JP7199759B2

JP7199759B2 - 病理学的凝血塊を処置するポリペプチド

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Publication number: JP7199759B2
Application number: JP2021527897A
Authority: JP
Inventors: ツェ・ウェンチャン，; シン・マオチュウ，; ウェイ・ティングティアン，; ティング・ウェイチャン，; ミング・ユーシェ，
Original assignee: Immunwork Inc
Current assignee: Immunwork Inc
Priority date: 2018-11-21
Filing date: 2019-11-21
Publication date: 2023-01-06
Anticipated expiration: 2039-11-21
Also published as: EP3883972A4; WO2020103910A1; TW202033550A; AU2019382515B2; EP3883972A1; CA3120211A1; US11220680B2; CN114679910B; CN114679910A; AU2019382515A1; US20200157519A1; TWI779252B; JP2022513095A

Description

本開示は、ポリペプチドの分野に関し、より具体的には、抗フィブリン抗体及びヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｈｕ－ｔＰＡ）のセリンプロテアーゼ部分を備えるポリペプチド並びに血栓症の処置におけるその使用に関する。

血液凝固（すなわち凝結）は、血液が血液を形成する複雑な工程である。凝結は、順次に増幅するプロテアーゼが触媒する事象のカスケードを含む。後のステップに向けて、第Ｘａ因子は、プロトロンビンを切断してトロンビンを生成し、トロンビンは次にフィブリノーゲンを、血小板との組合せで凝塊の網目構造を形成するフィブリンへと切断する。凝血塊の溶解には、組織プラスミノーゲン活性化因子を含む幾つかの酵素の１つを介してプラスミノーゲンから生成されるプラスミンが関与する。

血栓症は、凝結の障害であり、凝血塊（すなわち血栓）が血管を塞ぎ、それにより患部での血流を妨げる。種々の合併症（例えば、中でも、心血管、内分泌又は他の身体的な調節状態、手術、薬の使用からもたらされるもの）を患う患者は、そのような病理学的凝血塊を発症する傾向を有する。これらの凝塊は、生命を脅かす深刻な臨床状態を導くことが多い出血性脳卒中、頭部外傷、心筋梗塞、肺塞栓症又は深部静脈血栓症を引き起こし得る。

そのような血液凝固の病理学的課題に対処する上で、２つの主要な薬学的ニーズの態様があり、一方の態様は、凝塊の核が形成されると、病理学的凝血塊が形成又は大型化してしまうことを予防又は阻害することであり、他方の態様は、既に形成された病理学的凝塊を適時に溶解することである。双方の態様において、臨床的に利用可能な一連の薬学的生成物がある。

第Ｘａ因子の多数の間接的阻害剤が開発され、使用されている。何十年にもわたって、阻害剤は、主として、５～３０ｋＤａの様々な分子量の天然に生じるグリコサミノグリカンの多糖類の混合物であるヘパリン、低分子量ヘパリン及びヘパリノイド化合物である。それらの物質は、抗トロンビンを含むヘパリン結合タンパク質に結合し、それゆえそれらの物質を増強して第Ｘａ因子を阻害し、それにより凝塊形成を阻害する。タンパク質分解の程度に応じた３４～４０ｋＤａの一本鎖血清タンパク質である組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）は、第Ｘａ因子を阻害可能である。しかし、それは、治療薬として組換えＤＮＡ技術を使用して生成されるものではない。

トロンビンの多数の直接的阻害剤も、開発され、臨床的に使用されている。トロンビンに結合する医療用ヒルから天然に回復されるヒルジン及び組換えヒルジンは、より優れた他の薬の導入により廃止されるまで、長年使用された。

つい最近では、第Ｘａ因子又はトロンビンの直接的阻害剤である幾つかの小分子が開発され、幾つかの臨床的適応での凝結の予防における臨床使用が承認されている。あるセットの臨床用途では、これらの小分子は、アピキサバン、エドキサバン又はリバロキサバンのような第Ｘａ因子の直接的阻害剤である。他のセットの用途では、これらの小分子は、アルガトロバン又はダビガトランのようなトロンビンの直接的阻害剤である。直接的トロンビン阻害剤であるキシメラガトランは、好ましい動態を有し、極めて少ない用量で投与され得るが、肝毒性の問題により市場から撤回されている。

アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ及びラノテプラーゼを含む組換えヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）の幾つかの形態の開発は、血栓症の問題の重要な部分を解決している。しかし、多くの場合においてｔＰＡの使用は、凝塊を溶解するのに十分ではなく、若しくは深刻な内出血を引き起こし、又はその双方である。

凝血塊の溶解に使用するのに適した血栓溶解生成物に対してこれらのドメインの全ては必要とされないが、無傷のｔＰＡは個別の機能又は活性を有する幾つかの構造的ドメインを備えるため、無傷のｔＰＡの分子構造は複雑である。５２７個のアミノ酸残基を有する完全長ｔＰＡ分子（アルテプラーゼ）は、（ｉ）フィブリンに結合するフィブロネクチンフィンガードメイン、（２）肝細胞に結合してｔＰＡ’のクリアランスを促進する上皮成長因子ドメイン、（３）肝内皮細胞に結合してｔＰＡ’クリアランスを促進するクリングル１ドメイン、（４）フィブリンに結合してセリンプロテアーゼを活性化するクリングル２ドメイン、及び（５）プラスミノーゲンを切断し、Ｉ型プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ－１）によって阻害されるプロテアーゼドメインを含む。アルテプラーゼ、テネクテプラーゼ及びラノテプラーゼは哺乳動物細胞、ＣＨＯ細胞において生成され、レテプラーゼはバクテリアにおいて生成される。

長さ３５５残基のレテプラーゼは、フィブロネクチンフィンガー、上皮成長因子ドメイン及びクリングル１ドメインを含まない。レテプラーゼはバクテリアにおいて生成され、したがって翻訳後の炭水化物修飾を含まない。レテプラーゼはフィブリンに対する低い親和性を有し、そのプロテアーゼはアルテプラーゼにおけるような範囲まで活性化されないが、レテプラーゼは１４～１８分の血漿半減期を有し、これに対して、アルテプラーゼの半減期は血漿中で３～４分しか持続しない。アルテプラーゼはボーラスに続いて点滴によって投与されるが、レテプラーゼはｉｎｂｏｌｉで患者に投与される。

テネクテプラーゼは、アルテプラーゼの５２７個のアミノ酸残基の全長を有するが、３カ所に突然変異を有する。１０３位のスレオニンはアスパラギンに置換されグリコシル化修飾を可能にし、１１７位のアスパラギンはグルタミンに置換されグリコシル化を排除する。これらの突然変異は、肝細胞による分子のクリアランスを阻害する。さらに、２９６～２９９位の４個の残基（すなわち、リジン－ヒスチジン－アルギニン－アルギニン）は４個のアラニン残基によって置換され、したがってＰＡＩ－１に対する耐性を８０倍に増加する。テネクテプラーゼは、１８分の血漿半減期を有する。

ラノテプラーゼでは、フィブロネクチンフィンガー及び上皮成長因子ドメインが欠損され、１１７位のアスパラギンがグルタミンに置換される。ラノテプラーゼの血漿半減期は４５分に増加し、それによって投与手順が改善される。

組換えｔＰＡの幾つかの形態を比較する臨床研究も非常に活発である。種々の臨床試験では、４つの形態のｔＰＡの全体的な治療効能はほぼ同等であり、各々は特定の臨床条件において他よりも良好に適合するように思われる。ｔＰＡ及びその変異体並びにそれらの医学的使用についての豊富な出版された文献から、フィブリンへの結合における親和性、その半減期、肝細胞による分解に対する感受性及びプラスミノーゲン活性化因子阻害剤に対する耐性を含む、ｔＰＡの種々の特性は全て、ｔＰＡの特定の臨床条件に対する望ましい特性に関与することが明らかである。

上記を考慮して、病理学的又は閉塞性の凝血塊を処置する一層優れた生成物についての関連技術におけるニーズが存在する。

以下に、基本的な理解を読者に与えるために開示の簡略化した概要を提示する。この概要は、開示の広範な概観ではなく、本発明の鍵となる／重要な要素を特定するものでも本発明の範囲を記述するものでもない。その専らの目的は、ここに開示される幾つかの概念を、後述のさらに詳細な説明の序章としての簡略な形態で提示することである。

第１の態様では、本開示は、フィブリンに特異的な抗体に向けられる。本開示の種々の実施形態によると、抗フィブリン抗体は、ヒト又はマウスフィブリンに対して特異的である。さらに、本抗フィブリン抗体は、可溶性フィブリノーゲンよりも重合化された不溶性フィブリンと選好的に結合する。本発明の幾つかの実施形態によると、本抗フィブリン抗体は、ヒトフィブリノーゲンに対するよりも１０倍良好な親和性でヒトフィブリンに結合する。

幾つかの選択的実施形態では、抗フィブリン抗体は、配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ：）１、１７、１９又は２１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、及び配列番号２、１８、２０又は２２のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを有する。例えば、抗フィブリン抗体は、配列番号３又は５のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖであり得る。

本開示のある実施形態によると、抗フィブリン抗体は、配列番号１の残基３０～３２（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号１の残基４９～５４（ＣＤＲ－Ｌ２）、配列番号１の残基９１～９６（ＣＤＲ－Ｌ３）、配列番号２の残基３０～３３（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号２の残基５０～５９（ＣＤＲ－Ｈ２）及び配列番号２の残基９８～１０６（ＣＤＲ－Ｈ３）に対応するアミノ酸配列をそれぞれ有する６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を備える。

本開示の種々の実施形態によると、抗フィブリン抗体は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）又はシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。

他の選択的実施形態では、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインは、配列番号１６の配列を有する親水リンカーに連結される。

他の態様では、本開示は、本開示の上記の態様／実施形態による抗フィブリン抗体を備えるポリペプチドに向けられる。理解され得るように、そのようなポリペプチドを用いて血栓を処置する方法も、本開示の態様に入る。

本開示の実施形態によると、ポリペプチドは、抗フィブリン抗体及びヒトプラスミノーゲン活性化因子（ｈｕ－ｔＰＡ）のセリンプロテアーゼ部分を備え、抗フィブリン抗体はヒトフィブリノーゲンに対するよりも１０倍良好な親和性でヒトフィブリンに結合する。代替的又は追加的に、ポリペプチドは、ｈｕ－ｔＰＡよりも良好にヒトフィブリンに結合する。さらに代替的又は追加的に、ポリペプチドは、動物においてレテプラーゼよりも長い血清半減期を有する。

特に、ｔＰＡのセリンプロテアーゼ部分は、抗フィブリン抗体のＮ又はＣ末端に、直接又はその間の連結配列で間接的に連結される。

本開示の選択的実施形態によると、ｈｕ－ｔＰＡのセリンプロテアーゼ部分は、レテプラーゼである。

幾つかの実施形態では、抗フィブリン抗体は、ヒト由来のものであり、又はヒト化されている。

本開示のある実施形態によると、ポリペプチドは、配列番号１１、１２又は１４のアミノ酸配列を有する。

本開示の付随する構成及び効果の多くは、添付図面との関連で検討される以下の詳細な説明を参照してより深く理解されることになる。

本説明は、添付図面を考慮して読まれる以下の詳細な説明からより深く理解されるはずである。

図１Ａは、ヒトフィブリンに特異的なファージディスプレイされたｓｃＦｖのファージ力価分析の結果を示す。図１Ｂは、ヒトフィブリンに特異的なファージディスプレイされたＤ１０ｓｃＦｖの単一コロニーＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。図２は、ヒトフィブリンに特異的な精製された１０２－１０及び３Ｄ５抗体のＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。図３は、精製された組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ＶＬ－フレキシブルリンカー－ＶＨｓｃＦｖ αフィブリン）及びレテプラーゼ－（１０２－１０ｓｃＦｖ αフィブリン）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す。図４は、精製された組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ＶＬ－２１８－ＶＨｓｃＦｖ αフィブリン）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す。図５Ａは、３又は６日間保存された精製された組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す。図５Ｂは、１ヶ月間保存された精製された組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す。図５Ｃは、３又は６日間保存された精製された組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）のＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。図６は、ヒトフィブリン及びヒト第ＸＩＩＩａ因子によって処置された架橋フィブリンに対するレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドのＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。図７は、組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドの、マウスフィブリンへの結合のＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。図８は、組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドの、遊離フィブリノーゲンの存在下でのヒトフィブリンへの結合のＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。図９は、組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドの、ＰＢＳ又はヒト血清中の血栓溶解活性を示す。図１０は、組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドの、最終濃度１ｍＭでの血栓溶解活性を示す。図１１は、組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドの標的効果を示す。図１２は、組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）の用量依存的な血栓溶解活性を示す。図１３Ａは、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）のヒト凝塊に対する血栓溶解活性を示す。図１３Ｂは、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）のヒト凝塊に対する血栓溶解活性を示す。図１３Ｃは、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）のヒト凝塊に対する血栓溶解活性を示す。図１４Ａは、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）のサル凝塊に対する血栓溶解活性を示す。図１４Ｂは、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）のサル凝塊に対する血栓溶解活性を示す。図１５は、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）及びアルテプラーゼのヒトフィブリン結合親和性を示す棒図表である。図１６Ａは、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）、レテプラーゼ及びアルテプラーゼのヒト凝塊に対する血栓溶解活性を示す。図１６Ｂは、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）、レテプラーゼ及びアルテプラーゼのヒト凝塊に対する血栓溶解活性を示す。図１７Ａは、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）及びアルテプラーゼのタンパク質分解活性を示す。図１７Ｂは、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）及びアルテプラーゼのタンパク質分解活性を示す。図１８Ａは、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）で処置されたマウスのＩＶＩＳ画像である。図１８Ｂは、レテプラーゼで処置されたマウスのＩＶＩＳ画像である。図１８Ｃは、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）の標的効果を示す折れ線グラフである。図１９は、アルテプラーゼ、レテプラーゼ及び組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドの薬物動態プロファイルを示す。図２０は、アルテプラーゼ及び組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドの薬物動態プロファイルを示す。図２１Ａは、精製された組換え（３Ｄ５ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨｓｃＦｖ αフィブリン）－レテプラーゼポリペプチドのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す。図２１Ｂは、組換え３Ｄ５ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨｓｃＦｖ αフィブリン）－レテプラーゼポリペプチドのヒトフィブリンへの結合のＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。図２２は、組換え（３Ｄ５ｓｃＦｖ）－レテプラーゼポリペプチドのヒト凝塊に対する用量依存的な血栓溶解活性を示す。

一般的な慣例により、記載される種々の構成／要素は、縮尺通りに描かれていないが、その代わりに、本発明に関連する具体的構成／要素を最も良く示すように描かれている。また、種々の図面における同様の符号及び指定が、可能な場合には、同様の要素／部分を示すのに用いられる。

添付図面との関連で以下に与えられる詳細な説明は、本実施例の説明としてのものであり、本実施例が構成又は利用され得る形態のみを示すものではない。その記載は、実施例の機能及び実施例を構成して動作させるためのステップの配列を説明する。ただし、同一又は同等の機能及び配列が、異なる実施例によっても実現され得る。

便宜上、明細書、実施例及び付随する特許請求の範囲において採用される所定の用語をここにまとめる。ここで特に断りがない限り、本開示で採用される科学的及び技術的用語は、一般的に当業者に理解及び使用される意味を有するものとする。

また、文脈によってそれ以外が必要とされない限り、単数形の用語はその複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとすることが理解される。具体的には、ここで及び特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」及び「ａｎ」は、それ以外を文脈が明示しない限り、複数の参照を含む。また、ここで及び特許請求の範囲で使用されるように、用語「少なくとも１つの」及び「１以上の」は、同じ意味を有し、１、２、３又はそれ以上を含む。またさらに、本明細書及び付随する特許請求の範囲を通じて使用される文言「Ａ、Ｂ及びＣの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ又はＣの少なくとも１つ」及び「Ａ、Ｂ及び／又はＣの少なくとも１つ」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、Ａ及びＢ双方、Ｂ及びＣ双方、Ａ及びＣ双方、そしてＡ、Ｂ及びＣの全てを含むことが意図されている。

発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは概数であるものの、具体的な実施例で説明される数値は可能な限り厳密に報告される。ただし、いずれの数値も、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的にもたらされる所定の誤差を本来的に含む。また、ここで使用されるように、用語「約」は、所与の値又は範囲の１０％、５％、１％又は０．５％内を一般に意味する。あるいは、用語「約」は、当業者によって考慮される場合の平均の許容標準誤差内を意味する。有効な／効果的な実施例以外においても、明示の断りがない限り、ここに開示されるその材料の量、継続時間、温度、動作条件、量の比率などに対するものなどの数値範囲、量、値及び割合の全ては、いずれの場合においても用語「約」によって変更されるものとして理解されるべきである。したがって、逆のことが示されない限り、本開示及び添付の特許請求の範囲で説明される数値パラメータは、所望のように変化し得る概数である。少なくとも、各数値パラメータは、報告される有効数字の数を考慮してかつ通常の四捨五入手段を適用して少なくとも解釈されるべきである。範囲は、ここでは、ある終点から他の終端まで又は２つの終点間として表現され得る。ここに開示される全ての範囲は、特に断りがない限り終点を包含する。

本開示は、概略として、抗フィブリン抗体及びそれを備えるポリペプチドに関する。特に、抗フィブリン抗体は、ポリペプチドの標的要素（Ｔ）として作用し、それはさらにエフェクター要素（Ｅ）を備え、したがって、これらのポリペプチドを本書類では「Ｔ－Ｅ分子」、「Ｔ－Ｅ医薬品」又は「Ｔ－Ｅ薬剤」ということもある。

第１、第２、第３等の用語は、ここでは種々の要素、構成要素、領域及び／又は部分を記載するのに使用され得るが、これらの要素（並びに構成要素、領域及び／又は部分）はこれらの用語によって限定されるものではない。また、そのような序数の使用は、文脈によって明記されない限り、順列又は順序を示唆するものではない。逆に、これらの用語は、１つの要素を他の要素から区別するのに使用されるにすぎない。したがって、以下に記載する第１の要素は、例示的実施形態の教示から逸脱することなく、第２の要素と表記されてもよい。

ここで、用語「連結する（ｌｉｎｋ）」、「結合する（ｃｏｕｐｌｅ）」及び「結合する／標識化する（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」は、２つの構成要素を２つの構成要素間の直接の連結を介して又は間接的な連結を介して接続する任意の手段をいうものとして互換可能に用いられる。

ここで使用される用語「ポリペプチド」は、少なくとも２つのアミノ酸残基を有するポリマーをいう。通常、ポリペプチドは、長さ２～約２００個の残基、好ましくは２～５０個の残基を範囲とするアミノ酸残基を備える。アミノ酸配列がここに与えられる場合、Ｌ－、Ｄ－又はベータアミノ酸バージョンの配列も考慮される。ポリペプチドはまた、１以上のアミノ酸残基が対応の天然に生じるアミノ酸及び天然に生じるアミノ酸ポリマーの人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーを含む。さらに、当該用語は、ペプチド結合によって、又は例えば、ペプチド連結がα－エステル、β－エステル、チオアミド、ホスホルアミド、カルボメート、ヒドロキシレートなどによって置換される他の「修飾結合」によって接合されたアミノ酸に当てはまる。

ある実施形態では、ここに記載される配列のいずれかを備えるアミノ酸の保存的な置換が考慮される。種々の実施形態では、１、２、３、４又は５個の異なる残基が置換される。用語「保存的な置換」は、分子の活性（例えば、生物学的又は機能的な活性及び／又は特異性）を実質的に変更しないアミノ酸置換を反映するのに使用される。通常、保存的なアミノ酸置換は、１つのアミノ酸を類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水度）を有する他のアミノ酸に置換することを伴う。ある保存的な置換は、親残基から最小限に異なる非標準（例えば、希少性、合成など）のアミノ酸によって標準アミノ酸が置換される「類似置換」を含む。アミノ酸類似体は、親構造に対する大きな変化なく標準アミノ酸に合成的に由来するものとして考えられ、異性体であり、又は代謝物質前駆体である。

ある実施形態では、ここに記載する配列のいずれかと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％又は９８％の配列同一性を備えるポリペプチドも考慮される。

ここで同定されるポリペプチド配列に関する「パーセンテージ（％）アミノ酸配列同一性」は、最大パーセントの配列同一性を得るように必要に応じて配列の整列及びギャップの導入を行った後、保存的置換を配列同一性の一部として考慮せずに、特定のペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるポリペプチド残基のパーセンテージとして定義される。パーセンテージ配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ社）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いる当技術内の種々の態様で達成可能である。当業者であれば、対比されている配列の全長にわたって最大アライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここでの目的のため、２つのポリペプチド酸配列間の配列比較は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）によってオンラインで提供されるコンピュータプログラムＢｌａｓｔｐ（ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎＢＬＡＳＴ）によって実行された。所与のポリペプチド酸配列Ｂに対する所与のポリペプチド酸配列Ａのパーセンテージアミノ酸配列同一性（あるいは、所与のポリペプチド酸配列Ｂに対して所定％のアミノ酸配列同一性を有する所与のポリペプチド酸配列Ａということもできる）は、以下の定式で計算される。
Ｘ／Ｙ×１００％
ここで、Ｘは、そのプログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて配列アライメントプログラムＢＬＡＳＴによる完全な一致としてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、いずれか短い方のＡ又はＢにおけるアミノ酸残基の合計数である。

ここで使用される用語「ＰＥＧ化されたアミノ酸」は、１つのアミノ基及び１つのカルボキシル基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖をいう。一般に、ＰＥＧ化されたアミノ酸は、ＮＨ_２－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－ＣＯＯＨの式を有する。本開示では、ｎの値は、１～２０の範囲であり、好ましくは２～１２の範囲である。

ここで使用されるように、ポリペプチドに関する用語「末端」とは、ポリペプチドのＮ端又はＣ端におけるアミノ酸残基のことをいう。ポリマーに関しては、用語「末端」とは、ポリマー骨格の端部に位置するポリマー（例えば、本開示のポリエチレングリコール）の構成単位のことをいう。本明細書及び特許請求の範囲において、用語「自由末端」は、末端アミノ酸残基又は構成単位が他のいずれの分子にも化学結合されていないことを意味するのに使用される。

本明細書及び特許請求の範囲において、用語「抗体」は、広義で使用され、完全にアセンブルされた抗体、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ／Ｆａｂ´）、（ジスルフィド結合によって相互に連結された２つの抗原結合Ｆａｂ部分を有する）Ｆ（ａｂ´）_２フラグメント、可変フラグメント（Ｆｖ）、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、二特異性一本鎖可変フラグメント（ｂｉ－ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ナノボディ、ユニボディ及びディアボディなど、抗原と結合する抗体フラグメントを包含する。「抗体フラグメント」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合領域又は可変ドメインを備える。通常、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコード化された１以上のポリペプチドからなるタンパク質をいう。周知の免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー定常域遺伝子、並びに多数の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子を含む。軽鎖は、カッパ又はラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロンとして分類され、それは同様に免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥをそれぞれ定義する。標準的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体からなることが知られている。各四量体は、各対が１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有して、２つの同一のポリペプチド鎖対で構成される。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う約１００～１１０以上のアミノ酸の可変ドメインを定義する。軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）及び重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）という用語は、それぞれそれらの軽鎖及び重鎖をいう。本開示の実施形態によると、抗体フラグメントは、天然抗体を修飾することによって又は組換えＤＮＡ法を用いたデノボ合成によって生成され得る。本開示のある実施形態によると、抗体及び／又は抗体フラグメントは、二特異性であってもよく、種々の構成のものであり得る。例えば、二特異性抗体は、２つの異なる抗原結合部分（可変ドメイン）を備え得る。種々の実施形態において、二特異性抗体は、ハイブリドーマ技術又は組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。ある実施形態では、二特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する。

ここで使用される用語「特異的に結合する」は、約１×１０^－６Ｍ、１×１０^－７Ｍ、１×１０^－８Ｍ、１×１０^－９Ｍ、１×１０^－１０Ｍ、１×１０^－１１Ｍ、１×１０^－１２Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）で抗原と結合し、及び／又は非特異抗原に対するその親和性よりも少なくとも２倍高い親和性で抗原に結合する、抗体又はその抗原結合フラグメントの能力をいう。

ここで使用される用語「処置」は予防的（例えば、予防の）治癒的又は緩和的な処置を含み、ここで使用される用語「処置している」も予防的（例えば、予防の）治癒的又は緩和的な処置を含む。特に、ここで使用される用語「処置している」は、上記特定の疾患、障害及び／又は状態の１以上の症状又は特徴の部分的又は完全な軽減、改善、解放、発症の遅延、進行の阻害、重症度の低減及び／又は発症率の低減を目的で、医学的状態（例えば、血栓症）若しくは医学的状態に関連する症状、医学的状態に対して二次的な疾患若しくは障害、又は医学的状態に対する素質を有する被検体への本ポリペプチド又は本ポリペプチドを備える薬学的組成物の適用又は投与をいう。処置は、疾患、障害及び／若しくは病状に関連する進展する病理のリスクを減少させる目的のために、疾患、障害及び／若しくは病状の兆候を示さない被検体、又は疾患、障害及び／若しくは病状の初期の兆候のみを示す被検体に施され得る。

ここで使用される用語「有効量」は、所望の治療上の反応をもたらすのに充分な量の本ポリペプチドをいう。薬剤の有効量は、疾患又は状態を治癒することは要件とされないが、疾患又は病状の発症が遅延、阻害若しくは防止され又は疾患及び病状の症状が改善されるように疾患又は状態に対する処置を与える。有効量は、指定された期間を通して１、２又はそれ以上の回数に投与される適切な形態で１、２又はそれ以上の投与量に分割され得る。具体的な有効な又は充分な量は、処置されている特定の状態、患者の肉体的状態（例えば、患者の体重、年齢又は性別）、処置されている被検体の種類、処置の継続期間、（それがある場合には）併用療法の性質、並びに採用される具体的処方及び化合物又はその誘導体の構造といった要因で変化することになる。有効量は、例えば、活性成分の合計質量（例えば、グラム、ミリグラム又はマイクログラム）又は体重に対する活性成分の質量の比、例えば、キログラムあたりのミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）として表現され得る。

用語「適用」及び「投与」は、ここでは、その処置を必要とする被検体への本発明のポリペプチド又は薬学的成分の適用を意味するものとして互換可能に使用される。

用語「被検体」及び「患者」は、ここでは互換可能に使用され、本発明のポリペプチド、薬学的組成物及び／又は方法によって処置可能なヒト種を含む動物を意味することが意図される。用語「被検体」又は「患者」は、一方の性別が具体的に示されない限り、雄及び雌の両方の性別をいうものとする。したがって、用語「被検体」又は「患者」は、本開示の処置方法から利益を受け得る任意の哺乳動物を含む。「被検体」又は「患者」の例は、これに限定されないが、ヒト、ラット、マウス、モルモット、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ及び家禽を含む。例示的実施形態では、患者はヒトである。用語「哺乳動物」は、ヒト、霊長類、ウサギ、ブタ、ヒツジ及び畜牛などの家畜及び農場動物、並びに動物園、スポーツ又はペットの動物、マウス及びラットなどの齧歯類を含む哺乳類の全てのメンバーをいう。用語「非ヒト哺乳動物」は、ヒト以外の哺乳類の全てのメンバーをいう。

本開示は、少なくとも、フィブリノーゲンを介してフィブリン（特に、フィブリン凝塊）に選択的に結合する抗フィブリン抗体の同定に基づく。本発明の幾つかの実施形態によると、抗フィブリン抗体は、ヒトフィブリノーゲンに対するよりも１０倍高い親和性でヒトフィブリンに結合する。このように、本抗フィブリン抗体は、フィブリン凝塊の付近周辺に局在化するＴ－Ｅ分子の構成に対する標的要素として作用し得る。一方、Ｔ－Ｅ分子は、病理学上の凝血塊を破壊することができるものなど、１以上のエフェクター要素を備える。このように、Ｔ－Ｅ医薬品は、血液循環、リンパ系、及び他の細胞、組織又は臓器と比較して高い比率で標的細胞、標的組織又は臓器に送達され得る。これが達成されると、医薬品の治療効果が増加し、一方で副作用及び毒性の範囲及び重症度が減少する。治療エフェクターが、標的化成分のない形態よりもＴ－Ｅ分子の形態において低い投与量で投与されることも可能である。したがって、治療エフェクターは、副作用及び毒性を低減しつつも効力を失うことなく低い投与量で投与可能となる。

上記の観点で、本開示の一態様は、フィブリノーゲンからフィブリン凝塊を区別することができる抗フィブリン抗体に向けられる。他の抗フィブリン抗体が開発されてきたが、いずれも、臨床の適用をもたらすほどに充分な程度でフィブリン凝塊とフィブリノーゲンとを区別することはできない。したがって、フィブリノーゲンからフィブリン凝塊を区別することができるモノクローナル抗体の生成は、病理学上の凝塊を標的化するＴ－Ｅ医薬品の開発における大きなブレークスルーである。

本開示の実施形態によると、抗フィブリン抗体は、配列番号１及び２、配列番号１７及び１８、配列番号１９及び２０又は配列番号２１及び２２のアミノ酸配列をそれぞれ有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を備える。幾つかの実施形態によると、ＶＬドメイン及びＶＨドメインは、それぞれ３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を備える。具体的には、本抗フィブリン抗体のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３は、それぞれ、配列番号１の残基３０～３２、残基４９～５４及び残基９１～９６に対応するアミノ酸配列を有する。また、本抗フィブリン抗体のＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３は、それぞれ、配列番号２の残基３０～３３、残基５０～５９及び残基９８～１０６に対応するアミノ酸配列を有する。

本開示の種々の実施形態によると、抗フィブリン抗体は、抗原結合領域又は可変ドメイン（例えば、上記のＣＤＲ）を備える無傷の抗体又は抗体フラグメントであり得る。例えば、抗体は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）又はシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）として提供され得る。ただし、本開示はこれに限定されない。

幾つかの選択的実施形態では、抗フィブリン抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを備える。

本開示の幾つかの選択的実施形態によると、リンカー配列が、本ｓｃＦｖの半減期及び／又は結合親和性を増加させるように、ＶＬ配列とＶＨ配列の間又はＶＨ配列とＶＬ配列の間に配置される。例えば、リンカー配列は、親水性配列であり得る。幾つかの選択的実施形態では、抗フィブリン抗体は、配列番号３又は５のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖであってもよい。

他の態様では、本開示は、ポリペプチドに向けられる。特に、ポリペプチドは、標的化要素（例えば、本開示の上記態様／実施形態による抗フィブリン抗体）及び血栓症を処置するためのエフェクター要素（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子）を備えるＴ－Ｅ医薬品である。したがって、そのようなポリペプチドを用いて血栓症を処置する方法も、本開示の範囲に包含される。

本開示の種々の実施形態によると、ポリペプチドは、抗フィブリン抗体、及び抗フィブリン抗体のＮ又はＣ末端に直接又はリンカーを介して間接的に連結されるヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｈｕ－ｔＰＡ）のセリンプロテアーゼ部分を備える。

ｈｕ－ｔＰＡのセリンプロテアーゼ部分の例示はレテプラーゼである。レテプラーゼと等価な他のポリペプチドも、本開示の範囲に含まれる。

幾つかの選択的実施形態では、抗フィブリン抗体及びｈｕ－ｔＰＡのセリンプロテアーゼ部分は直接連結されるが、他の場合には、これら２つはその間に配された介在配列を有して間接的に連結される。本開示のある実施形態によると、親水性リンカー配列が、抗フィブリン抗体とｈｕ－ｔＰＡのセリンプロテアーゼ部分との間に配置されて凝塊におけるフィブリン網目構造とのポリペプチドの結合を促進する。例えば、ｈｕ－ｔＰＡのセリンプロテアーゼ部分が抗フィブリン抗体のＮ末端に連結される場合、ポリペプチドは配列番号１１又は１２のアミノ酸配列を有する。代替的に、ｈｕ－ｔＰＡのセリンプロテアーゼ部分が抗フィブリン抗体のＣ末端に連結される場合、ポリペプチドは配列番号１４のアミノ酸配列を有する。

幾つかの選択的実施形態によると、ｈｕ－ｔＰＡよりも本ポリペプチドの方が、ヒトフィブリンに良く結合する。代替的又は追加的に、レテプラーゼよりも本ポリペプチドの方が、動物における長い血清半減期を有する。

実験的実施例

実施例１：ファージディスプレイスクリーニングに対するヒトフィブリンコーティングされたプレートの調製
フィブリンコーティングされたプレートを調製するために、ＰＢＳで希釈したヒト由来のフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ社）をウェルあたり１０μｇ／１００μＬでマキシソーププレート（Ｎｕｎｃ社）に添加し、プレートを封止して４℃で一晩放置した。

各フィブリンプレートを以下のように調製した。最終濃度１．０Ｕ／ｍＬのトロンビン（Ｓｉｇｍａ社）、２ｍＭのＣａＣｌ及び７ｍＭのＬ－システイン（Ｍｅｒｃｋ社）を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）１００μＬをフィブリノーゲンプレートのウェルに添加し、そしてそれをＴＢＳバッファで洗浄し、ＰＢＳＴ（０．１％のｔｗｅｅｎ－２０を有するリン酸緩衝生理食塩水）中の５％のスキムミルクでブロッキングした。

実施例２：ヒトフィブリンに特異的なファージディスプレイされたｓｃＦｖの構築及び選択
ヒトフィブリンに特異的なｓｃＦｖを保有するファージクローンを、ＡｃａｄｅｍｉａＳｉｎｉｃａ（台湾、台北）のＧｅｎｏｍｉｃｓＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒのＡｎ－ＳｕｅｉＹａｎｇ博士の研究室との契約の締結を通じて得た。ｓｃＦｖライブラリのフレームワーク配列は、Ｇ６抗ＶＥＧＦＦａｂ（ＰｒｏｔｅｉｎＢａｎｋＣｏｄｅ２ＦＪＧ）に由来し、培養上清へのｓｃＦｖフラグメントの分泌のためのアンピシリン耐性、ｌａｃＺプロモータ、ｐｅｌＢリーダ配列及び検出に適用可能なＥ－ｔａｇを保有するファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社）の制限部位ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩにクローニングされた。ｓｃＦｖテンプレートのＶＨ及びＶＬドメインを、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順に基づいて個別に多様化させ、各可変ドメインの３個のＣＤＲを同時に多様化させた。１０^９個以上のクローンのｓｃＦｖライブラリを、ヒトフィブリンに対する選択に使用した。

消化されたヒトフィブリン（ウェルあたり１μｇ／１００μＬのＰＢＳ）でコーティングされたマキシソープ９６－ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社）を、抗フィブリン抗体のパニングに使用した。簡潔には、ウェルを、ウェル中のコーティング溶液を室温で２時間振とうすることによりヒトフィブリンでコーティングした。そして、フィブリンコーティングされたウェルを、ブロッキングバッファ（０．１％のｔｗｅｅｎ－２０を有するＰＢＳＴ中の５％のスキムミルク）で室温で１時間処置した。８×１０^１１ＣＦＵ／ｍｌに希釈したブロッキングバッファ中の組換えファージを、穏やかに振とうしながらフィブリンコーティングされたウェルに１時間添加した。そして、ウェルをＰＢＳＴで１０回強く、続いてＰＢＳで６回洗浄して、非特異的結合ファージを除去した。結合したファージを、ｐＨ２．２の０．１ＭのＨＣｌ／グリシンバッファを使用して溶出し、溶出溶液をｐＨ９．０の２ＭのＴｒｉｓ塩基バッファで直ちに中和した。大腸菌株ＥＲ２７３８（ＯＤ６００＝～０．６）を３７°Ｃで３０分間のファージ感染に使用し、感染していない大腸菌をアンピシリンで３０分間処置することにより排除した。その後、カナマイシン耐性を有するヘルパーファージＭ１３ＫＯ７をさらに１時間のインキュベーションのために添加した。大腸菌培養中のヘルパーファージによって救出された選択ファージを、カナマイシンの存在下で３７℃で一晩激しく振とうすることによって増幅した。増幅したファージをＰＥＧ／ＮａＣｌ中に沈殿してから、次の選択－増幅サイクルのためにＰＢＳに再懸濁した。この選択－増幅手順を繰り返すことにより、ヒトフィブリンに対して合計３回の連続したパニングラウンドを行った。

トロンビン処置されたフィブリンプレート（ウェルあたり１μｇ／１００μＬ）を、前述の実施例で説明したように調製した。フィブリンプレートを、抗フィブリン抗体をパニングするために使用した。簡潔には、フィブリンコーティングされたウェルを、ブロッキングバッファ（０．１％のｔｗｅｅｎ－２０を有するＰＢＳＴ中の５％スキムミルク）で室温で１時間処置した。８×１０^１１ＣＦＵ／ｍｌに希釈したブロッキングバッファ中の組換えファージを、穏やかに振とうしながらフィブリンコーティングされたウェルに１時間添加した。そして、ウェルをＰＢＳＴで１０回強く、続いてＰＢＳで６回洗浄して、非特異的結合ファージを除去した。結合したファージを、ｐＨ２．２の０．１ＭのＨＣｌ／グリシンバッファを使用して溶出し、溶出画分をｐＨ９．０の２ＭのＴｒｉｓ塩基バッファで直ちに中和した。大腸菌株ＥＲ２７３８（ＯＤ６００＝～０．６）を３７℃で３０分間のファージ感染に使用し、感染していない大腸菌をアンピシリンで３０分間処置することにより排除した。その後、カナマイシン耐性を有するヘルパーファージＭ１３ＫＯ７をさらに１時間のインキュベーションのために添加した。大腸菌培養中のヘルパーファージによって救出された選択ファージを、カナマイシンの存在下で３７℃で一晩強く振とうすることによって増幅した。増幅されたファージをＰＥＧ／ＮａＣｌ中に沈殿してから、次の選択－増幅サイクルのためにＰＢＳに再懸濁した。この選択－増幅手順を繰り返すことによって、ヒトフィブリンに対して合計３回の連続したパニングラウンドを行った。

段階希釈によって数え上げられたファージ感染されたＥＲ２７３８コロニーを計数し、ファージ力価を計算し、パニングラウンドあたりの出力力価／ｍｌ（ＣＦＵ／ｍｌ）を得た。ファージ出力力価における１．６Ｅ＋０４ＣＦＵ／ウェルから２．２Ｅ＋０７ＣＦＵ／ウェルへの１０００倍の増加が、３ラウンドのパニング後に得られた。各ラウンドによるファージ出力／入力力価の比率を図１Ａに示す。各パニングラウンドについて、ファージ出力／入力力価の比率をｙ軸上に示す。３ラウンドのパニングにわたって陽性クローンの明白な強化があった。結合クローンがライブラリの主要な集団になったため、第３のパニングラウンドにより、第１のラウンドと比較してファージ出力／入力力価の比率は１００倍に増加した。

通常の選択手順では、ＥＬＩＳＡプレートにおけるヒトフィブリンコーティングされたウェルに対する３ラウンドの抗原パニングの後、結合したファージ粒子のおよそ８０％が、コーティングされたフィブリンによるＥＬＩＳＡにおいてフィブリンに特異的に結合した。

実施例３：ヒトフィブリンに特異的なファージディスプレイされたｓｃＦｖの単一コロニーＥＬＩＳＡ分析
選択ｓｃＦｖ遺伝子をそのファージミドにそれぞれ保有する単一クローンファージで感染された大腸菌株ＥＲ２７３８を、ディープウェル中で２ＹＴブロス（１６ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中で１００μｇ／ｍｌアンピシリンと共に３７℃で振とうして対数増殖期中期に増殖させた。ブロスが１．０のＯＤ_６００に達した後、ＩＰＴＧを最終濃度１μｇ／ｍｌまで添加した。プレートを強く振とうしながら３７℃で一晩インキュベートした。その後、プレートを４０００ｇで１５分間４℃で遠心分離した。

可溶性ｓｃＦｖ結合試験に対して、ＥＬＩＳＡを実施した。簡潔には、９６－ウェルマキシソープ９６－ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社）をフィブリン（ウェルあたり０．５μｇ／１００μＬのＰＢＳ）又は陰性コントロール抗原であるヒトフィブリノーゲンで４℃で１８時間振とうしながらコーティングした。ブロッキングバッファの３００μＬで１時間処置した後、上清に分泌された１００μＬのｓｃＦｖを１００μＬのブロッキングバッファと混合してから、コーティングされたプレートにさらに１時間添加した。ヤギ抗Ｅ－ｔａｇ抗体（Ａｂｃａｍ社、カタログ番号ＡＢ１９４００、ＨＲＰ標識、１：４０００）をプレートに１時間添加した。ＴＭＢ基質（ウェルあたり５０μＬ）を各ウェルに添加し、１ＮのＨＣｌ（ウェルあたり５０μＬ）を添加することによって反応を停止した後、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。各ウェルに対するＯＤ_４５０を測定して各ｓｃＦｖクローンのフィブリン又はフィブリノーゲンへの結合親和性を決定した。各ｓｃＦｖクローンについて、フィブリンに関するＯＤ_４５０値をフィブリノーゲンに関するＯＤ_４５０値で除算して、上記ｓｃＦｖの、フィブリノーゲンよりもフィブリンへの選択的結合を表すＯＤ_４５０比率を得た。単一コロニーＥＬＩＳＡ分析では、第３のパニングラウンド後の合計１９２個のファージクローンについて本分析を行った。その中で、１０より大きいＯＤ_４５０比率でフィブリンに結合した１２個のｓｃＦｖクローンを、そのｓｃＦｖコード遺伝子を配列決定することによってさらに特徴づけた。６個の異なるＤＮＡ配列が同定された。図１Ｂに、ｓｃＦｖクローンＤ１０のＥＬＩＳＡ結果を示す。１．３のＯＤ_４５０でヒトフィブリンに結合するｓｃＦｖクローンＤ１０のアミノ酸配列を配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ：）４に示す。

選択の追加ラウンドを、上記のプロトコルに続けて実施した。今回は、９．３Ｅ＋０４ＣＦＵ／ウェルから４．５Ｅ＋０７ＣＦＵ／ウェルへのファージ出力力価の１０００倍の増加を、３ラウンドのパニング後に得た。結合クローンがライブラリの主要な集団となったため、第３のパニングラウンドにより、ファージ出力／入力力価の比率は第１のラウンドよりも１３０倍になった。第３のパニングラウンド後の合計１９２個のファージクローンについて本分析を行った。その中で、１０より大きいＯＤ_４５０比率でフィブリンに結合した１８個のｓｃＦｖクローンを、そのｓｃＦｖコード遺伝子を配列決定することによってさらに特徴付けた。４個の異なるＤＮＡ配列を同定し、これら４個のクローンのＯＤ_４５０データ及び配列を以下の表１にまとめた。

最も高いＯＤ_４５０比を有するｓｃＦｖである３Ｄ５ｓｃＦｖについてその後の分析を行い、ファージディスプレイされた３Ｄ５ｓｃＦｖのアミノ酸配列を配列番号５に示す。

実施例４：組換え抗フィブリン１０２－１０抗体及び抗フィブリン３Ｄ５抗体の調製
ヒトフィブリンに特異的な３Ｄ５抗体のＶ_Ｌ及びＶ_Ｈフラグメントを、発現のためにｐＧ１Ｋ発現ベクターに配置した。全長抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号８及び９に示す。

１０２－１０抗体（日本特許出願公開第２０１２－７２号）のＶ_Ｌ及びＶ_Ｈフラグメントを、発現のためにｐＧ１Ｋ発現ベクターに配置した。全長抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号６及び７に示す。

哺乳動物発現システムを使用して組換え抗体を調製するために、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞株に基づく過剰発現システムを使用した。システムは、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞株、カチオン性脂質ベースのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションエンハンサー１及び２からなるＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキット（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カールスバッド、米国）、並びに発現システム（Ｇｉｂｃｏ社、ニューヨーク、米国）の一部である培地を採用した。

Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ発現培地中に２．０×１０^６生細胞／ｍｌの密度で播種し、トランスフェクション前に１８～２４時間維持して、トランスフェクション時に細胞が活発に分裂していることを確実なものとした。トランスフェクション時に、２リットルのエルレンマイヤー振とうフラスコにおける２５５ｍｌの培地中の７．５×１０^８個の細胞をＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクション試薬によってトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、トランスフェクション後１６～１８時間、オービタルシェーカー（１２５ｒｐｍ）において３７℃でインキュベートし、細胞をＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションエンハンサー１及びエンハンサー２に添加して振とうフラスコに添加してから、５～６日間インキュベートした。培養上清を収集し、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィを使用して培地中の抗体を精製した。

実施例５：１０２－１０及び３Ｄ５抗体の、ヒトフィブリノーゲン、フィブリン、及びヒト第ＸＩＩＩａ因子によって処置された架橋フィブリンへの結合のＥＬＩＳＡ分析
１０２－１０及び３Ｄ５抗体の、ヒトフィブリノーゲン、フィブリン及び架橋フィブリンへの結合能力を試験するためにＥＬＩＳＡ分析を行った。

フィブリンコーティングされたプレートを調製するために、ＰＢＳで希釈したヒトフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ社）を１００μＬ／ウェルで９６－ウェルポリスチレンマイクロプレートに添加し、プレートを封止して４℃で一晩放置した。

各フィブリンプレートを以下のように調製した。最終濃度１．０Ｕ／ｍＬのトロンビン（Ｓｉｇｍａ社）、２ｍＭのＣａＣｌ及び７ｍＭのＬ－システイン（Ｍｅｒｃｋ社）を含むＴＢＳ１００μＬをフィブリノーゲンプレートのウェルに添加し、そしてそれをＴＢＳで洗浄し、バッファ（５％脱脂粉乳／ＰＢＳ）でブロッキングした。ブロッキング後、１００μＬの抗体を各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。そして、プレートを３回洗浄し、１／５０００に希釈したＨＲＰ標識タンパク質Ｌをウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、１００μＬのＴＭＢ基質バッファを添加した。５分後、１ＭのＨＣｌで発色を停止した。光学密度（ＯＤ）を、マイクロプレートリーダを使用して４５０ｎｍで測定した。

ＥＬＩＳＡの結果は、図２にまとめられ、３Ｄ５抗体が１０２－１０抗体よりも強くヒトフィブリン又は架橋フィブリンに結合可能であることを示す。

実施例６：レテプラーゼ及びヒトフィブリンに特異的な１０２－１０ｓｃＦｖをＶ_Ｌ－２１８リンカー－Ｖ_Ｈ構成中に含むポリペプチドの調製
フレキシブルリンカー（配列番号１５、以下、フレキシブルリンカー）を介して１０２－１０ｓｃＦｖのＮ末端にレテプラーゼを融合することによって（レテプラーゼ）－１０２－１０ｓｃＦｖポリペプチドを構成した。１０２－１０ｓｃＦｖは、Ｖ_Ｌ－リンカー－Ｖ_Ｈの配向性を有し、２個のドメインを親水性２１８リンカーであるＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１６）によって接続した。組換えポリペプチドの配列を、配列番号１０に示す。

本（レテプラーゼ）－（１０２－１０ｓｃＦｖ αフィブリン）ポリペプチドの構成を以下に示す。

実施例７：Ｅｘｐｉ２９３Ｆ過剰発現システムによる組換え（レテプラーゼ）－（ｓｃＦｖ αフィブリン）の発現及び精製
ｓｃＦｖをコードする配列をｐｃＤＮＡ３発現カセットに配置した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞における構築遺伝子の発現及び発現ポリペプチドの精製を、前述の実施例で説明したプロトコルを使用して実施した。

新規構築物の特徴付けを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して実施した。図３での１０％非還元ＳＤＡ－ＰＡＧＥの結果は、組換え（レテプラーゼ）－（１０２－１０ｓｃＦｖ αフィブリン）タンパク質（レーン２）が約７１ｋＤａで主要なバンドを有し、予想されるサイズと一致していることを示す。

実施例８：レテプラーゼ及びヒトフィブリンに特異的な３Ｄ５ｓｃＦｖをＶ_Ｌ－フレキシブルリンカー－Ｖ_Ｈ構成中に含むポリペプチドの調製
フレキシブルリンカーを介してヒトフィブリンに特異的な３Ｄ５ｓｃＦｖのＮ末端にレテプラーゼを融合することによって組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５Ｖ_Ｌ－フレキシブルリンカー－Ｖ_ＨｓｃＦｖ αフィブリン）タンパク質を構成した。

ｓｃＦｖはＶ_Ｌ－リンカー－Ｖ_Ｈの配向性を有し、２個のドメインをフレキシブルリンカーによって接続した。組換えポリペプチドの配列を配列番号１１に示す。新規構築物の特徴付けを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して実施した。図３での１０％非還元ＳＤＡ－ＰＡＧＥの結果は、レーン１のサンプルが約７１ｋＤａで予想生成物を有することを示すが、予想外の分解生成物も約５５ｋＤａで見られた。

実施例９：レテプラーゼ及びヒトフィブリンに特異的な３Ｄ５ｓｃＦｖをＶ_Ｌ－２１８リンカー－Ｖ_Ｈ構成中に含むポリペプチドの調製
フレキシブルリンカーを介してヒトフィブリンに特異的な３Ｄ５ｓｃＦｖのＮ末端にレテプラーゼを融合することによって組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５Ｖ_Ｌ－２１８－Ｖ_ＨｓｃＦｖ αフィブリン）タンパク質（以下、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ））を構成した。

ｓｃＦｖは、Ｖ_Ｌ－リンカー－Ｖ_Ｈの配向性を有し、２個のドメインを親水性の２１８リンカーによって接続した。組換えポリペプチドの配列を、配列番号１２に示す。新規構築物の特徴付けを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して実施した。図４での１０％非還元ＳＤＡ－ＰＡＧＥの結果は、新規構築物の組換え鎖（レーン１及びレーン２）が約７１ｋＤａのサイズを有し、予想されるサイズと一致することを示す。この実施例で調製されたレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）は前述の実施例のレテプラーゼ－（３Ｄ５Ｖ_Ｌ－フレキシブルリンカー－Ｖ_ＨｓｃＦｖ αフィブリン）ポリペプチドよりも安定であるため、以下の実施例では、本レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）についてさらなる分析を行った。

実施例１０：Ｅｘｐｉ２９３Ｆ過剰発現システムを使用した組換えレテプラーゼ－ＩｇＧ４．Ｆｃタンパク質の調製
フレキシブルなヒンジ領域を介してＩｇＧ４．ＦｃのＣＨ２ドメインのＮ末端にレテプラーゼを融合することによってレテプラーゼ－ＣＨ２－ＣＨ３（ヒトγ４）組換え鎖を構成した。ＩｇＧ４．Ｆｃポリペプチドにおける組換え鎖の配列を配列番号１３に示す。

Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞における発現ポリペプチドの構築遺伝子の発現を、前述の実施例で説明するように行った。

実施例１１：ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用したレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）の安定性分析
保存後のレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）の安定性を評価するために、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）を４℃で３、６及び３０日間保存してから、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＥＬＩＳＡ分析を行った。

１０％の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果は、図５Ａ及び５Ｂにまとめられ、組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドが少なくとも１か月間安定であることを示す。

保存されたレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドのヒトフィブリンへの結合能力を試験するために、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。

９６－ウェルポリスチレンマイクロプレートを、ＰＢＳバッファ（１００μＬ／ウェル）中のヒトフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ社）（２０μｇ／ｍＬ）でコーティングした。４℃で一晩インキュベートした後、コーティングされたウェルをＰＢＳバッファで洗浄した。ヒトフィブリンの架橋結合を誘発させるために、コーティングされたウェルを、２ｍＭのＣａＣｌ_２及び７ｍＭのＬ－シスチン（Ｍｅｒｃｋ社）を有するＴＢＳバッファ中で最終濃度１Ｕ／ｍＬのヒトα－トロンビン（Ｓｉｇｍａ社）と共に３７℃で１時間インキュベートした。ブロッキングバッファ（５％脱脂粉乳／ＰＢＳ）でウェルをブロッキングした後、最終濃度０．１、１及び１０μｇ／ｍＬのレテプラーゼ－（３Ｄ５－ｓｃＦｖ）１００μＬを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、プレートを３回洗浄し、１／５０００に希釈したＨＲＰ標識タンパク質Ｌをウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、１００μＬの３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質バッファを添加した。５分後、１ＭのＨＣｌで発色を停止した。光学密度（ＯＤ）をマイクロプレートリーダ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社）を使用して４５０ｎｍで測定し、データをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して処理した。

第ＸＩＩＩａ因子で処置された架橋フィブリンプレートの調製に関して、コーティングする手順を、フィブリンコーティングされたプレートに関して説明した手順と同様とした。簡潔には、ＰＢＳで希釈したヒト由来のフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ社）を１００μＬ／ウェルで９６－ウェルポリスチレンマイクロプレートに添加してから、プレートを封止して４℃で一晩放置した。

各フィブリンプレートを以下のように調製した。最終濃度１．０Ｕ／ｍＬのトロンビン（Ｓｉｇｍａ社）、ウェルあたり０．５５μｇの第ＸＩＩＩａ因子（Ｚｅｄｉｒａ社、ダルムシュタット、ドイツ）、２ｍＭのＣａＣｌ_２及び７ｍＭのＬ－システイン（Ｍｅｒｃｋ社）を含む１００μＬのＴＢＳをフィブリノーゲンプレートのウェルに添加し、そしてそれをＴＢＳで洗浄し、バッファ（５％脱脂粉乳／ＰＢＳ）でブロッキングした。

組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドを、ＨＲＰ標識タンパク質Ｌを使用して検出した。ＥＬＩＳＡの結果は、図５Ｃにまとめられ、指定された保存期間後であっても、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）は依然としてヒトフィブリン及び架橋フィブリンに特異的に結合可能であることを示す。

実施例１２：（レテプラーゼ）－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドのヒトフィブリン及び架橋フィブリン結合のＥＬＩＳＡ分析。
組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドのヒトフィブリン結合能力の用量依存性を調査するために、ＥＬＩＳＡアッセイに着手した。

ＥＬＩＳＡ分析の手順を、前述の実施例で説明した手順と同様とした。簡潔には、ＰＢＳで希釈したマウス由来のフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ社）を、１００μＬ／ウェルで９６－ウェルポリスチレンマイクロプレートに添加してから、プレートを封止して４℃で一晩放置した。

各フィブリンプレートを以下のように調製した。最終濃度１．０Ｕ／ｍＬのトロンビン（Ｓｉｇｍａ社）、２ｍＭのＣａＣｌ_２及び７ｍＭのＬ－システイン（Ｍｅｒｃｋ社）を含む１００μＬのＴＢＳをフィブリノーゲンプレートのウェルに添加し、そしてそれをＴＢＳで洗浄し、バッファ（５％脱脂粉乳／ＰＢＳ）でブロッキングした。その後、種々の最終濃度（６００ｎＭ、２００ｎＭ、６６ｎＭ、２２ｎＭ、７．４ｎＭ、２．５ｎＭ及び０．８ｎＭ）のレテプラーゼ－（３Ｄ５－ｓｃＦｖ）１００μＬを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。そして、プレートを３回洗浄し、１／５０００に希釈したＨＲＰ標識タンパク質Ｌをウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、１００μＬのＴＭＢ基質バッファを添加した。５分後、１ＭのＨＣｌで発色を停止した。光学密度（ＯＤ）を、マイクロプレートリーダを使用して４５０ｎｍで測定した。

組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドを、ＨＲＰ標識タンパク質Ｌを使用して検出した。図６にまとめたＥＬＩＳＡの結果は、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドがヒトフィブリン及び架橋フィブリンに特異的に結合することを示すが、それはフィブリンに対するよりも架橋フィブリンに対してより強い結合能力を有する。

実施例１３：組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドのマウスフィブリン結合のＥＬＩＳＡ分析
組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドのマウスフィブリンへの結合能力をＥＬＩＳＡによって確認するために、マウスフィブリンでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを調製した。

マウスフィブリンプレートを調製するために、コーティングの手順を、ヒトフィブリンコーティングプレートに関して説明した手順と同様とした。簡潔には、ＰＢＳで希釈したマウス由来のフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ社）を、１００μＬ／ウェルで９６－ウェルポリスチレンマイクロプレートに添加し、プレートを封止して４℃で一晩放置した。

各フィブリンプレートを以下のように調製した。最終濃度１．０Ｕ／ｍＬのトロンビン（Ｓｉｇｍａ社）、２ｍＭのＣａＣｌ_２及び７ｍＭのＬ－システイン（Ｍｅｒｃｋ社）を含む１００μＬのＴＢＳをフィブリノーゲンプレートのウェルに添加し、そしてそれをＴＢＳで洗浄し、バッファ（５％脱脂粉乳／ＰＢＳ）でブロッキングした。その後、最終濃度２００ｎＭのレテプラーゼ－（３Ｄ５－ｓｃＦｖ）１００μＬを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。そして、プレートを３回洗浄し、１／５０００に希釈したＨＲＰ標識タンパク質Ｌをウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、１００μＬのＴＭＢ基質バッファを添加した。５分後、１ＭのＨＣｌで発色を停止した。光学密度（ＯＤ）を、マイクロプレートリーダを使用して、４５０ｎｍで測定した。

ゾレア（Ｘｏｌａｉｒ）はＩｇＥに対する抗体であり、ここでは陰性コントロールとして使用された。組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチド及びレテプラーゼを、ＨＲＰ標識タンパク質Ｌを使用して検出した。図７にまとめたＥＬＩＳＡの結果は、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）が、マウスフィブリノーゲンにではなく、マウスフィブリンに特異的に結合することを示す。

実施例１４：遊離フィブリノーゲン存在下での組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドのヒトフィブリン結合のＥＬＩＳＡ分析
２００ｍｇ／ｄｌ又は４００ｍｇ／ｄｌのヒトフィブリノーゲン存在下での組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドのヒトフィブリンへの結合能力を査定するためにＥＬＩＳＡ分析を行い、手順を前述の実施例で説明したものと同様とした。

簡潔には、ＰＢＳで希釈したヒトフィブリノーゲンを、１００μＬ／ウェルで９６－ウェルポリスチレンマイクロプレートに添加してから、プレートを封止して４℃で一晩放置した。

各フィブリンプレートを以下のように調製した。最終濃度１．０Ｕ／ｍＬのトロンビン（Ｓｉｇｍａ社）、２ｍＭのＣａＣｌ_２及び７ｍＭのＬ－システイン（Ｍｅｒｃｋ社）を含む１００μＬのＴＢＳをフィブリノーゲンプレートのウェルに添加し、そしてそれをＴＢＳで洗浄し、バッファ（５％脱脂粉乳／ＰＢＳ）でブロッキングした。その後、最終濃度２００ｍｇ／ｄｌ又は４００ｍｇ／ｄｌのヒトフィブリノーゲンと混合された最終濃度２００ｎＭのレテプラーゼ－（３Ｄ５－ｓｃＦｖ）１００μＬを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。そして、プレートを３回洗浄し、１／５０００に希釈したＨＲＰ標識タンパク質Ｌをウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、１００μＬのＴＭＢ基質バッファを添加した。５分後、１ＭのＨＣｌで発色を停止した。光学密度（ＯＤ）を、マイクロプレートリーダを使用して４５０ｎｍで測定した。

組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチド及びレテプラーゼを、ＨＲＰ標識タンパク質Ｌを使用して検出した。図８にまとめたＥＬＩＳＡの結果は、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドが、最終濃度２００ｍｇ／ｄｌ又は４００ｍｇ／ｄｌでの遊離フィブリノーゲン存在下で、ヒトフィブリンに特異的に結合することを示す。

実施例１５：ＰＢＳ又はヒト血清における組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドの血栓溶解活性
血栓溶解活性を試験するために、全血血栓溶解プレートアッセイを行った。簡潔には、ヒト血液を、健常な被験者から、静脈穿刺により、最終濃度３．２％ｗ／ｖのクエン酸三ナトリウムに回収した。凝塊形成をトロンビンで誘発させた。凝固混合物を、トロンビン（最終濃度６．２５×１０^－３Ｕ）及びＨＥＰＥＳバッファ（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭのＮａＣｌ）中の最終濃度６７ｍＭの塩化カルシウムから新たに調製した。５μＬの凝固混合物を、９６－ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ社）のウェルの下端に沈着させ、続いて２５μＬの血液を添加した。そして、プレートを封止して３７℃で１時間インキュベートし、ウェルの端の周辺に凝血塊を形成した。

レテプラーゼ－ＩｇＧ４．Ｆｃ及びレテプラーゼ－（３Ｄ５－ｓｃＦｖ）を７０μＬのＰＢＳに希釈した。７０μＬのサンプルを、マルチチャンネルピペットにより室温で３分間にわたって、ヒト凝塊を含むウェルに同時に添加した。サンプルを除去した後、ヒト血清又はＰＢＳの７０μＬをウェルに添加し、溶解した凝塊からの血液が徐々にウェルの中心を覆うときに５１０ｎｍでの吸光度を測定することによって、マイクロプレートリーダ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社）を使用してヒト凝塊の分解を特定した。データをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して処理した。

図９にまとめた血栓溶解アッセイの結果は、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）がＰＢＳ中よりもヒト血清中でより優れた血栓溶解活性を有することを示す。

実施例１６：最終濃度１ｍＭの組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドの血栓溶解活性
レテプラーゼ－ＩｇＧ４．Ｆｃ及びレテプラーゼ－（３Ｄ５－ｓｃＦｖ）を７０μＬのＰＢＳに最終濃度１ｎＭで希釈した。７０μＬのサンプルを、マルチチャンネルピペットにより室温で３分間にわたって、ヒト凝塊を含むウェルに同時に添加した。サンプルを除去した後、７０μＬのヒト血清をウェルに添加し、溶解した凝塊からの血液が徐々にウェルの中心を覆うときに５１０ｎｍでの吸光度を測定することによって、マイクロプレートリーダ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社）を使用してヒト凝塊の分解を特定した。データをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して処理した。

図１０にまとめた血栓溶解アッセイの結果は、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）がレテプラーゼ－ＩｇＧ４．Ｆｃよりも最終濃度１ｍＭで優れた血栓溶解活性を有することを示す。

実施例１７：組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドの標的効果
レテプラーゼ－ＩｇＧ４．Ｆｃ及びレテプラーゼ－（３Ｄ５－ｓｃＦｖ）を７０μＬのＰＢＳに最終濃度３０ｎＭで希釈した。７０μＬのサンプルを、マルチチャンネルピペットにより室温で３分間にわたって、ヒト凝塊を含むウェルに同時に添加した。サンプルを除去し、凝塊を２５０μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、７０μＬのヒト血清をウェルに添加し、溶解した凝塊からの血液が徐々にウェルの中心を覆うときに５１０ｎｍでの吸光度を測定することによって、マイクロプレートリーダ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社）を使用してヒト凝塊の分解を特定した。データをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して処理した。

図１１にまとめたアッセイの結果は、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）がヒト凝塊を標的とし、洗浄処置後であってもなお所望の血栓溶解活性を示すことを示す。これに対して、コントロールタンパク質であるレテプラーゼ－ＩｇＧ４．Ｆｃは、洗浄処理後に標的機能を示さず、血栓溶解活性をほとんど示さない。

実施例１８：組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドの用量依存的な血栓溶解活性
レテプラーゼ－（３Ｄ５－ｓｃＦｖ）ポリペプチドを７０μＬのＰＢＳに最終濃度５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ及び３０ｎＭで希釈し、レテプラーゼ－ＩｇＧ４．Ｆｃを７０μＬのＰＢＳに最終濃度３０ｎＭで希釈した。７０μＬのサンプルを、マルチチャンネルピペットにより室温で３分間にわたって、ヒト凝塊を含むウェルに同時に添加した。サンプルを除去し、凝塊を２５０μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、７０μＬのヒト血清をウェルに添加し、溶解した凝塊からの血液が徐々にウェルの中心を覆うときに５１０ｎｍでの吸光度を測定することによって、マイクロプレートリーダ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社）を使用してヒト凝塊の分解を特定した。データをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して処理した。

図１２にまとめたアッセイの結果は、本レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）がヒト凝塊を標的とし、５ｎＭという低い濃度であっても所望の血栓溶解活性を示すことを示す。一方、レテプラーゼ－ＩｇＧ４．Ｆｃは、３０ｎＭの濃度であっても血栓溶解活性を有していなかった。

実施例１９：組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチド及びレテプラーゼのヒト凝塊に対する用量依存的な血栓溶解活性
組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチド及びレテプラーゼ（ＭＩＲｅｌ（登録商標）、ＲｅｌｉａｎｃｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ社から購入）のヒト凝塊に対する血栓溶解活性を比較するために、前述の実施例で説明したものと同様の手順で全血血栓溶解アッセイを行った。

レテプラーゼ及びレテプラーゼ－（３Ｄ５－ｓｃＦｖ）ポリペプチドを７０μＬのＰＢＳに最終濃度５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ及び３０ｎＭで希釈した。７０μＬのサンプルを、マルチチャンネルピペットにより室温で３分間にわたって、ヒト凝塊を含むウェルに同時に添加した。サンプルを除去し、凝塊を２５０μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、７０μＬのヒト血清をウェルに添加し、溶解した凝塊からの血液が徐々にウェルの中心を覆うときに５１０ｎｍでの吸光度を測定することによって、マイクロプレートリーダ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社）を使用してヒト凝塊の分解を特定した。データをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して処理した。

図１３Ａ及び１３Ｂのアッセイの結果は、レテプラーゼ（図１３Ａ）及びレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチド（図１３Ｂ）が、ヒト血漿において１０ｎＭ、３０ｎＭ及び９０ｎＭの濃度で血栓溶解活性を示すことを示す。

図１３Ｃにまとめたアッセイの結果は、組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドが、ヒト血漿において１０ｎＭ、３０ｎＭ及び９０ｎＭの濃度でレテプラーゼよりも優れた血栓溶解活性を示すことを示す。

実施例２０：組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドのサル凝塊に対する血栓溶解活性
サル血液はＮａｔｉｏｎａｌＤｅｆｅｎｓｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（台北、台湾）から購入した。サル凝塊形成をヒトトロンビンで誘発させ、手順を前述の実施例で説明したものと同様とした。簡潔には、凝固混合物を、トロンビン（最終濃度６．２５×１０^－３Ｕ）及びＨＥＰＥＳバッファ（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭのＮａＣｌ）中の最終濃度６７ｍＭの塩化カルシウムから新たに調製した。５μＬの凝固混合物を、９６－ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ社）のウェルの下端に沈着させ、続いて２５μＬの血液を添加した。そして、プレートを封止して３７℃で１時間インキュベートし、ウェルの端の周辺にサル凝血塊を形成した。

レテプラーゼ－（３Ｄ５－ｓｃＦｖ）を７０μＬのＰＢＳに希釈した。７０μＬのサンプルを、マルチチャンネルピペットにより室温で３分間にわたって、サル凝塊を含むウェルに同時に添加した。サンプルを除去した後、ヒト血漿又はＰＢＳの７０μＬをウェルに添加し、溶解した凝塊からの血液が徐々にウェルの中心を覆うときに５１０ｎｍでの吸光度を測定することによって、マイクロプレートリーダ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社）を使用してサル凝塊の分解を特定した。データをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して処理した。

図１４Ａにまとめた血栓溶解アッセイの結果は、本レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドが、１０ｎＭ、２０ｎＭ及び３０ｎＭの濃度で、ＰＢＳ中のサル凝塊を溶解可能であることを示す。

図１４Ｂにまとめた血栓溶解アッセイの結果は、本レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドが、１０ｎＭ、２０ｎＭ及び３０ｎＭの濃度で、ヒト血漿中のサル凝塊を溶解可能であることを示す。

実施例２１：組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチド及びアルテプラーゼのヒトフィブリン結合親和性
組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチド及びアルテプラーゼ（ＡＣＴＩＬＹＳＥ（登録商標）、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＩｎｇｅｌｈｅｉｍ社から購入）のヒトフィブリンへの結合親和性を比較するためにＥＬＩＳＡ分析を行い、手順を前述の実施例で説明したものと同様とした。簡潔には、ＰＢＳで希釈したヒトフィブリノーゲンを、１００μＬ／ウェルで９６－ウェルポリスチレンマイクロプレートに添加してから、プレートを封止して４℃で一晩放置した。

各フィブリンプレートを、以下のように調製した。最終濃度１．０Ｕ／ｍＬのトロンビン（Ｓｉｇｍａ社）、２ｍＭのＣａＣｌ_２及び７ｍＭのＬ－システイン（Ｍｅｒｃｋ社）を含む１００μＬのＴＢＳをフィブリノーゲンプレートのウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートし、そしてそれをＴＢＳで洗浄し、バッファ（５％脱脂粉乳／ＰＢＳ）でブロッキングした。その後、最終濃度２、２０又は２００ｎＭのレテプラーゼ－（３Ｄ５－ｓｃＦｖ）又はアルテプラーゼ１００μＬを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。そして、プレートを３回洗浄してから、１／２００に希釈したＨＲＰ標識抗レテプラーゼウサギポリクローナル抗体をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、１００μＬのＴＭＢ基質バッファを添加した。５分後、１ＭのＨＣｌで発色を停止した。光学密度（ＯＤ）を、マイクロプレートリーダを使用して４５０ｎｍで測定した。

組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチド及びアルテプラーゼを、ＨＲＰ標識抗レテプラーゼウサギポリクローナル抗体によって検出した。図１５にまとめたＥＬＩＳＡの結果は、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドはヒトフィブリンに特異的に結合可能であり、アルテプラーゼはヒトフィブリンへの結合活性を有していなかったことを示す。

実施例２２：組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチド、アルテプラーゼ及びレテプラーゼのヒト凝塊に対する血栓溶解活性
組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチド、アルテプラーゼ及びレテプラーゼのヒト凝塊に対する血栓溶解活性を比較するために、全血血栓溶解アッセイを行い、手順は前述の実施例で説明したものと同様とした。

レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドを７０μＬのＰＢＳに希釈した。７０μＬのサンプルを、マルチチャンネルピペットにより室温で３分間にわたって、サル凝塊を含むウェルに同時に添加した。サンプルを除去した後、ヒト血漿又はＰＢＳの７０μＬをウェルに添加し、溶解した凝塊からの血液が徐々にウェルの中心を覆うときに５１０ｎｍでの吸光度を測定することによって、マイクロプレートリーダ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社）を使用してヒト凝塊の分解を特定した。データをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して処理した。

図１６Ａ及び図１６Ｂにまとめた血栓溶解アッセイの結果は、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドがヒト凝塊に対する血栓溶解活性をＰＢＳ及びヒト血漿においてそれぞれ有したことを示す。

実施例２３：組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチド及びアルテプラーゼのタンパク質分解活性の動態
レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチド及びアルテプラーゼのタンパク質分解活性の動態を調査するために、組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチド及びアルテプラーゼによって触媒されるプラスミノーゲンのプラスミンへの変換による発色性アッセイを行った。簡潔には、種々の濃度（０．１、０．２、０．４、０．８、１．６、３．２及び６．４ｍＭ）の発色性基質ＣＨ_３ＳＯ_２－Ｄ－ヘキサヒドロチロシン－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐ－ニトロアニリド・ＡｃＯＨ（Ｓｉｇｍａ社）及びレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチド又はアルテプラーゼを含むサンプルを、９６－ウェル平底プレート（Ｎｕｎｃ社）において２５℃で１５分間インキュベートした。レテプラーゼのタンパク質分解活性は基質の加水分解をもたらし、黄色の遊離ｐ－ニトロアニリンの放出を、プレートリーダを使用して４０５ｎｍで測定した。

図１７Ａは、指定された基質濃度での本組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチド及びアルテプラーゼのタンパク質分解活性を示す折れ線グラフである。図１７Ｂは、図１７Ａにおけるデータから導出されたデータポイントで作成した二重逆数プロット（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋプロット）であり、そしてそのプロテアーゼ活性の［Ｋｍ］、［Ｖｍａｘ］及び［Ｋｃａｔ］値はＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋプロットから計算可能である。アルテプラーゼの［Ｋｍ］、［Ｖｍａｘ］及び［Ｋｃａｔ］値はそれぞれ０．３６ｍＭ、１５５ｎＭ／ｍｉｎ及び０．７７５である一方で、組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドの［Ｋｍ］、［Ｖｍａｘ］及び［Ｋｃａｔ］値はそれぞれ０．４１ｍＭ、１７０ｎＭ／ｍｉｎ及び０．８５である。これらのデータは、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチド及びアルテプラーゼの双方が発色性基質に対して同様のタンパク質分解活性を有することを示す。

実施例２４：組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドのヒト血漿における安定性分析
レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドのヒト血漿における安定性を評価するために、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドを１０又は２０％のヒト血漿中で３、６及び２４時間インキュベートしてから、ＥＬＩＳＡ分析を実施した。

フィブリンコーティングされたプレートを調製し、プロトコルを前述の実施例で説明したものと同様とした。簡潔には、９６－ウェルマイクロプレートを、ＰＢＳバッファ（１００μＬ／ウェル）中のヒトフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ社）（２０μｇ／ｍＬ）でコーティングした。４℃で一晩インキュベートした後、コーティングされたウェルをＰＢＳバッファで洗浄した。ヒトフィブリンの架橋結合を誘発させるために、コーティングされたウェルを、２ｍＭのＣａＣｌ_２及び７ｍＭのＬ－シスチン（Ｍｅｒｃｋ社）を含むＴＢＳバッファ中で最終濃度１Ｕ／ｍＬのヒトα－トロンビン（Ｓｉｇｍａ社）と共に３７℃で１時間インキュベートした。ブロッキングバッファでウェルをブロッキングした後、１０％又は２０％のヒト血漿中で３、６及び２４時間インキュベートした１００μＬのレテプラーゼ－（３Ｄ５－ｓｃＦｖ）ポリペプチドを各ウェルにそれぞれ添加してから、プレートを室温で１時間インキュベートした。その後、プレートを３回洗浄し、１／２００に希釈したＨＲＰ標識抗レテプラーゼウサギポリクローナル抗体をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、１００μＬのＴＭＢ基質バッファを添加した。５分後、１ＭのＨＣｌで発色を停止した。光学密度（ＯＤ）をマイクロプレートリーダ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を使用して４５０ｎｍで測定し、データをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して処理した。

ＥＬＩＳＡの結果は、図１８にまとめられ、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）が１０％又は２０％のヒト血漿存在下において安定であることを示す。

実施例２５：凝塊を移植されたマウスモデルにおける組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドの標的効果
ヒト凝塊を移植されたマウスモデルにおける組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドの標的効果を調査するために、ＩＶＩＳイメージング分析を行った。マウスモデルに移植されたヒト凝塊をモニタリングするために、ヒト凝塊をマウスの血管に移植する前に、ＦＩＴＣラベリングキット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して製造元の指示に従ってヒト凝塊を標識した。ＦＩＴＣでラベリングされたヒト凝塊を３８４－ウェルマイクロプレート（Ａｘｙｇｅｎ社）において調製し、マウス下大静脈（ＩＶＣ）への移植に適切なサイズのヒト凝塊を形成した。簡潔には、ヒトフィブリノーゲンを、最終濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ色素でラベリングした。ＦＩＴＣでラベリングされたフィブリノーゲンを４μＬのヒト血液と混合した。そして、混合された血液サンプルを、トロンビン（最終濃度６．２５×１０^－３Ｕ）及びＨＥＰＥＳバッファ（２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、１３７ｍＭのＮａＣｌ）における最終濃度６７ｍＭの塩化カルシウムで処置した。その後、５μＬの混合された血液サンプルを３８４－ウェルマイクロプレートの各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートして、ヒト凝塊を形成させた。

注入されたタンパク質の位置をモニタリングするために、組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチド及びレテプラーゼの処置の前に、製造元の指示に従って、Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０抗体ラベリングキット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチド及びレテプラーゼを標識した。

８～１０週齢のＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスを、ＡｃａｄｅｍｉａＳｉｎｉｃａのＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＦａｃｉｌｉｔｙｏｆＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＯｒｇａｎｉｓｍｉｃＢｉｏｌｏｇｙ（台北、台湾）から購入した。ＦＩＴＣでラベリングされたヒト凝塊をマウス下大静脈（ＩＶＣ）に移植した。簡潔には、マウスをＯ_２におけるイソフルランで麻酔し、ヒートランプの下に置いて生理的体温を維持した。腹壁を削り、７０％変性エタノールで消毒した。正中開腹術を行ってからＦＩＴＣでラベリングされたヒト凝塊をＩＶＣに配置した。露出したＩＶＣを、ＩＶＩＳＳｐｅｃｔｒｕｍＩｎＶｉｖｏＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）において観察した。蛍光画像を、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅＳｏｆｔｗａｒｅＶ３．２を使用して、（ＦＩＴＣの検出に対して）ｅｘ／ｅｍ＝４５９／５２０又は（Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０の検出に対して）ｅｘ／ｅｍ＝６７５／７２０で撮影した。画像を、ＩＶＩＳＳｐｅｃｔｒｕｍｉｍａｇｅｒを使用して、指示された時点で撮影し、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェアで分析した。

マウスをグループあたり２匹のマウスにグループ化し、２５６ｎＭのＤｙｌｉｇｈｔ６８０標識レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチド（グループＡ）又はレテプラーゼ（グループＢ）の約５０μＬを、眼窩静脈洞から注入した。ヒト凝塊を移植されたマウスからの蛍光画像を、ＤｙＬｉｇｈｔ６８０標識タンパク質の投与後０、５、１０、２０及び３０分に取得した。

図１８Ａに、グループＡのマウスの５つのＩＶＩＳ画像を示し、パネル＃１及び＃２をｅｘ／ｅｍ＝６７５／７２０で撮影し、パネル＃３及び＃４をｅｘ／ｅｍ＝４９５／５２０で撮影し、パネル＃２及び＃４における蛍光信号を合成してパネル＃５を与えた。パネル＃３及び＃４の双方での緑色蛍光は、マウスにおけるＦＩＴＣでラベリングされたヒト凝塊の存在を示す。一方で、ポリペプチドを注入した時のＤｙｌｉｇｈｔ６８０標識レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）の直後（０分）は、注入後３０分ではパネル＃２での強い赤色蛍光が観察されたのに対して、パネル＃１での顕著な赤色蛍光はなかった。パネル＃５での合成画像において重複する赤色及び緑色の信号は、本Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０標識レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドが、移植されたヒト凝塊の周囲に集結していることを示す。

図１８Ｂに、グループＢのマウスの５つのＩＶＩＳ画像を示し、パネル＃１及び＃２をｅｘ／ｅｍ＝６７５／７２０で撮影し、パネル＃３及び＃４をｅｘ／ｅｍ＝４９５／５２０で撮影し、パネル＃２及び＃４における蛍光信号を合成してパネル＃５を与えた。図１８ＡのＩＶＩＳ画像と同様に、パネル＃３及び＃４の双方での緑色蛍光は、マウスにおけるＦＩＴＣでラベリングされたヒト凝塊の存在を示す。しかし、Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０標識レテプラーゼの投与時（パネル＃１）又は投与後３０分（パネル＃２）で、赤色蛍光は観察されなかった。パネル＃５の合成画像は、画像に緑色信号のみがあるため、Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０標識レテプラーゼが移植されたヒト凝塊の周囲に集結していないことを示す。

Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０でラベリングされたサンプルの蛍光レベルを放射効率（Ｒ．Ｅ．）の観点で定量化するために、指定された時点で撮影された画像の蛍光強度を、０分においてｅｘ／ｅｍ＝６７５／７２０で撮影された参照画像に対して正規化した。したがって、結果は、図１９Ｃにまとめられ、レテプラーゼはマウスモデルのＩＶＣ中のヒト凝塊を効果的に標的することが可能ではないのに対して、本レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）はマウスモデルのＩＶＣ中のヒト凝塊を標的可能であることを示す。

実施例２６：ＥＬＩＳＡによるラットにおける組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドの半減期
アルテプラーゼ、レテプラーゼ及び組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドの半減期を測定するために、ｉ．ｖ．投与後のラットにおいてＥＬＩＳＡアッセイを実施した。血清サンプル中のアルテプラーゼ、レテプラーゼ及び組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドのタンパク質レベルを、ＥＬＩＳＡ法を使用して定量した。６週齢のＷｉｓｔａｒラットを、ＢｉｏＬａｓｃｏ社（台北、台湾）から購入した。ラットをグループあたり３匹のラットにグループ化し、０．３６４ｍｇ／ｋｇの薬剤分子の約５００μＬを静脈内注入した。

ＥＬＩＳＡアッセイについて、コーティングされたプレートを以下のように調製した。最終濃度１．０μｇ／ｍｌの（ＬＴＫＢｉｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ株式会社、桃園、台湾によって生成された）抗レテプラーゼウサギポリクローナル抗体を含む１００μＬのＴＢＳをプレートのウェルに添加してから、プレートを４℃で１８時間インキュベートし、そしてそれをＴＢＳで洗浄し、バッファ（５％脱脂粉乳／ＰＢＳ）でブロッキングした。

その後、種々の希釈条件下で回収された１００μＬの血液サンプルを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。そして、プレートを３回洗浄し、１．６５μｇ／ｍｌのＨＲＰ標識化抗レテプラーゼウサギポリクローナル抗体１００μＬをウェルに添加してから、プレートを室温で１時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、１００μＬのＴＭＢ基質バッファを添加した。５分後、１ＭのＨＣｌで発色を停止した。光学密度（ＯＤ）を、マイクロプレートリーダを使用して４５０ｎｍで測定した。

図１９は、アルテプラーゼ、レテプラーゼ及び組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドの薬物動態プロファイルを示す。図１９に見られるように、本レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドは、アルテプラーゼ及びレテプラーゼと比較して、種々の時点でラット血清中でより高いタンパク質レベルを示す。これらのデータは、本組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドが、アルテプラーゼ又はレテプラーゼよりも長い半減期を有することを示す。

実施例２７：ラットにおける組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドの半減期
組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドの半減期を調査するために、追加のタンパク質分解アッセイを、ｉ．ｖ．投与後のラットにおいて実施した。組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドの血清レベルを、レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドのタンパク質分解活性の観点から決定し、プロトコルを前述の実施例に説明したものと同様とした。

６週齢のＷｉｓｔａｒラットを、ＢｉｏＬａｓｃｏ社（台北、台湾）から購入した。ラットをグループあたり３匹のマウスにグループ化し、０．３６４ｍｇ／ｋｇの組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチド又はアルテプラーゼの約５００μＬを静脈内注入した。血液サンプルを、ｉ．ｖ．投与１０、２０、４０及び１２０分後に回収した。

０．８ｍＭの発色性基質ＣＨ_３ＳＯ_２－Ｄ－ヘキサヒドロチロシン－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐ－ニトロアニリド・ＡｃＯＨ（Ｓｉｇｍａ社）及び各希釈血液サンプル（１／１０）を、９６－ウェル平底プレート（Ｎｕｎｃ社）において２５℃で１５分間インキュベートした。本レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）又はアルテプラーゼのタンパク質分解活性は基質の加水分解をもたらし、黄色の遊離ｐ－ニトロアニリンの放出を、プレートリーダを使用して４０５ｎｍで測定した。

図２０は、組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチド及びアルテプラーゼの薬物動態プロファイルを示す。図２０に見られるように、本レテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドは、アルテプラーゼが示すのと比較して、ラット血清中で顕著に高いタンパク質レベルを示す。前述を鑑み、本組換えレテプラーゼ－（３Ｄ５ｓｃＦｖ）ポリペプチドは、アルテプラーゼが有するよりも長い半減期を有し、それは前述の実施例での発見と一致する。

実施例２８：組換え（３Ｄ５ｓｃＦｖ）－レテプラーゼポリペプチドの調製
フレキシブルリンカーを介してレテプラーゼのＮ末端にヒトフィブリンに特異的な３Ｄ５ｓｃＦｖを融合することによって組換え（３Ｄ５Ｖ_Ｌ－（Ｇ４Ｓ）_３－Ｖ_ＨｓｃＦｖ αフィブリン）－レテプラーゼポリペプチドを構成した。構築遺伝子のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞における発現及び発現ポリペプチドの精製を、前述の実施例で説明したものと同様とした。

ｓｃＦｖはＶ_Ｌ－リンカー－Ｖ_Ｈの配向性を有し、２個のドメインをフレキシブルリンカーによって接続した。組換えポリペプチドの配列を配列番号１４に示す。新規構築物の特徴付けを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して実施した。図２１Ａにおける１０％非還元ＳＤＡ－ＰＡＧＥの結果は、＃２レーンのサンプルが約７１ｋＤａの分子量の予想生成物を有することを示す。

組換え（３Ｄ５ｓｃＦｖ）－レテプラーゼポリペプチドのヒトフィブリノーゲン及びフィブリンに対する結合親和性を比較するためにＥＬＩＳＡ分析を実施し、プロトコルを前述の実施例で説明したものと同様とした。

組換え（３Ｄ５ｓｃＦｖ）－レテプラーゼポリペプチドを、ＨＲＰ標識化抗レテプラーゼウサギポリクローナル抗体を使用して検出した。図２１ＢにまとめたＥＬＩＳＡの結果は、本（３Ｄ５ｓｃＦｖ）－レテプラーゼポリペプチドが、ヒトフィブリノーゲンに対してではなく、ヒトフィブリンに対して特異的に結合可能であることを示す。

実施例２９：組換え（３Ｄ５ｓｃＦｖ）－レテプラーゼポリペプチドのヒト凝塊に対する用量依存的な血栓溶解活性
組換え（３Ｄ５ｓｃＦｖ）－レテプラーゼポリペプチドのヒト凝塊に対する血栓溶解活性を評価するために、全血血栓溶解アッセイを行い、プロトコルを前述の実施例で説明したものと同様とした。

組換え（３Ｄ５ｓｃＦｖ）－レテプラーゼポリペプチドを、７０μＬのＰＢＳに最終濃度１２．５ｎＭ、２５ｎＭ及び５０ｎＭで希釈した。７０μＬのサンプルを、マルチチャンネルピペットにより室温で３分間にわたって、ヒト凝塊を含むウェルに同時に添加した。サンプルを除去し、凝塊を２５０μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、７０μＬのヒト血清をウェルに添加し、溶解した凝塊からの血液が徐々にウェルの中心を覆うときに５１０ｎｍでの吸光度を測定することによって、マイクロプレートリーダ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社）を使用してヒト凝塊の分解を特定した。データをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して処理した。

図２２にまとめたアッセイの結果は、（３Ｄ５ｓｃＦｖ）－レテプラーゼポリペプチドがヒト凝塊を標的とし、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ及び５０ｎＭの濃度で血栓溶解活性を示すことを示す。

実施形態の上記説明は例示のみのために与えられること及び種々の変形が当業者によってなされ得ることが理解されるはずである。上記仕様、実施例及びデータは、発明の例示的実施形態の構造及び使用の完全な説明を与える。発明の種々の実施形態がある程度の特殊性で又は１以上の個別の実施形態を参照して上述されたが、当業者であれば、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく開示の実施形態に対して多数の変更を行うことができるはずである。

Claims

抗フィブリン抗体及びヒトプラスミノーゲン活性化因子（ｈｕ－ｔＰＡ）のセリンプロテアーゼ部分を備えるポリペプチドであって、前記抗フィブリン抗体は、ヒトフィブリノーゲンに対するよりも少なくとも１０倍良好な親和性でヒトフィブリンに結合し、
前記抗フィブリン抗体は、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを有し、それぞれ、配列番号１及び２、配列番号１７及び１８、配列番号１９及び２０、又は配列番号２１及び２２のアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
前記抗フィブリン抗体は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１に記載のポリペプチド。
ｈｕ－ｔＰＡの前記セリンプロテアーゼ部分は、レテプラーゼである、請求項１に記載のポリペプチド。
前記抗フィブリン抗体の前記軽鎖可変ドメイン及び前記重鎖可変ドメインを接続する配列番号１６の配列を有するリンカーをさらに備える請求項１に記載のポリペプチド。
ｈｕ－ｔＰＡの前記セリンプロテアーゼ部分と前記抗フィブリン抗体との間に配置されたリンカーをさらに備える請求項１に記載のポリペプチド。
ｈｕ－ｔＰＡの前記セリンプロテアーゼ部分は、前記抗フィブリン抗体のＮ末端に連結され、配列番号１１又は１２のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
ｈｕ－ｔＰＡの前記セリンプロテアーゼ部分は、前記抗フィブリン抗体のＣ末端に連結され、配列番号１４のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
それを必要とする被検体において血栓症を処置するための、請求項１に記載のポリペプチドを含む、薬学的組成物。
ヒトフィブリノーゲンに対するよりも少なくとも１０倍良好な親和性でヒトフィブリンに結合する抗フィブリン抗体であって、
前記抗フィブリン抗体は、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを有し、それぞれ、配列番号１及び２、配列番号１７及び１８、配列番号１９及び２０、又は配列番号２１及び２２のアミノ酸配列を有する、抗フィブリン抗体。
前記抗フィブリン抗体の前記軽鎖可変ドメイン及び前記重鎖可変ドメインを接続する配列番号１６の配列を有するリンカーをさらに備える請求項９に記載の抗フィブリン抗体。
配列番号１の残基３０～３２（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号１の残基４９～５４（ＣＤＲ－Ｌ２）、配列番号１の残基９１～９６（ＣＤＲ－Ｌ３）、配列番号２の残基３０～３３（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号２の残基５０～５９（ＣＤＲ－Ｈ２）及び配列番号２の残基９８～１０６（ＣＤＲ－Ｈ３）に対応するアミノ酸配列をそれぞれ有する６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を備える請求項９に記載の抗フィブリン抗体。
一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である請求項９に記載の抗フィブリン抗体。