JPH05508664A - リン脂質標的血栓溶解剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リン脂質標的血栓溶解剤 本明細書中に記載の研究はその一部を国立健康協会からの助成金の援助に依った ものである。政府は本発明の権利をその範囲内で有するものである。 技術分野 本発明は、リン脂質親和性ならびにフィブリン凝塊溶解性を有する接合体および 薬理組成物に関するものである。また本発明は、フィブリン凝塊に関連した疾病 を治療するための方法ならびに養生治療法に関するものである。 背景技術 フィブリン沈着物は、破裂アテローム硬化性斑を含めた血管損傷部に形成される 。フィブリン形成を起こすその初期においては、組織因子と循環因子ＶＩＩ／Ｖ ＩＩａとの接触により引き起こされる付帯的な凝固経路の活性化が起こる。組織 因子は血管の外側ならびにアテローム硬化性斑内に存在する膜結合調整蛋白であ る。組織因子が血管損傷または斑破裂によって血液中に混入すると、それはＣａ ”＋の存在下に因子ＶＩＩ／ＶＩＩａと結合する。組織因子と因子ＶＩＩ／ＶＩ Ｉａとの接合体は因子Ｘを活性化して因子Ｘａとし、そして因子Ｘａは次に因子 Ｖａ、リン脂質およびＣａ”の存在下にプロトロンビンを活性化してトロンビン にする。こうして出来たトロンビンは可溶性フィブリノーゲンを凝塊として沈着 する不溶性フィブリンに変える。 組織因子と因子ＶＩＩ／ＶＩＩａとの接合体は因子Ｘを活性化するのみならず因 子ＩＸを活性化して因子ＩＸａを形成する。因子ＩＸａは、リン脂質、因子ＶＩ ＩＩａおよびＣａ”＋の存在下に因子Ｘを活性化する。 フィブリノーゲンをフィブリンに変える反応以外の反応は、その最適触媒作用に フォスファチジルセリン（Ｐ　Ｓ）の様な負に帯電したリン脂質を必要として不 溶性リン脂質の表面において進行しフィブリン凝塊を局所的に形成する。したが ってフィブリン凝塊のほとんどの成分は不溶性フィブリン、リン脂質および前記 の活性化された凝固因子である。 試験管内で著しいトロンボゲン形成性を示すフォスファチジルセリンは普通赤血 球および血小板中の血しょう膜の外面には存在しない。この不均衡は活性な移送 機序によって維持されている。この不均衡なＰＳの分布は血小板の活性化によっ て変えられモしてＰＳは血しょう膜の外面に出されるようになると考えられてい る。この様な位置替えによってプロトロンビナーゼ接合体の形成のための負に帯 電したリン脂質が形成されそしてまたそれによって凝固系におけるその他のリン 脂質依存性の反応が活性化される。 ガンマ−カルボキシグルタミン酸残基（因子Ｘ、ＩＸ、ＶＩＩおよびプロトロン ビン）を含む凝固因子はＣａ”の存在下に１Ｏ−６から１０−ＴＭの範囲の結合 係数をもって負に帯電したリン脂質と結合する。生体内での血液凝固を起こす負 に帯電したリン脂質の主な源は血小板血しょう膜であると考えられている。事実 、因子Ｘａは活性化された血小板の表面に結合しそこで血小板結合因子Ｖａと接 合体（プロウロキナーゼ）を形成してプロトロンビンを活性化する。 セリンプロテアーゼであるプラスミンはフィブリン溶解をを起こす唯一の血しょ う酵素である。　これは前駆体プラスミノーゲンとして血液中を循環する。プラ スミノーゲンは一本鎖ポリペプチドであって、プラスミノーゲン活性化因子によ って二本鎖活性形であるプラスミンに変えられる。プラスミンはジスルフィド結 合によって結合されたＮＨ２末端末端鎖とＣ００Ｈ−末端Ｂ−鎖とから成る。Ａ −鎖は５つの特徴的な反復単位（クリングル領域）を含有し、そして一方Ｂ−鎖 はセリン−プロテアーゼ触媒単位を含む。第一のクリングルから第四のクリング ルまでの領域はフィブリノーゲンに結合し、循環しているプラスミノーゲンの幾 らかは凝塊が形成されるときにフィブリンと一緒に沈殿する。蛋白分解的に分解 されるプラスミノーゲン（Ｌｙｓ−プラスミノーゲン）は完全プラスミノーゲン （Ｇ　ｌ　ｕ−プラスミノーゲン）よりもフィブリン凝塊に対する親和性がより 高く、従ってフィブリン凝塊の溶解を促進する。 プラスミノーゲンのフィブリン結合部は第一および第四のクリングル領域に局在 している。 組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）およびウロキナーゼ（ｕＰＡ）は プラスミノーゲンの２つの生理的活性化因子である。両方の活性化因子は一本鎖 チモーゲンとして合成されそして二本鎖活性形に変換される。ｔＰＡは内皮細胞 中で主として合成されそして有る種の刺激に応答して血流中に放出される膜結合 蛋白である。ｔＰＡの血流中への分泌は付帯的なフィブリン溶解の引き金となる 。ｔＰＡのＮＨ，末端鎖は指領域と成長因子様領域と２つのクリングル領域とを 含有している。 第２のクリングル領域は１．６Ｘ１０−’Ｍのフィブリン凝塊に対する結合親和 性（Ｋｄ、これは結合定数または親和性定数としても知られている）を有してい る。フィブリン結合プラスミノーゲンに対するｔＰＡの触媒効率は循環プラスミ ノーゲンに対するそれよりもよりも約１，０００倍も高い。 ウロキナーゼの前駆体であるプロウロキナーゼ（一本鎖ウロキナーゼまたは５ｃ ｕＰＡ）は低い濃度で血液中に存在する。プロウロキナーゼは血しょうカリクレ インおよびプラスミンによって活性化されて内在性のフィブリン溶解作用を刺激 する。５ｃｕＰＡはクリングル領域を持ってはいるが、これはフィブリン凝塊に 対する結合親和性をほとんど示さない。しかしながら、これは遊離のプラスミノ ーゲンよりもフィブリン結合プラスミノーゲンの方をより効率的に加水分解する 。 細菌性蛋白であるストレプトキナーゼ（ＳＫ）はプラスミノーゲンと化学量論的 接合体を形成し、これはプラスミノーゲンをプラスミンに変換する。 フィブリン溶解性剤であるｔＰＡＳｕＰＡ、５ｃｕＰＡおよびＳＫは血栓症の患 者を治療するための治療剤として使われている。これらの薬剤はかなりの効果を 示すが、循環系中での半減期が短くまた全身系のフィブリノーゲン溶解の原因と なる性質があるなどの問題点がある。例えば、フィブリンに対する結合親和性が 比較的不十分であることや循環フィブリノーゲンとの交差結合性の可能性のある ことなどから大量のｔｐＡを投与しなければならず、このため著しいフィブリノ ーゲン溶解の原因ともなる。 上記の治療用蛋白類を先に述べた問題点を克服するために変性することが行われ てた。その改良のために使用した方法は次のようなものである。その分子を循環 禁止剤に耐性のある様にすること、フィブリン凝塊との結合親和性を強化するこ と、およびプラスミノーゲン活性化因子をフィブリン凝塊に特異性のある抗体と 接合してフィブリン沈着物への標的性を持たせることなどである。 アシル化プラスミノーゲン／ＳＫ　（ＡＰＳ）はＳＫよりも高いフィブリン選択 性を持っ′ている。 このＡＰＳ接合体は活性部位のセリン残基のヒドロキシル基がブロックされてい るためα、−プラスミン禁止剤によって不活性化されることはない。ＡＰＳはフ ィブリン凝塊と結合しそのアシル基はゆっくりと分解されて活性形を生成する。 ＡＰＳの半減期は非変性親分子のそれよりも著しく長い。 重鎮中の成長因子およびクリングル領域のない不完全な５ｃｕＰＡ（ｌないし１ ４３残基の欠失したもの）を発現することが行われていた。 この分子はその完全形とおなしフィブリン選択性を持っているがプラスミノーゲ ン活性化因子禁止剤−１（ＦＡＩ−１）によって阻害されない。 部位特定変異誘発によりＦＡＩ−１との結合部位（２９６ないし３０２残基）の 欠失した変性ｔＰＡを発現させることも行われていた。この分子は原ｔＰＡと同 じ酵素活性を有するが循環血液中のＦＡＩ−１やその他のセルピンによる阻害に 対して強力な抵抗性を有していた。 プラスミノーゲンのフィブリン結合領域（Ａ−鎖）とウロキナーゼの触媒領域と を結合したキメラ分子はウロキナーゼよりも８倍高いフィブリン凝塊にたいする 親和性を有していた。またこれはフィブリンモノマーに対するより高い触媒活性 を有していた。 プラスミノーゲンのＡ−鎖とｔＰＡの触媒領域とからなるキメラ分子はプラスミ ノーゲンと同じフィブリンとの結合親和性と原ｔＰＡと同じ触媒活性とを有して いた。 フィブリンのベーター鎖に特異的なネズミモノクロナール抗体をジスルフィド架 橋剤を使用してｔＰＡまたは５ｃｕＰＡの触媒鎖と接合させることが行われた。 これらの抗体は２ＸｌＯ−’Ｍ位位置度解離定数を有する。この抗体／ｌＰＡ接 合体はフィブリンモノマーの溶解において原ｔＰＡよりも１０倍活性が高かった 。抗体／ウロキナーゼ接合体はウロキナーゼよりも１０００倍高い活性を示した 。 抗凝固活性を有する幾つかの蛋白をヒト胎盤から単離することが行われた。これ らの蛋白はりポコルチン／アネキシン族の一員であることがわかり、そして今日 化にこの族の８員の蛋白が意図されたたくさんの色々な機能を持つ物として色々 な組織および培養細胞から単離されている。 これらの蛋白は慣用名として「アネキシンノと呼ばれている。全てのアネキシン は陰イオン性リン脂質とのカルシラン依存性の結合性を共有している。（船越ら 、ＢｉｏｃｈｅＩｌ、（１９８７ａ）、　２６．５５７２−５５７８；タイト（ Ｔａｉｔ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８８）　２７．６２６８−６２７６； 　ｏミック、（Ｒ（ｏｎｉｓｈｅ）およびバインバーガー（Ｈｅｉｍｂｕｒｇｅ ｒ）、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　Ｈｏｐｐ−３ｅｙｌｅｒ　（１９９０）、　３ ７１゜３８３−３８８゜） アネキシンＶ（これはＰＡＰ−１としても知られている）はこの族の主要な成分 であり胎盤から単離される。これは１個の遊離スルフォニル基を持ちそして結合 炭水化物鎖を持たない。そのｃＤＮＡ配列から推論したアネキシンＶの１次構造 によれば、アネキシンＶは４個の内在反復単位（各単位は６０ないし８０個のア ミノ酸残基を持つ）から成る。 （ＥＰ　ＡＯ２７９４５９：米国特許４．９３７．３２４．船越ら、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、　（１９８７ｂ）、　２６．８０８７−８０９２゜）アネキシンのなかで もアネキシンＶは血しょうおよび細胞外液（１，２ｍＭイオン化カルシウム、０ ．１５Ｍイオン強度）に相当する条件下において８０％のフォスファチジルコリ ン（Ｐ　Ｃ）と２０％のＰＳとを含むリン脂質小胞との最強の親和性（Ｋｄ＜１ ０−０−１ｏを有する。アネキシンは２個の負の帯電基を担持するリン脂質であ るＰＳおよびフォスファチジン酸（Ｐ　Ａ）を含む膜に対して強い親和性を示す 。 （タイトおよびギブリン（Ｇｉｂｓｏｎ）　（１９９０）、　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓ　Ｌｉｐｏｃｏｒｔｉｎ　Ｉｎｆｌａｍ、Ｄｉｆｆ、、　１７３−１８１ペー ジ。）その結合は可逆的であり完全にカルシラン依存性である。 アネキシンＶはヒト血小板に結合する。刺激をされていない血小板は少数の結合 部位を発現するが、結合部位の数は有る種の血小板作動薬により著しく増加する （たとえば、トロンビンとコラーゲンとの組合せにより約１５ないし２０倍）。 トロンビンとコラーゲンとによる刺激の結果血小板１個当たり約ｔｏｏ、ｏｏｏ 個の結合部位となる。この結合部位は７ｎＭの見掛は解離定数（Ｋｄ）を有する 。この結合はカルシウム依存性であり可逆的でありそしてＢＳ−含有小胞によっ て完全に阻害される。アネキシンＶはまた血小板表面からすでに結合した因子Ｘ ａを除去することが出来る。（チアガラジャン（Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ）およ びタイト、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　（１９９０）　１６５．１７４２０ −１７４２３．　）アネキシンＶはリン脂質を含む凝固系における活性化反応の 全てを阻害する。これらの反応を触媒するために、ガンマ−カルボキシグルタミ ン酸含有凝固因子がＣａ”＋の存在下に負に帯電したリン脂質に結合する。 ガンマ−カルボキシグルタミン酸含有凝固因子のリン脂質に対する解離定数は１ ０−’ないし１０−’Ｍの範囲であり、これはアネキシン■のそれよりも３ない し４桁程弱いものである。（本発明の目的のためには、より大きな解離定数をも つものはまたより大きなモル数値をもつものであり、従って１０−”Ｍの定数は １０−”　Ｍの解離定数よりも大きい。しかしながらもちろん本発明においては 、１０−１″Ｍの解離定数は１０−＠Ｍの定数よりもより大きな結合性を表すも のである。）アネキシンＶの阻害機序は陰イオン性リン脂質と結合する凝固因子 に競合するものである。 ヒト血しょうおよび血液と接しているヒト細胞中のアネキシンＶのレベルを親和 性精製ウサギ抗血清を使用してＥＬＩＳＡにより測定した。 アネキシンＶは血小板、内皮細胞および白血球中に細胞外に存在するが、赤血球 中には存在しない。アネキシンＶは本来健康なヒト血しょう中には存在せず細胞 の損傷や死滅により放出される。（フラヘルテイ（Ｆｌａｈｅｒｔｙ）　ら、Ｊ 、Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、（１９９０）　１１５．　１７４−１８１． 　）フィブリン溶解剤を更に改良するためには血栓にたいする結合親和性のより 高いものが望まれる。アネキシン■の負に帯電したリン脂質に対する親和性はｔ ＰＡのフィブリンに対するそれよりも約５０倍強くまたフィブリン特異性抗体の それよりも１０ないし１００倍強い。 本発明の目的は血栓溶解に有用なアネキシンープラスミノーゲン活性化剤接合体 を提供することである。 本発明の他の目的はアネキシンープラスミノーゲン活性化剤接合体をを製造する 方法を提供することである。 また本発明の他の目的は血栓症を原因とする疾病を治療するためのアネキシンー プラスミノーゲン活性化剤接合体からなる治療組成物ならびにそれを使用した治 療方法を提供することである。 発明の開示 アネキシンは種々の組織抽出物から単離することができる。（船越らの上記文献 （１９８７ａ）および（１９８７ｂ）　、タイトらの上記文献（１９８８）　； 米国特許４．９３７．３２４゜）適当な組織としては肝臓、肺臓および胎盤があ げられる。特に適当な組織はヒ）胎盤である。簡単に言うと、その組織を小片に 切断してこれをたとえば５０ｍＭＮａＣｌを含有するｐＨ７，９のリン酸塩緩衝 食塩水または５０ｍＭ）リス−ＭＣＩのような冷却した生理ａｌｌ衝液で洗浄す る。この組織厚片を通常５ｍＭＥＤＴＡおよび５ｍＭベンズアミジンを含有する 生理Ｉｌｉ衝液中で混合器で均質にする。この均質物を濾過して濾液をえる。　 次にこの濾液を例えば硫酸アンモニウムでの沈殿工程に付する。この濾液に硫酸 アンモニウムを加えて約３０％から約５０％の飽和状態とする。これから得られ た沈殿物を遠心分離によｉ　り除く。次にその上澄み液にさらに硫酸アンモニウ ムを加えて約７０％から約９０％の濃度として、そしてこれからさらに沈殿物が できた場合にはそれを遠心分離により集める。これらの沈殿物を合わせて、例え ば上記したような生理緩衝液中に溶かし、こうして出来た溶液を大量の生理緩衝 液に対して一晩透析して硫酸アンモニウムを除去する。緩衝液は規則的な間隔を もって交換する。 次いで透析物を例えばセファデックス、セルロースおよびセファロースなどと組 み合せたＤＥＡＥのような陰イオン交換体に通す。そして例えば約５０ｍＭから 約５００ｍＭＮａＣ１に増加する塩濃度の直線傾斜溶離により吸着蛋白を溶出す る。こうしてアネキシン含有画分（その分析は本文中下記に示す）を集める。 集めた画分を、たとえば繰り返し硫酸アンモニウムで沈殿させるかポリエチレン グリコールで沈殿させるかまたは遠心分離することにより濃縮する。所望によっ てはその試料を生理緩衝液に対して透析する。ついで試料をゲル濾過カラムに通 す。使用する適当なゲル濾過カラムとしてはセファデックスＧ−７５のマトリッ クスからなるものが挙げられる。 活性画分を集め、それらを合わせて透析してその塩濃度を下げる。 次いで透析物を陽イオン交換体に付する。使用する適当な陽イオン交換体として はＣＭ−セファデックス、ＳＰ−セファデックス、ＣＭ−セルロースまたはモノ Ｓ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）が挙げられる。その吸着蛋白を増加塩濃度を有す る傾斜緩衝液で傾斜溶出する。前記のようにして活性画分を合わせて濃縮する。 組織源として胎盤を使用する場合には、異なった数種のアネキシンが得られる。 前記した精製工程において、そのイオン交換クロマトグラフィーによってこれら の異種を分別しこうしてそれらを異なる塩濃度において溶出することによって分 別できる。 当分野において知られている方法を使用して例えば還元または非還元条件下にお いての５ＤＳ−ＰＡＧＥにより精製の精度を決定することが出来る。胎盤から得 られたアネキシンはそれらが同定されている限りにおいては３０．０００から３ ５，０００の範囲の分子量を有する。従って、適当なポリアクリルアミド濃度の ゲルを選択する。 アネキシンの幾つかの色々な特性をチェックする。たとえば、アネキシンは抗凝 固活性を示す。その抗凝固分析方法の１つはウサギ脳セファリンを使用するもの である。セファリン（Ｓｈｉｇｍａ社）１瓶分を１００ｍ１の食塩水中に均一に 懸濁させる。当体積量のセファリンと０．００３Ｍ　Ｃａ　ＣＩ　＊とを混合す る。別の試験管に酸洗浄したカオリンを食塩水中に５ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁さ せる。 次いで、２０μｌの健康なヒト胎盤を集めたものと、２０μｍのカオリン懸濁液 と、１０８ｍの被検試料とを混合し３７°Ｃで１０分間培養する。最後に、４０ μｌのセファリン−カルシウム混合物を加え凝固時間を測定する。 本来の凝固（カオリン誘発凝固）経路の阻害率を測定するための分析においては その付帯的な凝固経路の阻害率を測定してこれを修正することによりそれをめる ことが出来る。（近藤ら、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、　（１９８７）４８、４４ ９−４５９゜）　凝固時間は、例えばカオリン懸濁液をトロンボプラスチンに置 き換える以外は上記の方法と同様の方法により測定できる。 ヒト脳トロンボプラスチンを０．１５ＭＮａｃ１を含有するｐＨ７，４の５０ｍ Ｍトリス−ＨＣｌで希釈し、約６０秒の対照凝固時間をもとめる。 アネキシンもまたリン脂質に対して親和性を示す。リン脂質に結合するアネキシ ンを定量する方法の１つとして蛍光消光に基ずくものがある。 （タイトら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（１９８９）　２６４．７９４４ −７９４９．　）アネキシン（５０ＭＭ）を０．０５Ｍはう酸塩緩衝液（ｐＨ９ ，０）、０．１５ＭＮａＣ１、および１ｍＭＥＤＴＡ中フルオレセインイソチオ シアナート（５０ＭＭ）で３７°Ｃで１時間処理して標識する。反応混合物を２ ０ｍＭＨＥＰＥＳのｐＨ８，０緩衝液に対して透析する。透析物を陽イオン交換 カラムに付し、直線塩傾斜法により溶出する。フルオレセイン１分子で標識した アネキシンは０．２７ＭＮａＣ１において溶出し、複数のフルオレセインとの複 合形のアネキシンは０．３０ＭＮａＣ１と０．４５ＭＮａＣｌとの間の塩濃度に おいて溶出する。 ついで、リン脂質小胞をそれぞれ約２０％のＰＳ、２０％のジヘプタノイルーフ ォスファチジルコリンおよび６０％の長鎖ＰＣを加えることにより作るが、これ によって均−薄層状の小胞が自然に出来る。リン脂質原液を均等に分割した一部 それぞれをクロロホルム中で混合して所望のモル比のものとし、そしてクロロホ ルムを窒素中で蒸発させて除去する。ついでリン脂質をＨＥＰＥＳ緩衝液中に氷 冷しながら３分間音波震とうして溶かしそれから４°Ｃで１晩平衡化する。 蛍光測定は蛍光計（たとえば、Ｓ　ＬＭ８０００　Ｃ；　Ａｍｌｃｏ社、イリノ イ州、ウルバナ）を使って行うことが出来る。ここでは、適当な波長を選択し、 例えば、フルオレセインは励起波長が４９５±１６ｎＭであり、そして発光を５ ２０±ｌＯｎＭでモニターする。 結合分析は緩衝液と蛍光標識されたアネキシンとを含有する標準の石英蛍光セル 中で行う。まず、溶液を一度倒置混合し次いでリン脂質その量を変えてそのキュ ベツトに加える。その内容物を再び倒置混合し蛍光強度を記録する。更に５ｍＭ ＥＤＴＡをそのキュベツトに加えて、再び蛍光強度を記録する。消光量をＥＤＴ Ａの存在下の蛍光強度に対する最終の蛍光強度の比から夏山する。 リン脂質小胞へのアネキシンの結合は血しょうおよび細胞外液（１゜２　ｍＭイ オン化シカルシウム０．１５Ｍイオン強度）に相当する条件下で高い親和性（Ｋ ｄ＜１　ｏ−”　Ｍ）を示すものである。その結合は可逆的でありそして完全に カルシウム依存性である。 アネキシンの存在をモニターするのに適当なその外の分析方法としては、例えば 、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンプロット法の様な抗体を使用する方法がある。 またこれとは別に、アネキシンは遺伝子組換え法によっても作ることが出来る。 発現ライブラリーの抗体スクリーニングにより、またアネキシンペプチドから推 論したオリゴヌクレオチドプローブを使用してｃＤＮＡクローンを得ることが出 来る。アネキシンＶの全長ｃＤＮＡクローンを得てそして発現ベクターにサブク ローニングすることがおこなわれた。船越ら（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８７ａ ）　２６．５５７２−５５７８；　（１９７８ｂ）　８０８７−８０９２）はｃ ＤＮＡバンクをスクリーニングしてアネキシンＶクローンを得るために親和性に より精製した抗体を使用した。かれらは、アネキシンＶをコードする配列を含む １．３ｋｂＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ断片をクローニングして発現ベクター ｐ　ＫＫ　２３３　、　２　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）とし、発現プラスミドｐ ＰＡＰ−Ｉ−ｗｔを作った。この組換えアネキシンは細胞蛋白の約２％のレベル で細胞形質的に発現する。この組換えアネキシンは当分野で知られている方法に より宿主細胞から得ることが出来る。 アネキシンＶは約７５アミノ酸残基からなる４つの不完全縦列重複反復を含有す る。（船越ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８７ｂ）　２６．８０８７−８０９２ ゜）これらの反復列は４箇所に保護されたアミノ酸残基を含有し、１５個の位置 は疎水性アミノ酸残基からなり、４個の位置はヒドロキシアミノ酸からなり、そ して２箇所は酸性アミノ酸からなる。 その４個の反復配列の各々はリン脂質結合蛋白に通常存在する２つの領域を含有 している。第１の領域はＮＨ２末端１７残基からなり、これは既に知られている 配列Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ｘ−ｇｉｙ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ｇｌｕＯＸ−Ｘ−ｈ−ｈ− Ｘ−ｈ−ｈ−Ｘ−３ｅｒ−Ａｒｇ　（配列番号　Ｎｏ、１）（ガイソウ（Ｇｅｉ ｓｏｗ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８６）　３２０．６３６−６３８）に一致す る。ここでｈは疎水性アミノ酸であり、Ｘはいかなるアミノ酸でもよい。この配 列は、エンドネキシンやカレレクトリンのようなＣａ−調整膜結合蛋白中に見出 されている。ホスホリパーゼＡ！およびヘビ毒ホスホリパーゼＡ２禁止剤もまた 極めてこれに関連した配列を持っている。この蛋白中の第２の同族領域は各反復 列のＣ−末端部における疎水性アミノ酸の６個の残基の列である。これらの２つ の領域はリン脂質に直接結合しているものと思われる。（ガイソウら、ＦＥＢＳ 　Ｌｅｔｔ。 （１９８６）　２０３．９９−１０３゜）その強力な抗凝固活性はこのリン脂質 結合領域の存在の故であるといえる。アネキシンＶの結晶開学的分析によると、 アネキシンＶのこの４個の領域は同じ折り畳み構造を有し、それぞれは５個のα 螺旋型からなる。（ツーバー（Ｈｕｂｅｒ）ら、ＥＭＢｏ　Ｊ、　（１９９０） 　９゜３８６７−３８７４゜）彼らのグループはまたＬｊＩおよびＩＩＩ反復列 の凸面に局在するアネキシンＶの３個の強力なカルシウム結合部を見出した。 ツーバーらはそのカルシウム結合部が７ネキシンＶ分子とリン脂質との結合を仲 介していると推定している。（ツーバーら、ＦＥＢＳ　ｔ、ｅｔｔ。 （１９９０）　２７５．１５−２１゜）アネキシン分子は、そのリン脂質結合能 が実質的に低下しない限り１個またはそれ以上のアミノ酸残基において副分割ま たは部分変更してもよい。このようにアネキシンはその先端を切断して、例えば １個またはそれ以上の領域を含むか、または原蛋白よりもすくないアミノ酸残基 を含むようにするか、あるいは置換されたアミノ酸を含むようにすることが出来 る。その変異体または第２世代のアネキシン分子が実質的にリン脂質に対する親 和性が低下しない限りいかなる変更も本発明の範囲内において可能である。ここ で実質的に親和性が低下しないということは、リン脂質に対する結合定数が約１ ０−’Ｍよりも小さくならないということである。 同様にして、その変性または部分変更したものがフィブリン凝塊を溶解する能力 を維持する限りにおいてはフィブリン溶解剤もまた本発明の範囲内において変性 または部分変更することができる。例えば、１個またはそれ以上の領域を欠失さ せたｔＰＡ、ウロキナーゼまたはプロウロキナーゼのような、一部変異、一部欠 失、一部置換および／または先端部の切断によるフィブリン溶解剤もまた本発明 において使用できる。 （ｔＰＡ分子の欠失体については、ライクストローム（Ｗｉｋｓｔｒｏｍ）ら、 Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　（１９９０）　５．３１−４１およびヴアンゾネヴ エルト（Ｖａｎ　Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８６）　８３．４６７０−４６７４）を参照。）そ のほかのｔＰＡ欠失体ならびにウロキナーゼおよびプロウロキナーゼ欠失分子も また本発明において使用可能である。ＥＰ　２６６０３２Ａ、ＥＰ　２９９７０ ６Ａ　、ＥＰ　３０８７１６Ａ　、ＥＰ　２３６０４０Ａ　、ＥＰ　２４７６７ ４Ａ　、ＥＰ　２５３２４１Ａ　５ＵＳ４、７５３．８７９、Ｗｏ　８７１０４ ７２２および特開昭６３−２３００８４にはとりわけ色々な部分変更または変性 プロウロキナーゼ、ウロキナーゼおよびｔＰＡ分子が記載されている。またＵＳ 　４，７５２，５８１　、ＵＳ　４，９０８，２０４、ＵＳ　４．９９２゜２７ ４、ＵＳ　４．９１６．０７１及びＨＰ　２３１１８８３Ａにはたとえばウロキ ナーゼ／ｌＰＡ分子のようなハイブリッド分子が記載されている。 変性フィブリン溶解剤の蛋白溶解性は、例えばスキニー（Ｓｃｈｎｅｅ）ら（Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（１９８７）　８４．６９０４ −６９０８）により教えられた、またはポーテ（Ｂｏｄｅ）ら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｗ、　（１９８７）　２６２．１０８１９−１０８２３）により教え られた、色素原基質、Ｓ−２２８８、Ｓ−２４４４またはＳ−２２５１を使用す る公知の分析法により評価することができる。原蛋白に関して変性フィブリン溶 解剤における約５０％迄のフィブリン溶解活性の減少は本発明の範囲ないである と考えられる。 アネキシン、とりわけアネキシンＶの多くの性質のなかで、本発明において有用 なのはその血栓にたいする親和性である。アネキシンＶは生体内で血栓を標的と することが出来る。放射線標識したアネキシンＶを静脈内投与しその放射能の局 在性を調べた。注射後１００分間で、約１７：Ｉの血栓：血液の割合で血栓に於 ける著しい蓄積がみなれた。この放射線標識したアネキシンＶは血液から速やか に取り除かれた。 このようにアネキシンは血栓への標的剤として使用することが出来、これはそこ でその抗凝固活性を奏し、あるいはまたアネキシンはそれに接合した第２の分子 を血栓へ標的させるための手段として作用することも可能である。ここで第２の 分子としては、組織プラスミノーゲン活性化剤、ストレプトキナーゼ、ウロキナ ーゼおよびプロウロキナーゼのような血栓溶解剤を挙げることが出来る。アネキ シン接合体はウロキナーゼのような族フィブリン性でない血栓溶解剤として有用 である。たとえばストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼおよび 組織プラスミノーゲン活性化剤のような多くの血栓溶解剤は市販品として入手可 能であり、遺伝子組換えにより生産するかあるいは天然物から精製される。（例 えば、ｔＰＡについてはＵＳ　４．８５３．３３０および４．７６６、０７５を 、ウロキナーゼについてはウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）　、Ｂｒ１ｔ、　 Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｐａｔｈ、　（１９５１）　３２．５３０およびＵＳ　２．９ ８９．４４０．２．９８３．６４７および３．０８１．２３４を、ストレプトキ ナーゼについてはクリステンセン、Ｇｅｎ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　（１９５４） 　２８．３６３およびＵＳ　３．１３８．５４２．３．２２６．３０４．３．０ １６．３３７および３、１０７．２０３を、またプロウロキナーゼについてはＥ ＰＡ　０１３９４４７を参照。）選択的蛋白消化またはサブクローニングにより 、血栓溶解剤の第２世代形を作成し、これらはフィブリン結合能が強化されそし て半減期が延長されしかも、たとえば、副作用のような好ましくない性質を最少 に抑えるという利点がある。このようにして、表皮成長因子および指領域のない 、またはまさに第２クリングルおよびセリンプロテアーゼ領域をふくむｔＰＡを 作成した。また、たとえばウロキナーゼおよびｔＰＡの部分からなるキメラ血栓 溶解剤もまたプラスミノーゲンを活性化する作用がある。　（ビエラルド（Ｐｉ ｅｒａｒｄ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａ　（１９８７）　２２６２．　１１ ７７１゜） アネキシンは血栓溶解剤と化学的に交差結合することが出来る。たとえば、ＵＳ 　４．５６４．５９６はウロキナーゼとフィブリノーゲンとを接合するのに脂肪 族ジアミンを使用することを教示している。ＵＳ　４．５３６．３９１はスクシ ンイミドエステル類のカップリング剤を使用したプラスミンウロキナーゼ複合物 を教示している。セヴイラ（３ｅｖｉ　ｌ１ａ）ら（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ ｐｈｙｓ。 Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　（１９８５）　１３０．９ｌ−９６）はウロキナーゼと 抗−ヒトフィブリノーゲン抗体とをこれら２つの成分を異種二官能性カップリン グ剤であるＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸エス テル（ＳＰＤＰ）で架橋することによってこれらを接合することを教示している 。彼らの方法ではウロキナーゼを５ＰＤＰと反応させそしてこれとは別に抗体を ２−イミノチオランと混合するものである。そして次いでこの５ＰＤＰ−変性ウ ロキナーゼはイミノチオール化した抗体と混合して目的の接合体を生成する。こ の接合体は親和クロマトグラフィーにより生成するというものであった。 積出ら（Ｊ、　ＡｐｐＨｉｏｃｈｅｍ、　（１９８４）　６．５６−６３）は蛋 白を接合するのに有用なたくさんのマレイミド化合物を教示している。これを簡 単にいうと、５ｃｕＰＡ、ＳＫまたはプラスミノーゲンをリン酸塩緩衝液（ｐＨ ７，０）中でスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキ サン−１−カルボン酸エステル（ＳＭＣＣ）で処理する。ここでＳＭＣＣはその 条件下に遊離のアミノ基、好ましくはＮＨ，−末端アミノ基に共有結合する。反 応混合物は次いでゲル濾過カラムに付して副生成物を除去する。 目的の蛋白に結合するＳＭＣＣ分子の数は４，４″−ジチオジピリジンを使用し て測定できる。１．　５モル過剰のＳＭＣＣを使用した場合には、従来法によれ ば１．２ないし１．５モルのＳＭＣＣが蛋白中に導入されると考えられる。つい で、ＳＭＣＣ−蛋白、たとえばＳＭＣＣ−５ｃｕＰＡ、ＳＭＣＣ−８ＫまたはＳ ＭＣＣ−プラスミノーゲンを６Ｍ尿素または６Ｍグアニジンを含有するリン酸塩 緩衝液（ｐＨ６，０）ちゅうでアネキシンＶで処理する。ＳＭＣＣ蛋白はアネキ シンＶ分子のＣ−末端部（Ｃ−末端から数えて第５番目の残基）に存在する１個 の遊離スルフヒドリル基に特異的に結合する。この反応生成物をゲル濾過カラム （たとえば、セファデックスＧ−１００）に付してその条件下における主要生成 物であると考えられる単量体形を単離する。（アネキシンＶ／プラスミノーゲン ハイブリッドはウロキナーゼにより活性化されてアネキシン／プラスミンとなる 。アネキシンＶは自然条件下においてほとんどのプロテアーゼによる温和な消化 に対して耐性がある。）アネキシンと血栓溶解剤とを接合する化合物は色々にか えてスペーサーとなることが出来、その立体効果によりアネキシン結合親和性ま たは血栓溶解剤活性あるいはその両方が適当に調整される。たとえば、積重ら（ 上記文献）はマレイミドとスクシンイミド官能基との間のメチレン基の数を変え た化合物を教示し、マキシメント（Ｍａｘｉｍｅｎｔｏ）ら（上記文献）のジア ミン架橋剤は１ないし１２個のメチレン基を持つ脂肪族ジアミンからなるもので ある。 同様に、アネキシンと血栓溶解剤をコードする配列の間に適当なコード配列を挿 入することによってスペーサー領域を組換え接合体に配置替えすることも出来る 。 上記の血栓溶解剤の多くはクローニングされているので接合体は遺伝子組換え技 術によっても作ることができる。たとえば、スキニー（Ｓｃｈｎｅｅ）ら（Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｉｅ、　（１９８７）　８４．６９０４− ６９０８）は遺伝子組換え技術によるフィブリンモノクロナール抗体−ｔＰＡ接 合体の発現を教示している。すなわち、彼らは抗−フィブリン抗体の重鎮遺伝子 を発現ベクター中のｔＰＡβ−鎖遺伝子に隣接して挿入して組換えハイブリッド 蛋白を作成した。ピエラルド（Ｐｉｅｒａｒｄ）ら　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅ＋ｎ、　（１９８７）　２６２、１１７７１−１１７７８）はウロキナーゼま たはｔＰＡから得られた領域を含んでなる一連の組換えプラスミノーゲン活性化 剤を構築した。彼らは、その異なる領域に相当する核酸配列を切断して組み換え てキメラコード配列を作成し、これらの配列から次いでキメラ蛋白を作成した。 当業者により組換え接合体を発現するための宿主の決定が行われている。例えば 、大腸菌（Ｂ、　ｃｏｌｉ）　、枯草菌（９，３Ｂｌ）ｔｉｌｉｓ）　、酵母お よび哺乳類細胞を使用することができる。コード配列を含有するカセットをプロ モータを含む３゛−非コード配列およびその下流の５′−非コード配列を認識す る必要な宿主細胞からなる適当な発現ベクターのオペランド部中に配置する。こ こで適当な大腸菌発現ベクターはｐＫＫ２３３−２（アマンおよびブロシウス（ Ａｍａｎｎ　＆　Ｂｒｏｓｉｕｓ）、　Ｇｅｎｅ　（１９８５）　４０．１８３ −１９０）であり、適当な酵母発現ベクターはＤＰＯＴ　（チム（Ｔｈｉｍ）ら 、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８３．６７６６−６７７０ ）であり、そして適当な哺乳類細胞発現ベクターはｐＤｓＰｌ、ＩＢＧＨ（ファ ール（Ｐｆａｒｒ）ら、ＤＮＡ　（１９８５）　４．４６１−４８７　）である 。 上記の領域は二つまたは幾つかが一緒になってリン脂質結合活性または抗凝固活 性に寄与している。従って、１個またはそれ以上の領域あるいは１個の領域の複 製物からなるヌクレオチドコード配列を血栓溶解剤のコード配列に隣接してサブ クローニングして新規のまたは強化した性質を有する複合体を作成することが出 来る。 この接合体は薬理組成物の活性成分となることができる。このような組成物は薬 理的に許容される担体、希釈剤および賦形剤を含有してもよい。例えば、適当な 担体としては、緩衝液、生理食塩水、組織培養基および水があげられる。この接 合体はたとえば静脈内注射のような当分野で知られている方法により投与するこ とができる。その処置方法は動物実験や臨床試験によって決められ、そして病気 の程度、患者の症状などに合わせればよい。当業者は、例えばｒＧｏｏｄｍａｎ 　＆　Ｇｉ１ｍａｎ’　ｓ　Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｂａ５ｅ ｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ　Ｊ　（第６版、ａｏｏｄｍａｎら編、Ｍ ａｃＭｉｌｌａｎ社発行、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８０）などの多くの薬学論 文から適当な手引を得る事が出来る。 また池の態様として、アネキシンの標的到達能を薬剤を局所に到達させるのに使 うことも出来る。このように当業者は本明細書に記載の方法を薬剤をアネキシン と接合するために使用することも出来る。例えば、この目的に細胞毒性剤、マイ トーゲン（分裂促進剤）、抗生物質などを使用出来る。またその他の薬剤学の知 識をもって、投与形態や投与量などは当分野における当業者ならばそれらを確認 することができる。 図面の簡単な説明 第１図は組換えプラスミドｐＭＴＯ１７の地図を示すものである。ｔｒｐプロモ ーター領域はｔｒｐ　ｐｌｏとして表し、プロウロキナーゼをコードする領域は ＰｒｏＵＫとして、ヒルジンリンカ−はＨＩ　ＲＵＤＩＮとして、アネキシンＶ をコードする領域はＡｎＶとして、そしてｔｒｐ弱毒剤はｔｒｐＡとして表す。 ここでは周知のしかも有用な制限部位を表しである。 第２図は組換えプラスミドｐＭＴＯ２４の地図を示すものである。ビチア（Ｐｉ 　ａｈ　ｉ　ａ）ＡＯＸプロモーター領域は５’　Ａｏｘｌとして表し、５ｅｕ Ｐａ−ヒルジンーアネキシン■をコードする領域はＰＰＡ／ＨＩＲＵＤＩＮ／Ａ Ｖとして、ＡｏＸターミネータ−領域は３’　ＡＯＸｌとして、そして酵母選択 性マーカーはＨＩＳ４として表す。　ここで５°Ａｏｘｌ配列のＸｈｏＩ部位の 直下流の黒く塗りつぶした帯はムコール（Ｍｕｃｏｒ）レニンシグナル領域を表 す。　３’　Ａｏｘｌ配列と５’　Ａｏｘｌ配列との間の２．８６ｋｂ配列はｐ ＢＲ３２２由来配列である。またここで大きさはキロベース（ｋｂ）として表し 、そして周知のしかも有用な制限部位を表しである。 第３図は組換えプラスミドｐＭＲ３９１の地図を示すものである。ＨｉｎｄＩＩ Ｉ部位から始まって、第１の狭い右上がりの斜線をした領域はＳＶ４０エンハン サ−およびプロモーターであり、第２の狭い左上がりの斜線をした領域はＳＶ４ ０スプライシング接合部であり、第３の無色の領域はＰＰＡ（ｓｃｕＰＡ）をコ ードする領域であり、第４の広い右上がりの斜線をした領域はヒルジンリンカ− であり、第５の広い左上がりの斜線をした領域はアネキシンＶをコードする領域 であり、そして第６のＸｈｏ１部位の下流にある領域はＳＶ４０　ｐｏｌｙＡ領 域である。 発明を実施する為の最良の形態 次に本発明を更に実施例によって説明するが、これらは限定的なものではない。 量の表示はＷ／ＷまたはＷ／Ｖである。 実施例１ ヨウ素化アネキシンを例えばヨウ素化剤を使用する方法などの通常の方法によっ て作る。（チアガラジャン（Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ）およびタイト、Ｂｆｏｌ 、　Ｃｈｅｍ、　（１９９０）　２６５．１７４２０−１７４２３　、　）動脈 血栓の動物モデルとしては以前は主にイヌを使用したがここではリチー（Ｒｉｔ ｃｈｉｅ）らの記載のようにウサギを使う。（リチーら、Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏ ｎ　（１９８６）　７３．１００６−１０１２゜）ウサギの気管に管を挿入し、 ｌないし２％のハロサンで麻酔しそしてこれを電子心拍計でモニターする。対象 動脈（頚動脈または大腿動脈）を切開して２ないし５ｃｍの長さに結紮糸で両端 を結んで分離する。これをピンセットを使って繰り返し潰し、その体の中央に近 いほうの結紮糸を１分間緩めて新鮮な血液を流し込むようにし、次いで再び結ぶ 。２時間後に、放射線標識した１１２５−アネキシンＶを火剤の形で末梢静脈か ら注入しその後結紮糸を３００分間緩る。時間を色々に変えなから凝塊にアネキ シンＶを蓄積させそして溜まった血液から非結合アネキシンＶを取り除いてから 、この動脈を取り出し、ホルマリンに固定し、切片に切断しそしてその放射性を 測定する。 実施例２ アネキシンＶｃＤＮＡをプラスミドｐＰＡＰ−Ｉ−１，６から得た５°ＮｃｏＩ 末端と３’Ｘｂａｌ末端とで拡張するためにＰＣＲ（ＵＳ４゜６８３、１９５お よび４．６８３．２０２０）を使う。同様にして、ｓｃｕＰＡｃＤＮＡを５’Ｘ ｂａＮ部と３’　ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ部とでＰＣＲによって拡張する。 ５ｃｕＰＡのプライマーは公知のｃＤＮＡ（ホルメス（Ｍａｉｍｅｓ）ら、。 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ　（１９８５）　３．９２３−９２９）から作り、その拡張は ｃＤＮＡライブラリーから行える。この２つのＰＣＲ生成物をそれぞれＮｃｏＩ とＸｂａＩと、およびＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩとで消化し、次いで予めＮｃ。 ■とＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉとで消化したｐＫＫ２３３−２　（アマンおよびブロシ ウス、Ｇｅｎｅ　（１９８５）　４０．１８３−１９０）のような大腸菌発現ベ クター中にライゲートする。このプラスミドをＤＨ５αのような適当な宿主中に 挿入する。組換え体はコロニーハイブリダイゼーションにより同定し、その構造 は制限地図作成およびＤＮＡ配列作成により確認する。大腸菌中におけるハイブ リッド蛋白の発現レベルを次いで培養温度やＩＰＴＧでの誘発時間を変えること によって最適なものを選ぶ。 このハイブリッド蛋白はそれぞれ個々にアネキシンＶと５ｃｕＰＡとを含む封入 体中に封入することも出来そうである。（ウィンクラ−およびブラバー（Ｗｉｎ ｋｌｅｒ　＆　Ｂｌａｂｅｒ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８６）　２５．４０ ４１−４０４５゜）この封入体を遠心分離（１０，ＱＯＯＸｇ、１０分間）によ り単離し６Ｍ尿素中に溶解しそして透析により再遊離する。ついでこのハイブリ ッド蛋白を通常の低圧ＦＰＬＣクロマトグラフィー法により精製し、そのさい抗 アネキシン抗体を使用した蛍光偏光免疫分析により両分をモニターする。ハイブ リッド蛋白は化学合成したハイブリッドと同様にして公知の方法でその特性を同 定出来る。　発現させるまた別の方法としては、たとえばベクターＤＰＯＴ　（ チムら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（１９８６）　８３ ．６７６６−６７７０）を使用して酵母中で分泌させる方法がある。アネキシン Ｖも５ｃｕＰＡ（ザワロクキー（Ｚａｗｏｒｓｋｉ）ら、Ｇｅｎｅ　（１９８９ ）　８５゜５４５−５５１　）も両方ともサツカロミセスセレビシェ（Ｓａｃｃ ｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で次々と発現した。 実施例３ 目的のプラスミドを含有する大腸菌の培養物を３７’Ｃで１００μｇ／ｍｌのア ンピシリンを含有するし肉汁中で１晩培養する。培養物を１リツトルの同じ培養 基で１：１０に希釈して３７６ＣでＡ、。。がＱ、３より大きくなるまで震とう しながら培養する。ついで、ＩＰＴＧを３ｍＭ加えることによって合成を開始し 培養を更に４時間続ける。菌体を遠心分離により採取し、１０ｍＭＥＤＴＡを含 有する１　００ｍ１のＰＢＳで１回洗浄し、そして−２０’Ｃで保存する。ベレ ットをＰＢＳ、１０ｍＭＥＤＴＡ、６Ｍ尿素、０．５μｇ／ｍｌのロイペプチン 、０．５μｇ／ｍｌのペプスタチン、１％のトリトンＸ−１００および０．２ｍ Ｍフェニルメタンスルホニルフルオライドからなる２５ｍ１の緩衝液中に氷上で ２ないし３分間音波震とうして溶解する。抽出物を遠心分離（２５０００Ｘｇで ２０分間）する。上澄み液を５０ｍＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）　、０．５ μｇ／ｍｌのロイペプチン、０．５μｇ／ｍｌのベプスタイン、１ｍＭＥＤＴＡ 、３ｍＭＮａＮ５および１００　ｍＭＮａｃｌからなる緩衝液に対して４°Ｃで 透析する。その際緩衝液を繰り返し交換する。透析物を膜濾過し、そしてたとえ ば抗−アネキシン力ラムのような親和カラムに４°Ｃで付す。このカラムを透析 に使用したものと同じ緩衝液の少なくとも１００ｍ１で洗浄し、結合した蛋白を ０゜１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２，５）で溶出する。溶出物を１／４体積のＩＭ トリスＨＣＩ　ｃｐＨｓ、Ｏ）中に集めて直ちにｐＨを中和し、次いで透析し濃 縮する。 実施例４ ヒトアネキシンはそれがヒト血小板に結合するのと同様にウサギ血小板に結合す るので、ウサギはアネキシンＶハイブリッドの活性を試験するための実験モデル として使用できる。 ウサギの頚動脈に機械的に損傷を与えてうっ血させることによりその中に血栓を 誘発させた。２時間後に放射性標識したアネキシンＶＣ２５Ｉ−アネキシンＶ、 １５０ｕＣｉ）を１回静脈注射した。次いで５．１Ｏ１１５，３０および６０分 間隔で一連の血液サンプルをとり血液透明度を測定し、次にこの動物を１００分 後に屠殺して血液、尿および組織サンプルを取りその重量と＋ｔＳ　Ｉ含有量と を測定した。全身的な急性毒性の徴候は見られなかった。 表１に見られるように、１００分後には１２′■−アネキシンＶの蓄積は実質的 に血栓にあり、その血栓：血液の割合はＩ部：１であった。全血管（動脈および 静脈血管）中およびそ他のほとんどの組織中の蓄積量は極少量であった。′！５ 　Ｉ−アネキシンＶは速やかに血液から取り除かれその半減期は１０分であった 。その除去は尿および腎臓における放射性の蓄積量かられかるように主として腎 臓をとおして行われた。 表１−動脈血栓を有するウサギの１２′Ｉ−アネキシンＶの生体分布組織または 体液　１ｇＯ検体１分　検索血液比当たりの計数 血液　２０８０　１．００ 末梢部　５５２５　２．６６ 末梢部　４７００　２．２６ 大動脈　１５２７　０．７３ 大静脈　１６２０　０．７８ 腎臓　６０７５２　２９．２０ 尿　３２６４４　１５．７０ 肝臓　１５０６　０．７２ 牌臓　３１４１　１．５１ 心臓　１９０５　０．９２ 肺臓　４８９３　２．３５ 骨格筋　１５２４　０．７３ （ａ）血栓となった頚動脈を取り除いてホルマリンに固定した。ついでこれを３ つの切片に切断し、各切片についてその血栓を取り除き、血管と血栓とを別々に 計数した。 実施例５ 頚動脈でなくて大腿部に血栓を誘発させた場合も実質的に実施例１と同じ結果が 得られた。 実施例６ アネキシン／５ｃｕＰＡおよびアネキシン／プラスミノーゲンを血しょうカリク レイン（またはプラスミン）およびウロキナーゼでそれぞれ活性化する。活性化 されたアネキシン／ウロキナーゼ、アキキシン／プラスミンおよびアネキシン／ ＳＫをプラスミノーゲンで処理し、その結果のプラスミンを合成基質Ｂｏａ−Ｇ ｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ １社）を使用して分析する。そ（７）ハイブリッド分子のプラスミノーゲン活性 化能を親蛋白のそれと比較できる。 ハイブリッドのフィブリン溶解活性はりジュネン（Ｒｆ　ｊｎｅｎ）ら（’ｒｈ ｒｏｍｂ。 Ｈａｅ＋ｎｏｓｔａｓ、　（１９８４）　５２．３０８−３１０）の方法により 、ただし血小板欠乏血しょうの代わりに血小板に富んだ血しょうを使用して分析 できる。血小板に富んだ新鮮なヒト血しょうをトロンビン（または組織因子）、 ＣａＣ］　ｔおよびＩｔｓ　Ｉ−フィブリノーゲンに加え、直ちにサイラスチッ ク管（４ｍｍ内径）に入れて３７°Ｃで３０分間培養する。この管を所定の長さ の小片に切断し、凝血をその管から取り除き緩衝液で洗浄する。 その放射性を測定したのち凝血を前記のハイブリッドまたは尿蛋白（たとえば、 ５ｃｕＰＡ、ＳＫまたはプラスミン）と−緒に培養する。フィブリン溶解活性を その可溶化した放射性を測定することにより評価する。 サンプル血しょう中のフィブリノーゲンとプラスミノーゲンの濃度はＥＬＩ　Ｓ Ａにより分析してフィブリノーゲン溶解性を測定する。 実施例７ ヒト１本鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化剤（ｓｃｕＰＡ）をミドリ十 字社（大阪、日本）から得た。スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４− （Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸エステル）をピアー ス（Ｐｉｅｒｃｅ）社（ロックフォード、イリノイ州）から購入した。 ５ｃｕＰＡを６Ｍ尿素を含有する０、１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，３）に対 して１晩透析した。透析後、５ｃｕＰＡの濃度を３２．５μＭに調節した。 スルホ−ＳＭＣＣを透析した５ｃｕＰＡの部分に加えその最終濃度は６５μＭと ３２５μＭの２種類とした。これらのサンプルを室温で３０分間培養した。培養 の最後に、グリシン（１０ｍＭ）を加えた。これらサンプルをゲル濾過カラム（ ＰＤ−１０，Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に付して過剰の未反応の試薬を除去した。 次いでカラムを６Ｍ尿素と１０ｍＭＥＤＴＡとを含むリン酸ナトリウム緩衝液（ ＤＨ６，０）で溶出した。蛋白画分を集めた（ｓｃｕＰＡ−ＳＭＣＣ）。 アネキシンＶを６Ｍグアニジン（または８Ｍ尿素）を含む０．１Ｍリン酸ナトリ ウム緩衝液（ｐＨ７，３）に対して室温で１晩透析した。このサンプルをゲル濾 過カラム（ＰＤ−１０）に付して６Ｍ尿素と１０ｍＭＥＤＴＡとを含む０．１Ｍ リン酸塩緩衝液（ｐＨ６，０）で溶出した。 蛋白画分を集めた（展開アネキシンＶ）。 ＳＭＣＣ−５ｃｕＰＡを展開アネキシンＶと室温で１晩培養することによって接 合した。５ｃｕＰＡ／アネキシンＶ接合体の一部を５ＤＳ−ポリアクリルアミド ゲルに付し電気泳動により分離した。ＳＭＣＣ−５ｃｕＰＡのみ、アネキシンＶ のみ、および分子量マーカーを対照試験に使用した。形成された接合体はこれら ２つの成分の分子量の合計に等しい分子量のものであることが確認された。 実施例８ 実施例７で作成した５ｃｕＰＡ／アネキシンＶ接合体をプラスミンで活性化した 。５０μ】の５ｃｕＰＡ／アネキシンＶ接合体（約５００■Ｕ／ｍｌ）を５０μ ｍのプラスミン（０，９μＭ）と−緒に１０分間室温で培養した。次いで、５０ μｌのアボロチン（１０μＭ）を加えてその混合物を室温で５分間培養してプラ スミンの活性を阻害した。 次に、５０μｌの合成ペプチド基質（２ｍＭ）、ビｏＧｌｕ−ｇｌｙ−Ａｒｇ− ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２４４４、カビ（Ｋａｂｉ）社、スエーデン）を加え てその混合物を室温で３０分間培養した。１０％酢酸を１ｍｌ加えることによっ て反応を停止した。生成したｐ−ニトロアニリンの量は４０５　ｎｍの吸光度に より測定した。その活性は国際標準単位（ＩＵ）で表した。 ５ｃｕＰＡおよびそれに１個のＳＭＣＣが結合した５ｃｕＰＡは共に同等の活性 を示した。５ｃｕＰＡに結合したＳＭＣＣ分子の数が増加すれば、その活性はわ ずかに減少した。各５ｃｕＰＡ分子に１０個のＳＭ実施例９ ｓｃｕＰＡｃＤＮＡは多くの入手可能な５ｃｕＰＡクローン、たとえばプラスミ ドｐｓＶ−ＧＩ−ｐｒｅＵＫ　（特開昭６０−１８０５９１．、ＥＰＡ　２５３ ２４１、ＥＰＡ　１５４２７２）から誘導できる。プロモーターの下流に、例え ばｔｒｐプロモーター（ＥＰ　０１５２８３０ＸこれはＰＬ　Ｂｉｏｃｈｅａ＋ １ｃａｌｓ社のベクターｐＤＲ７２０やＧｅｎｅｘ社（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ ｇ、　ＭＤ）のベクターｐＧＸ１１２から得られる）のＣ１ａＩ部に５ｃｕＰＡ ｃＤＮＡを結合させるためには、次の配列（配列番号Ｎｏ、２）を持つ合成りＮ Ａを使用することができる。 ＭＳＮＥＬＨＱＶＰＮ Ｘｈｏｌ　Ｃ１ａｌ　ＴｔｈＨＢ８１ ５’　−ＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＡＴＡＡＡ　ＡＴＣＴＣＴ　ＡＡＣＧＡＡ　ＴＴ Ｇ　ＣＡＣＣＡＡ　ＧＴｒ　ＣＣＡ　ＴＣＧ−３’（配列番号Ｎｏ、　２） この合成りＮＡは５ｃｕＰＡのＣＩａＩ部からＡＴＧコドンまでの非翻訳領域か らなり、その領域はＡＴＧコドンからＴｔｈＨＢＢＩ部までの範囲からなりこれ は第１０番目のアミノ酸残基に相当し、酵母中においても同様に機能可能な発現 ベクターに結合するＣ１ａＩ部から上流のＸｈｏｌ部をもつ。この合成りＮＡは ５ｃｕＰＡｃＤＮＡの５°末端にライゲートして５ｃｕＰＡｃＤＮＡのｔｒｐプ ロモーターへのオペランド結合を可能とする。 アネキシンＶｃＤＮＡは、例えば船舷ら（１９８７ｂ、上記文献）や藤沢ら（Ｕ Ｓ　４．９３７．３２４）のクローンまたはプラスミドｐＰＡＰ−１−１゜６（ 実施例２を参照）のクローンから誘導できる。下記の塩基配列をもつ合成りＮＡ を５ｃｕＰＡのＣ末端を７ネキシンＶのＮ末端に結合するためのヒルジンリンカ −（Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ　（１９８６）　３６ ７、７３１−７４０）として使用した。このヒルジンリンカ−（公知の技術を使 用して合成した）、はヒルジンのアミノ酸配列の第５０番目から第６４番目のア ミノ酸残基をコードする塩基配列からなる（配列番号Ｎｏ、３）。 ＵＫ←１１→ヒルジン Ａｒｇ　ＩＪｅ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　＃ｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａ ｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　ｌｌａ　Ｌｅｕ　５ｅｒＡＧＧ　ＡＴＣＣＧＣＡＧＴ　 ＣＡＣＡＣＣＡＡＧ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＡＡＴ　ＧＧＣＣＴＧ　ＧＣＣＣＴＣＴ ＣＴＮｉｓ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　ＡｓｐＣＡＣＡＡＣＧＡＣＧＧＣＧＡＣ ａｍＨＩ ヒルジン−１１→アネキシンＶ Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　 Ａｌａ　Ｇｌｎ　ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＡｒｇＴｒＣＧＡＡ　ＧＡＡ　ＡＴＣＣＣＧ 　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＴＡＣＣＴＧ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　ＧＴｒ　ＣＴＣＡＧＡＮｓ Ｐ（７５２４）Ｖ　Ｄｄｅｌ （配列番号Ｎｏ、　３） 大腸菌の適当な菌株とその中で機能可能なベクターを選択する。たとえば、ｔｒ ｐプロモーター／オペレーター（ｐｌｏ）をｐＢＲ３２２（特開昭６０−１６０ ８８７またはＥＰＡ　１５８２３０）に挿入して作成したプラスミドｐＹＮ５と 、Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉリンカ−を下記の塩基配列５’　−ＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＣＣ ＧＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＧＧＧＣＴ−３’　（配列番号Ｎｏ、４）を持つｔｒｐ Ａ（ポリＹ尾部を持つターミネータ−であり、ＰＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ 社より市販のｔｒｐ弱毒剤）の両末端にライゲートしそしてそうしてえられたＤ ＮＡ断片をｐＵＣ９のＢａｍＨＩ部に挿入することによって作成した第２のプラ スミドとを使用してプラスミドｐＭＴＯ１７（第１図）を構築した。こうして対 象のＤＮＡ断片が得られ、これらをたとえばＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ　ＣＣａ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９ ８２）に記載されたような通常の方法によって結合した。 プラスミドｐＭＴ０１７はｔｒＤプロモーターの支配下にあって、５ｃｕＰＡｃ ＤＮＡ、ヒルジンの第５０番目から第６０番目のアミノ酸に相当する１５のアミ ノ酸残基をコードする塩基配列、アネキシンＶｃＤＮＡおよびｔｒｐ弱毒剤から なる。 プラスミドｐＭＴＯ１７を適当な大腸菌宿主、たとえば大腸菌ＨＢＩ０１（全酒 造（株）、これついてはそのメーカーの指示する処方による）中に導入し、得ら れた形質転換体を２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたし肉汁培地中で３０’ Ｃで１晩培養して遺伝子発現産物を得る。これらの産物を可溶化して再構築して から、その生物活性を調べた。これらの産物は約８５にの分子量を持ち抗ウロキ ナーゼ抗体と抗アネキシンＶ抗体との両方に反応性のあるプロウロキナーゼ／ア ネキシンＶ接合体（ハイブリッド蛋白）であった。（たとえば、フラヘルテイ（ Ｆｌａｈｅｒｔｙ）ら、上記文献を参照。）これらの産物はフィブリン平板分析 によって血栓溶解活性のあることが確かめられた。　一実施例１０ ピチア発現ベクターであるプラスミドｐＭＴＯ２４（第２図）をプラスミドｐＭ ＴＯ１７とプラスミドｐＡＯＯ８０７ＮＸ（後者は、たとえば上記文献Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇに記載された通常の方法を使用してプラスミドｐＡ ０８０７Ｎ　（特開昭２−１０４２９０またはＥＰＡ　３４４５９）のＥｃｏＲ Ｉクローン部位をＸｈｏＩ部位に変えることにより得られた）を使用して構築し た。プラスミドｐＭＴＯ２４はＡＯＸｌプロモーターの支配下に、プラスミドｐ 　Ｊ　Ｋ　１　（Ｇｅｎｅ　（１９９１）　９９．２３５−２４１）から得られ るムコール（Ｍｕｃｏｒ）レニンのシグナル配列（平松ら、Ｊ、　Ｂｉ。 １、　Ｃｈｅｍ、（１９８９）　２６４．１６８６２）　、ｓ　ｃ　ｕ　ＰＡｃ ＤＮＡ、ヒルジンの第５０番目から第６４番目のアミノ酸残基の１５のアミノ酸 残基をコードする塩基配列、およびアネキシンＶｃＤＮＡからなる。 プラスミドｐＭＴＯ２４を、たとえばピチアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓ ｔｏｒｉｓ）ＧＴＳ１１５　（ＮＲＲＬ　Ｙ−１５８５１）のような適当なピチ ア酵母宿主中に導入し、ＮｏｔＩで消化しくこの断片は約２ｍｇ／ｍｌの濃度で ＴＥ緩衝液中にＥｔＯＨで沈殿させ懸濁させ、その１０ｕｌを１００μｍの競合 細胞に加え、モしてＨｉｓ＋形質転換体を選択した）、そして形質転換細胞を１ ％酵母エキス、２％バクトペブトンおよび１％ＭｅＯＨを含む培地中で３０°Ｃ で３日間培養してその細胞から遺伝子発現産物を分泌させた。これらの組換え産 物は、約８５にの分子量を持ち抗ウロキナーゼ抗体と抗アネキシンＶ抗体との両 方に反応性のあるプロウロキナーゼ／アネキシンＶ接合体（ハイブリッド蛋白） であった。 これらの産物はフィブリン平板分析において血栓溶解活性を有していた。 実施例１Ｉ ＣＨＯ細胞発現ベクターであるプラスミドｐＭＲ３９’ｌ（第３図）を、たとえ ば上記文献Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇに記載された通常の方法によっ て、上記したプラスミドｐＭＴＯ１７と１）ｓＶ−Ｇｌ−ｐｒｅＵＫを使用して 構築した。プラスミドｐＭＲ３９１はＳＶ４０エンハンサ−／プロモーターの支 配下に、ＳＶ４０スプライス接合、５ｃｕＰＡｃＤＮＡ、ヒルジンの第５０番目 から第６４番目のアミノ酸残基に相当する１５のアミノ酸残基をコードする塩基 配列、アネキシンＶｃＤＮＡおよびＳＶ４０ポリＡシグナル配列からなる。 ＣＨＯ細胞をプラスミドｐＭＲ３９１で形質転換し、形質転換細胞を１０％ＦＣ ３を加えたＭＥＭ中で３７°Ｃで３日間培養してそれらの細胞から遺伝子発現産 物を分泌させた。これらの産物は約９０にの分子量をもち抗ウロキナーゼ抗体と 抗アネキシンＶ抗体との両方に反応性のあるプロウロキナーゼ／アネキシンＶ接 合体（ハイブリッド蛋白）であった。これらの産物はフィブリン平板分析におい て血栓溶解活性を有していた。 実施例］２ 上記した技術を使用して作ったＳＭＣＣ−５ｃｕＰＡを室温で１晩培養すること によりそのＮ末端に更にシスティン残基を持つ変性アネキシンＶと接合する。（ この変性アネキシンＶは、アネキシンＶコード配列の５′末端にそのアミノ酸末 端にシスティン残基を含む約１０個のアミノ酸残基をコードするオリゴヌクレオ チドをライゲートすることにより作った。）ｓｃｕＰＡ／変性アネキシンＶ接合 体の部分をＳＤＳポリアクリルアミドゲルに付して電気泳動的に分離する。ＳＭ ＣＣ−５ｃｕＰＡのみ、変性アネキシンＶのみ、および分子量マーカーを対照試 験に使用する。形成された接合体はこれら２つの成分の分子量の合計に等しい分 子量のものであることが確認された。 実施例１３ ５０ｍＭＫＣＩおよび１　ｍＭＭ　ｇ　ＣＩ　２を含む５０ｍＭｈリエタノール アミン（ＴＥＡ）−ＨＣ１緩衝液（ｐ）Ｔ８．０）の２５０μｍ中のアネキシン Ｖ（８ｎｍｏｌ）を２．５μｍのβ−メルカプトエタノール（最終濃度は１％） と混合しそして０″Ｃに冷却した。次いで、その濃度を変えてイミノチオラン（ １０μｌ）を各サンプルに加えて２０分間０６Ｃに放置した。これらのサンプル を高速脱塩カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ＨＲＩ　Ｏ／１０）によって５０ｍ ＭＮａＣｌ５１ｍＭＥＤＴＡおよび０．０５％のＮａＮ５を含む５０ｍＭトリス −ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）を使って脱塩しくここで、この緩衝液は使用前にＮ２ でフラッシュした）、そして蛋白含有画分（１，１ｍ１）を集めた。新たに導入 したスルフヒドリル基の量はエルマン（Ｅｌ　１ｍａｎ’　ｓ）試薬（Ｅｌｌｍ ａｎ、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉ。 ｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　（１９５８）　７４，４４３）を使用して測定 した。凝血活性は上記のようにして測定し、そして禁止活性率は基準アネキシン Ｖを使って作った標準曲線から算出した。アネキシン■１モル当たりのスルフヒ ドリル基（ＳＨ）のモル数と凝血活性率とを表２にしめした。アネキシンＶの禁 止活性はその変性後もなお保持された。 退２ １　２−３１　２５．０　１３１　９７２　１．５８　１２．５　１３３　１０ １３、　０．８３　５−０　１３４　１０２４　ＣＬ５６　２−５　１２３　８ １ ５　０．３７　１２５　１２６　８７ ６　０．１９　０．５　１２７　８９ 実施例１４ ０．１Ｍ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）　緩１ｉ（ｐＨ６ ，０）中の５ｃｕＰＡ　（２０ｎｍｏｌ、２００μｍ、特異的活性４１７　Ｕ／ ｍｇ）をテトラヒドロフラン中０°Ｃでその濃度を変えた無水ヨード酢酸（ＩＡ Ａ）と混合した。ＩＡＡは３分間隔で３回に分けて加えた。次いでサンプルを５ ０ｍＭＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡおよび０．０５％ＮａＮ５を含む５０ｍＭトリ ス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）を使用して高速脱塩カラム（ＨＲｌ　０／１０）に 付した（ここで、この緩衝液は使用前にＮｓでフラッシュした）。 ５ｃｕＰＡ中に導入したイソアデニル基（ＩＡ）の量は次のようにして測定した 。すなわち、イソアデニル−５ｃｕＰＡを既知量の還元グルタチオンと混合し、 残留グルタチオンをエルマン試薬を使用して分析した。ヨードアセチル−５ｃｕ ＰＡのアミド溶解活性はペプチド基質Ｓ−２４４４を使用してこれをプラスミン で活性化してから分析した。表３にアネキシンＶに対するヨードアセチル基のモ ル数とヨードアセチル−５ｃｕＰＡのアミド溶解活性とを示した。この結果から 、ヨードアセチル−５ｃｕＰＡは非変性の５ｃｕＰＡとおなじアミド溶解活性を 持つことが分かる。 塁澄 ２　０．４４　１０６　０．１６３　９４３　０．５４　０．８　０．１６９　 １０６４　０　０　０．１７４　１００ 実施例１５ 上記のようにして作成したスルフヒドリルーアネキシンＶとヨードアセチル−５ ｃｕＰＡとを混合し、暗所に３７°Ｃで１時間放置した。生成物を５ＤＳ−ポリ アクリルアミドゲルに付して分離し、抗−ｓ　ｃｕＰＡおよび抗−アネキシンＶ 抗体を使用して免疫プロッティング分析により調べた。（ここで、６．７ｎｍｏ ｌのスルフヒドリルーアネキシンＶの３種の異なる処方、すなわちスルフヒドリ ル基／アネキシンのモル比を１．３１．０．８２および０．５７としたものを６ ．７ｎｍｏｌのヨードアセチル−５ｃｕＰＡと接合した。）約９２．０００の分 子量の種として移動したバンドが両抗体により検出され、すなわち９２．０００ の種が７ネキシンＶ／５ｃｕＰＡの接合と高いスルフヒドリル基含有量を持つ場 合にはもつと多くの接合体が形れなかうた。 実施例］６ アネキシンＶ−Ｎ１を、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇ ｌｙ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ　（配列番号Ｎｏ、５ ）の配列が成熟アネキシンＶのアミノ末端Ａｌａ残基と結合した配列を持つアミ ノ末端拡張分子となるように作成する。第３Ｃｙｓ残基のＳＨ基はヨードアセチ ル−５ｃｕＰＡとの接合に使用できる。　アネキシンＶ−ＮＩ　ＤＮＡを欅築す るために、（５°−ＣＡＴＧＧＣＡＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＧＴＧＧＴＣＣＧＴＣ ＴＧＧＴＧＧＴＣＣ−３’　（配列番号Ｎｏ、６）と５°−ＣＡＴＧＧＧＡＣＣ ＡＣＣＡＧＡＣＣＧＡＣＣＡＣＣＡＧＡＣＧＧＧＣＡＴＧＣ−３’　（配列番号 Ｎｏ、７）とのＮｃｏＩ部を含む２つの相補オリゴヌクレオチドを標準的な方法 により合成し、精製し、ホスホリル化し、そしてアニーリングした。プラスミド ｐＰＡＰ−１−３１９（タイトおよびスミス、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　（１９９１）　２８８．１４１）をＮｃｏＩで消化した。次 いでこの２本鎖オリゴヌクレオチドをこのプラスミド中にライゲートしてプラス ミドｐＰＡＰ−Ｉ−ＮＩを創製した。そのＤＮＡｌＥ列からこの組換えプラスミ ドは目的の配列を含むことが確認された。この組換え蛋白をタイトらの方法（タ イトおよびスミスの上記文献）に従って発現させそして精製した。 形質転換大腸菌細胞をｌＯリットルの培養物から採取し、５０ｍＭＮａｃｉｌを 含む５０ｍＭ）リスーＭＣＩ緩衝液（ｐＨ７，４）で１回洗浄した。ｔＩ６Ｍ尿 素、１％トリトンＸ−１００，０，１ｍＭジイソプロピルフルオロリン酸塩およ び１０ｍＭＥＤＴＡを含有するリン酸塩緩衝液（：’ｐ：ａ’ｒ、４）２５０ｍ １中に細胞を懸濁し、３回それぞれ１分間音波処理Ｌ′？：。この細胞溶解物を １５．ＯＯＯｒｐｍで２０分間遠心分離して、その上澄み液を採取し、５０ｍＭ ＮａＣｌと１ｍＭＥＤＴＡとを含む５１）ｒｔｎＭ　）リスーＭＣＩ緩衝液（ｐ Ｈ７，４）に対して透析した。ついでこのサンプルを同じ緩衝液を使用してモノ Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に付し、ＮａＣ１傾斜（０，０５−ＬＭ）溶 出した。アネキシンＶ−Ｎ１を点プロッティングにより検出し、アネキシンＶ− Ｎｌを含む画分を集めて限外濾過により濃縮した。この濃縮サンプルをＴＳＫゲ ルＧ３０００ＳＷＸＬ　（２０Ｘ５００ｍｍ）カラムに付し、アネキシンＶ−Ｎ １を含む両分（点ブロッティングにより検出された）を集めて濃縮した。アネキ シンＶ−Ｎ１の禁止活性を上記の凝血活性により測定し、その結果からアネキシ ンＶ−Ｎ１と野生型アネキシンとは同じ活性を持つことが分かった。この蛋白配 列の分析から、アネキシンＶ−Ｎ１は目的のアミノ末端オリゴペプチドを持ち、 アミノ末端メチオニンの欠失したものであることが確認された。 本文中に引用した参考文献はすべてその都度文中に示した。 本発明の方法および組成物は様々な態様が可能であり、その一部を本明細書中に 例示したものであることを理解されたい。本発明はその精神ならびに本質的な特 徴を逸脱しない限りその他のあらゆる態様をもその範囲に含むものである。本文 中に例示した態様は単なる例示のためのものであり本発明を限定するものではな い。従って、本発明の範囲は上記の記載よりもむしろ下記の請求の範囲に示され るものである。そしてその意図するところならびに請求の範囲の記載と均等であ る範囲におけるあらゆる変更も本発明の範囲内に含まれるものである。 要約書 リン脂質に対して親和性を有する接合体を開示しである。これら接合体は約１０ −’Ｍよりも大きくない解離定数を持ったリン脂質に対する親和性を有する第１ の化合物と、血栓を溶解するかあるいは血栓を溶解する化合物の前駆体である第 ２の化合物とからなる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）約１０−７Ｍよりも大きくない解離定数を持った、リン脂質に対する 親和性を有する第１の化合物と、（ｂ）血栓を溶解するか、あるいは血栓を溶解 する化合物の前駆体である第２の化合物とからなる接合体。 ２．該第１の化合物がアネキシンである請求の範囲第１項に記載の接合体。 ３．該アネキシンがアネキシンＶである請求の範囲第２項に記載の接合体。 ４．該第２の化合物がストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲ ン活性化剤またはプロウロキナーゼである請求の範囲第１項に記載の接合体。 ５．該第２の化合物が変性ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノ ーゲン活性化剤またはプロウロキナーゼである請求の範囲第１項に記載の接合体 。 ６．該第２の化合物が欠失型化合物である請求の範囲第５項に記載の接合体。 ７．該第２の化合物がウロキナーゼである請求の範囲第４項に記載の接合体。 ８．（ａ）約１０−７Ｍよりも大きくない解離定数を持った、リン脂質に対する 親和性を有する第１の化合物と、（ｂ）血栓を溶解するか、あるいは血栓を溶解 する化合物の前駆体である第２の化合物と、 （ｃ）薬理的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とからなる治療用組成物。 ９．該第１の化合物がアネキシンである請求の範囲第８項に記載の治療用組成物 。 １０．該第１の化合物がアネキシンＶである請求の範囲第９項に記載の治療用組 成物。 １１．該第２の化合物がストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノー ゲン活性化剤またはプロウロキナーゼである請求の範囲第８項に記載の治療用組 成物。 １２．該第２の化合物が変性ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミ ノーゲン活性化剤またはプロウロキナーゼである請求の範囲第８項に記載の治療 用組成物。 １３．該第２の化合物が欠失型化合物である請求の範囲第１２項に記載の治療用 組成物。 １４．該第２の化合物がウロキナーゼである請求の範囲第１１項に記載の治療用 組成物。 １５．（１）（ａ）約１０−７Ｍよりも大きくない解離定数を持った、リン脂質 に対する親和性を有する第１の化合物と、（ｂ）血栓を溶解するか、あるいは血 栓を溶解する化合物の前駆体である第２の化合物とからなる接合体と、（２）薬 理的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とからなる組成物の治療効果的量を 治療の必要な宿主に投与することからなる血栓を溶解する方法。 １６．該第１の化合物がアネキシンである請求の範囲第１５項に記載の方法。 １７．該第１の化合物がアネキシンＶである請求の範囲第１６項に記載の方法。 １８．該第２の化合物がストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノー ゲン活性化剤またはプロウロキナーゼである請求の範囲第１５項に記載の方法。 １９．該第２の化合物が変性ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミ ノーゲン活性化剤またはプロウロキナーゼである請求の範囲第１５項に記載の方 法。 ２０．該第２の化合物が欠失型化合物である請求の範囲第１９項に記載の方法。 ２１．該第２の化合物がウロキナーゼである請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２２．該第１の化合物と該第２の化合物とを化学的に結合させて得た請求の範囲 第１項に記載の接合体。 ２３．該第２の化合物に結合した該第１の化合物の融合蛋白を作ることによって 得た請求の範囲第１項に記載の接合体であって、該融合蛋白が該第１および該第 ２の化合物をコードする配列からなる組換え核酸を担持する宿主により発現され たものであり、そして該触合蛋白を再生したものである前記接合体。 ２４．該第２の化合物がハイブリッド型化合物である請求の範囲第５項に記載の 接合体。 ２５．該第２の化合物がハイブリッド型化合物である請求の範囲第１２項に記載 の治療用組成物。 ２６．該第２の化合物がハイブリッド型化合物である請求の範囲第１９項に記載 の方法。 ２７．（ａ）約１０−７Ｍよりも大きくない解離定数を持った、リン脂質に対す る親和性を有する第１の化合物と、（ｂ）血栓を溶解するか、あるいは血栓を溶 解する化合物の前駆体である第２の化合物とからなる接合体を製造する方法であ って、該第１の化合物と該第２の化合物とを化学的に結合させることからなる前 記方法。 ２８．システイン残基を含むオリゴヌクレオチドを該第１の化合物のアミノ末端 に付着させ、そしてシステイン残基のＳＨ基を該第２の化合物のＮＨ２基と化学 的に結合させることからなる請求の範囲第２７項に記載の方法。 ２９．該第１の化合物がスルフヒドリフ基を有するものである請求の範囲第２７ 項に記載の方法。 ３０．該第２の化合物がヨードアセチル基を有するものである請求の範囲第２７ 項に記載の方法。 ３１．（ａ）約１０−７Ｍよりも大きくない解離定数を持った、リン脂質に対す る親和性を有する第１の化合物と、（ｂ）血栓を溶解するか、あるいは血栓を溶 解する化合物の前駆体である第２の化合物とからなる接合体を製造する方法であ って、（１）該第１の化合物をコードする遺伝子とそれに直接または間接的に結 合した該第２の化合物をコードする遺伝子とを持つプラスミドを構築し、 （２）このプラスミドを宿主中に導入して形質転換体を得て、（３）この形質転 換体を培養して第１の化合物とそれに直接または間接的に結合した第２の化合物 とからなる融合蛋白を発現させ、そして（４）この融合蛋白を培養物から回収す ることからなる前記方法。 ３２．該プラスミドが、その５′から３′位に、第２の化合物をコードする遺伝 子とリンカーと第１の化合物をコードする遺伝子とを担持するものである請求の 範囲第３１項に記載の方法。 ３３．該リンカーがヒルジンのアミノ酸残基の第５０番目から第６０番目のアミ ノ酸残基をコードする塩基配列を持つものである請求の範囲第３２項に記載の方 法。 ３４．該プラスミドが、その５′または３′位に、第１の化合物をコードする遺 伝子とリンカーと第２の化合物をコードする遺伝子とを担持するものである請求 の範囲第３１項に記載の方法。