JPS60136520A - フイブリン吸着性ウロキナ−ゼ複合体 - Google Patents
フイブリン吸着性ウロキナ−ゼ複合体Info
- Publication number
- JPS60136520A JPS60136520A JP58251990A JP25199083A JPS60136520A JP S60136520 A JPS60136520 A JP S60136520A JP 58251990 A JP58251990 A JP 58251990A JP 25199083 A JP25199083 A JP 25199083A JP S60136520 A JPS60136520 A JP S60136520A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- urokinase
- plasmin
- heavy chain
- complex
- fibrin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なフィブリン吸着性ウロキナーゼ複合体、
及びその製造法に関する。
及びその製造法に関する。
人の尿から精製さｎるウロキナーゼには、高分子型（分
子量約５，４万で活性中心を含む分子量約３．２万の重
鎮（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）と、分子量約２．２万の
軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）がｓ−ｓ で結合しテ
イル）と低分子Ｍ（上記分子怠約３万前後の重鎮からな
る）の２楓類があり、低分子型は高分子型が精製中に限
定分解を受けて生じたものであるが［Ｗ、Ｆ。
子量約５，４万で活性中心を含む分子量約３．２万の重
鎮（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）と、分子量約２．２万の
軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）がｓ−ｓ で結合しテ
イル）と低分子Ｍ（上記分子怠約３万前後の重鎮からな
る）の２楓類があり、低分子型は高分子型が精製中に限
定分解を受けて生じたものであるが［Ｗ、Ｆ。
Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
５．２１６０（１９６６） ］、インビトロ（ｉｎ
ｖｉｔｒｏ）の酵素活性には大差がなく、いずｎも血栓
溶解酵素剤として、血栓症の治療に広（臨床で使用さｎ
ている。しかしながら２等ウロキナーゼは血栓を構成し
ている蛋白成分であるフィブリンに対して全く吸着性を
有しておらず、また静注さｎたウロキナーゼは速やかに
代細排泄さｎてしまう等のために、インビトロの活性か
ら期待さ几るほどの治療効果が得らｎでいない現状にあ
る。
５．２１６０（１９６６） ］、インビトロ（ｉｎ
ｖｉｔｒｏ）の酵素活性には大差がなく、いずｎも血栓
溶解酵素剤として、血栓症の治療に広（臨床で使用さｎ
ている。しかしながら２等ウロキナーゼは血栓を構成し
ている蛋白成分であるフィブリンに対して全く吸着性を
有しておらず、また静注さｎたウロキナーゼは速やかに
代細排泄さｎてしまう等のために、インビトロの活性か
ら期待さ几るほどの治療効果が得らｎでいない現状にあ
る。
一万血中蛋白質であるプラスミンは、フィブリンに対し
て強い結合能を有し、その結合部位もかなり詳細に解明
さｎている［Ｂ、 Ｗｉｍａｎ ａｎｄ Ｐ、Ｗａｌｌ
ｅｎ。
て強い結合能を有し、その結合部位もかなり詳細に解明
さｎている［Ｂ、 Ｗｉｍａｎ ａｎｄ Ｐ、Ｗａｌｌ
ｅｎ。
Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 １．２１
３（１９７７月。即ち人プラスミンはフィブリン吸着性
に関与する重鎮（分子量約６カ）と活性中心を含む軽鎖
（分子量約３カ）が２個のＳ−８で結合した分子量約９
万の蛋白であり、」ニ記重鎮には５つの相同性の高い単
位横這（ｒＫｒｉｎｇｌｅＪ と呼はｎている）のくり
返しがアリ、Ｋ’ｒｉｎｇｌｅ ｌ〜３に強いフィブリ
ン吸着部位かあり、Ｋｒｉｎｇｌｅ ４にも吸着性かあ
る事か知られす、 １９１（１９７８））。
３（１９７７月。即ち人プラスミンはフィブリン吸着性
に関与する重鎮（分子量約６カ）と活性中心を含む軽鎖
（分子量約３カ）が２個のＳ−８で結合した分子量約９
万の蛋白であり、」ニ記重鎮には５つの相同性の高い単
位横這（ｒＫｒｉｎｇｌｅＪ と呼はｎている）のくり
返しがアリ、Ｋ’ｒｉｎｇｌｅ ｌ〜３に強いフィブリ
ン吸着部位かあり、Ｋｒｉｎｇｌｅ ４にも吸着性かあ
る事か知られす、 １９１（１９７８））。
本発明は上記プラスミンを始めとしてフィブリンに吸着
性のある蛋白を、ウロキナーゼに結合させて、ウロキナ
ーゼにフィブリン結合性を付与することができｎば、該
ウロキナーゼはその治療目的である血栓に吸着さｎ１代
謝排泄さｎにくくなり、血中半減期の延長が期待さｎ、
所望の治療効果を奏し得るという着急から、上記フィブ
リンに吸着性を有するウロキナーゼを得ることを目的と
して糾意研究を重ねた結果、完成さｎたものである。
性のある蛋白を、ウロキナーゼに結合させて、ウロキナ
ーゼにフィブリン結合性を付与することができｎば、該
ウロキナーゼはその治療目的である血栓に吸着さｎ１代
謝排泄さｎにくくなり、血中半減期の延長が期待さｎ、
所望の治療効果を奏し得るという着急から、上記フィブ
リンに吸着性を有するウロキナーゼを得ることを目的と
して糾意研究を重ねた結果、完成さｎたものである。
本発明の要旨とする所は、高分子型ウロキナーゼの重鎮
とブーラスミンの重鎮とがＳ−８結合により結合されて
いることを特徴とするフ、イブリシ吸着性つロキナーゼ
複合体及びその製造方法に係る。。
とブーラスミンの重鎮とがＳ−８結合により結合されて
いることを特徴とするフ、イブリシ吸着性つロキナーゼ
複合体及びその製造方法に係る。。
本発明の複合体は、血栓溶解剤としてウロキナーゼ単独
に比し、より少量の使用で血栓部位に選択的（局所的〕
に作用し、代謝排泄が遅延さｎｌしかもプラスミン阻害
剤による影響か少なく、充分な血栓溶解作用を持続発現
し得ると共に、全身性の出血傾向等の副作用も少なく、
非常に有効である。殊に本発明複合体は、高分子型ウロ
キナーゼの重鎮とプラスミンの重鎮とを、之等夫々の重
鎮がそｎぞｎの＠鎮と本来結合していた部位で、何らの
結合試薬をも介することな（Ｓ−５結合により結合ざぜ
た最も自然な構造を有しており、しかも上記ｓ−ｓ 結
合によるプラスミン重鎮の結合は、ウロキナーゼの活性
発現に無関係と考えられる部位で行なわｎているため、
優ｎたフィブリン分解活性（血栓溶解活性）を奏し得る
。従って本発明の複合体は新しい血栓溶解剤として有用
であり、医薬品業界、その他の分野において大きく貢献
するものである。ｔた本発明はかかる血栓溶解剤として
有用な新しい複合体を、容易に効率よく収得する新しい
方法をも提供するものである。
に比し、より少量の使用で血栓部位に選択的（局所的〕
に作用し、代謝排泄が遅延さｎｌしかもプラスミン阻害
剤による影響か少なく、充分な血栓溶解作用を持続発現
し得ると共に、全身性の出血傾向等の副作用も少なく、
非常に有効である。殊に本発明複合体は、高分子型ウロ
キナーゼの重鎮とプラスミンの重鎮とを、之等夫々の重
鎮がそｎぞｎの＠鎮と本来結合していた部位で、何らの
結合試薬をも介することな（Ｓ−５結合により結合ざぜ
た最も自然な構造を有しており、しかも上記ｓ−ｓ 結
合によるプラスミン重鎮の結合は、ウロキナーゼの活性
発現に無関係と考えられる部位で行なわｎているため、
優ｎたフィブリン分解活性（血栓溶解活性）を奏し得る
。従って本発明の複合体は新しい血栓溶解剤として有用
であり、医薬品業界、その他の分野において大きく貢献
するものである。ｔた本発明はかかる血栓溶解剤として
有用な新しい複合体を、容易に効率よく収得する新しい
方法をも提供するものである。
以下本発明複合体につき、その製造方法よりこｎをδ子
連する。
連する。
本発明複合体の製造に用いる高分子型ウロキナーゼ単独
は、公知の繭分子型ウロキナーゼ［Ｈｉｇｈ八イｏへｅ
Ｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ−Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ、 Ｂ
ＭＷ−ＵＫ、平均分子１ｉ ５４０００． Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉ８ｔｒｙ、 ５．２１６０（１９６６）］より容
易に分１ａｃｋ、作製できる。即ち高分子型ウロキナー
ゼ！！Ｌ鎖は、まず高分子型ウロキナーゼ（ＨＭＷ−［
） を、例えは２−メルカプトエタノール、ジチオスレ
イトール、ジチオエリスリトール等のチオール−協在下
で部分還元して、その重鎮と軽鎖との間のＳ−８結合を
還元的に切断し、次いで反応液を高分子型ウロキナーゼ
重鎮の活性中心に対するアフィニティーリガンドを有す
る樹脂に吸着、溶出させることにより分離収得すること
ができる［Ｈ５ｕｍｉ ａｎｄ Ｋ、 Ｃ，Ｒｏｂｂｊ
ｎｓ、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｂｅｍ、、 ２５８（１
３）８０１４（１９８３）］。
は、公知の繭分子型ウロキナーゼ［Ｈｉｇｈ八イｏへｅ
Ｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ−Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ、 Ｂ
ＭＷ−ＵＫ、平均分子１ｉ ５４０００． Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉ８ｔｒｙ、 ５．２１６０（１９６６）］より容
易に分１ａｃｋ、作製できる。即ち高分子型ウロキナー
ゼ！！Ｌ鎖は、まず高分子型ウロキナーゼ（ＨＭＷ−［
） を、例えは２−メルカプトエタノール、ジチオスレ
イトール、ジチオエリスリトール等のチオール−協在下
で部分還元して、その重鎮と軽鎖との間のＳ−８結合を
還元的に切断し、次いで反応液を高分子型ウロキナーゼ
重鎮の活性中心に対するアフィニティーリガンドを有す
る樹脂に吸着、溶出させることにより分離収得すること
ができる［Ｈ５ｕｍｉ ａｎｄ Ｋ、 Ｃ，Ｒｏｂｂｊ
ｎｓ、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｂｅｍ、、 ２５８（１
３）８０１４（１９８３）］。
本発明複合体の製造に用いるプラスミン重鎮は、例えは
文献［Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ５７．４
４１（１９７５）］等に記載の方法に準じて製造さｎ、
こｎはプラスミンを部分還元して得られるメルカプト五
を有するものである。上記プラスミン重鎮は、上記と同
梯にして例えはプラスミンを２−メルカプトエタノール
の存在下に部分還元して、その重鎮と軽鎖との間のＳ−
８結合を切断し、反応液を重鎮にのみ親和性を有するリ
ジン−セファロース等に吸着、溶出させることにより分
離収得することができる。
文献［Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ５７．４
４１（１９７５）］等に記載の方法に準じて製造さｎ、
こｎはプラスミンを部分還元して得られるメルカプト五
を有するものである。上記プラスミン重鎮は、上記と同
梯にして例えはプラスミンを２−メルカプトエタノール
の存在下に部分還元して、その重鎮と軽鎖との間のＳ−
８結合を切断し、反応液を重鎮にのみ親和性を有するリ
ジン−セファロース等に吸着、溶出させることにより分
離収得することができる。
上記の如くして得らｎる高分子型ウロキナーゼ！Ｉ【鎮
とプラスミンｍＨとの結合反応は、例えはＳ−Ｓ 交換
反応［Ｔｅｒｏｕａｎｎｅ、 Ｂ、、Ｎ１ｃｏｌａｓ、
Ｊ、 Ｃ，。
とプラスミンｍＨとの結合反応は、例えはＳ−Ｓ 交換
反応［Ｔｅｒｏｕａｎｎｅ、 Ｂ、、Ｎ１ｃｏｌａｓ、
Ｊ、 Ｃ，。
Ｄｅｓｃｏｍｐｓ、 Ｂ、 ＆ Ｃｒｕｓｔｅｓ ｄｅ
Ｐａｕｌｅｔ、 Ａ、、 Ｊ。
Ｐａｕｌｅｔ、 Ａ、、 Ｊ。
Ｉｍｍｕ ｎ ｏ ｌ 、八Ｉｅｔｂｏｄｓ、 ３５．
２６７（１９８０月により実施することができる。上記
Ｓ−８交換゛反応は、例えば水溶液、生理食塩水もしく
はｐＨ４〜１０の通常の緩衝液中、好ましくはｐＨ６〜
８の緩衝液中で、θ〜４０℃好′ましくは室温付近で、
好ましくは窒素気流中で行なわｎ、る。該反応は通電数
分〜２４時聞ＰＡＷで完結する。上記において用いらｎ
る緩向故とｊ７ては、公知の各回のものをいすｎも使用
することができる。より好ましくは上記結合反応は、予
め高分子型ウロキナーゼ重鎮に大過剰鷲の５．５′−ジ
チオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）を作用さ七て、該重
鎮の軽鎖との結合に関与していたシスティン残五にジチ
オニトロベンゾエート基を４１加１／’％ジチオニトロ
ベンゾエート付加高分子型ウロキナーゼ重鎮とした後、
こｎにプラスミン重鎖を反応させる方法により行なうの
がよい。
２６７（１９８０月により実施することができる。上記
Ｓ−８交換゛反応は、例えば水溶液、生理食塩水もしく
はｐＨ４〜１０の通常の緩衝液中、好ましくはｐＨ６〜
８の緩衝液中で、θ〜４０℃好′ましくは室温付近で、
好ましくは窒素気流中で行なわｎ、る。該反応は通電数
分〜２４時聞ＰＡＷで完結する。上記において用いらｎ
る緩向故とｊ７ては、公知の各回のものをいすｎも使用
することができる。より好ましくは上記結合反応は、予
め高分子型ウロキナーゼ重鎮に大過剰鷲の５．５′−ジ
チオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）を作用さ七て、該重
鎮の軽鎖との結合に関与していたシスティン残五にジチ
オニトロベンゾエート基を４１加１／’％ジチオニトロ
ベンゾエート付加高分子型ウロキナーゼ重鎮とした後、
こｎにプラスミン重鎖を反応させる方法により行なうの
がよい。
上記結合反応において、高分子型ウロキナーゼ重鎮もし
くはジチオニトロベンゾエート付加高分子型ウロキナー
ゼ重鎮とプラスミン重鎮との使用割合は、適宜に決定さ
ｎるが、通常高分子型ウロキナーゼ重鎮に対してプラス
ミン重鎖鎮を約０．５〜１０倍モル量程度、好ましくは
約１〜５倍モル量用い６のがよい。
くはジチオニトロベンゾエート付加高分子型ウロキナー
ゼ重鎮とプラスミン重鎮との使用割合は、適宜に決定さ
ｎるが、通常高分子型ウロキナーゼ重鎮に対してプラス
ミン重鎖鎮を約０．５〜１０倍モル量程度、好ましくは
約１〜５倍モル量用い６のがよい。
かくして製造さｎる本発明の複合体は、主としてプラス
ミン重鎮１モルに対して高分子型ウロキナーゼ重鎮が１
〜３モル、好ましくはほぼ１モル結合したものである。
ミン重鎮１モルに対して高分子型ウロキナーゼ重鎮が１
〜３モル、好ましくはほぼ１モル結合したものである。
このことは得らｎる複合体の分子量及び該複合体を還元
状態とした後、Ｓ■）Ｓ処理し電気泳動させて生ずるバ
ンドの活性ＳＨ基を測定することにより確認さｎる。即
ち上記還元（Ｓ−Ｓ 結合の開裂）によｎは、分子量約
６万と約３万のバンドが現わｎ１該約６万の分子量を有
するバンドは平均３個のＳＨ基を有しており、また約３
万の分子量を有するバンドは１個のＳ’Ｈ基を有してい
る。しかしてプラスミン重鎮は、その軽鎖との間の２個
のＳ−５結合の還元開裂により庄する２個のＳＨ基と他
に平均１個のＳＨ基を有しており、また高分子型ウロキ
ナーゼ重鎮は、その−鎮との間のＳ−８粘合の還元的分
解により生ずる１個のＳｌｌ基を有している。本発明複
合体はこの各重鎮のＳｌｌ基が相互に結合したものであ
る。
状態とした後、Ｓ■）Ｓ処理し電気泳動させて生ずるバ
ンドの活性ＳＨ基を測定することにより確認さｎる。即
ち上記還元（Ｓ−Ｓ 結合の開裂）によｎは、分子量約
６万と約３万のバンドが現わｎ１該約６万の分子量を有
するバンドは平均３個のＳＨ基を有しており、また約３
万の分子量を有するバンドは１個のＳ’Ｈ基を有してい
る。しかしてプラスミン重鎮は、その軽鎖との間の２個
のＳ−５結合の還元開裂により庄する２個のＳＨ基と他
に平均１個のＳＨ基を有しており、また高分子型ウロキ
ナーゼ重鎮は、その−鎮との間のＳ−８粘合の還元的分
解により生ずる１個のＳｌｌ基を有している。本発明複
合体はこの各重鎮のＳｌｌ基が相互に結合したものであ
る。
上記１こより得ら几る本発明複合体は、結合反応終了後
、常法に従い、例えは透析法、ゲル濾過沃分別沈澱法及
びアフィニティークロマトグラフィー等により＠易に単
離精製できる。またこｎは適冷の凍結乾燥法により保存
できる。
、常法に従い、例えは透析法、ゲル濾過沃分別沈澱法及
びアフィニティークロマトグラフィー等により＠易に単
離精製できる。またこｎは適冷の凍結乾燥法により保存
できる。
上記の如くして得られる本発明複合体は、フィブリン吸
着能及びウロキナーゼ活性を有しており、血柱俗解剤と
して血栓症の治療に有効なものであるＯ 本発明の製造法で得らｎる複合体は、こｎを血栓溶解剤
として用いるに当り、通常の製剤的担体と共に製剤組成
物の形態とさｎる。該血栓溶解剤の投与単位形態として
は、各種の形態を治療目的に応じて適宜選択できるが、
通常は注射剤として用いらｎる。該注射剤は通常の方法
で殺菌さｎ、好ましくは血液と等張とさｎる。注射剤の
形態に成形するに際して用いられる希釈剤としては、こ
の分野において慣用さｎている各種のもの、例えば水、
生理食塩水等゛を例示できる。なおこの場合等張性の浴
液を調製するに充分な息の食塩、ブドウ糖あるいはグリ
セリンを血栓俗解剤中に含１°せしめてもよく、また通
常の溶解補助剤、緩衝剤、無陥化剤、保存剤等を、更に
必要に応じて着色剋香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬
品を骸血栓溶解剤中に含有せしめてもよい。
着能及びウロキナーゼ活性を有しており、血柱俗解剤と
して血栓症の治療に有効なものであるＯ 本発明の製造法で得らｎる複合体は、こｎを血栓溶解剤
として用いるに当り、通常の製剤的担体と共に製剤組成
物の形態とさｎる。該血栓溶解剤の投与単位形態として
は、各種の形態を治療目的に応じて適宜選択できるが、
通常は注射剤として用いらｎる。該注射剤は通常の方法
で殺菌さｎ、好ましくは血液と等張とさｎる。注射剤の
形態に成形するに際して用いられる希釈剤としては、こ
の分野において慣用さｎている各種のもの、例えば水、
生理食塩水等゛を例示できる。なおこの場合等張性の浴
液を調製するに充分な息の食塩、ブドウ糖あるいはグリ
セリンを血栓俗解剤中に含１°せしめてもよく、また通
常の溶解補助剤、緩衝剤、無陥化剤、保存剤等を、更に
必要に応じて着色剋香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬
品を骸血栓溶解剤中に含有せしめてもよい。
血栓俗解剤中に含有させるべき本発明複合体の鴬は、特
に限定されず広い範囲から適宜選択さｎるが、通常金製
剤［酸物中に約０．０１〜３０重ｔｈ！％含有される鼠
とするのがよい。
に限定されず広い範囲から適宜選択さｎるが、通常金製
剤［酸物中に約０．０１〜３０重ｔｈ！％含有される鼠
とするのがよい。
又上記血栓溶解剤は、その使用易こ際し、各種形態に応
じた方法で投与さｎるが、通常は注射剤として単独であ
るいはブドウ糖、アミノ酸輸液等の輸液と混合して静脈
内投与される。その投与量は使用目的、症状等により適
宜選択されるが、通常有効成分である本発明複合体とし
て１日当り約１０００〜５０００００ 単位／Ｋｙ Ｃ
単位：ウロキナーゼ標準品と比較換算した国際単位）と
するのが好ましく、こｎは２〜４回に分けて投与しても
よい。
じた方法で投与さｎるが、通常は注射剤として単独であ
るいはブドウ糖、アミノ酸輸液等の輸液と混合して静脈
内投与される。その投与量は使用目的、症状等により適
宜選択されるが、通常有効成分である本発明複合体とし
て１日当り約１０００〜５０００００ 単位／Ｋｙ Ｃ
単位：ウロキナーゼ標準品と比較換算した国際単位）と
するのが好ましく、こｎは２〜４回に分けて投与しても
よい。
以下、本発明に用いる高分子型ウロキナーゼ重鎮及びプ
ラスミン重鎮の製造乃至調整例を参考例として挙げ、次
いで本発明複合体の製造例を実施例として挙げ、更に実
施例で得た複合体の薬理試験例を挙ける。尚各側におけ
る各独活性の測定法及びその他物性等の試験法は以下の
通りである。
ラスミン重鎮の製造乃至調整例を参考例として挙げ、次
いで本発明複合体の製造例を実施例として挙げ、更に実
施例で得た複合体の薬理試験例を挙ける。尚各側におけ
る各独活性の測定法及びその他物性等の試験法は以下の
通りである。
Ｏウロキナーゼ活性測定
■ 合成基質法；ウロキナーゼサンプルを０．１５Ｍ−
ＮａＣ１及び５９／ｌポリエチレングリコール（ＰＥＧ
６０００ 和光紬薬に、に、） を含む水浴液で適当濃
度に希釈し、その１００μｌに０．１ ＡＩ −ＮａＣ
１を含有する０、０５Ｍ−）リスｔＭ酸綾衝液（ｐＨ＝
８．４） ８００μｌを加え、３７°ＣＳ１分加温後
、こｎに基質Ｓ −２４４４（ＰｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｙ
−Ａｒｙ−ｐ −Ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ、第１化学
薬品社装）の０．３ μＭを上記緩衝液に加えた液１０
０μｌを添加し、３７℃、２分インキュベートする。５
０％酢酸水浴液１００μｌを加えて反応を停止させ、４
０５ｎｍにて吸光度を測定する。標準ウロキナーゼを用
い同様に操作して得らｎた吸光度より、サンプルの活性
を算定する。
ＮａＣ１及び５９／ｌポリエチレングリコール（ＰＥＧ
６０００ 和光紬薬に、に、） を含む水浴液で適当濃
度に希釈し、その１００μｌに０．１ ＡＩ −ＮａＣ
１を含有する０、０５Ｍ−）リスｔＭ酸綾衝液（ｐＨ＝
８．４） ８００μｌを加え、３７°ＣＳ１分加温後
、こｎに基質Ｓ −２４４４（ＰｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｙ
−Ａｒｙ−ｐ −Ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ、第１化学
薬品社装）の０．３ μＭを上記緩衝液に加えた液１０
０μｌを添加し、３７℃、２分インキュベートする。５
０％酢酸水浴液１００μｌを加えて反応を停止させ、４
０５ｎｍにて吸光度を測定する。標準ウロキナーゼを用
い同様に操作して得らｎた吸光度より、サンプルの活性
を算定する。
■ フィブリン平板法；０．３％ フィブリノーゲン（
Ｐｏｖｉｔｅ社製）の０．１ Ｍ−ＮａＣ１加０．０５
Ｍ ベロナールＭ衝液（ｐＨ＝８．０） ６ｍｌ に
、最終０．０２Ｍ ０Ｊ ＣａＣｌ２、最終的３ＮＩＨ
単位／ｍｌ の牛トロンビン（持田鯨某社製）を加え攪
拌後、シャーレ（内径８．５ｃｍ）にまき、フィブリン
平板を詞裟する。０．１％ウサキ血清アルブミン（シグ
マ社製）の上記緩衝液に溶解したウロキナーゼサンプル
の１０μｌを、上記フィブリン平板にスポットし、３７
℃、１６時間インキュベート後、溶解円の径を測定する
。
Ｐｏｖｉｔｅ社製）の０．１ Ｍ−ＮａＣ１加０．０５
Ｍ ベロナールＭ衝液（ｐＨ＝８．０） ６ｍｌ に
、最終０．０２Ｍ ０Ｊ ＣａＣｌ２、最終的３ＮＩＨ
単位／ｍｌ の牛トロンビン（持田鯨某社製）を加え攪
拌後、シャーレ（内径８．５ｃｍ）にまき、フィブリン
平板を詞裟する。０．１％ウサキ血清アルブミン（シグ
マ社製）の上記緩衝液に溶解したウロキナーゼサンプル
の１０μｌを、上記フィブリン平板にスポットし、３７
℃、１６時間インキュベート後、溶解円の径を測定する
。
０５１１基の定に
サンプル１００ ｐ ｌを脱気後、こｒｔ、ｔこ脱気Ｎ
２に換した０、 ２ Ｍ −）リス緩衝液（ｐＨ＝ ８
．２） １ ｍ ｌ を加え、次いで脱気したメタノー
ルに溶解した０、０１Ｍ−５，５’−ジチオビス（２−
二トロ安息香９ ）１００μｌを添加し、攪拌後、室温
にて約３０分数を後、４１２ｎｍの吸光度を測定する。
２に換した０、 ２ Ｍ −）リス緩衝液（ｐＨ＝ ８
．２） １ ｍ ｌ を加え、次いで脱気したメタノー
ルに溶解した０、０１Ｍ−５，５’−ジチオビス（２−
二トロ安息香９ ）１００μｌを添加し、攪拌後、室温
にて約３０分数を後、４１２ｎｍの吸光度を測定する。
２−メルカプトエタノールを標準としてサンプルのＳＨ
基量を換算する。
基量を換算する。
０５１）Ｓ ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）電気泳動 サンプルを４０％グリセロール及び２％ＳＤＳを含有す
る０、０２Ｍ１−リスｔＭ酸綬衝液（ｐＨ＝ ８．（Ｌ
）に等九混合し、１００℃、２分加熱後、１２．５％分
離用ゲル及び４％濃縮用ゲルを用いラヱメ！Ｊ （Ｕ、
Ｋ。
Ｅ）電気泳動 サンプルを４０％グリセロール及び２％ＳＤＳを含有す
る０、０２Ｍ１−リスｔＭ酸綬衝液（ｐＨ＝ ８．（Ｌ
）に等九混合し、１００℃、２分加熱後、１２．５％分
離用ゲル及び４％濃縮用ゲルを用いラヱメ！Ｊ （Ｕ、
Ｋ。
１、ａｅｍｍｌｉ） らの方法［Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏ
ｎｄｏｎ）、 ２２７．６８０（１９７０））及びファ
ルマシア社製グラジェントゲルＰＡＡ４／３０により泳
動させる。泳動後コマージーブリリアントブルー（Ｃ，
Ｂ、 Ｂ、 ）染色し、標準蛋白（モレキュラーウェイ
トキット、ファルマシアネ］装）より分子量を換算する
。
ｎｄｏｎ）、 ２２７．６８０（１９７０））及びファ
ルマシア社製グラジェントゲルＰＡＡ４／３０により泳
動させる。泳動後コマージーブリリアントブルー（Ｃ，
Ｂ、 Ｂ、 ）染色し、標準蛋白（モレキュラーウェイ
トキット、ファルマシアネ］装）より分子量を換算する
。
参考例１ 高分子型ウロキナーゼ重鎮の装造高分子型ウ
ロキナーゼ（日本ケミカルリサーチ社Ｈ）１３０万 単
位（合成基質法による、以下同じ）を含む溶液（０，０
５Ｍ）！Ｊス塩酸緩衝肢、ｐＨ８，０，０，１５λ１Ｎ
ａＣ１及びＯ，０２ＭＥＤＴＡを含有する）２ｍｌに、
窒素置換後、最終濃度か０．０１ＡＩとなるように２−
メルカプトエタノールを加え、窒素気流下、室温で約１
０時間攪拌した。冷却後、４℃下でセファデックスＧ−
２５ファインカラム（ファルマシア社、１．５ｃｍ径Ｘ
１．５ｃｍ長さ）で未反応のメルカプトエタノールを除
いた。カラムの平価化及び溶出には、充分窒素置換した
向上緩衝液を用いた。次いで得らｎた蛋白ピーク画分（
約９ｍｌ ）に、０．０１Ｍ−５，５−ジチオビス（２
−二トロ安息査敲）の同上緩衝液１ｍｌ を加え、室温
下で３０分間攪拌後、ＩＮ−Ｈ（Ｊ でｐＨを７．５に
調整し、４℃下ベンズアミジンーＣＨ−セファロース（
ホルムベルブ（Ｌ、 Ｈｏｌｍｂｅｒｇ） らの方法［
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａ
ｃｔａ、 ４４５．２１５（１９７６）］に準じて作製
した）のカラム（１，５ｃｍ径ＸＪｃｍ長ざ）に吸着さ
せた。同カラムは、窒素置換した０、０５Ｍ−）リス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５，０，４ＭＮａＣ１及び０．０１
ＭＥｌ）ＴＡを含有する）で平衡化及び洗浄し、０．４
ＭＮａＣ１を含む０．１ Ｍ酢酸で溶出した。溶出液の
蛋白ピーク画分を、ダイアフロー限外Ｆ３ｍ膜ＰＭ−１
０（アミコン社製）で濃縮後、窒素置換した０、ＯｌＭ
−リン酸ナトリウム１！ｇ！衝液（ｐＨ８，０，０，１
５ＭＮａＣ１及び０．０１ＭＥＤＴＡを含有する）で４
℃下に透析した。以上の操作により、ジチオニトロベン
ゾニー１・基を付加したウロキナーゼ（活性重鎮）、約
１００万軍位を得た。
ロキナーゼ（日本ケミカルリサーチ社Ｈ）１３０万 単
位（合成基質法による、以下同じ）を含む溶液（０，０
５Ｍ）！Ｊス塩酸緩衝肢、ｐＨ８，０，０，１５λ１Ｎ
ａＣ１及びＯ，０２ＭＥＤＴＡを含有する）２ｍｌに、
窒素置換後、最終濃度か０．０１ＡＩとなるように２−
メルカプトエタノールを加え、窒素気流下、室温で約１
０時間攪拌した。冷却後、４℃下でセファデックスＧ−
２５ファインカラム（ファルマシア社、１．５ｃｍ径Ｘ
１．５ｃｍ長さ）で未反応のメルカプトエタノールを除
いた。カラムの平価化及び溶出には、充分窒素置換した
向上緩衝液を用いた。次いで得らｎた蛋白ピーク画分（
約９ｍｌ ）に、０．０１Ｍ−５，５−ジチオビス（２
−二トロ安息査敲）の同上緩衝液１ｍｌ を加え、室温
下で３０分間攪拌後、ＩＮ−Ｈ（Ｊ でｐＨを７．５に
調整し、４℃下ベンズアミジンーＣＨ−セファロース（
ホルムベルブ（Ｌ、 Ｈｏｌｍｂｅｒｇ） らの方法［
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａ
ｃｔａ、 ４４５．２１５（１９７６）］に準じて作製
した）のカラム（１，５ｃｍ径ＸＪｃｍ長ざ）に吸着さ
せた。同カラムは、窒素置換した０、０５Ｍ−）リス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５，０，４ＭＮａＣ１及び０．０１
ＭＥｌ）ＴＡを含有する）で平衡化及び洗浄し、０．４
ＭＮａＣ１を含む０．１ Ｍ酢酸で溶出した。溶出液の
蛋白ピーク画分を、ダイアフロー限外Ｆ３ｍ膜ＰＭ−１
０（アミコン社製）で濃縮後、窒素置換した０、ＯｌＭ
−リン酸ナトリウム１！ｇ！衝液（ｐＨ８，０，０，１
５ＭＮａＣ１及び０．０１ＭＥＤＴＡを含有する）で４
℃下に透析した。以上の操作により、ジチオニトロベン
ゾニー１・基を付加したウロキナーゼ（活性重鎮）、約
１００万軍位を得た。
得らｎたジチオニＩ・ロベンゾエートイ」加篩分子型ウ
ロキナーゼ重鎮の分子量は、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより３
２０００であった。また該重鎮がジチオニトロベンゾエ
ート基を付刃ｌさｎていることは、５．５−ジチオ−ビ
ス（２−二トロ安息査１ＩＪ２）を作用させた際１こ副
生ずる５−メルカプト−２−二トロ安息香酸の量を画定
することにより確認さ７’したし４例２ プラスミン重
鎮の製造 ヒト血液より精製したプラスミノーゲン３００ｍｙを０
゜ＩＭ−ＮａＣ１及び２５％クリセロールを含有するｌ
）、０５八１−トリス壇酸に両液（ｐＨ＝ ７．８ ）
６０ｍ１に溶解し、ウロキナーゼ１８１１ Ｃ１０単
位を添加し、２５℃で８時開インキュベートする。更に
９０００ 単位のウロキナーゼを添加して２５℃で１６
時間インキュベートした。この溶液にｐ−ニトロフェニ
ル−ｐ−クアニジノベンゾエ−）ｔ［塩３ｊｍｙを０．
４ｍ／のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ） ｉ
こ溶かした溶液を加え、３７℃で１ｏ分間攪拌した後、
屋素置換し、２−メルカプトエタノールを鯉終ｏ、１ｍ
ｍ度となるよるに添加し、２０℃で２０分間攪拌した。
ロキナーゼ重鎮の分子量は、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより３
２０００であった。また該重鎮がジチオニトロベンゾエ
ート基を付刃ｌさｎていることは、５．５−ジチオ−ビ
ス（２−二トロ安息査１ＩＪ２）を作用させた際１こ副
生ずる５−メルカプト−２−二トロ安息香酸の量を画定
することにより確認さ７’したし４例２ プラスミン重
鎮の製造 ヒト血液より精製したプラスミノーゲン３００ｍｙを０
゜ＩＭ−ＮａＣ１及び２５％クリセロールを含有するｌ
）、０５八１−トリス壇酸に両液（ｐＨ＝ ７．８ ）
６０ｍ１に溶解し、ウロキナーゼ１８１１ Ｃ１０単
位を添加し、２５℃で８時開インキュベートする。更に
９０００ 単位のウロキナーゼを添加して２５℃で１６
時間インキュベートした。この溶液にｐ−ニトロフェニ
ル−ｐ−クアニジノベンゾエ−）ｔ［塩３ｊｍｙを０．
４ｍ／のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ） ｉ
こ溶かした溶液を加え、３７℃で１ｏ分間攪拌した後、
屋素置換し、２−メルカプトエタノールを鯉終ｏ、１ｍ
ｍ度となるよるに添加し、２０℃で２０分間攪拌した。
その後水冷し、あらかじメ窒ｙｔｔ−ｍシタｏ、２Ｍ−
ＮａＣ１，０，０１Ｍ−ＥＤＴＡ 及び０．００１八１
−２−メルカプトエタノールを含有する０、０１Ｍ−リ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．２）で充分に平衡イ
ｂしたリジンセファロースカラム（錦−化学菓品株式会
社製、５ｃｍ径Ｘ１５ｃｍ長さ）に付し、同緩衝液で洗
浄し、続いて０．００１Ｍ＝６−アミツヘキサ７１９．
０．１５Ｍ−ＮａＣ１，０，０１Ｍ−ＥＤＴＡ及ｐ ０
．００１Ｍ −２−メルカプトエタノールを含む０．０
１Ｍ−！Ｊン酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ＝７．２）テ洗
浄シタ後、０．００３Ｍ−６−７ミ／ヘキサン酸を含む
同緩衝液で溶出し、２８０ｎｍでの吸光度のピーク画分
を集め、アミコンＰＭ−１０限外濾過膜（アミコン社製
）にて、窒素加圧下に５０ｍ１ まで濃縮した。１ａ縮
液をあらかじめ窒素置廓した０、１５Ｍ−ＮａＣ１及び
０．０１Ｍ−ＥＤＴＡを含む０．０１Ｍ−リン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ＝ ７．２ ）で平衡化したセファデ
ックスＧ−２５カラム（ファルマシア社、５ｃｍ径Ｘ２
０ｃｍ長さ）に付し、同緩衝液で溶出した。２８０ｎｍ
での吸光度のピーク画分を集め、アミコン社製（−１０
限外−濾過膜にて窒素加圧下にｉｆｆし、約１００ｍｇ
のプラスミン重鎮を得る。このものは１モル当り約３モ
ルのＳＨ基が検出さｎた。
ＮａＣ１，０，０１Ｍ−ＥＤＴＡ 及び０．００１八１
−２−メルカプトエタノールを含有する０、０１Ｍ−リ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．２）で充分に平衡イ
ｂしたリジンセファロースカラム（錦−化学菓品株式会
社製、５ｃｍ径Ｘ１５ｃｍ長さ）に付し、同緩衝液で洗
浄し、続いて０．００１Ｍ＝６−アミツヘキサ７１９．
０．１５Ｍ−ＮａＣ１，０，０１Ｍ−ＥＤＴＡ及ｐ ０
．００１Ｍ −２−メルカプトエタノールを含む０．０
１Ｍ−！Ｊン酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ＝７．２）テ洗
浄シタ後、０．００３Ｍ−６−７ミ／ヘキサン酸を含む
同緩衝液で溶出し、２８０ｎｍでの吸光度のピーク画分
を集め、アミコンＰＭ−１０限外濾過膜（アミコン社製
）にて、窒素加圧下に５０ｍ１ まで濃縮した。１ａ縮
液をあらかじめ窒素置廓した０、１５Ｍ−ＮａＣ１及び
０．０１Ｍ−ＥＤＴＡを含む０．０１Ｍ−リン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ＝ ７．２ ）で平衡化したセファデ
ックスＧ−２５カラム（ファルマシア社、５ｃｍ径Ｘ２
０ｃｍ長さ）に付し、同緩衝液で溶出した。２８０ｎｍ
での吸光度のピーク画分を集め、アミコン社製（−１０
限外−濾過膜にて窒素加圧下にｉｆｆし、約１００ｍｇ
のプラスミン重鎮を得る。このものは１モル当り約３モ
ルのＳＨ基が検出さｎた。
実施例１
参考例１で得たウロキナーゼ重鎮約、１００万単位（８
ｍｌ溶液）を、参考例２で得たプラスミン重１１１２４
ｍｙ（約５ ｍ ｌ ｓあらかじめｌＮ−ＮａＯＨでｐ
ＩＩＢに調１１）と混合し、窒素置換後、窒素気流下、
室温で４時間撹拌した。次いでＮ−エチルマレイミドを
電＆１根度が１ｍＭ となるように添加し、更に２０分
間攪拌後、反応液をダイア７０−限外Ｆ８膜Ｆｉｌ−１
０で濃縮した。濃縮液をセファデックス・Ｇ１５０−ス
ーパーファインカラム（ファルマシア社、２．６ｃｍ径
Ｘ９２ｃｍ長さ）でゲル濾過した。同カラムは０．０１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５，０，５ＭＮａ
Ｃｌ！含有）にて平衡化及び溶出した。浴出液を３ｍｌ
ずつ分画し、その酵素活性を、Ｓ−２４４４（カビ社
製、スエーデン）を基質として前記合成基質法に従い測
定した。分子１１１９〜１０万付近と考えらｎる活性ピ
ーク画分を混合し、ダイア７０−限外濾過膜ＰＭ−１０
で鎖線し、同股上で内液緩衝液組成をリン酸塩緩衝化生
理食塩水に一模した。上記の方法により本発明複合体約
１２万単位（＊準つロキナーゼと合成基質法で比較した
国際単位）を得た。
ｍｌ溶液）を、参考例２で得たプラスミン重１１１２４
ｍｙ（約５ ｍ ｌ ｓあらかじめｌＮ−ＮａＯＨでｐ
ＩＩＢに調１１）と混合し、窒素置換後、窒素気流下、
室温で４時間撹拌した。次いでＮ−エチルマレイミドを
電＆１根度が１ｍＭ となるように添加し、更に２０分
間攪拌後、反応液をダイア７０−限外Ｆ８膜Ｆｉｌ−１
０で濃縮した。濃縮液をセファデックス・Ｇ１５０−ス
ーパーファインカラム（ファルマシア社、２．６ｃｍ径
Ｘ９２ｃｍ長さ）でゲル濾過した。同カラムは０．０１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５，０，５ＭＮａ
Ｃｌ！含有）にて平衡化及び溶出した。浴出液を３ｍｌ
ずつ分画し、その酵素活性を、Ｓ−２４４４（カビ社
製、スエーデン）を基質として前記合成基質法に従い測
定した。分子１１１９〜１０万付近と考えらｎる活性ピ
ーク画分を混合し、ダイア７０−限外濾過膜ＰＭ−１０
で鎖線し、同股上で内液緩衝液組成をリン酸塩緩衝化生
理食塩水に一模した。上記の方法により本発明複合体約
１２万単位（＊準つロキナーゼと合成基質法で比較した
国際単位）を得た。
得ら几た複合体の分子量は、ＳＤＳ ＰＡＧＥで約９〜
１０万であった。またこの複合体を再び還元状態に戻し
、ＳＤＳ処理後箪気泳動さぜると、約６万の分子量を有
するバンドと約３万の力子社を有するバンドとが出現し
た。こｎらのことから上記複合体は、高分子型ウロキナ
ーゼ重鎮とプラスミン重鎮とが１対ｌのモル比でＳ −
５結合したものであると同定さｎる。
１０万であった。またこの複合体を再び還元状態に戻し
、ＳＤＳ処理後箪気泳動さぜると、約６万の分子量を有
するバンドと約３万の力子社を有するバンドとが出現し
た。こｎらのことから上記複合体は、高分子型ウロキナ
ーゼ重鎮とプラスミン重鎮とが１対ｌのモル比でＳ −
５結合したものであると同定さｎる。
く薬理試験〉
（１）フィブリン溶解活性試験
（イ）実施例１で得た複合体につき、フィブリン平板法
により、その溶解活性を測定した。結果を第１図に示す
。
により、その溶解活性を測定した。結果を第１図に示す
。
第１図中、ヨコ軸は合成基質法により測定したウロキナ
ーゼ活性（単位／ｍｌ） を、タテ軸は不法によるフィ
ブリン俗解活性（俗解円 直径、ｍｍ ）を示す。また
第１図において線（１）は本発明複合体を、また線（２
）はＨＭ Ｗ −Ｕ Ｋ （コントロール）をそｎぞｎ
示す。
ーゼ活性（単位／ｍｌ） を、タテ軸は不法によるフィ
ブリン俗解活性（俗解円 直径、ｍｍ ）を示す。また
第１図において線（１）は本発明複合体を、また線（２
）はＨＭ Ｗ −Ｕ Ｋ （コントロール）をそｎぞｎ
示す。
該図より本発明の複合体は、コントロールとするＩＩん
ＩＷ−ＬＩＫに比し順名に優几たフィブリン溶解活性を
保持していることが明らかである。
ＩＷ−ＬＩＫに比し順名に優几たフィブリン溶解活性を
保持していることが明らかである。
またヒト血痕よりｂｌ、 Ｍｏｒｏｉ等の方法［Ｊ、
Ｂｉｏｌ。
Ｂｉｏｌ。
Ｃ１＋ｅｍ、 、２５１．５９５６ （１９７６月に従
って得たプラスミンインヒビタ−を、サンプル０．５ｍ
ｊ？に対して０．５ｒｎｌ加え、該プラスミンインヒビ
タ−の存在下に１一様な溶解活性試験を行った結果、い
ず九のサンプルも溶解活性が低下するが本発明複合体は
プラスミンインヒビタ−の存在下でも、上ｄｄと同様に
コントロールとするウロキナーゼよりも優ｎたフィブリ
ン溶解活性を奏することが１７１１誌さｎた。
って得たプラスミンインヒビタ−を、サンプル０．５ｍ
ｊ？に対して０．５ｒｎｌ加え、該プラスミンインヒビ
タ−の存在下に１一様な溶解活性試験を行った結果、い
ず九のサンプルも溶解活性が低下するが本発明複合体は
プラスミンインヒビタ−の存在下でも、上ｄｄと同様に
コントロールとするウロキナーゼよりも優ｎたフィブリ
ン溶解活性を奏することが１７１１誌さｎた。
（２） フィブリン吸着能試験
実施例１で得た季発明複合体のフィブリン結合能を下記
方法により試験した。即ちフィブリン−モノマー−セフ
ァロース６Ｂ （ハーネ（Ｄ、 Ｌ。
方法により試験した。即ちフィブリン−モノマー−セフ
ァロース６Ｂ （ハーネ（Ｄ、 Ｌ。
Ｉ（ｅｅｎｅ） らの方法［Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ、 ２，１３７（１９７３）］に早じて
作成した）の３ｍｌ を充填したカラムを０．１３５Ｍ
ＮａＣ１を含有する０、００５ＡＩリン酸ナトリウム塩
緩衝液（ｐＨ＝ ７．４ ）で平衡化後、上起絃衝液に
溶解した不発１１１ｊ複貧体、ＨｌｌｉＷ−ＵＫ。
ｅ５ｅａｒｃｈ、 ２，１３７（１９７３）］に早じて
作成した）の３ｍｌ を充填したカラムを０．１３５Ｍ
ＮａＣ１を含有する０、００５ＡＩリン酸ナトリウム塩
緩衝液（ｐＨ＝ ７．４ ）で平衡化後、上起絃衝液に
溶解した不発１１１ｊ複貧体、ＨｌｌｉＷ−ＵＫ。
プラスミノーゲン又はプラスミン重１（各２〜３ｍｙ）
をアプライし、上記鞍褐肢３０ｍ１にて洗浄した。１０
ｍＭ−６−アミツヘキサン叡を金材する上記緩衝液にて
浴出し、プラスミノーゲン及びプラスミン重鎮は、溶出
画分の２８０ｎｍ４こおける吸収より、又本発明複合体
及びＨＭＷ−（ＪＫは、溶出画分のウロキナーゼ活性を
合成基質法により測冗した活性より、夫々の溶出画分へ
の回収率をへこれをフィブリン吸着能とした。
をアプライし、上記鞍褐肢３０ｍ１にて洗浄した。１０
ｍＭ−６−アミツヘキサン叡を金材する上記緩衝液にて
浴出し、プラスミノーゲン及びプラスミン重鎮は、溶出
画分の２８０ｎｍ４こおける吸収より、又本発明複合体
及びＨＭＷ−（ＪＫは、溶出画分のウロキナーゼ活性を
合成基質法により測冗した活性より、夫々の溶出画分へ
の回収率をへこれをフィブリン吸着能とした。
上記試験の結果、本発明複合体は、俊ｎたフィブリン吸
５１ｔ能を示した。
５１ｔ能を示した。
第１図は、本発明複合体のフィブリン溶解活性を示す図
面である。 （以上）
面である。 （以上）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ■ 高分子型ウロキナーゼの重鎮とプラスミンの重鎮と
がＳ−８結合により結合さｎていることを特徴とするフ
ィブリン吸着性ウロキナーゼ複合体０ （８）高分子型ウロキナーゼの重鎮とプラスミンの重鎮
とをＳ−８交換反応により結合させることを特徴とする
フィブリン吸着性ウロキナーゼ複合体の製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58251990A JPS60136520A (ja) | 1983-12-23 | 1983-12-23 | フイブリン吸着性ウロキナ−ゼ複合体 |
| US06/683,024 US4545988A (en) | 1983-12-23 | 1984-12-18 | Urokinase-plasmin complex adsorbable by fibrin and process for preparing same |
| EP84116127A EP0151308B1 (en) | 1983-12-23 | 1984-12-21 | Urokinase complex adsorbable by fibrin and process for preparing same |
| DE8484116127T DE3471004D1 (en) | 1983-12-23 | 1984-12-21 | Urokinase complex adsorbable by fibrin and process for preparing same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58251990A JPS60136520A (ja) | 1983-12-23 | 1983-12-23 | フイブリン吸着性ウロキナ−ゼ複合体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60136520A true JPS60136520A (ja) | 1985-07-20 |
| JPH0365151B2 JPH0365151B2 (ja) | 1991-10-09 |
Family
ID=17231006
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58251990A Granted JPS60136520A (ja) | 1983-12-23 | 1983-12-23 | フイブリン吸着性ウロキナ−ゼ複合体 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4545988A (ja) |
| EP (1) | EP0151308B1 (ja) |
| JP (1) | JPS60136520A (ja) |
| DE (1) | DE3471004D1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60252422A (ja) * | 1983-12-24 | 1985-12-13 | ビーチャム・グループ・ピーエルシー | ハイブリツド蛋白質、その製法及びそれを含む医薬組成物 |
| JPH0627702U (ja) * | 1992-09-07 | 1994-04-12 | 有限会社佐野機工 | ごみ等の収納容器 |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4880776A (en) * | 1983-12-24 | 1989-11-14 | Beecham Group P.L.C. | Plasmin A-chain urokinase B-chain hybrid protein |
| GB8609948D0 (en) * | 1986-04-23 | 1986-05-29 | Beecham Group Plc | Compounds |
| GB8400653D0 (en) * | 1984-01-11 | 1984-02-15 | Beecham Group Plc | Conjugates |
| US5256413A (en) * | 1985-01-08 | 1993-10-26 | The General Hospital Corporation | Method and use for site-specific activation of substances |
| US5204255A (en) * | 1986-01-31 | 1993-04-20 | Sagami Chemical Research Center | Hybrid tissue plasminogen activator/urokinase polypeptides |
| DE3781420T2 (de) * | 1986-01-31 | 1993-02-25 | Sagami Chem Res | Hybrides plasminogenaktivatoraehnliches polypeptid. |
| US5302390A (en) * | 1987-07-01 | 1994-04-12 | Beecham Group Plc | Hybrid proteins of human plasminogen and human t-PA, pharmaceutical compositions and methods of treatment |
| US5582862A (en) * | 1988-04-04 | 1996-12-10 | General Hospital Corporation | Antibodies that bind to α2-antiplasmin crosslinked to fibrin which do not inhibit plasma α2-antiplasmin |
| US5372812A (en) * | 1988-04-04 | 1994-12-13 | The General Hospital Corporation | Composition and method for acceleration of clot lysis |
| US5811265A (en) * | 1988-08-19 | 1998-09-22 | The General Hospital Corporation | Hybrid immunoglobulin-thrombolytic enzyme molecules which specifically bind a thrombus, and methods of their production and use |
| US5609869A (en) * | 1988-08-19 | 1997-03-11 | The General Hospital Corporation | Hybrid immunoglobulin-thrombolytic enzyme molecules which specifically bind a thrombus, and methods of their production and use |
| US4892826A (en) * | 1988-10-11 | 1990-01-09 | Abbott Laboratories | Process for the preparation of urokinase derivatives |
| DE3900649A1 (de) * | 1989-01-11 | 1990-07-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur abloesung eines analyten von seinem bindeprotein |
| EP0937146A2 (en) * | 1996-09-20 | 1999-08-25 | The General Hospital Corporation | Composition and method for enhancing fibrinolysis using antibodies to alpha-2-antiplasmin |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3926727A (en) * | 1971-09-24 | 1975-12-16 | Choay Sa | Urokinase preparations |
| US4082612A (en) * | 1976-09-24 | 1978-04-04 | Michael Reese Research Foundation | Plasminogen activator complex |
| NZ191320A (en) * | 1978-09-07 | 1982-09-14 | Beecham Group Ltd | In vivo fibrinolytic enzyme having active site blocked by hydrolytically removable group pharmaceutical compositions |
| US4272506A (en) * | 1979-08-31 | 1981-06-09 | Syva Company | Purification of reagents by disulfide immobilization |
| US4418052A (en) * | 1980-08-12 | 1983-11-29 | Wong Dennis W | Diagnostic compositions and method for radiologic imaging of fibrinogen deposition in the body |
| US4536391A (en) * | 1982-11-17 | 1985-08-20 | Otsuka Pharmaceutical Co. | Process for preparing urokinase complex |
-
1983
- 1983-12-23 JP JP58251990A patent/JPS60136520A/ja active Granted
-
1984
- 1984-12-18 US US06/683,024 patent/US4545988A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-12-21 EP EP84116127A patent/EP0151308B1/en not_active Expired
- 1984-12-21 DE DE8484116127T patent/DE3471004D1/de not_active Expired
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60252422A (ja) * | 1983-12-24 | 1985-12-13 | ビーチャム・グループ・ピーエルシー | ハイブリツド蛋白質、その製法及びそれを含む医薬組成物 |
| JPH0627702U (ja) * | 1992-09-07 | 1994-04-12 | 有限会社佐野機工 | ごみ等の収納容器 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0151308A2 (en) | 1985-08-14 |
| DE3471004D1 (en) | 1988-06-16 |
| JPH0365151B2 (ja) | 1991-10-09 |
| EP0151308A3 (en) | 1986-12-17 |
| EP0151308B1 (en) | 1988-05-11 |
| US4545988A (en) | 1985-10-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS60136520A (ja) | フイブリン吸着性ウロキナ−ゼ複合体 | |
| US20210113657A1 (en) | Gla domains as targeting agents | |
| US5308617A (en) | Protein heparin conjugates | |
| ES2434032T3 (es) | Compuestos de FVIIA diméricos y multiméricos | |
| JPH02501305A (ja) | 改良された体組織結合特異性を有する薬剤活性抱合体 | |
| JPH05508664A (ja) | リン脂質標的血栓溶解剤 | |
| US5023078A (en) | Plasminogen activator-heparin conjugates | |
| DePoli et al. | Thrombospondin interaction with plasminogen. Evidence for binding to a specific region of the kringle structure of plasminogen | |
| JP2010540432A (ja) | ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベータの精製方法 | |
| JPS61122224A (ja) | 部位選択性プラスミノ−ゲン活性化因子及びその製造方法 | |
| AU625283B2 (en) | New fibrinolytic enzymes, methods for their production and pharmaceutical compositions containing them | |
| JPS6360938A (ja) | 修飾組織型プラスミノ−ゲン活性化因子およびその製造方法 | |
| JPH0892294A (ja) | ヒト活性化プロテインｃ誘導体 | |
| EP0414828A1 (en) | Process for the preparation of urokinase derivatives | |
| JPS60184026A (ja) | 組織プラスミノ−ゲン・アクチベ−タ−の溶解補助方法 | |
| Blomback | Fibrinogen and fibrin formation and its role in fibrinolysis | |
| JPH0249708B2 (ja) | ||
| JPH03500125A (ja) | プロウロキナーゼの低分子量誘導体及び該誘導体を含有する薬剤組成物 | |
| JPH01279898A (ja) | 第ｘ３因子のアフイニテイクロマトグラフイーによる精製法 | |
| Hopmeier et al. | Zinc modulates thrombin adsorption to fibrin | |
| JPH0521551B2 (ja) | ||
| JPS60174727A (ja) | 新規なプラスミノ−ゲン・アクチベ−タ−の安定化方法 | |
| JPS62108824A (ja) | 新規なウロキナ−ゼ重合体及び該重合体を有効成分とする血栓溶解剤 | |
| JPH0471486A (ja) | フィブリン溶解活性蛋白質複合体 | |
| JPS60158116A (ja) | 新規なプラスミノ−ゲン・アクチベ−タ−およびその製法ならびにこれを含有する薬剤 |