JPH02500950A - 組換えハイブリッド免疫グロブリン分子及び使用方法 - Google Patents
組換えハイブリッド免疫グロブリン分子及び使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
組換えハイブリッド免疫グロブリン分子及び使用方法発明の分野
本発明は、プラスミノーゲンアクチベータ−(活性化因子)の活性部分を含む第
二タンパク質に結合せしめられたフィブリンに特異的な抗原結合部位を有する組
換えハイブリッド免疫グロブリン分子に関する。本発明は、これらの新規ハイブ
リッド免疫グロブリン分子のクローニング及び産生にも関する。本発明は、免疫
診断及び免疫治療プロセスにおいてこれらのハイブリッド免疫グロブリン分子を
用いる方法にも更に関する。
発明の背景
大半の心筋梗塞は冠動脈血栓により引き起こされる〔ブラッドら2ニ二一イング
ランド・ジャーナル・オブ・メディシン、第303巻、第897頁、1983年
(DeWood et al、、Nev England Journal o
f Medicine、303 :897(1983)))。心筋梗塞を引き起
こす冠動脈血栓は、血栓溶解剤(血栓崩壊剤)によって溶解させることができる
。これらの血栓溶解剤は、プラスミノーゲンからフィブリン溶解酵素プラスミン
への変換を活性化するプラスミノーゲンアクチベーターである。プラスミンは血
栓中に存在するフィブリンを溶解させる。プラスミノーゲンアクチベーターによ
るこの治療法は、副作用なしというわけではない。プラスミンは非選択的に作用
し、したがって血栓中のフィブリンを溶解させるだけでなくフィブリノーゲン及
び凝固因子をも攻撃することから、重度の出血体質にしてしまうことが多い。
ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ及び組織型ブ、ラスミノ
ーゲンアクチベーター(tPA)は、血栓を溶解させるための公知のプラスミノ
ーゲンアクチベーターである。これらのアクチベーターは、梗塞、発作、肺塞栓
、深部静脈血栓、末梢動脈閉塞及び他の静しかしながら、ストレプトキナーゼ及
びウロキナーゼは深刻な制限を有する。フィブリンに対する低いアフィニティー
のせいで、双方のアクチベーターは循環性及びフィブリン結合性のプラスミノー
ゲンを無差別的に活性化する。循環血液中で形成されるプラスミンは、それが血
栓溶解に用いられる前に中和されてしまう。残留プラスミンは例えばフィブリノ
ーゲン、第V因子及び第■因子のような数種の凝固因子タンパク質を分解して、
出血傾向を引き起こす。更に、ストレプトキナーゼは強抗原性であって、高抗体
力価の患者は治療に対して有効に応答せず、継続的治療を続けることができない
。
ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーターはフィブリンと結合することができ
、したがって血栓に極めて近いプラスミノーゲンの活性化を特に促し、循環中の
それ以外のフィブリノーゲンにはほとんど作用しない。しかしながら、冠動脈血
栓の溶解を促進するために要する用量での組織型プラスミノーゲンアクチベータ
ーの使用は出血を引き起こすこともある。
血栓に対する血栓溶解剤の特異性を増加させるために、ウロキナーゼをフィブリ
ン特異性抗体に共有結合させれば、フィブリン溶解能及び特異性を著しく高める
ことができる。ボードら、サイエンス、第229巻、第765−767頁、19
85年(Bode et al、、5cience、229ニア85−767(
1985) )。
すべての抗体分子の1つの機能特性は、抗原決定基に対して特異的結合すること
である。抗体はインビボで二価の単一特異性であって、2つの同一抗原結合部位
を有する。抗体分子による抗原の特異的結合性・は、H及びL鎖双方の可変領域
(F ab)の抗体構造によって決定される。
二重特異性を有する抗体は、異なる特異性のある抗体を2本のH鎖を互いに結合
しているジスルフィド結合の選択的開裂に付すことにより作製される。次いで、
抗体半分子は二重特異性のあるハイブリッド抗体を得るために中性pH下で再会
合される。ニソンホフら、ネーチャー(ロンドン)、第194巻、第355頁、
1962年(Nisonhoff et al、、Nature(London
)、194:355(1962) ) ;ブレナン(Brennan)ら、サイ
エンス、第229巻、第31頁、1985年;リューら、プロシーディング・オ
ブ・ナショナル・アカデミ−崇オブ争サイエンスUSA。
第82巻、第8648頁、1985年(Liu et at、。
Procee−d−tng of’ National AcadelIy o
r 5cience USA、82 :8B4g(1985)) ;共同譲渡さ
れた同時係属米国特許出願第851.554号明細書、1986年4月14日付
出願参照。
二特異性抗体はハイブリドーマがらも産生された。抗体産生ハイブリドーマ細胞
の融合にょる二特異性モノクローナル抗体の産生については、ミスルタイン(X
i 1stein)及びクエO(Cuel Io)、ネーチャー(ロンドン)。
第305巻、第537頁、1983年並び1.: P CT出願WO第83/1
03679号明細書で記載されている。
抗体は、組換えDNA技術によってもクローニングされかつ産生された。H及び
L鎖に関する遺伝子は適切な宿主中に導入され、発現され、しかる後これらの個
々の鎖が機能性抗体分子に再集合された〔例えば、マンロー(Munro) +
ネーチャー、第312巻、第597頁。
1984年:モリソン、 S、 L、 (Morrlson、S、L、) *サ
イエンス、第229巻、第1202頁、1985年;オーイら、バイオテクニク
ス、第4巻、第214頁。
1986年(Of et al、、BloTechniques、4:214(
198B)) ;ウッド(wood)ら、ネーチャー、第314U巻、第446
−449頁、1985年参照〕。L及びH鎖可変領域は外来宿主中でクローニン
グされ、発現されて、それらの結合能を維持していた〔ムーア(Moore)ら
、欧州特許公開第88994号明細書(1983年9月21日付公開)]。
キメラ又゛はハイブリッド抗体は、組換えDNA技術によっても作製された。オ
ーイ及びモリソン、バイオテクニクス、第4巻、第214頁、1986年では、
キメラ抗体を産生ずるための方法について記載している。
第218−220頁では、キメラ:ヒトIgG抗Leu3抗体が記載されている
。著者らは、キメラマウス:ヒト抗ダンシル抗体が得られたと述べている。こΦ
論文では、詳細に述べているわけではないが、Leu3結合特異性及び抗ダンシ
ル結合特異性が単一免疫グロブリン分子中に一緒に組込まれたことを示している
。
モリソン、サイエンス、第229巻、第1202頁。
1985年では、第1表において、可変り又は可変H鎖領域が非1g配列に結合
されて融合タンパク質を得ることができると述べている。この論文では、融合タ
ンパク質について可能な用途は3つ:即ち(1)アッセイ用の酵素に抗体特異性
を付与すること;(2)抗原カラムによって非1gタンパク質を単離すること;
及び(3)特異的に毒性剤を放出することであると述べている。しかしながら、
この参考文献において、いずれの特異的キメラ免疫グロブリン分子に関しても記
載がない。
ニューバーガー(Neuberger)ら、ネーチャー。
第314巻、第268頁、1985年では、そのH鎖がハブテンの4−ヒドロキ
シ−3−ニトロフェニルアセチルに特異的なマウス可変領域に融合されたヒト不
変領域であるキメラ抗体について記載している。
欧州特許出願第120,694号明細書では、大腸菌(Escherichia
colt)宿主細胞中で発現される免疫グロブリン分子の可変及び不変領域の
遺伝子工学について記載している。その出願明細書の第10頁では、免疫グロブ
リン分子が不変ドメインの1つに結合されたもう1つのペプチド部分と共に宿主
細胞で合成されると述べている。
このペプチド部分は、細胞毒性又は酵素性のいずれかとして記載されている。第
10頁では、免疫グロブリン分子が治療剤を含んでいてもよいとも述べている。
出願明細書及び実施例中の説明では、4−ヒドロキシ−3−二トロフェニルアセ
クール(NP)ハブテンと結合するモノクローナル抗体から得られるλ様鎖の用
途について記載している。
欧州特許出願第125.023号明細書では、キメラ又はそれ以外に修正された
免疫グロブリン分子を産生ずるための組換えDNA技術の適用に関する。これら
の免疫グロブリン分子に関して第3−4頁で記載された用途の1つは、特定の標
的病組織に対する抗体を患者に注射することによる全身的診断及び治療のための
用途である。
疾患の存在は適切な標識を抗体に結合させて調べることができ、又は病組織は適
切な薬物を抗体で運んで攻撃することができる。出願明細書では、″改造抗体”
として薬物の特異的放出を補助しうるように工学処理された抗体についで記載し
ている。
PCT出願WO第83/3971号明細書は、抗体−酵素活性毒素を含むハイブ
リッドタンパク質に関する。
PCT出願WO第83/1533号明細書では、酵素の活性部分を含む第二タン
パク質の一部に結合された免疫グロブリン分子の可変領域を有するキメラ抗体に
ついて第5頁で記載している。
ボーリアン(Boulianne)ら、ネーチャー、第312巻。
第643頁、1984年では、トリニトロフェニルハブテンに特異的なマウス可
変領域についてコードするDNAセグメントがヒトμ及びに不変領域についてコ
ードするセグメントに結合された免疫グロブリン遺伝子について作製した。これ
らのキメラ遺伝子は、機能性TNP結合キメラIgMとして発現された。
モリソンら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンスUSA、第81巻。
第6851頁、1984年では、ヒトにL鎖遺伝子のエキソンに結合された抗ホ
スホリルコリンミエローマタンパク質遺伝子のH鎖可変領域エキソンを利用して
キメラ分子を作製していた。その遺伝子はマウスミエローマ細胞系中にトランス
フェクト(transfect)され、抗原結合機能のあるキメラマウス−ヒト
IgGを産生ずる形質転換細胞を生じた。
シャロン(Sharon)ら、ネーチャー、第309巻。
M604’頁、1984年では、アゾフェニルアルソネートに特異的なマウスH
鎖可変領域についてコードする遺伝子をマウスにL鎖不変領域遺伝子と融合させ
ていた。
この構造体は、適切なミエローマ細胞系中に導入された場合に、対応vL−にポ
リペプチド鎖と二量体化したポリペプチド鎖を生じた。vHKvLCK分子は、
アゾフェニルアルソネートハブテンと結合した。
二ニーバーガーら、ネーチャー、第312巻。
第604頁、’1984年では、ハブテン特異性抗体のH鎖可変領域遺伝子をミ
クロコツカスヌクレアーゼの合成について指示する遺伝子と結合させ、抗原結合
性及び酵素活性の双方を有するハイブリッド分子を得ていた。
フィブリノーゲンよりもフィブリンに対する高いアフィニティー及び特異性によ
って特徴付けられかつフィブリン含有血栓の近位環境においてのみプラスミノー
ゲンの活性化を促す選択プラスミノーゲンアクチベーターを得ることが望まれる
のである。
発明の要旨
本発明は、プラスミノーゲンアクチベーターの活性部分を含む第二タンパク質に
結合せしめられたフィブリンに特異的な抗原結合部位を有する組換えノー免疫グ
ロブリン分子ブリン分子に関する。本発明は、これらの新規I\イブリッド免疫
グロブリン分子のクローニング及び産生にも関する。本発明は、免疫診断及び免
疫治療プロセスにおいぞこれらの組換えハイブリッド免疫グロブリン分子を用い
る方法にも更に関する。
本発明は、ハイブリッド免疫グロブリン分子についてコードする遺伝子配列、か
かる遺伝子配列を含むクローニング及び発現ベクター、かかるベクターで形質転
換された宿主、並びにかかる宿主中に存在する遺伝子配列の発現によるこのよう
なハイブリッド分子の産生方法にも関する。
図面の説明
第1図は、H鎖tPA融合タンパク質についてコードする発現プラスミドpSV
D8tの構造について示している。コード配列は円外の標識で示され、組立てに
用いられる制限部位は円内で示されている。略号:VDJ。
産生59D8H鎖再配列;2b−CH,ネズミ2bH鎖不変領域のゲノム配列;
tPA、ヒトtPA鎖についてコードするcDNA配列;3’ −UT、ヒトt
PAcDNAの3′−非翻訳配列;Amp ’、pBR322アンピシリン耐性
遺伝子; gp t、SV40プロモーターにより作動される大腸菌グアニンホ
スホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子:R1,EcoRl。
第2図は、組換えタンパク質の触媒活性とメラノーマtPAの活性とを比較する
発色原基質アッセイについて一2288アッセイは10105n白丸印)又は7
0ng(白画角メ)の組換えタンパク質で行われた。実線は、標準として用いら
れた50ng(黒丸印)、40ng(黒画角印)又は30ng(黒三角印)のメ
ラノーマtPAの触媒活性について示している。組換えタンパク質の相対的モル
活性は、同様の触媒速度のtPA標準との比較により決定された。第2B図:S
−2251アッセイはメラノーマtPA標準(白丸印)、組換えタンパク質(黒
丸印)及び牛トリプシン(白三角印)の各種アクチベーターで行われた。各タン
パク質の活性単位は、S−2288アツセイで決定された。
第3図は、59D8抗フィブリン抗体及び組換えタンパク質の結合作用の比較に
ついて示している。曲線は、様々な濃度の可溶性フィブリンモノマーとの競合に
よる固相フィブリンモノマーへの抗体結合阻害について表している。組換え抗体
(点線)は、抗体(実線)の場合よりも50%阻害に関してやや高い濃度の可溶
性フィブリンを要し、したがってフィブリンとやや弱く結合するのである。この
差異は10倍以下である。
発明の詳細な説明
本発明は、抗原結合性及び酵素活性の双方を有するハイブリッド免疫グロブリン
分子に関する。更に詳しくは、本発明は、プラスミノーゲンアクチベーターの活
性部分を含む第二タンパク質に結合せしめられたフィブリンに特異的な抗原結合
部位を有する組換えハイブリッド免疫グロブリレ分子に関する。本発明は、これ
らの新規ハイブリッド免疫グロブリン分子のクローニング及び産生にも関する。
本明細書全体において、“ハイブリッド免疫グロブリン分子°という用語は、フ
ィブリン特異性抗体の全部又は一部及びプラスミノーゲンアクチベーターの全部
又は一部を含んだ組換えDNA技術によって産生される単一分子を表すために用
いられる。異種三機能性抗体、異種抗体、二特異性抗体、異種結合抗体、抗体二
重体及び異種二量体とはすべて、更に詳しくいうと、二重特異性、即ち1分子中
に2つの抗体結合部位のあ茗抗体に関する用語である。
本明細書で用いられるフィブリン特異性とは、フィブリンに対して産生された抗
体を意味する。血液が血管構造から出ると、酵素反応の複雑なカスケードによっ
てフィブリノーゲンを凝固血液中の構造タンパク質たるフィブリンに変換する。
フィブリノーゲン自体は、最少の血漿タンパク質可溶成分である。340,00
0kdMVであって、Aα、Bβ及びγと呼ばれる3対の非同一ポリペプチド鎖
から生じる2回(two−rold)対称性を有している。血栓部位において、
凝固カスケードはトロンビンを生成するように活性化されるが、これは極性ペプ
チド(AαからフィブリノペプチドA及びBβからフィブリノペプチドB)を酵
素的に開裂してフィブリンモノマーを形成させる。フィブリンモノマーは一層溶
解しにくく、自発的にポリマー化して、ゲル網状組織を形成する。ポリマー化後
、フィブリン凝塊はtJ X Iff a因子により安定化されるが、これは共
有鏡開e−(g−グルタミル)リジン結合を導入する。フィブリノーゲン及びフ
ィブリンはそれ゛らの構造が98%以上同一であって、フィブリンα及びβ鎖の
2つの新たに露呈されたアミノ末端においてのみ異なる。これらフィブリンアミ
ノ末端のアミノ酸配列は公知である。ドーリットル、 R,F、 (Doolj
ttle。
R,P、) 、“フィブリノーゲン及びフィブリン°、パットナム、p、W、
(Putnam、FJ、)編集、血漿タンパク質:構造、機能及び遺伝子コント
ロール、第3版、第2巻。
ニューヨーク:アカデミツク・プレス(Academic Press)。
1975年、109−156゜
本発明で使用可能なフィブリンエピトープとしては、フィブリンβ鎖のアミノ末
端、フィブリンα鎖のアミノ末端、プラスミン開裂部位及びγ鎖架橋結合部位の
カルボキシ末端であるβ(43−49)アミノ酸配列がある。
フィブリンに対して特異性のある抗体は、ヒューイ(Hul)ら、サイエンス、
第222巻、第1129頁。
1983年で記載されていた。更に、同タイプの抗体に関する記載は、“フィブ
リノーゲン交差反応性を欠くフィブリン特異性モノクローナル抗体°に関して1
986年1月30日付で出願された、一般譲渡された同時係属米国特許出願第8
24,228号明細書で見ることができる。実質上フィブリノーゲン交差反応性
を欠くフィブリン特異性モノクローナル抗体は、1986年4月14日付で出願
された、共同譲渡された同時係属米国特許出願第851.514号明細書でも見
られる。フィブリンに対して特異性のある抗体の他の例としては、クドリックら
、モレキユラー・イムノロジー、第21巻、第89頁、1984年[Kudry
k et al、、)!olecular 1wiunology。
21:89(19B4) ) ; “部位選択プラスミノーゲンアクチベーター
並びにそれの製造及び使用方法″に関する1985年6月26日付で公開された
コールワード(Callewaert)の欧州特許出願節146,050号明細
書;“架橋結合フィブリンに対して特異性のあるモノクローナル抗体及びそれら
の診断用途°に関するパンデセン(Bundesen)ら、オーストラリア特許
出願節AV −A −25387/84号明細書がある。
本発明のハイブリッド免疫グロブリン分子を作製する場合に、完全フィブリン特
異性抗体がクローニングされるが、それはハイブリッド分子の一部を含んでいて
もよい。しかしながら、ハイブリッド免疫グロブリン分子のサイズを減少させか
つ抗原性を減少させるためには、フィブリンを認識しかつそれと結合する抗体領
域のみを用いることが好ましい。
フィブリン特異性抗体のこの領域をクローニングするには、抗体の構造及び機能
の理解が必要である。簡単に言えば、抗体は2本の同一り鎖及び2本の同−H鎖
からなる四量体免疫グロブリンである。各タンパク質鎖は、2つの基本領域:即
ちN末端可変(V)領域及びC末端不変(C)領域からなる。可変L(V)及び
H(vH)鎖は可変領域ドメインを形成する。可変ドメインは、具体的抗原に対
する認識性及び特異性を決定する。
L(C)及びH(CH)鎖の不変領域ドメインは、免り
疫応答に関与するエフェクター機能を媒介する。抗体分子のヒンジ領域(J)は
、Fabフラグメントを抗体のF フラグメントに結合している。
可変領域内には、シバ−シティ−(diverslty) ドメイン(D)とし
て知られる超可変領域が存在していてもよい。これらのシバ−シティ−ドメイン
は、可変領域についてコードする遺伝子中で観察されるエキソンと関係している
。
抗体、即ちタンパク質構造規定の可変ドメインは、L及びH鎖のV 及びVu双
方のセグメントからなる。そし
れは、L鎖中に3つ及びH鎖中に3つ、合わせて6つの超可変領域を有している
。遺伝子レベルにおいて、3つのエキソンはその枠組み及び超可変領域を含めて
VHを特定するのに関係し、2つのエキソンはVLを特定している。vL及びv
H双方の最初の2つの超可変領域は、L及びH鎖のV遺伝子エキソンによって各
々特定されている。L宿の3番目の超可変領域は、2つのエキソンVL及びJL
によって特定されている。H鎖の3番目の超可変領域は、3つのエキソンV a
−D及びJHによって特定されている。
免疫グロブリン遺伝子発現は、8926球における体細胞組換えによるC遺伝子
へのV遺伝子の結合を介して生じる。これらの遺伝子は結合されて、完全免疫グ
ロブリンを形成する。その場合に、再配列され結合された遺伝子セグメントは、
完全免疫グロブリン又はL及びH可変鎖の抗原結合ドメインについてコードして
いる。
化学的及びイソタイプ性質により特徴付けられる5種の基本クラスがH鎖には存
在する。これらのH鎖りラスは、μ、γ、δ、α及びεとして呼ばれる。L鎖に
も2種の基本クラス:に及びλが存在する。
本発明において、フィブリンに特異的な抗体はハイブリッド免疫グロブリン分子
の一部としてクローニングされる。好ましくは、フィブリン抗体の可変領域のみ
がクローニングされる。可変りもしくは可変H鎖のいずれか又は双方は、ハイブ
リッド分子の一部を成している。更には、フィブリン特異性抗体のヒンジ領域も
クローニング可能である。可変領域に結合されたフィブリン特異性抗体のFab
部分の不変ドメインもクローニングすることができる。
ハイブリッド免疫グロブリン分子においてクローニングされから使用されるフィ
ブリン特異性抗体の可変及び不変領域は、哺乳動物源、好ましくはヒト供給源か
ら得られる。一方、可変領域は哺乳動物源から、不変領域はヒト供給源から得る
こともできる。
本発明で使用可能なプラスミノーゲンアクチベーターとしては、ウロキナーゼ、
プロウロキナーゼ、組織型プラスミノーゲンアクチベーター及びストレプトキナ
ーゼがある。プラスミノーゲンがアクチベーターによって血漿の活性フィ゛プリ
ン溶解酵素プラスミンに変換される場合には、それはその基質であるフィブリン
に対して顕著なアフィニティーを有している。
したがって、“プラスミノーゲンアクチベーター”という用語は血栓溶解剤であ
って、本明細書においては利用されるいずれの物質をも含めた意味である。フィ
ブリン溶解を含めた血栓溶解に関する他の用語も、当業界で知られている。最も
一般的なプラスミノーゲンアクチベーターはストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ
、プロウロキナーゼ及び組織型プラスミノーゲンアクチベーターであるが、他の
いずれのプラスミノーゲンアクチベーター又は血栓溶解剤も本発明で使用可能で
ある。
本発明のハイブリッド免疫グロブリン分子を製造する場合に、完全プラスミノー
ゲンアクチベーターはハイブリッド分子の一部としてクローニングされ及び発現
される。好ましくは、プラスミノーゲンアクチベーターの活性部分の本がクロー
ニングされる。この活性部位又は触媒部位は、例中で記載されているようにルー
チンのスクリーニングによって調べることができる。
本発明によりハイブリッド免疫グロブリン分子を得るためのプロセスでは、フィ
ブリン特異性抗体及びプラスミノーゲンアクチベーターのクローニング、並びに
単一ハイブリッド分子中でのそれらDNA配列の発現を必要とする。
ハイブリッド免疫グロブリン分子の作製のために用いられるフィブリン特異性抗
体及びプラスミノーゲンアクチベーターのDNA配列は、様々な供給源から得ら
れる。
これらの供給源としては、ゲノムDNA、cDNA、合成りNA及びそれらの組
合せがある。ゲノムDNAは天然イントロンを含んでいても又は含んでいなくて
もよい。
ゲノムDNA又はcDNAから得られるDNAは、様々な方法で得ることができ
る。望ましい配列についてコードする細胞が単離され、ゲノムDNAが1以上の
制限エンドヌクレアーゼによって好都合に断片化され、得られたフラグメントが
クローニングされ、フィブリン特異性又はプラスミノーゲンアクチベーターにつ
いてコードするDNA配列の存在に関してプローブでスクリーニングされる。
フィブリン特異性抗体の可変領域に関して、再配列されたH鎖コードDNAはV
、D及びJ GA域を含んでいてもよい。肯配列された生殖系り鎖コードDNA
は■及びJ領域を含んでいてもよい。望ましいフィブリン特異性DNA配列結合
部位を含むクローニングされたフラグメントが確認されたならば、このフラグメ
ントは余分なりNAを除去し、一方もしくは双方の末端を修正し、介在配列(イ
ントロン)の全部もしくは一部を除去する等のために更に処理することができる
。
可変フラグメントの結合は、結合用にプラント末端化もしくは付着端化された端
部、適切な末端を得るための制限酵素消化、適切な付着端の補充、望ましくない
結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理及び適切なりガーゼによる結合
によって、慣用的技術に従い行われる。
cDNAの場合、CDNAはクローニングされ、得られたクローンは望ましい可
変又は不変領域についてコードするcDNA用の適切なプローブでスクリーニン
グされる。望ましいクローンが単離されたならば、cDNAはゲノムDNAの場
合と実質上同様の方法で処理される。
しかしながら、cDNAの場合にはイントロン又は介在配列は存在しない。
更に、フィブリン特異性抗体の遺伝子及びプラスミノーゲンアクチベーターの遺
伝子は周知の手段により合成され、ハイブリッド免疫グロブリン分子作製用にク
ローニングされる。
ハイブリッド免疫グロブリン分子を発現させるためには、適切な宿主により認識
される転写及び翻訳シグナルが必要である。真核宿主は、インビトロで培養する
ことができる哺乳動物細胞、特に白血球、更に詳しくはミエローマ細胞又は他の
形質転換もしくは発癌性リンパ球、例えばEBV形質転換細胞である。一方、細
菌、酵母等の真菌、糸状菌等のような非噴乳動物細胞も使用可能で配列は、ゲノ
ムDNAからプロモーター領域と共に得られることがある。宿主細胞が可変領域
と結゛合された転写調節及び翻訳開始シグナルを認識しうる範囲まで、可変領域
コード配列の5′側領域は転写及び翻訳開始調節のために保存しかつ用いること
ができる。
可変領域5′側の隣接非コード領域は、TATAボックス、キャッピング配列C
AAT配列等のような転写及び翻訳の開始に必要な配列を通常含んでいる。5′
−非コード配列は一般的には少なくとも150bp、更に一般的には少なくと
も200bpであって、一般的には約2kbp 、更に一般的には約1 kbp
を超えない。
フィブリン特異性不変領域3′側の非コード領域は、終結化及びポリアデニル化
のようなその転写終結:A節配列のために保存しておいてもよい。しかも、コー
ド領域3′側の非コード領域は、免疫グロブリン遺伝子中に重要なエン六ンサー
も含んでいる。したがって、不変領域についてコードするDNA配列に天然で隣
接している3′領域を保存することにより、転写終結シグナルが付与される。転
写終結シグナルが発現宿主細胞中において十分に機能的でない場合には、宿主細
胞中で機能的な3′領域に置き代えてもよい。
フィブリン特異性抗体及びプラスミノーゲンアクチベーターに関する構造体は、
互いに結合して単−DNAセグメントを形成してもよく、又は単独でもしくはベ
クターと共に別々のセグメントとして維持させておいてもよい。
構造体は選択用の遺伝子と共に形質転換によって細胞内に導入され、その場合に
構造体は宿主ゲノム中に組込まれるようになる。通常、構造体は宿主細胞で認識
される複製系をもったベクターの一部となる。
本発明の分子産生用の発現ビヒクルとしては、プラスミド又は他のベクターがあ
る。一般に、宿主細胞と適合する種から得られるレプリコン及びコントロール配
列を含んだこのようなベクターは、宿主との関連で用いられる。ベクターは、レ
プリコン部位、並びに形質転換細胞に表現型選択を付与しうる特定遺伝子を通常
有している。
例えば、大腸菌は大腸菌種由来プラスミドpBR322を用いて容易に形質転換
される。pBR322は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性に関する遺伝
子を含んでおり°、したがって形質転換細胞を確認しうる容易な手段を提供しう
る。pBR322プラスミド又は他の微生物プラスミドは、それ自体のタンパク
質発現のために微生物によって用いられるプロモーターも含むか、又は含むよう
に修正されねばならない。組換えDNA構造体で最も一般的に用いられるプロモ
ーターとしては、β−ラクタマーゼ、ラクトースプロモーター系、λフアージプ
ロモーター及びトリプトファンプロモーター系がある。
これらは最も一般的に用いられるが、他の微生物プロモーターも発見されていて
、利用可能である。
例えば、ハイブリッド免疫グロブリン分子の遺伝子構造体は、バクテリオファー
ジλ左方プロモーターのコントロール下に置くことができる。コントロールはλ
リプレッサーにより行われ、隣接制限部位は公知である。
ハイブリッド免疫グロブリン分子の発現は、非形質転換状態の生物と相同的であ
る他の調節配列のコントロール下に置くこともできる。例えば、ラクトース依存
性大腸菌染色体DNAはβ−ガラクトシダーゼ酵素の作製によりラクトース利用
を媒介するラクトース、即ちlacオペロンを含んでいる。lacコントロール
要素は、大腸菌に感染性であるバクテリオファージλplac5から得られる。
lacプロモーター−オペレーター系は、I PTGにより誘導することができ
る。
他のプロモーター/オペレーター系又はその一部も同様に使用°可能である。例
えば、コリシンE1、ガラクトース、アルカリホスファターゼ、トリプトファン
、キシロース、tax等が使用可能である。
好ましい宿主は、組織培養物中インビトロで又は動物体内中インビボで増殖され
た哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、正確な部位における正確なホールディ
ング(f’old!ng)又はグリコジル化を含めて、免疫グロブリンタンパク
質分子を翻訳後修正しうる。
宿主として有用な哺乳動物細胞としては、VEROもしくはCHO−Klのよう
な繊維芽細胞源細胞又はハイブリドーマ5P210−AG14もしくはミエロー
マp3x63Sg8のようなリンパ源細胞及びそれらの誘導体がある。好ましい
哺乳動物宿主細胞としては、S P 210及びJ 558Lがある。腎臓癌細
胞〔フェリボロら、ジャーナル・オブ・セリニラ−・フィジオロジー、第121
巻、第363頁、1984年(Ferralvol。
et a!、、Journal or Ce1lular Physiolog
y、121:183(1984)))及び373細胞〔ベクタら、EMBOジャ
ーナル、第3巻、第190頁、1984年(Belin et al、、EMB
。
Journal、3: 190(1984)) )のような数種の細胞系はウロ
キナーゼを分泌し、トランスフェクション用に用いることができる。
哺乳動物宿主の場合には、数種の可能なベクター系がハイブリッド免疫グロブリ
ン分子の発現用に利用しうる。
1つのべ゛フタ−クラスでは、牛パピローマウィルス、ボリオーマウイスル、ア
デノウィルス又はSV40ウィルスのような動物ウィルスから得られる自律的複
製染色体外プラスミドを与えるDNA要素を利用している。第二のクラスのベク
ターは、宿主細胞染色体中への望ましい遺伝子配列の組込みに依存している。導
入されるDNAをそれらの染色体中に安定的に組込んだ細胞は、発現ベクターを
含んだ宿主細胞を選択しうる1以上のマーカーも導入することによって選択する
ことができる。マーカーは、例えば抗生物質又は銅等の重金属のような殺生物耐
性を原栄養性として栄養要求宿主に与える。選択マーカー遺伝子は、発現すべき
DNA遺伝子配列に直接結合させても、又は同時トランスフェクションで同−細
胞中に導入してもよい。付加的要素も、単一鎖結合タンパク質mRNAの至適合
成用に必要であろう。これらの要素としては、スプライスシグナル、転写プロモ
ーター、エンハンサ−及び終結シグナルがある。このような要素を組込んだcD
NA発現ベクターとしては、オカヤマ。
H0Iモレキュラー・セル中バイオロジー、第3巻。
第280頁、1983年[Okayama、H,、Mo1ecular eel
1B1o1ogy、3:280(1983) )及びその他で記載されたもの
がある。
様々な転写及び翻訳調節配列が、宿主の性質に応じて用いられる。転写及び翻訳
調節シグナルは、調節シグナルが高レベルの発現を示す具体的遺伝子と関連して
いるアデノウィルス、牛パピローマウィルス、サルウィルス等のようなウィルス
源から得られる。一方、アクチン、コラーゲン、ミオシン等のような哺乳動物発
現産物由来のプロモーターも使用可能である。抑制又は活性化を可能にする転写
開始調節シグナルも選択されうるが、その場合には遺伝子の発現が調節される。
温度を変えて発現が抑制もしくは開始されるというように温度感受性であるか又
は代謝゛産物で化学的に調節されやすい調節シグナルが重要である。
他の好ましい宿主は酵母である。酵母は、グリコジル化を含めた翻訳後ペプチド
修正も行いうるという実質的利点を有する。酵母内の望ましいタンパク質産生用
に使用可能な高コピー数のプラスミド及び強プロモーター配列を利用したいくつ
かの組換えDNA方法が存在する。
酵母は、クローニングされた哺乳動物遺伝子産物上のリーダー配列を認識し、リ
ーダー配列含有ペプチド(即ち、プレペプチド)を分泌する。
酵母がグルコースに富む培地中で増殖された場合に多量に産生される解糖酵素に
ついてコードする活性発現遺伝子由来のプロモーター及び終結要素を組込んだ酵
母遺伝子発現系であればいずれも利用可能である。公知の解糖酵素も非常に効果
的な転写コントロールシグナルを与えることができる。例えば、ホスホグリセリ
ン酸キナーゼ遺伝予めプロモーター及びターミネータ−シグナルも利用可能であ
る。
これらの構造体を含むベクター又はDNA配列が発現用に作製されたならば、D
NA構造体は適切な宿主中に導入される。プロトプラスト融合、リン酸カルシウ
ム沈降、エレクトロポレーシヨン(electroporation)又は他の
慣用的技術のような様々な技術が利用される。融合後、細胞は選択培地で増殖さ
れ、そこで非形質転換細胞が殺されて、DNA構造体で形質転換された細胞のみ
を残留させる。遺伝子発現の結果としてアセンブリー化し、ハイブリッド免疫グ
ロブリン分子を形成する。
大部分の宿主細胞、特にミエローマ又はリンホーマ細胞は、永続的細胞である。
これらの細胞は培養フラスコ内の適切な栄養培地中で培養されるか、又はマウス
もしくはラット等のシナ−ジェニック(synergenic)宿主、免疫欠損
宿主又はヌードマウスもしくはハムスター嚢(pouch)等の宿主部位中に注
入される。特に、細胞は腹水産生及びキメラレセプター回収のために腹腔内にい
れられる。一方、細胞は皮下注入してもよく、抗体は宿主の血液から回収される
。細胞はハイブリドーマ細胞と同様の方法で用いられる。参考のため本明細書に
組込まれるダイアモンド(Diaωond)ら、ニューイングランド・ジャーナ
ル・オブ・メディシン、第304巻、第1344頁、1981年:ケナット(K
ennatt) 、?−/クカーン(MeKearn) ’及びベクトール(B
echtol) (編集)、モノクローナル抗体:ハイブリドーマ−生物学的分
析の新しい次元、プレナム(Plenum)、1980年参照。
ハイブリッド免疫グロブリン分子は、抽出、沈降、クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー1電気泳動等のような慣用的条件に従い単離精製さ
れる。
好ましい方法は、選択的にハイブリッド分子を単離するための、フィブリンβ鎖
のアミノ末端へブタペプチド(抗フィブリン部位に結合する)又はベンズアミジ
ン(プラスミノーゲンアクチベーター触媒部位に結合する)のいずれかによるア
フィニティークロマトグラフィーである。
本発明はハイブリッド免疫グロブリン分子を用いる免疫治療及び免疫診断方法も
提供する。免疫治療及び免疫診断応用において、ハイブリッド免疫グロブリン分
子は患者に投与され、ハイブリッド分子のフィブリン特異的結合部位によって血
栓部位に局在化するようになる。血栓は、ハイブリッド分子のプラスミノーゲン
アクチベータ一部分の酵素活性により溶解される。当業者であれば明らかなよう
に、フィブリン特異性プラスミノーゲンアクチベーターハイブリッド分子の特異
性は、血栓との付着選択性及びその溶解を可能化し、ひいては出血のように深刻
な副作用の危険性を低下させる。
本発明のハイブリッド免疫グロブリン分子は、インビボ免疫診断°を含めた免疫
診断分野にも用いることができる。この分野において、ハイブリッド分子は放射
性核種で検出可能に標識される。放射性核種は、所定タイプの装置で検出されう
る崩壊型でなければならない。更に、インビボ診断用の放射性核種は、最大取込
み時間経過後でもなお検出可能な程十分長いが但し診断後に望ましくない放射能
が患者に残らない程十分短い半減期を有しているべきである。放射性核種をタン
パク質及びひいてはハイブリッド分子にカップリングさせることは当業界で公知
であり、直接に又は中間官能基に間接的にいずれかで通常行われる。インビボ診
断に使用可能゛な放射性同位元素ノ例トシテハ、99Tc、1231S131
l、111.、.97Ru、67cu、67Ga、68Ga、72A8.89Z
r及び201T、力、ある。
インビボ診断用の常磁性同位元素も、本発明の方法に従い用いることができる。
磁気共鳴エネルギー技術用に特に有用な元素の例としては、157Gd、55M
n、 162Dy、52C「及び58peがある。
ハイブリッド免疫グロブリン分子は、薬学上許容される担体と共に医薬組成物を
更に構成することができる。
これらの担体は当業界で周知であり、塩水及び緩衝液を含めた水性もしくは溶媒
乳濁液又は懸濁液がある。例えば、レミントンの製薬科学(Remington
’s PhargaceutiealSclences) (1980年、第1
6版)で記載されているような製剤技術。
ハイブリッド免疫グロブリン分子投与の用量範囲は、血栓の存在を検出しうるに
十分多い範囲である。投与量は、発疹又はアナフィラキシ−ショック等のような
副作用を引き起こすほど多くてはならない。一般に、投与量は患者の年齢、症状
、性別及び重篤度に応じて変動する。
反症状としては過敏症及びその他があるが、個々の医者によって調整することが
できる。投与量は、0.01〜50C)ng/kg体重、好ましくは0.01〜
200mg/kgの範囲内である。ハイブリッド免疫グロブリン分子は、注射又
は時間をかけた徐々の潅流によって非経口的に投与される。それらは静脈内、腹
腔内、筋肉内又は皮下的にも投与することができる。
ここまで本発明を一般的に記載しており、本発明は具体例を参考にして更に容易
に理解されるようになるであろうが、但しこれらは説明のみの目的で本明細書中
に含まれているのであって、他に指摘のない限り限定するためのものではない。
例
3− (2−ピリジルジチオ)プロピオン酸N−スクシンイミジル(SPDP)
及び2−イミノチオランはピアース(Pierce)から得られ、セファ0−ス
(Sepharose)4B−CLはファルマシア(Phara+acia)か
ら得た。
125!フイブリノーゲン(IBRIN)はアマ−ジャム(Aaersham)
製であった。血漿は地方血液銀行から購入した。プロテアーゼ用の発色原基質H
−D−イソロイシル−L−プロリル−し−アルギニン−p−ニトロアニリド二塩
酸塩(S−2288)は、ヘレナ研究所(llelenaLabs)から得た。
他のすべての化学物質は、シグマ(Sigma)又はフィッシャー(Fishe
r)のいずれかから得た。
フィブリン特異性抗体64C5は、参考のため本明細書に組込まれるヒューイら
、前掲及び共同所有された同時係属米国特許出願第824.228号明細書で記
載されている。フィブリン特異性抗体59D8は、参考のため本明細書に組込ま
れる、共同所有された同時係属米国特許出願第851.514号明細書で記載さ
れている。
電気泳動及びオートラジオグラフィー
SDS −PAGEは、レムリ(Laellmlり 、 ネーチャー(ロンドン
)、第177巻、第681頁、1970年の方法に従い実施された。タンパク質
は、クマシーブリリアントブルーRを用いて又は放射性同位元素標識された場合
には一70℃で24〜72時間オートラジオグラフィーにより、いずれかで視覚
化された。
ウロキナーゼ遺伝子のクローニング
触媒性B鎖コード配列含有の相補的DNAクローン(PHUK8)は、F、ブラ
シー(F、Blasi)博士から進呈品として得た〔バー1′(Verde)
、プロシーディング・オブφナショナル◆アカデミ−・オブ・サイエンスUSA
、第81巻、第4727頁、1984年〕。このクローンをpBR322で増殖
させ、多量に単離した。
このDNAクローンのセグメントを抗フィブリン抗体遺伝子と共に構造体中で用
い、それを用いてゲノムDNA配列を単離する。
tPA遺伝子のクローニング
ヒトtPA遺伝子(PPA34−F)の完全鎖長相補的DNAクローンは、サン
ドラ・デジエン(Sandra Degen)博士から進呈品として供与された
。tPAの触媒性B鎖についてコードする配列はクローンから抽出されたが、2
つの共通制限酵素開裂部位についてコードする合成りNA (アダプター)の特
異の短鎖セグメントはこの配列の5゛末端に位置していた。このアダプターは、
遺伝子を“枠内°で他のDNAセグメントに都合よく結合させることができる。
この尾部形成(tai 1ored)クローンは、抗フィブリン抗体遺伝子と共
に構造体中で用いられる。
それはtPA B鎖についてコードするゲノム配列を単離するためにも用いられ
るが、その後でゲノム配列は59D8遺伝子と共に構造体中で用いられる。
64C5のL鎖のアミノ末端に相当するように合成された余剰オリゴヌクレオチ
ド17量体及び市販に/Jプローブを用いて、産生性64C5L鎖再配列をpB
R322中で組立てられたサブゲノムライブラリーからクローニングした。完全
り鎖は、マウスに不変領域についてコードする5、8kb EcoR1/Bam
H1フラグメントを含んだpBR322プラスミドにクローニングされた再配列
フラグメントを結合させ、セグメントを付加することによって再組立てされた〔
マックスら。
ジャーナルーオブ・バイオロジカル・ケミストリー。
第256巻、第5116−20頁、1981年(Max 、 etal、、Jo
urnal of Biological Chemistry、25[i:5
11G−20<1981)):l。
VJ再配列は正しい向きで不変領域の5′側に位置していた。64C5ハイブリ
ドーマ由来ゲノムDNAをEcoRI制限酵素で消化し、プレバラティブアガロ
ースゲル上でサイズ分別し、しかる後λクローニングベクターに結合させ、サブ
ゲノムライブラリーを得た。H鎖結合領域由来プローブを用いて、再配列された
フラグメントをクローニングした。抗体のアミノ末端配列上のオリゴヌクレオチ
ドとのハイブリッド化により、64C5ハイブリドーマで用いられたH鎖再配列
であることがわ59D8ハイブリドーマ由来ゲノムDNAをサイズ分別し、λク
ローニングベクターに結合させ、上記H鎖結合領域プローブでスクリーニングし
た。双方のH鎖再配列をクローニングし、産生体を59D8H鎖のRNA配列に
基づくオリゴヌクレオチド20量体との/\イブリッド化により選択した。
59D8又は64C5遺伝子の可変及び結合領域並びにエンハンサ−配列を含む
クローニングされた制限フラグメントを、ツウスフ2BH鎖不変領域配列5′側
のプラスミド中に正しい向きで挿入する。この不変領域配列含有プラスミド(P
sV GPT/72B) は、pBR322由来のアンピシリン耐性遺伝子、及
びSV40ウィルスプロモーターのコントロール下にあるグアニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ(GPT)遺伝子も含んでいる。それはリチャード・二一
ア(Rlchard Neer)博士からの進呈品として得られたものである。
この構造体をアンピシリン耐性遺伝子を介して大腸菌M C1061内で増加さ
せるが、真核細胞内のGPT遺伝子発現はキサンチン、ヒボキサンチン及びミコ
フェノール酸の存在において選択することができる。
H鎖不変領域の力、ルボキシ末端についてコードする配列の大部分をその後で除
去した。それを触媒カルボキシ“B°鎖、ウロキナーゼ又は組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターについてコードする相補的DNAフラグメントで置き換えた。
いずれか1つのH鎖不変領域遺伝子における3番目のエキソンは、通常のアミノ
酸配列が産生されかつ複合タンパク質が生じるように、プラスミノーゲンアクチ
ベーター遺伝子の1つに“枠内′で結合される。この最終構造体を、通常のH鎖
産生を停止した適切な59D8又は64C5ハイブリド一マ変異体中にエレクト
ロポレーションによりトランスフェクトする。これらのトランスフェクト体は、
先端を欠(H鎖の末端におけるプラスミノーゲンアクチベータ一部分と共にフィ
ブリン特異性のある抗体分子を産生ずる。
ハイブリッド分子は、抗体結合部位及びウロキナーゼもしくはtPA配列の双方
を含むハイブリッド分子を得るために、ベンズアミジンセファロース及びβ−ペ
プチドセファ0−ス上の連続アフィニティークロマトグラ゛フィーを用いて単離
される。アフィニティーカラムは、5′族アミノ末端β鎖フィブリンペプチド(
Gly−His−Arg−Pro−Leu−Asp−Lys−Cys (β−ペ
プチド)〕(ヒューイ。
サイエンス、第222巻、第1129頁、1983年)をマレイミドベンゾイル
リジン−セファロースC14B(キ・タガワら、ジャーナル・オブ・バイオケミ
スロリー(日本)、第79巻、第233頁、1976年(Kitagava、e
t al、、Journal of’ BIochemlstry(Japan
)、79 :233(1978)))にカップリングすることにより作製される
。
このカラムの溶離液(0,2MグリシンHC1゜pH2,8)は回収されて、フ
ィブリン結合性及びフィバイブリッド免疫グロブリン分子は、2工程の連続アフ
ィニティークロマトグラフィーにより宿主細胞から精製される。分子を最初に固
定ベンズアミジン含をセファロースCL−4Bに供し、tPA−抗体ハイブリッ
ド分子を残留させ、しかる後0.IMアセテート、0.4MNaC1(pH4,
0)で溶出させた。次いで、中和後、溶出液をペプチド−セファロースカラムに
供する。β−ペプチドカラムからの溶出液(0,2Mグリシン、pH2,8)を
1.0Mアルギニン及び0.1%ツイーン(Tveen) 80含有NaPi緩
衝液に対して透析し、この緩衝液中4℃で貯蔵した。
ハイブリッド免疫グロブリン分子の特徴ハイブリッド分子を還元及び非還元双方
の条件下で5DS−PAGEに供する。ゲルをクマシーブルーで染色するか又は
(tPA又はUKがカップリング前に125Iで標識されている場合には)オー
トラジオグラフハイブリッド分子の機能性を評価するために、そのペプチド分解
性を非選択的基質H−D−イソロイシル−L−プロリル−し−アルギニン−p−
ニトロアニリドニ塩酸塩(S−2288)に関して最初に試験する。S−228
8アツセイを基質濃度3X104Mで0.05MトリスHCI、0.IOM N
aC1(pH8,5)(7)総容ff11.0mlで行う。405nmの吸光度
を20℃で10秒毎に測定する。
フィブリノーゲンアッセイ
クエン酸処理ヒト血漿又はクエン酸処理ウサギ血漿のサンプル中のフィブリノー
ゲン含量を2つの方法で調べた。凝固性フィブリノーゲンをクラウス、アクタ・
ケミ力・スカンジナビ力、第90巻、第419頁、1957年(CIauss、
、Acta Chewica 5candinavica、90:419(19
57))の方法により測定し、全フィブリノーゲンを亜硫酸ナトリウム沈降で調
べる。
血漿凝固アッセイ
リネンら、トロンボ・ヘモスタス、第52巻。
第308頁、1984年(Lljnen、et al、、Thromb。
Haeaostas、、52:30g(1984) )の方法を用いるが、但し
下記修正を加える。ドナーから得たヒト新鮮凍結血漿をプールし、等分し、再凍
結する。各実験の直前に、tPA、UK及びそれらのハイブリッド免疫グロブリ
ン分子の活性をS−2288アツセイで較正する(即ち、天然プラスミノーゲン
アクチベーター及びそれらのハイブリッド分子のペプチダーゼ活性を調べ、ペプ
チダーゼ活性(単位/ ml )が各サンプルで同一となるように適切な希釈を
行う)。下記物質を新鮮凍結血漿に加えることにより、血漿凝固を行わせるニト
ロンビン、 8 NIH単位/ml;0、5M Ca C12,100ttl
/ml ;及び I標識ヒトフィブリノーゲン(IBRIN)、40,000c
ps/ml。溶液をシラスチック(Si 1astic)チュービング(内径−
4+am)中に直ちに吸引し、37℃で30分間インキュベートする。凝固新鮮
凍結血漿含有シラスチックチュービング1.5on部分に切断し、凝固物0.2
mlを得る。次いで、使用前に0.15M NaC1で洗浄する。各凝固物をプ
ラスチックチューブに入れ、計測し、(同一プールからの)新鮮凍結血漿1ml
中に懸濁する。
実験をプラスミノーゲンアクチベータ−(又はプラスミノーゲンアクチベーター
及び抗体のハイブリッド分子)の添加によって開始させる。30分間隔で、一部
の新鮮凍結血漿を計測用に各チューブから取出す。サンプルをフィブリノーゲン
レベル測定実験の終了時貯蔵する。
インビボ血栓溶解
コレンら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション、第71巻
、第368頁、1983年(Collen、et al、、Journal o
f Cl1nical Investigation。
71:868(1983)]のウサギ頚静脈血管モデルを用いる。アセトプロマ
シン及びケタミンによるウサギの鎮静化後、右下顆から上記右鎖骨にかけて近中
心切開する。外側頚静脈血管を切開により摘出し、枝血管を結び、分離する。
羊毛糸を入れて、凝固物をつなぎとめる。出血が止んだ後、この外側頚静脈血管
片を摘出しうるように血管クランプを置き、凝固成分を摘出された血管片中に入
れる。
これらの成分は、 I標識ヒトフィブリノーゲン(各サンプルは使用前に計測さ
れる)約500.000 cpa%パック詰めヒト赤血球100μg、ヒト新鮮
凍結血漿100、cl、0.5M CaCl210.cl及び牛トロンビン(8
NIH単位)10Mgからなる。30分間後、血管クランプを取り除き、血流を
元に戻す。血栓中に取り込まれた放射能を測定するためにクランプが緩められた
後直ちに、血液サンプルを取出す。プラスミノーゲンアクチベーターの測定量を
25m1容量まで希釈し、インフュージョンポンプで4時間にわたり反対耳の縁
血管から注ぎ込む。シリンジ、ガーゼスポンジ及びチュービングを計測すること
により、逸失分のカウント数を調べる。
インフュージョン開始6時間後、完全な血管片を摘出し、除去し、計測する。溶
解率は、実験終了時に残留するカウント数対開始時のネット(net)カウント
数の比率として調べられる。
フィブリン溶解アッセイ
定量フィブリン溶解アッセイでは、フィブリンモノマーをセファロースにリンク
させる。フィブリノーゲンをリジン−セファロース通過によりプラスミン汚染物
質から精製し、痕跡量の125I標識フイブリノーゲンと混合する。次いで、そ
れを臭化シアン活性化セファロースCl−4Bにカップリングさせる。固定され
たフィブリノーゲンを100111M CaCl2存在下ヒトトロンビンの添加
によりフィブリンに変換させる。
それらの相対的フィヲリン溶解活性を計画するために、1251−UK−64C
5ハイブリッド分子及びウロキナーゼ(又は1251− tPA−59D8ハイ
ブリッド分子及びtPA)を次第に増量させて125I−フィブリン−セファロ
ースと共に4時間インキュベートする。しかる後、樹脂を精製プラスミノーゲン
と共にインキュベートする。2.5及び15時間の間隔後、混合物を遠心分離し
、上澄の放射能を測定する。この操作をコントロール複合体(1251−UK)
−SS−(3H3)で繰返す。
例2
高分子量ゲノムDNAをクォーターマスら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、
第128巻、第2687−2690頁、1987年(Quertermous、
et al、、Journalof Immuno1ogL128:2887−
2690(1987):lで既に記載された59D8ハイブリドーマ細胞から得
た。59D8ハイブリドーマ系に特異的な再配列H鎖免疫グロブリン遺伝子を確
認するために、サザンプロット分析を既に記載されたようにEcoRI消化ゲノ
ムDNA及び1.7キロ塩基(kb)EcoR1/Ps t 1ゲノム結合領域
プローブで行った〔サザーン、 E、 M、 、 ジャーナル・オブ壷モレキュ
ラー・バイオロジー、第98巻、第503−517頁(Southern、E、
M、、Journal of MolecularBiology、98 :
503−517) ;サカノら、ネーチャー。
第286巻、第676−683頁、1980年〕。元来融合して59D8ハイブ
リドーマ(SP210及びBa1b/C)を産生ずるいずれの細胞においても存
在しない2種の再配列が確認された。次いで、ゲノムDNA1a+gをEcoR
lで消化し、プレバラティブアガロースゲル上でサイズ分別した。サザーン、E
、メソッズ・イン・エンザイモロジ−(Methods in Enzywol
ogy) 。
編集ウー、 Ro(Wu、R,) 、(アカデミツク・プレス、二ニーヨーク)
、第68巻、第152−176頁。2種の再配列フラグメントの各々を含んだ両
分を結合領域プローブとのハイブリッド化により確認する。これらの画分を濃縮
し、λgtlOに結合させた。こうして組み立てられた2種のサブゲノムライブ
ラリーを結合領域プローブでスクリーニングし、数種の可能なりローンを各ライ
ブラリーから単離した〔マニアナイスら、モレキュラー・クローニング、198
2年(コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク) (Maniatis
et al、、MolecularCloning、 1982(Cold
Spring Harbor、NY)) ) 、 59 D 8抗原結合部位に
ついてコードする再配列フラグメントを含んだクローンの選択は、59D8H鎖
mRNAの配列に基づき組み立てられた20塩基対オリゴヌクレオチドとのハイ
ブリッド化により行われた。RNAの単離及び配列決定、T4ポリヌクレオチド
キナーゼによるオリゴヌクレオチドの32P標識化並びにハイブリッド化は、既
に記載された技術に従い行われた〔マニアナイスら。
モレキュラー・クローニング、前掲;クラークら8 ジャーナル・オブφエクス
ペリメンタル・メディシン。
第161巻、第687−704頁、1985年(C1arke。
et al、、 Journal of Experimental Medf
cine、161:887−704(1985)):サッグス(Suggs)ら
、プロシーディング・オブφナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスUSA
。
第78巻、第6613−6617頁、1981年〕。
発現ベクターの組立て
HELA細胞mRNAから組み立てられたcDNAクローン(pPA34’ F
)よりtPA配列を得た。フィッシャーら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー、第260巻、第11223−11230頁。
1985年o p B R322のβ鎖Sac I部位からEcoR1部位まで
についてコードするDNAを単離し、pGEM3に結合させた。次いで、隣接5
′フラグメントをS f aNl及び5aclでの消化により単離した。
BamH1端、Xho1部位及びグリシンに関するコドンを再構成する2つの塩
基を含んだ合成オリゴヌクレオチドをこの第二フラグメントの5′端に加えた。
次いで、修正されたフラグメントを既に3′端を含むプラスミド中に結合し、β
鎖配列を再構成した。β鎖をXhol及び5calで切り出したが、5acl部
位はpBR322配列から得られたものである。
最終構造体を、ネズミγ2b H鎖不変領域についてコードする6kbXbal
制限フラグメントを含んだポリリンカーの挿入により修正されたpsV2gl)
tベクター中にアセンブリーさせた。マリガン(Hut l igan)ら、プ
ロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスUSA、第
78巻、第2072−2076頁、1981年;タッカ−(Tucker)ら、
サイエンス、第206巻、第1303−1306頁、1979年。
2.6kb EcoR1フラグメントでクローニングされた産生性59D8 H
鎖再配列遺伝子を72b不変領域の5′側ポリリンカーにおけるEcoR1部位
中に正しい向きで挿入した。CH2中の唯一のXho1部位とポリリンカー中5
a11部位との間の不変領域配列を切り出し、5a11部位をプラント化し、t
PA β鎖を所定箇所に結合させた。ヌクレオチド配列分析では、H鎖及びtP
Aセグメント間の結合が枠内であることを確認した。サンガー(Sanger)
ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスUS
A、第74巻、第5463−5467頁、1977年。
モノクローナル抗体及び欠失変異体の選択ヒニーイら、サイエンス、第222巻
、第1129−1132頁、1983年で既に記載されているように、フィブリ
ンβ鎖のアミノ末端配列に基づく合成へブタペプチドでの免疫感作により、フィ
ブリン特異性モノクローナル抗体59D8を産生した。ハイブリドーマ細胞及び
欠失変異体をグルコース4. 5+g/ml、 1296牛脂児血清(FCS)
、硫酸ゲンタマイシン50g/ml及びL−グルタミン0.6■/ml含有DM
EMの完全培地で維持した。H鎖欠失変異体の選択のために、細胞を軟寒天中で
増殖させた。完全培地+0.2%アガロース及び追加8%FCSの5mlを組織
培養皿(60++++s)に加え、室温で3〜5分間かけて固化させた。鎖欠失
に関して選択される細胞(1〜2×103)をアガロース上に置いた。
細胞集団が形成されるまで(2〜4日間)、プレートを6%CO2中37℃でイ
ンキュベートした。H鎖欠失変異体を検出するために、細胞集団に0.2%アガ
ロース及び5〜10%ウサギもしくはヤギ抗マウスH鎖と共に完全培地を含む抗
血清溶液1.0mlをまいた。H鎖を分泌する細胞集団は沈降素ハロー(hal
o)を形成した。沈降素ハローを有しない集団をキャピラリーピペットで軟アガ
ロースから取出し、しかる後8%追加FCSと共に完全培地を含んだ96ウエル
プレート中に入れた。個々のサブクローンをH及びL鎖の存在に関して酵素結合
免疫吸着剤アッセイ(ELISA)又はウェスターンプロット法により調べた。
トランスフェクション及び選択
ボッター(Potter)ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ
−拳オブ・サイエンスUSA、第81巻、第7161−7165頁、1984年
で記載されているようにイスコ(lsco)電源を用いて、エレクトロポレーシ
ョンによって不変pD8SVtβを欠失変異体細胞中にトランスフェクトした。
最適のトランスフェクション条件はリン酸緩衝液0.8ml中に2000ボルト
電流を流すことであった。トランスフェクト体をミコフェノール酸、キサンチン
及びヒボキサンチン中での増殖により選択した。トランスフェクション及び発現
の確認は、ヒトtPAβ鎖の3′部分についてコードする2kbcDNAプロー
ブを用いてノザンプロット分析により行われた。マニアティスら、モレキュラー
・クローニング。
前掲。トランスフェクトされた細胞系を標準技術に従いサブクローニングした。
タンパク質の精製
2本のカラム上の連続二重アフィニティークロマトグラフィーにより、細胞上澄
及び腹水からタンパク質を精製した。1本のカラムは、59D8の生成に用いら
れる合成タンパク質をセファロースにリンクさせることにより組み立てた。他は
、セファロースにリンクされた抗ヒトtPAモノクローナル抗体から構成されて
いた。我々は、最初の精製試験において、セファロースにリンクされたベンズア
ミジンから構成される第三のカラムを用いた。しかしながら、ベンズアミジンは
tPAの活性部位に十分結合しかつベンズアミジン−セファ0−スは完全分子を
精製するために使用可能であるにもかかわらず、カラムは組換えタンパク質を残
留させなかった。
組換えタンパク質の精製は、2種の固相免疫アッセイによりモニターされた。抗
フィブリン抗体活性を検出するために、96ウ工ル微量滴定プレートをフィブリ
ンモノマーで被覆し、10%ウマ血清で阻止した。次いで、それらをサンプルと
共にインキュベートシ、洗浄し、のアッセイは、抗フィブリン抗体活性に関連し
たtPA抗原を検出しうるように考えられた。このアッセイでは、フィブリンモ
ノマー被覆プレートを培養上澄又は腹水と共にインキュベートし、l標識抗ヒト
tPAでプローブ処理した。tPA鎖はフィブリン結合活性を有していないこと
から、双方の機能性ドメインを含む組換えタンパク質のみが検出される。
ウェスターンプロット分析
確立された技術を用い、N a D o d S O4ポリアクリルアミドゲル
上で分離された還元及び非還元双方のサンプルからウェスターンプロットを行っ
た。バーネット。
W、N、、アナライティカル・バイオケミストリー、第112巻、第195−2
03頁、1981年(Burnette。
W、N、、Analytjcal Biochemistry、112:195
−203(1981))。
1251で標識されたヤギ抗マウスFab又はモノクローナル抗ヒトtPA抗体
をプローブとして用いた。
抗原結合アッセイ
オリジナル抗体(59D8)及び組換え分子を最初にフィブリン結合Fab抗原
の存在に関して試験した。これは、プローブとして125I標識ヤギ抗マウスF
を用いb
て上記固相免疫アッセイにより行われた。滴定曲線は、アッセイにおいて59D
8及び組換えタンパク質に関しそれらの濃度を変えることにより作成された。次
いで、同量の結合125I標識抗体を生じるであろう濃度を各曲線の直線部分か
ら選択した。59D8又は融合タンパク質のいずれかのこの濃度において、フィ
ブリンで被覆されかつ様々な量の可溶性フィブリンで補充されたウェル中で競合
アッセイを行った。不溶性でない可溶性フィブリンに結合したタンパク質を標識
抗体の適用前に洗浄除組換えタンパク質の酵素機能を天然tPAの場合と比較す
るために、最初に非選択的基質S−2288(テキサス州バーモントのヘレナ研
究所)の開裂について測定するアッセイによりそのペプチド分解性を調べた。ア
ッセイは、発色源基質最終濃度1mMにおいて緩衝液(0,15M)リス、0.
15M NaC1)50μN中で行われた。ボーウェス(Boves)メラノー
マ細胞系〔カリフォルニア州へイワードのバイオ・レスポンス(Bio Re5
ponse))から精製された様々な濃度の組換えタンパク質又はtPAを加え
、405niの吸光度を経時的に測定した。
組換えタンパク質がプラスミノーゲンを活性化しうるか否かについて調べるため
に、発色原基質S−2251(ヘレナ研究所)を用いて、第二のアッセイを行っ
た。
メラノーマtPA、組換えタンパク質及び牛トリプシンの活性を最初にS−22
88アツセイで調べ、各酵素が100単位/100μgで存在するように濃度を
調整した。次いで、メラノーマtPA、組換えタンパク質又は牛トリプシン10
0μgをヒトプラスミノーゲン(0,15mg/ml) 10011g及びS−
2251基質800μgに連続希釈しながら加えた。サンプルを37℃で60分
間インキュベートした。反応を5096酢酸1mlの添加により終結させ、40
50mの吸光度を測定した。
結果
59D8 H鎖欠失変異体中にpSVD8T構造体(第1図)のエレクトロポレ
ーションによりトランスフェクトされた多数のクローンを得た。約1×108の
ハイブリドーマ細胞をリン酸緩衝液0.8ml中環状プラスミドDNA50μg
と混合しかつ2000ボルトの放電に供した場合には、96ウエルプレート上約
15のウェルが薬物耐性クローンを含有していた。これらクローンの約75%は
組換えタンパク質を分泌することが示された。5つのクローンが、それらの増殖
速度及び融合タンパク質についてコードするmRNAの発現に関して別の分析用
に選択された。
アフィニティー精製組換えタンパク質のウェスターンプロット分析が行われた。
ヨウ素化抗ヒトtPAモノクローナル抗体でプローブ処理された還元ゲルのプロ
ットでは、65kDペプチドの標識化を示した。これは、H鎖tPA融合タンパ
ク質の予期されたサイズであった。
tPAのβ鎖は約33kDであって、先端を欠く8鎖が30kDを占めているべ
きである。いくつかの系の証拠によれば、65kDペプチドが牛脂児血清による
tPA様分子でないことを示している。65kDバンドは、トランスフェクトさ
れた細胞系が無血清培地中又はマウスの腹腔内で増殖された場合に観察される。
更に、我々はベンズアミジンアフィニティークロマトグラフィーにより牛脂児血
清から牛tPAを精製した場合に、それがウェスターンプロットにおいて抗体に
より標識されていたとしても、分子のサイズは75kDであった。
ポリクローナル血清由来のヤギ抗マウスFabでプローブ処理された還元サンプ
ルのウェスターンプロットでは、25kDタンパク質の標識化を示すが、これは
59D8にL鎖の予期されたサイズであった。かかるプロットにおいてこの試薬
は通常マウス免疫グロブリンH鎖も標識化するが、大部分のH鎖不変領域が除去
されていたことから、融合ペプチドの標識化の不存在は驚くべきことでない。非
還元サンプルで行われたプロットは、ヨウ素化抗体の双方により分子量170〜
180kDで単一バンドの標識化を示す。これは、ハイブリドーマ細胞が免疫グ
ロブリン及びtPAペプチドの双方を含む分子を産生じているという強い証拠を
与えている。170〜180kDという値は、H鏡開ジスルフィド結合が形成さ
れて2つの抗原結合部位及び2つのtPA部分を含むF ′ 様b 2
分子を生じることを示唆している。
分子のtPA部分のペプチド分解活性は、最初に非特異的基質S−2288の開
裂を測定することにより評価された。このトリペプチドの開裂は、波長405n
mの光を吸収するp−ニトロアニリンの生成を追跡することにより正確にモニタ
ーできる。第2A図は、異なる濃度の純粋なメラノーマtPAの活性を直接利用
した典型的アッセイについて示している。このアッセイにおける活性は、吸光度
(光学密度)の変化率として規定される。組換えタンパク質及び天然tPA間の
モルベースで比較が行われた場合に、組換えタンパク質は天然tPAの70%の
活性を有している。
触媒性β鎖サブユニットがプラスミノーゲン(その生理学的基質)に対する活性
を維持しているか否かについて調べるために、S−2251アツセイを実施した
。ここでは、プラスミノーゲンをプラスミンに変換するためにプラスミノーゲン
アクチベーターが必要であって、しかる後プラスミンは合成トリペプチドからp
−ニトロアニリンを遊離させる。プラスミノーゲンアクチベーターもトリプシン
も、S−2251基質を直接変換することができない。組換えタンパク質、メラ
ノーマtPA及びトリプシンのアミド分解活性を最初にS−2288アツセイで
調べ、次いで匹敵する量のそれら各々がプラスミノーゲンを変換しうる能力につ
いて調べた。第2B図は、組換えタンパク質が生理学的基質に作用しうる能力が
天然tPAの場合と極めて類似していることを示している。
トリプシンのような非特異的セリンプロテアーゼはプラスミノーゲンをプラスミ
ンに変換しうるけれども、それは天然又は組換えいずれのプラスミノーゲンアク
チベーターの場合はど十分に有効というわけではない。
精製過程及び精製後に用いられるアッセイは双方とも、完全及び機能性抗原結合
部位を必要とした。組換え分子を抗体59D8と更に定量的に比較するため、我
々は単純な競合アッセイを用いた。このアッセイでは、96ウエルプレートの底
に結合したフィブリンに対して抗体結合部位に関し競合する可溶°性フィブリン
モノマーの能力を測定した。アッセイでは天然抗体が組換えタンパク質の場合よ
りもフィブリンモノマーとよく結合しうろことを示しているが、それらの結合ア
フィニティーに関する差異は10倍以下である(第3図)。それは、抗体結合性
が融合タンパク質において有意には損なわれていないという証拠である。
考察
分泌されたタンパク質の詳細な分析では、59D8H鎖tPA融合タンパク質が
予想されたようにL鎖と共に発現されかつ分泌されることを示している。しかし
ながら、細胞培養上澄中に存在する組換えタンパク質の量はモノクローナル抗体
に関して予想される場合のわずが10%でしかない。アフィニティー精製により
、我々はルーチン的に精製タンパク質を細胞培養上澄1ml当たり0.1μg1
又は腹水1ml当たり10μg得ただけであった。我々は上記のように固相免疫
アッセイで精製をモニターしたが、アフィニティーカラムからの我々の回収率は
予想範囲内であった。限られた組換えタンパク質産生については、いくつかの可
能な理由がある。1つは、組換えタンパク質が細胞増殖又はタンパク質精製過程
で分解されてしまうことである。タンパク質分解を抑制する試みとして、我々は
プロテアーゼインヒビターを細胞培養物に加えた。収率上の改善は観察されなか
ったが、タンパク質分解は懸念されたままである。
他の更に基本的な問題は、タンパク質の低収率の原因である。適切なサイズのメ
ツセンジャーRNAがノザンプロットで見出されうるが、構造体の転写は低レベ
ルのままである。転写は天然H鎖プロモーター及びエンハンサ−により行われる
が、但し免疫グロブリン発現の調節に関して重要であることが判明した3′配列
はこの構造体から排除されていた。ブレゴー(Gregor)ら、モレキュラー
・セル・バイオロジー、第6巻、第1903−1916頁、1986年;コブリ
ン(1(obrin)ら、モレキュラー・セル・バイオロジー、第6巻、第16
87−1697頁、1986年。しかも、キメラ遺伝子の3′非翻訳領域は、正
常な条件下低レベルで産生されしかる後産生された細胞中で保存されるタンパク
質tPAに由来しているのである。tPA遺伝子の3’ UT領領域転写もしく
は翻訳を低レベルにしているか又は細胞からの組換えタンパク質の分泌を妨げて
いる可能性がある。
mRNA合成、タンパク質合成の定量及び組換えペプチドの安定性を目的とした
実験は、この問題を解決するにちがいないであろう。
H鎖欠失変異体は、抗体結合部位の再構成に便利な手段を提供する。それらの入
手性は、産生性り鎖再配列をクローニングしかつトランスフェクトすることを不
要にしている。このアプローチは、勿論これらの変異細胞系をトランスフェクト
しうるか否かに依存している。これらの実験で用いられる2つの系は標準的技術
を用いて容易にトランスフェクトされるが、但し他のS P 210誘導系も同
様に挙動するか否かはまだ明らかではない。H鎖欠失変異体が分泌するし鎖の量
は様々である。しかしながら、少量のし鎖を分泌する一部の欠失変異体は、H鎖
合成が再開された場合にこの同様のL鎖を正常な量で分泌することができる。ウ
ィルドら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー、第10巻、第46
2−467頁、1980年(vilde、et al、、EuropeanJo
urnal or I+u+uno1ogy、10:462−467(1980
)) o これらの細胞における免疫グロブリン鎖産生の欠失に関する生物学的
基礎についてはほとんど知られていないが、L鎖及びH鎖を産生しうる一部の欠
失変異体の能力が損なわれている可能性がある。我々の組換えタンパク質の低レ
ベル産生は、抑制されたL鎖発現の結果であろう。
組換えtPAβ鎖は高レベルの触媒活性を有しており、それはプラスミノーゲン
をプラスミンに変換する特異的能力を留めている。スタフィロコッカスヌクレア
ーゼ及び大腸菌DNAポリメラーゼ機能を免疫グロブリンH鎖にリンクさせた初
期の研究では、S−2288アツセイで測定される70%よりも著しく低いエフ
ェクター機能活性を示した。二ニーバーガーら、ネーチャー。
第312巻、第604−608頁、1984年;ウィリアムスら、ジーン、第4
3巻、第319−324頁。
1986年[Williams、et al、、Gene、43:319−32
4(198G) )。
酵素活性及び基質特異性のこの保有は、堅いホールディング及び多数鏡開ジスル
フィド結合の形成を要する複雑な分子であってもハイブリッド組換えタンパク質
を形成する上で使用可能であることを示している。他方では、tPAのβ鎖が正
確にホールディングしかっα鎖の不存在下で活性を維持しうろことを示した。マ
クドナルド(MaeDonald)ら、ジーン、第42巻、第59−67頁。
1986年;フォン・シネベルド(Won Zonneveld)ら。
プロシーディング争オブ・ナショナル。アカデミ−・オブ・サイエンスUSA、
第83巻、第4670−4674頁、1986年。我々の結果は触媒鎖単独の活
性を確認させ、かつ鎖が異なるアミノ末端配列との関係で正確にホールディング
しうろことを示している。しかも、これらの観察は異なるタンパク質ドメインの
独立的ホールディングに関する証拠を提供している。
要約すれば、我々は抗フィブリン抗体の抗原結合部位についてコードするH鎖遺
伝子をクローニングし、先端を欠くH鎖tPA βサブユニツト融合ペプチドに
ついてコードする構造体を産生じた。次いで、構造体は抗フィブリンのハイブリ
ドーマのH鎖欠失変異体中にトランスフェクトされた。ウェスターンプロット分
析では、融合タンパク質が抗フィブリン抗体活性を有しかつ天然tPAの場合と
同様であると考えうる程十分高いプラスミノーゲン活性化活性レベルを有するこ
とを示している。
これらの記載、例及び態様は説明のみの目的であって、様々な修正が本出願及び
添付された請求の範囲の精神及び範囲内で示唆されうると、理解される。
F工GURX I
DJ
浄書(内容に変更なし)
i+乎 (時間ン
夙2A図
浄書(内容に変更なし)
為28図
浄書(内容に変更なし)
、1 1 10 100
可r ;Z +z ンン7゛ソン0ズA〒)δン 、μg手手続補正書式式
%式%
1、事件の表示
PCT/US 87/102968
2、発明の名称
組換えハイブリッド免疫グロブリン分子及び使用方法3、補正をする者
事件との関係 特許出願人
ザ、ゼネラル、ホスピタル、コーポレーション4、代 理 人(郵便番号100
)
平成1年12月11日
(発送日 平成1年12月19日)
6、補正の対象
特許法第184条の5第1項の規定による書面の出願人の欄委任状、図面翻訳文
国際調査報告
Claims (5)
- 1.フィブリンに特異的な抗原結合部位のある抗体可変領域及びフィブリン溶解 酵素活性領域を有するキメラ免疫グロブリン分子。
- 2.フィブリン溶解酵素が組織型プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプト キナーゼ、ウロキナーゼ及びプロウロキナーゼからなる群より選択される、請求 の範囲第1項に記載のキメラ免疫グロブリン分子。
- 3.請求の範囲第1項に記載の組換えキメラ免疫グロブリン及び薬学上許容され る担体を含有する医薬組成物。
- 4.血栓のある患者に請求の範囲第3項に記載の医薬組成物の有効量を投与する ことを特徴とする血栓溶解方法。
- 5.血栓を検出するための方法であって、(a)請求の範囲第1項に記載のキメ ラ免疫グロブリン分子を宿主に投与し(上記分子は放射性同位元素標識されてい る);及び (b)上記血栓の存在を検出する; ことを特徴とする方法。
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