DE3786151T2

DE3786151T2 - Rekombinante Hybrid-Immunoglobulinmoleküle sowie deren Verwendung.

Info

Publication number: DE3786151T2
Application number: DE87310006T
Authority: DE
Inventors: Edgar Haber; Thomas Quertermous
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1986-11-12
Filing date: 1987-11-12
Publication date: 1994-01-13
Anticipated expiration: 2007-11-13
Also published as: CA1339445C; EP0271227B1; WO1988003559A1; ATE90385T1; EP0271227A3; DE3786151D1; ES2054688T3; EP0271227A2; JPH02500950A

Description

Diese Erfindung betrifft ein rekombinantes Hybrid-Immunoglobulinmolekül mit einer Antigenbindungsstelle, die für Fibrin spezifisch ist, das an ein zweites Protein gebunden ist, welches den aktiven Teil eines Plasminogenaktivators enthält. Diese Erfindung betrifft auch das Klonieren und Herstellen dieser neuartigen Hybrid-Immunoglobulinmoleküle. Diese Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Verwendung dieser Hybrid- Immunoglobulinmoleküle in immunodiagnostischen und immunotherapeutischen Prozessen.
Die meisten Myokardinfarkte werden durch Koronarthrombose verursacht (DeWood et al., N. Eng. J. Med., 303 : 897 (1983)). Die Koronarthrornbose, die den Myokardinfarkt verursacht, kann durch Thrombolytika aufgelöst werden. Diese Thrombolytika sind Plasminogenaktivatoren, die die Konversion von Plasminogen zu dem fibrinolytischen Enzym Plasmin aktivieren. Plasmin löst dann das in dem Thrombus vorhandene Fibrin auf. Diese Behandlung mit Plasminogenaktivatoren ist nicht ohne Nebenwirkungen. Plasmin wirkt nicht selektiv und löst daher nicht nur das Fibrin im Thrombus auf, sondern greift auch Fibrinogen und andere Gerinnungsfaktoren an, was oftmals zu einer schweren Blutungsneigung führt.
Streptokinase, Urokinase, Prourokinase und gewebeartiger Plasminogenaktivator (tPA) sind bekannte Plasminogenaktivatoren zur Auflösung von Thromben. Diese Aktivatoren sind für die Behandlung akuter kardiovaskulärer Erkrankungen wie Infarkt, Schlaganfall, Lungenembolie, tiefe Venenthrombose, peripherer Arterienverschluß und andere venöse Thrombosen indiziert. Sowohl Streptokinase als auch Urokinase weisen jedoch starke Einschränkungen auf. Aufgrund-einer geringen Affinität für Fibrin aktivieren beide Aktivatoren unterschiedslos das zirkulierende und fibringebundene Plasminogen. Das in dem zirkulierenden Blut gebildete Plasmin wird neutralisiert, bevor es in der Thrombolyse verwendet werden kann. Verbleibendes Plasmin baut verschiedene Gerinnungsfaktorproteine ab, zum Beispiel Fibrinogen, Faktor V und Faktor VIII, wodurch ein Blutungspotential entsteht. Ferner ist Streptokinase stark antigen und Patienten mit hohen Antikörpertitern sprechen ungenügend auf die Behandlung an und können nicht kontinuierlich behandelt werden.
Der gewebeartige Human-Plasminogenaktivator kann an Fibrin binden und begünstigt daher die Aktivierung von Plasminogen in der Nähe des Thrombus, wodurch möglicherweise Fibrinogen anderswo im Kreislauf verschont wird. Bei Dosen, die zum raschen Auflösen von Koronarthromben erforderlich sind, kann die Verwendung des gewebeartigen Plasminogenaktivators jedoch auch zu Blutungen führen.
Zur Erhöhung der Spezifität der Thrombolytika gegenüber dem Thrombus hat sich gezeigt, daß kovalente Bindung von Urokinase an einen fibrinspezifischen Antikörper zu einer deutlichen Verstärkung der fibrinolytischen Potenz und Spezifität führt. Bode et al., Science, 229 : 765-767 (1985).
Eine für jedes Antikörpermolekül charakteristische Funktion ist die spezifische Bindung an eine antigene Determinante. In vivo Antikörper sind bivalent und monospezifisch und enthalten zwei identische Antigenbindungsstellen. Die spezifische Bindung des Antigens durch ein Antikörpermolekül wird durch die Struktur der variablen Regionen (Fab) der schweren und leichten Ketten des Antikörpers bestimmt.
Es wurden Antikörper mit zweifacher Spezifität hergestellt, indem Antikörper verschiedener Spezifität einer selektiven Spaltung der Disulfidbrücken unterzogen wurden, die die beiden schweren Ketten verbinden. Antikörper-Halbmoleküle werden dann bei neutralem pH reassoziiert, um die Hybrid-Antikörper mit zweifacher Spezifität herzustellen. Siehe Nisonhoff et al., Nature (London), 194 : 355 (1962); Brennan et al., Science 229 : 31(1985); Liu et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 82 : 8648 (1985); und die gemeinschaftlich übertragene, anhängige U.S. Patentanmeldung, Seriennr. 851.554, eingereicht am 14. April 1986 (entsprechend der veröffentlichten EP-A-024 1907).
Bispezifische Antikörper wurden auch aus Hybridomen erzeugt. Die Herstellung von bispezifischen monoklonalen Antikörpern durch Verschmelzen von antikörpererzeugenden Hybridomzellen wird von Milstein und Cuello, Nature (London), 305 : 537 (1983) und in der PCT-Anmeldung WO83 103679 beschrieben.
Antikörper wurden auch durch rekombinante DNA-Techniken kloniert und erzeugt. Gene für schwere und leichte Ketten wurden in geeignete Wirte eingeführt und exprimiert, worauf eine Reaggregation dieser einzelnen Ketten zu funktionellen Antikörpermolekülen folgt (siehe zum Beispiel Munro, Nature, 312 : 597 (1984); Morrison, S.L. Science 222 : 1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4 : 214 (1986); Wood et al., Nature, 314U:446-449 (1985)). Variable Regionen der leichten und schweren Kette wurden in fremden Wirten kloniert und exprimiert und behalten ihre Bindungsfähigkeit (Moore et al., Europäische Patentveröffentlichung 0088994 (veröffentlicht am 21. September 1983).
Chimäre oder hybride Antikörper wurden auch durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt. Oi und Morrison, BioTechniques, 4 : 214 (1986) beschreibt eine Methode zur Erzeugung chimärer Antikörper. Auf den Seiten 218-220 wird ein chimärer: Human-IgG Anti-Leu3 Antikörper beschrieben. Die Autoren erklären, daß ein chimärer Maus:Human-Anti-Dansyl-Antikörper erzeugt wurde. Dieser Artikel läßt darauf schließen, ohne dies genau anzuführen, daß die Leu3-Bindungsspezifität und die Anti-Dansyl-Bindungsspezifität gemeinsam in ein einziges Immunoglobulinmolekül kloniert wurden.
Morrison, Science, 222 : 1202 (1985) zeigt in Tabelle 1, daß zur Herstellung von Fusionsproteinen variable Regionen der leichten oder schweren Ketten an eine Non-Ig-Sequenz angeheftet werden können. In dem Artikel wird behauptet, daß die Fusionsproteine drei Verwendungsmöglichkeiten besitzen: 1) das Anheften der Antikörperspezifität an Enzyme zur Verwendung in Tests; 2) die Isolierung der Non-Ig-Proteine durch Antigensäulen; und 3) die spezifische Abgabe von toxischen Mitteln. In dieser Bezugsstelle gibt es keine Beschreibung hinsichtlich irgendeines spezifischen chimären Immunoglobulinmoleküls.
Neuberger et al., Nature, 314 : 268 (1985) beschreibt einen chimären Antikörper, dessen schwere Kette eine konstante Region des Menschen ist, die mit einer variablen Region der Maus, die für das Hapten 4-Hydroxy-3-nitrophenyl-acetyl spezifisch ist, verschmolzen wurde.
Die Europäische Patentanmeldung 120.694 beschreibt die genetische Erzeugung der variablen und konstanten Regionen eines Immunoglobulinmoleküls, das in E.coli-Wirtszellen exprimiert wird. Auf Seite 10 der Anmeldung wird behauptet, daß das Immunoglobulinmolekül durch eine Wirtszelle synthetisiert werden kann, wobei ein weiterer Peptidteil an eine der konstanten Domänen angeheftet wird. Dieser Peptidteil wird als entweder cytotoxisch oder enzymatisch beschrieben. Auf Seite 10 wird auch behauptet, daß das Immunoglobulinmolekül auch ein Therapeutikum umfassen kann. Die Beschreibung in der Anmeldung und in den Beispielen schildert die Verwendung einer lambdaähnlichen Kette, die von einem monoklonalen Antikörper abgeleitet wird, der an die 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetal (NP) Haptene bindet.
Die Europäische Patentanmeldung 125.023 betrifft die Verwendung rekombinanter DNA-Techniken zur Herstellung von Immunoglobulinmolekülen, die chimär oder anders modifiziert sind. Eine der auf Seiten 3-4 beschriebenen Verwendungen dieser Immunoglobulinmoleküle ist die Verwendung zur Ganzkörperdiagnose und Behandlung durch Injektion der Antikörper, die auf spezifische Zielkrankheitsgewebe gerichtet sind, in Patienten. Die Krankheit kann durch Anheften eines geeigneten Markers an die Antikörper nachgewiesen werden oder das erkrankte Gewebe kann durch den Transport eines geeigneten Medikaments mit Antikörpern angegriffen werden. Die Anmeldung beschreibt Antikörper, die zur Unterstützung der spezifischen Abgabe eines Mittels erzeugt wurden, als "Veränderte Antikörper".
Die PCT-Anmeldung W083103971 betrifft ein Hybridprotein, das Antikörper-enzymatisch aktive Toxine umfaßt.
In der PCT-Anmeldung W083/01533 werden auf Seite 5 chimäre Antikörper beschrieben, bei welchen die variable Region eines Immunoglobulinmoleküls an einen Teil eines zweiten Proteins gebunden ist, das den aktiven Teil eines Enzyms umfassen kann.
Boulianne et al., Nature, 312 : 643 (1984) konstruierten ein Immunoglobulingen, bei dem die DNA-Segmente, die die variablen Regionen der Maus, die für das Hapten Trinitrophenyl spezifisch sind, zu Segmenten verbunden werden, die Mu und Kappa konstante Regionen des Menschen kodieren. Diese chimären Gene wurden als funktionelles, TNP-bindendes, chimäres IgM exprimiert.
Morrison et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81 : 6851(1984) schufen ein chimäres Molekül unter Verwendung der Exons der variablen Region der schweren Kette eines Anti-Phosphor-Cholin-Myelomproteingens, die mit den Exons jedes Kappa-leichten Kettengens des Menschen verbunden wurden. Die Gene wurden in Maus-Myelom-Zellinien transfektiert, wodurch transformierte Zellen hergestellt wurden, die chimäres Maus-Human-IgG mit Antigenbindungsfunktion erzeugten.
Sharon et al., Nature, 309 : 604 (1984) verschmolzen ein Gen, das eine variable Region der schwere Ketten der Maus, die für Azophenylarsonat spezifisch ist, mit dem Gen der konstanten Region der Kappa-leichten Kette der Maus verschmolzen. Dieses Gebilde führte zu einer Polypeptidkette, die mit der entsprechenden VL-Kappa-Polypeptidkette dimerisierte, wenn sie in die geeignete Myelom-Zellinie eingeführt wurde. Das VHKappaVLCKappa-Molekül wurde an das Azophenylarsonat-Hapten gebunden.
Neuberger et al., Nature, 312 : 604 (1984) verbanden das Gen der variablen Region der schweren Kette eines haptenspezifischen Antikörpers mit einem Gen, das die Synthese der micrococcalen Nuklease spezifizierte, und erhielten ein Hybridmolekül, das sowohl die Antigenbindung als auch die enzymatische Aktivität aufwies.
Es wäre wünschenswert, einen selektiven Plasminogenaktivator zu haben, der durch eine hohe Affinität und Spezifität für Fibrin im Verhältnis zu Fibrinogen gekennzeichnet ist und der die Aktivierung von nur Plasminogen in der unmittelbaren Umgebung eines finbrinhältigen Thrombus bewirkt.
Diese Erfindung betrifft ein rekombinantes Hybrid-Immunoglobulinmolekül mit einer Antigenbindungsstelle, die für Fibrin spezifisch ist, das an ein zweites Protein gebunden ist, welches den aktiven Teil eines Plasminogenaktivators umfaßt. Die Erfindung betrifft auch das Klonieren und Herstellen dieser neuartigen Hybrid-Immunoglobulinmoleküle. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Verwendung dieser rekombinanten Hybrid-Immunoglobulinmoleküle in immunodiagnostischen und immunotherapeutischen Verfahren.
Die Erfindung umfaßt auch genetische Sequenzen, die für die Hybrid-Immunoglobulinmoleküle kodieren, Klonierungs- und Expressionsvektoren, die solche genetischen Sequenzen enthalten, Wirte, die mit solchen Vektoren transformiert sind, und Methoden zur Herstellung solcher Hybrid-Moleküle durch Expression der zugrundeliegenden genetischen Sequenzen in solchen Wirten.
Der Rest der Beschreibung und auch die Zeichnungen betreffen bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung, wobei
Fig. 1 die Struktur des Expressionsplasmids pSVD8t zeigt, das für das schwere Kette-t-PA-Fusionsprotein kodiert. Die Kodierungssequenzen sind außerhalb des Kreises bezeichnet; Restriktionsstellen, die zur Konstruktion verwendet werden, sind innerhalb des Kreises beschrieben. Abkürzungen; VDJ, Neuordnung der produktiven 59D8 schweren Kette; 2b-CH, genomische Sequenz der 2b-schwere Kette-konstanten Region der Maus; t-PA-, cDNA-Sequenz, die für die t-PA Kette des Menschen kodiert; 3'-UT, 3' nichttranslatierte Sequenz der t-PA cDNA des Menschen; AMPr, pBR322 Ampicillin-Resistenzgen; gpt, E. coli Guanin-Phosphoribosyl-Transferasegen, das von den SV40 Promotor angetrieben wird; R1, Eco R1.
Fig. 2 den chromogenen Substrattest zeigt, der die katalytische Aktivität des rekombinanten Proteins mit jener des Melanom t-PA vergleicht. Fig. 2A: Wie durch die strichlierten Linien dargestellt wird, wurde der S-2288 Test mit 105 ng (offene Kreise) oder 70 ng (offene Kästen) des rekombinanten Proteins durchgeführt. Die vollen Linien stellen die katalytische Aktivität von 50 ng (volle Kreise), 40 ng (volle Kästen) oder 30 ng (volle Dreiecke) des Melanom t-PA dar, das als Standard verwendet wurde. Die relative molare Aktivität des rekombinanten Proteins wurde durch Vergleich mit t-PA-Standards mit ähnlichen Katalysegeschwindigkeiten bestimmt. Fig. 2B: Der S-2251-Test wurde mit unterschiedlichen Aktivitäten von Melanom t-PA-Standard (offene Kreise), rekombinantem Protein (volle Kreise) und Rindertrypsin (offene Dreiecke) durchgeführt. In dem S-2288-Test wurden die Einheiten der Aktivität jedes Proteins bestimmt.
Fig. 3 einen Vergleich des Bindungsverhaltens von 59D8-Antifibrin-Antikörper und rekombinantem Protein wiedergibt. Die Kurven stellen die Hemmung der Antikörperbindung an Festphasen-Fibrinmonomer durch Verdrängung mit verschiedenen Konzentrationen von löslichem Fibrinmonomer dar. Rekombinanter Antikörper (strichlierte Linien) erfordert eine etwas höhere Konzentration an löslichem Fibrin für eine 50% Hemmung als der Antikörper (volle Linien) und bindet daher Fibrin etwas weniger rasch.
Dieser Unterschied ist geringer als das Zehnfache.
Diese Erfindung betrifft ein rekombinantes Hybrid-Immunoglobulinmolekül, das sowohl Antigenbindung als auch Enzymaktivität besitzt. Genauer betrifft diese Erfindung ein rekombinantes Hybrid-Immunoglobulinmolekül mit einer Antigenbindungsstelle, die für das Fibrin spezifisch ist, das an einem zweiten Protein gebunden ist, welches den aktiven Teil des Plasminogenaktivators umfaßt. Diese Erfindung betrifft auch das Klonieren und Herstellen dieser neuartigen Hybrid-Immunoglobulinmoleküle.
In dieser Patentschrift wird der Begriff "Hybrid-Immunoglobulinmolekül" zur Bezeichnung eines einzelnen Moleküls verwendet, das durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt wird und den gesamten oder einen Teil eines fibrinspezifischen Antikörpers und den gesamten oder einen Teil eines Plasminogenaktivators umfaßt. Heterobifunktioneller Antikörper, Heteroantikörper, bispezifischer Antikörper, heteroligierender Antikörper, doppelsträngiger Antikörper und Heterodimer sind Begriffe, die sich alle definitiver auf einen Antikörper mit zweifacher Spezifität beziehen, das heißt, zwei Antikörper-Verbindungsstellen in einem Molekül.
Fibrinspezifität bezeichnet hierin Antikörper, die gegen Fibrin gebildet wurden. Wenn Blut aus dem Gefäßsystem austritt, wandelt eine komplizierte Kaskade von enzymatischen Reaktionen Fibrinogen zu Fibrin um, dem Strukturprotein in geronnenem Blut. Fibrinogen selbst ist das am wenigsten lösliche der Plasmaproteine. Bei einem 340.000 kd MW besitzt es eine zweifache Symmetrie, die aus drei Paaren nichtidentischer Polypeptidketten, A-Alpha, 3-Beta und Gamma genannt, entsteht. An der Stelle der Thrombose wird die Gerinnungskaskade aktiviert, um Thrombin zu erzeugen, das polare Peptide (Fibrinopeptid A aus A-Alpha und Fibrinopeptid B aus B-Beta) enzymatisch spaltet und zu einer Fibrinmonomerbildung führt. Fibrinmonomere, die weitaus weniger löslich sind, polymerisieren sofort zu einem Gelnetz. Nach der Polymerisation wird das Fibringerinnsel durch Faktor XIIIa stabilisiert, der kovalente e-(g-Glutamyl)lysinbindungen zwischen den Ketten bewirkt. Fibrinogen und Fibrin sind in mehr als 98% ihrer Struktur identisch und unterscheiden sich nur in zwei neu exponierten Aminotermini, jene der Fibrin-Alpha- und Beta-Ketten. Die Aminosäuresequenz dieser Fibrin-Aminotermini ist bekannt. Doolittle, R.F., "Fibrinogen and Fibrin", in Putnam, F.W. Hrsg., The Plasma Proteins: Structure. Function and Genetic Control, 3. Auflage, Band 2, New York: Academic Press, 1975; 109-156.
Fibrinepitope, die in dieser Erfindung verwendet werden können, umfassen den Aminoterminus der Fibrin-Beta-Kette, den Aminoterminus der Fibrin-Alpha-Kette, die Beta- (43-49) Aminosäuresequenzen, die zu einer Plasminspaltungsstelle Carboxy-endständig sind, und die Gamma-Kette-Vernetzungsstelle.
Antikörper mit Spezifität zu Fibrin wurden in Hui et al., Science, 221 : 1129 (1983) beschrieben. Eine weitere Beschreibung derselben Art von Antikörpern ist in der gemeinschaftlich übertragenen, anhängigen U.S.
Patentanmeldung, Seriennr. 824.228, eingereicht am 30. Jänner 1986 (US-A-49279 16), für "Fibrin-Specific Monoclonal Antibodies Lacking Fibrinogen Cross-Reactivity" zu finden. Fibrinspezifische monoklonale Antikörper mit im wesentlichen keiner Fibrinogen-Kreuzreaktivitat werden auch in der gemeinschaftlich übertragenen, anhängigen U.S. Patentanmeldung, Seriennr. 851.514, eingereicht am 14. April 1986, beschrieben. Andere Beispiele für Antikörper mit einer Spezifität gegen Fibrin umfassen Kudryk et al., Mol. Imm., 21 : 89 (1984); der Callewaert gehörenden Europäischen Patentanmeldung 146.050, veröffentlicht am 26. Juni 1985, für "Site Selective Plasminogen Activator and Method of Making and Using Same"; und der Bundesen et al. gehörenden Australischen Patentanmeldung, AU-A-25387/84 für "Monoclonal Antibodies with Specificity for Crosslinked Fibrin and Their Diagnostic Uses".
Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Hybrid-Immunoglobulinmoleküle kann der gesamte fibrinspezifische Antikörper kloniert werden und einen Teil des Hybridmoleküls umfassen. Zur Verringerung der Größe des Hybrid-Immunoglobulinmoleküls und zur Verringerung der Antigenität wird jedoch bevorzugt, nur die Region des Antikörpers zu verwenden, die Fibrin erkennt und an dieses bindet.
Das Klonieren dieser Region des fibrinspezifischen Antikörpers erfordert die Kenntnis der Struktur und Funktion von Antikörpern. Kurz, Antikörper sind tetramere Immunoglobuline, die aus zwei identischen leichten (L) Ketten und zwei identischen schweren (H) Ketten bestehen. Jede Proteinkette besteht aus zwei Hauptregionen: der N-terminalen variablen (V) Region und der C-terminalen konstanten (C) Region. Die variablen leichten (VL) und schweren (VH) Ketten bilden die variable Regionsdomäne. Die variable Domäne bestimmt das Erkennen und die Spezifität zu einem bestimmten Antigen. Die konstanten Regionsdomäne der leichten (CL) und schweren (CH) Ketten vermitteln die Effektorfunktion, die für die Durchführung der Immunantwort verantwortlich ist. Die Hinge-Region (J) des Antikörpermoleküls verbindet das Fab-Fragment mit dem Fc-Fragment des Antikörpers.
Innerhalb der variablen Region können hypervariable Regionen vorhanden sein, die als Diversity-Domäne (D) bekannt sind. Diese Diversity-Domäne stehen mit Exons in Verbindung, die in den Genen beobachtet werden, die für die variablen Regionen kodieren.
Die variable Domäne eines Antikörpers, eine Proteinstrukturdefinition, besteht sowohl aus VL als auch aus VHSegmenten der leichten und schweren Ketten. Sie enthält 6 hypervariable Regionen, drei in der leichten Kette und drei in der schweren Kette. Auf genetischem Niveau sind drei Exons für die Spezifizierung von VH verantwortlich, einschließlich des Rahmens und der hypervariablen Regionen; zwei Exons spezifizieren VL. Die ersten beiden hypervariablen Regionen sowohl von VL als auch von VH werden durch die V-Gen-Exons der leichten bzw. schweren Kette spezifiziert. Die dritte hypervariable Region der leichten Kette wird durch zwei Exons, VL und JL, spezifiziert. Die dritte hypervariable Region der schweren Kette wird durch drei Bxons, VH, D und JH, spezifiziert.
Die Expression des Immunoglobulingens erfolgt durch Verbindung des V-Gens mit dem C-Gen durch somatische Rekombination in den B-Lymphozyten. Diese Gene werden zur Bildung des vollständigen Immunoglobulins verbunden. Die neugeordneten, verbundenen Gensegmente kodieren dann die vollständigen Immunoglobulin oder Antigen-Bindungsdomäne der leichten und schweren variablen Ketten.
Es gibt fünf Hauptklassen von schweren Ketten, die durch chemische und isotypische Eigenschaften gekennzeichnet sind. Diese Klassen der schweren Kette werden als Mut Gamma, Delta, Alpha und Epsilon bezeichnet. Es gibt auch zwei Hauptklassen von leichten Ketten: Kappa und Lambda.
In dieser Erfindung wird ein für Fibrin spezifischer Antikörper als Teil des Hybrid-Immunoglobulinmoleküls kloniert. Vorzugsweise wird nur die variable Region des Fibrin-Antikörpers kloniert. Entweder umfassen die variable leichte oder die variable schwere Kette oder beide zum Teil das Hybridmolekül. Zusätzlich kann die Hinge-Region des fibrinspezifischen Antikörpers kloniert werden. Die konstante Domäne des Fab-Teils des fibrinspezifischen Antikörpers, die mit der variablen Region verbunden ist, kann auch kloniert werden.
Die variable und konstante Region des klonierten und in dem Hybrid-Immunoglobulinmolekül verwendeten, fibrinspezifischen Antikörpers kann von einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen erhalten werden. Die variable Region kann aber auch von einem Säugetier und die konstante Region von einem Menschen erhalten werden.
Zu den Plasminogenaktivatoren, die in dieser Erfindung verwendet werden können, zählen Urokinase, Prourokinase, gewebeartiger Plasminogenaktivator und Streptokinase. Wenn Plasminogen durch einen Aktivator zu Plasmin, dem aktiven fibrinolytischen Enzym von Plasma, konvertiert wird, entwickelt es eine deutliche Affinität für sein Substrat, Fibrin.
Der Begriff "Plasminogenaktivator" ist daher ein Thrombolytikum und soll in dieser Patentschrift jedes verwendete Mittel umfassen. Es sind in der Technik andere Begriffe für die Auflösung eines Thrombus bekannt, einschließlich Fibrinolyse. Die häufigsten Plasminogenaktivatoren sind zwar Streptokinase, Urokinase, Prourokinase und gewebeartiger Plasminogenaktivator, es können aber auch andere Plasminogenaktivatoren oder Thrombolytika in dieser Erfindung verwendet werden.
Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Hybrid- Immunoglobulinmoleküle kann der gesamte Plasminogenaktivator kloniert und als Teil des Hybridmoleküls exprimiert werden. Vorzugsweise wird nur der aktive Teil des Plasminogenaktivators kloniert. Diese aktive Stelle oder katalytische Stelle kann durch Routinedurchmusterung bestimmt werden, wie in den Beispielen beschrieben ist.
Das Verfahren zum Erhalten eines Hybrid-Immunoglobulinmoleküls gemäß der vorliegenden Erfindung erfordert das Klonieren des fibrinspezifischen Antikörpers und des Plasminogenaktivators und die Expression ihrer DNA-Sequenzen in ein einziges Hybridmolekül.
Die DNA-Sequenzen des fibrinspezifischen Antikörpers und des Plasminogenaktivators, die zur Herstellung des Hybrid-Immunoglobulinmoleküls verwendet werden, können von einer Reihe von Quellen abgeleitet werden. Zu diesen Quellen zählen genomische DNA, cDNA, synthetische DNA und Kombinationen davon. Die genomische DNA kann natürlich vorkommende Introns enthalten oder auch nicht.
Die von der genomischen DNA oder cDNA erhaltene DNA kann auf verschiedene Weisen erzeugt werden. Zellen, die für die gewünschte Sequenz kodieren, können isoliert, die genomische DNA fragmentiert, zweckdienlicherweise durch eine oder mehrere Restriktionsendonucleasen, und die erhaltenen Fragmente kloniert und mit einer Sonde auf das Vorhandensein der DNA-Sequenz, die für die Fibrinspezifität oder für den Plasminogenaktivator kodiert, durchmustert werden.
Für die variable Region des fibrinspezifischen Antikörpers kann die für die neugeordnete schwere Kette kodierende DNA V, D und J Regionen enthalten. Die für die leichte Kette der neugeordneten Keimbahn kodierende DNA kann die V und J Regionen enthalten. Sobald das klonierte Fragment, das die gewünschte fibrinspezifische DNA-Sequenz-Bindungsstelle enthält, identifiziert wurde, kann dieses Fragment weiter behandelt werden, um überflüssige DNA zu entfernen, einen oder beide Termini zu modifizieren, sämtliche oder einen Teil der intervenierenden Sequenzen (Introns) zu entfernen, oder ähnliches.
Das Verbinden der verschiedenen Fragmente erfolgt nach herkömmlichen Techniken, wobei Termini mit stumpfen oder versetzten Enden zur Ligation, Restriktionsenzymverdau zur Schaffung geeigneter Termini, das erforderliche Auffüllen kohäsiver Enden, die Behandlung mit alkalischer Phosphatase zur Vermeidung unerwünschter Verbindungen und die Ligation mit geeigneten Ligasen verwendet werden.
Für cDNA kann die cDNA kloniert und der erhaltene Klon mit einer geeigneten Sonde auf die cDNA, die für die gewünschte variable oder konstante Region kodiert, durchmustert werden. Sobald der gewünschte Klon isoliert wurde, kann die cDNA auf im wesentlichen dieselbe Weise manipuliert werden, wie die genomische DNA. Bei der cDNA gibt es jedoch keine Introns oder intervenierende Sequenzen.
Ferner können die Gene des fibrinspezifischen Antikörpers und die Gene des Plasminogenaktivators auf allgemein bekannte Weise synthetisiert werden und zur Verwendung in der Herstellung des Hybrid-Immunoglobulinmoleküls kloniert werden.
Zur Expression des Hybrid-Immunoglobulinmoleküls sind transcriptionale und translationale Signale, die von einem geeigneten Wirt erkannt werden, notwendig. Eukaryontische Wirte sind Säugetierzellen, die für eine in vitro Kultur geeignet sind, besonders Leukozyten, insbesondere Myelomzellen oder andere transformierte oder onkogenetische Lymphozyten, z. B. EBV-transformierte Zellen. Es können aber auch Nicht-Säugetierzellen verwendet werden, wie Bakterien, Pilze, z. B. Hefe, fädige Pilze, oder ähnliches.
Die DNA-Sequenz, die für die fibrinspezifische variable Region kodiert, kann in Verbindung mit der Promotorregion von genomischer DNA erhalten werden. In dem Ausmaß, in dem die Wirtszellen die transcriptionalen Regulator und translationalen Startsignale, die mit der variablen Region zusammenhängen, erkennen, kann dann die Region 5' der kodierenden Sequenz der variablen Region erhalten und zur transcriptionalen und translationalen Startregulierung verwendet werden.
Die angrenzende nichtkodierende Region 5' zu der variablen Region enthält normalerweise jene Sequenzen, die mit dem Auslösen der Transkription und Translation zusammenhängen, wie die TATA-Box, Cap-Sequenz, CAAT-Sequenz und ähnliches. Normalerweise ist die 5'-nichtkodierende Sequenz zumindest 150 bp lang, besonders typisch zumindest 200 bp, üblicherweise nicht mehr als etwa 2 kbp, besonders typisch nicht mehr als etwa 1 kbp.
Die nichtkodierende Region 3' zu der fibrinspezifischen konstanten Region kann hinsichtlich ihrer transkriptionalen Termination- Regulatorsequenzen, wie Termination und Polyadenylierung, erhalten werden.
Zusätzlich enthält die nichtkodierende Region 3' zu der kodierenden Region auch einen wichtigen Verstärker in Immunoglobulingenen. So können durch Erhalten der 3'-Region, die normalerweise an die DNA-Sequenz angrenzt, die für die konstante Region kodiert, die transkriptionalen Terminationssignale geschaffen werden. Wenn die transkriptionalen Terminationssignale in der Expressionswirtszelle nicht zufriedenstellend funktionell sind, kann eine 3'-Region, die in der Wirtszelle funktionell ist, als Ersatz verwendet werden.
Die Konstrukte für den fibrinspezifischen Antikörper und den Plasminogenaktivator können zur Bildung eines einzelnen DNA-Segments verbunden oder als getrennte Segmente erhalten werden, als solche oder in Verbindung mit Vektoren.
Das oder die Konstrukt(e) können durch Transformation in Verbindung mit einem Gen in eine Zelle eingeführt werden, wobei selektiv bestimmt werden kann, wo das Gebilde in das Wirtsgenom integriert wird. Üblicherweise ist das Gebilde Teil eines Vektors mit einem Replikationssystem, das von der Wirtszelle erkannt wird.
Zu den Expressionsvektoren zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Moleküle zählen Plasmide oder andere Vektoren. Im allgemeinen werden solche Vektoren in Verbindung mit dem Wirt verwendet, die Replikon und Kontrollsequenzen enthalten, die von Arten abgeleitet werden, die mit der Wirtszelle verträglich sind. Der Vektor trägt normalerweise eine Replikonstelle wie auch spezifische Gene, die eine phänotypische Auswahl in transformierten Zellen bieten können. Zum Beispiel wird E. coli leicht bei Verwendung von pBR322 transformiert, einem Plasmid, das von einer E. coli-Art abgeleitet wird. pBR322 enthält Gene für Ampicillin und Tetracyclinresistenz und bietet somit ein leichtes Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen. Das pBR322 Plasmid oder andere mikrobielle Plasmide müssen auch Promotoren enthalten oder modifiziert sein, um diese zu enthalten, die von dem mikrobiellen Organismus zur Expression seiner eigenen Proteine verwendet werden können. Die Promotoren, die am häufigsten in der rekombinanten DNA-Konstruktion verwendet werden, sind Beta-Lactamase, Lactosepromotorsysteme, Lambda-Phage-Promotoren und die Tryptophan-Promotorsysteme. Während diese die am häufigsten verwendeten sind, wurden andere mikrobielle Promotoren entdeckt und können auch verwendet werden.
Zum Beispiel kann ein genetisches Gebilde für das Hybrid-Immunoglobulinmolekül unter die Kontrolle des linken Promotors von Bakteriophage Lambda gestellt werden. Die Kontrolle wird durch den Lambda Repressor ausgeübt und angrenzende Restriktionsstellen sind bekannt.
Die Expression des Hybrid-Immunoglobulinmoleküls kann auch unter die Kontrolle anderer Regulatorsequenzen gestellt werden, die zu dem Organismus in seinem nichttransformierten Zustand homolog sein können. Zum Beispiel umfaßt lactoseabhängige E. coli chromosomale DNA ein Lactose- oder Lac-Operon, das die Lactosenutzung durch Bildung des Enzyms Beta-Galactosidase vermittelt. Die lac-Kontrollelemente können von Bakteriophage Lambda placs erhalten werden, der für E. coli infektiv ist. Das lac Promotor/Operatorsystem kann durch IPTG induziert werden.
Es können auch andere Promotor/Operatorsysteme oder Teile davon verwendet werden. Zum Beispiel können Colicin El, Galactose, alkalische Phosphatase, Tryptophan, Xylose tax und ähnliches verwendet werden.
Die bevorzugten Wirte sind Säugetierzellen, die in vitro in Gewebskulturen oder in vivo in Tieren gezüchtet wurden. Säugetierzellen bieten posttranslationale Modifikationen der Immunoglobulinproteinmoleküle einschließlich der richtigen Faltung oder Glykosylierung an den richtigen Stellen.
Säugetierzellen, die als Wirte geeignet sein können, umfassen Zellen mit Fibroblast-Ursprung, wie VERO oder CHO-K1, oder Zellen mit lymphoidem Ursprung, wie die Hybridome SP2/0-AG14 oder das Myelom P3x63Sg8, und ihre Derivate. Zu den bevorzugten Säugetier-Wirtszellen zählen SP2/0 und J558L. Mehrere Zellinien sezernieren Urokinase und können zur Transfektion verwendet werden, wie gezüchtete Nierenkarzinomzellen (Ferraivolo, et al., J. Cell. Physiol., 121 : 363 (1984)) und 3T3-Zellen (Belin, et al., EMBO J., 3 : 190 (1984)).
Bei einem Säugetierwirt sind mehrere mögliche Vektorsystem für die Expression des Hybrid-Immunoglobulinmoleküls verfügbar. Eine Klasse von Vektoren verwendet DNA-Elemente, die für eine autonome Replikation extra-chromosomaler Plasmide sorgen, die von Tierviren wie dem Rinderpapillomavirus, Polyomavirus, Adenovirus oder SV40-Virus abgeleitet wurden. Eine zweite Klasse von Vektoren beruht auf der Integration der gewünschten Gensequenzen in das Wirtszellenchromosom. Zellen, welche die eingefügte DNA stabil in ihre Chromosome integriert haben, können ausgewählt werden, indem auch ein oder mehrere Marker eingefügt werden, die eine Selektion der Wirtszellen ermöglichen, die den Expressionsvektor enthalten. Der Marker kann eine Prototrophie zu einem auxotrophen Wirt, Biozidresistenz, z. B. Antibiotika, oder Schwermetalle, wie Kupfer, oder ähnliches bieten. Das selektierbare Markergen kann entweder direkt an die zu exprimierenden DNA-Gensequenzen gebunden oder in dieselbe Zelle durch Cotransfektion eingefügt werden. Für eine optimale Synthese der Einzelkettenbindungsprotein mRNA können auch zusätzliche Elemente benötigt werden. Diese Elemente können Spleißsignale wie auch Transkriptionspromotoren, Verstärker und Terminationssignale enthalten. cDNA-Expressionsvektoren, die solche Elemente enthalten, umfassen jene, die von Okayama, H., Mol. Cel. Biol., 3 : 280 (1983) beschrieben wurden, und andere.
Es können zahlreiche transkriptionale und translationale Regulatorsequenzen verwendet werden, abhängig von der Art des Wirts. Die transkriptionalen und translationalen Regulatorsignale können von viralen Quellen abgeleitet werden, wie Adenovirus, Rinderpapillomavirus, Simian Virus, oder ähnlichen, wo die Regulatorsignale mit einem besonderen Gen assoziiert sind, das ein hohes Expressionsniveau aufweist. Es können auch Promotoren von Säugetier-Expressionsprodukten wie Actin, Collagen, Myosin, usw., verwendet werden. Transkriptionale Startregulatorsignale können ausgewählt werden, die eine Hemmung oder Aktivierung ermöglichen, so daß die Expression der Gene verändert werden kann. Interessant sind Regulatorsignale, die temperaturempfindlich sind, so daß die Expression durch Veränderung der Temperatur unterdrückt oder ausgelöst werden kann, oder einer chemischen Regulierung, z. B. Metabolisierung, unterzogen werden können.
Ein weiterer bevorzugter Wirt ist Hefe. Hefe bietet wesentliche Vorteile, indem sie auch posttranslationale Peptidmodifikationen durchführen kann, einschließlich der Glykosylierung. Es gibt eine Reihe von rekombinanten DNA-Strategien, die starke Promotorsequenzen und hohe Kopiezahlen von Plasmiden verwenden, die zur Erzeugung der gewünschten Proteine in Hefe verwendet werden können. Hefe erkennt Leader-Sequenzen auf klonierten Säugetier-Genprodukten und sezerniert Peptide, die Leader-Sequenzen tragen (d. h. Präpeptide).
Es kann jedes einer Reihe von Hefe-Genexpressionssystemen verwendet werden, das Promotor und Terminationselemente von den aktiv exprimierten Genen enthält, die für glykolytische Enzyme kodieren, die in großen Mengen erzeugt werden, wenn Hefe in glucosereichen Medien gezüchtet wird. Bekannte glykolytische Gene können auch sehr effiziente Transkriptionskontrollsignale liefern. Zum Beispiel können die Promotor und Terminatorsignale des Phosphoglyceratkinasegens verwendet werden.
Sobald der Vektor oder die DNA-Sequenz, die das oder die Konstrukt(e) enthält, für die Expression hergestellt wurden, können die DNA-Konstrukte in einen geeigneten Wirt eingefügt werden. Es können verschiedene Techniken angewendet werden, wie die Protoplastfusion, Calcium-Phosphat-Präzipitation, Elektroporation oder andere herkömmliche Techniken. Nach der Fusion werden die Zellen in einem selektiven Medium gezüchtet, wo nichttransformierte Zellen getötet werden und nur mit dem DNA-Gebilde transformierte Zellen verbleiben. Die Expression des Gens oder der Gene führt in der Verbindung zur Bildung des Hybrid-Immunoglobulinmoleküls.
Die Wirtszellen sind größtenteils unsterblich gemachte Zellen, besonders Myelom- oder Lymphomzellen. Diese Zellen können in einem geeigneten Nährmedium in Kulturkolben gezüchtet oder in einem synergetischen Wirt, z. B. eine Maus oder Ratte, oder einen Wirt oder ein Wirtszelle mit Immunmangel injiziert werden, z. B. nackte Maus oder Hamstertasche. Insbesondere können die Zellen für die Erzeugung von Bauchwasser und zur Entnahme der chimären Rezeptoren in die Bauchhöhle eingeführt werden. Die Zellen können auch subcutan injiziert und die Antikörper aus dem Blut des Wirts geerntet werden. Die Zellen können auf dieselbe Weise wie die Hybridomzellen verwendet werden. Siehe Diamond et al., N. Eng. J. Med. (1981) 304 : 1344 und Kennatt, McKearn und Bechtol (Hrsg.), Monoclonal Antibodies: Hybridomas - A New Dimension in Biologic Analysis, Plenum, 1980, die hierin durch Bezugnahme eingeführt wird.
Das Hybrid-Immunoglobulinmolekul kann unter herkömmlichen Bedingungen, wie Extraktion, Präzipitation, Chromatographie, Affinitätschromatographie, Elektrophorese und ähnliches, isoliert und gereinigt werden. Die bevorzugte Methode ist die Affinitätschromatographie mit entweder dem aminoterminalen Heptapeptid der Fibrin-Beta-Kette (bindet an die Antifibrinstelle) oder mit Benzamidin (bindet an die katalytische Plasminogenaktivatorstelle), um das Hybridmolekül selektiv zu isolieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Immunotherapie und Immunodiagnose unter Verwendung der Hybrid-Immunoglobulinmoleküle.
Bei den immunotherapeutischen und immunodiagnostischen Anwendungen wird das Hybrid-Immunoglobulinmolekül an einen Patienten verabreicht, der an der Stelle eines Thrombus durch die fibrinspezifische Bindungsstelle des Hybridmoleküls lokalisiert wird. Der Thrombus wird durch die Enzymaktivität des Plaminogenaktivatorteils des Hybridmoleküls aufgelöst. Wie für den Fachmann offensichtlich ist, ermöglicht die Spezifität des fibrinspezifischen Plasminogenaktivator-Hybridmoleküls das selektive Anheften an dem Thrombus und dessen Auflösung, wodurch die Gefahr ernsthafter Nebenwirkungen, wie Blutung, verringert wird.
Die Hybrid-Immunoglobulinmoleküle dieser Erfindung können auch in immunodiagnostischen Anwendungen einschließlich der in vivo Immundiagnose eingesetzt werden. Bei dieser Anwendung ist das Hybridmolekül nachweisbar mit einem Radionuclid markiert. Das Radionuclid muß so zerfallen, das es für eine bestimmte Art von Gerät nachweisbar ist. Ferner sollte das Radionuclid zur in vivo Diagnose eine Halbwertzeit besitzen, die lange genug ist, so daß es zum Zeitpunkt der maximalen Aufnahme noch immer nachweisbar ist, aber kurz genug, daß nach der Diagnose keine unerwünschte Strahlung in dem Patienten zurückbleibt. Die Kopplung der Radionuclide an das Protein und somit an das Hybridmolekül ist in der Technik bekannt und wird oft entweder direkt oder indirekt unter Verwendung einer funktionellen Zwischengruppe durchgeführt.
Beispiele für Radioisotope, die zur in vivo Diagnose verwendet werden können, sind &sup9;&sup9;Tc, ¹²³I, ¹³¹I, ¹¹¹In, &sup9;&sup7;Ru, &sup6;&sup7;Cu, &sup6;&sup7;Ga, &sup6;&sup8;Ga, &sup7;²As, &sup8;&sup9;Zr und ²&sup0;¹Tl.
Paramagnetische Isotope zur in vivo Diagnose können auch gemäß den Verfahren dieser Erfindung verwendet werden. Beispiele von Elementen, die zur Verwendung in magnetischen Resonanzenergietechniken besonders zweckmäßig sind, umfassen ¹&sup5;&sup7;Gd, &sup5;&sup5;Mn, ¹&sup6;²Dy, &sup5;²Cr und &sup5;&sup6;Fe.
Das Hybrid-Immunoglobulinmolekül kann ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen. Diese Träger sind in der Wissenschaft gut bekannt und können wässerige oder lösende Emulsionen oder Suspensionen umfassen einschließlich der Kochsalzlösung und gepufferten Medien. Pharmazie, wie zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences (16. Ausgabe, 1980) beschrieben ist.
Die Dosisbereiche zur Verabreichung des Hybrid- Immunoglobulinmoleküls sind jene, die für den Nachweis von Thromben groß genug sind. Die Dosierung sollte nicht so groß sein, daß sie unerwünschte Nebenwirkungen verursacht, wie Überempfindlichkeitsreaktionen wie Ausschläge oder anaphylaktischen Schock. Im allgemeinen variiert die Dosis mit dem Alter, der körperlichen Verfassung, dem Geschlecht und der Schwere der Erkrankung des Patienten. Gegenanzeigen können Überempfindlichkeit und andere Variable umfassen und können von dem jeweiligen Arzt eingestellt werden. Die Dosierung kann im Bereich von 0,01 mg/kg bis 500 mg/kg Körpergewicht liegen, vorzugsweise von 0,01 mg/kg bis 200 mg/kg. Das oder die Hybrid-Immunoglobulinmoleküle können parenteral durch Injektion oder durch allmähliche Perfusion über einen Zeitraum verabreicht werden. Sie können auch intravenös, intraperitoneal, intramuskulär oder subcutan verabreicht werden.
Nach dieser allgemeinen Beschreibung der Erfindung wird sie mit Bezugnahme auf spezifische Beispiele besser verdeutlicht, die hier nur zur Veranschaulichung angeführt sind und falls nicht ausdrücklich angegeben, nicht als Einschränkung gedacht sind.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

Materialien

N-Succinimidyl 3-(2-Pyridyldithio) Propionat (SPDP) und 2-Iminothiolan wurden von Pierce und Sepharose 4B-CL wurde von Pharmacia bezogen. Das ¹²&sup5;I Fibrinogen (IBRIN) stammte von Amersham. Plasma wurde von der örtlichen Blutbank gekauft. Ein chromogenes Substrat für Proteasen, H-D-Isoleucyl-L-prolyl-L-arginin-p-nitroanalid Dihydrochlorid (S-2288) wurde von Helena Labs bezogen. Alle anderen Chemikalien stammten entweder von Sigma oder Fisher.
Fibrinspezifischer Antikörper 64C5 wurde in Hui et. al., supra, und in der gemeinschaftlich in Besitz stehenden, anhängigen U.S. Patentanmeldung, Seriennr. 824.228 beschrieben, die hierin durch Bezugnahme eingebracht wird. Fibrinspezifischer Antikörper 59D8 wurde in der gemeinschafflich in Besitz stehenden U.S. Patentanmeldung, Seriennr. 851.514 beschrieben, die hierin durch Bezugnahme eingebracht wird.

Elektrophorese und Autoradiographie

SDS-PAGE wurde nach der Methode von Laemmli, Nature (London), 277 : 681(1970) durchgeführt. Proteine wurden entweder unter Verwendung von Coomassie Brilliant Blue R oder, bei Radiomarkierung, durch Autoradiographie über 24-72 Stunden bei -70ºC sichtbar gemacht.

Klonieren des Urokinasegens

Ein komplementärer DNA-Klon (PHUK8), der die Sequenz enthielt, die die katalytische B-Kette kodiert, wurde als Geschenk von Dr. F. Blasi (Verde et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 81,:4727 (1984)) erhalten. Dieser Klon wurde quantitativ in pBR322 gezüchtet und isoliert. Ein Segment dieses DNA-Klons wird in den Gebilden mit Antifibrin-Antikörpergenen und zur Isolierung der genomischen DNA-Sequenz verwendet.

Klonieren des tPA-Gens

Eine volle Länge des komplementären DNA-Klons des tPA Gens des Menschen (PPA34'F) wurde als Geschenk von Dr. Sandra Degen erhalten. Die Sequenz, die für die katalytische B-Kette von tPA kodiert, wurde von dem Klon extrahiert und ein einziges kurzes Segment synthetischer DNA (Adaptor), das für zwei gemeinsame Restriktionsenzymspaltungsstellen kodiert, am 5'-Ende dieser Sequenz angeordnet. Dieser Adaptor ermöglicht, daß das Gen zweckmäßig mit anderen DNA-Segmenten innerhalb des Rahmens verbunden wird. Dieser nach Maß hergestellte Klon wird in Gebilden mit Antifibrin-Antikörpergenen verwendet. Er wird auch zur Isolierung der genomischen Sequenz verwendet, die für die tPA B-Kette kodiert, und der genomischen Sequenz, die in der Folge in Gebilden mit den 59D8-Genen verwendet wird.

Klonieren der variablen leichten und schweren Kettengene des fibrinspezifischen Antikörpers 64C5

Unter Verwendung eines redundanten Oligonucleotids 17-mer, das synthetisiert wurde, um dem Aminoterminus für die leichte Kette von 64C5 und einer verfügbaren Kappa/J-Sonde zu entsprechen, wurde die produktive 64C5 leichte Kettenneuordnung von einer in pBR322 konstruierten subgenomischen Bank kloniert. Die gesamte leichte Kette wurde durch Verknüpfung des klonierten, neugeordneten Fragments in ein pBR322 Plasmid rekonstruiert, das ein 5,8kb EcoR1/BamH1-Fragment enthielt, das die konstante Kappa-Region der Maus und verbindende Segmente kodiert (Max, et al., J. Biol. Chem., 256 : 5116-20 (1981)). Die VJ-Neuanordnung wurde 5' von der konstanten Region in der richtigen Ausrichtung angeordnet. Genomische DNA, die von dem 64C5 Hybridom abgeleitet wurde, wurde mit dem EcoR1-Restriktionsenzym digeriert, auf einem präparativen Agarosegel größenfraktioniert und dann in einen Lambda-Klonierungsvektor ligiert, um eine subgenomische Bank herzustellen. Unter Verwendung einer Sonde von der Verbindungsregion der schweren Kette wurde ein neugeordnetes Fragment kloniert. Es wurde als die schwere Ketten-Neuanordnung bestimmt, die in dem 64C5-Hybridom durch Hybridisierung an ein Oligonucleotid auf der Basis der aminoterminalen Sequenz des Antikörpers verwendet wird.

Klonieren des variablen schweren Kettengens des fibrinspezifischen Antikörpers 59D8

Die genomische DNA von dem 59D8 Hybridom wurde größenfraktioniert, in einen Lambda Klonierungsvektor ligiert und mit der Sonde der Verbindungsregion der schweren Kette, wie oben beschrieben, gescreent. Beide schweren Ketten-Neuanordnungen wurden kloniert und die produktive wurde durch Hybridisierung an ein Oligonucleotid 20-mer auf der Basis der RNA-Sequenz der 59D8-schweren Kette ausgewählt.

Genetische Konstrukte von fibrinspezifischem Antikörper/Plasminogenaktivator

Das klonierte Restriktionsfragment, das die variable und Verbindungsregion wie auch Verstärkersequenzen des 59D8 oder 64C5-Gens enthielt, wird in richtiger Ausrichtung in ein Plasmid 5' der Sequenz der konstanten Region der Gamma 2B-schweren Kette der Maus eingefügt. Dieses Plasmid, das die Sequenz der konstanten Region enthält (PSV GPT/Gamma 2B) enthält auch das Ampicillinresistenzgen von pBR322 und das Guaninphosphoribosyltransferase- (GPT) Gen unter der Kontrolle des viralen SV40-Promotors. Es wurde als Geschenk von Dr. Richard Neer erhalten. Dieses Konstrukt wurde in E. coli MC1061 über das Ampicillinresistenzgen vermehrt und die Expression des GPT-Gens in Eukaryonten konnte in Gegenwart von Xanthin, Hypoxanthin und Mycophenolsäure gewählt werden. Die Masse der Sequenz, die für den Carboxy-Terminus der konstanten Region der schweren Kette kodiert, wurde in der Folge entfernt. Sie wurde durch ein komplementares DNA-Fragment ersetzt, das für die katalytische Carboxy-"B"-Kette oder Urokinase oder den Gewebeplasminogenaktivator kodiert. Das dritte Exon von einem der Gene der konstanten Region der schweren Kette wird "innerhalb des Rahmens" an eines der Plasminogenaktivatorgene gebunden, so daß die normale Aminosäuresequenz erzeugt und ein zusammengesetztes Protein erhalten wird. Dieses endgültige Gebilde wird über Elektroporation in die geeignete 59D8 oder 64C5-Hybridomvariante transfektiert, welche die Erzeugung der normalen schweren Kette beendet hat. Diese Transfektanten erzeugen ein Antikörpermolekül mit Fibrinspezifität, mit einem Plasminogenaktivatorteil an dem Schwanzende der abgestumpften schweren Kette.

Reinigung der Urokinase-64C5 Hybrid-Immunoglobulinmoleküle

Das Hybridmolekül wird durch Affinitätschromatographie auf Benzamidin-Sepharose und anschließend Beta-Peptid-Sepharose isoliert, um Hybridmoleküle zu erhalten, die sowohl eine Antikörperverbindungsstelle als auch Urokinase oder tPA-Sequenz enthalten. Die Affinitätssäule wird durch Kopplung eines synthetischen aminoterminalen Beta-Kette-Fibrinpeptids (Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Cys (Beta Peptid)), Hui, et al., Science, 222 : 1129 (1983), an Maleimidokenzoyllysin-Sepharose C1-4B, Kitagawa, et al., J. Biochem. (Japan), 79 : 233 (1976), erzeugt. Das Eluat dieser Säule (0,2 M Glycin-HCl, pH 2,8) wird gewonnen und zur Bestimmung der Fibrinbindungseigenschaften und der fibrinolytischen Aktivität analysiert.

Reinigung der tPA-59D8 Hybrid-Immunoglobulinmoleküle

Hybrid-Immunoglobulinmoleküle werden von den Wirtszellen durch sequentielle Affinitätschromatographie in zwei Schritten gereinigt. Die Moleküle werden zunächst auf Sepharose CL-4B aufgebracht, die immobilisiertes Benzamidin enthält: t-PA Antikörper-Hybridmoleküle wurden zurückgehalten und später mit 0,1M Acetat, 0,4M NaCl (pH 4,0) eluiert. Nach der Neutralisierung wird das Eluat auf die Peptid-Sepharose-Säule aufgebracht. Das Eluat von der Beta-Peptid-Säule (0,2M Glycin, pH 2,8) wird gegen NaPi-Puffer dialysiert, der 1,0 M Arginin und 0,1% Tween 80 enthält, und wird in diesem Puffer bei 4 Grad gelagert.

Charakterisierung der Hybrid-Immunoglobulinmoleküle

Die Hybridmoleküle werden SDS-PAGE unterzogen, sowohl unter reduzierenden als auch unter nichtreduzierenden Bedingungen. Die Gele werden entweder mit Coomassie Blau gefärbt oder einer Autoradiographie unterzogen (wenn tPA oder UK vor der Kopplung mit ¹²&sup5;I markiert wird).

Chromogenischer Substrattest auf Peptidase-Aktivität

Zur Bestimmung der funktionellen Eigenschaften des Hybridmoleküls, werden zunächst seine peptidolytischen Eigenschaften in bezug auf ein nichtselektives Substrat, H-D-Isoleucyl-L-prolyl-L-arginin-p-nitroanalid Dihydrochlorid (5-2288) untersucht. Der 5-2288-Test wird mit einem Gesamtvolumen von 1,0 ml in 0,05 M Tris- HCl, 0,10 M NaCl (pH 8,5) mit einer Substratkonzentration von 3 · 10&sup4;M durchgeführt. Die Absorption bei 405 nm wird alle 10 Sekunden bei 20ºC gemessen.

Fibrinogentests

Der Fibrinogengehalt von Proben von citriertem Humanplasma oder citriertem Kaninchenplasma wurde durch zwei Methoden bestimmt. Gerinnbares Fibrinogen wurde durch die Methode von Clauss, Acta Chir. Scand., 90 : 419 (1957) gemessen und Gesamtfibrinogen wird durch Natrium-Sulfit-Präzipitation bestimmt.

Plasmagerinnseltest

Die Methode von L&ijlig;nen et al., Thromb. Haemostas., 52 : 308 (1984) wird mit den folgenden Modifikationen verwendet. Frischgefrorenes Humanplasma, das von Spendern erhalten wurde, wird gesammelt, in aliquote Teilmengen geteilt und wieder gefroren. Unmittelbar vor jedem Versuch werden die Aktivitäten von tPA, UK und ihrer Hybrid-Immunoglobulinmoleküle unter Verwendung des 5-2288-Tests kalibriert (d. h. die Peptidase-Aktivitäten der nativen Plasminogenaktivatoren und ihrer Hybridmoleküle werden bestimmt und geeignete Verdünnungen hergestellt, so daß die Peptidase-Aktivität [in Einheiten/ml] für jede Probe identisch ist). Plasmagerinnsel werden hergestellt, indem jedes der folgenden zu dem frischgefrorenen Plasma zugegeben wird: Thrombin, 8 NIH-Einheiten/ml; 0,5M CaCl&sub2;, 100 ul/ml; und ¹²&sup5;I-markiertes Human-Fibrinogen (IBRIN), 40.000 cpm/ml. Die Lösung wird sofort in Silastic-Röhrchen gezogen (I.D. = 4 mm) und bei 37ºC 30 Min. inkubiert. Die Silastic-Röhrchen, die geronnenes frischgefrorenes Plasma enthalten, werden in 1,5 cm Abschnitte geschnitten, wodurch Gerinnsel von 0,2 ml erhalten werden. Diese werden dann vor der Verwendung in 0, 15 M NaCl gewaschen. Jedes Gerinnsel wird in ein Kunststoffröhrchen eingebracht, ausgezählt und in 1 ml frischgefrorenem Plasma (von demselben Pool) suspendiert. Die Versuche werden durch die Zugabe eines Plasminogenaktivators (oder Hybridmoleküls von Plasminogenaktivator und Antikörper) gestartet. In Abständen von 30 Minuten wird eine Teilmenge des frischgefrorenen Plasmas von jedem Röhrchen zur Zählung entfernt. Die Proben werden am Ende des Versuchs zur Bestimmung der Fibrinogenwerte aufgehoben.

In-vivo Thrombolyse

Es wird das Jugularvene-Modell an Kaninchen von Collen et al., J. Clin. Invest., 71 : 368 (1983) verwendet. Nach der Sedierung des Kaninchens mit Acetopromazin und Ketamin wird ein paramedialer Schnitt vom rechten Unterkiefer bis über das rechte Schlüsselbein gemacht. Die äußere Jugularvene wird durch Sektion isoliert und die Äste werden abgebunden und getrennt. Zur Befestigung des Gerinnsels wird ein Wollfadensegment eingeführt. Nach Beendigung der Blutung werden Gefäßklemmen so angeordnet, daß dieses Segment der äußeren Jugularvene isoliert wird und die Bestandteile des Gerinnsels werden in das isolierte Venensegment eingeführt. Diese Bestandteile bestehen aus etwa 500.000 cpm von ¹²&sup5;I-markiertem Human-Fibrinogen (jede Probe wird vor Verwendung ausgezählt), 100 ul von gepackten roten Blutkörperchen, 100 ul frischgefrorenem Humanplasma, 100 ul 0,5 M CaCl&sub2; und 10 ul Rinderthrombin (8 NIH Einheiten). Nach 30 Minuten werden die Gefäßklemmen entfernt und der Blutfluß wiederhergestellt. Eine Blutprobe wird unmittelbar nach Lösung der Klemmen genommen, um die Radioaktivität zu bestimmen, die nicht in den Thrombus inkorporiert ist. Gemessene Mengen des Plasminogenaktivators werden auf ein Volumen von 25 ml verdünnt und über die Randvene des gegenüberliegenden Ohres über 4 Stunden durch eine Infusionspumpe abgeben. Verloren gegangene Mengen werden durch Auszählen der Spritzen, Mullkissen und Röhrchen bestimmt. Sechs Stunden nach Beginn der Infusion wird das gesamte Venensegment isoliert, entfernt und ausgezählt. Die prozentuelle Lyse wird als das Verhältnis der Auszählungen, die am Ende eines Versuchs verbleiben, zu den Nettozählungen zu Beginn bestimmt.

Fibrinolytischer Test

Der quantitative fibrinolytische Test bindet Fibrinmonomer an Sepharose. Fibrinogen wird von Plasminverunreinigungen gesäubert, indem es über Lysin-Sepharose geleitet und dann mit spurmarkierten ¹²&sup5;I-Fibrinogen vermischt wird. Es wird dann an Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose C1-4B gekoppelt. Das immobilisierte Fibrinogen wird durch Zugabe von Human-Thrombin in Gegenwart von 100 mmM CaCl&sub2; zu Fibrin umgewandelt.
Zur Bestimmung der relativen fibrinolytischen Aktivität werden zunehmende Mengen von ¹²&sup5;I-UK-64C5-Hybridmolekül und Urokinase (oder ¹²&sup5;I-tPA-59D8-Hybridmolekül und tPA) mit ¹²&sup5;I-Fibrin-Sepharose 4 Stunden inkubiert. Danach wird das Harz mit gereinigtem Plasminogen inkubiert. Nach Abständen von 2,5 und 15 Stunden wird die Mischung zentrifugiert und die Radioaktivität des Überstandes bestimmt. Dieses Verfahren wird mit dem Kontrollkonjugat (¹²&sup5;I.Uk).SS.(3H3) wiederholt.

BEISPIEL 2

MATERIALIEN UND METHODEN

Klonieren des 59D8 Gens der schweren Kette

Genomische DNA mit hohem Molekulargewicht wurde aus den 59D8 Hybridomzellen wie zuvor in Quertermous et al., J. Immunolog., 128 : 2687-2690 (1987) beschrieben, hergestellt. Zur Identifizierung neuangeordneter Immunoglobulingene der schweren Kette, die für die 59D8 Hybridomlinie spezifisch sind, wurde eine Southern-Blot Analyse wie zuvor beschrieben, mit EcoR1-digerierter genomischer DNA und einer 1,7-Kilobasen (kb) EcoR1/PstI genomischen Verbindungsregionsonde durchgeführt (Southern, E.M., J. Mol. Biol., 98 : 503-517; Sakano et al., Nature, 286 : 676-683 (1980). Zwei Neuanordnungen wurden identifiziert, die in keiner jener Zellen gefunden wurden, die ursprünglich zur Bildung des 59D8 Hybridoms verschmolzen wurden (SP2/0 und Balb/c). Danach wurde ein Milligramm genomischer DNA mit EcoR1 digeriert und auf einem präparativen Agarosegel größenfraktioniert. Southern, E. in Methods in Enzymology, et. Wu R. (Academic Press, NY), Bd. 68, S. 152-176. Fraktionen, die jedes der beiden neuangeordneten Fragmente enthielten, wurden durch Hybridisierung an die Verbindungsregionsonde identifiziert. Dieses Fraktionen wurden konzentriert und in λ gt10 ligiert. Die beiden so gebildeten subgenomischen Banken wurden mit der Verbindungsregionsonde gescreent und aus jeder Bank wurden mehrere mögliche Klone isoliert. (Maniatis et al., Molecular Cloning, 1982 (Cold Spring Harbor, NY). Die Wahl des Klons, der das neuangeordnete Fragment enthielt, das für die 59D8-Antigenverbindungsstelle kodiert, erfolgte durch Hybridisierung an ein 20-Basenpaar Oligonucleotid, das auf der Basis der Sequenz der 59D8 schweren Ketten mRNA konstruiert worden war. Die RNA-Isolierung und Sequenzierung, ³²P Markierung des Oligonucleotids mit T4 Polynucleotidkinase und die Hybridisierung wurden nach bereits beschriebenen Techniken durchgeführt. (Maniatis et al., Molecular Cloning, supra; Clarke et al., J. Exp. Med., 161 : 687-704 (1985); Suggs et al., Proc. Nat'l Acad. Sci USA, 78 : 6613-6617 (1981).

Konstruktion des Expressionsvektors

Die t-PA-Sequenz wurde von einem cDNA-Klon (pPA34'F) abgeleitet, der aus HELA-Zellen mRNA konstruiert worden war. Fisher et al., J. Biol. Chem., 260 : 11223-11230 (1985). DNA, die die β-Kette SacI-Stelle zu der EcoR1-STelle von pBR322 kodiert, wurde isoliert und in pGEM3 ligiert. Danach wurde ein angrenzendes 5'-Fragment durch Verdau mit SfaN1 und Sac1 isoliert. Ein synthetisches Oligonucleotid, das ein BamH1-Ende, eine Xho1-Stelle und zwei Basen, die ein Codon für Glycin rekonstituieren, enthielt, wurde an das 5'-Ende des zweiten Fragments angefügt. Das modifizierte Fragment wurde dann in ein Plasmid ligiert, das bereits das 3'-Fragment enthielt, wodurch die β-Kettensequenz rekonstituiert wurde. Die β-Kette wurde mit Xho1 und Sca1 ausgeschnitten - wobei die Sca1-Stelle durch die pBR322-Sequenz beigesteuert wurde.
Das endgültige Gebilde wurde in dem pSV2gpt-Vektor zusammengebaut, der durch das Einsetzen eines Polylinkers modifiziert worden war, der ein 6-kb Xba1 Restriktionsfragment enthielt, das die γ2b konstante Region der schweren Kette der Maus kodierte. Mulligan et al., Proc. Nat'l Acad. Sci USA, 78 : 2072-2076 (1981), Tucker et al., Science, 206 : 1303-1306 (1979). Das produktive neuangeordnete Gen der 59D8 schweren Kette, das auf einem 2,6 kb EcoR1-Fragment kloniert worden war, wurde in der richtigen Ausrichtung in eine EcoR1-Stelle in dem Polylinker 5' von der γ2b konstanten Region eingefügt. Die Sequenz der konstanten Region zwischen der einzigen Xho1-Stelle in CH2 und einer Sal1-Stelle in dem Polylinker wurde ausgeschnitten, die Sal1-Stelle wurde abgestumpft und die t-PA-β-Kette wurde in die Stelle ligiert. Eine Nucleotidsequenzanalyse bestätigte, daß die Verbindung zwischen der schweren Kette und den t-PA-Segmenten innerhalb des Rahmes war. Sanger et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 74 : 5463-5467 (1977).

Monoklonale Antikörper und Selektion von Verlustvarianten

Fibrinspezifischer monoklonaler Antikörper 59D8 wurde durch Immunisierung mit einem synthetischen Heptapeptid auf der Basis der aminoterminalen Sequenz der Fibrin-β-Kette gebildet, wie bereits in Hui et al., Science, 222 : 1129-1132 (1983) beschrieben wurde. Hybridomzellen und Verlustvarianten wurden in Vollmedium gehalten: DMEM mit 4,5 mg/ml Glucose, 12 Prozent fötalem Kälberserum (FCS), 50 g/ml Gentamicinsulfat und 0,6 mg/ml L-Glutamin. Zur Selektion der Verlustvarianten der schweren Kette wurden die Zellen in weicher Agarose gezüchtet. Fünf Milliliter Vollmedium plus 0,2 Prozent Agarose und zusätzlich 8 Prozent FCS wurde Gewebekulturschalen (60 mm) beigegeben und bei Raumtemperatur 3 bis 5 Min. verfestigen gelassen. Die für den Kettenverlust auszuwählenden Zellen (1 bis 2 · 10³) wurden über die Agarose geschichtet. Die Platten wurden bei 37ºC in 6 Prozent CO&sub2; inkubiert, bis sich Zellanhäufungen bildeten (2 bis 4 Tage). Für den Nachweis von Verlustvarianten der schweren Kette wurden Zellanhäufungen mit einer Antiserumlösung (1,0 ml) überschichtet, die Vollmedium mit 0,2 Prozent Agarose und 5 bis 10 Prozent Kaninchen oder Ziegen Anti-Maus schwere Kette enthielt. Zellanhäufungen, die schwere Kette sezernierten, entwickelten einen Präzipitin-Lichthof. Anhäufungen, die keinen Präzipitin-Lichthof aufwiesen, wurden aus der weichen Agarose mit einer Kapillarpipette herausgenommen und danach in Platten mit 96 Vertiefungen eingebracht, die Vollmedium mit 8 Prozent zusätzlichem FCS enthielten. Die einzelnen Subklone wurden durch enzymverbundenen Immunoabsorbenstest (ELISA) oder Western-Blot auf das Vorhandensein von schwerer oder leichter Kette getestet.

Transfektion und Selektion

Das pD8SVtβ-Konstrukt wurde durch Elektroporation in Zellen mit Verlustvariante transfektiert, wobei eine Isco-Energieversorgung wie bei Potter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81 : 7161-7165 (1984) beschrieben, verwendet wurde. Optimale Transfektionsbedingungen waren eine 2000-Volt-Entladung in 0,8 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Transformanden wurden durch Züchten in Mycophenolsäure, Xanthin und Hypoxanthin gewählt. Die Bestätigung der Transfektion und Expression wurde durch Northern-Blot Analyse erhalten, wobei eine 2-kb cDNA-Sonde verwendet wurde, die für den 3'-Teil der t-PA-β-Kette des Menschen kodiert. Maniatis et al., Molecular Cloning, supra. Tranfektierte Zellinien wurden nach Standardtechniken subkloniert.

Proteinreinigung

Protein wurde von Zellüberständen und Bauchwasser durch sequentielle Doppelaffinitätschromatographie auf zwei Säulen gereinigt. Eine Säule wurde durch Bindung des synthetischen Peptids, das zur Erzeugung von 59D8 verwendet wurde, an Sepharose hergestellt. Die andere bestand aus einem Anti-Mensch t-PA monoklonalen Antikörper, der an Sepharose gebunden war. In unseren anfänglichen Reinigungsversuchen verwendeten wir eine dritte Säule, die aus an Sepharose gebundenem Benzamidin bestand. Obwohl Benzamidin gut an die aktive Stelle von t-PA bindet und Benzamidin-Sepharose zur Reinigung des intakten Moleküls verwendet werden kann, hielt die Säule das rekombinante Protein nicht zurück.
Die Reinigung des rekombinanten Proteins wurde durch zwei
Festphasen-Immunotests aufgezeichnet. Für den Nachweis der Antifibrin-Antikörperaktivität wurden Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit Fibrinmonomer überzogen und mit 10 Prozent Pferdeserum blockiert. Sie wurden dann mit Proben inkubiert und gewaschen und mit ¹²&sup5;I-markiertem Ziegen Anti-Maus Fab sondiert. Der zweite Test war für den Nachweis des t-PA Antigens ausgerichtet, das mit der Antifibrin-Antikörperaktivität zusammenhängt. In diesem Test wurden die mit Fibrinmonomer überzogenen Platten mit Kulturüberstand oder Bauchwasser inkubiert und mit ¹²&sup5;I-markiertem Anti-Mensch t-PA sondiert. Da die Kette von t-PA keine Fibrin-Bindungsaktivität besitzt, wird nur rekombinantes Protein, das beide funktionellen Domänen enthält, nachgewiesen.

Western-Blot Analyse

Western-Blots wurden sowohl aus reduzierten als auch nichtreduzierten Proben hergestellt, die auf NaDodSO&sub4;-Polyacrylamidgels unter Verwendung anerkannter Techniken getrennt wurden. Burnette, W.N., Anal. Biochem., 112 : 195-203 (1981). Als Sonde wurde entweder Ziegen Anti-Maus Fab oder ein monoklonaler Anti-Mensch t-PA Antikörper, mit ¹²&sup5;I markiert, verwendet.

Antigenbindungstest

Der ursprüngliche Antikörper (59D8) und das rekombinante Molekül wurden zunächst auf das Vorhandensein des Fibrinbindungs-Fab-Antigens getestet. Dies erfolgte mit dem zuvor beschriebenen Festphasen-Immunotest, wobei ¹²&sup5;I-markiertes Ziegen Anti-Maus Fab als Sonde verwendet wurde. Titrierungskurven wurden für 59D8 und das rekombinante Protein erstellt, indem ihre Konzentrationen in dem Test verändert wurden. Jene Konzentration, die dieselben Menge an gebundenem ¹²&sup5;I-markiertem Antikörper ergibt, wurde dann aus dem linearen Teil jeder Kurve ausgewählt. Bei dieser Konzentration entweder von 59D8 oder des Fusionsproteins wurde ein Verdrängungstest in Vertiefungen durchgeführt, die mit Fibrin überzogen und mit verschiedenen Mengen löslichen Fibrins gefüllt worden waren. Protein, das an das lösliche und nicht an das unlösliche Fibrin band, wurde durch Waschen vor dem Auftragen des markierten Antikörpers entfernt.

Tests der enzymatischen Funktion

Für den Vergleich der enzymatischcn Funktion des rekombinanten Proteins mit jener des nativen t-PA wurden seine peptidolytischen Eigenschaften zunächst in einem Test untersucht, der die Spaltung des nichtselektiven Substrats S-2288 mißt (Helena Labs, Beaumont, TX). Der Test wurde in einem 50ul Volumen eines Puffers (0,15 M Tris, 0,15 M NaCl) mit einer 1 millimolaren Endkonzentration von chromogenischem Substrat durchgeführt. Es wurden verschiedene Konzentrationen von rekombinantem Protein oder t-PA, das von der Bowes Melanomzellinie (Bio Response, Hayward, CA) gereinigt worden war, zugegeben und die Absorption bei 405nm zu einer Reihe von Zeitpunkten gemessen.
Zur Bestimmung, ob das rekombinante Protein zur Aktivierung von Plasminogen fähig ist, wurde ein zweiter Test unter Verwendung des chromogenischen Substrats S-2251 (Helena Labs) durchgeführt. Die Aktivität des Melanom t-PA, das rekombinante Protein und Rindertrypsin wurden zunächst in dem S-2288-Test bestimmt und die Konzentrationen wurden so eingestellt, daß jedes Enzym mit 100 Einheiten/100 ul vorhanden war. Hundert ul Melanom t-PA, rekombinantes Protein oder Rindertrypsin wurden dann in Serienverdünnung zu 100 ul Humanplasminogen (0,15 mg/ml) und 800 ul S-2251 Substrat zugegeben. Die Proben wurden 60 Min. bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 1 ml 50% Essigsäure unterbrochen und die Absorption bei 405 nm bestimmt.

ERGEBNISSE

Elektroporation der Konstrukte pSVD8T (Fig. 1) in die Verlustvarianten der 59D8 schweren Kette ergaben zahlreiche transfektierte Klone. Wenn etwa 1 · 10&sup8; Hybridomzellen mit 50 ug kreisförmiger Plasmid-DNA in 0,8 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung vermischt und einer Entladung von 2000 Volt unterzogen wurde, enthielten etwa 15 Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen gegen Arzneimittel-resistente Klone. Etwa 75 Prozent dieser Klone sezernierten nachweislich das rekombinante Protein. Fünf Klone wurden für eine weitere Analyse auf der Basis ihrer Wachstumsrate und Expression von mRNA, die für das Fusionsprotein kodiert, ausgewählt.
Es wurden Western-Blot-Analysen des affinitätsgereinigten rekombinanten Proteins durchgeführt. Blots von reduzierten Gels, die mit einem iodierten Anti-Mensch t-PA monoklonalen Antikörper sondiert wurden, zeigten eine Markierung eines 65-kD Peptids. Dies ist die erwartete Größe eines schwere Kette-t-PA Fusionsproteins. Die β-Kette von t-PA beträgt etwa 33 kD und die stumpfe schwere Kette sollte 30 kD beitragen. Mehrere Beweislinien weisen darauf hin, daß das 65 kD Peptid nicht ein t-PA-ähnliches Molekül ist, das durch fötales Kälberserum beigetragen wird. Die 65-kD Bande wird beobachtet, wenn die transfektierten Zellinien in serumfreiem Medium oder in dem intraperitonealen Raum von Mäusen gezüchtet werden. Auch wenn wir Rinder t-PA von fötalem Kälberserum durch Benzamidin-Affinitätschromatographie reinigten, selbst wenn es durch den Antikörper auf Western-Blots markiert war, betrug die Größe des Moleküls 75 kD.
Western-Blots von reduzierten Probensonden mit einem Ziegen Anti-Maus Fab, das von polyklonalen Seren abgeleitet wurde, zeigten eine Markierung eines 25 kD Proteins, welches die erwartete Größe der 59D8 K leichten Kette darstellt. Obwohl auf solchen Blots dieses Reagens üblicherweise auch die schweren Ketten des Maus-Immunoglobulins markiert, ist die fehlende Markierung des Fusionspeptids nicht überraschend, da der Großteil der konstanten Region der schweren Kette entfernt wurde. Blots, die mit nichtreduzierten Proben erstellt wurden, zeigten eine Markierung einer einzelnen Bande bei einem Molekulargewicht von 170-180 kD durch beide der iodierten Antikörper. Dies liefert einen deutlichen Beweis, daß die Hybridomzellen ein Molekül erzeugen, das sowohl Immunoglobulin als auch t-PA Peptide enthält. Der 170-180 kD Wert läßt darauf schließen, daß die Disulfidbindungen zwischen den schweren Ketten gebildet wurden, um ein Fab'&sub2;-ähnliches Molekül zu ergeben, daß zwei Antigenverbindungsstellen und zwei t-PA-Teilmengen enthält.
Die peptidolytische Aktivität des t-PA Teils des Moleküls wurde zunächst durch Messung der Spaltung des nichtspezifischen Substrats S-2288 bestimmt. Die Spaltung dieses Tripeptids kann genau durch Verfolgung der Paranitroanilin-Produktion aufgezeichnet werden, das Licht bei einer Wellenlänge von 405 nm absorbiert. Fig. 2A zeigt einen typischen Test, der direkt die Aktivität von unterschiedlichen Konzentrationen von reinem Melanom t-PA verwendet. Die Aktivität wird in diesem Test als die Geschwindigkeit der Veränderung in der optischen Dichte gemessen. Wenn ein Vergleich auf einer molaren Basis zwischen dem rekombinanten Protein und dem nativen t-PA angestellt wird, besitzt das rekombinante Protein 70 Prozent der Aktivität des nativen t-PA.
Zur Bestimmung, ob die katalytische β-Subeinheit die Aktivität gegen Plasminogen (ihr physiologisches Substrat) beibehält, wurde ein S-2251 Test durchgeführt. Hier soll der Plasminogenaktivator Plasminogen zu Plasmin umwandeln und das Plasmin setzt in der Folge Paranitroanilin von einem synthetischen Tripeptid frei. Weder der Plasminogenaktivator noch Trypsin können das S-2251 Substrat direkt konvertieren. Die amidolytische Aktivität von rekombinantem Protein, Melanom t-PA und Trypsin wurden zunächst in dem S-2288 Test bestimmt und dann wurde die Fähigkeit, Plasminogen umzuwandeln, mit jeweils vergleichbaren Mengen bestimmt. Fig. 2B zeigt, daß die Fähigkeit des rekombinanten Proteins, auf das physiologische Substrat zu wirken, jener des nativen t-PA sehr ähnlich ist. Obwohl eine nichtspezifische Serinprotease wie Trypsin Plasminogen zu Plasmin umwandeln kann, erfolgt dies weitaus weniger effizient als bei dem nativen oder rekombinanten Plasminogenaktivator.
Sowohl das Reinigungsschema als auch die Tests, die nach der Reinigung verwendet wurden, erfordern eine intakte und funktionelle Antigen-Verbindungsstelle. Für einen stärker quantitativen Vergleich des rekombinanten Moleküls mit dem Antikörper 59D8 verwendeten wird einen einfachen Verdrängungstest. Dieser Test maß die Fähigkeit von löslichem Fibrinmonomer, um Antikörperbindungsstellen mit Fibrin zu competitieren, das an dem Boden einer Platte mit 96 Vertiefungen gebunden ist. Obwohl der Test anzeigt, daß der native Antikörper das Fibrinmonomer besser bindet als das rekombinante Protein, ist der Unterschied in ihren Bindungsaffinitäten geringer als das Zehnfache (Fig. 3). Es ist offensichtlich, daß die Antikörperbindung nicht signifikant in dem Fusionsprotein beeinträchtigt ist.

DISKUSSION

Eine umfassende Analyse des sezernierten Proteins weist darauf hin, daß ein 59D8 schwere Kette-t-PA Fusionsprotein in Verbindung mit der leichten Kette in der vorhergesagten Weise exprimiert und sezerniert wird. Die Menge von in den Zellkulturüberständen vorhandenem rekombinanten Protein erscheint jedoch nur 10 Prozent des für monoklonale Antikörper erwarteten Werts zu sein. Durch Affinitätsreinigung erhielten wir routinemäßig nur 0,1 ug gereinigtes Protein pro Milliliter Zellkulturüberstand oder 10 ug pro ml in Bauchwasser. Wir überwachten die Reinigung mit Festphasen-Immunotests wie oben beschrieben und unsere Ausbeuten von den Affinitätssäulen lagen innerhalb des erwarteten Bereichs. Es gibt eine Reihe von möglichen Gründen für die eingeschränkte Erzeugung von rekombinantem Protein. Einer ist, daß das rekombinante Protein während des Zellwachstums oder der Proteinreinigung abgebaut wird. Bei einem Versuch, den proteolytischen Abbau zu begrenzen, gaben wir den Zellkulturen Proteasehemmer bei. Obwohl keine Verbesserung in der Ausbeute beobachtet wurde, bleibt der proteolytische Abbau ein Anliegen.
Andere, viel wesentlichere Probleme könnten der Grund für die geringen Proteinausbeuten sein. Obwohl die Boten-RNA mit der geeigneten Größe auf dem Northern-Blot gezeigt werden kann, könnte die Transkription des Konstrukts auf-einen geringerem Niveau erfolgen. Die Transkription wird durch den natürlichen schwere Kette-Promotor und Verstärker angetrieben, aber 3'-Sequenzen, die nachweislich in der Regulierung der Immunoglobulinexpression wichtig sind, wurden aus diesem Gebilde ausgeschlossen. Gregor et al., Mol. Cell. Biol., 6 : 1903-1916 (1986); Kobrin et al., Mol. Cell. Biol., 6 : 1687-1697 (1986). Zusätzlich stammt die 3' nichttranslatierte Region des chimären Gens von t-PA, einem Protein, das unter normalen Bedingungen bei einem geringen Niveau erzeugt wird, und wird nachfolgend in den Zellen, in denen es erzeugt wird, gelagert. Es ist möglich, daß die 3'UT-Region des t-PA-Gens zu geringen Transkriptions- oder Translationsniveaus führt oder die Sekretion des rekombinanten Proteins von der Zellen störend beeinflußt. Versuche zur quantitativen Bestimmung der mRNA-Synthese, Proteinsynthese und Stabilität des rekombinanten Proteins sollten eine Lösung dieses Problems ermöglichen.
Schwere Kette-Verlustvarianten stellen ein geeignetes Mittel für die Rekonstitution der Antikörper-Verbindungsstelle dar. Ihre Verfügbarkeit macht das Klonieren und Transfektieren der produktiven leichte Kette-Neuanordnung unnötig. Dieses Vorgehen hängt natürlich von der Fähigkeit ab, diese varianten Zellinien zu transfektieren. Die beiden, in diesen Versuchen verwendeten Linien wurden leicht unter Verwendung von Standardtechniken transfektiert, aber es ist noch nicht klar, ob sich andere SP2/0-stämmige Linien ähnlich verhalten. Die Menge an leichter Kette, die schwere Kette-Verlustvarianten sezernieren, ist unterschiedlich. Einige Verlustvarianten, die geringe Mengen leichte Kette sezernieren, könnten fähig sein, normale Mengen derselben leichten Kette zu sezernieren, wenn die schwere Kette-Synthese wieder aufgenommen wird. Wilde et al., Eur. J. Immunol., 10 : 462-467 (1980). Über die biologische Basis für den Verlust der Immunoglobulinkettenerzeugung in diesen Zellen ist wenig bekannt und es ist möglich, daß die Fähigkeit von einigen Verlustvarianten, leichte Kette wie auch schwere Kette zu produzieren, beeinträchtigt sein könnte.
Unsere geringen Produktionsniveaus des rekombinanten Proteins könnten das Ergebnis einer unterdrückten Expression der leichten Kette sein.
Die rekombinante t-PA-β-Kette weist ein hohes Niveau katalytischer Aktivität auf und behält die spezifische Fähigkeit, Plasminogen zu Plasmin umzuwandeln. Frühere Studien, die staphylococcale Nuclease und E. coli DNA-Polymerasefunktionen mit der schweren Kette des Immunoglobulins verbanden, ergaben eine deutlich geringere Effektorfunktion-Aktivität, als die in dem S-2288-Test gemessenen 70 Prozent. Neuberger et al., Nature, 312 : 604-608 (1984): Williams etal., Gene, 43 : 319-324 (1986). Dieses Beibehalten der enzymatischen Aktivität und Substratspezifität weist darauf hin, daß selbst komplexe Moleküle, die eine genaue Faltung und Bildung von zahlreichen Disulfidbindungen zwischen den Ketten erfordern, zur Bildung rekombinanter Hybridproteine verwendet werden können. Andere haben gezeigt, daß die β-Kette von t-PA fähig ist, richtig zu falten und die Aktivität bei fehlender α-Kette aufrechtzuerhalten. MacDonald et al., Gene, 42 : 59-67 (1986); von Zooneveld et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 83 : 4670-4674 (1986). Unsere Ergebnisse bestätigen die Aktivität nur der katalytischen Kette und lassen darauf schließen, daß die Kette in Verbindung mit einer anderen aminoterminalen Sequenz richtig faltet. Insgesamt liefern diese Beobachtungen den Beweis für die unabhängige Faltung von verschiedenen Proteindomänen.
Zusammenfassend haben wir das Gen der schweren Kette kloniert, das für die Antigenverbindungsstelle eines Antifibrin-Antikörpers kodiert und ein Konstrukt erzeugt, das für eine stumpfes, schwere Kette-t-PA β-Subeinheit Fusionspeptid kodiert. Das Konstrukt wurde in der Folge in schwere Kette-Verlustvarianten des Antifibrin-Hybridoms transfektiert. Die Western-Blot-Analyse weist darauf hin, daß das Fusionsprotein Antifibrin-Antikörper-Aktivität besitzt und ein Niveau der Plasminogen-Aktivierungsaktivität beibehält, das hoch genug ist, um als dem des nativen t-PA ähnlich erachtet zu werden.

Claims

1. Rekombinantes Hybrid-Immunoglobulinmolekül, bestehend aus einem Antikörper oder einem Teil davon, der für Fibrin spezifisch ist, und einem Plasminogenaktivator oder einem Teil davon, der zur Konvertierung von Plasminogen zu Plasmin imstande ist.

2. Molekül nach Anspruch 1, wobei der Plasminogenaktivator ein gewebeartiger Plasminogenaktivator, Streptokinase, Urokinase oder Prourokinase ist.

3. Molekül nach Anspruch 1 oder 2, das Antikörper 64c5 (ATCC HB 8545) oder 59D8 (ATCC HB 8546) ist.

4. Molekül nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Teil des Plasminogenaktivators die katalytische Region ist.

5. Molekül nach Anspruch 4, wobei die katalytische Region die B-Kette von tPA oder Urokinase ist.

6. DNA, die für ein rekombinantes Hybrid-Immunoglobulinmolekül nach einem der vorangehenden Ansprüche kodiert.

7. Pharmazeutische oder in vivo diagnostisch verabreichbare Zusammensetzung, bestehend aus einem rekombinanten Hybrid-Immunoglobulinmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und einem pharmazeutisch oder veterinärisch annehmbaren Träger dafür.

8. Verwendung eines rekombinanten Hybrid-Immunoglobulinmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in der Herstellung eines Thrombolytikums.

9. Rekombinantes Hybrid-Immunoglobulinmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das nachweisbar markiert ist.

10. Rekombinantes Hybrid-Immunoglobulinmolekül nach Anspruch 9, das radiomarkiert ist.

11. Verwendung eines markierten rekombinanten Hybrid-Immunoglobulinmoleküls nach Anspruch 9 oder 10 in der Herstellung eines Thrombuserkennungsmittels.

12. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Hybrid-Immunoglobulinmoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren die Kopplung aufeinanderfolgender Aminosäuren durch Bildung von Peptidbindungen umfaßt.