JPH0892294A - ヒト活性化プロテインｃ誘導体 - Google Patents
ヒト活性化プロテインｃ誘導体Info
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- JPH0892294A JPH0892294A JP6235035A JP23503594A JPH0892294A JP H0892294 A JPH0892294 A JP H0892294A JP 6235035 A JP6235035 A JP 6235035A JP 23503594 A JP23503594 A JP 23503594A JP H0892294 A JPH0892294 A JP H0892294A
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- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
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- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ヒト活性化プロテインＣのポリエチレングリ
コール修飾体の提供 【構成】 ポリエチレングリコールを結合した特定の１
官能性架橋剤を反応させることにより得られる、ヒト活
性化プロテインＣのアミノ基をポリエチレングリコール
で修飾したヒト活性化プロテインＣ誘導体。
コール修飾体の提供 【構成】 ポリエチレングリコールを結合した特定の１
官能性架橋剤を反応させることにより得られる、ヒト活
性化プロテインＣのアミノ基をポリエチレングリコール
で修飾したヒト活性化プロテインＣ誘導体。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ポリエチレングリコー
ル（以下、ＰＥＧと省略する）で修飾されたヒト活性化
プロテインＣ（以下、ｈＡＰＣと省略する）の誘導体に
関する。更に詳しくはボーラス静注投与可能な血中半減
期が延長されたＰＥＧで修飾されたｈＡＰＣ誘導体に関
する。
ル（以下、ＰＥＧと省略する）で修飾されたヒト活性化
プロテインＣ（以下、ｈＡＰＣと省略する）の誘導体に
関する。更に詳しくはボーラス静注投与可能な血中半減
期が延長されたＰＥＧで修飾されたｈＡＰＣ誘導体に関
する。
【０００２】
【従来の技術】ｈＡＰＣは血液凝固カスケードに関与す
る活性化第Ｖ因子（Ｆ．Ｖａ）および活性化第VIII因子
（Ｆ．VIIIａ）、線溶系の制御因子プラスミノーゲン・
アクチベーター・インヒビター（ＰＡＩ）を選択的に阻
害することにより抗血液凝固作用を発現し、現在汎発生
血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の治療薬として臨床試験が
行われている血漿蛋白質の一つである。
る活性化第Ｖ因子（Ｆ．Ｖａ）および活性化第VIII因子
（Ｆ．VIIIａ）、線溶系の制御因子プラスミノーゲン・
アクチベーター・インヒビター（ＰＡＩ）を選択的に阻
害することにより抗血液凝固作用を発現し、現在汎発生
血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の治療薬として臨床試験が
行われている血漿蛋白質の一つである。
【０００３】現在使用されているｈＡＰＣはヒト血漿か
ら精製したプロテインＣを酵素、例えばトロンビンで活
性化したもの（J. Clin. Invest., ７６１−７６９，１
９７９．参照）、遺伝子組み換え法により直接又はＰＣ
を経由して得られたｈＡＰＣ（ＷＯ９０／１３０７９号
明細書参照）であり、その誘導体については活性部位が
アシル基で修飾された誘導体（日本公表特許公報 昭６
０―５０１８５９号参照）以外に報告されていない。
ら精製したプロテインＣを酵素、例えばトロンビンで活
性化したもの（J. Clin. Invest., ７６１−７６９，１
９７９．参照）、遺伝子組み換え法により直接又はＰＣ
を経由して得られたｈＡＰＣ（ＷＯ９０／１３０７９号
明細書参照）であり、その誘導体については活性部位が
アシル基で修飾された誘導体（日本公表特許公報 昭６
０―５０１８５９号参照）以外に報告されていない。
【０００４】一方、Ｌ―アスパラギナーゼをＰＥＧで修
飾することが報告されて以来（Chemistry Letters,７７
３−７７６，１９８０．参照）、数多くの蛋白質につい
てＰＥＧ修飾が試みられている。このＰＥＧ修飾は通常
血中半減期の延長、異種蛋白質の場合には免疫原性の消
失、抗体産生の抑制等を目的として実施され、既にアデ
ノシンデアミナーゼではＰＥＧ修飾体が米国で商品化さ
れている（N. Engl. J.Med.,３１６，５８６−５９６，
１９８７．参照）。しかし、ｈＡＰＣについてはＰＥＧ
で修飾された例は報告されていない。
飾することが報告されて以来（Chemistry Letters,７７
３−７７６，１９８０．参照）、数多くの蛋白質につい
てＰＥＧ修飾が試みられている。このＰＥＧ修飾は通常
血中半減期の延長、異種蛋白質の場合には免疫原性の消
失、抗体産生の抑制等を目的として実施され、既にアデ
ノシンデアミナーゼではＰＥＧ修飾体が米国で商品化さ
れている（N. Engl. J.Med.,３１６，５８６−５９６，
１９８７．参照）。しかし、ｈＡＰＣについてはＰＥＧ
で修飾された例は報告されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする問題点】ｈＡＰＣは血管内に
投与されると速やかに血漿中の特異的インヒビター（プ
ロテインＣインヒビター、α1 ―アンチトリプシン）と
複合体を形成して阻害されるため、活性半減期が短く
（約２０分）、２４時間の点滴静注により投与されてい
る。ｈＡＰＣはその優れた抗血液凝固作用によりＤＩＣ
以外の血栓症、例えば脳梗塞、心筋梗塞などへの適応拡
大が考えられているが、急性期における治療では点滴静
注による投与が可能であるものの、症状が安定した慢性
期においてはより簡便なボーラス静注投与が望ましく、
その際血中半減期が短いことは欠点となり半減期の延長
化が望まれている。
投与されると速やかに血漿中の特異的インヒビター（プ
ロテインＣインヒビター、α1 ―アンチトリプシン）と
複合体を形成して阻害されるため、活性半減期が短く
（約２０分）、２４時間の点滴静注により投与されてい
る。ｈＡＰＣはその優れた抗血液凝固作用によりＤＩＣ
以外の血栓症、例えば脳梗塞、心筋梗塞などへの適応拡
大が考えられているが、急性期における治療では点滴静
注による投与が可能であるものの、症状が安定した慢性
期においてはより簡便なボーラス静注投与が望ましく、
その際血中半減期が短いことは欠点となり半減期の延長
化が望まれている。
【０００６】
【問題を解決するための手段】本発明者らは上記の問題
点を解決すべく検討し、ＤＮＡの塩基配列に特異的な
変異導入法を用いてｈＡＰＣの構造変異体とする方法、
ｈＡＰＣをリポソーム内に保護した組成物とする方
法、高分子修飾する方法、等を考慮した。その結果、
に関しては、変異導入蛋白自体の抗原性が懸念される
こと、に関してはリポソーム自体の安定性の問題、ｈ
ＡＰＣがリポソーム内で高濃度になることによる自己分
解の可能性、等の問題が考えられた。の高分子による
修飾はｈＡＰＣの様にインヒビターとの複合体形成が不
活性化の原因である場合には、酵素活性を保持した状態
でかつインヒビターと複合体を形成しない酵素を得るこ
とができる有効な手段であると考えられた。また、修飾
に伴う構造変化のため自己分解の抑制も期待できた。
点を解決すべく検討し、ＤＮＡの塩基配列に特異的な
変異導入法を用いてｈＡＰＣの構造変異体とする方法、
ｈＡＰＣをリポソーム内に保護した組成物とする方
法、高分子修飾する方法、等を考慮した。その結果、
に関しては、変異導入蛋白自体の抗原性が懸念される
こと、に関してはリポソーム自体の安定性の問題、ｈ
ＡＰＣがリポソーム内で高濃度になることによる自己分
解の可能性、等の問題が考えられた。の高分子による
修飾はｈＡＰＣの様にインヒビターとの複合体形成が不
活性化の原因である場合には、酵素活性を保持した状態
でかつインヒビターと複合体を形成しない酵素を得るこ
とができる有効な手段であると考えられた。また、修飾
に伴う構造変化のため自己分解の抑制も期待できた。
【０００７】蛋白質の高分子修飾に用いられる高分子と
してはデキストラン、ＰＥＧ、等が用いられている。こ
れらを比較した場合、デキストランは分岐鎖構造が抗原
決定部位となり、抗体産生を引き起こしうるが、ＰＥＧ
は免疫原性、毒性を持たず、またポリペプチド鎖に対し
て物理的な立体障害以外の相互作用を与えない高分子で
あることが知られており、より有用であると考えられ
た。
してはデキストラン、ＰＥＧ、等が用いられている。こ
れらを比較した場合、デキストランは分岐鎖構造が抗原
決定部位となり、抗体産生を引き起こしうるが、ＰＥＧ
は免疫原性、毒性を持たず、またポリペプチド鎖に対し
て物理的な立体障害以外の相互作用を与えない高分子で
あることが知られており、より有用であると考えられ
た。
【０００８】そこで、本発明者らはｈＡＰＣに対するＰ
ＥＧ修飾を鋭意研究した結果、以下のａ）及びｂ）に挙
げる特定の修飾方法によってのみ所望の目的を達成しう
ることを見出し、本発明に到達したものである。
ＥＧ修飾を鋭意研究した結果、以下のａ）及びｂ）に挙
げる特定の修飾方法によってのみ所望の目的を達成しう
ることを見出し、本発明に到達したものである。
【０００９】一般的に、ａ）ＰＥＧで修飾される蛋白分
子中の官能基としてはリジンのε―アミノ基、アミノ末
端のアミノ基、及びグルタミン酸、アスパラギン酸のカ
ルボキシル基が挙げられる。ｈＡＰＣの場合にはカルボ
キシル基を修飾すると活性の完全な消失がみられたが、
アミノ基への修飾はｈＡＰＣの活性が保持されることを
見いだした。おそらく、カルボキシル基は酵素活性の発
現に必須な官能基であると考えられる（参考実験１参
照）。
子中の官能基としてはリジンのε―アミノ基、アミノ末
端のアミノ基、及びグルタミン酸、アスパラギン酸のカ
ルボキシル基が挙げられる。ｈＡＰＣの場合にはカルボ
キシル基を修飾すると活性の完全な消失がみられたが、
アミノ基への修飾はｈＡＰＣの活性が保持されることを
見いだした。おそらく、カルボキシル基は酵素活性の発
現に必須な官能基であると考えられる（参考実験１参
照）。
【００１０】ｂ）更に、架橋剤が２カ所以上でｈＡＰＣ
と結合するとｈＡＰＣの分子間に架橋反応が生じ酵素活
性が著しく低下することを見い出した。従って、架橋剤
としては分子間の架橋反応が生じない、修飾されるｈＡ
ＰＣとの結合部位が１カ所である構造を有するものが好
ましいことが証明された（参考実験２参照）。
と結合するとｈＡＰＣの分子間に架橋反応が生じ酵素活
性が著しく低下することを見い出した。従って、架橋剤
としては分子間の架橋反応が生じない、修飾されるｈＡ
ＰＣとの結合部位が１カ所である構造を有するものが好
ましいことが証明された（参考実験２参照）。
【００１１】しかして本発明は、分子中の少なくとも１
個のアミノ基が架橋剤を介してＰＥＧで修飾されたｈＡ
ＰＣ誘導体である。
個のアミノ基が架橋剤を介してＰＥＧで修飾されたｈＡ
ＰＣ誘導体である。
【００１２】本発明で用いられるｈＡＰＣとしては、前
記した如くヒト血漿から精製したプロテインＣを活性化
して得られるもの（J. Clin. Invest., ７６１−７６
９，１９７９．参照）、遺伝子組み換え法により直接又
はＰＣを経由して得られたｈＡＰＣ（ＷＯ９０／１３０
７９号明細書参照）が挙げられる。
記した如くヒト血漿から精製したプロテインＣを活性化
して得られるもの（J. Clin. Invest., ７６１−７６
９，１９７９．参照）、遺伝子組み換え法により直接又
はＰＣを経由して得られたｈＡＰＣ（ＷＯ９０／１３０
７９号明細書参照）が挙げられる。
【００１３】本発明で用いられるＰＥＧとしては平均分
子量１０００以上の炭素数１〜３のｏ―アルコキシ（例
えば、ｏ―メトキシ、ｏ―エトキシ、ｏ―ｎ―プロポキ
シ、ｏ―イソプロポキシなと）ＰＥＧが挙げられる。
子量１０００以上の炭素数１〜３のｏ―アルコキシ（例
えば、ｏ―メトキシ、ｏ―エトキシ、ｏ―ｎ―プロポキ
シ、ｏ―イソプロポキシなと）ＰＥＧが挙げられる。
【００１４】また、本発明は該架橋剤によってｈＡＰＣ
が分子間で架橋されていないＰＥＧで修飾されたｈＡＰ
Ｃ誘導体である。
が分子間で架橋されていないＰＥＧで修飾されたｈＡＰ
Ｃ誘導体である。
【００１５】該架橋剤は前記アミノ基とＰＥＧとの結合
を仲介するもので、ＰＥＧとこれら架橋剤とを予め反応
させることによって得られる活性化ＰＥＧをｈＡＰＣと
反応させることにより目的の誘導体が得られる。
を仲介するもので、ＰＥＧとこれら架橋剤とを予め反応
させることによって得られる活性化ＰＥＧをｈＡＰＣと
反応させることにより目的の誘導体が得られる。
【００１６】該架橋剤としてはトリアジン、スクシニミ
ジルスクシネート、ｐ―ニトロフェニルホルメートなど
が挙げられる。トリアジンの場合、１分子のＰＥＧが結
合した４，６―クロロ―ｓ―トリアジン―ＰＥＧ1 と２
分子のＰＥＧが結合した６―クロロ―ｓ―トリアジン―
ＰＥＧ2 の２種類の構造を有する活性化ＰＥＧがある。
その内、１分子のＰＥＧが結合した４，６―クロロ―ｓ
―トリアジン―ＰＥＧ 1 ではその構造上修飾される蛋白
質との結合部位が２カ所存在するため化学修飾の結果、
蛋白質の分子間で架橋反応が生じてしまい酵素活性の著
しい低下を引き起こす。それ故、化学修飾には蛋白質と
の結合部位が１カ所しか存在せず架橋反応を引き起こさ
ない２分子のＰＥＧが結合可能な６―クロロ―ｓ―トリ
アジンが好ましい。
ジルスクシネート、ｐ―ニトロフェニルホルメートなど
が挙げられる。トリアジンの場合、１分子のＰＥＧが結
合した４，６―クロロ―ｓ―トリアジン―ＰＥＧ1 と２
分子のＰＥＧが結合した６―クロロ―ｓ―トリアジン―
ＰＥＧ2 の２種類の構造を有する活性化ＰＥＧがある。
その内、１分子のＰＥＧが結合した４，６―クロロ―ｓ
―トリアジン―ＰＥＧ 1 ではその構造上修飾される蛋白
質との結合部位が２カ所存在するため化学修飾の結果、
蛋白質の分子間で架橋反応が生じてしまい酵素活性の著
しい低下を引き起こす。それ故、化学修飾には蛋白質と
の結合部位が１カ所しか存在せず架橋反応を引き起こさ
ない２分子のＰＥＧが結合可能な６―クロロ―ｓ―トリ
アジンが好ましい。
【００１７】従って、本発明に用いられる架橋剤は６―
クロロ―ｓ―トリアジン、スクシニミジルスクシネー
ト、ｐ―ニトロフェニルホルメートの３種であり構造式
［Ｉ］−［III ］で表される。
クロロ―ｓ―トリアジン、スクシニミジルスクシネー
ト、ｐ―ニトロフェニルホルメートの３種であり構造式
［Ｉ］−［III ］で表される。
【００１８】反応に際しては、適当なｐＨの緩衝液にｈ
ＡＰＣを溶解させた後、活性化ＰＥＧを反応させる。そ
の際、ｈＡＰＣに対して添加する活性化ＰＥＧのモル比
を変化させることによりＰＥＧ修飾率をコントロールす
ることが可能である。
ＡＰＣを溶解させた後、活性化ＰＥＧを反応させる。そ
の際、ｈＡＰＣに対して添加する活性化ＰＥＧのモル比
を変化させることによりＰＥＧ修飾率をコントロールす
ることが可能である。
【００１９】本発明のＰＥＧで修飾された、すなわち架
橋剤を介してＰＥＧが結合したｈＡＰＣ誘導体（以下、
ＰＥＧ−ｈＡＰＣと省略する）は、例えば次の様にして
調製することができる。
橋剤を介してＰＥＧが結合したｈＡＰＣ誘導体（以下、
ＰＥＧ−ｈＡＰＣと省略する）は、例えば次の様にして
調製することができる。
【００２０】（１）トリアジンを架橋剤とするＰＥＧ―
ｈＡＰＣの一例 ＰＥＧ１モルに対して２〜５モルの塩化シアヌルをベン
ゼンあるいはトルエン中で約５０〜８０℃、約１５〜５
０時間反応させる。反応後の混液中には活性化ＰＥＧ2
（６―クロロ―ｓ―トリアジン―ＰＥＧ2 ）、及び活性
化ＰＥＧ1 （４，６―クロロ―ｓ―トリアジン―ＰＥＧ
1 ）が含まれているためゲル濾過によって目的の活性化
ＰＥＧを精製した後、石油エーテルを加えて活性化ＰＥ
Ｇを沈殿させ回収する。
ｈＡＰＣの一例 ＰＥＧ１モルに対して２〜５モルの塩化シアヌルをベン
ゼンあるいはトルエン中で約５０〜８０℃、約１５〜５
０時間反応させる。反応後の混液中には活性化ＰＥＧ2
（６―クロロ―ｓ―トリアジン―ＰＥＧ2 ）、及び活性
化ＰＥＧ1 （４，６―クロロ―ｓ―トリアジン―ＰＥＧ
1 ）が含まれているためゲル濾過によって目的の活性化
ＰＥＧを精製した後、石油エーテルを加えて活性化ＰＥ
Ｇを沈殿させ回収する。
【００２１】ｐＨ８―１０に調製した緩衝液にｈＡＰＣ
を０．１〜１％の濃度で溶解、上記活性化ＰＥＧをｈＡ
ＰＣの１モルに対し１〜３０倍モル添加した後、酵素の
失活を防ぐため、例えば低温下（４〜１０℃）で、０．
５〜２４時間反応させる。反応後、未反応の活性化ＰＥ
Ｇ及びｈＡＰＣを除くため通常のタンパク質の精製に用
いられる方法（ゲル濾過、限外濾過、等）でＰＥＧ―ｈ
ＡＰＣを精製することができる。
を０．１〜１％の濃度で溶解、上記活性化ＰＥＧをｈＡ
ＰＣの１モルに対し１〜３０倍モル添加した後、酵素の
失活を防ぐため、例えば低温下（４〜１０℃）で、０．
５〜２４時間反応させる。反応後、未反応の活性化ＰＥ
Ｇ及びｈＡＰＣを除くため通常のタンパク質の精製に用
いられる方法（ゲル濾過、限外濾過、等）でＰＥＧ―ｈ
ＡＰＣを精製することができる。
【００２２】（２）スクシニミジルスクシネートを架橋
剤とするＰＥＧ―ｈＡＰＣの一例 ＰＥＧ１モルに対して５〜１０モルの無水コハク酸をピ
リジンを含むジクロロエタン中でＮ2 ガスを通しながら
３日間反応させた後、得られたＰＥＧ―コハク酸にＮ―
ヒドロキシスクシンイミドを加え、ジメチルホルムアミ
ド中で反応させた。ジシクロヘキシルカルボジイミドを
加え室温で２４時間放置する。この溶液に冷ベンゼンを
加え、更に石油エーテルを加えて活性化ＰＥＧ（スクシ
ニミジルスクシネート―ＰＥＧ）を沈殿させ回収する。
剤とするＰＥＧ―ｈＡＰＣの一例 ＰＥＧ１モルに対して５〜１０モルの無水コハク酸をピ
リジンを含むジクロロエタン中でＮ2 ガスを通しながら
３日間反応させた後、得られたＰＥＧ―コハク酸にＮ―
ヒドロキシスクシンイミドを加え、ジメチルホルムアミ
ド中で反応させた。ジシクロヘキシルカルボジイミドを
加え室温で２４時間放置する。この溶液に冷ベンゼンを
加え、更に石油エーテルを加えて活性化ＰＥＧ（スクシ
ニミジルスクシネート―ＰＥＧ）を沈殿させ回収する。
【００２３】上記活性化ＰＥＧをｈＡＰＣの１モルに対
し１〜３０倍モル添加し、緩衝液中で反応させてＰＥＧ
―ｈＡＰＣを得る。
し１〜３０倍モル添加し、緩衝液中で反応させてＰＥＧ
―ｈＡＰＣを得る。
【００２４】（３）ｐ―ニトロフェニルホルメートを添
加剤とするＰＥＧ―ｈＡＰＣの一例 ＰＥＧ１モルに対して１〜５モルのｐ―ニトロフェニル
クロロホルメートをトリエチルアミンを含むアセトニト
リル中で攪拌しながら反応させて活性化ＰＥＧ（ｐ―ニ
トロフェニルホルメート―ＰＥＧ）を得る。
加剤とするＰＥＧ―ｈＡＰＣの一例 ＰＥＧ１モルに対して１〜５モルのｐ―ニトロフェニル
クロロホルメートをトリエチルアミンを含むアセトニト
リル中で攪拌しながら反応させて活性化ＰＥＧ（ｐ―ニ
トロフェニルホルメート―ＰＥＧ）を得る。
【００２５】活性化ＰＥＧをｈＡＰＣの１モルに対し１
〜３０倍モル添加し、緩衝液中で反応させてＰＥＧ―ｈ
ＡＰＣを得る。
〜３０倍モル添加し、緩衝液中で反応させてＰＥＧ―ｈ
ＡＰＣを得る。
【００２６】なお、上記調製法は炭素数１〜３のｏ―ア
ルコキシＰＥＧを用いても同様に実施することが可能で
ある。
ルコキシＰＥＧを用いても同様に実施することが可能で
ある。
【００２７】上記のように調製したＰＥＧ―ｈＡＰＣに
はｈＡＰＣ１分子当たり２〜２０分子程度のＰＥＧが結
合しており、酵素活性は修飾前のｈＡＰＣの約８〜４０
％程度まで減少する。酵素活性及びＰＥＧ修飾率は以下
のように測定した。
はｈＡＰＣ１分子当たり２〜２０分子程度のＰＥＧが結
合しており、酵素活性は修飾前のｈＡＰＣの約８〜４０
％程度まで減少する。酵素活性及びＰＥＧ修飾率は以下
のように測定した。
【００２８】ＡＰＣの活性測定 ＡＰＣの活性はＡＰＴＴの延長で評価した。手順は以下
のとおりである。 １．ｈＡＰＣ溶液（０〜８００ｎｇ／ｍｌ）１００μｌ
とヒト血漿［サイトロール・Ｉ（バクスター社製）］１
００μｌを混合し、３７℃で１分間インキュベーション
する。 ２．ＡＰＴＴ試薬［データーファイ（バクスター社
製）］１００μｌを更に添加し、３７℃で２分間インキ
ュベーションする。 ３．予め加温した２５ｍＭ ＣａＣｌ2 １００μｌを
加え、凝固時間をクロテックII（バクスター社製）を用
いて測定する。
のとおりである。 １．ｈＡＰＣ溶液（０〜８００ｎｇ／ｍｌ）１００μｌ
とヒト血漿［サイトロール・Ｉ（バクスター社製）］１
００μｌを混合し、３７℃で１分間インキュベーション
する。 ２．ＡＰＴＴ試薬［データーファイ（バクスター社
製）］１００μｌを更に添加し、３７℃で２分間インキ
ュベーションする。 ３．予め加温した２５ｍＭ ＣａＣｌ2 １００μｌを
加え、凝固時間をクロテックII（バクスター社製）を用
いて測定する。
【００２９】ＰＥＧ修飾率は遊離アミノ基をフルオレス
カミンで定量することにより確認した。
カミンで定量することにより確認した。
【００３０】フルオレスカミンによるアミノ基の定量 タンパク質濃度を測定したＰＥＧ―ｈＡＰＣに１００ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて全量を１．５ｍ
ｌとし、更に０．０３％フルオレスカミン―アセトン溶
液５００μｌ添加し、蛍光強度を測定する（励起波長３
９５ｎｍ、蛍光波長４７０ｎｍ）。予め濃度既知の未修
飾ｈＡＰＣを用いて作成した検量線を用いてＰＥＧ―ｈ
ＡＰＣのアミノ基の定量を行う。
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて全量を１．５ｍ
ｌとし、更に０．０３％フルオレスカミン―アセトン溶
液５００μｌ添加し、蛍光強度を測定する（励起波長３
９５ｎｍ、蛍光波長４７０ｎｍ）。予め濃度既知の未修
飾ｈＡＰＣを用いて作成した検量線を用いてＰＥＧ―ｈ
ＡＰＣのアミノ基の定量を行う。
【００３１】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。
に説明する。
【００３２】［実施例１］モノメトキシＰＥＧ（平均分
子量５０００）４０ｇをベンゼン２００ｍｌ、無水炭酸
ナトリウム２０ｇ、モレキュラーシーブ３Ａ（和光純薬
工業社製）１０ｇからなる混合液に塩化シアヌル７３０
ｍｇを加え８０℃、２０時間攪拌しながら反応させた。
反応後、反応混液をセファデックスＧ―１００カラム
（１．２×８８．５ｃｍ）（ファルマシア社製）による
ゲル濾過で活性化ＰＥＧ2 （６―クロロ―ｓ―トリアジ
ン―ＰＥＧ2 ）を精製し、更に石油エーテル４００ｍｌ
を加えて沈殿せしめた。その沈殿物はデシケーター中で
減圧下で乾燥させた。
子量５０００）４０ｇをベンゼン２００ｍｌ、無水炭酸
ナトリウム２０ｇ、モレキュラーシーブ３Ａ（和光純薬
工業社製）１０ｇからなる混合液に塩化シアヌル７３０
ｍｇを加え８０℃、２０時間攪拌しながら反応させた。
反応後、反応混液をセファデックスＧ―１００カラム
（１．２×８８．５ｃｍ）（ファルマシア社製）による
ゲル濾過で活性化ＰＥＧ2 （６―クロロ―ｓ―トリアジ
ン―ＰＥＧ2 ）を精製し、更に石油エーテル４００ｍｌ
を加えて沈殿せしめた。その沈殿物はデシケーター中で
減圧下で乾燥させた。
【００３３】ヒト血漿由来のｈＡＰＣ（ヒト血漿から精
製したＰＣをトロンビンで活性化して得たｈＡＰＣ）２
０ｍｇに対し１０倍のモル比になるように、上記で得ら
れた活性化ＰＥＧ2 ８００ｍｇを加え、１００ｍＭホウ
酸緩衝液（ｐＨ９．０）の１０ｍｌ中で４℃、２０時間
反応させた後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
を６０ｍｌ加え反応を停止させ、限外濾過［アミコン社
製（米国）膜ＹＭ−３０］で未反応の活性化ＰＥＧ2 誘
導体及びその加水分解物を除去し、濃縮液２ｍｌをＴＳ
Ｋ―ＧＥＬ３０００ＳＷ（東ソー社製）カラム（２１．
５×３００ｍｍ）のゲル濾過によって精製し、ＰＥＧ―
ｈＡＰＣ約２０ｍｇを得た。修飾率約１５％、酵素活性
が未修飾のＡＰＣの約８％のＰＥＧ―ｈＡＰＣ１５ｍｇ
を得た。
製したＰＣをトロンビンで活性化して得たｈＡＰＣ）２
０ｍｇに対し１０倍のモル比になるように、上記で得ら
れた活性化ＰＥＧ2 ８００ｍｇを加え、１００ｍＭホウ
酸緩衝液（ｐＨ９．０）の１０ｍｌ中で４℃、２０時間
反応させた後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
を６０ｍｌ加え反応を停止させ、限外濾過［アミコン社
製（米国）膜ＹＭ−３０］で未反応の活性化ＰＥＧ2 誘
導体及びその加水分解物を除去し、濃縮液２ｍｌをＴＳ
Ｋ―ＧＥＬ３０００ＳＷ（東ソー社製）カラム（２１．
５×３００ｍｍ）のゲル濾過によって精製し、ＰＥＧ―
ｈＡＰＣ約２０ｍｇを得た。修飾率約１５％、酵素活性
が未修飾のＡＰＣの約８％のＰＥＧ―ｈＡＰＣ１５ｍｇ
を得た。
【００３４】［実施例２］モノメトキシＰＥＧ（平均分
子量５０００）５０ｇ、ピリジン４ｍｌ、１，２―ジク
ロロエタン２５０ｍｌからなる混合液に無水コハク酸５
ｇを加えＮ2 ガスを通しながら３日間還流させた。反応
後、濾過し、溶媒をエバポレートして得られた沈殿を水
１００ｍｌに溶解した後、ジエチルエーテル５０ｍｌで
２回洗浄した。ＰＥＧ―コハク酸を抽出するためにクロ
ロホルム５０ｍｌを水相に加えた。この操作を２回繰り
返した後、クロロホルムをエバポレートしてＰＥＧ―コ
ハク酸４３ｇを得た。上記で得られたＰＥＧ―コハク酸
をジメチルホルムアミド２００ｍｌに溶解し、更に大過
剰のＮ―ヒドロキシスクシンイミドを加えた後、０℃に
冷却した（ＰＥＧ―コハク酸溶液）。Ｎ―ヒドロキシス
クシンイミドと同モルのジシクロヘキシルカルボジイミ
ドをジメチルホルムアミド１０ｍｌに溶解し、この溶液
を上記のＰＥＧ―コハク酸溶液を攪拌しながら滴下して
加え、室温で２４時間放置した。この溶液に冷ベンゼン
１００ｍｌを加え、更に石油エーテル２００ｍｌを滴下
することにより活性化ＰＥＧ（スクシニミジルスクシネ
ート―ＰＥＧ）を沈殿せしめ、その沈殿はガラスフィル
ターで濾過することにより回収した。活性化ＰＥＧは−
２０℃、デシケーター中で保存した。
子量５０００）５０ｇ、ピリジン４ｍｌ、１，２―ジク
ロロエタン２５０ｍｌからなる混合液に無水コハク酸５
ｇを加えＮ2 ガスを通しながら３日間還流させた。反応
後、濾過し、溶媒をエバポレートして得られた沈殿を水
１００ｍｌに溶解した後、ジエチルエーテル５０ｍｌで
２回洗浄した。ＰＥＧ―コハク酸を抽出するためにクロ
ロホルム５０ｍｌを水相に加えた。この操作を２回繰り
返した後、クロロホルムをエバポレートしてＰＥＧ―コ
ハク酸４３ｇを得た。上記で得られたＰＥＧ―コハク酸
をジメチルホルムアミド２００ｍｌに溶解し、更に大過
剰のＮ―ヒドロキシスクシンイミドを加えた後、０℃に
冷却した（ＰＥＧ―コハク酸溶液）。Ｎ―ヒドロキシス
クシンイミドと同モルのジシクロヘキシルカルボジイミ
ドをジメチルホルムアミド１０ｍｌに溶解し、この溶液
を上記のＰＥＧ―コハク酸溶液を攪拌しながら滴下して
加え、室温で２４時間放置した。この溶液に冷ベンゼン
１００ｍｌを加え、更に石油エーテル２００ｍｌを滴下
することにより活性化ＰＥＧ（スクシニミジルスクシネ
ート―ＰＥＧ）を沈殿せしめ、その沈殿はガラスフィル
ターで濾過することにより回収した。活性化ＰＥＧは−
２０℃、デシケーター中で保存した。
【００３５】ＷＯ９２／１３０７９号明細書の実施例１
および２に記載の方法（２９３細胞／ＴＺｍ５―９００
２）で得られたｈＰＣを同じく実施例４に記載された方
法で精製、活性化したｈＡＰＣ２５ｍｇに対し、４倍の
モル比になるように上記で得られた活性化ＰＥＧ１９５
ｍｇを加え、１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）の
２５ｍｌ中で４℃、２０時間反応させた後、ε―アミノ
カプロン酸６４ｍｇを添加して反応を停止させた。反応
混液は限外濾過膜［アミコン社製（米国）膜ＹＭ―３
０］で濾過して未反応のＰＥＧを除去した後、ＴＳＫ―
ＧＥＬ３０００ＳＷ（東ソー社製）カラム（２１．５×
３００ｍｍ）のゲル濾過によってＰＥＧ―ｈＡＰＣを精
製した。修飾率約１４％（ｈＡＰＣ１分子に対して約３
分子のＰＥＧが結合）、酵素活性が未修飾のＡＰＣの約
１１％のＰＥＧ―ｈＡＰＣ１０ｍｇを得た。
および２に記載の方法（２９３細胞／ＴＺｍ５―９００
２）で得られたｈＰＣを同じく実施例４に記載された方
法で精製、活性化したｈＡＰＣ２５ｍｇに対し、４倍の
モル比になるように上記で得られた活性化ＰＥＧ１９５
ｍｇを加え、１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）の
２５ｍｌ中で４℃、２０時間反応させた後、ε―アミノ
カプロン酸６４ｍｇを添加して反応を停止させた。反応
混液は限外濾過膜［アミコン社製（米国）膜ＹＭ―３
０］で濾過して未反応のＰＥＧを除去した後、ＴＳＫ―
ＧＥＬ３０００ＳＷ（東ソー社製）カラム（２１．５×
３００ｍｍ）のゲル濾過によってＰＥＧ―ｈＡＰＣを精
製した。修飾率約１４％（ｈＡＰＣ１分子に対して約３
分子のＰＥＧが結合）、酵素活性が未修飾のＡＰＣの約
１１％のＰＥＧ―ｈＡＰＣ１０ｍｇを得た。
【００３６】［実施例３］ ＰＥＧ―ｈＡＰＣの製造 モノメトキシＰＥＧ（平均分子量５０００）１２．５ｇ
をアセトニトリル５０ｍｌ、ｐ―ニトロフェニルクロロ
ホルメート（和光純薬工業社製）２９０ｍｇからなる混
合液にを加え、４℃、２４時間攪拌しながら反応させ
た。反応後、沈殿した塩化トリエチルアンモニウムを濾
過し、濾過後の溶液にエチルエーテル５００ｍｌを加
え、４℃で一晩放置して活性化ＰＥＧを結晶化させた。
得られた結晶を濾過、エチルエーテルで洗浄した後、そ
の結晶（ｐ―ニトロフェニルホルメート―ＰＥＧ）をア
セトニトリル―エーテル中で再結晶させた。
をアセトニトリル５０ｍｌ、ｐ―ニトロフェニルクロロ
ホルメート（和光純薬工業社製）２９０ｍｇからなる混
合液にを加え、４℃、２４時間攪拌しながら反応させ
た。反応後、沈殿した塩化トリエチルアンモニウムを濾
過し、濾過後の溶液にエチルエーテル５００ｍｌを加
え、４℃で一晩放置して活性化ＰＥＧを結晶化させた。
得られた結晶を濾過、エチルエーテルで洗浄した後、そ
の結晶（ｐ―ニトロフェニルホルメート―ＰＥＧ）をア
セトニトリル―エーテル中で再結晶させた。
【００３７】ヒト血漿由来のｈＡＰＣ１０ｍｇに対し、
上記で得られた活性化ＰＥＧ１９５ｍｇを加え、１００
ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ８．０）１０ｍｌ中で４
℃、４時間反応させた後、ε―アミノカプロン酸２６ｍ
ｇを添加して反応を停止させた。その後、限外濾過［ア
ミコン社製（米国）膜ＹＭ−３０］で未反応のＰＥＧを
除去し、濃縮液１．０ｍｌをＴＳＫ―ＧＥＬ３０００Ｓ
Ｗ（東ソー社製）カラム（２１．５×３００ｍｍ）のゲ
ル濾過によって精製し、ＰＥＧ―ｈＡＰＣ約６ｍｇを得
た。修飾率約２２％、酵素活性が未修飾のＡＰＣの約１
６％のＰＥＧ―ｈＡＰＣ１５ｍｇを得た。
上記で得られた活性化ＰＥＧ１９５ｍｇを加え、１００
ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ８．０）１０ｍｌ中で４
℃、４時間反応させた後、ε―アミノカプロン酸２６ｍ
ｇを添加して反応を停止させた。その後、限外濾過［ア
ミコン社製（米国）膜ＹＭ−３０］で未反応のＰＥＧを
除去し、濃縮液１．０ｍｌをＴＳＫ―ＧＥＬ３０００Ｓ
Ｗ（東ソー社製）カラム（２１．５×３００ｍｍ）のゲ
ル濾過によって精製し、ＰＥＧ―ｈＡＰＣ約６ｍｇを得
た。修飾率約２２％、酵素活性が未修飾のＡＰＣの約１
６％のＰＥＧ―ｈＡＰＣ１５ｍｇを得た。
【００３８】実施例１から３で得られたＰＥＧ―ｈＡＰ
ＣのＰＥＧ修飾率と酵素活性を表１に示す。
ＣのＰＥＧ修飾率と酵素活性を表１に示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】［実施例４］実施例１と同様にして、分子
量の異なるＰＥＧ（平均分子量１０００、２０００また
は５０００）を用い、それぞれの活性化ＰＥＧを調製し
これらをそれぞれ実施例１で用いたのと同様のｈＡＰＣ
に対し１０倍のモル比になるようにｈＡＰＣと反応さ
せ、実施例１と同様の方法でそれぞれのＰＥＧ―ｈＡＰ
Ｃを調製した。得られたＰＥＧ―ｈＡＰＣの修飾率と酵
素活性（ＡＰＴＴ）を測定した。これらの結果を表２に
示す。
量の異なるＰＥＧ（平均分子量１０００、２０００また
は５０００）を用い、それぞれの活性化ＰＥＧを調製し
これらをそれぞれ実施例１で用いたのと同様のｈＡＰＣ
に対し１０倍のモル比になるようにｈＡＰＣと反応さ
せ、実施例１と同様の方法でそれぞれのＰＥＧ―ｈＡＰ
Ｃを調製した。得られたＰＥＧ―ｈＡＰＣの修飾率と酵
素活性（ＡＰＴＴ）を測定した。これらの結果を表２に
示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】
【参考実験１】カルボキシル基が修飾されたＰＥＧ―ｈＡＰＣ ｈＡＰＣ分子中のグルタミン酸残基あるいはアスパラギ
ン酸残基のカルボキシル基をＰＥＧで修飾する方法とし
てはカルボキシル基にプトレスシン等のジアミン化合物
を反応させてアミノ基を導入し、このアミノ基をＰＥＧ
で修飾する。以下にその調製法を記す。
ン酸残基のカルボキシル基をＰＥＧで修飾する方法とし
てはカルボキシル基にプトレスシン等のジアミン化合物
を反応させてアミノ基を導入し、このアミノ基をＰＥＧ
で修飾する。以下にその調製法を記す。
【００４３】ヒト血漿由来のｈＡＰＣ１００ｍｇに対し
２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）３０
ｍｌ、プトレスシン（和光純薬工業社製）２５０ｍｇ、
カルボジイミド・ＨＣｌ（同仁化学研究所社製）３００
ｍｇからなる混合液を加え４℃、１２時間攪拌しながら
反応させた。反応後、未反応のプトレスシン及びカルボ
ジイミド・ＨＣｌを除去するために、セファデックスＧ
―２５［ファルマシア社製（スエーデン）］のカラム
（４５×６００ｍｍ）でゲル濾過を行った後、得られた
ｖｏｉｄフラクション（ｈＡＰＣ―プトレスシン）を凍
結乾燥した。
２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）３０
ｍｌ、プトレスシン（和光純薬工業社製）２５０ｍｇ、
カルボジイミド・ＨＣｌ（同仁化学研究所社製）３００
ｍｇからなる混合液を加え４℃、１２時間攪拌しながら
反応させた。反応後、未反応のプトレスシン及びカルボ
ジイミド・ＨＣｌを除去するために、セファデックスＧ
―２５［ファルマシア社製（スエーデン）］のカラム
（４５×６００ｍｍ）でゲル濾過を行った後、得られた
ｖｏｉｄフラクション（ｈＡＰＣ―プトレスシン）を凍
結乾燥した。
【００４４】上記で得られたｈＡＰＣ―プトレスシン３
０ｍｇに対し実施例２で得られた活性化ＰＥＧ５８０ｍ
ｇを加え、１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）３０
ｍｌ中で４℃、一晩反応させた後、１００ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）を１８０ｍｌ加え反応を停止させ、
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、４℃で２４時
間透析した。透析後、限外濾過［アミコン社製（米国）
膜ＹＭ−３０］で未反応のＰＥＧを除去し、ＰＥＧ―ｈ
ＡＰＣとして約２０ｍｇを得た。得られたＰＥＧ―ｈＡ
ＰＣの酵素活性を測定したところ、活性は消失してい
た。
０ｍｇに対し実施例２で得られた活性化ＰＥＧ５８０ｍ
ｇを加え、１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）３０
ｍｌ中で４℃、一晩反応させた後、１００ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）を１８０ｍｌ加え反応を停止させ、
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、４℃で２４時
間透析した。透析後、限外濾過［アミコン社製（米国）
膜ＹＭ−３０］で未反応のＰＥＧを除去し、ＰＥＧ―ｈ
ＡＰＣとして約２０ｍｇを得た。得られたＰＥＧ―ｈＡ
ＰＣの酵素活性を測定したところ、活性は消失してい
た。
【００４５】ｈＡＰＣ分子中のアミノ基を修飾した実施
例２では修飾後においても酵素活性は保持されていたが
カルボキシル基を修飾すると酵素活性は消失した。
例２では修飾後においても酵素活性は保持されていたが
カルボキシル基を修飾すると酵素活性は消失した。
【００４６】
【参考実験２】４，６―クロロ―ｓ―トリアジン―ＰＥＧ（活性ＰＥＧ
1 誘導体）で修飾されたＰＥＧ―ｈＡＰＣ 実施例１と同様の方法で４，６―クロロ―ｓ―トリアジ
ン―ＰＥＧ（活性ＰＥＧ1 ）を精製した。
1 誘導体）で修飾されたＰＥＧ―ｈＡＰＣ 実施例１と同様の方法で４，６―クロロ―ｓ―トリアジ
ン―ＰＥＧ（活性ＰＥＧ1 ）を精製した。
【００４７】実施例１に記載のｈＡＰＣ１ｍｇに対し２
及び４倍のモル比になるように、上記で得られた活性化
ＰＥＧ1 を各々４、８ｍｇを加え、１００ｍＭホウ酸緩
衝液（ｐＨ９．０）の１ｍｌ中で４℃、２０時間反応さ
せた後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を４ｍ
ｌ加え反応を停止させ、限外濾過［アミコン社製（米
国）膜ＹＭ−３０］で未反応のＰＥＧを除去し、濃縮液
０．５ｍｌをＴＳＫ―ＧＥＬ３０００ＳＷ（東ソー社
製）カラム（２１．５×３００ｍｍ）のゲル濾過によっ
て精製し、ＰＥＧ―ｈＡＰＣ各々約０．８ｍｇを得た。
得られたＰＥＧ―ｈＡＰＣの修飾率と酵素活性を表３に
示す。
及び４倍のモル比になるように、上記で得られた活性化
ＰＥＧ1 を各々４、８ｍｇを加え、１００ｍＭホウ酸緩
衝液（ｐＨ９．０）の１ｍｌ中で４℃、２０時間反応さ
せた後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を４ｍ
ｌ加え反応を停止させ、限外濾過［アミコン社製（米
国）膜ＹＭ−３０］で未反応のＰＥＧを除去し、濃縮液
０．５ｍｌをＴＳＫ―ＧＥＬ３０００ＳＷ（東ソー社
製）カラム（２１．５×３００ｍｍ）のゲル濾過によっ
て精製し、ＰＥＧ―ｈＡＰＣ各々約０．８ｍｇを得た。
得られたＰＥＧ―ｈＡＰＣの修飾率と酵素活性を表３に
示す。
【００４８】
【表３】
【００４９】蛋白質との結合部位が１カ所しか存在せ
ず、ｈＡＰＣ分子間の架橋反応が生じない架橋剤である
６―クロロ―ｓ―トリアジンを用いたＰＥＧ修飾（実施
例１）では修飾後の酵素活性は保持されていたが、本参
考実験を示した蛋白質との結合部位が２カ所存在する
４，６―クロロ―ｓ―トリアジンを架橋剤として用いる
とｈＡＰＣ分子間で架橋反応が生じるため酵素活性が著
しく低下した。
ず、ｈＡＰＣ分子間の架橋反応が生じない架橋剤である
６―クロロ―ｓ―トリアジンを用いたＰＥＧ修飾（実施
例１）では修飾後の酵素活性は保持されていたが、本参
考実験を示した蛋白質との結合部位が２カ所存在する
４，６―クロロ―ｓ―トリアジンを架橋剤として用いる
とｈＡＰＣ分子間で架橋反応が生じるため酵素活性が著
しく低下した。
【００５０】
【試験例１】ＰＥＧ―ｈＡＰＣの血中半減期 実施例３と同様にして調製したＰＥＧ―ｈＡＰＣまたは
ｈＡＰＣをラットに静脈内投与（ｈＡＰＣとして１００
μｇ／ｋｇ）した後、経時的に尾静脈から採血した。血
液を遠心分離して得られた血漿のＡＰＴＴを測定するこ
とにより血中半減期を求めた。結果を表４に示す。ＰＥ
Ｇ修飾により血中半減期の有意な延長効果が見られた。
ｈＡＰＣをラットに静脈内投与（ｈＡＰＣとして１００
μｇ／ｋｇ）した後、経時的に尾静脈から採血した。血
液を遠心分離して得られた血漿のＡＰＴＴを測定するこ
とにより血中半減期を求めた。結果を表４に示す。ＰＥ
Ｇ修飾により血中半減期の有意な延長効果が見られた。
【００５１】
【表４】
Claims (3)
- 【請求項１】 分子中の少なくとも１個のアミノ基が架
橋剤を介してポリエチレングリコールで修飾されたヒト
活性化プロテインＣ誘導体。 - 【請求項２】 該架橋剤によってヒト活性化プロテイン
Ｃが分子間で架橋されていない請求項１記載のヒト活性
化プロテインＣ誘導体。 - 【請求項３】 該架橋が下式［Ｉ］―［III ］で表され
る化合物からなる群より選ばれる化合物により達成され
る請求項１記載のヒト活性化プロテインＣ誘導体。 【化１】 ［但し、式中、Ｒ1 はＣ1 〜Ｃ3 アルキル基を表わし、
ｎは２０〜５００の整数を表わす。］
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6235035A JPH0892294A (ja) | 1994-09-29 | 1994-09-29 | ヒト活性化プロテインｃ誘導体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6235035A JPH0892294A (ja) | 1994-09-29 | 1994-09-29 | ヒト活性化プロテインｃ誘導体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0892294A true JPH0892294A (ja) | 1996-04-09 |
Family
ID=16980127
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6235035A Pending JPH0892294A (ja) | 1994-09-29 | 1994-09-29 | ヒト活性化プロテインｃ誘導体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0892294A (ja) |
Cited By (7)
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| US6423826B1 (en) | 2000-06-30 | 2002-07-23 | Regents Of The University Of Minnesota | High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides |
| US6933367B2 (en) | 2000-10-18 | 2005-08-23 | Maxygen Aps | Protein C or activated protein C-like molecules |
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| WO2013156488A3 (en) * | 2012-04-16 | 2014-01-16 | Leverton Licence Holdings Limited | Optimised subcutaneous therapeutic agents |
| US8632771B2 (en) | 2000-06-30 | 2014-01-21 | Regents Of The University Of Minnesota | High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides |
-
1994
- 1994-09-29 JP JP6235035A patent/JPH0892294A/ja active Pending
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| WO2002032461A3 (en) * | 2000-10-18 | 2002-09-26 | Maxygen Aps | Protein c or activated protein c-like molecules |
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