JPH0892294A - ヒト活性化プロテインc誘導体 - Google Patents
ヒト活性化プロテインc誘導体Info
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- JPH0892294A JPH0892294A JP6235035A JP23503594A JPH0892294A JP H0892294 A JPH0892294 A JP H0892294A JP 6235035 A JP6235035 A JP 6235035A JP 23503594 A JP23503594 A JP 23503594A JP H0892294 A JPH0892294 A JP H0892294A
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ヒト活性化プロテインCのポリエチレングリ
コール修飾体の提供 【構成】 ポリエチレングリコールを結合した特定の1
官能性架橋剤を反応させることにより得られる、ヒト活
性化プロテインCのアミノ基をポリエチレングリコール
で修飾したヒト活性化プロテインC誘導体。
コール修飾体の提供 【構成】 ポリエチレングリコールを結合した特定の1
官能性架橋剤を反応させることにより得られる、ヒト活
性化プロテインCのアミノ基をポリエチレングリコール
で修飾したヒト活性化プロテインC誘導体。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、ポリエチレングリコー
ル(以下、PEGと省略する)で修飾されたヒト活性化
プロテインC(以下、hAPCと省略する)の誘導体に
関する。更に詳しくはボーラス静注投与可能な血中半減
期が延長されたPEGで修飾されたhAPC誘導体に関
する。
ル(以下、PEGと省略する)で修飾されたヒト活性化
プロテインC(以下、hAPCと省略する)の誘導体に
関する。更に詳しくはボーラス静注投与可能な血中半減
期が延長されたPEGで修飾されたhAPC誘導体に関
する。
【0002】
【従来の技術】hAPCは血液凝固カスケードに関与す
る活性化第V因子(F.Va)および活性化第VIII因子
(F.VIIIa)、線溶系の制御因子プラスミノーゲン・
アクチベーター・インヒビター(PAI)を選択的に阻
害することにより抗血液凝固作用を発現し、現在汎発生
血管内凝固症候群(DIC)の治療薬として臨床試験が
行われている血漿蛋白質の一つである。
る活性化第V因子(F.Va)および活性化第VIII因子
(F.VIIIa)、線溶系の制御因子プラスミノーゲン・
アクチベーター・インヒビター(PAI)を選択的に阻
害することにより抗血液凝固作用を発現し、現在汎発生
血管内凝固症候群(DIC)の治療薬として臨床試験が
行われている血漿蛋白質の一つである。
【0003】現在使用されているhAPCはヒト血漿か
ら精製したプロテインCを酵素、例えばトロンビンで活
性化したもの(J. Clin. Invest., 761−769,1
979.参照)、遺伝子組み換え法により直接又はPC
を経由して得られたhAPC(WO90/13079号
明細書参照)であり、その誘導体については活性部位が
アシル基で修飾された誘導体(日本公表特許公報 昭6
0―501859号参照)以外に報告されていない。
ら精製したプロテインCを酵素、例えばトロンビンで活
性化したもの(J. Clin. Invest., 761−769,1
979.参照)、遺伝子組み換え法により直接又はPC
を経由して得られたhAPC(WO90/13079号
明細書参照)であり、その誘導体については活性部位が
アシル基で修飾された誘導体(日本公表特許公報 昭6
0―501859号参照)以外に報告されていない。
【0004】一方、L―アスパラギナーゼをPEGで修
飾することが報告されて以来(Chemistry Letters,77
3−776,1980.参照)、数多くの蛋白質につい
てPEG修飾が試みられている。このPEG修飾は通常
血中半減期の延長、異種蛋白質の場合には免疫原性の消
失、抗体産生の抑制等を目的として実施され、既にアデ
ノシンデアミナーゼではPEG修飾体が米国で商品化さ
れている(N. Engl. J.Med.,316,586−596,
1987.参照)。しかし、hAPCについてはPEG
で修飾された例は報告されていない。
飾することが報告されて以来(Chemistry Letters,77
3−776,1980.参照)、数多くの蛋白質につい
てPEG修飾が試みられている。このPEG修飾は通常
血中半減期の延長、異種蛋白質の場合には免疫原性の消
失、抗体産生の抑制等を目的として実施され、既にアデ
ノシンデアミナーゼではPEG修飾体が米国で商品化さ
れている(N. Engl. J.Med.,316,586−596,
1987.参照)。しかし、hAPCについてはPEG
で修飾された例は報告されていない。
【0005】
【発明が解決しようとする問題点】hAPCは血管内に
投与されると速やかに血漿中の特異的インヒビター(プ
ロテインCインヒビター、α1 ―アンチトリプシン)と
複合体を形成して阻害されるため、活性半減期が短く
(約20分)、24時間の点滴静注により投与されてい
る。hAPCはその優れた抗血液凝固作用によりDIC
以外の血栓症、例えば脳梗塞、心筋梗塞などへの適応拡
大が考えられているが、急性期における治療では点滴静
注による投与が可能であるものの、症状が安定した慢性
期においてはより簡便なボーラス静注投与が望ましく、
その際血中半減期が短いことは欠点となり半減期の延長
化が望まれている。
投与されると速やかに血漿中の特異的インヒビター(プ
ロテインCインヒビター、α1 ―アンチトリプシン)と
複合体を形成して阻害されるため、活性半減期が短く
(約20分)、24時間の点滴静注により投与されてい
る。hAPCはその優れた抗血液凝固作用によりDIC
以外の血栓症、例えば脳梗塞、心筋梗塞などへの適応拡
大が考えられているが、急性期における治療では点滴静
注による投与が可能であるものの、症状が安定した慢性
期においてはより簡便なボーラス静注投与が望ましく、
その際血中半減期が短いことは欠点となり半減期の延長
化が望まれている。
【0006】
【問題を解決するための手段】本発明者らは上記の問題
点を解決すべく検討し、DNAの塩基配列に特異的な
変異導入法を用いてhAPCの構造変異体とする方法、
hAPCをリポソーム内に保護した組成物とする方
法、高分子修飾する方法、等を考慮した。その結果、
に関しては、変異導入蛋白自体の抗原性が懸念される
こと、に関してはリポソーム自体の安定性の問題、h
APCがリポソーム内で高濃度になることによる自己分
解の可能性、等の問題が考えられた。の高分子による
修飾はhAPCの様にインヒビターとの複合体形成が不
活性化の原因である場合には、酵素活性を保持した状態
でかつインヒビターと複合体を形成しない酵素を得るこ
とができる有効な手段であると考えられた。また、修飾
に伴う構造変化のため自己分解の抑制も期待できた。
点を解決すべく検討し、DNAの塩基配列に特異的な
変異導入法を用いてhAPCの構造変異体とする方法、
hAPCをリポソーム内に保護した組成物とする方
法、高分子修飾する方法、等を考慮した。その結果、
に関しては、変異導入蛋白自体の抗原性が懸念される
こと、に関してはリポソーム自体の安定性の問題、h
APCがリポソーム内で高濃度になることによる自己分
解の可能性、等の問題が考えられた。の高分子による
修飾はhAPCの様にインヒビターとの複合体形成が不
活性化の原因である場合には、酵素活性を保持した状態
でかつインヒビターと複合体を形成しない酵素を得るこ
とができる有効な手段であると考えられた。また、修飾
に伴う構造変化のため自己分解の抑制も期待できた。
【0007】蛋白質の高分子修飾に用いられる高分子と
してはデキストラン、PEG、等が用いられている。こ
れらを比較した場合、デキストランは分岐鎖構造が抗原
決定部位となり、抗体産生を引き起こしうるが、PEG
は免疫原性、毒性を持たず、またポリペプチド鎖に対し
て物理的な立体障害以外の相互作用を与えない高分子で
あることが知られており、より有用であると考えられ
た。
してはデキストラン、PEG、等が用いられている。こ
れらを比較した場合、デキストランは分岐鎖構造が抗原
決定部位となり、抗体産生を引き起こしうるが、PEG
は免疫原性、毒性を持たず、またポリペプチド鎖に対し
て物理的な立体障害以外の相互作用を与えない高分子で
あることが知られており、より有用であると考えられ
た。
【0008】そこで、本発明者らはhAPCに対するP
EG修飾を鋭意研究した結果、以下のa)及びb)に挙
げる特定の修飾方法によってのみ所望の目的を達成しう
ることを見出し、本発明に到達したものである。
EG修飾を鋭意研究した結果、以下のa)及びb)に挙
げる特定の修飾方法によってのみ所望の目的を達成しう
ることを見出し、本発明に到達したものである。
【0009】一般的に、a)PEGで修飾される蛋白分
子中の官能基としてはリジンのε―アミノ基、アミノ末
端のアミノ基、及びグルタミン酸、アスパラギン酸のカ
ルボキシル基が挙げられる。hAPCの場合にはカルボ
キシル基を修飾すると活性の完全な消失がみられたが、
アミノ基への修飾はhAPCの活性が保持されることを
見いだした。おそらく、カルボキシル基は酵素活性の発
現に必須な官能基であると考えられる(参考実験1参
照)。
子中の官能基としてはリジンのε―アミノ基、アミノ末
端のアミノ基、及びグルタミン酸、アスパラギン酸のカ
ルボキシル基が挙げられる。hAPCの場合にはカルボ
キシル基を修飾すると活性の完全な消失がみられたが、
アミノ基への修飾はhAPCの活性が保持されることを
見いだした。おそらく、カルボキシル基は酵素活性の発
現に必須な官能基であると考えられる(参考実験1参
照)。
【0010】b)更に、架橋剤が2カ所以上でhAPC
と結合するとhAPCの分子間に架橋反応が生じ酵素活
性が著しく低下することを見い出した。従って、架橋剤
としては分子間の架橋反応が生じない、修飾されるhA
PCとの結合部位が1カ所である構造を有するものが好
ましいことが証明された(参考実験2参照)。
と結合するとhAPCの分子間に架橋反応が生じ酵素活
性が著しく低下することを見い出した。従って、架橋剤
としては分子間の架橋反応が生じない、修飾されるhA
PCとの結合部位が1カ所である構造を有するものが好
ましいことが証明された(参考実験2参照)。
【0011】しかして本発明は、分子中の少なくとも1
個のアミノ基が架橋剤を介してPEGで修飾されたhA
PC誘導体である。
個のアミノ基が架橋剤を介してPEGで修飾されたhA
PC誘導体である。
【0012】本発明で用いられるhAPCとしては、前
記した如くヒト血漿から精製したプロテインCを活性化
して得られるもの(J. Clin. Invest., 761−76
9,1979.参照)、遺伝子組み換え法により直接又
はPCを経由して得られたhAPC(WO90/130
79号明細書参照)が挙げられる。
記した如くヒト血漿から精製したプロテインCを活性化
して得られるもの(J. Clin. Invest., 761−76
9,1979.参照)、遺伝子組み換え法により直接又
はPCを経由して得られたhAPC(WO90/130
79号明細書参照)が挙げられる。
【0013】本発明で用いられるPEGとしては平均分
子量1000以上の炭素数1〜3のo―アルコキシ(例
えば、o―メトキシ、o―エトキシ、o―n―プロポキ
シ、o―イソプロポキシなと)PEGが挙げられる。
子量1000以上の炭素数1〜3のo―アルコキシ(例
えば、o―メトキシ、o―エトキシ、o―n―プロポキ
シ、o―イソプロポキシなと)PEGが挙げられる。
【0014】また、本発明は該架橋剤によってhAPC
が分子間で架橋されていないPEGで修飾されたhAP
C誘導体である。
が分子間で架橋されていないPEGで修飾されたhAP
C誘導体である。
【0015】該架橋剤は前記アミノ基とPEGとの結合
を仲介するもので、PEGとこれら架橋剤とを予め反応
させることによって得られる活性化PEGをhAPCと
反応させることにより目的の誘導体が得られる。
を仲介するもので、PEGとこれら架橋剤とを予め反応
させることによって得られる活性化PEGをhAPCと
反応させることにより目的の誘導体が得られる。
【0016】該架橋剤としてはトリアジン、スクシニミ
ジルスクシネート、p―ニトロフェニルホルメートなど
が挙げられる。トリアジンの場合、1分子のPEGが結
合した4,6―クロロ―s―トリアジン―PEG1 と2
分子のPEGが結合した6―クロロ―s―トリアジン―
PEG2 の2種類の構造を有する活性化PEGがある。
その内、1分子のPEGが結合した4,6―クロロ―s
―トリアジン―PEG 1 ではその構造上修飾される蛋白
質との結合部位が2カ所存在するため化学修飾の結果、
蛋白質の分子間で架橋反応が生じてしまい酵素活性の著
しい低下を引き起こす。それ故、化学修飾には蛋白質と
の結合部位が1カ所しか存在せず架橋反応を引き起こさ
ない2分子のPEGが結合可能な6―クロロ―s―トリ
アジンが好ましい。
ジルスクシネート、p―ニトロフェニルホルメートなど
が挙げられる。トリアジンの場合、1分子のPEGが結
合した4,6―クロロ―s―トリアジン―PEG1 と2
分子のPEGが結合した6―クロロ―s―トリアジン―
PEG2 の2種類の構造を有する活性化PEGがある。
その内、1分子のPEGが結合した4,6―クロロ―s
―トリアジン―PEG 1 ではその構造上修飾される蛋白
質との結合部位が2カ所存在するため化学修飾の結果、
蛋白質の分子間で架橋反応が生じてしまい酵素活性の著
しい低下を引き起こす。それ故、化学修飾には蛋白質と
の結合部位が1カ所しか存在せず架橋反応を引き起こさ
ない2分子のPEGが結合可能な6―クロロ―s―トリ
アジンが好ましい。
【0017】従って、本発明に用いられる架橋剤は6―
クロロ―s―トリアジン、スクシニミジルスクシネー
ト、p―ニトロフェニルホルメートの3種であり構造式
[I]−[III ]で表される。
クロロ―s―トリアジン、スクシニミジルスクシネー
ト、p―ニトロフェニルホルメートの3種であり構造式
[I]−[III ]で表される。
【0018】反応に際しては、適当なpHの緩衝液にh
APCを溶解させた後、活性化PEGを反応させる。そ
の際、hAPCに対して添加する活性化PEGのモル比
を変化させることによりPEG修飾率をコントロールす
ることが可能である。
APCを溶解させた後、活性化PEGを反応させる。そ
の際、hAPCに対して添加する活性化PEGのモル比
を変化させることによりPEG修飾率をコントロールす
ることが可能である。
【0019】本発明のPEGで修飾された、すなわち架
橋剤を介してPEGが結合したhAPC誘導体(以下、
PEG−hAPCと省略する)は、例えば次の様にして
調製することができる。
橋剤を介してPEGが結合したhAPC誘導体(以下、
PEG−hAPCと省略する)は、例えば次の様にして
調製することができる。
【0020】(1)トリアジンを架橋剤とするPEG―
hAPCの一例 PEG1モルに対して2〜5モルの塩化シアヌルをベン
ゼンあるいはトルエン中で約50〜80℃、約15〜5
0時間反応させる。反応後の混液中には活性化PEG2
(6―クロロ―s―トリアジン―PEG2 )、及び活性
化PEG1 (4,6―クロロ―s―トリアジン―PEG
1 )が含まれているためゲル濾過によって目的の活性化
PEGを精製した後、石油エーテルを加えて活性化PE
Gを沈殿させ回収する。
hAPCの一例 PEG1モルに対して2〜5モルの塩化シアヌルをベン
ゼンあるいはトルエン中で約50〜80℃、約15〜5
0時間反応させる。反応後の混液中には活性化PEG2
(6―クロロ―s―トリアジン―PEG2 )、及び活性
化PEG1 (4,6―クロロ―s―トリアジン―PEG
1 )が含まれているためゲル濾過によって目的の活性化
PEGを精製した後、石油エーテルを加えて活性化PE
Gを沈殿させ回収する。
【0021】pH8―10に調製した緩衝液にhAPC
を0.1〜1%の濃度で溶解、上記活性化PEGをhA
PCの1モルに対し1〜30倍モル添加した後、酵素の
失活を防ぐため、例えば低温下(4〜10℃)で、0.
5〜24時間反応させる。反応後、未反応の活性化PE
G及びhAPCを除くため通常のタンパク質の精製に用
いられる方法(ゲル濾過、限外濾過、等)でPEG―h
APCを精製することができる。
を0.1〜1%の濃度で溶解、上記活性化PEGをhA
PCの1モルに対し1〜30倍モル添加した後、酵素の
失活を防ぐため、例えば低温下(4〜10℃)で、0.
5〜24時間反応させる。反応後、未反応の活性化PE
G及びhAPCを除くため通常のタンパク質の精製に用
いられる方法(ゲル濾過、限外濾過、等)でPEG―h
APCを精製することができる。
【0022】(2)スクシニミジルスクシネートを架橋
剤とするPEG―hAPCの一例 PEG1モルに対して5〜10モルの無水コハク酸をピ
リジンを含むジクロロエタン中でN2 ガスを通しながら
3日間反応させた後、得られたPEG―コハク酸にN―
ヒドロキシスクシンイミドを加え、ジメチルホルムアミ
ド中で反応させた。ジシクロヘキシルカルボジイミドを
加え室温で24時間放置する。この溶液に冷ベンゼンを
加え、更に石油エーテルを加えて活性化PEG(スクシ
ニミジルスクシネート―PEG)を沈殿させ回収する。
剤とするPEG―hAPCの一例 PEG1モルに対して5〜10モルの無水コハク酸をピ
リジンを含むジクロロエタン中でN2 ガスを通しながら
3日間反応させた後、得られたPEG―コハク酸にN―
ヒドロキシスクシンイミドを加え、ジメチルホルムアミ
ド中で反応させた。ジシクロヘキシルカルボジイミドを
加え室温で24時間放置する。この溶液に冷ベンゼンを
加え、更に石油エーテルを加えて活性化PEG(スクシ
ニミジルスクシネート―PEG)を沈殿させ回収する。
【0023】上記活性化PEGをhAPCの1モルに対
し1〜30倍モル添加し、緩衝液中で反応させてPEG
―hAPCを得る。
し1〜30倍モル添加し、緩衝液中で反応させてPEG
―hAPCを得る。
【0024】(3)p―ニトロフェニルホルメートを添
加剤とするPEG―hAPCの一例 PEG1モルに対して1〜5モルのp―ニトロフェニル
クロロホルメートをトリエチルアミンを含むアセトニト
リル中で攪拌しながら反応させて活性化PEG(p―ニ
トロフェニルホルメート―PEG)を得る。
加剤とするPEG―hAPCの一例 PEG1モルに対して1〜5モルのp―ニトロフェニル
クロロホルメートをトリエチルアミンを含むアセトニト
リル中で攪拌しながら反応させて活性化PEG(p―ニ
トロフェニルホルメート―PEG)を得る。
【0025】活性化PEGをhAPCの1モルに対し1
〜30倍モル添加し、緩衝液中で反応させてPEG―h
APCを得る。
〜30倍モル添加し、緩衝液中で反応させてPEG―h
APCを得る。
【0026】なお、上記調製法は炭素数1〜3のo―ア
ルコキシPEGを用いても同様に実施することが可能で
ある。
ルコキシPEGを用いても同様に実施することが可能で
ある。
【0027】上記のように調製したPEG―hAPCに
はhAPC1分子当たり2〜20分子程度のPEGが結
合しており、酵素活性は修飾前のhAPCの約8〜40
%程度まで減少する。酵素活性及びPEG修飾率は以下
のように測定した。
はhAPC1分子当たり2〜20分子程度のPEGが結
合しており、酵素活性は修飾前のhAPCの約8〜40
%程度まで減少する。酵素活性及びPEG修飾率は以下
のように測定した。
【0028】APCの活性測定 APCの活性はAPTTの延長で評価した。手順は以下
のとおりである。 1.hAPC溶液(0〜800ng/ml)100μl
とヒト血漿[サイトロール・I(バクスター社製)]1
00μlを混合し、37℃で1分間インキュベーション
する。 2.APTT試薬[データーファイ(バクスター社
製)]100μlを更に添加し、37℃で2分間インキ
ュベーションする。 3.予め加温した25mM CaCl2 100μlを
加え、凝固時間をクロテックII(バクスター社製)を用
いて測定する。
のとおりである。 1.hAPC溶液(0〜800ng/ml)100μl
とヒト血漿[サイトロール・I(バクスター社製)]1
00μlを混合し、37℃で1分間インキュベーション
する。 2.APTT試薬[データーファイ(バクスター社
製)]100μlを更に添加し、37℃で2分間インキ
ュベーションする。 3.予め加温した25mM CaCl2 100μlを
加え、凝固時間をクロテックII(バクスター社製)を用
いて測定する。
【0029】PEG修飾率は遊離アミノ基をフルオレス
カミンで定量することにより確認した。
カミンで定量することにより確認した。
【0030】フルオレスカミンによるアミノ基の定量 タンパク質濃度を測定したPEG―hAPCに100m
Mリン酸緩衝液(pH8.0)を加えて全量を1.5m
lとし、更に0.03%フルオレスカミン―アセトン溶
液500μl添加し、蛍光強度を測定する(励起波長3
95nm、蛍光波長470nm)。予め濃度既知の未修
飾hAPCを用いて作成した検量線を用いてPEG―h
APCのアミノ基の定量を行う。
Mリン酸緩衝液(pH8.0)を加えて全量を1.5m
lとし、更に0.03%フルオレスカミン―アセトン溶
液500μl添加し、蛍光強度を測定する(励起波長3
95nm、蛍光波長470nm)。予め濃度既知の未修
飾hAPCを用いて作成した検量線を用いてPEG―h
APCのアミノ基の定量を行う。
【0031】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。
に説明する。
【0032】[実施例1]モノメトキシPEG(平均分
子量5000)40gをベンゼン200ml、無水炭酸
ナトリウム20g、モレキュラーシーブ3A(和光純薬
工業社製)10gからなる混合液に塩化シアヌル730
mgを加え80℃、20時間攪拌しながら反応させた。
反応後、反応混液をセファデックスG―100カラム
(1.2×88.5cm)(ファルマシア社製)による
ゲル濾過で活性化PEG2 (6―クロロ―s―トリアジ
ン―PEG2 )を精製し、更に石油エーテル400ml
を加えて沈殿せしめた。その沈殿物はデシケーター中で
減圧下で乾燥させた。
子量5000)40gをベンゼン200ml、無水炭酸
ナトリウム20g、モレキュラーシーブ3A(和光純薬
工業社製)10gからなる混合液に塩化シアヌル730
mgを加え80℃、20時間攪拌しながら反応させた。
反応後、反応混液をセファデックスG―100カラム
(1.2×88.5cm)(ファルマシア社製)による
ゲル濾過で活性化PEG2 (6―クロロ―s―トリアジ
ン―PEG2 )を精製し、更に石油エーテル400ml
を加えて沈殿せしめた。その沈殿物はデシケーター中で
減圧下で乾燥させた。
【0033】ヒト血漿由来のhAPC(ヒト血漿から精
製したPCをトロンビンで活性化して得たhAPC)2
0mgに対し10倍のモル比になるように、上記で得ら
れた活性化PEG2 800mgを加え、100mMホウ
酸緩衝液(pH9.0)の10ml中で4℃、20時間
反応させた後、100mMリン酸緩衝液(pH7.0)
を60ml加え反応を停止させ、限外濾過[アミコン社
製(米国)膜YM−30]で未反応の活性化PEG2 誘
導体及びその加水分解物を除去し、濃縮液2mlをTS
K―GEL3000SW(東ソー社製)カラム(21.
5×300mm)のゲル濾過によって精製し、PEG―
hAPC約20mgを得た。修飾率約15%、酵素活性
が未修飾のAPCの約8%のPEG―hAPC15mg
を得た。
製したPCをトロンビンで活性化して得たhAPC)2
0mgに対し10倍のモル比になるように、上記で得ら
れた活性化PEG2 800mgを加え、100mMホウ
酸緩衝液(pH9.0)の10ml中で4℃、20時間
反応させた後、100mMリン酸緩衝液(pH7.0)
を60ml加え反応を停止させ、限外濾過[アミコン社
製(米国)膜YM−30]で未反応の活性化PEG2 誘
導体及びその加水分解物を除去し、濃縮液2mlをTS
K―GEL3000SW(東ソー社製)カラム(21.
5×300mm)のゲル濾過によって精製し、PEG―
hAPC約20mgを得た。修飾率約15%、酵素活性
が未修飾のAPCの約8%のPEG―hAPC15mg
を得た。
【0034】[実施例2]モノメトキシPEG(平均分
子量5000)50g、ピリジン4ml、1,2―ジク
ロロエタン250mlからなる混合液に無水コハク酸5
gを加えN2 ガスを通しながら3日間還流させた。反応
後、濾過し、溶媒をエバポレートして得られた沈殿を水
100mlに溶解した後、ジエチルエーテル50mlで
2回洗浄した。PEG―コハク酸を抽出するためにクロ
ロホルム50mlを水相に加えた。この操作を2回繰り
返した後、クロロホルムをエバポレートしてPEG―コ
ハク酸43gを得た。上記で得られたPEG―コハク酸
をジメチルホルムアミド200mlに溶解し、更に大過
剰のN―ヒドロキシスクシンイミドを加えた後、0℃に
冷却した(PEG―コハク酸溶液)。N―ヒドロキシス
クシンイミドと同モルのジシクロヘキシルカルボジイミ
ドをジメチルホルムアミド10mlに溶解し、この溶液
を上記のPEG―コハク酸溶液を攪拌しながら滴下して
加え、室温で24時間放置した。この溶液に冷ベンゼン
100mlを加え、更に石油エーテル200mlを滴下
することにより活性化PEG(スクシニミジルスクシネ
ート―PEG)を沈殿せしめ、その沈殿はガラスフィル
ターで濾過することにより回収した。活性化PEGは−
20℃、デシケーター中で保存した。
子量5000)50g、ピリジン4ml、1,2―ジク
ロロエタン250mlからなる混合液に無水コハク酸5
gを加えN2 ガスを通しながら3日間還流させた。反応
後、濾過し、溶媒をエバポレートして得られた沈殿を水
100mlに溶解した後、ジエチルエーテル50mlで
2回洗浄した。PEG―コハク酸を抽出するためにクロ
ロホルム50mlを水相に加えた。この操作を2回繰り
返した後、クロロホルムをエバポレートしてPEG―コ
ハク酸43gを得た。上記で得られたPEG―コハク酸
をジメチルホルムアミド200mlに溶解し、更に大過
剰のN―ヒドロキシスクシンイミドを加えた後、0℃に
冷却した(PEG―コハク酸溶液)。N―ヒドロキシス
クシンイミドと同モルのジシクロヘキシルカルボジイミ
ドをジメチルホルムアミド10mlに溶解し、この溶液
を上記のPEG―コハク酸溶液を攪拌しながら滴下して
加え、室温で24時間放置した。この溶液に冷ベンゼン
100mlを加え、更に石油エーテル200mlを滴下
することにより活性化PEG(スクシニミジルスクシネ
ート―PEG)を沈殿せしめ、その沈殿はガラスフィル
ターで濾過することにより回収した。活性化PEGは−
20℃、デシケーター中で保存した。
【0035】WO92/13079号明細書の実施例1
および2に記載の方法(293細胞/TZm5―900
2)で得られたhPCを同じく実施例4に記載された方
法で精製、活性化したhAPC25mgに対し、4倍の
モル比になるように上記で得られた活性化PEG195
mgを加え、100mMホウ酸緩衝液(pH8.0)の
25ml中で4℃、20時間反応させた後、ε―アミノ
カプロン酸64mgを添加して反応を停止させた。反応
混液は限外濾過膜[アミコン社製(米国)膜YM―3
0]で濾過して未反応のPEGを除去した後、TSK―
GEL3000SW(東ソー社製)カラム(21.5×
300mm)のゲル濾過によってPEG―hAPCを精
製した。修飾率約14%(hAPC1分子に対して約3
分子のPEGが結合)、酵素活性が未修飾のAPCの約
11%のPEG―hAPC10mgを得た。
および2に記載の方法(293細胞/TZm5―900
2)で得られたhPCを同じく実施例4に記載された方
法で精製、活性化したhAPC25mgに対し、4倍の
モル比になるように上記で得られた活性化PEG195
mgを加え、100mMホウ酸緩衝液(pH8.0)の
25ml中で4℃、20時間反応させた後、ε―アミノ
カプロン酸64mgを添加して反応を停止させた。反応
混液は限外濾過膜[アミコン社製(米国)膜YM―3
0]で濾過して未反応のPEGを除去した後、TSK―
GEL3000SW(東ソー社製)カラム(21.5×
300mm)のゲル濾過によってPEG―hAPCを精
製した。修飾率約14%(hAPC1分子に対して約3
分子のPEGが結合)、酵素活性が未修飾のAPCの約
11%のPEG―hAPC10mgを得た。
【0036】[実施例3] PEG―hAPCの製造 モノメトキシPEG(平均分子量5000)12.5g
をアセトニトリル50ml、p―ニトロフェニルクロロ
ホルメート(和光純薬工業社製)290mgからなる混
合液にを加え、4℃、24時間攪拌しながら反応させ
た。反応後、沈殿した塩化トリエチルアンモニウムを濾
過し、濾過後の溶液にエチルエーテル500mlを加
え、4℃で一晩放置して活性化PEGを結晶化させた。
得られた結晶を濾過、エチルエーテルで洗浄した後、そ
の結晶(p―ニトロフェニルホルメート―PEG)をア
セトニトリル―エーテル中で再結晶させた。
をアセトニトリル50ml、p―ニトロフェニルクロロ
ホルメート(和光純薬工業社製)290mgからなる混
合液にを加え、4℃、24時間攪拌しながら反応させ
た。反応後、沈殿した塩化トリエチルアンモニウムを濾
過し、濾過後の溶液にエチルエーテル500mlを加
え、4℃で一晩放置して活性化PEGを結晶化させた。
得られた結晶を濾過、エチルエーテルで洗浄した後、そ
の結晶(p―ニトロフェニルホルメート―PEG)をア
セトニトリル―エーテル中で再結晶させた。
【0037】ヒト血漿由来のhAPC10mgに対し、
上記で得られた活性化PEG195mgを加え、100
mMホウ酸バッファー(pH8.0)10ml中で4
℃、4時間反応させた後、ε―アミノカプロン酸26m
gを添加して反応を停止させた。その後、限外濾過[ア
ミコン社製(米国)膜YM−30]で未反応のPEGを
除去し、濃縮液1.0mlをTSK―GEL3000S
W(東ソー社製)カラム(21.5×300mm)のゲ
ル濾過によって精製し、PEG―hAPC約6mgを得
た。修飾率約22%、酵素活性が未修飾のAPCの約1
6%のPEG―hAPC15mgを得た。
上記で得られた活性化PEG195mgを加え、100
mMホウ酸バッファー(pH8.0)10ml中で4
℃、4時間反応させた後、ε―アミノカプロン酸26m
gを添加して反応を停止させた。その後、限外濾過[ア
ミコン社製(米国)膜YM−30]で未反応のPEGを
除去し、濃縮液1.0mlをTSK―GEL3000S
W(東ソー社製)カラム(21.5×300mm)のゲ
ル濾過によって精製し、PEG―hAPC約6mgを得
た。修飾率約22%、酵素活性が未修飾のAPCの約1
6%のPEG―hAPC15mgを得た。
【0038】実施例1から3で得られたPEG―hAP
CのPEG修飾率と酵素活性を表1に示す。
CのPEG修飾率と酵素活性を表1に示す。
【0039】
【表1】
【0040】[実施例4]実施例1と同様にして、分子
量の異なるPEG(平均分子量1000、2000また
は5000)を用い、それぞれの活性化PEGを調製し
これらをそれぞれ実施例1で用いたのと同様のhAPC
に対し10倍のモル比になるようにhAPCと反応さ
せ、実施例1と同様の方法でそれぞれのPEG―hAP
Cを調製した。得られたPEG―hAPCの修飾率と酵
素活性(APTT)を測定した。これらの結果を表2に
示す。
量の異なるPEG(平均分子量1000、2000また
は5000)を用い、それぞれの活性化PEGを調製し
これらをそれぞれ実施例1で用いたのと同様のhAPC
に対し10倍のモル比になるようにhAPCと反応さ
せ、実施例1と同様の方法でそれぞれのPEG―hAP
Cを調製した。得られたPEG―hAPCの修飾率と酵
素活性(APTT)を測定した。これらの結果を表2に
示す。
【0041】
【表2】
【0042】
【参考実験1】カルボキシル基が修飾されたPEG―hAPC hAPC分子中のグルタミン酸残基あるいはアスパラギ
ン酸残基のカルボキシル基をPEGで修飾する方法とし
てはカルボキシル基にプトレスシン等のジアミン化合物
を反応させてアミノ基を導入し、このアミノ基をPEG
で修飾する。以下にその調製法を記す。
ン酸残基のカルボキシル基をPEGで修飾する方法とし
てはカルボキシル基にプトレスシン等のジアミン化合物
を反応させてアミノ基を導入し、このアミノ基をPEG
で修飾する。以下にその調製法を記す。
【0043】ヒト血漿由来のhAPC100mgに対し
200mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)30
ml、プトレスシン(和光純薬工業社製)250mg、
カルボジイミド・HCl(同仁化学研究所社製)300
mgからなる混合液を加え4℃、12時間攪拌しながら
反応させた。反応後、未反応のプトレスシン及びカルボ
ジイミド・HClを除去するために、セファデックスG
―25[ファルマシア社製(スエーデン)]のカラム
(45×600mm)でゲル濾過を行った後、得られた
voidフラクション(hAPC―プトレスシン)を凍
結乾燥した。
200mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)30
ml、プトレスシン(和光純薬工業社製)250mg、
カルボジイミド・HCl(同仁化学研究所社製)300
mgからなる混合液を加え4℃、12時間攪拌しながら
反応させた。反応後、未反応のプトレスシン及びカルボ
ジイミド・HClを除去するために、セファデックスG
―25[ファルマシア社製(スエーデン)]のカラム
(45×600mm)でゲル濾過を行った後、得られた
voidフラクション(hAPC―プトレスシン)を凍
結乾燥した。
【0044】上記で得られたhAPC―プトレスシン3
0mgに対し実施例2で得られた活性化PEG580m
gを加え、100mMホウ酸緩衝液(pH8.0)30
ml中で4℃、一晩反応させた後、100mMリン酸緩
衝液(pH7.0)を180ml加え反応を停止させ、
10mMリン酸緩衝液(pH7.0)中、4℃で24時
間透析した。透析後、限外濾過[アミコン社製(米国)
膜YM−30]で未反応のPEGを除去し、PEG―h
APCとして約20mgを得た。得られたPEG―hA
PCの酵素活性を測定したところ、活性は消失してい
た。
0mgに対し実施例2で得られた活性化PEG580m
gを加え、100mMホウ酸緩衝液(pH8.0)30
ml中で4℃、一晩反応させた後、100mMリン酸緩
衝液(pH7.0)を180ml加え反応を停止させ、
10mMリン酸緩衝液(pH7.0)中、4℃で24時
間透析した。透析後、限外濾過[アミコン社製(米国)
膜YM−30]で未反応のPEGを除去し、PEG―h
APCとして約20mgを得た。得られたPEG―hA
PCの酵素活性を測定したところ、活性は消失してい
た。
【0045】hAPC分子中のアミノ基を修飾した実施
例2では修飾後においても酵素活性は保持されていたが
カルボキシル基を修飾すると酵素活性は消失した。
例2では修飾後においても酵素活性は保持されていたが
カルボキシル基を修飾すると酵素活性は消失した。
【0046】
【参考実験2】4,6―クロロ―s―トリアジン―PEG(活性PEG
1 誘導体)で修飾されたPEG―hAPC 実施例1と同様の方法で4,6―クロロ―s―トリアジ
ン―PEG(活性PEG1 )を精製した。
1 誘導体)で修飾されたPEG―hAPC 実施例1と同様の方法で4,6―クロロ―s―トリアジ
ン―PEG(活性PEG1 )を精製した。
【0047】実施例1に記載のhAPC1mgに対し2
及び4倍のモル比になるように、上記で得られた活性化
PEG1 を各々4、8mgを加え、100mMホウ酸緩
衝液(pH9.0)の1ml中で4℃、20時間反応さ
せた後、100mMリン酸緩衝液(pH7.0)を4m
l加え反応を停止させ、限外濾過[アミコン社製(米
国)膜YM−30]で未反応のPEGを除去し、濃縮液
0.5mlをTSK―GEL3000SW(東ソー社
製)カラム(21.5×300mm)のゲル濾過によっ
て精製し、PEG―hAPC各々約0.8mgを得た。
得られたPEG―hAPCの修飾率と酵素活性を表3に
示す。
及び4倍のモル比になるように、上記で得られた活性化
PEG1 を各々4、8mgを加え、100mMホウ酸緩
衝液(pH9.0)の1ml中で4℃、20時間反応さ
せた後、100mMリン酸緩衝液(pH7.0)を4m
l加え反応を停止させ、限外濾過[アミコン社製(米
国)膜YM−30]で未反応のPEGを除去し、濃縮液
0.5mlをTSK―GEL3000SW(東ソー社
製)カラム(21.5×300mm)のゲル濾過によっ
て精製し、PEG―hAPC各々約0.8mgを得た。
得られたPEG―hAPCの修飾率と酵素活性を表3に
示す。
【0048】
【表3】
【0049】蛋白質との結合部位が1カ所しか存在せ
ず、hAPC分子間の架橋反応が生じない架橋剤である
6―クロロ―s―トリアジンを用いたPEG修飾(実施
例1)では修飾後の酵素活性は保持されていたが、本参
考実験を示した蛋白質との結合部位が2カ所存在する
4,6―クロロ―s―トリアジンを架橋剤として用いる
とhAPC分子間で架橋反応が生じるため酵素活性が著
しく低下した。
ず、hAPC分子間の架橋反応が生じない架橋剤である
6―クロロ―s―トリアジンを用いたPEG修飾(実施
例1)では修飾後の酵素活性は保持されていたが、本参
考実験を示した蛋白質との結合部位が2カ所存在する
4,6―クロロ―s―トリアジンを架橋剤として用いる
とhAPC分子間で架橋反応が生じるため酵素活性が著
しく低下した。
【0050】
【試験例1】PEG―hAPCの血中半減期 実施例3と同様にして調製したPEG―hAPCまたは
hAPCをラットに静脈内投与(hAPCとして100
μg/kg)した後、経時的に尾静脈から採血した。血
液を遠心分離して得られた血漿のAPTTを測定するこ
とにより血中半減期を求めた。結果を表4に示す。PE
G修飾により血中半減期の有意な延長効果が見られた。
hAPCをラットに静脈内投与(hAPCとして100
μg/kg)した後、経時的に尾静脈から採血した。血
液を遠心分離して得られた血漿のAPTTを測定するこ
とにより血中半減期を求めた。結果を表4に示す。PE
G修飾により血中半減期の有意な延長効果が見られた。
【0051】
【表4】
Claims (3)
- 【請求項1】 分子中の少なくとも1個のアミノ基が架
橋剤を介してポリエチレングリコールで修飾されたヒト
活性化プロテインC誘導体。 - 【請求項2】 該架橋剤によってヒト活性化プロテイン
Cが分子間で架橋されていない請求項1記載のヒト活性
化プロテインC誘導体。 - 【請求項3】 該架橋が下式[I]―[III ]で表され
る化合物からなる群より選ばれる化合物により達成され
る請求項1記載のヒト活性化プロテインC誘導体。 【化1】 [但し、式中、R1 はC1 〜C3 アルキル基を表わし、
nは20〜500の整数を表わす。]
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6235035A JPH0892294A (ja) | 1994-09-29 | 1994-09-29 | ヒト活性化プロテインc誘導体 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6235035A JPH0892294A (ja) | 1994-09-29 | 1994-09-29 | ヒト活性化プロテインc誘導体 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0892294A true JPH0892294A (ja) | 1996-04-09 |
Family
ID=16980127
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6235035A Pending JPH0892294A (ja) | 1994-09-29 | 1994-09-29 | ヒト活性化プロテインc誘導体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0892294A (ja) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002032461A2 (en) * | 2000-10-18 | 2002-04-25 | Maxygen Aps | Protein c or activated protein c-like molecules |
US6423826B1 (en) | 2000-06-30 | 2002-07-23 | Regents Of The University Of Minnesota | High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides |
US6933367B2 (en) | 2000-10-18 | 2005-08-23 | Maxygen Aps | Protein C or activated protein C-like molecules |
US7160540B2 (en) | 2000-06-30 | 2007-01-09 | Regents Of The University Of Minnesota | Methods for detecting activity of clottings factors |
US7867774B2 (en) | 2004-10-12 | 2011-01-11 | Luminex Corporation | Methods for altering surface characteristics of microspheres |
WO2013156488A3 (en) * | 2012-04-16 | 2014-01-16 | Leverton Licence Holdings Limited | Optimised subcutaneous therapeutic agents |
US8632771B2 (en) | 2000-06-30 | 2014-01-21 | Regents Of The University Of Minnesota | High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides |
-
1994
- 1994-09-29 JP JP6235035A patent/JPH0892294A/ja active Pending
Cited By (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7160540B2 (en) | 2000-06-30 | 2007-01-09 | Regents Of The University Of Minnesota | Methods for detecting activity of clottings factors |
US6423826B1 (en) | 2000-06-30 | 2002-07-23 | Regents Of The University Of Minnesota | High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides |
WO2002002764A3 (en) * | 2000-06-30 | 2002-08-01 | Univ Minnesota | High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides |
US9050372B2 (en) | 2000-06-30 | 2015-06-09 | Regents Of The University Of Minnesota | High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides |
US8632771B2 (en) | 2000-06-30 | 2014-01-21 | Regents Of The University Of Minnesota | High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides |
US7226999B2 (en) | 2000-10-18 | 2007-06-05 | Maxygen Aps | Protein C or activated protein C-like molecules |
WO2002032461A2 (en) * | 2000-10-18 | 2002-04-25 | Maxygen Aps | Protein c or activated protein c-like molecules |
US6933367B2 (en) | 2000-10-18 | 2005-08-23 | Maxygen Aps | Protein C or activated protein C-like molecules |
WO2002032461A3 (en) * | 2000-10-18 | 2002-09-26 | Maxygen Aps | Protein c or activated protein c-like molecules |
US7867774B2 (en) | 2004-10-12 | 2011-01-11 | Luminex Corporation | Methods for altering surface characteristics of microspheres |
US8153440B2 (en) | 2004-10-12 | 2012-04-10 | Luminex Corporation | Methods for altering surface characteristics of microspheres |
WO2013156488A3 (en) * | 2012-04-16 | 2014-01-16 | Leverton Licence Holdings Limited | Optimised subcutaneous therapeutic agents |
GB2516388A (en) * | 2012-04-16 | 2015-01-21 | Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd | Optimised subcutaneous therapeutic agents |
EA033469B1 (ru) * | 2012-04-16 | 2019-10-31 | Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd | Подкожное введение конъюгатов факторов крови с полиэтиленгликолем |
US11351112B2 (en) | 2012-04-16 | 2022-06-07 | Cantab Biopharmaceuticals Patents Limited | Optimised subcutaneous therapeutic agents |
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