JPH02500950A - 組換えハイブリッド免疫グロブリン分子及び使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えハイブリッド免疫グロブリン分子及び使用方法発明の分野 本発明は、プラスミノーゲンアクチベータ−（活性化因子）の活性部分を含む第 二タンパク質に結合せしめられたフィブリンに特異的な抗原結合部位を有する組 換えハイブリッド免疫グロブリン分子に関する。本発明は、これらの新規ハイブ リッド免疫グロブリン分子のクローニング及び産生にも関する。本発明は、免疫 診断及び免疫治療プロセスにおいてこれらのハイブリッド免疫グロブリン分子を 用いる方法にも更に関する。

発明の背景 大半の心筋梗塞は冠動脈血栓により引き起こされる〔ブラッドら２ニ二一イング ランド・ジャーナル・オブ・メディシン、第３０３巻、第８９７頁、１９８３年 （ＤｅＷｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｅｖ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ ｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３０３　：８９７（１９８３）））。心筋梗塞を引き起 こす冠動脈血栓は、血栓溶解剤（血栓崩壊剤）によって溶解させることができる 。これらの血栓溶解剤は、プラスミノーゲンからフィブリン溶解酵素プラスミン への変換を活性化するプラスミノーゲンアクチベーターである。プラスミンは血 栓中に存在するフィブリンを溶解させる。プラスミノーゲンアクチベーターによ るこの治療法は、副作用なしというわけではない。プラスミンは非選択的に作用 し、したがって血栓中のフィブリンを溶解させるだけでなくフィブリノーゲン及 び凝固因子をも攻撃することから、重度の出血体質にしてしまうことが多い。

ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ及び組織型ブ、ラスミノ ーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）は、血栓を溶解させるための公知のプラスミノ ーゲンアクチベーターである。これらのアクチベーターは、梗塞、発作、肺塞栓 、深部静脈血栓、末梢動脈閉塞及び他の静しかしながら、ストレプトキナーゼ及 びウロキナーゼは深刻な制限を有する。フィブリンに対する低いアフィニティー のせいで、双方のアクチベーターは循環性及びフィブリン結合性のプラスミノー ゲンを無差別的に活性化する。循環血液中で形成されるプラスミンは、それが血 栓溶解に用いられる前に中和されてしまう。残留プラスミンは例えばフィブリノ ーゲン、第Ｖ因子及び第■因子のような数種の凝固因子タンパク質を分解して、 出血傾向を引き起こす。更に、ストレプトキナーゼは強抗原性であって、高抗体 力価の患者は治療に対して有効に応答せず、継続的治療を続けることができない 。

ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーターはフィブリンと結合することができ 、したがって血栓に極めて近いプラスミノーゲンの活性化を特に促し、循環中の それ以外のフィブリノーゲンにはほとんど作用しない。しかしながら、冠動脈血 栓の溶解を促進するために要する用量での組織型プラスミノーゲンアクチベータ ーの使用は出血を引き起こすこともある。

血栓に対する血栓溶解剤の特異性を増加させるために、ウロキナーゼをフィブリ ン特異性抗体に共有結合させれば、フィブリン溶解能及び特異性を著しく高める ことができる。ボードら、サイエンス、第２２９巻、第７６５−７６７頁、１９ ８５年（Ｂｏｄｅ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２２９ニア８５−７６７（ １９８５）　）。

すべての抗体分子の１つの機能特性は、抗原決定基に対して特異的結合すること である。抗体はインビボで二価の単一特異性であって、２つの同一抗原結合部位 を有する。抗体分子による抗原の特異的結合性・は、Ｈ及びＬ鎖双方の可変領域 （Ｆ　ａｂ）の抗体構造によって決定される。

二重特異性を有する抗体は、異なる特異性のある抗体を２本のＨ鎖を互いに結合 しているジスルフィド結合の選択的開裂に付すことにより作製される。次いで、 抗体半分子は二重特異性のあるハイブリッド抗体を得るために中性ｐＨ下で再会 合される。ニソンホフら、ネーチャー（ロンドン）、第１９４巻、第３５５頁、 １９６２年（Ｎｉｓｏｎｈｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ ）、１９４：３５５（１９６２）　）　；ブレナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）ら、サイ エンス、第２２９巻、第３１頁、１９８５年；リューら、プロシーディング・オ ブ・ナショナル・アカデミ−崇オブ争サイエンスＵＳＡ。

第８２巻、第８６４８頁、１９８５年（Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｔ、。

Ｐｒｏｃｅｅ−ｄ−ｔｎｇ　ｏｆ’　Ｎａｔｉｏｎａｌ　ＡｃａｄｅｌＩｙ　ｏ ｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　ＵＳＡ、８２　：８Ｂ４ｇ（１９８５））　；共同譲渡さ れた同時係属米国特許出願第８５１．５５４号明細書、１９８６年４月１４日付 出願参照。

二特異性抗体はハイブリドーマがらも産生された。抗体産生ハイブリドーマ細胞 の融合にょる二特異性モノクローナル抗体の産生については、ミスルタイン（Ｘ ｉ　１ｓｔｅｉｎ）及びクエＯ（Ｃｕｅｌ　Ｉｏ）、ネーチャー（ロンドン）。

第３０５巻、第５３７頁、１９８３年並び１．：　Ｐ　ＣＴ出願ＷＯ第８３／１ ０３６７９号明細書で記載されている。

抗体は、組換えＤＮＡ技術によってもクローニングされかつ産生された。Ｈ及び Ｌ鎖に関する遺伝子は適切な宿主中に導入され、発現され、しかる後これらの個 々の鎖が機能性抗体分子に再集合された〔例えば、マンロー（Ｍｕｎｒｏ）　＋ 　ネーチャー、第３１２巻、第５９７頁。

１９８４年：モリソン、　Ｓ、　Ｌ、　（Ｍｏｒｒｌｓｏｎ、Ｓ、Ｌ、）　＊サ イエンス、第２２９巻、第１２０２頁、１９８５年；オーイら、バイオテクニク ス、第４巻、第２１４頁。

１９８６年（Ｏｆ　ｅｔ　ａｌ、、ＢｌｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４：２１４（ １９８Ｂ））　；ウッド（ｗｏｏｄ）ら、ネーチャー、第３１４Ｕ巻、第４４６ −４４９頁、１９８５年参照〕。Ｌ及びＨ鎖可変領域は外来宿主中でクローニン グされ、発現されて、それらの結合能を維持していた〔ムーア（Ｍｏｏｒｅ）ら 、欧州特許公開第８８９９４号明細書（１９８３年９月２１日付公開）］。

キメラ又゛はハイブリッド抗体は、組換えＤＮＡ技術によっても作製された。オ ーイ及びモリソン、バイオテクニクス、第４巻、第２１４頁、１９８６年では、 キメラ抗体を産生ずるための方法について記載している。

第２１８−２２０頁では、キメラ：ヒトＩｇＧ抗Ｌｅｕ３抗体が記載されている 。著者らは、キメラマウス：ヒト抗ダンシル抗体が得られたと述べている。こΦ 論文では、詳細に述べているわけではないが、Ｌｅｕ３結合特異性及び抗ダンシ ル結合特異性が単一免疫グロブリン分子中に一緒に組込まれたことを示している 。

モリソン、サイエンス、第２２９巻、第１２０２頁。

１９８５年では、第１表において、可変り又は可変Ｈ鎖領域が非１ｇ配列に結合 されて融合タンパク質を得ることができると述べている。この論文では、融合タ ンパク質について可能な用途は３つ：即ち（１）アッセイ用の酵素に抗体特異性 を付与すること；（２）抗原カラムによって非１ｇタンパク質を単離すること； 及び（３）特異的に毒性剤を放出することであると述べている。しかしながら、 この参考文献において、いずれの特異的キメラ免疫グロブリン分子に関しても記 載がない。

ニューバーガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）ら、ネーチャー。

第３１４巻、第２６８頁、１９８５年では、そのＨ鎖がハブテンの４−ヒドロキ シ−３−ニトロフェニルアセチルに特異的なマウス可変領域に融合されたヒト不 変領域であるキメラ抗体について記載している。

欧州特許出願第１２０，６９４号明細書では、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ 　ｃｏｌｔ）宿主細胞中で発現される免疫グロブリン分子の可変及び不変領域の 遺伝子工学について記載している。その出願明細書の第１０頁では、免疫グロブ リン分子が不変ドメインの１つに結合されたもう１つのペプチド部分と共に宿主 細胞で合成されると述べている。

このペプチド部分は、細胞毒性又は酵素性のいずれかとして記載されている。第 １０頁では、免疫グロブリン分子が治療剤を含んでいてもよいとも述べている。

出願明細書及び実施例中の説明では、４−ヒドロキシ−３−二トロフェニルアセ クール（ＮＰ）ハブテンと結合するモノクローナル抗体から得られるλ様鎖の用 途について記載している。

欧州特許出願第１２５．０２３号明細書では、キメラ又はそれ以外に修正された 免疫グロブリン分子を産生ずるための組換えＤＮＡ技術の適用に関する。これら の免疫グロブリン分子に関して第３−４頁で記載された用途の１つは、特定の標 的病組織に対する抗体を患者に注射することによる全身的診断及び治療のための 用途である。

疾患の存在は適切な標識を抗体に結合させて調べることができ、又は病組織は適 切な薬物を抗体で運んで攻撃することができる。出願明細書では、″改造抗体” として薬物の特異的放出を補助しうるように工学処理された抗体についで記載し ている。

ＰＣＴ出願ＷＯ第８３／３９７１号明細書は、抗体−酵素活性毒素を含むハイブ リッドタンパク質に関する。

ＰＣＴ出願ＷＯ第８３／１５３３号明細書では、酵素の活性部分を含む第二タン パク質の一部に結合された免疫グロブリン分子の可変領域を有するキメラ抗体に ついて第５頁で記載している。

ボーリアン（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ）ら、ネーチャー、第３１２巻。

第６４３頁、１９８４年では、トリニトロフェニルハブテンに特異的なマウス可 変領域についてコードするＤＮＡセグメントがヒトμ及びに不変領域についてコ ードするセグメントに結合された免疫グロブリン遺伝子について作製した。これ らのキメラ遺伝子は、機能性ＴＮＰ結合キメラＩｇＭとして発現された。

モリソンら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ ンスＵＳＡ、第８１巻。

第６８５１頁、１９８４年では、ヒトにＬ鎖遺伝子のエキソンに結合された抗ホ スホリルコリンミエローマタンパク質遺伝子のＨ鎖可変領域エキソンを利用して キメラ分子を作製していた。その遺伝子はマウスミエローマ細胞系中にトランス フェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）され、抗原結合機能のあるキメラマウス−ヒト ＩｇＧを産生ずる形質転換細胞を生じた。

シャロン（Ｓｈａｒｏｎ）ら、ネーチャー、第３０９巻。

Ｍ６０４’頁、１９８４年では、アゾフェニルアルソネートに特異的なマウスＨ 鎖可変領域についてコードする遺伝子をマウスにＬ鎖不変領域遺伝子と融合させ ていた。

この構造体は、適切なミエローマ細胞系中に導入された場合に、対応ｖＬ−にポ リペプチド鎖と二量体化したポリペプチド鎖を生じた。ｖＨＫｖＬＣＫ分子は、 アゾフェニルアルソネートハブテンと結合した。

二ニーバーガーら、ネーチャー、第３１２巻。

第６０４頁、’１９８４年では、ハブテン特異性抗体のＨ鎖可変領域遺伝子をミ クロコツカスヌクレアーゼの合成について指示する遺伝子と結合させ、抗原結合 性及び酵素活性の双方を有するハイブリッド分子を得ていた。

フィブリノーゲンよりもフィブリンに対する高いアフィニティー及び特異性によ って特徴付けられかつフィブリン含有血栓の近位環境においてのみプラスミノー ゲンの活性化を促す選択プラスミノーゲンアクチベーターを得ることが望まれる のである。

発明の要旨 本発明は、プラスミノーゲンアクチベーターの活性部分を含む第二タンパク質に 結合せしめられたフィブリンに特異的な抗原結合部位を有する組換えノー免疫グ ロブリン分子ブリン分子に関する。本発明は、これらの新規Ｉ＼イブリッド免疫 グロブリン分子のクローニング及び産生にも関する。本発明は、免疫診断及び免 疫治療プロセスにおいぞこれらの組換えハイブリッド免疫グロブリン分子を用い る方法にも更に関する。

本発明は、ハイブリッド免疫グロブリン分子についてコードする遺伝子配列、か かる遺伝子配列を含むクローニング及び発現ベクター、かかるベクターで形質転 換された宿主、並びにかかる宿主中に存在する遺伝子配列の発現によるこのよう なハイブリッド分子の産生方法にも関する。

図面の説明 第１図は、Ｈ鎖ｔＰＡ融合タンパク質についてコードする発現プラスミドｐＳＶ Ｄ８ｔの構造について示している。コード配列は円外の標識で示され、組立てに 用いられる制限部位は円内で示されている。略号：ＶＤＪ。

産生５９Ｄ８Ｈ鎖再配列；２ｂ−ＣＨ，ネズミ２ｂＨ鎖不変領域のゲノム配列； ｔＰＡ、ヒトｔＰＡ鎖についてコードするｃＤＮＡ配列；３’　−ＵＴ、ヒトｔ ＰＡｃＤＮＡの３′−非翻訳配列；Ａｍｐ　’、ｐＢＲ３２２アンピシリン耐性 遺伝子；　ｇｐ　ｔ、ＳＶ４０プロモーターにより作動される大腸菌グアニンホ スホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子：Ｒ１，ＥｃｏＲｌ。

第２図は、組換えタンパク質の触媒活性とメラノーマｔＰＡの活性とを比較する 発色原基質アッセイについて一２２８８アッセイは１０１０５ｎ白丸印）又は７ ０ｎｇ（白画角メ）の組換えタンパク質で行われた。実線は、標準として用いら れた５０ｎｇ（黒丸印）、４０ｎｇ（黒画角印）又は３０ｎｇ（黒三角印）のメ ラノーマｔＰＡの触媒活性について示している。組換えタンパク質の相対的モル 活性は、同様の触媒速度のｔＰＡ標準との比較により決定された。第２Ｂ図：Ｓ −２２５１アッセイはメラノーマｔＰＡ標準（白丸印）、組換えタンパク質（黒 丸印）及び牛トリプシン（白三角印）の各種アクチベーターで行われた。各タン パク質の活性単位は、Ｓ−２２８８アツセイで決定された。

第３図は、５９Ｄ８抗フィブリン抗体及び組換えタンパク質の結合作用の比較に ついて示している。曲線は、様々な濃度の可溶性フィブリンモノマーとの競合に よる固相フィブリンモノマーへの抗体結合阻害について表している。組換え抗体 （点線）は、抗体（実線）の場合よりも５０％阻害に関してやや高い濃度の可溶 性フィブリンを要し、したがってフィブリンとやや弱く結合するのである。この 差異は１０倍以下である。

発明の詳細な説明 本発明は、抗原結合性及び酵素活性の双方を有するハイブリッド免疫グロブリン 分子に関する。更に詳しくは、本発明は、プラスミノーゲンアクチベーターの活 性部分を含む第二タンパク質に結合せしめられたフィブリンに特異的な抗原結合 部位を有する組換えハイブリッド免疫グロブリレ分子に関する。本発明は、これ らの新規ハイブリッド免疫グロブリン分子のクローニング及び産生にも関する。

本明細書全体において、“ハイブリッド免疫グロブリン分子°という用語は、フ ィブリン特異性抗体の全部又は一部及びプラスミノーゲンアクチベーターの全部 又は一部を含んだ組換えＤＮＡ技術によって産生される単一分子を表すために用 いられる。異種三機能性抗体、異種抗体、二特異性抗体、異種結合抗体、抗体二 重体及び異種二量体とはすべて、更に詳しくいうと、二重特異性、即ち１分子中 に２つの抗体結合部位のあ茗抗体に関する用語である。

本明細書で用いられるフィブリン特異性とは、フィブリンに対して産生された抗 体を意味する。血液が血管構造から出ると、酵素反応の複雑なカスケードによっ てフィブリノーゲンを凝固血液中の構造タンパク質たるフィブリンに変換する。

フィブリノーゲン自体は、最少の血漿タンパク質可溶成分である。３４０，００ ０ｋｄＭＶであって、Ａα、Ｂβ及びγと呼ばれる３対の非同一ポリペプチド鎖 から生じる２回（ｔｗｏ−ｒｏｌｄ）対称性を有している。血栓部位において、 凝固カスケードはトロンビンを生成するように活性化されるが、これは極性ペプ チド（ＡαからフィブリノペプチドＡ及びＢβからフィブリノペプチドＢ）を酵 素的に開裂してフィブリンモノマーを形成させる。フィブリンモノマーは一層溶 解しにくく、自発的にポリマー化して、ゲル網状組織を形成する。ポリマー化後 、フィブリン凝塊はｔＪ　Ｘ　Ｉｆｆ　ａ因子により安定化されるが、これは共 有鏡開ｅ−（ｇ−グルタミル）リジン結合を導入する。フィブリノーゲン及びフ ィブリンはそれ゛らの構造が９８％以上同一であって、フィブリンα及びβ鎖の ２つの新たに露呈されたアミノ末端においてのみ異なる。これらフィブリンアミ ノ末端のアミノ酸配列は公知である。ドーリットル、　Ｒ，Ｆ、　（Ｄｏｏｌｊ ｔｔｌｅ。

Ｒ，Ｐ、）　、“フィブリノーゲン及びフィブリン°、パットナム、ｐ、Ｗ、　 （Ｐｕｔｎａｍ、ＦＪ、）編集、血漿タンパク質：構造、機能及び遺伝子コント ロール、第３版、第２巻。

ニューヨーク：アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）。

１９７５年、１０９−１５６゜ 本発明で使用可能なフィブリンエピトープとしては、フィブリンβ鎖のアミノ末 端、フィブリンα鎖のアミノ末端、プラスミン開裂部位及びγ鎖架橋結合部位の カルボキシ末端であるβ（４３−４９）アミノ酸配列がある。

フィブリンに対して特異性のある抗体は、ヒューイ（Ｈｕｌ）ら、サイエンス、 第２２２巻、第１１２９頁。

１９８３年で記載されていた。更に、同タイプの抗体に関する記載は、“フィブ リノーゲン交差反応性を欠くフィブリン特異性モノクローナル抗体°に関して１ ９８６年１月３０日付で出願された、一般譲渡された同時係属米国特許出願第８ ２４，２２８号明細書で見ることができる。実質上フィブリノーゲン交差反応性 を欠くフィブリン特異性モノクローナル抗体は、１９８６年４月１４日付で出願 された、共同譲渡された同時係属米国特許出願第８５１．５１４号明細書でも見 られる。フィブリンに対して特異性のある抗体の他の例としては、クドリックら 、モレキユラー・イムノロジー、第２１巻、第８９頁、１９８４年［Ｋｕｄｒｙ ｋ　ｅｔ　ａｌ、、）！ｏｌｅｃｕｌａｒ　１ｗｉｕｎｏｌｏｇｙ。

２１：８９（１９Ｂ４）　）　；　“部位選択プラスミノーゲンアクチベーター 並びにそれの製造及び使用方法″に関する１９８５年６月２６日付で公開された コールワード（Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ）の欧州特許出願節１４６，０５０号明細 書；“架橋結合フィブリンに対して特異性のあるモノクローナル抗体及びそれら の診断用途°に関するパンデセン（Ｂｕｎｄｅｓｅｎ）ら、オーストラリア特許 出願節ＡＶ　−Ａ　−２５３８７／８４号明細書がある。

本発明のハイブリッド免疫グロブリン分子を作製する場合に、完全フィブリン特 異性抗体がクローニングされるが、それはハイブリッド分子の一部を含んでいて もよい。しかしながら、ハイブリッド免疫グロブリン分子のサイズを減少させか つ抗原性を減少させるためには、フィブリンを認識しかつそれと結合する抗体領 域のみを用いることが好ましい。

フィブリン特異性抗体のこの領域をクローニングするには、抗体の構造及び機能 の理解が必要である。簡単に言えば、抗体は２本の同一り鎖及び２本の同−Ｈ鎖 からなる四量体免疫グロブリンである。各タンパク質鎖は、２つの基本領域：即 ちＮ末端可変（Ｖ）領域及びＣ末端不変（Ｃ）領域からなる。可変Ｌ（Ｖ）及び Ｈ（ｖＨ）鎖は可変領域ドメインを形成する。可変ドメインは、具体的抗原に対 する認識性及び特異性を決定する。

Ｌ（Ｃ）及びＨ（ＣＨ）鎖の不変領域ドメインは、免り 疫応答に関与するエフェクター機能を媒介する。抗体分子のヒンジ領域（Ｊ）は 、Ｆａｂフラグメントを抗体のＦ　フラグメントに結合している。

可変領域内には、シバ−シティ−（ｄｉｖｅｒｓｌｔｙ）　ドメイン（Ｄ）とし て知られる超可変領域が存在していてもよい。これらのシバ−シティ−ドメイン は、可変領域についてコードする遺伝子中で観察されるエキソンと関係している 。

抗体、即ちタンパク質構造規定の可変ドメインは、Ｌ及びＨ鎖のＶ　及びＶｕ双 方のセグメントからなる。そし れは、Ｌ鎖中に３つ及びＨ鎖中に３つ、合わせて６つの超可変領域を有している 。遺伝子レベルにおいて、３つのエキソンはその枠組み及び超可変領域を含めて ＶＨを特定するのに関係し、２つのエキソンはＶＬを特定している。ｖＬ及びｖ Ｈ双方の最初の２つの超可変領域は、Ｌ及びＨ鎖のＶ遺伝子エキソンによって各 々特定されている。Ｌ宿の３番目の超可変領域は、２つのエキソンＶＬ及びＪＬ によって特定されている。Ｈ鎖の３番目の超可変領域は、３つのエキソンＶ　ａ 　−Ｄ及びＪＨによって特定されている。

免疫グロブリン遺伝子発現は、８９２６球における体細胞組換えによるＣ遺伝子 へのＶ遺伝子の結合を介して生じる。これらの遺伝子は結合されて、完全免疫グ ロブリンを形成する。その場合に、再配列され結合された遺伝子セグメントは、 完全免疫グロブリン又はＬ及びＨ可変鎖の抗原結合ドメインについてコードして いる。

化学的及びイソタイプ性質により特徴付けられる５種の基本クラスがＨ鎖には存 在する。これらのＨ鎖りラスは、μ、γ、δ、α及びεとして呼ばれる。Ｌ鎖に も２種の基本クラス：に及びλが存在する。

本発明において、フィブリンに特異的な抗体はハイブリッド免疫グロブリン分子 の一部としてクローニングされる。好ましくは、フィブリン抗体の可変領域のみ がクローニングされる。可変りもしくは可変Ｈ鎖のいずれか又は双方は、ハイブ リッド分子の一部を成している。更には、フィブリン特異性抗体のヒンジ領域も クローニング可能である。可変領域に結合されたフィブリン特異性抗体のＦａｂ 部分の不変ドメインもクローニングすることができる。

ハイブリッド免疫グロブリン分子においてクローニングされから使用されるフィ ブリン特異性抗体の可変及び不変領域は、哺乳動物源、好ましくはヒト供給源か ら得られる。一方、可変領域は哺乳動物源から、不変領域はヒト供給源から得る こともできる。

本発明で使用可能なプラスミノーゲンアクチベーターとしては、ウロキナーゼ、 プロウロキナーゼ、組織型プラスミノーゲンアクチベーター及びストレプトキナ ーゼがある。プラスミノーゲンがアクチベーターによって血漿の活性フィ゛プリ ン溶解酵素プラスミンに変換される場合には、それはその基質であるフィブリン に対して顕著なアフィニティーを有している。

したがって、“プラスミノーゲンアクチベーター”という用語は血栓溶解剤であ って、本明細書においては利用されるいずれの物質をも含めた意味である。フィ ブリン溶解を含めた血栓溶解に関する他の用語も、当業界で知られている。最も 一般的なプラスミノーゲンアクチベーターはストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ 、プロウロキナーゼ及び組織型プラスミノーゲンアクチベーターであるが、他の いずれのプラスミノーゲンアクチベーター又は血栓溶解剤も本発明で使用可能で ある。

本発明のハイブリッド免疫グロブリン分子を製造する場合に、完全プラスミノー ゲンアクチベーターはハイブリッド分子の一部としてクローニングされ及び発現 される。好ましくは、プラスミノーゲンアクチベーターの活性部分の本がクロー ニングされる。この活性部位又は触媒部位は、例中で記載されているようにルー チンのスクリーニングによって調べることができる。

本発明によりハイブリッド免疫グロブリン分子を得るためのプロセスでは、フィ ブリン特異性抗体及びプラスミノーゲンアクチベーターのクローニング、並びに 単一ハイブリッド分子中でのそれらＤＮＡ配列の発現を必要とする。

ハイブリッド免疫グロブリン分子の作製のために用いられるフィブリン特異性抗 体及びプラスミノーゲンアクチベーターのＤＮＡ配列は、様々な供給源から得ら れる。

これらの供給源としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成りＮＡ及びそれらの組 合せがある。ゲノムＤＮＡは天然イントロンを含んでいても又は含んでいなくて もよい。

ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡから得られるＤＮＡは、様々な方法で得ることができ る。望ましい配列についてコードする細胞が単離され、ゲノムＤＮＡが１以上の 制限エンドヌクレアーゼによって好都合に断片化され、得られたフラグメントが クローニングされ、フィブリン特異性又はプラスミノーゲンアクチベーターにつ いてコードするＤＮＡ配列の存在に関してプローブでスクリーニングされる。

フィブリン特異性抗体の可変領域に関して、再配列されたＨ鎖コードＤＮＡはＶ 、Ｄ及びＪ　ＧＡ域を含んでいてもよい。肯配列された生殖系り鎖コードＤＮＡ は■及びＪ領域を含んでいてもよい。望ましいフィブリン特異性ＤＮＡ配列結合 部位を含むクローニングされたフラグメントが確認されたならば、このフラグメ ントは余分なりＮＡを除去し、一方もしくは双方の末端を修正し、介在配列（イ ントロン）の全部もしくは一部を除去する等のために更に処理することができる 。

可変フラグメントの結合は、結合用にプラント末端化もしくは付着端化された端 部、適切な末端を得るための制限酵素消化、適切な付着端の補充、望ましくない 結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理及び適切なりガーゼによる結合 によって、慣用的技術に従い行われる。

ｃＤＮＡの場合、ＣＤＮＡはクローニングされ、得られたクローンは望ましい可 変又は不変領域についてコードするｃＤＮＡ用の適切なプローブでスクリーニン グされる。望ましいクローンが単離されたならば、ｃＤＮＡはゲノムＤＮＡの場 合と実質上同様の方法で処理される。

しかしながら、ｃＤＮＡの場合にはイントロン又は介在配列は存在しない。

更に、フィブリン特異性抗体の遺伝子及びプラスミノーゲンアクチベーターの遺 伝子は周知の手段により合成され、ハイブリッド免疫グロブリン分子作製用にク ローニングされる。

ハイブリッド免疫グロブリン分子を発現させるためには、適切な宿主により認識 される転写及び翻訳シグナルが必要である。真核宿主は、インビトロで培養する ことができる哺乳動物細胞、特に白血球、更に詳しくはミエローマ細胞又は他の 形質転換もしくは発癌性リンパ球、例えばＥＢＶ形質転換細胞である。一方、細 菌、酵母等の真菌、糸状菌等のような非噴乳動物細胞も使用可能で配列は、ゲノ ムＤＮＡからプロモーター領域と共に得られることがある。宿主細胞が可変領域 と結゛合された転写調節及び翻訳開始シグナルを認識しうる範囲まで、可変領域 コード配列の５′側領域は転写及び翻訳開始調節のために保存しかつ用いること ができる。

可変領域５′側の隣接非コード領域は、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列Ｃ ＡＡＴ配列等のような転写及び翻訳の開始に必要な配列を通常含んでいる。５′ 　−非コード配列は一般的には少なくとも１５０ｂｐ、更に一般的には少なくと も２００ｂｐであって、一般的には約２ｋｂｐ　、更に一般的には約１　ｋｂｐ を超えない。

フィブリン特異性不変領域３′側の非コード領域は、終結化及びポリアデニル化 のようなその転写終結：Ａ節配列のために保存しておいてもよい。しかも、コー ド領域３′側の非コード領域は、免疫グロブリン遺伝子中に重要なエン六ンサー も含んでいる。したがって、不変領域についてコードするＤＮＡ配列に天然で隣 接している３′領域を保存することにより、転写終結シグナルが付与される。転 写終結シグナルが発現宿主細胞中において十分に機能的でない場合には、宿主細 胞中で機能的な３′領域に置き代えてもよい。

フィブリン特異性抗体及びプラスミノーゲンアクチベーターに関する構造体は、 互いに結合して単−ＤＮＡセグメントを形成してもよく、又は単独でもしくはベ クターと共に別々のセグメントとして維持させておいてもよい。

構造体は選択用の遺伝子と共に形質転換によって細胞内に導入され、その場合に 構造体は宿主ゲノム中に組込まれるようになる。通常、構造体は宿主細胞で認識 される複製系をもったベクターの一部となる。

本発明の分子産生用の発現ビヒクルとしては、プラスミド又は他のベクターがあ る。一般に、宿主細胞と適合する種から得られるレプリコン及びコントロール配 列を含んだこのようなベクターは、宿主との関連で用いられる。ベクターは、レ プリコン部位、並びに形質転換細胞に表現型選択を付与しうる特定遺伝子を通常 有している。

例えば、大腸菌は大腸菌種由来プラスミドｐＢＲ３２２を用いて容易に形質転換 される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性に関する遺伝 子を含んでおり°、したがって形質転換細胞を確認しうる容易な手段を提供しう る。ｐＢＲ３２２プラスミド又は他の微生物プラスミドは、それ自体のタンパク 質発現のために微生物によって用いられるプロモーターも含むか、又は含むよう に修正されねばならない。組換えＤＮＡ構造体で最も一般的に用いられるプロモ ーターとしては、β−ラクタマーゼ、ラクトースプロモーター系、λフアージプ ロモーター及びトリプトファンプロモーター系がある。

これらは最も一般的に用いられるが、他の微生物プロモーターも発見されていて 、利用可能である。

例えば、ハイブリッド免疫グロブリン分子の遺伝子構造体は、バクテリオファー ジλ左方プロモーターのコントロール下に置くことができる。コントロールはλ リプレッサーにより行われ、隣接制限部位は公知である。

ハイブリッド免疫グロブリン分子の発現は、非形質転換状態の生物と相同的であ る他の調節配列のコントロール下に置くこともできる。例えば、ラクトース依存 性大腸菌染色体ＤＮＡはβ−ガラクトシダーゼ酵素の作製によりラクトース利用 を媒介するラクトース、即ちｌａｃオペロンを含んでいる。ｌａｃコントロール 要素は、大腸菌に感染性であるバクテリオファージλｐｌａｃ５から得られる。

ｌａｃプロモーター−オペレーター系は、Ｉ　ＰＴＧにより誘導することができ る。

他のプロモーター／オペレーター系又はその一部も同様に使用°可能である。例 えば、コリシンＥ１、ガラクトース、アルカリホスファターゼ、トリプトファン 、キシロース、ｔａｘ等が使用可能である。

好ましい宿主は、組織培養物中インビトロで又は動物体内中インビボで増殖され た哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、正確な部位における正確なホールディ ング（ｆ’ｏｌｄ！ｎｇ）又はグリコジル化を含めて、免疫グロブリンタンパク 質分子を翻訳後修正しうる。

宿主として有用な哺乳動物細胞としては、ＶＥＲＯもしくはＣＨＯ−Ｋｌのよう な繊維芽細胞源細胞又はハイブリドーマ５Ｐ２１０−ＡＧ１４もしくはミエロー マｐ３ｘ６３Ｓｇ８のようなリンパ源細胞及びそれらの誘導体がある。好ましい 哺乳動物宿主細胞としては、Ｓ　Ｐ　２１０及びＪ　５５８Ｌがある。腎臓癌細 胞〔フェリボロら、ジャーナル・オブ・セリニラ−・フィジオロジー、第１２１ 巻、第３６３頁、１９８４年（Ｆｅｒｒａｌｖｏｌ。

ｅｔ　ａ！、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇ ｙ、１２１：１８３（１９８４）））及び３７３細胞〔ベクタら、ＥＭＢＯジャ ーナル、第３巻、第１９０頁、１９８４年（Ｂｅｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢ 。

Ｊｏｕｒｎａｌ、３：　１９０（１９８４））　）のような数種の細胞系はウロ キナーゼを分泌し、トランスフェクション用に用いることができる。

哺乳動物宿主の場合には、数種の可能なベクター系がハイブリッド免疫グロブリ ン分子の発現用に利用しうる。

１つのべ゛フタ−クラスでは、牛パピローマウィルス、ボリオーマウイスル、ア デノウィルス又はＳＶ４０ウィルスのような動物ウィルスから得られる自律的複 製染色体外プラスミドを与えるＤＮＡ要素を利用している。第二のクラスのベク ターは、宿主細胞染色体中への望ましい遺伝子配列の組込みに依存している。導 入されるＤＮＡをそれらの染色体中に安定的に組込んだ細胞は、発現ベクターを 含んだ宿主細胞を選択しうる１以上のマーカーも導入することによって選択する ことができる。マーカーは、例えば抗生物質又は銅等の重金属のような殺生物耐 性を原栄養性として栄養要求宿主に与える。選択マーカー遺伝子は、発現すべき ＤＮＡ遺伝子配列に直接結合させても、又は同時トランスフェクションで同−細 胞中に導入してもよい。付加的要素も、単一鎖結合タンパク質ｍＲＮＡの至適合 成用に必要であろう。これらの要素としては、スプライスシグナル、転写プロモ ーター、エンハンサ−及び終結シグナルがある。このような要素を組込んだｃＤ ＮＡ発現ベクターとしては、オカヤマ。

Ｈ０Ｉモレキュラー・セル中バイオロジー、第３巻。

第２８０頁、１９８３年［Ｏｋａｙａｍａ、Ｈ，、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｅｅｌ 　１Ｂ１ｏ１ｏｇｙ、３：２８０（１９８３）　）及びその他で記載されたもの がある。

様々な転写及び翻訳調節配列が、宿主の性質に応じて用いられる。転写及び翻訳 調節シグナルは、調節シグナルが高レベルの発現を示す具体的遺伝子と関連して いるアデノウィルス、牛パピローマウィルス、サルウィルス等のようなウィルス 源から得られる。一方、アクチン、コラーゲン、ミオシン等のような哺乳動物発 現産物由来のプロモーターも使用可能である。抑制又は活性化を可能にする転写 開始調節シグナルも選択されうるが、その場合には遺伝子の発現が調節される。

温度を変えて発現が抑制もしくは開始されるというように温度感受性であるか又 は代謝゛産物で化学的に調節されやすい調節シグナルが重要である。

他の好ましい宿主は酵母である。酵母は、グリコジル化を含めた翻訳後ペプチド 修正も行いうるという実質的利点を有する。酵母内の望ましいタンパク質産生用 に使用可能な高コピー数のプラスミド及び強プロモーター配列を利用したいくつ かの組換えＤＮＡ方法が存在する。

酵母は、クローニングされた哺乳動物遺伝子産物上のリーダー配列を認識し、リ ーダー配列含有ペプチド（即ち、プレペプチド）を分泌する。

酵母がグルコースに富む培地中で増殖された場合に多量に産生される解糖酵素に ついてコードする活性発現遺伝子由来のプロモーター及び終結要素を組込んだ酵 母遺伝子発現系であればいずれも利用可能である。公知の解糖酵素も非常に効果 的な転写コントロールシグナルを与えることができる。例えば、ホスホグリセリ ン酸キナーゼ遺伝予めプロモーター及びターミネータ−シグナルも利用可能であ る。

これらの構造体を含むベクター又はＤＮＡ配列が発現用に作製されたならば、Ｄ ＮＡ構造体は適切な宿主中に導入される。プロトプラスト融合、リン酸カルシウ ム沈降、エレクトロポレーシヨン（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）又は他の 慣用的技術のような様々な技術が利用される。融合後、細胞は選択培地で増殖さ れ、そこで非形質転換細胞が殺されて、ＤＮＡ構造体で形質転換された細胞のみ を残留させる。遺伝子発現の結果としてアセンブリー化し、ハイブリッド免疫グ ロブリン分子を形成する。

大部分の宿主細胞、特にミエローマ又はリンホーマ細胞は、永続的細胞である。

これらの細胞は培養フラスコ内の適切な栄養培地中で培養されるか、又はマウス もしくはラット等のシナ−ジェニック（ｓｙｎｅｒｇｅｎｉｃ）宿主、免疫欠損 宿主又はヌードマウスもしくはハムスター嚢（ｐｏｕｃｈ）等の宿主部位中に注 入される。特に、細胞は腹水産生及びキメラレセプター回収のために腹腔内にい れられる。一方、細胞は皮下注入してもよく、抗体は宿主の血液から回収される 。細胞はハイブリドーマ細胞と同様の方法で用いられる。参考のため本明細書に 組込まれるダイアモンド（Ｄｉａωｏｎｄ）ら、ニューイングランド・ジャーナ ル・オブ・メディシン、第３０４巻、第１３４４頁、１９８１年：ケナット（Ｋ ｅｎｎａｔｔ）　、？−／クカーン（ＭｅＫｅａｒｎ）　’及びベクトール（Ｂ ｅｃｈｔｏｌ）　（編集）、モノクローナル抗体：ハイブリドーマ−生物学的分 析の新しい次元、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）、１９８０年参照。

ハイブリッド免疫グロブリン分子は、抽出、沈降、クロマトグラフィー、アフィ ニティークロマトグラフィー１電気泳動等のような慣用的条件に従い単離精製さ れる。

好ましい方法は、選択的にハイブリッド分子を単離するための、フィブリンβ鎖 のアミノ末端へブタペプチド（抗フィブリン部位に結合する）又はベンズアミジ ン（プラスミノーゲンアクチベーター触媒部位に結合する）のいずれかによるア フィニティークロマトグラフィーである。

本発明はハイブリッド免疫グロブリン分子を用いる免疫治療及び免疫診断方法も 提供する。免疫治療及び免疫診断応用において、ハイブリッド免疫グロブリン分 子は患者に投与され、ハイブリッド分子のフィブリン特異的結合部位によって血 栓部位に局在化するようになる。血栓は、ハイブリッド分子のプラスミノーゲン アクチベータ一部分の酵素活性により溶解される。当業者であれば明らかなよう に、フィブリン特異性プラスミノーゲンアクチベーターハイブリッド分子の特異 性は、血栓との付着選択性及びその溶解を可能化し、ひいては出血のように深刻 な副作用の危険性を低下させる。

本発明のハイブリッド免疫グロブリン分子は、インビボ免疫診断°を含めた免疫 診断分野にも用いることができる。この分野において、ハイブリッド分子は放射 性核種で検出可能に標識される。放射性核種は、所定タイプの装置で検出されう る崩壊型でなければならない。更に、インビボ診断用の放射性核種は、最大取込 み時間経過後でもなお検出可能な程十分長いが但し診断後に望ましくない放射能 が患者に残らない程十分短い半減期を有しているべきである。放射性核種をタン パク質及びひいてはハイブリッド分子にカップリングさせることは当業界で公知 であり、直接に又は中間官能基に間接的にいずれかで通常行われる。インビボ診 断に使用可能゛な放射性同位元素ノ例トシテハ、９９Ｔｃ、１２３１Ｓ１３１　 ｌ、１１１．、．９７Ｒｕ、６７ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａ８．８９Ｚ ｒ及び２０１Ｔ、力、ある。

インビボ診断用の常磁性同位元素も、本発明の方法に従い用いることができる。

磁気共鳴エネルギー技術用に特に有用な元素の例としては、１５７Ｇｄ、５５Ｍ ｎ、　１６２Ｄｙ、５２Ｃ「及び５８ｐｅがある。

ハイブリッド免疫グロブリン分子は、薬学上許容される担体と共に医薬組成物を 更に構成することができる。

これらの担体は当業界で周知であり、塩水及び緩衝液を含めた水性もしくは溶媒 乳濁液又は懸濁液がある。例えば、レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ’ｓ　ＰｈａｒｇａｃｅｕｔｉｅａｌＳｃｌｅｎｃｅｓ）　（１９８０年、第１ ６版）で記載されているような製剤技術。

ハイブリッド免疫グロブリン分子投与の用量範囲は、血栓の存在を検出しうるに 十分多い範囲である。投与量は、発疹又はアナフィラキシ−ショック等のような 副作用を引き起こすほど多くてはならない。一般に、投与量は患者の年齢、症状 、性別及び重篤度に応じて変動する。

反症状としては過敏症及びその他があるが、個々の医者によって調整することが できる。投与量は、０．０１〜５０Ｃ）ｎｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１〜 ２００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。ハイブリッド免疫グロブリン分子は、注射又 は時間をかけた徐々の潅流によって非経口的に投与される。それらは静脈内、腹 腔内、筋肉内又は皮下的にも投与することができる。

ここまで本発明を一般的に記載しており、本発明は具体例を参考にして更に容易 に理解されるようになるであろうが、但しこれらは説明のみの目的で本明細書中 に含まれているのであって、他に指摘のない限り限定するためのものではない。

例 ３−　（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ） 及び２−イミノチオランはピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）から得られ、セファ０−ス （Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂ−ＣＬはファルマシア（Ｐｈａｒａ＋ａｃｉａ）か ら得た。

１２５！フイブリノーゲン（ＩＢＲＩＮ）はアマ−ジャム（Ａａｅｒｓｈａｍ） 製であった。血漿は地方血液銀行から購入した。プロテアーゼ用の発色原基質Ｈ −Ｄ−イソロイシル−Ｌ−プロリル−し−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド二塩 酸塩（Ｓ−２２８８）は、ヘレナ研究所（ｌｌｅｌｅｎａＬａｂｓ）から得た。

他のすべての化学物質は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）又はフィッシャー（Ｆｉｓｈｅ ｒ）のいずれかから得た。

フィブリン特異性抗体６４Ｃ５は、参考のため本明細書に組込まれるヒューイら 、前掲及び共同所有された同時係属米国特許出願第８２４．２２８号明細書で記 載されている。フィブリン特異性抗体５９Ｄ８は、参考のため本明細書に組込ま れる、共同所有された同時係属米国特許出願第８５１．５１４号明細書で記載さ れている。

電気泳動及びオートラジオグラフィー ＳＤＳ　−ＰＡＧＥは、レムリ（Ｌａｅｌｌｍｌり　、　ネーチャー（ロンドン ）、第１７７巻、第６８１頁、１９７０年の方法に従い実施された。タンパク質 は、クマシーブリリアントブルーＲを用いて又は放射性同位元素標識された場合 には一７０℃で２４〜７２時間オートラジオグラフィーにより、いずれかで視覚 化された。

ウロキナーゼ遺伝子のクローニング 触媒性Ｂ鎖コード配列含有の相補的ＤＮＡクローン（ＰＨＵＫ８）は、Ｆ、ブラ シー（Ｆ、Ｂｌａｓｉ）博士から進呈品として得た〔バー１′（Ｖｅｒｄｅ）　 、プロシーディング・オブφナショナル◆アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ 、第８１巻、第４７２７頁、１９８４年〕。このクローンをｐＢＲ３２２で増殖 させ、多量に単離した。

このＤＮＡクローンのセグメントを抗フィブリン抗体遺伝子と共に構造体中で用 い、それを用いてゲノムＤＮＡ配列を単離する。

ｔＰＡ遺伝子のクローニング ヒトｔＰＡ遺伝子（ＰＰＡ３４−Ｆ）の完全鎖長相補的ＤＮＡクローンは、サン ドラ・デジエン（Ｓａｎｄｒａ　Ｄｅｇｅｎ）博士から進呈品として供与された 。ｔＰＡの触媒性Ｂ鎖についてコードする配列はクローンから抽出されたが、２ つの共通制限酵素開裂部位についてコードする合成りＮＡ　（アダプター）の特 異の短鎖セグメントはこの配列の５゛末端に位置していた。このアダプターは、 遺伝子を“枠内°で他のＤＮＡセグメントに都合よく結合させることができる。

この尾部形成（ｔａｉ　１ｏｒｅｄ）クローンは、抗フィブリン抗体遺伝子と共 に構造体中で用いられる。

それはｔＰＡ　Ｂ鎖についてコードするゲノム配列を単離するためにも用いられ るが、その後でゲノム配列は５９Ｄ８遺伝子と共に構造体中で用いられる。

６４Ｃ５のＬ鎖のアミノ末端に相当するように合成された余剰オリゴヌクレオチ ド１７量体及び市販に／Ｊプローブを用いて、産生性６４Ｃ５Ｌ鎖再配列をｐＢ Ｒ３２２中で組立てられたサブゲノムライブラリーからクローニングした。完全 り鎖は、マウスに不変領域についてコードする５、８ｋｂ　ＥｃｏＲ１／Ｂａｍ Ｈ１フラグメントを含んだｐＢＲ３２２プラスミドにクローニングされた再配列 フラグメントを結合させ、セグメントを付加することによって再組立てされた〔 マックスら。

ジャーナルーオブ・バイオロジカル・ケミストリー。

第２５６巻、第５１１６−２０頁、１９８１年（Ｍａｘ　、　ｅｔａｌ、、Ｊｏ ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５［ｉ：５ １１Ｇ−２０＜１９８１））：ｌ。

ＶＪ再配列は正しい向きで不変領域の５′側に位置していた。６４Ｃ５ハイブリ ドーマ由来ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、プレバラティブアガロ ースゲル上でサイズ分別し、しかる後λクローニングベクターに結合させ、サブ ゲノムライブラリーを得た。Ｈ鎖結合領域由来プローブを用いて、再配列された フラグメントをクローニングした。抗体のアミノ末端配列上のオリゴヌクレオチ ドとのハイブリッド化により、６４Ｃ５ハイブリドーマで用いられたＨ鎖再配列 であることがわ５９Ｄ８ハイブリドーマ由来ゲノムＤＮＡをサイズ分別し、λク ローニングベクターに結合させ、上記Ｈ鎖結合領域プローブでスクリーニングし た。双方のＨ鎖再配列をクローニングし、産生体を５９Ｄ８Ｈ鎖のＲＮＡ配列に 基づくオリゴヌクレオチド２０量体との／＼イブリッド化により選択した。

５９Ｄ８又は６４Ｃ５遺伝子の可変及び結合領域並びにエンハンサ−配列を含む クローニングされた制限フラグメントを、ツウスフ２ＢＨ鎖不変領域配列５′側 のプラスミド中に正しい向きで挿入する。この不変領域配列含有プラスミド（Ｐ ｓＶ　ＧＰＴ／７２Ｂ）　は、ｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子、及 びＳＶ４０ウィルスプロモーターのコントロール下にあるグアニンホスホリボシ ルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）遺伝子も含んでいる。それはリチャード・二一 ア（Ｒｌｃｈａｒｄ　Ｎｅｅｒ）博士からの進呈品として得られたものである。

この構造体をアンピシリン耐性遺伝子を介して大腸菌Ｍ　Ｃ１０６１内で増加さ せるが、真核細胞内のＧＰＴ遺伝子発現はキサンチン、ヒボキサンチン及びミコ フェノール酸の存在において選択することができる。

Ｈ鎖不変領域の力、ルボキシ末端についてコードする配列の大部分をその後で除 去した。それを触媒カルボキシ“Ｂ°鎖、ウロキナーゼ又は組織プラスミノーゲ ンアクチベーターについてコードする相補的ＤＮＡフラグメントで置き換えた。

いずれか１つのＨ鎖不変領域遺伝子における３番目のエキソンは、通常のアミノ 酸配列が産生されかつ複合タンパク質が生じるように、プラスミノーゲンアクチ ベーター遺伝子の１つに“枠内′で結合される。この最終構造体を、通常のＨ鎖 産生を停止した適切な５９Ｄ８又は６４Ｃ５ハイブリド一マ変異体中にエレクト ロポレーションによりトランスフェクトする。これらのトランスフェクト体は、 先端を欠（Ｈ鎖の末端におけるプラスミノーゲンアクチベータ一部分と共にフィ ブリン特異性のある抗体分子を産生ずる。

ハイブリッド分子は、抗体結合部位及びウロキナーゼもしくはｔＰＡ配列の双方 を含むハイブリッド分子を得るために、ベンズアミジンセファロース及びβ−ペ プチドセファ０−ス上の連続アフィニティークロマトグラ゛フィーを用いて単離 される。アフィニティーカラムは、５′族アミノ末端β鎖フィブリンペプチド（ Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ　（β−ペ プチド）〕（ヒューイ。

サイエンス、第２２２巻、第１１２９頁、１９８３年）をマレイミドベンゾイル リジン−セファロースＣ１４Ｂ（キ・タガワら、ジャーナル・オブ・バイオケミ スロリー（日本）、第７９巻、第２３３頁、１９７６年（Ｋｉｔａｇａｖａ、ｅ ｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ’　ＢＩｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ（Ｊａｐａｎ ）、７９　：２３３（１９７８）））にカップリングすることにより作製される 。

このカラムの溶離液（０，２ＭグリシンＨＣ１゜ｐＨ２，８）は回収されて、フ ィブリン結合性及びフィバイブリッド免疫グロブリン分子は、２工程の連続アフ ィニティークロマトグラフィーにより宿主細胞から精製される。分子を最初に固 定ベンズアミジン含をセファロースＣＬ−４Ｂに供し、ｔＰＡ−抗体ハイブリッ ド分子を残留させ、しかる後０．ＩＭアセテート、０．４ＭＮａＣ１（ｐＨ４， ０）で溶出させた。次いで、中和後、溶出液をペプチド−セファロースカラムに 供する。β−ペプチドカラムからの溶出液（０，２Ｍグリシン、ｐＨ２，８）を １．０Ｍアルギニン及び０．１％ツイーン（Ｔｖｅｅｎ）　８０含有ＮａＰｉ緩 衝液に対して透析し、この緩衝液中４℃で貯蔵した。

ハイブリッド免疫グロブリン分子の特徴ハイブリッド分子を還元及び非還元双方 の条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥに供する。ゲルをクマシーブルーで染色するか又は （ｔＰＡ又はＵＫがカップリング前に１２５Ｉで標識されている場合には）オー トラジオグラフハイブリッド分子の機能性を評価するために、そのペプチド分解 性を非選択的基質Ｈ−Ｄ−イソロイシル−Ｌ−プロリル−し−アルギニン−ｐ− ニトロアニリドニ塩酸塩（Ｓ−２２８８）に関して最初に試験する。Ｓ−２２８ ８アツセイを基質濃度３Ｘ１０４Ｍで０．０５ＭトリスＨＣＩ、０．ＩＯＭ　Ｎ ａＣ１（ｐＨ８，５）（７）総容ｆｆ１１．０ｍｌで行う。４０５ｎｍの吸光度 を２０℃で１０秒毎に測定する。

フィブリノーゲンアッセイ クエン酸処理ヒト血漿又はクエン酸処理ウサギ血漿のサンプル中のフィブリノー ゲン含量を２つの方法で調べた。凝固性フィブリノーゲンをクラウス、アクタ・ ケミ力・スカンジナビ力、第９０巻、第４１９頁、１９５７年（ＣＩａｕｓｓ、 、Ａｃｔａ　Ｃｈｅｗｉｃａ　５ｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ、９０：４１９（１９ ５７））の方法により測定し、全フィブリノーゲンを亜硫酸ナトリウム沈降で調 べる。

血漿凝固アッセイ リネンら、トロンボ・ヘモスタス、第５２巻。

第３０８頁、１９８４年（Ｌｌｊｎｅｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｔｈｒｏｍｂ。

Ｈａｅａｏｓｔａｓ、、５２：３０ｇ（１９８４）　）の方法を用いるが、但し 下記修正を加える。ドナーから得たヒト新鮮凍結血漿をプールし、等分し、再凍 結する。各実験の直前に、ｔＰＡ、ＵＫ及びそれらのハイブリッド免疫グロブリ ン分子の活性をＳ−２２８８アツセイで較正する（即ち、天然プラスミノーゲン アクチベーター及びそれらのハイブリッド分子のペプチダーゼ活性を調べ、ペプ チダーゼ活性（単位／　ｍｌ　）が各サンプルで同一となるように適切な希釈を 行う）。下記物質を新鮮凍結血漿に加えることにより、血漿凝固を行わせるニト ロンビン、　８　ＮＩＨ単位／ｍｌ；０、５Ｍ　Ｃａ　Ｃ１２，１００ｔｔｌ　 ／ｍｌ　；及び　Ｉ標識ヒトフィブリノーゲン（ＩＢＲＩＮ）、４０，０００ｃ ｐｓ／ｍｌ。溶液をシラスチック（Ｓｉ　１ａｓｔｉｃ）チュービング（内径− ４＋ａｍ）中に直ちに吸引し、３７℃で３０分間インキュベートする。凝固新鮮 凍結血漿含有シラスチックチュービング１．５ｏｎ部分に切断し、凝固物０．２ ｍｌを得る。次いで、使用前に０．１５Ｍ　ＮａＣ１で洗浄する。各凝固物をプ ラスチックチューブに入れ、計測し、（同一プールからの）新鮮凍結血漿１ｍｌ 中に懸濁する。

実験をプラスミノーゲンアクチベータ−（又はプラスミノーゲンアクチベーター 及び抗体のハイブリッド分子）の添加によって開始させる。３０分間隔で、一部 の新鮮凍結血漿を計測用に各チューブから取出す。サンプルをフィブリノーゲン レベル測定実験の終了時貯蔵する。

インビボ血栓溶解 コレンら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション、第７１巻 、第３６８頁、１９８３年（Ｃｏｌｌｅｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ ｆ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ。

７１：８６８（１９８３）］のウサギ頚静脈血管モデルを用いる。アセトプロマ シン及びケタミンによるウサギの鎮静化後、右下顆から上記右鎖骨にかけて近中 心切開する。外側頚静脈血管を切開により摘出し、枝血管を結び、分離する。

羊毛糸を入れて、凝固物をつなぎとめる。出血が止んだ後、この外側頚静脈血管 片を摘出しうるように血管クランプを置き、凝固成分を摘出された血管片中に入 れる。

これらの成分は、　Ｉ標識ヒトフィブリノーゲン（各サンプルは使用前に計測さ れる）約５００．０００　ｃｐａ％パック詰めヒト赤血球１００μｇ、ヒト新鮮 凍結血漿１００、ｃｌ、０．５Ｍ　ＣａＣｌ２１０．ｃｌ及び牛トロンビン（８ ＮＩＨ単位）１０Ｍｇからなる。３０分間後、血管クランプを取り除き、血流を 元に戻す。血栓中に取り込まれた放射能を測定するためにクランプが緩められた 後直ちに、血液サンプルを取出す。プラスミノーゲンアクチベーターの測定量を ２５ｍ１容量まで希釈し、インフュージョンポンプで４時間にわたり反対耳の縁 血管から注ぎ込む。シリンジ、ガーゼスポンジ及びチュービングを計測すること により、逸失分のカウント数を調べる。

インフュージョン開始６時間後、完全な血管片を摘出し、除去し、計測する。溶 解率は、実験終了時に残留するカウント数対開始時のネット（ｎｅｔ）カウント 数の比率として調べられる。

フィブリン溶解アッセイ 定量フィブリン溶解アッセイでは、フィブリンモノマーをセファロースにリンク させる。フィブリノーゲンをリジン−セファロース通過によりプラスミン汚染物 質から精製し、痕跡量の１２５Ｉ標識フイブリノーゲンと混合する。次いで、そ れを臭化シアン活性化セファロースＣｌ−４Ｂにカップリングさせる。固定され たフィブリノーゲンを１００１１１Ｍ　ＣａＣｌ２存在下ヒトトロンビンの添加 によりフィブリンに変換させる。

それらの相対的フィヲリン溶解活性を計画するために、１２５１−ＵＫ−６４Ｃ ５ハイブリッド分子及びウロキナーゼ（又は１２５１−　ｔＰＡ−５９Ｄ８ハイ ブリッド分子及びｔＰＡ）を次第に増量させて１２５Ｉ−フィブリン−セファロ ースと共に４時間インキュベートする。しかる後、樹脂を精製プラスミノーゲン と共にインキュベートする。２．５及び１５時間の間隔後、混合物を遠心分離し 、上澄の放射能を測定する。この操作をコントロール複合体（１２５１−ＵＫ） −ＳＳ−（３Ｈ３）で繰返す。

例２ 高分子量ゲノムＤＮＡをクォーターマスら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、 第１２８巻、第２６８７−２６９０頁、１９８７年（Ｑｕｅｒｔｅｒｍｏｕｓ、 ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏ１ｏｇＬ１２８：２８８７− ２６９０（１９８７）：ｌで既に記載された５９Ｄ８ハイブリドーマ細胞から得 た。５９Ｄ８ハイブリドーマ系に特異的な再配列Ｈ鎖免疫グロブリン遺伝子を確 認するために、サザンプロット分析を既に記載されたようにＥｃｏＲＩ消化ゲノ ムＤＮＡ及び１．７キロ塩基（ｋｂ）ＥｃｏＲ１／Ｐｓ　ｔ　１ゲノム結合領域 プローブで行った〔サザーン、　Ｅ、　Ｍ、　、　ジャーナル・オブ壷モレキュ ラー・バイオロジー、第９８巻、第５０３−５１７頁（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ、 Ｍ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、９８　：　 ５０３−５１７）　；サカノら、ネーチャー。

第２８６巻、第６７６−６８３頁、１９８０年〕。元来融合して５９Ｄ８ハイブ リドーマ（ＳＰ２１０及びＢａ１ｂ／Ｃ）を産生ずるいずれの細胞においても存 在しない２種の再配列が確認された。次いで、ゲノムＤＮＡ１ａ＋ｇをＥｃｏＲ ｌで消化し、プレバラティブアガロースゲル上でサイズ分別した。サザーン、Ｅ 、メソッズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｗｏｌ ｏｇｙ）　。

編集ウー、　Ｒｏ（Ｗｕ、Ｒ，）　、（アカデミツク・プレス、二ニーヨーク） 、第６８巻、第１５２−１７６頁。２種の再配列フラグメントの各々を含んだ両 分を結合領域プローブとのハイブリッド化により確認する。これらの画分を濃縮 し、λｇｔｌＯに結合させた。こうして組み立てられた２種のサブゲノムライブ ラリーを結合領域プローブでスクリーニングし、数種の可能なりローンを各ライ ブラリーから単離した〔マニアナイスら、モレキュラー・クローニング、１９８ ２年（コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク）　（Ｍａｎｉａｔｉｓ 　ｅｔ　ａｌ、、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　１９８２（Ｃｏｌｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ））　）　、　５９　Ｄ　８抗原結合部位に ついてコードする再配列フラグメントを含んだクローンの選択は、５９Ｄ８Ｈ鎖 ｍＲＮＡの配列に基づき組み立てられた２０塩基対オリゴヌクレオチドとのハイ ブリッド化により行われた。ＲＮＡの単離及び配列決定、Ｔ４ポリヌクレオチド キナーゼによるオリゴヌクレオチドの３２Ｐ標識化並びにハイブリッド化は、既 に記載された技術に従い行われた〔マニアナイスら。

モレキュラー・クローニング、前掲；クラークら８　ジャーナル・オブφエクス ペリメンタル・メディシン。

第１６１巻、第６８７−７０４頁、１９８５年（Ｃ１ａｒｋｅ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｆ ｃｉｎｅ、１６１：８８７−７０４（１９８５））：サッグス（Ｓｕｇｇｓ）ら 、プロシーディング・オブφナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ 。

第７８巻、第６６１３−６６１７頁、１９８１年〕。

発現ベクターの組立て ＨＥＬＡ細胞ｍＲＮＡから組み立てられたｃＤＮＡクローン（ｐＰＡ３４’　Ｆ ）よりｔＰＡ配列を得た。フィッシャーら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル ・ケミストリー、第２６０巻、第１１２２３−１１２３０頁。

１９８５年ｏ　ｐ　Ｂ　Ｒ３２２のβ鎖Ｓａｃ　Ｉ部位からＥｃｏＲ１部位まで についてコードするＤＮＡを単離し、ｐＧＥＭ３に結合させた。次いで、隣接５ ′フラグメントをＳ　ｆ　ａＮｌ及び５ａｃｌでの消化により単離した。

ＢａｍＨ１端、Ｘｈｏ１部位及びグリシンに関するコドンを再構成する２つの塩 基を含んだ合成オリゴヌクレオチドをこの第二フラグメントの５′端に加えた。

次いで、修正されたフラグメントを既に３′端を含むプラスミド中に結合し、β 鎖配列を再構成した。β鎖をＸｈｏｌ及び５ｃａｌで切り出したが、５ａｃｌ部 位はｐＢＲ３２２配列から得られたものである。

最終構造体を、ネズミγ２ｂ　Ｈ鎖不変領域についてコードする６ｋｂＸｂａｌ 制限フラグメントを含んだポリリンカーの挿入により修正されたｐｓＶ２ｇｌ） ｔベクター中にアセンブリーさせた。マリガン（Ｈｕｔ　ｌ　ｉｇａｎ）ら、プ ロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第 ７８巻、第２０７２−２０７６頁、１９８１年；タッカ−（Ｔｕｃｋｅｒ）ら、 サイエンス、第２０６巻、第１３０３−１３０６頁、１９７９年。

２．６ｋｂ　ＥｃｏＲ１フラグメントでクローニングされた産生性５９Ｄ８　Ｈ 鎖再配列遺伝子を７２ｂ不変領域の５′側ポリリンカーにおけるＥｃｏＲ１部位 中に正しい向きで挿入した。ＣＨ２中の唯一のＸｈｏ１部位とポリリンカー中５ ａ１１部位との間の不変領域配列を切り出し、５ａ１１部位をプラント化し、ｔ ＰＡ　β鎖を所定箇所に結合させた。ヌクレオチド配列分析では、Ｈ鎖及びｔＰ Ａセグメント間の結合が枠内であることを確認した。サンガー（Ｓａｎｇｅｒ） ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳ Ａ、第７４巻、第５４６３−５４６７頁、１９７７年。

モノクローナル抗体及び欠失変異体の選択ヒニーイら、サイエンス、第２２２巻 、第１１２９−１１３２頁、１９８３年で既に記載されているように、フィブリ ンβ鎖のアミノ末端配列に基づく合成へブタペプチドでの免疫感作により、フィ ブリン特異性モノクローナル抗体５９Ｄ８を産生した。ハイブリドーマ細胞及び 欠失変異体をグルコース４．　５＋ｇ／ｍｌ、　１２９６牛脂児血清（ＦＣＳ） 、硫酸ゲンタマイシン５０ｇ／ｍｌ及びＬ−グルタミン０．６■／ｍｌ含有ＤＭ ＥＭの完全培地で維持した。Ｈ鎖欠失変異体の選択のために、細胞を軟寒天中で 増殖させた。完全培地＋０．２％アガロース及び追加８％ＦＣＳの５ｍｌを組織 培養皿（６０＋＋＋＋ｓ）に加え、室温で３〜５分間かけて固化させた。鎖欠失 に関して選択される細胞（１〜２×１０３）をアガロース上に置いた。

細胞集団が形成されるまで（２〜４日間）、プレートを６％ＣＯ２中３７℃でイ ンキュベートした。Ｈ鎖欠失変異体を検出するために、細胞集団に０．２％アガ ロース及び５〜１０％ウサギもしくはヤギ抗マウスＨ鎖と共に完全培地を含む抗 血清溶液１．０ｍｌをまいた。Ｈ鎖を分泌する細胞集団は沈降素ハロー（ｈａｌ ｏ）を形成した。沈降素ハローを有しない集団をキャピラリーピペットで軟アガ ロースから取出し、しかる後８％追加ＦＣＳと共に完全培地を含んだ９６ウエル プレート中に入れた。個々のサブクローンをＨ及びＬ鎖の存在に関して酵素結合 免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又はウェスターンプロット法により調べた。

トランスフェクション及び選択 ボッター（Ｐｏｔｔｅｒ）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ −拳オブ・サイエンスＵＳＡ、第８１巻、第７１６１−７１６５頁、１９８４年 で記載されているようにイスコ（ｌｓｃｏ）電源を用いて、エレクトロポレーシ ョンによって不変ｐＤ８ＳＶｔβを欠失変異体細胞中にトランスフェクトした。

最適のトランスフェクション条件はリン酸緩衝液０．８ｍｌ中に２０００ボルト 電流を流すことであった。トランスフェクト体をミコフェノール酸、キサンチン 及びヒボキサンチン中での増殖により選択した。トランスフェクション及び発現 の確認は、ヒトｔＰＡβ鎖の３′部分についてコードする２ｋｂｃＤＮＡプロー ブを用いてノザンプロット分析により行われた。マニアティスら、モレキュラー ・クローニング。

前掲。トランスフェクトされた細胞系を標準技術に従いサブクローニングした。

タンパク質の精製 ２本のカラム上の連続二重アフィニティークロマトグラフィーにより、細胞上澄 及び腹水からタンパク質を精製した。１本のカラムは、５９Ｄ８の生成に用いら れる合成タンパク質をセファロースにリンクさせることにより組み立てた。他は 、セファロースにリンクされた抗ヒトｔＰＡモノクローナル抗体から構成されて いた。我々は、最初の精製試験において、セファロースにリンクされたベンズア ミジンから構成される第三のカラムを用いた。しかしながら、ベンズアミジンは ｔＰＡの活性部位に十分結合しかつベンズアミジン−セファ０−スは完全分子を 精製するために使用可能であるにもかかわらず、カラムは組換えタンパク質を残 留させなかった。

組換えタンパク質の精製は、２種の固相免疫アッセイによりモニターされた。抗 フィブリン抗体活性を検出するために、９６ウ工ル微量滴定プレートをフィブリ ンモノマーで被覆し、１０％ウマ血清で阻止した。次いで、それらをサンプルと 共にインキュベートシ、洗浄し、のアッセイは、抗フィブリン抗体活性に関連し たｔＰＡ抗原を検出しうるように考えられた。このアッセイでは、フィブリンモ ノマー被覆プレートを培養上澄又は腹水と共にインキュベートし、ｌ標識抗ヒト ｔＰＡでプローブ処理した。ｔＰＡ鎖はフィブリン結合活性を有していないこと から、双方の機能性ドメインを含む組換えタンパク質のみが検出される。

ウェスターンプロット分析 確立された技術を用い、Ｎ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏ４ポリアクリルアミドゲル 上で分離された還元及び非還元双方のサンプルからウェスターンプロットを行っ た。バーネット。

Ｗ、Ｎ、、アナライティカル・バイオケミストリー、第１１２巻、第１９５−２ ０３頁、１９８１年（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ。

Ｗ、Ｎ、、Ａｎａｌｙｔｊｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１２：１９５ −２０３（１９８１））。

１２５１で標識されたヤギ抗マウスＦａｂ又はモノクローナル抗ヒトｔＰＡ抗体 をプローブとして用いた。

抗原結合アッセイ オリジナル抗体（５９Ｄ８）及び組換え分子を最初にフィブリン結合Ｆａｂ抗原 の存在に関して試験した。これは、プローブとして１２５Ｉ標識ヤギ抗マウスＦ 　を用いｂ て上記固相免疫アッセイにより行われた。滴定曲線は、アッセイにおいて５９Ｄ ８及び組換えタンパク質に関しそれらの濃度を変えることにより作成された。次 いで、同量の結合１２５Ｉ標識抗体を生じるであろう濃度を各曲線の直線部分か ら選択した。５９Ｄ８又は融合タンパク質のいずれかのこの濃度において、フィ ブリンで被覆されかつ様々な量の可溶性フィブリンで補充されたウェル中で競合 アッセイを行った。不溶性でない可溶性フィブリンに結合したタンパク質を標識 抗体の適用前に洗浄除組換えタンパク質の酵素機能を天然ｔＰＡの場合と比較す るために、最初に非選択的基質Ｓ−２２８８（テキサス州バーモントのヘレナ研 究所）の開裂について測定するアッセイによりそのペプチド分解性を調べた。ア ッセイは、発色源基質最終濃度１ｍＭにおいて緩衝液（０，１５Ｍ）リス、０． １５Ｍ　ＮａＣ１）５０μＮ中で行われた。ボーウェス（Ｂｏｖｅｓ）メラノー マ細胞系〔カリフォルニア州へイワードのバイオ・レスポンス（Ｂｉｏ　Ｒｅ５ ｐｏｎｓｅ））から精製された様々な濃度の組換えタンパク質又はｔＰＡを加え 、４０５ｎｉの吸光度を経時的に測定した。

組換えタンパク質がプラスミノーゲンを活性化しうるか否かについて調べるため に、発色原基質Ｓ−２２５１（ヘレナ研究所）を用いて、第二のアッセイを行っ た。

メラノーマｔＰＡ、組換えタンパク質及び牛トリプシンの活性を最初にＳ−２２ ８８アツセイで調べ、各酵素が１００単位／１００μｇで存在するように濃度を 調整した。次いで、メラノーマｔＰＡ、組換えタンパク質又は牛トリプシン１０ ０μｇをヒトプラスミノーゲン（０，１５ｍｇ／ｍｌ）　１００１１ｇ及びＳ− ２２５１基質８００μｇに連続希釈しながら加えた。サンプルを３７℃で６０分 間インキュベートした。反応を５０９６酢酸１ｍｌの添加により終結させ、４０ ５０ｍの吸光度を測定した。

結果 ５９Ｄ８　Ｈ鎖欠失変異体中にｐＳＶＤ８Ｔ構造体（第１図）のエレクトロポレ ーションによりトランスフェクトされた多数のクローンを得た。約１×１０８の ハイブリドーマ細胞をリン酸緩衝液０．８ｍｌ中環状プラスミドＤＮＡ５０μｇ と混合しかつ２０００ボルトの放電に供した場合には、９６ウエルプレート上約 １５のウェルが薬物耐性クローンを含有していた。これらクローンの約７５％は 組換えタンパク質を分泌することが示された。５つのクローンが、それらの増殖 速度及び融合タンパク質についてコードするｍＲＮＡの発現に関して別の分析用 に選択された。

アフィニティー精製組換えタンパク質のウェスターンプロット分析が行われた。

ヨウ素化抗ヒトｔＰＡモノクローナル抗体でプローブ処理された還元ゲルのプロ ットでは、６５ｋＤペプチドの標識化を示した。これは、Ｈ鎖ｔＰＡ融合タンパ ク質の予期されたサイズであった。

ｔＰＡのβ鎖は約３３ｋＤであって、先端を欠く８鎖が３０ｋＤを占めているべ きである。いくつかの系の証拠によれば、６５ｋＤペプチドが牛脂児血清による ｔＰＡ様分子でないことを示している。６５ｋＤバンドは、トランスフェクトさ れた細胞系が無血清培地中又はマウスの腹腔内で増殖された場合に観察される。

更に、我々はベンズアミジンアフィニティークロマトグラフィーにより牛脂児血 清から牛ｔＰＡを精製した場合に、それがウェスターンプロットにおいて抗体に より標識されていたとしても、分子のサイズは７５ｋＤであった。

ポリクローナル血清由来のヤギ抗マウスＦａｂでプローブ処理された還元サンプ ルのウェスターンプロットでは、２５ｋＤタンパク質の標識化を示すが、これは ５９Ｄ８にＬ鎖の予期されたサイズであった。かかるプロットにおいてこの試薬 は通常マウス免疫グロブリンＨ鎖も標識化するが、大部分のＨ鎖不変領域が除去 されていたことから、融合ペプチドの標識化の不存在は驚くべきことでない。非 還元サンプルで行われたプロットは、ヨウ素化抗体の双方により分子量１７０〜 １８０ｋＤで単一バンドの標識化を示す。これは、ハイブリドーマ細胞が免疫グ ロブリン及びｔＰＡペプチドの双方を含む分子を産生じているという強い証拠を 与えている。１７０〜１８０ｋＤという値は、Ｈ鏡開ジスルフィド結合が形成さ れて２つの抗原結合部位及び２つのｔＰＡ部分を含むＦ　′　様ｂ　２ 分子を生じることを示唆している。

分子のｔＰＡ部分のペプチド分解活性は、最初に非特異的基質Ｓ−２２８８の開 裂を測定することにより評価された。このトリペプチドの開裂は、波長４０５ｎ ｍの光を吸収するｐ−ニトロアニリンの生成を追跡することにより正確にモニタ ーできる。第２Ａ図は、異なる濃度の純粋なメラノーマｔＰＡの活性を直接利用 した典型的アッセイについて示している。このアッセイにおける活性は、吸光度 （光学密度）の変化率として規定される。組換えタンパク質及び天然ｔＰＡ間の モルベースで比較が行われた場合に、組換えタンパク質は天然ｔＰＡの７０％の 活性を有している。

触媒性β鎖サブユニットがプラスミノーゲン（その生理学的基質）に対する活性 を維持しているか否かについて調べるために、Ｓ−２２５１アツセイを実施した 。ここでは、プラスミノーゲンをプラスミンに変換するためにプラスミノーゲン アクチベーターが必要であって、しかる後プラスミンは合成トリペプチドからｐ −ニトロアニリンを遊離させる。プラスミノーゲンアクチベーターもトリプシン も、Ｓ−２２５１基質を直接変換することができない。組換えタンパク質、メラ ノーマｔＰＡ及びトリプシンのアミド分解活性を最初にＳ−２２８８アツセイで 調べ、次いで匹敵する量のそれら各々がプラスミノーゲンを変換しうる能力につ いて調べた。第２Ｂ図は、組換えタンパク質が生理学的基質に作用しうる能力が 天然ｔＰＡの場合と極めて類似していることを示している。

トリプシンのような非特異的セリンプロテアーゼはプラスミノーゲンをプラスミ ンに変換しうるけれども、それは天然又は組換えいずれのプラスミノーゲンアク チベーターの場合はど十分に有効というわけではない。

精製過程及び精製後に用いられるアッセイは双方とも、完全及び機能性抗原結合 部位を必要とした。組換え分子を抗体５９Ｄ８と更に定量的に比較するため、我 々は単純な競合アッセイを用いた。このアッセイでは、９６ウエルプレートの底 に結合したフィブリンに対して抗体結合部位に関し競合する可溶°性フィブリン モノマーの能力を測定した。アッセイでは天然抗体が組換えタンパク質の場合よ りもフィブリンモノマーとよく結合しうろことを示しているが、それらの結合ア フィニティーに関する差異は１０倍以下である（第３図）。それは、抗体結合性 が融合タンパク質において有意には損なわれていないという証拠である。

考察 分泌されたタンパク質の詳細な分析では、５９Ｄ８Ｈ鎖ｔＰＡ融合タンパク質が 予想されたようにＬ鎖と共に発現されかつ分泌されることを示している。しかし ながら、細胞培養上澄中に存在する組換えタンパク質の量はモノクローナル抗体 に関して予想される場合のわずが１０％でしかない。アフィニティー精製により 、我々はルーチン的に精製タンパク質を細胞培養上澄１ｍｌ当たり０．１μｇ１ 又は腹水１ｍｌ当たり１０μｇ得ただけであった。我々は上記のように固相免疫 アッセイで精製をモニターしたが、アフィニティーカラムからの我々の回収率は 予想範囲内であった。限られた組換えタンパク質産生については、いくつかの可 能な理由がある。１つは、組換えタンパク質が細胞増殖又はタンパク質精製過程 で分解されてしまうことである。タンパク質分解を抑制する試みとして、我々は プロテアーゼインヒビターを細胞培養物に加えた。収率上の改善は観察されなか ったが、タンパク質分解は懸念されたままである。

他の更に基本的な問題は、タンパク質の低収率の原因である。適切なサイズのメ ツセンジャーＲＮＡがノザンプロットで見出されうるが、構造体の転写は低レベ ルのままである。転写は天然Ｈ鎖プロモーター及びエンハンサ−により行われる が、但し免疫グロブリン発現の調節に関して重要であることが判明した３′配列 はこの構造体から排除されていた。ブレゴー（Ｇｒｅｇｏｒ）ら、モレキュラー ・セル・バイオロジー、第６巻、第１９０３−１９１６頁、１９８６年；コブリ ン（１（ｏｂｒｉｎ）ら、モレキュラー・セル・バイオロジー、第６巻、第１６ ８７−１６９７頁、１９８６年。しかも、キメラ遺伝子の３′非翻訳領域は、正 常な条件下低レベルで産生されしかる後産生された細胞中で保存されるタンパク 質ｔＰＡに由来しているのである。ｔＰＡ遺伝子の３’　ＵＴ領領域転写もしく は翻訳を低レベルにしているか又は細胞からの組換えタンパク質の分泌を妨げて いる可能性がある。

ｍＲＮＡ合成、タンパク質合成の定量及び組換えペプチドの安定性を目的とした 実験は、この問題を解決するにちがいないであろう。

Ｈ鎖欠失変異体は、抗体結合部位の再構成に便利な手段を提供する。それらの入 手性は、産生性り鎖再配列をクローニングしかつトランスフェクトすることを不 要にしている。このアプローチは、勿論これらの変異細胞系をトランスフェクト しうるか否かに依存している。これらの実験で用いられる２つの系は標準的技術 を用いて容易にトランスフェクトされるが、但し他のＳ　Ｐ　２１０誘導系も同 様に挙動するか否かはまだ明らかではない。Ｈ鎖欠失変異体が分泌するし鎖の量 は様々である。しかしながら、少量のし鎖を分泌する一部の欠失変異体は、Ｈ鎖 合成が再開された場合にこの同様のＬ鎖を正常な量で分泌することができる。ウ ィルドら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー、第１０巻、第４６ ２−４６７頁、１９８０年（ｖｉｌｄｅ、ｅｔ　ａｌ、、ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏ ｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏ１ｏｇｙ、１０：４６２−４６７（１９８０ ））　ｏ　これらの細胞における免疫グロブリン鎖産生の欠失に関する生物学的 基礎についてはほとんど知られていないが、Ｌ鎖及びＨ鎖を産生しうる一部の欠 失変異体の能力が損なわれている可能性がある。我々の組換えタンパク質の低レ ベル産生は、抑制されたＬ鎖発現の結果であろう。

組換えｔＰＡβ鎖は高レベルの触媒活性を有しており、それはプラスミノーゲン をプラスミンに変換する特異的能力を留めている。スタフィロコッカスヌクレア ーゼ及び大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ機能を免疫グロブリンＨ鎖にリンクさせた初 期の研究では、Ｓ−２２８８アツセイで測定される７０％よりも著しく低いエフ ェクター機能活性を示した。二ニーバーガーら、ネーチャー。

第３１２巻、第６０４−６０８頁、１９８４年；ウィリアムスら、ジーン、第４ ３巻、第３１９−３２４頁。

１９８６年［Ｗｉｌｌｉａｍｓ、ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、４３：３１９−３２ ４（１９８Ｇ）　）。

酵素活性及び基質特異性のこの保有は、堅いホールディング及び多数鏡開ジスル フィド結合の形成を要する複雑な分子であってもハイブリッド組換えタンパク質 を形成する上で使用可能であることを示している。他方では、ｔＰＡのβ鎖が正 確にホールディングしかっα鎖の不存在下で活性を維持しうろことを示した。マ クドナルド（ＭａｅＤｏｎａｌｄ）ら、ジーン、第４２巻、第５９−６７頁。

１９８６年；フォン・シネベルド（Ｗｏｎ　Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ）ら。

プロシーディング争オブ・ナショナル。アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、 第８３巻、第４６７０−４６７４頁、１９８６年。我々の結果は触媒鎖単独の活 性を確認させ、かつ鎖が異なるアミノ末端配列との関係で正確にホールディング しうろことを示している。しかも、これらの観察は異なるタンパク質ドメインの 独立的ホールディングに関する証拠を提供している。

要約すれば、我々は抗フィブリン抗体の抗原結合部位についてコードするＨ鎖遺 伝子をクローニングし、先端を欠くＨ鎖ｔＰＡ　βサブユニツト融合ペプチドに ついてコードする構造体を産生じた。次いで、構造体は抗フィブリンのハイブリ ドーマのＨ鎖欠失変異体中にトランスフェクトされた。ウェスターンプロット分 析では、融合タンパク質が抗フィブリン抗体活性を有しかつ天然ｔＰＡの場合と 同様であると考えうる程十分高いプラスミノーゲン活性化活性レベルを有するこ とを示している。

これらの記載、例及び態様は説明のみの目的であって、様々な修正が本出願及び 添付された請求の範囲の精神及び範囲内で示唆されうると、理解される。

Ｆ工ＧＵＲＸ　Ｉ ＤＪ 浄書（内容に変更なし） ｉ＋乎　（時間ン 夙２Ａ図 浄書（内容に変更なし） 為２８図 浄書（内容に変更なし） 、１　１　１０　１００ 可ｒ　；Ｚ　＋ｚ　ンン７゛ソン０ズＡ〒）δン　、μｇ手手続補正書式式 ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８７／１０２９６８ ２、発明の名称 組換えハイブリッド免疫グロブリン分子及び使用方法３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ザ、ゼネラル、ホスピタル、コーポレーション４、代　理　人（郵便番号１００ ） 平成１年１２月１１日 （発送日　平成１年１２月１９日） ６、補正の対象 特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の出願人の欄委任状、図面翻訳文 国際調査報告

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．フィブリンに特異的な抗原結合部位のある抗体可変領域及びフィブリン溶解 酵素活性領域を有するキメラ免疫グロブリン分子。
2. ２．フィブリン溶解酵素が組織型プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプト キナーゼ、ウロキナーゼ及びプロウロキナーゼからなる群より選択される、請求 の範囲第１項に記載のキメラ免疫グロブリン分子。
3. ３．請求の範囲第１項に記載の組換えキメラ免疫グロブリン及び薬学上許容され る担体を含有する医薬組成物。
4. ４．血栓のある患者に請求の範囲第３項に記載の医薬組成物の有効量を投与する ことを特徴とする血栓溶解方法。
5. ５．血栓を検出するための方法であって、（ａ）請求の範囲第１項に記載のキメ ラ免疫グロブリン分子を宿主に投与し（上記分子は放射性同位元素標識されてい る）；及び （ｂ）上記血栓の存在を検出する； ことを特徴とする方法。