族滅した、こののち高速成体クロマトグラフ
用の東洋ソーダ製カラム５Ｗ−８０００にて、フィブロ
ネクチン・セクレチン複合体を含む分子量２３万及び４
６万に相当する位門に浴出した両分をあっめた。この両
分に含まれるフィブロネクチン及びセクレチンは抗原抗
体反応による方法にてそりぞれ足載し、ここに得られた
フィブロネクチン・セクレチン複合体の結合比を求めた
。その結果、この方法にて得られたフィブロネクチン・
セクレチンの結合比はフィブロネクチン１ミリモルに対
してセクレチン４０００単位であった。（収率３７％） 分析値： １　セクレチンのフィブロネクチンに対する結合比、４
０００単位／ｒｎｏｌｅ １１　　抗ヒトフィブロネクチンウサギ血清に対する抗
原性、陽性 第１頁の続き ０発　明　者　土居卓治 京都市左京区松ケ崎東山１７−Ｉ ０発　明　者　大村孝男 宝塚市青葉台２丁目１５−２１ ０発　明　者　船越哲 交野市青山１−１６−５ ０発　明　者　須山忠和 京都府綴喜郡田辺町松井ケ丘４ 丁目・３番７号 手続補正書（自発） 昭和５８年１１月１４　日 特許庁長官　殿 １、事件の表示 昭和５８年特許願第００８９１２　　号２、発明の名称 フィブロネクチン・生理活性物質複合体の製造法３、補
正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名（名称）　株式会？ｊ：＜トリ十字４、代理人 ■５４１ 住　所　大阪市東区平野町４丁目５３番地３ニューライ
フ平野町４０６号 電話（０６）　２２７−１１５６ ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 （１）（７）細書第３頁、第１２行〜第１３行の「抗体
−抗原反応Ｊｆｆｉｒ抗原−抗体反応」に訂正する０（
２）同書第４頁、第４行の「（以下「複合体」という）
」、ｒ「（以下複合体という）」に訂正する０（３）回
書第４頁、第５行の「疾、＠部位の」勿「疾患部位への
」に訂正下る。

（４）同書第７頁、第１行のｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｊの次にｒ　ａｎｄ　Ｊ才挿入了ゐ○ （５ン　　同書第７頁、ｉｚ行のｒ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉ
ｃｓ　Ｊ　ｒ　ｒＢｉｏｐｂｙｓｔｃａｌ　Ｊに訂正下
ゐ。

（６）同書第７頁、第２行のｒ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔ
ｉｏｎ　Ｊ’ｖ−「Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　　
Ｊに訂正する０（７）同書第７頁、第３行のｒ　１２５
ＮａＩ　Ｊ　１ｒＮａ１２５Ｉ　Ｊに訂正下る。

（８）同曹第７頁、第１４行の「ぶとう状菌Ｊｋｒぶど
う状球菌」に訂正下る。

（９）　　向書第８頁、下から第３行の「水浸法ストレ
スＪ　ｋ　ｒ　Ｃｌａｍｐｉｎｇ−Ｃｏｒｔｉｓｏｎｅ
法」に訂正下６□四　同ｗａｌ１頁、第５行の「０８μ
ｍ　Ｊ　ｋ　ｒφ０．８μｍ　」に訂正する。

東　園書第１２頁、第９行の「ジメルアミノ」會「ジメ
チルアミン」に訂正するＯ Ｑ４　　四書第１３頁、下刃）ら第２行の「夕゛ウノマ
イシン」２「マイトマイシン」に訂正゛する。

曹　向曹第ｔｂ頁、第１５行のｒ　ｍｏｌｅ　ｊ　ｉｒ
ｍ　ｍｏｌｅ　Ｊに訂正する。

以　　　辷

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 生理活性物質とフィブロネクチンとを結合させることを
   待依とする疾患部位親和性の商いフィブロネクチン・生
   理活性物質複合体の装造法。