JPH02501305A - 改良された体組織結合特異性を有する薬剤活性抱合体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 改良された体組織結合特異性を有する薬剤活性抱合体本発明は、特定の体組織に 対する改良された結合特異性を有する薬剤活性抱合体に関する。本発明は、更に これらの抱合体の製造法およびこれらの抱合体を含む製剤にも関する。特定の態 様では、本発明はプラスミノゲン活性化因子または抗リウマチ薬を含む薬剤活性 抱合体に関する。

身体の小さな領域にのみ影響を与える各種の薬物を身体に大量投与して症状を治 療することは、一般に行われている。標的部位において十分な濃度の薬物を得る ために、大量投与を必要とすることがしばしばある。しかしながら、これらの大 量で且つ絶えず投与される投与量では、治療を受ける患者に重大な副作用が起こ り、治療症状には改善が見られてもしばしば治療を中断するに至ることもあった 。この問題点は、過去においては特に癌細胞を破壊するため毒性のある抗腫瘍剤 を投与する場合および毒性のある抗リウマチ薬、具体的には金化合物を投与する 場合に存在した。

このような問題点が存在する薬物の投与のもう一つの例は、血栓症状の治療の場 合である。深静脈血栓症または肺動脈血栓症のようなある種の血栓症状の従来の 治療法は、フィブリン溶解を促進する薬剤の連続輸液から成っている。フィブリ ン溶解とは、フィブリンを主要素とする血餅のタン白質分解性の分解の過程に与 えられる用語である。フィブリン溶解は、大きな血管閉塞物の分解を起こすプラ スミンによって媒介されるタン白質分解である。フィブリン溶解に与かる主要な 酵素はプラスミノゲンーブラスミンであることは一般に受け入れられている。チ モーゲン、すなわちプラスミノゲンは、活性化因子の領域の１種類によって架橋 したフィブリン血餅を分解して可溶性生成物（ＦＤＰｓ）とすることができる活 性プロテアーゼであるプラスミンに変換される。プラスミンは、配座の変化を伴 う限定されたタン白質分解性開裂によってプラスミノゲンから産生されるセリン プロテアーゼである。

プラスミノゲンの活性化の精確な機構は、関与するプラスミノゲン活性化因子に よって変わる。例えば、アロステリックに作用するある種の微生物に由来するプ ラスミノゲン活性化因子、例えばストレプトキナーゼの場合には、タン白質分解 性開裂なしに活性化を起こすこともできる。一般的には、活性化が血餅表面で起 きるときには、活性化は一層効果的であり、これはプラスミノゲンが有するフィ ブリンに対する親和性によって助長される現象である。プラスミノゲン活性化因 子は、血中、各種の組織および尿、唾液および精液中に生じる。前記のように、 それらはある種の微生物によっても産生される。

少量の不安定なプラスミノゲン活性化因子である組織プラスミノゲン活（７−化 因子（ｔ−ＰＡ）は、血行中に生じる。その水準は、運動および静脈閉塞のよう な刺激によって上昇する。フィブリン結合領域を運ぶｔ−ＰＡは、死体の血漿お よび血管内皮細胞やボウズ黒色腫細胞ラインの培養液から単離されている。更に 最近では、このプラスミノゲン活性化因子は、組換えＤＮＡ技術によっても製造 された（例えば、英国特許第−Ａ−２１１９８０４号明細書を参照されたい）。

ウロキナーゼ（ＵＫ）は、尿中に存在するプラスミノゲン活性化因子である。ｔ −ＰＡとは異なり、ＵＫは高度に精製された結晶状の形態で容易に単離すること ができる。これは、分子量がそれぞれ５４．０００および３２．００［１の２種 類の形態で存在する単一鎖β−グロブリンである。

ＵＫは、（見掛上は）腎臓で合成され、且つフィブリンに対する親和性はほとん どない。ＵＫはプラスミノゲンを活性化してプラスミンを産生じ、これが阻害を 受けやすいのである。

ストレプトキナーゼ（ＳＫ）は、β−溶血性連鎖球菌によって産生されるプラス ミノゲン活性化因子であり、精製された製剤で利用可能である。ＳＫは、分子量 が約４８．０００の単一鎖α２−グロブリンである。ＳＫはプラスミノゲンへ結 合することによって活性化因子として作用し、配座の変化を引き起こす。生成す るＳＫ−プラスミノゲン錯体は酵素活性を有するが、α２−マクログロブリンに よって阻害されない。

ＵＫとＳＫは両方とも、血栓溶解剤として良好に用いられてきた。ＵＫの方が一 般的には一層良好な薬剤と考えられているが、ＳＫが一層廉価に製造されること からより一般的に用いられている。ＳＫは抗原性が高く、−回限りの治療にのみ 有効である傾向があり、その治療の後には身体の自動免疫系によって生じた多数 の抗体がそれ以後の治療の効果を著しく減少させる。更に、抗−５Ｋのタイター は連鎖球菌に感染の前歴によって個人間で変化する。これが、有効な安全投与量 の決定を困難にしている。抗体によって媒介される耐性はＵＫでは生じない。

ＵＫは抗原性を持たないが、ＵＫによる治療は、多量の人尿を分別する必要があ る結果として利用可能性が限定され且つ高価であるといった２つの不都合を有す る。

血栓溶解状態を保持するために極めて多量のＵＫを投与する必要があるのは、部 分的にはＵＫのフィブリンに対する親和性が低いことによるものと考えられる。

その結果、全経路の治療を行うには、約５０００リツトルの尿の分別を必要とす ることになる。ＵＫとＳＫの両者による治療の場合には、多量の活性化因子の全 身性投与によって出血合併症を起こすことがある重大な危険性がある。局所投与 により血栓溶解を行う試みは未だ促進されていない。ＳＫの場合には、有効投与 量と出血投与量とがほとんど同じであると考えられるので、有効投与量は高プラ スミン血症、フィブリノーゲン分解および抗凝集作用を有することにより出血性 合併症に対して添加されるフィブリノーゲン分解生成物の蓄積を起こすことがあ る。

更に最近では、治療を要する身体の部分に対して高い親和性を有する担体に薬剤 を結合させることによって、この問題を解決しようとする試みが為されてきた。

これらの担体は治療を要する部位に薬剤を向けることにより、比較的低いがなお 有効な投与量を投与することができる。

かかる担体の例は、欧州特許出願公告節＾２−１１４［１８５号明細書および更 に最近では米国特許第４．５８７．１２２号明細書に開示されており、これら明 細書にはタン白質架橋剤を用いる全フィブロネクチンと共有結合的に抱合した各 種の抗腫瘍剤、抗菌剤および抗炎症剤の製造と使用が記載されている。フィブロ ネクチンは薬剤による治療を必要とする身体の病的領域に容易に結合する有効な 担体であることが述べられているが、フィブロネクチン自体が多数の体組織に対 する結合部位を有しており、治療を必要とする身体の部位に優先的に結合すると は保証することはできず、実際に、優先的な結合が身体の他の部分で起こり、治 療を要する部分に蓄積する薬剤の量は場合によっては無視し得る程度であること もある。更に、フィブロネクチンは、通常は最初の結合したフィブロネクチンに 自己会合によって体内の部位に蓄積することを示唆する証拠がある。すなわち、 自己会合によってフィブロネクチンの蓄積が非特異的に増幅されるようになる。

明らかに、この機構によれば、投与されたフィブロネクチン−薬剤抱合体は体内 のフィブロネクチンの如何なる蓄積部位に結合することもできるので、投与され たフィブロネクチン−薬剤抱合体の「標的捕獲」能力を著しく損なうことになる 。

本発明は、薬剤治療を必要とし且つ自己会合の傾向が少ない身体の特定部位に対 して比較的高度の結合特異性を有する標的捕獲部分を有する改良された薬剤抱合 体を提供する概念に基づいている。したがって、本発明は、薬剤学的に活性な抱 合体の標的捕獲部分をタン白質フラグメントの形態で、例えば身体上の異常に伴 う特定の体組織に対して親和性を有する接着性筒タン白質の酵素消化によって生 成した形態で提供することによってこのような必要性を満たす方法という問題点 の解決法を提供することを模索するものである。これらのフラグメントを用いる 一つの利点は、完全なフィブロネクチンのような全接着性筒タン白質は通常は多 数の体組織に対して広範な親和性を有するのであるが、特異性または少なくとも 単一の体組織に対して高度の選択性を有する接着性筒タン白質のフラグメントを 製造することが可能なことである。それ故、タン白質フラグメントを用いること により、実質的に治療される異常に伴う特定の体組織のみに結合する抱合体を製 造することが可能になる。更に、適当なモデルとしてフィブロネクチンを用いる と、タン白質フラグメントは生理的条件下ではそれらの親の糖タン白質に結合す る傾向が減少するので、全体内における結合の特異性が増す。

それ故、本発明の第一の観点によれば、特定の体組織を含む身体の異常を治療す るための薬剤学的に活性な物質を含んで成る薬剤学的に活性な抱合体であって、 前記の薬剤学的に活性な物質を直接または間接的に親タン白質と比較して前記の 体組織に対する結合特異性が改良された接着性筒タン白質の少なくとも１種類の フラグメントと抱合させることを特徴とする抱合体が提供される。

この糖タン白質は、少なくとも２種類の異なる組織に対して特異的な結合部位を 有する。

本発明による抱合体に好適なタン白質フラグメントは、例えば天然に存在する接 着性筒タン白質またはグリコジル化されたまたはグリコジル化されていない形態 でのその一部をプロテアーゼで消化することにより、あるいは遺伝子工学処理を 行った前記の相当物であって同じアミノ酸配列または結合特異性に影響を与えな い１以上の変化を除いては同じアミノ酸配列を有するものから誘導することがで きる。更に、本発明の抱合体に好適なタン白質フラグメントは組換えＤＮＡ技術 または化学的合成のいずれかによって直接製造することができることが理解され るであろう。薬剤学的に活性な物質は、好ましくは架橋剤を介してまたは多数の 活性物質の分子および接着性タン白質の１個以上のフラグメントを有することが ある担体分子により直接または間接に選択されたタン白質フラグメントまたは複 数のフラグメントに共有結合的に結合する。

この種類の薬剤学的に活性な抱合体は普通の手段（通常は経口または静脈内）に よって投与することができ、特定の身体的異常の状態にある身体の特定の部位に 更に容易に且つ有効に標的捕獲される。このような抱合体は、血流またはその他 の体液中で目的とする部位へと運ばれて通過するとき、その部位に高度に選択的 に容易に且つ速やかに結合し易くなるので、抱合体における活性物質と他の体組 織との間で起こる競合的な副反応の傾向は減少する。これは、特定の異常を治療 するための投与要件を減少させると同時に、非効率的に用いられる薬剤学的に活 性な物質を身体に多量に投与することによって頻繁に起こる望ましくない副作用 の程度を減少させるといった二重の利点を有する。

接着性筒タン白質とその消化フラグメントは、身体によって産生されるある種の タン白質に対して強い親和性を有することが知られている。本発明の好ましい抱 合体は、それ故タン白質物質を含むまたはから成る組織の蓄積を伴う身体の異常 を治療するのに有効な種類のものである。この場合には、薬剤学的に活性な物質 は、好ましくは蓄積されたタン白質をタン白質分解を生じる薬剤を含んで成る。

蓄積されたタン白質がフィブリンを主要な成分とする血餅から成る場合には、本 発明の好適な抱合体はプラスミノゲン活性化因子、例えばｔ−ＰＡ、ストレプト キナーゼ（ＳＫ）またはウロキナーゼ（Ｕ　Ｋ）であってフィブリンに対して高 度に選択的に結合するタン白質フラグメントに結合したもの、好ましくはフィブ リンに対する結合親和性を有するフィブロネクチンフラグメントであるが全フィ ブロネクチンとは異なり実質的にゼラチンまたはコラーゲン結合親和性を欠くも のを含んで成る。実際に、本発明の抱合体は糖タン白質フラグメントに対して共 有結合によって容易に結合することができるので、これらの抱合体は薬剤学的に 活性な物質がタン白質または酵素の形態であるときには特に有効であることが見 出されている。

本発明による好ましい抱合体の他の例は、リウマチ性関節炎に冒された関節中の 関節組織に対して選択された薬剤を選択的に標的捕獲するのに好適な抗リウマチ 薬−タン白質抱合体である。この状況は、慢性滑膜炎によってコラゲナーゼが放 出されて活性化され、その結果冒されている関節の結合組織におけるコラーゲン が破壊されて、変性してゼラチンを形成することによって特徴化される。したが って、リウマチ性関節炎の治療に用いられる本発明の抱合体は、体内でのゼラチ ン−結合のための高度な選択性を有する１種類以上のタン白質フラグメントに直 接または間接的に結合した金、金化合物またはペニシラミンのような抗リウマチ 薬を含んでいる。前記したように、フィブロネクチンはゼラチン結合ドメインを 有し、更に自然のままのコラーゲンよりもゼラチン（変性コラーゲン）に対する 親和性が高い。したがって、本発明の抗リウマチ薬抱合体のタン白質フラグメン ト成分としては、ゼラチン結合ドメインを含んでいるがフィブリン結合親和性を 実質的に持たない１種類以上のフィブロネクチンフラグメントを用いるのが最も 好ましい。

タン白質フラグメントと結合して本発明の抱合体を形成することができる他の薬 剤学的に活性な物質は、抗腫瘍剤、抗炎症剤および主要な抗生物質の抗菌剤であ る。

結合させることができる物質の例は、欧州特許第Ａ２−０１１４６８５号明細書 および米国特許第４，５８７，１２２号明細書に記載されており、ダウノマイシ ン、ミドマイシン、セファロチン、ペニシリンＧおよびセクレチンが挙げられる 。、タン白質フラグメントと結合して本発明の抱合体を形成することができる薬 剤学的に活性な物質の更に他の例は、例えば局部的な傷の修復を促進するタン白 質成長因子および抗生物質（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧの種類）である。

本発明の抱合体内部に配合するのに好適な薬剤学的に活性な物質が有する一つの 本質的な特徴は、それらがタン白質、特に接着性筒タン白質フラグメントまたは 無毒の担体分子例えばデキストランと直接にまたは結合性基を介して結合する能 力である。例えば、これらの物質は、アミノ、カルボキシまたはヒドロキシル基 のような官能基を有することができる。本発明の抱合体に配合するための興味あ る一つの特定の活性物質は金であり、これはタン白質に中に存在するスルフィド リル基と直接結合することができる。

薬剤学的に活性な物質を特定の体組織へ運搬する効率を増加させるために、活性 物質をデキストランのような無毒の担体分子、好ましくはフィブロネクチンまた はアルブミンまたはそれらの一部のようなタン白質に担持させ、１種類以上の標 的捕獲タン白質フラグメントと直接または間接的に結合させることよって本発明 の抱合体を調製してもよい。担体は一般的には共有結合的に結合する。明らかに 、多数の接着性タン白質フラグメント、例えば１〜２０個、具体的には１〜５個 のフラグメントを単一の担体分子に結合させてもよい。

選択される担体が、フィブロネクチンまたは異なる結合特異性の範囲を有するそ の高分子量部分である場合には、これらは活性物質およびタン白質フラグメント を付着することによって大部分が無効になり、したがって抱合体の選択性を実質 的に減少させることが防止される。

かかる担体を使用することは、金または金化合物を１種類以上のゼラチン結合フ ィブロネクチンフラグメントと共に用いる本発明の抗リウマチ性抱合体を製造す るには特に好ましい。リウマチ性関節炎の治療用の毒性を有する金化合物を従来 の方法で投与することは、特に金が肝臓および腎臓に蓄積される結果、望ましく ない副作用が起こりやすいという点で不利である。しかしながら、金または金化 合物を担体分子および少なくとも１個の標的捕獲フィブロネクチンフラグメント であって体内でのゼラチン結合に対して高度の選択性を有するものに結合させた 本発明の抗リウマチ性抱合体を用いることにより、関節炎に冒されている関節で 金濃度を高くすることができ、肝臓または腎臓に損傷を与える危険性は実質的に 減少する。特に好ましいものは、例えば金チオリンゴ酸またはその塩から誘導さ れる全自体を担体タン白質のスル質フラグメント、好ましくはゼラチン結合親和 性を有するがフィブリン結合親和性を実質的に欠いている１種類以上のフィブロ ネクチンフラグメントを架橋剤、例えばシアナミドによって担体に結合させる。

フィブロネクチンまたはその部分はスルフィドリル基による金の結合容量が高い ため、この種類の抱合体の担体分子として特に好ましい。全フィブロネクチンま たはゼラチン結合ドメインを有するその一部を用いる抗リウマチ性抱合体の製造 の際には、予防的手段を用いて最終抱合体の担体タン白質のゼラチン結合親和性 を保護してもよい。例えば、担体タン白質と金との直接的な共有結合は、ゼラチ ン例えば可溶性ゼラチンまたはセファロースのようなアガロ質フラグメントを担 体タン白質のゼラチン結合能力を破壊しない温和な条件下で結合させてもよい。

このような保護手段を取って担体タン白質におけるゼラチン結合部位を保持する ことによって、最終抱合体の選択性は減少せず、実際には増大することもある。

単一組織の種類に対する親タン白質と比較して特異性が増大した接着性筒タン白 質のフラグメントは、下記のような処理段階を採用することによって製造するこ とができる。

（ａ）所望な組織結合特異性を有する接着性筒タン白質を選択し、 （ｂ）好ましくはプロテアーゼ、例えばトリプシン、トロンビンまたはカセグレ ンＤを用いる酵素消化により選択されたタン白質を断片とし、 （Ｃ）特異的な親和性または治療を要する異常に伴う体組織についての親タン白 質と比較して少なくとも高度な選択性を有するフラグメントを選択する。

薬剤学的に活性な物質が非タン白質性、例えば金または金化合物である本発明の 抱合体を製造する場合には、活性物質を直接または架橋剤を介してタン白質分解 の前に段階（ａ）において選択される接着性タン白質に結合させてもよく、結合 条件は接着性タン白質が対象とする組織に対する結合親和性を保持するように選 択される。

段階（Ｃ）は、親和性クロマトグラフィによって行うのが好ましい。例えば、段 階（ｂ）においてタン白質分解から生じるタン白質フラグメントを目的とする組 織結合部位または密接に関連した組織以外の結合部位に対する特異的な結合親和 性を有する親和性支持体上で親和性クロマトグラフィに付してもよい。結合した フラグメントを、次に溶出して、必要ならば、続いて１以上の親和性クロマトグ ラフィを更に行い、目的の組織結合部位の外に１以上の追加の組織結合部位を有 するフラグメントを取り出してもよい。最初の親和性クロマトグラフィ段階およ び引き続く複数の親和性クロマトグラフィ段階は、例えば適当な体組織または疑 似体組織を固定した親和性支持体上で行ってもよい。このような親和性支持体に 対して、組織または疑似組織をアガロースを基剤とした支持体、例えばセファロ ース上で好都合に固定してもよい。

タン白質分解に対して選択されるタン白質が２以上の組織結合特異性を有する場 合には、特定の組織の種類に対して所望な増大した特異性を有するフラグメント を交互に得るためには、段階（ｂ）からのタン白質フラグメントを１以上の分離 段階であって目的の組織以外の体組織に対する親和性を有するタン白質フラグメ ントを選択的に取り除く段階に付すことによって段階（Ｃ）を始めてもよい。そ れぞれのこのような分離段階は、例えば目的のフラグメントに結合親和性を必要 としない固定された体組織（または疑似体組織）上で親和性クロマトグラフィに より好都合に行うこともできる。最後に、固定された体組織または目的の組織結 合部位に対する親和性を有する疑似体組織を有する別の親和性支持体を用いる親 和性クロマトグラフィによって、または必要な組織結合部位と密接に関連した体 組織以外の結合部位に対して特異的結合親和性を有する親和性支持体を用いるこ とによって、所望なフラグメントを単離してもよい。

選択されるフラグメントの大きさはフラグメントが生成するタン白質の大きさ、 タン白質の分画化の方法（好ましくはタン白質分解酵素による消化によって行う ）、および用いられる分画法の範囲および厳密性によって変わる。

フラグメントを誘導することができる一つのタン白質は天然の接着性糖タン白質 フィブロネクチン（分子量、４４０．０００）であり、これは広範な結合部位を 有することが知られており、ゼラチンおよびフィブリンに対する結合部位を有し 、且つタン白質分解酵素によって容易に消化してフラグメントにすることができ る。これは血漿中および他の体液中に見出され、結合組織、細胞表面および基部 膜と関連している。その広範な生物学的機能は、ゼラチンおよびフィブリンだけ でなく細胞表面、グリコアミノグリカン類および他の高分子にもこれを結合させ る一連の特異的な結合部位によるものである。血漿フィブロネクチンは、２本の 極めて類似しているが同一ではないポリペプチド鎖であってＣ０ＯＨ末端基でジ スルフィド結合によって連結されており、且つ他の基部膜および血漿タン白質よ りもタン白質分解を受けやすいものから構成されている。セリンプロテアーゼは 完全なフィブロネクチンを最初は２か所の優先的な部位で開裂させて、鏡開ジス ルフィドを有する短いＣ０ＯＨ末端フラグメントとＮＨ２末端フラグメント、分 子量２７．０００〜３０，０００を放出する。これは、フィブリン、アクチン、 Ｓ、　ａｕｒｅｕｓおよびヘパリンの結合部位と血漿トランスグルタミナーゼ（ 因子Ｘ１ｌｌａ）に対する架橋部位を有する。消化が進行すると、下記に示され るような結合ドメインを生じる。

タン白質　（１）　（２）　（３）　（４）　（５）　（６）　（７）１：　フ ィブリン、ヘパリン、アクチンおよびＳ、　ａｕｒｅｕｓに結合。

２：　ゼラチン、コラーゲンおよびフィブロネクチンに結合。

４：　細胞に結合。

５：　ヘパリンに結合。

６：　フィブリンに結合。

ゼラチン結合親和性の不在でフィブリンに対する結合親和性またはフィブリン結 合親和性の不在でのゼラチン結合親和性を有するフィブロネクチンフラグメント を、フィブリンモノマー親和性支持体例えばフィブリンモノマー−セファロース およびゼラチン−親和性支持体例えばゼラチン−セファロースを用いる適当な２ 段階親和性クロマトグラフィ法によって、フィブロネクチンフラグメントの混合 物例えば全フィブロネクチンのプロテアーゼ消化混合物から好都合に単離しても よい。フィブロネクチンのフィブリン結合部位はヘパリン結合部位と緊密に関連 しているので、前記のフラグメント精製法におけるフィブリンモノマー−親和性 支持体を、フィブリンモノマー−セファロースよりも高い容量を有し且つ一層容 易に製造することができるヘパリン−親和性支持体例えばヘパリン−セファ０− スで有利に置換してもよい。実際に、ヘパリン−セファロースは、商業的源例え ばファルマシア・エイ・ビー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ａ、Ｂ、）から入手するこ ともできる。

フィブリン結合特異性を有するフィブロネクチンフラグメントの好ましい分子量 範囲はＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィ）によって測定したところ、２５ から４００　ｋＤａであるかまたは５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ドデシル硫酸ナトリウ ム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって測定したところ２５から２００ 　ｋＤａであり、一方ゼラチン結合特異性を有するフィブロネクチンフラグメン トの分子量範囲は、好ましくはＨＰＬＣによって測定すると４０から５００　ｋ Ｄａの範囲にあるかまたは５ＤＳ−ＰＡＧＥによって測定すると４０から２００ 　ｋＤａの範囲にあり、これらの範囲ではフラグメントが小さくなれば特異性は 増加する。ＨＰＬＣを用いる場合に記録される高めの分子量は、計測前または中 にフラグメントが会合することによって見掛けの分子量を増加させることによる ものと思われる。

本発明のもう一つの観点によれば、本発明の薬剤学的に活性な抱合体の製造法で あって、薬剤学的に活性な物質を全接着性夕・白質と比較して治療の必要がある 異常の状態にある体組織に対して改良された結合特異性を有する接着性糖タン白 質の少なくとも１種類のフラグメントに直接または間接的に結合させ、または薬 剤学的に活性な物質がタン白質でないときには、薬剤学的に活性な物質を全接着 性糖タン白質またはその一部に結合させ、必要ならば前記体組織に対して特異的 な結合部位を保護した後、タン白質分解によって抱合された薬剤学的に活性な物 質を担持するタン白質フラグメントを産生させ、前記のタン白質またはその一部 と比較して改良された結合特異性を有する前記のフラグメントの少なくとも１種 類を選択することを含んで成る方法を提供するものである。

したがって、例えば本発明による抗リウマチ抱合体は、金をゼラチン結合親和性 を有する接着性タン白質例えば全フィブロネクチンのスルフィドリル基に直接に 結合させた後プロテアーゼで分解し、体内におけるゼラチン結合について親抱合 体よりも選択性が改良された抱合体を選択することによって製造することができ る。フィブロネクチンまたはそのゼラチン結合部分が出発の接着性タン白質とし て選択される場合には、全抱合をゼラチン、例えば可溶性ゼラチンまたはアガロ ースを基剤とする支持体に結合したゼラチンの存在で行って、接着性タン白質の ゼラチン結合部位を保護゛ｆるようにする。

目的の組織に対する親タン白質と比較して結合特異性が改良された接着性タン白 質の１種類以上のフラグメントを用いて薬剤学的に活性な物質に結合させること からまたは間接的に抱合させる前に好ましくは共存結合的に担体に結合させ、ま たはこのような担体結合をタン白質のフラグメント結合の後に行い、その場合に は条件を選択して輪の）タン白質フラグメントの必要な組織結合能を保持する。

薬剤学的に活性な物質として非タン白質性の化合物種を含んで成る本発明の抱合 体をより大きな接着性タン白質含有抱合体のプロテアーゼ消化によって生成させ る場合には、所望な組織結合特異性を実質的に減少させることなく、選択された 抱合体を担体に引きメントに結合した活性物質の荷重が増加すると共に増加する ので、活性物質は抱合体内にモル過剰量で存在するのが好ましい。しかしながら 、活性物質の荷重が高すぎると、組織−結合基質上の必要な組織結合部位を遮蔽 しがちになり、抱合効率が低くなることがある。このため、本発明の抱合体はタ ン白質フラグメント１モル当たり活性物質（通常は単一化合物または元素）１か ら１００モル、更に好ましくは１から５０モルを含むのが好ましい。活性物質が タン白質または酵素あるいは他の高分子物質から成るときには、抱合体における タン白質フラグメント対活性物質のモル比は１：１から１＝ｌＯであるのが好ま しい。他方、低分子量の活性化合物、例えば金原子は、高めの荷重比率例えば１ ：ＩＯから１＝５０で存在するのが好ましい。

前記した金−タン白質フラグメント抗リウマチ剤抱合体を除いた本発明による抱 合体の製造においては、タン白質フラグメントまたは複数のフラグメントはカル ボジイミド、ジカルボン酸のジアルデヒド誘導体、ジイソシアネートまたはアル ドヘキソピラノース環開裂構造を有する酸化デキストランのような既知のタン白 質架橋剤を用いて薬剤学的に活性な物質と結合させるのが最も好ましい。

好適なカルボジイミドには、米国特許第４．０４６．８７１号明細書に開示され たもののいずれかが挙げられ、且つ下記のいずれかから選択してもよい。

１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミド−塩酸塩 、 １−シクロへキシル−３−（２−モルホリノエチル）−カルボジイミド−メト− ｐ−トルエン−スルホネート、１−シクロへキシル−３−（４−ジエチルアミノ シクロヘキシル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエン−スルホネート、 １−シクロへキシル−３−（β−ジエチルアミノ−エチル）−カルボジイミド、 １−エチル−３−（２−モルホリノ−エチル）−カルボジイミド−塩酸塩、 １−エチル−３−（２−モルホリノ−エチル）−カルボジイミド−サルフェート およびシアナミド。

用いられる架橋剤がジカルボン酸のジアルデヒド誘導体から成るときには、酸は カルボキシ−末端の０２〜Ｃ５の直鎖状アルカンであるのが好ましく、最も好ま しくはグルタミン酸であり、そのジアルデヒド誘導体はゲルタールアルデヒドで ある。ゲルタールアルデヒドを用いて抱合体形成する好適な方法は、ジェイ・ダ ブリュ・ペイン（Ｊ、Ｖ−Ｐａｙｎｅ）著、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　（１９７ ３）　１３５．８６７−８７３に記載されている。

好適なジイソシアネートの例は、ヘキサメチレンジイソシアネートである。

好適な酸化デキストランとこれを用いる抱合体形成の方法は、米国特許第４．５ ８７．１２２号明細書に開示されている。

薬剤学的に活性な物質と１種類以上のタン白質フラグフラグメントと、架橋剤と 、薬剤学的に活性な物質を同ン白質フラグメントと反応させた後、生成物を薬剤 学的に活性な物質と反応させてもよい。

薬剤学的に活性な物質と１種類以上のタン白質フラグメントとを共有結合的にカ ップリングさせて本発明の抱合体を形成させることは、一般的にはｐＨ５から９ 、好ましくは６から９の水性溶液中で、好ましくは緩衝溶液中で行われる。好ま しい反応温度は１０℃から３０℃であり、特に室温である。反応時間は、好まし くは０．５から１５時間であり、更に好ましくは０．５から５時間である。反応 混合物中の薬剤学的に活性な物質の好ましいモル比は、好ましくは１：１から１ ００　：　ｌであり、適切であるならば、十分な量のまたは過剰量の架橋剤が存 在して、これら三者の抱合を行う。

前記の方法によフて製造される活性物質−タン白質フラグメント抱合体は反応混 合物から分離するのが好ましく、それらは固定化された体組織またはタン白質フ ラグメントが親和性を有する疑似体組織上で親和性クロマトグラフィによって製 造されるのである。

次の、活性物質−タン白質フラグメント抱合体の高分子担体、例えばフィブロネ クチン、アルブミンまたはそれらの高分子量部分への共有結合的カップリングも 、前記のように温和な条件下で架橋剤を用いることによって行うことができる。

しかしながら、キャリヤーを有する本発明による抱合体を製造することが所望な 場合には、キャリヤーはタン白質フラグメントの結合の前に直接にまたはカップ リング剤を介して薬剤学的に活性な物質共有結合的にカップリングする。したが って、金がキャリヤータン白質に結合している本発明の好ましい抗リウマチ剤抱 合体を製造するためには、適切な金化合物、例えば金チオマリン酸または金チオ マリン酸ナトリウムのようなその塩を最初にキャリヤーのスルフィドリル基と反 応させてこれらの基を介して直接に金をカップリングさせるのが好ましい。前記 のように、この段階に対して選択されるタン白質がフィブロネクチンまたはその ゼラチン結合部分である場合には、タン白質の抱合はゼラチン例えば可溶性ゼラ チンまたはアガロースを基剤とした支持体に結合されたゼラチン例えばセファロ ースの存在で行ってもよく、この場合にはキャリヤータン白質はゼラチン結合部 位を保持する。あるいは、フィブロネクチンは、それ自体セファロースのような アガロースを基剤とした支持体に結合しているかまたはこうして結合されたフィ ブロネクチンに吸着されているときには、金と直接結合するのが好都合なことが ある。本発明の抗リウマチ剤抱合体を含むキャリヤーの製造には、例えば金チオ マリン酸ナトリウムのような適当な金化合物をアガロースを基剤とする支持体に 結合したアルブミン、例えばアルブミン−セファロースカラムと反応させること によってタン白質のスルフィドリル基を介してアルブミンに直接結合させるのが 好都合であることもある。本発明の抗リウマチ剤抱合体の製造において、金を最 初にタン白質であってそれ自体セファロースのような支持体上に共有結合的に結 合しているものに結合させる場合には、必要とされる金−キャリヤータン白質抱 合体は適切なプロテアーゼ消化によって放出させてもよく、すなわち最終抱合体 のキャリヤータン白質はより大きなプレキャリヤータン白質から誘導される。

本発明の第三の観点によれば、薬剤学的に受容可能な希釈剤またはキャリヤー、 例えば食塩溶液中に溶解または分散させた第一の観点による薬剤学的に活性な物 質を含んで成る薬剤組成物が提供される。この組成物は、静脈内注射により、ま たは錠剤または摂取可能な液体の形態での組成物を経口的に摂取することによっ て投与してもよい。水性組成物の典型的な投与量は、組成物０．０５から１０ｍ １中に抱合体ＩＯから３００　ｍｇを含むものであってもよい。

本発明のもう一つの観点によれば、ヒトまたはヒト以外の動物の治療に使用する ための本発明の抱合体、例えばプラスミノゲン活性化因子を主としてフィブリン 標的捕獲能を有するフィブロネクチンフラグメントに結合させて血栓症状の治療 に用いるかまたは金のような抗リウマチ性物質を主としてゼラチン標的捕獲能を 有するフィブロネクチンフラグメントに結合させてリウマチ性関節炎の治療に用 いることを特徴とする本発明の抱合体が提供される。

本発明の更にもう一つの観点としては、前記の抱合体が顕著な標的捕獲能を有す る特定の体組織での異常の治療に用いられる組成物を製造するために本発明によ る抱合体の使用が提供される。

本発明の更にもう一つの観点としては、身体の異常な状セ億る組織に薬剤学的に 活性な物質を輸送する方法であって、前記の薬剤学的に活性な物質を前記の組織 に対して顕著な標的捕獲能を有する本発明による抱合体の形態で投与することを 特徴とする方法が提供される。

下記の非限定的な実施例は、本発明を説明するためのものである。

下記の実施例において用いられるＰＦＭは、プラズマ・フラクショネーション・ ラボラトリ−（ＰｌａｓｍａＦｒａｃｔｌｏｎａｔｌｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ）　、チャーチル０ホスピタル（Ｃｈｕｒｃｈｊｌｌ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ）、 オックスフォード、英国（Ｇ　Ｂ）によって供給された血漿寒冷沈降物から沈澱 によって精製したフィブリノーゲンから成っていた。二〇ＰＰＭは、フィブリノ ーゲン６８重量％と、フィブロネクチン（天然の混在物）１０重量％と、痕跡量 の第Ｖｌｌｌ：ＲＡｇ因子および第Ｘ１ｌｌａ因子を含んでいた。通常のフィブ リン血餅は必ずフィブロネクチンを含んでいるので、このＰＦＭを疑似フィブリ ン血餅として用いた。

ＦＦＦＭは、ＰＦＭ内のフィブリノーゲンをゼラチン−セファロース親和性クロ マトグラフィに付すことによってフィブリノーゲンからフィブロネクチンを除去 することによって製造した。このクロマトグラフィ処理に用いたカラムの調製を 下記に説明する。

ゼラチン−セファロースカラムは、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂに材料を吸 着するため、製造業者（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｌａ＞　、ウプサラ、ス ウェーデン）が推奨の方法に記載されているカップリング法によって調製した。

セファロースゲル１ｇの湿時重量当たりゼラチン１５ｍｇのカップリング比を用 いて、カラムを調製した。

調製したカラムの操作条件は、流出緩衝液が１０ｗＭリン酸塩、１０ｄ７エン酸 塩、１５０ｄ　Ｎ　ａ　Ｃ１溶液、ｐＨ７，５から成り、リン酸緩衝食塩水中Ｉ Ｍアルギニンで溶出を行ったこと以外はヴエント（Ｖｕｅｎｔｏ）とバヘリ（Ｖ ａｈｅｒｉ）、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ、、　（１９７９）　１８３．３３１頁 から採用した。カラムは、４℃で用いた。

フィブリンモノマーカラムは、ヘーン（Ｈｅｅｎｅ）とマチアス（Ｍａｔｔｈ！ ａｓ）、ＴｈｒｏＩｌ、　Ｒｅｓ、、　（１９７３）　２．１３７頁の方法によ って調製ビた。用いたモノマーは、生理的フィブリンモノマー（ＰＦＭ）である ものまたはフィブロネクチン不含フィブリンモノマー（ＦＦＦＭ）である２種類 のカラムであった。ＰＦＭ−セファロースおよびＦＦＦＭ−セファロースカラム を、製造業者（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｌａ）　）の推奨法によってＰＦ ＭまたはＦＦＦＭをＣＮＢ　ｒ活性化セファロースに結合させることによって調 製した。これら二種類のカラムについての操作条件ヘパリン−セファロースカラ ムは、ＣＮ　Ｂ　ｒ活性化セファロース４Ｂへ材料をカップリングさせるため製 造業者によって推奨された方法にしたがって調製した。これらのカラムは、同製 造業者（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ウプサラ、スウェーデン）から 「容易にカップリングできる」ものとして市販されている。操作条件は、緩衝液 がｌ１０ｆｆ１リン酸塩、２０ｍＭ食塩、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液、ｐＨ７， ５から成り、ＩＯＧＭリン酸塩、０．５Ｍ食塩、０．５ｍＭＥＤＴＡ溶液、ｐＨ ７，５を用いて溶出したこと以外は、ゼラチン−セファロースについて前記した 通りであった。

親和性クロマトグラフィによって選択されたタン白質フラグメントは、セファク リル５２００を用いてゲル浸透クロマトグラフィによって更に分割した。流出緩 衝液は、１０ｄリン酸塩、１５０ｏ＋Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ１、ｐＨ７，５であった。

約１０ｍｇ者セ拠−ド容積カラム（２，２ｘ　８４ｃｍ）へ１２ｍ１／時の流速 で加えた。

Ｂ５．　プラスミノゲン活性化因子の分析溶液中のプラスミノゲン活性化因子の 濃度は、発色物質Ｓ−２２５１（、カビ・ビトリラム（Ｋａｂｉ　Ｙｔｔｒｉｕ ｍ）、スウェーデン）を用いて血漿中のプラスミノゲンの測定のためのカビ・デ ィアグノスティカ（Ｋａｂｌ　ＤｉａｇｎｏｓＬｆｃａ）「反応の初期速度（Ｉ ｎｉｔｉａｌ　Ｒａｔｅ　ｏｒ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）Ｊを用いて測定した。この 方法のプロトコールを下記に纏める。

（１）　ヒト血漿を、１２ｎＭＮ　ａ　Ｃ１を含む５０５Ｍ　）リス−ＨＣｌ５ ｐＨ７，４から成る分析用緩衝溶液で血漿対緩衝溶液の容積比が１：２０となる ように希釈し、この希釈した血漿２００μｌを反応管に加え、 （２）　管を３７℃で２から６分間インキュベーションし、（３）　既知数の単 位（例えばｌＯまたは２５単位）のプラスミノゲン活性化因子またはプラスミノ ゲン活性化因子を含む試験抱合体を分析用緩衝溶液で１００μｌまで希釈したも のを反応管に加え、 （４）　管を３７℃で１０分間インキュベーションし、（５）　Ｓ　−２２５１ から成る基質溶液７００μｌを分析用緩衝溶液で希釈して０．８８ｄの処理溶液 としたものを加え、（６）　混合し、反応管の内容物を微量キュベツトに移し、 ３７℃で４０５ｎ１１の波長の光に対する混合物の吸光度（Ａ）の経時変化（Δ Ａ４ｏ５）を測定し、 （７）　ΔＡ４ｏ５／分を計算して、この結果を緩衝溶液中に存在する１ｍｌ当 たりのプラスミノゲン活性化因子の単位数に対してプロットする。

ＰＦＭ−セファロースについての活性を試験するために、もう一つのプラスミノ ゲン活性化因子の分析法を用いた。前記の「反応の初期速度」分析法によっては セファロースを試験することはできなかったので、終了点分析法を用いなければ ならなかった。この分析法のプロトコールを下記に纏める。

（１）　ガラス漏斗上で吸引濾過によって試験ＰＦＭ−セファロースを部分乾燥 し、 （２）　試験ＰＦＭ−セファ０−ス１００　ｔｎｇ　（湿時重量）を反応管に秤 量して入れ、 （３）　希釈したヒト血漿２００μｍを加え、（４）　混合し、 （５）　管を３７℃で１０分間インキュベーションし、（Ｂ）　３７℃で発色性 物質Ｓ−２２５１（カビ（Ｋａｂｉ））の溶液７００μｌを加えて、混合して、 精確に１８０秒間インキュベーションし、 （７）　５０％酢酸１００μｌを加えて、混合して直ちに反応を停止させ、 （８）　４０５ｎｍに対する生成する溶液の４時間以内の吸光度を測定し、結果 を吸光度に対するプラスミノゲン活性化因子の既知濃度についての標準曲線に関 連付ける。

Ｃ１接着性タン白質のタン白質分解酵素を用いる消化によるタン白質フラグメン トの生成 フィブロネクチンを出発の接着性タン白質として選択した。消化の前に、ウルト ロパック（［１ｔｒｏｐａｅ）　Ｔ　Ｓ　ＫＧ　４０００　ＳＷカラムを用い、 分画範囲を１ｏｏｏｋＤａから５ｋＤａまでとして、サイズ排除高性能液体クロ マトグラフィによってフィブロネクチンの純度を検査した。これは、消化前にフ ィブロネクチン凝集体またはフラグメントが存在すると、次の消化工程に影響を 与えることがあるので、タン白質分解酵素による消化によって生成したフィブロ ネクチンフラグメントを標準化するために必要であった。

Ｃ，１フィブロネクチンのトリプシンによる消化ＰＢＳ　（ＰＢＳ−１０ｍＭリ ン酸ナトリウムと０．１５８のＮａＣｌを含むリン酸緩衝食塩水、ｐ　Ｈ７，５ ）　１０ｍ１中１０ｍｇフィブロネクチンを、トリプシン０．０５ｍｇで３７℃ で２時間消化した。トリプシンは、アルギニンまたはりジン残基に隣接するペプ チド結合を特異的に開裂することができるエンドペプチダーゼである。反応混合 物の試料を、下記の表−１に示した時間に採取した。２時間後に大豆阻害剤０． １ｍｇを加えて、反応を停止した。

消化によって生成したフィブロネクチンフラグメントの分子量をＴＳＫ　Ｇ　３ ０００　ＳＷカラムを用いてゲル浸透高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰ　Ｌ　 Ｃ）によって測定した。処理緩衝液は０．０５％ナトリウムアジドを含む０．１ Ｍリン酸溶液ｐＨ６，８であり、流速は０．４ｍｌ／分であり、溶出時間は７０ 分間であった。溶出液の吸光度を２８０ｎｍで観察してフィブロネクチンフラグ メントの存在を検知した。

表−１ インキュベーション　タン白質フラグメントの分子量　（ｋＤａ）トリプシンに よるフィブロネクチンの広範な消化により（すなわち、１０分間より長時間）、 競合的酵素結合分析法（トラン（［）ｏｒａｎ）ら、Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ　（１９ ８３）　４５．２４３−２５１）によって測定したところ、そのゼラチン結合活 性は著しく減少した。したがって、１０分間の最少有効消化時間の原則を採用し た。

Ｃ２，トロンビンによるフィブロネクチンの消化フィブロネクチンをトリプシン の代わりに２５０国際単位（ｔｕ）のトロンビンを用いて消化したことを除き、 Ｃ１の処理を繰り返した。トロンビン、血餅形成の際のフィブリノーゲンのフィ ブリンへの最終的な変換に与かるセリンプロテアーゼである。１２０分後にベン ズアミジンを反応混合物中において最終濃度が８畦となるまで加えることによっ て、消化を停止した。反応混合物の試料を下記の表−２に示した時間毎に採取し て、Ｃ１に記載したのと同じ方法を用いて分析した。

インキュベーション　タン白質フラグメントの分子量　（ｋＤａ）ゼラチン結合 親和性とフィブリン結合親和性のいずれか一方または両方あるいはこれらの２種 類の結合特異性のいずれをも持たないフラグメントの混合物を含んで成るトリプ シンまたはトロンビンによるフィブロネクチン消化生成物を出発物質として用い て、デュアルカラム親和性クロマトグラフィ法を用いてゼラチン結合親和性の不 在またはその逆でフィブリン結合親和性を有するフィブロネクチンフラグメント を選択した。

Ｃ２の方法を、試薬の量を大規模にし且つ溶液の容積を比例して増加させて繰り 返した。トロンビンを用いて３７℃で１２０分間のフィブロネクチンの消化によ って得られたフィブロネクチンフラグメントの溶液から成る生成物を、既知量の フィブロネクチンフラグメントを含む数個の分画に分けた。これらの分画を、直 接にゼラチンーセ、ファロースの１５ｍ１カラムに適用しく前記の一般的方法Ｂ １を参照）、ゼラチンおよびフィブリン結合部位の両方を有するまたはゼラチン 結合部位を有するがフィブリン結合部位を持たないゼラチンに対する親和性を有 するタン白質フラグメントを除去した。これらの未結合分画であって、ゼラチン 結合親和性を持たないがフィブリンに対する親和性を有するタン白質フラグメン トおよびフィブリンにもゼラチンにも結合親和性を持たないタン白質フラグメン トを含むものを、ＦＦＦＭ−セファロースの１５ｍ１カラムに適用した（上記の 一般的方法Ｂ２を参照）。ＦＦＦＭ−セファロースからの溶出液は、フィブリン に対する結合親和性を有するがゼラチンに対する結合親和性は持たない精製され たタン白質フラグメントを含んでいた。

この二段階親和性クロマトグラフィ法の結果を、生成物の収率に関して下記の表 −３に示す。

表−３ 供試試料　ゼラ子ンーセファロース観和１クロマトグラフィ　目状タン９賃　Ｆ ＦＦＭ−セファロース鴎クロマトグラフィ　Ｂ収タン臼賃（ｍｇ）　！ｅ（＋ｎ ｇ）　未結合　（ａ＋ｇ）　（％）　結ｅ（ｍｇ）　未結合　（ｍｇ）　（％） ８３．０２．８４　２２．９４　７８　１．１９　３．７９　１１．５１５、（ １６，４８，５８６１，７２２，４４６８，４７，２２，６４２，５６７２０， ７４１，４０８１，０表−３に示したそれぞれの段階でのタン白質フラグメント の回収率は、フィブロネクチンに対する消光係数を１．２８）に対するものであ った。

ＦＦＦＭ−セファロースおよびゼラチン−セファロースカラムからの溶出液を、 ＨＰＬＣによって分析し、ゼラチン結合フラグメントとフィブリン結合フラグメ ントの分子量を決定した。ゼラチンカラムから溶出したフラグメントの大きさは 、４３５および２９６ｋＤａであることが判った。ＦＦＦＭカラムから溶出した フラグメントの大きさは、３８２．１１０および４５ｋＤａであった。

上記の二段階親和性クロマトグラフィ法を逆にすると、（ＦＦＦＭ−吸着の後に ゼラチン吸着）、第二の吸着段階からの溶出液であってゼラチンに対する結合親 和性を有するがフィブリン結合親和性は持たない精製されたタン白質フラグメン トを含むものを与えることが理解されるであろう。

（ａ）　上記の０１に記載した方法を大規模に変更して、トリプシンで１０分間 消化したフィブロネクチンを用いてＤｌの方法を繰り返した。親和性カラムから の溶出液を、ＨＰＬＣによって分析した。これによると、ゼラチンカラムからは 大きさが３５８．１４０．１１９および６９ｋＤａのタン白質フラグメントが溶 出し、ＦＦＦＭカラムからは５６ｋＤａのタン白質フラグメントが溶出すること が判った。

（ｂ）　交互デュアルカラム親和性クロマトグラフィ法においてＦＦＦＭ−セフ ァロースの代わりにヘパリン−セファロースを用いることによって、フィブロネ クチン中のフィブリン結合部位とヘパリン結合部位との間の密接な関係を利用し て、フィブリン結合親和性を有するがゼラチン結合親和性は持たないフィブロネ クチンフラグメントを単離した。

フィブロネクチンのトリプシン消化フラグメントの溶液を前記のＤ　２　（ａ） と同様にして調製し、溶液を既知量のフィブロネクチンフラグメントを含む数個 の分画に分けた。これらの分画を、前記のＢ３に記載の一般的方法によってヘパ リン−セファ０−スの１５ｍ１カラムに適用した。ヘパリンとフィブリンに対す る親和性を有するタン白質フラグメントを含む結合分画を、次に前記の８１に記 載の方法によってゼラチン−セファロースの３０ｍ１カラムに適用した。未結合 分画は、ヘパリン／フィブリンに対する親和性を有する精製されたタン白質フラ グメントを含んでいた。ゼラチン−セファロースに結合するものであって、ゼラ チンとヘパリン／フィブリンの両方に対する結合活性を有するものは、廃棄した 。この二段階親和性クロマトグラフィ法の結果を、下記の表−４に示す。

吸着カラムからの溶出液を、ＨＰＬＣによって分析した。これにより、二段階精 製法からのタン白質フラグメントの大きさは、３６（１，１８１、１４（１（少 量）、５Ｂおよび４２ｋＤａであることが判った。

これらのフラグメントは総てヘパリン／フィブリン結合活性を保持しており、ゼ ラチンには結合しなかったが、この方法によって生成した別のフラグメントの大 きさのものを、前記の８４に記載の方法でセファクリル５２００上で分離するこ とによって更に分割することができた。ヘパリン結合および非ゼラチン結合分画 の比率を、表−５に示す。

フィブリン結合性であるそれぞれの段階におけるタン白質フラグメントの比率を 、前記の８２の方法によってＰ　Ｆ　Ｍ−セファロースカラムに分画を適用する ことによって測定した。

表−４ 供試試料　ヘバリン−セフ１ロース配クロマトグラフィ　目収夕冫百賃　ゼラチ ンーセファロース君相生クロマトグラフィ　回【タン臼賃（ＩＩＩｇ）　結６（ ｌｎｇ）　未結合　（ｍｇ）　（％）　結合（ｃｇ）　未ｕ　（ｍｇ）　（％） ２３．７　１１．２　１３．７　１０５．０　１．８　９．１　９７Ｊ精製段階 　回収タン白質　出発物質　フィブリン結合活性（ｍｇ）　（％）　（％′） フィブロネクチンの トリブシン消化　２３．７　１００　２３ヘバリンーセフ７ロース （結合分画＞　１１．１２　４５．６ ゼラチンーセファロース （未結合分画）　９．１０　３７．３　６３セファクリノレ ８２００分画 ３６０Ｋ　２．６１　１１．０　２３ １８１Ｋ　１．４９　６４　３９ （１４０Ｋ微量ピーク）　Ｎ．Ｄ．　Ｎ．Ｄ．Ｎ．Ｄ．一未７１１’ｌ定。

２種類の親和性クロマトグラフィ力ラムを反対の順序で用いると、すなわちゼラ チンーセファロースカラムの結合分画をヘバリンーセファロース力ラムに適用す ると、ゼラチン結合親和性を有するがフィブリンおよびヘバリン結合親和性を持 たないフィブロネクチンフラグメントを単離することが理解されるであろう。

ストレプトキナーゼ４重量％と、アルブミン５０重量％と、ナトリウム塩４４重 量％と、水２重量％を含む市販のストレプトキナーゼ製剤の水性溶液（商品名「 カビキナーゼ（Ｘａｂｉｋｉｎａｓｅ）、カビ・ビトルム・エイビー・ヘマトロ ジ−（Ｋａｂｉ　Ｖｉｔｒｕｍ　ＡＢ　｝Ｉａｅｍａｔｏｌｏｇｙ）、ストック ホルム、スウェーデンより発売）を、チバクロン・ブルー（Ｃｉｂａｃｒｏｎ　 ｂｌｕｅ）一セフ７ｏ−スＣＬ６Ｂ吸着樹脂のカラム中を周囲温度で通過させる ことによって、アルブミンを吸着させてストレプトキナーゼから分離した。未結 合分画を、プラスミノゲン活性化因子の活性について分析した。

１ｍｌ当たりアルブミン不含ストレプトキナーゼを約８００単位含む未結合分画 の水性溶液２ｍｌを、前記に記載の方法によって調製した。Ｄ１の方法によって 調製したフィブリン結合性フィブロネクチンフラグメントの水性溶液の同量をス トレプトキナーゼ溶液に加えた。混合物のｐＨを、少量の０．　ＩＮ塩酸を加え ることによって７．０に調整した。生成する溶液を撹拌しながら、周囲温度で０ ．５８８Ｍの１−エチル−３−（３−ジメチレンアミノブ口ピル）一カルポジイ ミドー塩酸溶液を加えて、生成する溶液中のカルボジイミドー塩酸の含量を０． ５％（重量／容量）とした。撹拌を２時間継続し、反応混合物中にストレプトキ ナーゼータン白質フラグメントの抱合生成物を生成させた。所望な生成物を、Ｆ ＦＦＭ−セファロース上に吸着させた後、０．２Ｍ食塩溶液で溶出させることに よって回収した。生成する溶出液中の抱合体の濃度を、必要ならば加圧限外濾過 によって増加させた。

溶液の各種の抱合体濃度での抱合体内のストレプトキナーゼの活性を、未抱合ス トレプトキナーゼの溶液中における等濃度に対して前記のＢ５に記載の方法によ って測定した。これらの測定結果を、下記の表−６に示す。

表−６ ＳＫａ度　活性（ΔＡ４０５分　） （単位／１）　ＳＫ単独　ＳＫ一タン白質分画抱合体１０　０．０１９　０．０ １０ ２０　０．０３Ｂ　０．０１４ ３０　０．０５３　０．０２１ これらの結果は、抱合体中のストレプトキナーゼ活性は未抱合体中に存在するも のの３８から５２％であることを示している。

Ｆ．　フィブリン結合親和性を有する選択されたフィブウ口キナーゼ（ＵＫ）　 ２２４０単位を、Ｄ１の方法によって調製したフィブリン結合フィブロネクチン フラグメン｝０．１２ｍｇ／ｍｌを含むｐＨ７．３の緩衝溶液（２０ｍＭ｝リス 塩酸塩、０．１５Ｍ食塩）２ｍｌ中に溶解した。溶液内のタン白質フラグメント の総含量は３．２７　Ｘ　１０−６Ｍであった。生成する溶液に、５％（重量／ 容量）グルタルアルデヒドの水溶液（最終濃度、０．２％）８０μｌを加えた。

生成する溶液を、グルタルアルデヒドを加えながらボルテックスミキサー上で混 合した。混合を１分間継続した後、溶液を室温（２０℃）で２４時間インキユベ ーションした。所望な生成物を、前記の方法Ｅに記載のＦＦＦＭ−セファ口−ス を用いて回収した。溶液中の抱合体の濃度を、必要ならば、加圧限外濾過または 緩衝溶液で希釈することによって調整した。

溶液中の各種の抱合体濃度における抱合体内のウロキナーゼの活性を、未抱合ウ ロキナーゼの溶液中での等濃度に対して前記のＢ５に記載の方法によって測定し た。

これらの測定の結果を、表−７に示す。

表−７ ＵＫａ度　活性（ΔＡ４０５分−１） （単位／ｉｆ）　ＵＫ単独　ＵＫ−タン白質分画抱合体１０　０．０２０　０． ００Ｂ ２０　０．０４７５　０．０１０ ３０　０．０５７５　０．０１３ 前記の表−７に示した結果は、抱合体内のウロキナーゼのプラスミノーゲン活性 はその元の未抱合体における活性の２１から３０％であることを示している。

Ｇ、フィブリン結合親和性を有する選択されたフィブロネクチンフラグメントの ウロキナーゼへの抱合の別途法 Ｕ　Ｋ　２２４０単位を、前記のＤｌの方法によって調製したフィブリン結合フ ィブロネクチンフラグメント０．１２＋ｎｇ／ｍ１（３，２７ｘ　１０−６Ｍ） を含むｐＨ７，３の緩衝溶液（２０ｍＭ　トリス塩酸塩、Ｏ，１５Ｍ食塩）２ｍ ｌ中に溶解した。

溶液のｐＨを、少量の０．ＩＮ塩酸を加えることによって５に調整した。生成す る溶液に、撹拌しながら周囲温度で、０．５８８Ｍの１−エチル−３−（３−ジ メチレンアミノプロピル）−カルボジイミド−塩酸溶液を加えて、生成する溶液 中のカルボジイミド−塩酸の含量を１．０％（重量／容量）とした。撹拌を１時 間継続し、反応混合物中にウロキナーゼ−フィブロネクチンフラグメント生成物 を生成させた。０．５％（重量／容量）カルボジイミドを用いて、ｐＨ７，０（ すなわち、塩酸を加えない）での２時間の温和な形態のカルボジイミド架橋も好 適であった。所望な生成物を、ＦＦＦＭ−セファロース上に吸着させた後、０， ２Ｍ食塩溶液で溶出させることによって回収した。

生成する溶出液中の抱合体の濃度を、必要ならば加圧限外濾過によって増加させ た。

溶液中の各種の抱合体濃度での抱合体内のウロキナーゼの活性を、前記のＦに記 載の方法によって測定した。

これらの測定結果を、下記の表−８に示す。

表−８ ＵＫ濃度　活性（ΔＡ４ｏ５分　） （単位／＋ａｌ）　ＵＫ単独　ＵＫ−タン白質分画抱合体１０　０．０２２５　 ０．０１５ ２０　０．０５０　０．０３３ ３０　０．０［ｉｏ　０．０４２ 前記の表−８から、抱合体内のＵＫのプラスミノーゲン活性はその元の未抱合体 における活性の６４から６７％であることが判る。

トリス−ＭＣＩ−食塩溶液中のフィブリン結合フィブロネクチンフラグメントの 濃度を０．０１３ｍｇ／ｍｌに減少させたことを除き、前記のＧの方法を繰り返 した。

トリス−ＨＣｌ−食塩溶液中のフィブリン結合フィブロネクチンフラグメントの 濃度を０．０３ｍｇ／ｍｌに減少させたことを除き、前記のＧの方法を繰り返し た。

Ｊ、　プラスミノゲン活性化因子−タン白質フラグメント抱合体の疑似血餅組織 （フィブリンモノマー）への結合 前記のＥおよびＧ−Ｉに記載の方法によって調整した抱合体の効率を試験するた め、それぞれの抱合体の溶液を固定化した疑似血餅組織と接触させ、この組織に よって吸着されるプラスミノゲン活性化因子の量を測定した。

体内ではフィブリン血餅によるプラスミノゲン活性化因子の吸収と引き続くフィ ブリン溶解の速度との間には直接的相関があることが知られているので、この試 験はこれらの抱合体の薬理学的価値を有効に示唆するものである。

選択された疑似組織は、生理的フィブリンモノマー（ＰＦＭ）製剤であり、通常 の血餅の成分の多くを含むことが知られている。粗製のフィブリンモノマー（カ ビ・ディアグノスティカ（Ｋａｂｉ　Ｄｌａｇｎｏｓｔｉｃａ））であって、本 発明ではＰ　Ｆ　Ｍと表わされるものを、前記の８２に記載の方法によって、セ ファロース４Ｂビーズ（ファルマシア（Ｐｈａｒｗａｃｊａ）　、スウェーデン ）に固定化した。プラスミノゲン活性化因子−フィブロネクチンフラグメント抱 合体を、プラスミノゲン活性化因子の活性が１６から１６０単位／ｍｌである既 知濃度の別の溶液に作成した。これらの溶液を、次に前記の固定化したＰ　Ｆ　 Ｍの１００ｍｇ（湿時重量）の量と共に４℃で２時間ローラー混合した。

次いで、固定化したＰＦＭを５抛Ｎトリス−ＨＣｌ溶液、ｐＨ７，８で十分に洗 浄し、未結合活性を完全に除去した。

次いで、結合抱合体の量を、前記のＢ５に記載の終点分析法と親和性吸着剤の懸 濁液の分画を用いてＰＦＭ−セファロースの直接分析法によって測定した。出発 物質（プラスミノゲン活性化因子−フィブロネクチンフラグメント抱合体）と結 合後の洗浄したＰ　Ｆ　Ｍ−セファロースとにおけるプラスミノゲン活性化因子 の活性を、試験抱合体中のフィブリン結合フィブリン溶解剤の尺度として（溶液 １ｍｌ当たりプラスミノゲン活性化因子（ＰＡ）の単位によって）測定した。こ れらの測定の結果を、下記の表−９に示す。

表−９ 抱合体　固定化された　セファロース　セファ０−ス　タン白質分画調製法　Ｐ ＰＭに加えた　に結合した　に結合した　ｌｎｇ当たりの抱合体内のＰＡ　ＰＡ 　ＰＡの活性　反応したＰＡのＥ　１Ｂ　０．４２　２．６　１３３ ３２　３．２　１０．０　２６７ ８０　２３．０　２８．０　６６７ １６０　４１、［ｉ　２Ｂ、０　１３３３０２５６゜０　２３．６　２０ｇ ５０　１０．４　２０．７　４１７ １００　１５．３　１５．３　８３３ １５０　１７．８　１１．９　１２５０８　５０　１８．１３　３６４　８３３ １００　３２．０　３２．０　１６６７１５０　３１．６　２１．１　２５００ ＋　５０　２５．６　５１．２　１６６７１００　３４．２　３４．２　３１１ １１５０　４２．９　２８．８　５０００表−９の結果を、第１図および第２図 に模式的に示す。

第１図は、固定化されたＰＦＭに加えた抱合体の量と続いてそれに結合したＰＡ の量との間の相関を示すグラフである。第２図は、抱合体を生成した架橋反応混 合物に用いたフィブロネクチンフラグメントＩＩＩＩｇ当たりのプラスミノゲン 活性化因子の（単位での）量と抱合体に生成されたフィブリン結合プラスミノゲ ン活性化因子の量との間の前記のＥおよびＧ−１の方法によって調整した抱合体 についての相関を示している。ウロキナーゼを用いると、架橋反応混合物内でプ ラスミノゲン活性化因子の使用量が増加するので、抱合体ＰＡ含量の増加には２ つの相の傾斜がある。ストレプトキナーゼを用いた場合の傾斜は遥かに急であり 、一層有効な結合があることを示プラスミノゲン活性化因子−フィブロネクチン フラグメント抱合体は、その支持体マトリックスよりもフィブリンモノマーに対 して選択的に結合していることを確かめるために、前記の方法Ｇの生成物をＪに 記載した結合法を用いて未置換セファロース４Ｂゲルに適用した。生成する分画 のプラスミノゲン活性化因子の活性を分析した。未結合分画のみで活性が見られ た。回収率は１００％であった。方法Ｇの抱合体は未置換セファ０−スに対する 親和性は無視し得る程度であったので、フィブリン置換セファロースは疑似フィ ブリン血餅として作用し、この抱合体は疑似血餅のタン白質部分に完全に結合し たものと結論された。

因子の結合 ウロキナーゼ２０１６単位をｐＨ７，３の緩衝溶液（０，１５Ｍ食塩を含有する ２０ｆｆ１ＭトリスＨＣＩ）２ｍｌに溶解し、ＰＦＭ−セファロース４Ｂに適用 した。混合物を４℃で２時間保持した。溶液中に存在した元のＵＫ活性の５％の みが疑似血餅に結合し、疑似血餅組織に対する未改質ウロキナーゼの基礎的結合 は最少限であることを示していた。

方法Ｇのプラスミノゲン活性化因子−フィブロネクチンフラグメント抱合体生成 物の薬理学的効果を、抱合体の選択的結合に対するフィブリンを主成分とする血 餅の溶解を検討することによって更に試験した。標的としたプラスミノゲン活性 化因子抱合体の影響を、　■で標識した血餅から血餅洗浄媒質中に放出される１ ２５Ｉ−ＦＤＰを測定することによって評価した。

フィブリノーゲンをクロラミンＴ法（グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、Ｂｊｏｃｈｅ ｉ、　Ｊ、、　（１９［ｉ３）、　８９．１１４頁）によってヨウ素化し、フィ ブリノーゲン１ｇ当たり１００単位のトロンビンを用いて活性化した。ＰＢＳ− 洗浄血餅組織を、タン白質シートの形状にプロットし、これから小さなディスク （１０〜２０ｏ＋ｇ）を容易に切除することができるようにした。１２５１−フ ィブリン血餅ディスク（２０ｍｇ）を、８００Ｕ　／　ｍｌのウロキナーゼまた は８００Ｕ／ｍｌのウロキナーゼ−フィブロネクチンフラグメント抱合体を含む トリス緩衝溶液、ｐＨ７，４（５０ｍＭトリス、１１０ｍＭ食塩）　０．２５ｍ １中で、室温で２時間インキュベーションした。

血餅ディスクを２ｍｌのトリス緩衝溶液、ｐＨ７，４で２回洗浄して、非特異的 に結合したウロキナーゼを除去した。コントロール血餅ディスクを、ウロキナー ゼまたは抱合体なしでトリス緩衝溶液、ｐＨ７，４中でインキュベーションして 、試験試料と平行して洗浄した。

血餅ディスクをチャンバー（１０ｍｌ容積）に移し、この中を血餅洗浄媒質（２ ５ｍｌ）を媒質溜めから２ｍ１Ｚ分の流速で循環させた。洗浄媒質は、０．０３ ｍｇ／ｍｌのプラスミノゲンおよび１ｍｇ／ｍｌのヒトアルブミンを含むトリス 緩衝溶液、ｐＨ７，４から成っていた。

洗浄媒質の試料（０，５ｍｌ）を２４時間毎に採取して、可溶化した放射能を測 定した。これらの測定の結果を第３図に模式的に示しており、これはウロキナー ゼ活性に対しするフィブリン血餅ディスクから放出される１２５Ｉの放射能の時 間経過を示すグラフである。抱合体と共にインキュベーションした血餅の解離は 、同じ活性を有するプラスミノゲン活性化因子のみの場合より３．３倍速かった （例えば、１８時間：コントロール−ゼロ活性化因子−刺激溶解）。これは、抱 合体の特異的且つ優先的な結合によって、血餅の付近のプラスミノゲンの活性化 が促進され、血餅がフィブリン溶解反応により破壊されることを示している。

ファロースまたはアルブミン−セファロースへの直接的共有結合によるカップリ ング フィブロネクチン−セファ０−ススラリ−［１〜２部のカップリング緩衝液（５ ０ｉＭトリスーＨＣｌ、ｐＨ７，５，１Ｍ尿素）に１部湿時沈降容積のゲルであ ってフィブロネクチン０．７ｇ／ｇＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂから成るも のを加えたちのコと１ｍｌのカップリング緩衝液であって５０ＭＭのナトリウム 金チオマレートを含むものとを、ローラーミキサーを用いて３７℃で４時間イン キュベーションした。次いで、セファロースを適当な溶液、例えば５０ａ＋Ｍ　 ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５で洗浄して、未反応の金化合物とタン白質を除去し た。湿ったベレット状のゲルを遠心分離またはガラス漏斗を用いて真空濾過する ことによって回収し、トリプシンを用いて酵素対タン白質基質の比率が約１　： 　２００で５０＋ａＭ　トリス−ＨＣ１゜ｐＨ７，５中で３７℃で１５から１２ ０分間インキュベーションした。放出された金−フィブロネクチンフラグメント 抱合体を、遠心分離によってセファロースから分離した。

上記の処理においてフィブロネタチン−セファ０−スの代わりにアルブミン−セ ファロースを用いて、金−アルブミンフラグメント抱合体を得た。

上記の処理によって得られる全抱合体は、ゼラチンを標的とする接着性タン白質 フラグメントに架橋することによって抗リウマチ抱合体を製造するのにキャリヤ ータン白質−全抱合体として好適である。

金の抱合を条件（温度、インキュベーション時間、イオン強度）の範囲に就いて も試験した。ナトリウム金チオマレートの金成分について具体的に原子吸光分光 分析法によって測定し、タン白質はフォリン−ローリ−分析法によって測定した 。下記の表−１Ｏは結合した金の量がどの様に変化するかを示している。（単位 容積のフィブロネクチン−セファロース当たり金のマイクロモル数での）結合は 、低イオン強度のトリス−ＨＣｌでは、有意であったが、低かった。ＩＭの尿素 を加えることにより、結合は４時間および３７℃で最適になり５０から１５０％ まで増加した。下記の表−１１はフィブロネクチン−セファロースへの金の結合 に対する尿素の水準の増加の相対的影響を示している。尿素濃度を０．１から１ ．ＯＮまで増加させると、金の取り込みはほぼ４倍まで増加する（この場合には 、全結合は抱合体のタン白質含量に関して測定した）。実際に、これらは、１． ２　Ｘ　１０’モルの金／フィブロネタチン１モルの程度であり、極めて高い結 合の水準である。アルブミン−セファロースをフィブロネクチン−セファロース の代わりに用いると、タン白質重量に対してフィブロネクチン−セファロースに ついての最低水準の約３５％であった。カップリングは低イオン強度でのもので あったが、最終の抱合体は生理的ＮａＣ１水準に対して極めて安定であった。固 定化した錯体からの金の喪失は、０．ＩＭから０．７５ＭのＮａＣｌでは一定で あり２１から２３％であった。

表−１０ 固相フィブロネクチンへの金の結合に対する反応条件の影響 ５０ｄ　トリス　Ｄ、１５ｍＭ　ＮａＣｌ　１）４［素Ａｕ　基本結合　Ａｕ　 基本結合 ２時間反応 ＋４℃　Ｂ、００　４．６５　７７．５％　９．１５　１５２．５％３、ＧＯ ＋３７℃　７．２０　十浦番　５０％　１２．７５　１７７％４時間反応 ＋４℃　６．７５　６．３０　９３％　１２．００　１７８％＋３７℃　７．８ ０　６．３０　８１’Ｘ　１９．５０　２５０％（１）　数字は２ｍｌのゲルか ら回収されるセファロースに結合した金の総量（原子吸光による）を表わす。

（２）　基本結合は、トリス緩衝液のみでの値として、対応する条件を用い、１ ００％としたものである。

尿素濃度　平均全配合量　コントロール水準に対する０、１Ｍ　Ｏ，０９８９６ ％ ０．５Ｍ　Ｏ，１３３１６５％ ＬＭ　Ｏ，２０８９Ｂ ２Ｍ　Ｏ，１９３２８７％ ＊２回の実験の平均値、３７℃で４時間インキュベーション。

フィブロネクチン−セファロースは、低イオン強度で多量の可溶性フィブロネク チンを結合し、これは緩衝液のＮａＣ１濃度を上昇することによって回収できる 。

フィブロネクチン−セファ０−ススラリ−［１〜２部の緩衝液（５０ｍＭ）リス −ＭＣＩ、ｐＨ７，５）に１部湿時沈降容積のゲルであってフィブロネクチン０ ．７　ｇ／ｇＣＮＢ　ｒ活性化セファロース４Ｂから成るものを加えたちの］を 、前記と同じ緩衝液中精製した血漿フィブロネクチン（約ｌｌＩｇ／ｍ＋）　２ ｍｌと混合し、１５〜３０分間混合した。ゲルを（同じ緩衝液で）洗浄して、未 結合フィブロネクチンを除去し、充填したフィブロネクチンｌｒｎｇ当たり尿素 ＩＭとナトリウム金チオマレートとして金２５μＭを含む５０１Ｍ　）リス−Ｈ Ｃｌ５ｐＨ７，５中でローラーミキサーを用いて３７℃で４時間インキュベーシ ョンした。次いで、ゲルを洗浄して、高イオン強度の緩衝液（５０ｄ）リス−Ｉ ＣＬ　ｐＨ７，５，０，５ＭＮａＣｌ）に再分散して、吸着したフィブロネクチ ン−全抱合体を解離させた。混合を、室温で１５から６０分間行った。溶液中の 金−フィブロネクチン抱合体を透析、限外濾過またはゲル濾過あるいはそれらの 技法の組み合わせによって脱塩し、凍結または乾燥保存した。

全抱合に対するこの技法を用いて、適用した金の３７９６が抱合され、特異的結 合値は９．８　ｘ　１０３モルの金／１モルのフィブロネクチンとなった。フィ ブロネクチンのゼラチンを標的とするトロンビンフラグメントへの架橋の後、特 異的全結合は１．１　ｘ　１０”モルの金／１モルのフィブロネクチンまで減少 した。

前記の処理において、可溶性フィブロネクチンをフィブロネクチンフラグメント に代えても、ゼラチンを標的とする接着性タン白質フラグメントへの架橋による 抗リウマチ抱合体の製造に好適なキャリヤータン白質−全抱合体を提供すること ができる。

上記のＡ１およびＡ２に記載の全抱合法を用いても、生成する金−フィブロネク チンまたは金−フィブロネクチンフラグメント抱合体はゼラチン結合活性を保持 しなかった。フィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントへの金の直 接カップリングに用いられるこの第三の方法では、カップリング反応に用いられ るタン白質のゼラチン結合部位を、可溶性ゼラチンまたはゼラチンセファロース の形態でのゼラチンへの結合によって保護した。

５０ｆｆ１ＭトリスーＨＣ１、ｐＨ７，５の１ｍｌ当たり（皮膚コラーゲンの変 性によって製造した）ゼラチンの１〜５ＩＩ１ｇを溶解したちの２ｍｌを、同じ 緩衝液中に完全なフィブロネクチンまたはゼラチン結合性フィブロネクチンフラ グメント２ｍｇを加えたものと混合した。混合物を、室温で１時間ロールした。

または、フィブロネクチンまたはゼラチン結合性フィブロネクチンフラグメント を同じ緩衝液中でゼラチン−セファロースに吸着させた。ナトリウム金チオマレ ート５０μＭを加えて、溶液またはゼラチン−セファロース−フィブロネクチン スラリーを尿素でＩＭとし、室温で４時間混合した。

可溶性ゼラチンを用いるときには、４Ｍ尿素を加え、４Ｍ尿素を有する２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ５，２中に透析し、予備膨潤させたカルボキシメチルセ ルロースイオン交換体（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）　ＣＭ　５２　）と混合 することによって、ゼラチン−フィブロネクチン結合を開裂させた。可溶性ゼラ チンをイオン交換体に結合させ、遠心分離によって除去したところ、可溶性抱合 体が残った。

ゼラチン−セファロースを用いる場合には、ゲル上にフィブロネクチン−全抱合 体を作成し、未反応の薬剤またはタン白質フラグメントを金化合物を含まない同 じ緩衝液で洗浄して除去した。最少的なフィブロネクチン−全抱合体は、ゼラチ ン−セファロース吸着剤を４Ｍ尿素または５０ＩＩＩＭトリスーＨＣｌ、ｐＨ７ ，５中ＩＭアルギニンで洗浄して回収した。

全フィブロネクチンと共に上記のような「ゼラチン結合保護法」を用いると、約 ５０％の金を抱合させてフィブロネクチン−全抱合体を与え、２．３　ｘ　１０ ３Ｍの金／ＬＭのフィブロネクチンとなることが判った。

こうして単離されたゼラチン結合性金−フィブロネクチンフラグメント抱合体か ら、ゼラチン結合親和性を有するがフィブリン結合親和性は持たないフィブロネ クチンフラグメントを有する抱合体を、抗リウマチ抱合体として直接使用するの に好適なＦＦＦＭ−セファロースまたはヘパリン−セファロース親和性クロマト グラフィによって選択することができる。このような抗リウマチ抱合体は、前記 と同様な方法によって単離されたゼラチン結合性金−全フィブロネクチン抱合体 をプロテアーゼ消化に付した後、フィブリン結合親和性を欠く金−フィブロネク チンフラグメント抱合体を選択することによっても得ることができる。あるいは 、金−フィブロネクチン抱合体並びに前記の「ゼラチン結合保護法」によって製 造した金−フィブロネクチンフラグメント抱合体をキャリヤータン白質−全抱合 体として用いて、ゼラチンを標的とする接着性タン白質フラグメント、例えばゼ ラチン結合親和性を有するがフィブリン結合親和性を実質的に欠くフィブロネク チンフラグメントに架橋させることによって抗リウマチ抱合体を製造することも できる。

フィブロネクチンを、実施例１の第０１節および第０２節に記載のトリプシンま たはトロンビンを用いて、または通常の方法でカテプシンＤを用いて消化して、 ゼラチン結合親和性とフィブリン結合親和性を両方とも有するかまたはこれら２ つの結合特異性はどちらも持たないフラグメントの混合物を生成した。プロテア ーゼで消化したフィブロネクチンを５０ＩｎＭトリスーＭＣＩ、ｐＨ７，５に溶 解したもの（１ｒｐｇ／　ｍｌ　）　ｌｏｍ＋を、ヘバリンーセファロース力ラ ムに載せた。ヘパリンまたはフィブリン結合部位を有するフラグメントを含まな い）未結合物質を、ゼラチンセファロースカラムに、０．５ＭＮ　ａ　Ｃ１を含 む５０ｍＭ　）リス−ＨＣ１，ｐＨ７，５中１＋＋＋ｇ／ｍｌの濃度で加えた。

未結合タン白質を洗浄した後、ゼラチン結合フラグメントを、処理緩衝液中４Ｍ 尿素または１Ｍアルギニンを用いて溶出し、透析によって脱塩した。

１０ＩＩＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５，２中（前記のＡＩ、Ａ２または Ａ３に記載の方法によって製造した）フィブロネクチンキャリヤー−金抱合体５ ｍｌを、フィブロネクチン−金抱合体と同じタン白質濃度で１％（０，２５Ｍ） シアナミドの最終濃度として、前記のＢに記載の方法で製造したゼラチン結合性 フィブロネクチンフラグメント５ｍｌと共に２２℃で１〜４時間インキュベーシ ョンした。

過剰の反応物を、透析、限外濾過またはゲル濾過によって除去した。

Ｄ、　最終抱合体のゼラチン結合活性の試験最終的な抱合体を、前記のＢと同じ ゼラチン−セファロースカラムに充填することによってゼラチン結合活性を分析 した。結合した物質を溶出して、総タン白質および全含量について分析した。こ れにより金のμＭ／ゼラチン結合性タン白質のμｇとしてゼラチン結合の尺度が 与えられた。

ＰＦＭ−セファロースに添加された ＵＫまたはＳＫの単位／ＭＬ 結合ＵＫまたはＳＫ 活性の単位／ＭＬ ＦＩＧ、３ 記号、Δ−Ａ　ＩＩＫ−フィブロネクチンフラグメント抱合体補正書の翻訳文提 出書（特許法第１８４条の８）平成　１　年　５　月　２９Ｅ］ｉ 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、　特許出願の表示 ＰＣＴ／ＧＢ　８７１００８５４ ２、発明の名称 改良された体組織結合特異性を有する薬剤活性抱合体３、特許出願人 住　所　イギリス国ハートフォードシャー、ボラムララド、エルストリー、ダガ ー、レイン、ザ、フレスト（番地なし）名　称　セントラル、ブラッド、ラボラ トリーズ、オーソリティー４、代理人 （郵便番号１００） 東京都千代田区丸の内三丁目２番３号 ５、　補正書の提出年月日 １９８８年　９　月　２８日 （１）　明細書第１３頁第７行の「セファロース」を、「セファロース（登録商 標）」に補正する。

（２）　同書第２９頁第１０行の「セファクリル５２００Ｊを、「セファクリル （登録商標）Ｓ２００Ｊに補正する。

（３）　同書第５７頁第４行の「ワットマン＜ｌｌ′ｈａｔｍａｎ＞ＣＭ５２Ｊ を、「ワットマン（Ｗｈａｔｏａｎ）　ＣＭ　５２　（登録商標）」に補正する 。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．特定の体組織を含む身体の異常を治療するための薬剤学的に活性な物質を含 んで成る薬剤学的に活性な抱合体であって、該薬剤学的に活性な物質が、親タン 白質と比較して前記の体組織に対する結合特異性が改良された接着性糖タン白質 の少なくとも１種類のフラグメントと直接または間接的に結合していることを特 徴とする抱合体。
2. ２．前記の薬剤学的に活性な物質が共有結合的に結合している、請求の範囲第１ 項に記載の抱合体。
3. ３．前記の薬剤学的に活性な物質が抗腫瘍剤、抗菌剤、抗炎症剤、抗リウマチ剤 、抗血栓剤、成長因子および抗生物質から選択される、請求の範囲第１項または 第２項に記載の抱合体。
4. ４．プラスミノゲン活性化因子が、フィブリン結合親和性を有するがゼラチンま たはコラーゲン結合親和性を実質的に欠く少なくとも１種類のフィブロネクチン フラグメントと直接または間接的に結合している、請求の範囲第３項に記載の抱 合体。
5. ５．抗リウマチ剤が、ゼラチン結合親和性を有するがフィブリン結合親和性を実 質的に欠く少なくとも１種類のフィブロネクチンフラグメントと直接または間接 的に結合している、請求の範囲第３項に記載の抱合体。
6. ６．前記の抗リウマチ剤が、金、抗リウマチ性金化合物およびペニシラミンから 選択される、請求の範囲第５項に記載の抱合体。
7. ７．薬剤学的に活性な物質および前記のタン白質フラグメントが直接または間接 的にキャリヤー分子に結合している、前記の請求の範囲のいずれか１項に記載の 抱合体。
8. ８．前記のキャリヤーがフィブロネクチン、アルブミンまたはそれらの高分子量 部分から選択される。請求の範囲第７項に記載の抱合体。
9. ９．前記のキャリヤーが共有結合的に結合している、請求の範囲第７項または第 ８項に記載の抱合体。
10. １０．薬剤学的に活性な物質を、全接着性タン白質と比較して治療される異常に 伴う体組織についての結合特異性が改良された接着性の糖タン白質の少なくとも １種類のフラグメントに直接または間接的に結合させ、または薬剤学的に活性な 物質がタン白質でないときには、この薬剤学的に活性な物質を全接着性糖タン白 質またはその一部に抱合させ、必要に応じて前記の体組織に特異的な結合部位を 保護し、次いでタン白質分解によって抱合された薬剤学的に活性な物質を担持す るタン白質フラグメントを生成させ、前記のタン白質またはその一部と比較して 結合特異性が改良された前記のフラグメントの少なくとも１種類を選択すること を特徴とする、前記の請求の範囲のいずれか１項に記載の薬剤学的に活性な抱合 体の製造法。
11. １１．薬剤学■に活性な物質を、親タン白質と比較して前記体組織に対する結合 特異性が改良された接着性糖タン白質のプロテアーゼ消化混合物から選択される １種類以上のフラグメントと直接または間接的に結合させる、請求の範囲第１０ 項に記載の方法。
12. １２．薬剤学的に活性な物質をキャリヤーに共有結合的に結合させた後、これを 親タン白質と比較して前記の体組織に対する結合特異性が改良された接着性糖タ ン白質の１種類以上のフラグメントに共有結合的に結合させる、請求の範囲第１ ０項または第１１項に記載の方法。
13. １３．金を、キャリヤータン白質または一層大きなブレキャリヤータン白質を金 チオリンゴ酸またはその塩と反応させることよって金を前記のタン白質のスルフ ィドリル基を介してこのタン白質に直接的に結合させた後、プレキャリヤータン 白質の抱合の場合には、プロテアーゼ消化および所望なキャリヤータン白質−金 抱合体を選択する、抗リウマチ抱合体を製造するための請求の範囲第１２項に記 載の方法。
14. １４．ヒトまたはヒト以外の動物の治療に用いる、請求の範囲第１項から第８項 のいずれか１項に記載の抱合体。
15. １５．特定の体組織を含む異常の治療に用いられる組成物を製造するための請求 の範囲第１項から第８項のいずれか１項に記載の抱合体でのって、顕著な標的捕 獲能を有するものの使用。
16. １６．身体の異常な状態にある組織に薬剤学的に活性な物質を輸送する方法であ って、前記の薬剤学的に活性な物質を、前記の組織に対して顕著な標的捕獲能を 有する本発明による抱合体の形態で投与することを特徴とする方法。