TWI617319B - 用以治療病理性血栓的融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本揭示內容提出了多種分子構建體，這些分子構建體具有一標的元件與一效應元件。此處亦揭示了利用所述分子構建體來治療多種疾病的方法。

Description

用以治療病理性血栓的融合蛋白
本揭示內容是關於藥學領域；更明確地說，是關於多功能的分子構建體，譬如具有標的元件與效應元件以將效應元件(如治療藥物)遞送至標的部位的分子構建體。
近年來，本領域發展出多種篩檢與選擇以抗原為標的之單株抗體(monoclonal antibodies，mAbs)的方法，進而帶動許多治療用抗體的研發，替一些不久前還被認為是不治之症的疾病帶來曙光。根據治療性抗體資料庫(Therapeutic Antibody Database)的統計，有多達2,800種左右的抗體已經或即將投入人體臨床試驗，而經政府藥物管理機構核准可用於臨床治療的抗體則約有80種。從與抗體療效相關的大量數據可以得知抗體是基於何種藥理機制而發其揮療效。
以抗體作為治療藥劑時，其主要的藥理機制是利用抗體來中和或誘捕造成疾病的介質；所述介質可能是存在於血液循環、間質空間(interstitial space)或淋巴結中的細胞介素或免疫成分。中和所述介質的活性可抑制造成疾病的介質和其受體之間的互動。此外，可將細胞介素的可溶性受體或受體的細胞外部分和免疫球蛋白IgG的Fc部分製成融合蛋白，此種融合蛋白可利用類似中和抗體的機制來中和上述細胞介素或免疫因子；因此目前也開發出多種融合蛋白治療劑。
另外，某些取得臨床使用許可或正在進行臨床研究的治療性抗體則是採用了與上述主要抗體機制不同的機制，來發揮其藥理作用，譬如可藉由和受體結合以阻斷這些受體和其配體之間的互動。對此類抗體藥物來說，其主要的藥理機制並非由Fc-介導的機制(如抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)或是補體介導的細胞溶解(complement-mediated cytolysis，CMC)等)。
另一些治療性抗體可和目標細胞上的某些表面抗原結合，並藉此在目標細胞上發揮Fc介導的功能以及其他機制。最重要的Fc介導的機制為抗體依賴性細胞毒性(ADCC)以及補體介導的細胞溶解(CMC)，這兩種機制都會將與抗體結合的目標細胞溶解。這些抗體和特定的細胞表面抗原結合後，可使得與其結合的目標細胞發生細胞凋亡。
製備具有雙重專一性的抗體的概念與方法，早在三十年前就已萌芽。近年來，隨著重組抗體工程方法的進步、以及對於更好藥物的需求驅使下，發展出多種具有不同結構構形的雙專一性抗體。
舉例來說，雙價或多價抗體可能帶有二或更多種抗原結合位。已知有多種方法可用以製備多價抗體，這些方法通常利用連接結構將三或四種抗原結合片段(antigen-binding fragment，Fab)共價連接在一起。舉例來說，已透過重組工程製備出能表現三或四個串聯(tandem)的Fab重複片段的抗體。
此外，利用合成的交聯物(crosslinker)，透過化學方法將不同的抗體或結合部位連接在一起，以製造出多價抗體的方法也是本領域公知的技術。其中一種方式是利用不同的接合物(linker)，將三、四或更多個分離的Fab片段，透過化學交聯的方式彼此接合。另一種方式是先製備一個具有多個Fab的構建體，將這些Fab組裝成一維的DNA支架(one-dimensional DNA scaffold)。這些經設計可和目標分子結合的各種多價抗體構建體彼此的尺寸、半衰期、構形彈性以 及調節免疫系統的能力各不相同。基於以上說明，已有部分研究著眼於製備效應元件數目固定的分子構建體或具有二或更多種不同功能性元件(譬如至少一標的元件與至少一效應元件)的分子構建體。然而，通常很難利用化學合成或重組技術等方法，來建立具有特定標的與效應元件組合的分子構建體。因此，本領域亟需一種新穎的分子平台，其可用以建構適用於多種疾病的各種分子。
<I>含胜肽核的多臂接合物
本揭示內容的第一種態樣是關於一種接合單元，其上連接了至少兩種不同的功能性元件。舉例來說，所述接合單元可連接有：兩種不同的效應元件、一種標的元件與一種效應元件、或一種效應元件與可延長接合單元生命週期的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)鏈。本發明接合單元經設計成帶有至少兩種不同的官能基，使得這些功能性元件能夠和各別的官能基反應而與接合單元相連接。因此，本發明接合單元可作為用以製備帶有二或更多種功能性元件的分子構建體的平台。
根據本揭示內容多種實施方式，所述接合單元包含一中心核及複數個連接臂。中心核可以是多肽核，其包含2至15個離胺酸(lysine，K)殘基，其中每一個K殘基和次一個K殘基之間由一填充序列所隔開，所述填充序列包含甘胺酸(glycine，G)與絲胺酸(serine，S)殘基；或者是，所述多肽核的序列為(Xaa-K)n，其中Xaa是具有2至12個乙二醇(ethylene glycol，EG)重複單元的聚乙二醇化胺基酸(PEGylated amino acid)，且n為2至15的整數。在視需要而實施的實施方式中，填充序列是由2至20個胺基酸殘基所組成。於多種實施方式中，填充序列可具有任一種以下序列：GS、GGS、GSG或序列編號：1-16所示序列。根據本揭示內容某些實施方式，中心核包含2至15個單元的G1-5SK序列；在較佳的情形中，中 心核的序列為(GSK)2-15。每一連接臂藉由和K殘基形成醯胺鍵而連接於中心核的K殘基。連接臂的自由端(即，未連接於中心核的一端)有一順丁烯二醯亞胺基(maleimide group)、N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimidyl，NHS)基、疊氮基(azide group)、炔基(alkyne group)、四嗪基(tetrazine group)、環辛烯基(cyclooctene group)或環辛炔基(cyclooctyne group)。此外，位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基有一疊氮基或炔基；或者是或額外地，令位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基為半胱胺酸(C)殘基，且有一耦合臂透過此半胱胺酸殘基的硫氫基而與其連接，此時所述耦合臂未和中心核連接的自由端有一疊氮基、炔基、四嗪基或環辛烯基或環辛炔基。
根據本揭示內容多種實施方式，所述接合單元更包含複數個第一元件。於某些實施方式中，藉由在連接臂和第一元件之間形成醯胺鍵，而將每一第一元件連接至連接臂。在其他實施方式中，透過發生在連接臂與第一元件之間的硫氫-順丁烯二醯亞胺反應、銅催化的疊氮化物-炔羥環加成(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)、應力促進的疊氮化物-炔羥鏈接化學(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)反應或逆電子需求狄爾斯-阿德(inverse electron demand Diels-Alder，iEDDA)反應，而將每一第一元件連接至連接臂。
根據本揭示內容某些實施方式，當該些第一元件是透過CuAAC或SPAAC反應而分別連接至該些連接臂時，則位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基為半胱胺酸殘基，且耦合臂的自由端是四嗪基或環辛烯基。根據本揭示內容其他實施方式，當該些第一元件是透過iFDDA反應而分別連接至該些連接臂時，則位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基有該疊氮基或炔基；或位於中心核N-或C- 端的胺基酸殘基是半胱胺酸殘基，且耦合臂的自由端為疊氮基、炔基或環辛炔基。
在某些實施方式中，所述連接臂為一PEG鏈；在較佳情形中，其具有2至20個EG重複單元。於某些實施方式中，所述耦合臂為一PEG鏈；在較佳情形中，其具有2至12個EG重複單元。
帶有疊氮基的胺基酸殘基實例包括：L-疊氮高丙胺酸(azidohomoalanine，AHA)、4-疊氮-L-苯丙胺酸(4-azido-L-phenylalanine)、4-疊氮-D-苯丙胺酸(4-azido-D-phenylalanine)、3-疊氮-L-丙胺酸(3-azido-L-alanine)、3-疊氮-D-丙胺酸(3-azido-D-alanine)、4-疊氮-L-高丙胺酸(4-azido-L-homoalanine)、4-疊氮-D-高丙胺酸(4-azido-D-homoalanine)、5-疊氮-L-烏胺酸(5-azido-L-ornithine)、5-疊氮-D-烏胺酸(5-azido-D-ornithine)、6-疊氮-L-離胺酸(6-azido-L-lysine)以及6-疊氮-D-離胺酸(6-azido-D-lysine)。例示性的帶有炔基胺基酸殘基包括：L-高炔丙基甘胺酸(L-homopropargylglycine，L-HPG)、D-高炔丙基甘胺酸(D-homopropargylglycine，D-HPG)以及β-高炔丙基甘胺酸(beta-homopropargylglycine、β-HPG)。
當位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基是半胱胺酸殘基時，位於耦合臂自由端的環辛烯基可以是反式-環辛烯(trans-cyclooctene，TCO)基，而位於耦合臂自由端的環辛炔基則可以是二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne，DBCO)、二氟化環辛炔(difluorinated cyclooctyne，DIFO)、二環壬炔(bicyclononyne，BCN)或二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne，DICO)基。另一方面，位於耦合臂自由端的四嗪基包括，但不限於：1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪以及1,2,4,5-四嗪基，以及其衍生物，譬如6-甲基四嗪基。
根據本揭示內容多種視需要而實施的實施方式，第一元件是可在個體體內發揮欲求效果(如，治療效果)的效應元件；或者是，第一元件是能夠將 接合單元導引至目標部位的標的元件。根據本發明實施方式，第一元件是對纖維素專一的單鏈可變片段(single-chain variable fragment，scFv)。
在有需要的情形中，接合單元可更包含與第一元件不同的第二元件。在某些實施方式中，第二元件帶有疊氮基或炔基，使得其可和中心核或耦合臂的對應炔基或疊氮基進行CuAAC反應，進而與中心核或耦合臂耦接。或者是，在某些實施方式中，第二元件帶有疊氮基或環辛炔基，使得其可和中心核或耦合臂的對應環辛炔基或疊氮基進行SPAAC反應，進而與中心核或耦合臂耦接。又或者是，於一些實施方式中，第二元件帶有四嗪基或環辛烯基，而使得其可和中心核或耦合臂的對應環辛烯基或四嗪基進行iEDDA反應，進而與中心核或耦合臂耦接。根據本揭示內容某些實施方式，所述第二元件是組織性血漿蛋白原活化因子(tissue plasminogen activator)、第Xa型凝血因子抑制劑或凝血酶抑制劑。組織性血漿蛋白原活化因子的例示性實施方式包括：阿替普酶(alteplase)、瑞替普酶(reteplase)、替奈普酶(tenecteplase)與拉諾普酶(lanoteplase)。第Xa型凝血因子抑制劑係選自由以下組成的群組：阿哌沙班(apixaban)、伊度沙班(edoxaban)與利伐沙班(rivaroxaban)。凝血酶抑制劑可以是阿加曲班(argatroban)或美拉加群(melagatran)。
於一些實施方式中，所述接合單元更包含視需要而加入的第三元件，此種第三元件和第一、第二元件不同。在第二元件直接與中心核連接的情形中，所述中心核的另一端(即，未與第二元件連接的自由端)可視需要而為半胱胺酸殘基，此一殘基可用以引入非必要的第三元件。具體來說，半胱胺酸殘基的硫氫基可和一PEG鏈上的順丁烯二醯亞胺基反應，而此一與中心核連接的PEG鏈在此稱為「耦合臂」；上述耦合臂的自由端帶有四嗪基或環辛烯基。如此一來，第三元件即可透過iEDDA反應而與耦合臂連接。在較佳的情形中，第三元 件是能夠改善接合單元藥動學性質的元件。分子量為20,000至50,000道耳頓(daltons)的長PEG鏈就是一種能改善接合單元藥動學性質的元件。
<II>含胜肽核的多臂接合物的用途
在臨床醫學領域中，根據本揭示內容第一態樣的接合單元可用於治療多種疾病。因此，本揭示內容的第二種態樣是關於治療這些疾病的方法。根據本揭示內容多種實施方式，用以治療特定疾病的方法包含以下步驟：對有需要的個體投予治療有效量的接合單元，所述接合單元可以是根據本揭示內容上述態樣與實施方式的任一種接合單元。當可理解，可將所述接合單元以藥學配方的形式施用，此種藥學配方除了包含本發明接合單元外，還包含適用於所欲給藥方式的藥學上可接受的賦型劑。
根據本揭示內容某些實施方式，此處提出的接合單元可用以預防血栓形成。在這些實施方式中，第一元件是對纖維素專一的scFv，而第二元件是第Xa型凝血因子抑制劑或凝血酶抑制劑。所述第Xa型凝血因子抑制劑係選自由阿哌沙班、伊度沙班與利伐沙班所組成的群組。所述凝血酶抑制劑可以是阿加曲班或美拉加群。
根據本揭示內容其他實施方式，所述接合單元可用以治療血管栓塞，此種接合單元包含對纖維素專一的scFv(作為第一元件)以及組織性血漿蛋白原活化因子(作為第二元件)。組織性血漿蛋白原活化因子的例示性實施例包括：阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶與拉諾普酶。
<III>用以預防血栓形成與治療血管栓塞的Fc型分子構建體及其用途
本揭示內容的第五態樣是關於以可結晶片段(fragment crystallizable，Fc)為基礎的分子構建體(下文稱為Fc型分子構建體)，其具有直接或間接連接到免疫球蛋白CH2-CH3區域的至少一標的元件與至少一效應元件。 藉由審慎選擇所述Fc型分子構建體的標的與效應元件，所得到的Fc型分子構建體可用以預防血栓形成及治療血管栓塞，或可用以製備用於上述用途的藥物。當可想見，利用此種Fc型分子構建體來預防血栓形成或治療血管栓塞的方法亦屬於本揭示內容的一種態樣。
根據本揭示內容某些實施方式，Fc型分子構建體包含一對IgG.Fc的CH2-CH3區段、一對效應元件及一對標的元件。成對的效應元件可以是組織性血漿蛋白原活化因子或一載藥束(drug bundle)，此載藥束包含複數個第Xa型凝血因子抑制劑或凝血酶抑制劑分子，而成對的標的元件可以是對纖維素專一的抗體片段。
當成對效應元件是組織性血漿蛋白原活化因子(如：阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶與拉諾普酶)時，此一成對的效應元件連接於成對CH2-CH3區段的N-端，而成對的標的元件則連接於成對CH2-CH3區段的C-端，反之亦然。或者是，當成對的效應元件是載藥束時，則成對的效應元件連接於成對CH2-CH3區段的C-端，而成對的標的元件則連接到成對CH2-CH3區段的N-端。
於一些實施方式中，該成對CH2-CH3區段衍生自人類IgG重鏈γ4或人類IgG重鏈γ1。
在某些例子中，成對的標的元件形成抗原結合片段(antigen-binding fragment，Fab)的構形(即，由VH-CH1區域以及VL-Cκ區域所組成)；此種Fab片段連接於第一與第二重鏈的N-端，而使得Fc型分子構建體形成IgG構形。在這些情形中，成對的效應元件則連接於成對CH2-CH3區段的C-端。
根據某些視需要而實施的實施方式，效應元件為以接合單元為基礎的載藥束。此種載藥束的優點在於可在將載藥束和抗體分子耦接之前先單獨製備此種載藥束，因而能夠避免在嚴苛的化學條件下將藥物分子直接與抗體分子接合的問題。根據本揭示內容的多種實施方式，載藥束包括複數個與血液凝 結相關的抑制劑，譬如第Xa型凝血因子抑制劑(如：阿哌沙班、伊度沙班與利伐沙班)以及凝血酶抑制劑(如：阿加曲班、美拉加群)。作為例示而非限制，這些Fc-型分子構建體可用於預防血栓形成。
根據某些實施方式，此處提出的Fc-型分子構建體更包含一多肽延伸段及一耦合臂。具體來說，多肽延伸段的序列為(G2-4S)2-8C，且連接於成對CH2-CH3區段其中之一的C-端。在這種情形中，耦合臂透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應而連接於多肽延伸段的C-端。此外，在和載藥束耦接之前，耦合臂的自由端(即，未連接於多肽延伸段的半胱胺酸殘基的一端)經修飾帶有炔基、疊氮基、高應力炔基或四嗪基，而使得載藥束可透過逆電子需求狄爾斯-阿德(inverse electron demand Diels-Alder，iEDDA)反應、應力促進的疊氮化物-炔羥鏈接化學(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)反應或銅催化的疊氮化物-炔羥環加成(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)反應而與耦合臂耦接。
根據某些視需要而實施的實施方式，所述載藥束包含一中心核、複數個連接臂。根據本揭示內容多種實施方式，中心核可以是具有複數個胺基的化合物或包含複數個離胺酸(K)殘基的多肽。每一連接臂的一端藉由和化合物核的胺基或多肽核的K殘基反應，而與中心核連接。此外，上述連接臂在其自由端帶有順丁烯二醯亞胺基，而每一藥物分子(譬如與凝血相關的抑制劑分子)則藉由和順丁烯二醯亞胺基反應，進而透過第一連接臂而與中心核連接。
在中心核是多肽核的情形中，位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基是半胱胺酸殘基或帶有疊氮基或炔基。
當多肽中心核的末端胺基酸殘基帶有疊氮基或炔基時，載藥束可以透過發生於上述末端殘基與耦合臂C-端之間的CuAAC反應而和耦合臂連接。
用以對有需要的個體預防血栓形成和/或治療血管栓塞的方法包含以下步驟：對所述個體投予有效量的本態樣之分子構建體。
主要元件符號如下：
1200A‧‧‧Fc型分子構建體
1210‧‧‧CH2-CH3鏈
E1‧‧‧效應元件
T1‧‧‧標的元件
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，茲將所附圖式簡單說明如下。
第1A圖至第1K圖為根據本揭示內容某些實施方式的接合單元的示意圖。
第2圖為包含化合物核的接合單元的示意圖。
第3A圖至3C為根據本揭示內容多種實施方式的Fc型分子構建體的示意圖。
第4A與4B圖為根據本揭示內容多種實施方式的Fc型分子構建體的示意圖。
第5圖為根據本揭示內容一實驗例的多肽核接合單元的質譜MALDI-TOF結果，所述多肽核接合單元有一條帶有一TCO官能的耦合臂基與5條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG6連接臂。
第6圖為根據本揭示內容一實驗例所合成的阿哌沙班-PEG3-S-S-PEG3-阿哌沙班的質譜MALDI-TOF結果。
第7圖為根據本揭示內容一實驗例所合成的阿加曲班-PEG3-S-S-PEG3-阿加曲班的質譜MALDI-TOF結果。
第8A、8B與8C圖分別是根據本揭示內容一實驗例，經純化之對人類纖維素專一的102-10 scFv的SDS-PAGE、MALDI-TOF與ELISA分析結果。
第9A圖與第9B圖分別是根據本揭示內容一實驗例，對人類纖維素專一的噬菌體-呈現scFv的病毒效價分析與單菌落ELISA分析果。
第10A圖與第10B圖分別是根據本揭示內容一實驗例，純化的瑞替普酶的SDS-PAGE與MALDI-TOF分析結果。
第11圖是根據本揭示內容一實驗例，TCO-瑞替普酶複合物的質譜分析結果。
第12圖是根據本揭示內容一實驗例的標的接合單元的SDS-PAGE分析結果，上述標的接合單元有一自由的四嗪基與三個對人類纖維素專一的scFv。
第13圖是根據本揭示內容一實驗例的的單一接合單元分子構建體的MS分析結果，上述分子構建體有三個對人類纖維素專一的scFv(作為標的元件)以及一個瑞替普酶分子(作為效應元件)。
第14圖是根據本揭示內容一實驗例的阿哌沙班-PEG3-SH分子的抑制分析結果。
第15圖是根據本揭示內容一實驗例，經純化的重組雙鏈(瑞替普酶)-hIgG4.Fc融合蛋白的SDS-PAGE分析結果。
第16圖是根據本揭示內容一實驗例，經純化的重組雙鏈(瑞替普酶)-hIgG4.Fc-(scFv α纖維素)融合蛋白的SDS-PAGE分析結果。
第17圖是根據本揭示內容一實驗例，經純化的重組雙鏈(瑞替普酶)-(scFv α纖維素)融合蛋白的SDS-PAGE分析結果。
第18圖是根據本揭示內容一實驗例，經純化的重組雙鏈(TNK-tPA)-IgG4.Fc融合蛋白的SDS-PAGE分析結果。
第19圖是根據本揭示內容一實驗例，重組雙鏈(瑞替普酶)-hIgG4.Fc、雙鏈(瑞替普酶)-hIgG4.Fc-(scFv α纖維素)與(瑞替普酶)-(scFv α纖維素)的蛋白質酶活性分析結果。
根據慣常的作業方式，圖中各種特徵與元件並未依比例繪製，其繪製方式是為了以最佳的方式呈現與本發明相關的具體特徵與元件。此外，在不同圖式間，儘可能以相同或相似的元件符號來指稱相似的元件/部件。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
為了便於說明，此處整理了說明書、實施例與附隨申請專利範圍中所用的某些詞彙。除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙的含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。
在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。此外，在本說明書與申請專利範圍中，「至少一」與「一或更多」等表述方式的意義相同，兩者都代表包含了一、二、三或更多。更有甚者，在本說明書與申請專利範圍中，「A、B及C其中至少一者」、「A、B或C其中至少一者」以及「A、B和/或C其中至少一者」係指涵蓋了僅有A、僅有B、僅有C、A與B兩者、B與C兩者、A與C兩者、以及A、B與C三者。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」 一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。當可理解，除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一端點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
本揭示內容一般係關於多種分子構建體，其中每一分子構建體包含一標的元件(T)與一效應元件(E)，在本說明書中有時將這些分子構建體稱為「T-E分子」、「T-E藥物」或「T-E藥品」。
在此處，「標的元件(targeting element)」一詞係指分子構建體能夠直接或間接結合到一目標標的(如，一細胞表面上的受體或一組織中的蛋白質)的部分，因而能夠協助將本發明分子構建體遞送到目標標的。在某些例子中，標的元件可將所述分子構建體導引至鄰近目標細胞處。在其他情形中，標的元件可專一地結合到目標細胞表面上的分子；或標的元件可和第二分子專一地結合，而此一第二分子能夠專一地結合到目標細胞表面上的分子。在某些例子中，一旦標的元件與目標標的接合之後，標的元件可將本發明分子構建體內化，而使其移動到目標細胞的細胞質內。標的元件可以是細胞表面受體的抗體或配體；或者是可和上述抗體或配體結合的分子，因而能夠間接地將本發明分子構建體標的到目標部位(譬如所選定的細胞表面)。相較於沒有標的功能的治療藥物，利用本發明分子構建體能夠加強或有利於效應元件(治療藥劑)在疾病部位的局部 化(localization)。上述局部化是一種程度或相對的比例，而不是讓效應元件在疾病部位絕對或完全的局部化。
根據本發明，「效應元件(effector element)」一詞係指一旦分子構建體到達目標部位後，所述分子構建體中能夠發揮生物活性(譬如，誘發免疫反應、發揮細胞毒性及與其相似者)或其他功能活性(譬如招募其他經半抗原標記的治療用分子)的部分。「效應」可指治療性或診斷性的效果。效應元件包含能夠和細胞和/或細胞外免疫調節因子結合的元件。上述效應元件包含如蛋白質、核酸、脂質、碳水化合物、醣蛋白、藥物部分(包含小分子藥與生物製劑)、化合物、元素及同位素等物質，也包含上述物質的片段。
雖然在此處利用「第一」、「第二、「第三」等詞彙來描述多種元件、部件、區域和/或區段，這些元件(以及部件、區域和/或區段)不受上述修飾詞的限制。此外，除非上下文有明示的說明，使用這些序數並未隱含序列或順序。反之，這些詞彙僅是用來區分各元件。因此，亦可將下文所述的第一元件命名為第二元件，而不會悖離例示性實施方式所揭示的內容。
在此處，「連接(link)」、「耦接(couple)」以及「複合(conjugate)」等詞可互換使用，且都是用來指稱透過直接或間接的連接關係，將兩個元件連接在一起。
「多肽(polypeptide)」一詞在此係指具有至少兩個胺基酸殘基的聚合物。一般來說，多肽包含2到200個胺基酸殘基；在較佳的情形中，是2到50個殘基。在本說明書中所提及的胺基酸序列涵蓋了此種序列的L-、D-或β-胺基酸等形式。多肽亦包括胺基酸聚合物，其中有一或多個胺基酸殘基是與一天然胺基酸相應的人工化學類似物，當然也包括天然產生的胺基酸聚合物。此外，此一詞彙亦涵蓋以多肽鏈或其他方式連接的胺基酸，上述其他方式如經修飾的連接(modified linkage)，譬如以α-酯(α-ester)、β-酯(β-ester)、硫醯胺(thioamide)、磷 醯胺(phosphoramide)、氨基甲酸酯(carbomate)、羥基酯(hydroxylate)鍵、以及與其相似者來取代多肽鍵。
於一些實施方式中，本發明範圍亦涵蓋了其他相較於所述序列具有保守性置換的蛋白。於多種實施方式中，有一、二、三、四或五個不同的殘基經過置換。在此處，「保守性置換(conservative substitution)」一詞是指所述胺基酸置換不會明顯地改變分子活性(譬如生物或功能活性和/或專一性)。一般來說，保守性胺基酸置換是利用另一種具有相似化學性質(如電荷或疏水性)的胺基酸來取代某一胺基酸。某些保守性置換包括「類似物置換」，亦即以非標準(如罕見或合成等)胺基酸來取代標準胺基酸，而上述非標準胺基酸和被取代的原有胺基酸之間的差異極小。可由標準胺基酸經人工修飾而在不會大幅改變原有胺基酸結構的前提下，得到所述的胺基酸類似物，譬如異構物或代謝前驅物等皆屬之。
於一些實施方式中，本案的範圍亦涵蓋和任何所述序列具有至少80%序列相似度的任何序列，上述序列相似度較佳為至少85%或90%、更佳為至少95%或98%。
此處針對多肽序列所述的「胺基酸序列相似度百分比(Percentage(%)amino acid sequence identity)」係指候選序列的胺基酸殘基與參考多肽序列的胺基酸殘基完全相同的百分比；於進行上述比對時，可將所述的候選多肽片段與所述的特定多肽片段並排，並於必要時引入間隙，以使二序列形成最高的序列相似度；在計算相似度時，保守性置換的胺基酸殘基視為不同的殘基。相關領域已有多種方法可用以進行上述並排，譬如可公開取得的軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)等。本發明所屬技術領域中具有通常知識者在進行並排時，可選擇適當的參數與計算方式，以得到最佳的排列方式。在本說明書中，二多肽序列間的序列比較是採用美國國家生物科技資訊中心 (Nation Center for Biotechnology Information，NCBI)所提供的蛋白質-蛋白質BLAST分析資料庫Blastp來進行。候選多肽序列A相較於參考多肽序列B的胺基酸序列相似度(在本說明書中亦稱之為多肽序列A與多肽序列B具有特定百分比(%)的胺基酸序列相似度)的計算方式如下： 其中X是利用BLAST序列並排程式對序列A、B進行排列後所得到的相同胺基酸殘基數目(identical matches)，而Y是A、B二序列中較短者的胺基酸殘基總數。
「聚乙二醇化胺基酸(PEGylated amino acid)」一詞在此係指帶有一個胺基(amino group)與一個羧基(carboxyl group)的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)鏈。一般來說，聚乙二醇化胺基酸的結構式為NH2-(CH2CH2O)n-COOH。在本揭示內容中，n值介於1到20之間；較佳是介於2至12。
在此處一多肽的「端」係指位於該多肽N-或C-端點的胺基酸殘基。在描述一聚合物(譬如此處所述的聚乙二醇)的組成單元時時，「端」則是指在聚合物骨架末端的部分。在本說明書與申請專利範圍中，「自由端」一詞是用來指稱並未與另一個分子形成化學鍵結的末端胺基酸殘基或構成單元。
「抗原(antigen或Ag)」一詞係指能夠導致免疫反應的分子。此種免疫反應可能涉及分泌性(secretory)、荷爾蒙性(humoral)和/或細胞級(cellular)的抗原專一反應。在本揭示內容中，「抗原」一詞係指蛋白質、多肽(包括其突變株或具有生物活性的片段)、多醣、醣蛋白、醣脂質、核酸或上述之組合。
在本說明書與申請專利範圍中，「抗體(antibody)」一詞應以廣義方式解釋，且包含完整組裝的抗體、可和抗原結合的抗體片段，譬如抗原結合片段(Fab/Fab’)、F(ab’)2片段(具有彼此以雙硫鍵連接的兩個Fab部分)、可變片 段(variable fragment，Fv)、單鏈可變片段(scFv)、雙專一性單鏈可變片段(bi-scFv)、奈米抗體(nanobodies)、單抗體(unibodies)以及雙體抗體(diabodies)。「抗體片段」包含完整抗體的一部分，較佳為包括完整抗體的抗原結合區域或可變區域。在典型的例子中，「抗體」係指實質上由免疫球蛋白基因或其片段所編碼的一或多種多肽所組成的蛋白質。習知的免疫球蛋白基因包括κ(kappa)、λ(lambda)、α(alpha)、γ(gamma)、δ(gamma)、ε(epsilon)與μ(mu)等恆定區基因(constant region gene)、以及無數的免疫球蛋白可變區基因(variable region genes)。輕鏈通常歸類為κ(kappa)或λ(lambda)。重鏈通常歸類為γ(gamma)、μ(mu)、α(alpha)、δ(gamma)或ε(epsilon)，基於這些結構，定義出了以下類型的免疫球蛋白：IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE。典型的免疫球蛋白抗體結構是一種四聚物(tetramer)。每一個四聚物是由兩條相同的多肽鏈所組成，且每一對分別有一「輕」鏈(約25kDa)與一「重」鏈(約50-70kDa)。每一鏈的N-端界定了一個可變區域，包含約100至110個或更多的胺基酸，其主要負責抗原辨識。可變輕鏈(variable light chain，VL)與可變重鏈(variable heavu chain，VH)等詞就是分別指上述的輕鏈與重鏈。根據本揭示內容的實施方式，可藉由改變天然抗體或利用重組DNA方式重新合成上述抗體片段。於本揭示內容一些實施方式中，上述抗體和/或抗體片段可具有雙專一性，且可有多種不同的構形。舉例來說，雙專一性抗體可包含二個不同的抗原結合部位(可變區域)。於多種實施方式中，可利用融合瘤技術或重組DNA技術來製備雙專一性抗體。於一些實施方式中，雙專一性抗體對至少兩種不同的表位(epitope)有結合專一性。
「專一地結合(specifically bind)」一詞在此處係指抗體或其抗原結合片段能夠和抗原結合的能力，上述結合的解離常數(dissociation constant，Kd)小於約1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M或1×10-12 M；或者是或額外地，相較於其對於非專一性抗原的結合親和力，上述抗體或其抗原結合片段與抗原結合的親和力為兩倍以上。
「治療(treatment)」一詞係指預防性(如，預防用藥)、療癒性或緩和性的處置，藉以達到所欲的藥學和/或生理學效果；而治療的行為在此包括上述預防性、療癒性或緩和性的處置。具體來說，治療在此係指對於可能患有一醫療疾患、症狀、疾病或與疾患相關的異常、或易於罹患一疾患的個體施用或投予本發明分子構建體或包含此分子構建體的藥學組合物，以期能部分地或完全地緩和、改善、減輕特定異常和/或病症的一或多種症狀或特徵，或是延緩其發生、阻礙其進展、減輕其嚴重性和/或減低發生率。亦可對尚未表出現疾病、異常和/或病症徵兆的個體和/或出現早期徵兆的個體進行治療，以期降低發展出與該疾病、異常和/或病症相關的病理變化的風險。
在此處，「有效量(effective amount)」一詞係指本發明分子構建體的用量足以招致所欲的治療反應。藥劑的有效量不必然能夠治癒疾病或病症，但能夠延緩、阻礙或防止該疾病或病症的發生，或是可緩減與疾病或病症相關的病徵。可將治療有效量可分成一、二或更多劑，而以適當的劑型在指定期間內施用一次、二次或更多次。具體的治療有效量取決於多種因素，例如欲治療的特定狀況、個體的生理條件(如，個體體重、年齡或性別)、接受治療的個體類型、治療持續時間、併行治療(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。舉例來說，可將治療有效量表示成活性成分的總重量，譬如以克、毫克或微克來表示；或表示成活性成分重量相對於體重的比例，譬如表示為每公斤體重多少毫克(mg/kg)。
所述「施用(application)」與「投予(administration)」等詞在此可交替使用，其係指將本發明之分子構建體或藥學組合物提供給需要治療的個體。
「個體(subject)」或「患者(patient)」等詞在此可交互使用，且是指可接受本揭示內容之分子構建體、藥學組合物和/或方法處置的動物(包含人類)。除非另有指明，「個體」或「患者」一般包含雄性與雌性。「個體」或「患者」包含任何可因本揭示內容的處置而獲益的哺乳類動物。所述「個體」或「患者」的例示包含，但不限於：人類、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、豬、山羊、牛、馬、狗、貓、鳥和禽類。在一實例中，所述患者為人類。所述哺乳類動物涵蓋哺乳動物綱的所有成員，包括人類、靈長類動物、家畜和農畜(如兔子、豬、綿羊和牛)、動物園動物或競賽用動物、寵物，以及齧齒類動物(如，小鼠和大鼠)。「非人類哺乳動物」一詞則涵蓋除了人類以外的所有哺乳動物綱成員。
本揭示內容至少部分是基於建構出了T-E藥物，此種T-E藥物可被遞送至目標細胞、目標組織或器官，且其在這些部位的比例相對高於在血液循環、淋巴系統以及其他細胞、組織和器官中的比例。當實現上述情境時，即可提升T-E藥物的療效，且其副作用與毒性的數目和嚴重性都會降低。相較於不含標的元件的藥物，以T-E分子的形式來投遞藥物時，發揮療效的效應物所用的濃度可能較低。因此，可在較低的劑量下施用治療用的效應物而不會減損其有效性，但卻能同時降低其副作用與毒性。
可因較佳藥物標的而獲益的疾病
若是可將藥物標的到疾病部位，亦即若是可使藥物在疾病部位(相對於在正常組織或器官)局部化或有較優勢的濃度，就能夠改善用以治療許多疾病的藥物，使其具備較佳的療效與安全性。某些抗體藥物是以感染性微生物或其毒素產物為標的，若使這些抗體藥物具備招募免疫細胞的能力，以吞噬或清除與抗體結合的粒子，就能夠提升其療效。下文提出一些主要的例示性疾病，若是能使得這些疾病所用藥物在疾病部位或細胞有較佳的分布比例或能夠招募可吞噬細胞的免疫細胞，就可以改善這些藥物。
與血栓相關的疾病/症狀
在處理與血栓(blood clotting或coagulation)相關的病理問題時，藥物開發主要涉及兩大面向：其一是處預防或抑制病理性血栓的形成或在血栓核形成後防止其體積增大；其二則是即時溶解已形成的病理性血栓。目前臨床上已有針對這兩種面向開發的藥物。然而，仍有許多相關研究希望開發更優良的藥物，也有一些藥物正在進行臨床試驗。
患者常因為多種併發症(如：由心臟血管、內分泌或其他與身體調節相關症狀所致、使用藥物或其他原因)而容易發展出血栓。血栓可能會導致出血性中風(hemorrhagic strokes)、頭部創傷(head trauma)、心肌梗塞(myocardial infarction)、肺栓塞(pulmonary embolism)或深層血管栓塞(deep vein thrombosis)，這些症狀經常會導致嚴重且可能造成生命威脅的臨床症狀。
凝血作用通常會涉及一系列依序強化的由蛋白質酶催化的事件。在較為後段的步驟中，第Xa型凝血因子可將前凝血酶(prothrombin)剪切為凝血酶(thrombin)，而凝血酶又可將纖維蛋白原(fibrinogen)剪切得到纖維素；纖維素和血小板可共同形成血塊的篩狀架構。血塊的溶解涉及了纖維蛋白溶酶(plasmin)，有多種酵素(包括組織性血漿蛋白原活化因子)可將血漿蛋白原(plasminogen)纖維蛋白溶酶。
(A)使用T-E分子來預防血栓形成
目前已開發並使用了多種間接的第Xa型凝血因子抑制劑。在過去數十年間，最主要的抑制劑為肝素(heparin)、小分子量肝素與肝素類化合物；肝素是指分子量介於5,000至30,000道耳頓不等的醣胺聚糖(glycosaminoglycan)的天然存在多醣類混合物。這些物質可結合至肝素-結合蛋白(包括抗-凝血酶)進而使得此類物質能夠抑制第Xa型凝血因子，並進一步抑制血栓形成。組織因子路徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)是一種單鏈血清蛋白，隨著蛋白 溶解程度的不同，其分子量介於34,000至40,000道耳頓之間，TFPI能夠抑制第Xa型凝血因子。然而，目前並未利用重組DNA技術來生此類因子做為藥物。
臨床上也開發並使用了多種凝血酶抑制劑。由醫學用水蛭所取得的天然水蛭素以及重組水蛭素可以和凝血酶結合，過去臨床上曾使用此類物質，但由於相繼開發出更佳的藥品，近年來已不再使用。
近年來，開發出多種第Xa型凝血因子或凝血酶的小分子抑制劑，並已取得核准而可用於在多種臨床症狀中預防凝血。在某些臨床應用中，所用的小分子是第Xa型凝血因子的直接抑制劑，譬如：阿哌沙班(apixaban)、伊度沙班(edoxaban)與利伐沙班(rivaroxaban)。另外有些小分子屬於凝血酶的直接抑制劑，譬如：阿加曲班(argatroban)或達比加群(dabigatran)。希美加群(ximelagatran)也是一種直接凝血酶抑制劑，其具有較佳的藥動學特性，且施用劑量極低，但其會造成肝毒性，故已不再使用。希美加群是一種前驅藥物，口服的希美加群在肝臟中會被轉換成美拉加群(melagatran)，此一活性形式會和凝血酶結合並抑制其活性。因此，降低美拉加群相對於希美加群的劑量，以及避免希美加群在肝臟中的轉換，極有可能能夠避免使用希美加群時所發生的肝臟毒性副作用。
本案發明人體認到，要處理血栓形成的有效方法是抑制血栓核使其無法長成到病理性血栓的大小。因此，若能提升在血栓核處的第Xa型凝血因子抑制劑和/或凝血酶抑制劑的含量，就可避免血栓體積成長至病變狀態。此處可使用抗-纖維素抗體的IgG或scFv將帶有第Xa型凝血因子抑制劑或凝血酶抑制劑或兩者的組合之載藥束帶到新近形成的血栓核處。第Xa型凝血因子抑制劑分子(譬如：阿哌沙班、伊度沙班與利伐沙班)以及凝血酶抑制劑分子(譬如：阿加曲班與美拉加群)都帶有胺基，可利用此一胺基將其和此處提出的接合單元複合。
因為使用抗-纖維素抗體將第Xa型凝血因子抑制劑和/或凝血酶抑制劑攜帶到血栓部位，相對於不使用抗-纖維素抗體的情形，可使用較少劑量的抑制劑。更有甚者，由於血管中血液的流動，只有當血栓核成長到一定體積後，被攜帶到血栓附近的抑制劑才會有明顯的聚集效應(concentration effects)。因而，當體內出現輕微內傷時，生理上必須進行的血液凝結作用不會受到影響。正因如此，利用抗-纖維素抗體將第Xa型凝血因子與凝血酶抑制劑攜帶到血栓處的策略，應當具有較佳的治療效果，且可降低內出血的副作用。
根據本揭示內容的實施方式，聯合接合物構形的T-E分子可使用對纖維素專一的scFv作為標的元件，並使用第Xa型凝血因子抑制劑(阿哌沙班、伊度沙班或利伐沙班)和/或凝血酶抑制劑(阿加曲班與美拉加群)作為效應元件。
(B)使用T-E分子來加速血栓溶解
為了適時施用能夠溶解病理性血栓的適當藥物，必須嚴格控制時程，這是本領域面臨的重大挑戰之一。已開發出多種重組人類組織性血漿蛋白原活化因子(tissue plasminogen activator，tPA)，包括：阿替普酶(alteplase)、瑞替普酶(reteplase)、替奈普酶(tenecteplase)與拉諾普酶(lanoteplase)；這些重組tPA解決了血管栓塞問題的大部分問題。然而，在許多情形中，使用tPA不足以溶解血栓和/或可能會造成嚴重內出血。tPA的劑量控制與給藥時程仍是當前的研發重點。也有許多臨床研究著眼於比較不同重組tPA形式的藥效。從與tPA、其變異株與醫療用途相關的大量文獻可以得知，tPA對纖維素的結合親和力、半衰期、肝細胞降解敏感性、對血漿蛋白原活化物抑制劑的抗性等各種性質和tPA在特定臨床症狀下的特定息息相關。
完整tPA的分子結構相當複雜，包含具備不同功能或活性的多個結構域，然而並非所有結構域都是用於溶解血栓的血栓溶解產品所必須的。全長tPA分子(阿替普酶)共有527個胺基酸殘基，其包括(i)纖維結合素手指區域 (fibronectin finger domain)，其可和纖維素結合；(2)表皮生長因子區域，其可和肝細胞結合並有助於tPA廓清；(3)Kringle 1區域，其可和肝內皮細胞結合並有助於tPA廓清；(4)Kringle 2區域，其可和纖維素結合並可活化絲胺酸蛋白酶；以及(5)蛋白酶區域，其可剪切血漿蛋白原並受到第I型血漿蛋白原活化物抑制劑(plasminogen activator inhibitor type 1，PAI-1)的抑制。可利用哺乳類細胞、CHO細胞來製備阿替普酶、替奈普酶與拉諾普酶，而瑞替普酶則是由細菌細胞所製備。
瑞替普酶全長共355個胺基酸殘基，不含纖維結合素手指區域、上皮生長因子區域、與Kringle 1區域。瑞替普酶是利用細菌系統所製備，且因此不含有轉譯後醣類修飾。雖然瑞替普酶對纖維素的親和力較低，且其蛋白質酶活性也比不上阿替普酶，但瑞替普酶的血漿半衰期為14至18分鐘；相較之下，阿替普酶在血漿中的半衰期只有3至4分鐘。瑞替普酶可採多次推注(boli)形式施用，而阿替普酶是在單次推注(bolus)後進行灌注(infusion)。
替奈普酶的全長和阿替普酶一樣是527個胺基酸殘基，但帶有三個突變位點。將第103位的蘇胺酸取代為天門冬醯胺酸，以利進行醣化修飾；將第117位的天門冬醯胺酸取代為麩醯胺酸，以避免該處的醣化。這些突變可抑制替奈普酶被肝細胞清除。此外，在第296至299位的離胺酸-組胺酸-精胺酸-精胺酸四個胺基酸殘基則被取代為4個丙胺酸殘基，此一突變使得其對PAI-1的抗性提升了80倍。替奈普酶的血漿半衰期為18分鐘。
在拉諾普酶中，刪除了纖維結合素手指區域與上皮生長因子區域，且在第117位的天門冬醯胺酸被取代為麩醯胺酸。拉諾普酶的血漿半衰期長達45分鐘，大幅改善了給藥方式的限制。
在諸多臨床試驗中，上述四種tPA的療效不相上下，而每一種藥物在特定的臨床症狀下，各有其優缺點。
本案發明人認為，略微提升瑞替普酶纖維素的結合力同時略微延長其血漿半衰期，可望改善瑞替普酶的療效。這些分子構建體提升了其和血栓的結合專一性，故因而能夠降低給藥劑量與減少副作用。若這些藥物不適用與溶解血栓相關的所有臨床症狀，至少可適用其中某些症狀。因此，本發明一較佳的實施方式是關於一種可用於溶解血栓之經改良的tPA，其採用聯合接合物構形，並帶有了1至3個抗-纖維素抗體的scFv(作為標的元件)，以及1至2個瑞替普酶分子(作為效應元件)。在一種替代性的構建體中，將瑞替普酶的C-端與接合單元複合，以使得位於N-端的Kringe 2區域能夠有彈性地與血栓中的纖維素篩狀架構相接觸。瑞替普酶的C-端有一延伸多肽(譬如(GGGGS)2)以及一個半胱胺酸殘基。在又一實施方式中，採用Fc-融合蛋白構建體，將tPA或其片段和對纖維物專一的scFv相連接；此種構建體亦適用於促進病理性血栓的溶解。
第一節 用以治療特定疾病的多臂接合物
(i)用於多臂接合物的多肽核
本揭示內容的第一態樣是關於一種接合單元，其包含：(1)一中心核，其包含2-15個離胺酸(K)殘基；以及(2)2-15個連接臂，分別連接於中心核的各K殘基。本發明中心核的特徵在於其N-或C-端帶有疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基。
在製備本發明接合單元時，將一端帶有N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimydil，NHS)基且另一端帶有一官能基(如，NHS基、順丁烯二醯亞胺基、疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基)的PEG鏈連接到K殘基上；具體來說，利用上述NHS基和K殘基上的胺基形成醯胺鍵，進而將PEG鏈連接到中心核上。在本揭示內容中，將連接到K殘基之後的PEG鏈稱為連接臂，此連接臂的自由端帶有官能基。
根據本揭示內容的實施方式，上述中心核是多肽核，其長度為 8-120個胺基酸殘基，且包含2至15個離胺酸(K)殘基，其中每一個K殘基和下一個K殘基之間以一填充序列隔開。
根據本揭示內容的實施方式，填充序列包含甘胺酸(glycine，G)與與絲胺酸(serine，S)殘基；在較佳的情形中，填充序列是由選自G、S及其組合的2-15個殘基所組成。舉例來說，填充序列可以是：GS、GGS、GSG、GGGS(序列編號：1),GSGS(序列編號：2)、GGSG(序列編號：3)、GSGGS(序列編號：4)、SGGSG(序列編號：5)、GGGGS(序列編號：6)、GGSGGS(序列編號：7)、GGSGGSG(序列編號：8)、SGSGGSGS(序列編號：9)、GSGGSGSGS(序列編號：10)、SGGSGGSGSG(序列編號：11)、GGSGGSGGSGS(序列編號：12)、SGGSGGSGSGGS(序列編號：13)、GGGGSGGSGGGGS(序列編號：14)、GGGSGSGSGSGGGS(序列編號：15)或SGSGGGGGSGGSGSG(序列編號：16)。
兩個離胺酸殘基之間的填充序列可以由各種長度和組合的甘胺酸與絲胺酸殘基所組成。在離胺酸殘基數目較少的多肽核中，可使用較長的填充序列；在離胺酸殘基數目較多的多肽核中，則可使用較短的填充序列。除了甘胺酸與絲胺酸之外，可在填充序列中加入親水性胺基酸殘基，如天冬胺酸與組胺酸。除了由甘胺酸與絲胺酸殘基組成的填充序列之外，也可使用其他填充序列，譬如可使用常見人類血清蛋白(如白蛋白與免疫球蛋白)中的可撓性、可溶性環。
基本上，離胺酸殘基之間的填充序列可包含甘胺酸與絲胺酸殘基。然而，所述填充序列也可以是由任何側鏈不帶有胺基的胺基酸殘基所組成。這些胺基酸殘基主要可以是親水性殘基，但不需要全部都是親水性殘基。所述胺基酸殘基也不必然是天然存在的。
根據本揭示內容某些較佳的實施方式，中心核包含2-15個單元的G1-5SK序列。或者是，此多肽核的序列為(GSK)2-15；即，多肽包含至少兩個連續的GSK單元。舉例來說，本發明中心核可包含下列胺基酸序列：Ac-CGGSGGSGGSKGSGSK(序列編號：17)、Ac-CGGSGGSGGSKGSGSKGSK(序列編號：18)或Ac-CGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSK(序列編號：19)，其中Ac代表乙醯基。
根據本揭示內容某些實施方式，中心核是序列為(Xaa-K)n的多肽核，其中Xaa是聚乙二醇化胺基酸，其具有2至12個乙二醇(EG)重複單元，且n是2至15的整數。
當可理解，本案所述中心核的離胺酸殘基也可置換任何側鏈帶有胺基的胺基酸殘基；譬如：帶有(CH2-)nNH2側鏈(n=1-3或5)的α-胺基酸、帶有(CH(OH)-)nCH2-NH2側鏈(n=1-5)的α-胺基酸、帶有(CH2-CH(OH)-)nCH2-NH2側鏈 (n=1-3)的α-胺基酸以及帶有(CH2-CH2-O-)nCH2-NH2側鏈(n=1-2)的α-胺基酸。這些胺基酸不必然是天然存在的胺基酸。
如上文所述，本發明中心核的特徵在於其N-或C-端帶有疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基。根據本揭示內容某些實施方式，本發明中心核的N-或C-端胺基酸殘基帶有疊氮基或炔基。帶有疊氮基的胺基酸殘基可以是：L-疊氮高丙胺酸(AHA)、4-疊氮-L-苯丙胺酸、4-疊氮-D-苯丙胺酸、3-疊氮-L-丙胺酸、3-疊氮-D-丙胺酸、4-疊氮-L-高丙胺酸、4-疊氮-D-高丙胺酸、5-疊氮-L-烏胺酸、5-疊氮-D-烏胺酸、6-疊氮-L-離胺酸或6-疊氮-D-離胺酸。舉例來說，本發明中心核可具有以下序列：Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-AAH、Ac-AAH-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、Ac-AAH-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C、Ac-C-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-AAH、Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-AAH、Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4、Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C或Ac-C-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-AAH，其中Xaa是帶有所述數目的EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸，Ac代表乙醯基，而AAH代表AHA殘基。
帶有炔基的胺基酸的例子包括，但不限於：L-高炔丙基甘胺酸(L-HPG)、D-高炔丙基甘胺酸(D-HPG)、或β-高炔丙基甘胺酸(β-HPG)。在本例中，本發明中心核可具有以下序列：Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-GHP、Ac-GHP-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、 Ac-GHP-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C、Ac-C-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-GHP、Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-GHP、Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4、Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C或Ac-C-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-GHP，其中Xaa是帶有所述數目的EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸，Ac代表乙醯基，而GHP代表HPG殘基。
當可理解，目前已可透過商業管道取得多種側鏈帶有疊氮基或炔基的胺基酸與聚乙二醇化胺基酸，這些胺基酸可以帶有保護基團，如叔-丁氧羰基(tert-butyloxycarbonyl，t-boc)或茀甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，Fmoc)，故可輕易用於固態多肽合成。
根據本揭示內容某些實驗例，所用的中心核可包含以下序列：Ac-GHPGGSGGSGGSKGSGSK(序列編號：20)、Ac-GHPGGSGGSGGSKGSGSKGSK(序列編號：21)、Ac-AAHGGSGGSGGSKGSGSKGSK(序列編號：22)、Ac-GHPGGSGGSGGSKGSGSKGSGSC(序列編號：23)、Ac-C-Xaa2-K-Xaa2-K-Xaa2-K(序列編號：24)或Ac-C-Xaa6-K-Xaa6-K-Xaa6-K-Xaa6-K-Xaa6-K(序列編號：25)，其中Xaa為帶有指定數目的EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸、Ac代表乙醯基、AAH代表AHA殘基且GHP代表HPG殘基。
或者是，本發明中心核可和耦合臂連接，此耦合臂的自由端(即，未和中心核連接的一端)帶有一官能基(如，疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基)。在這些情形中，本發明中心核的N-或C-端為半胱胺酸殘基。在製備與耦合臂連 接的接合單元時，將一端帶有順丁烯二醯亞胺基且另一端帶有上述官能基的PEG鏈與上述半胱胺酸殘基連接；具體來說，可透過PEG鏈的順丁烯二醯亞胺基和半胱胺酸殘基的硫氫基之間的硫氫-順丁烯二醯亞胺反應將兩者連接在一起。在本揭示內容中，連接到中心核末端半胱胺酸殘基上的PEG鏈稱為耦合臂，且其自由端帶有上述官能基。
當可理解，本案所述中心核的半胱胺酸殘基可取代成任何側鏈帶有硫氫基的胺基酸殘基；譬如：帶有(CH(OH)-)nCH2-SH側鏈(n=1-5)的α-胺基酸、帶有(CH2-CH(OH)-)nCH2-SH側鏈(n=1-3)的α-胺基酸以及帶有(CH2-CH2-O-)nCH2-SH側鏈(n=1-2)的α-胺基酸。這些胺基酸不必然是天然存在的胺基酸。此外，半胱胺酸殘基也不必然要設於多肽核的N-或C-端。舉例來說，可將半胱胺酸殘基設於多肽核中間的位置，而使得離胺酸殘基位於半胱胺酸殘基的兩側。
在較佳的情形中，耦合臂的自由端帶有四嗪基或高應力炔基(如，環辛烯基或環辛炔基)。這些耦合臂具有2-12個EG單元。根據本揭示內容的實施方式，上述四嗪基為1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪1,2,4,5-四嗪或其衍生物。高應力炔基可以是環辛烯基或環辛炔基。根據本揭示內容的實驗例，所述環辛烯基可以是反式-環辛烯(TCO)基；而環辛炔基的實施例包括，但不限於：二苯并環辛炔(DBCO)、二氟化環辛炔(DIFO)、二環壬炔(BCN)與二苯并環辛炔(DICO)。根據本揭示內容某些實施方式，四嗪基為6-甲基-四嗪。
根據多種實施例，用以與耦合臂連接的中心核包括，但不限於：Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-四嗪、Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-高應力炔基、Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-C-Xaa2-12-四嗪、Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-C-Xaa2-12-高應力炔基、 四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、高應力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4以及高應力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4。
或者是，中心核的一端帶有疊氮基或炔基，而另一端則接上了帶有四嗪基或高應力炔基的耦合臂，茲舉例如下：Ac-AAH-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-四嗪、Ac-AAH-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-高應力炔基、四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-AAH、高應力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-AAH、Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-四嗪、Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-高應力炔基、四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-AAH、高應力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-AAH、Ac-GHP-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-四嗪、Ac-GHP-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-高應力炔基、四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-GHP、高應力炔基-Xaa2-12-C(AC)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-GHP、Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-四嗪、Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-高應力炔基、四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-GHP以及高應力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-GHP。
也可利用重組技術來合成上述多肽，再利用細菌或哺乳類宿主細胞來表現指定的基因區段。如果多肽核的離胺酸殘基數目較多且長度較長，利 用重組蛋白技術較佳。這是因為當多肽長度變長時，使用固態合成法發生錯誤的機率會增加，且其純度和/或產量會降低。要運用細菌或哺乳類宿主細胞來產生多肽核時，可在兩個K殘基之間插入長度為2至20個胺基酸殘基的填充序列。此外，由於AHA和HPG並非可由遺傳密碼子編碼的天然胺基酸，這些重組多肽的N-端或C-端殘基可以是半胱胺酸。在表現出重組蛋白並將其純化之後，可使末端的半胱胺酸殘基和短的雙功交聯物反應；上述雙功交聯物的一端帶有可和半胱胺酸殘基的SH基反應的順丁烯二醯亞胺基，另一端則帶有炔基、疊氮基、四嗪基或高應力炔基。
相較於利用常規胺基酸(如甘胺酸與絲胺酸殘基)來合成多肽核，使用聚乙二醇化胺基酸來合成多肽核的步驟較少。此外，可採用不同長度的聚乙二醇化胺基酸(即，帶有不同EG重複單元者)，一方面可提供可撓性與水溶性，另一方面亦可在相鄰的離胺酸殘基之間提供間隔。除了聚乙二醇化胺基酸之外，中心核也可包含人工胺基酸，如D-構形胺基酸、高胺基酸、N-甲基胺基酸等。在較佳的情形中，可使用帶有不同長度聚乙二醇(PEG)的聚乙二醇化胺基酸來建構中心核，因為胺基分子中所含的PEG部分可提供構形上的可撓性，並在用以接合的基團間提供了適當的間隔，還可以提升其水溶性；另外，一般來說，PEG的免疫源性較低。合成帶有聚乙二醇化胺基酸的中心核的方法和合成常規多肽相似。
視需要，本發明中心核可更帶有一乙醯基，以保護位於N端的胺基酸殘基，進而提升其穩定性。
當可理解，連接於中心核的連接臂的數目主要取決於連接於中心核中所含離胺酸殘基的數目。由於本發明中心核包含至少兩個離胺酸殘基，所述接合單元可包含複數個連接臂。
參照第1A圖。如圖所示，接合單元10A包含中心核11a，其帶有一個HPG(GHP)殘基以及四個離胺酸(K)殘基，其間分別以填充序列(以下各圖式中以「…」表示)隔開。HPG殘基和K殘基之間或任兩個K殘基之間的填充序列可以是相同或不同的胺基酸序列。在本實施例中，四個連接臂20a-20d藉由NHS基和離胺酸殘基的胺基間所形成的醯胺鍵而連接到各個離胺酸殘基。當可理解，本說明書所述的多種接合單元間可能有一些共通的特徵，因此針對上述接合單元10A或下述各接合單元所述的某些或全部特徵可能也適用於下文提出的實施例，除非其明顯有悖於特定實施方式的脈絡。為求簡潔，下文可能不會重複說明這些共通特徵。
第1B圖繪示了根據本揭示內容另一種實施方式的接合單元10B。中心核11b有一個半胱胺酸(C)殘基以及六個離胺酸(K)殘基，這些殘基之間分別以填充序列隔開。在本實施例中，接合單元10B包含連接到各個離胺酸殘基的六個連接臂20a-20f。根據本揭示內容的實施方式，連接臂是具有2至20個EG重複單元的PEG鏈。
接合單元1B與第1A圖的接合單元10A不同之處在於接合單元1B更包含耦合臂60。如上文所述，可利用一端帶有順丁烯二醯亞胺基而另一端帶有一特殊官能基的PEG鏈來形成耦合臂60。如此一來，耦合臂60可透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應而連接到中心核11b的半胱胺酸殘基。在本實施例中，耦合臂60的自由端帶有的特殊官能基是四嗪基72。根據本揭示內容的實施方式，耦合臂是具有2至12個EG重複單元的PEG鏈。
當需要在標的部位釋放效應元件時，可以在連接臂中加入一個可裂解鍵；上述裂解鍵可經酸/鹼水解、還原/氧化或酵素作用而裂解。舉例來說，可利用NHS-PEG2-20-S-S-順丁烯二醯亞胺作為此處所述的耦合臂，這是一種可裂解PEG鏈，其中的S-S雙硫鍵會被緩慢的還原，而NHS基可用來和中心核的胺基 接合，進而將PEG鏈連接到中心核上。另外，可利用疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基來取代位在連接臂自由端的順丁烯二醯亞胺基。
根據本發明實施方式，連接到中心核的K殘基的連接臂在自由端帶有一官能基(即，順丁烯二醯亞胺基、NHS基、疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基)。在較佳的情形中，當連接臂的自由端是疊氮基、炔基或環辛炔基時，位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基是半胱胺酸殘基，且耦合臂的自由端是四嗪基或環辛烯基。或者是，當連接臂的自由端是四嗪基或環辛烯基時，位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基帶有疊氮基或炔基；或者是位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基是半胱胺酸殘基，且耦合臂的自由端帶有疊氮基、炔基或環辛炔基。
隨著位於連接臂自由端上官能基(即，順丁烯二醯亞胺基、NHS基、疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基)的不同，可以設計帶有相應官能基的功能性元件(譬如，標的元件、效應元件或用以改善藥動學性質的元件)，而使得所述功能性元件可透過任一種下列化學反應而連接到連接臂的自由端：(1)形成醯胺鍵：在此情形中，連接臂的自由端有一NHS基，且功能性元件有一胺基；(2)硫氫-順丁烯二醯亞胺反應：在此情形中，連接臂的自由端有一順丁烯二醯亞胺基，且功能性元件有一硫氫基；(3)一價銅催化的疊氮化物-炔羥環加成(copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition；CuAAC，或簡稱為「鍊接」反應)：連接臂的自由端和功能性元件其中之一帶有疊氮基，而另一個則帶有炔基；CuAAC反應如反應式1所示；(4)逆電子需求狄爾斯-阿德(inverse electron demand Diels-Alder，iEDDA)：連接臂的自由端和功能性元件其中之一帶有四嗪基，而另一個則帶有環辛烯基；iEDDA反應如反應式2所示；或 (5)應力促進的疊氮化物-炔羥鏈接化學(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)：連接臂的自由端和功能性元件其中之一帶有疊氮基，而另一個則帶有環辛炔基；SPAAC反應如反應式3所示。
<<反應式1 CuAAC反應>>
<<反應式2 iEDDA反應>>
<<反應式3 SPAAC反應>>
CuAAC反應會產生1,5-二取代1,2,3-三唑(1,5-disubstituted 1,2,3-triazole)。炔基和疊氮基之間的反應選擇性極高，且天然生物分子不含炔基和疊氮基。再者，上述反應快速且對pH值不敏感。已知除了利用一價銅(如溴化銅(I)或碘化銅(I))來催化鏈接反應之外，較佳可使用二價銅和還原劑(如抗壞血酸鈉)的混合物以在反應系統中原位(in situ)產生一價銅。或者是，可利用不含銅的反應，將第二元件連接到中心核的N-或C-端，此反應可利用環戊烷基環戊二烯基氯化釕複合物(pentamethylcyclopentadienyl ruthenium chloride complex)作為催化劑，以催化疊氮基-炔環加成反應。
為了方便說明，和連接臂相連的功能性元件稱為第一元件。當可理解，本發明接合單元可攜帶的第一元件的數目取決於中心核的K殘基的數目(且因此，取決於連接臂的數目)。因此，本發明所屬技術領域具有通常知識者可調整所述接合單元中第一元件的數目，以達到所欲的標的或治療效果。
如第1C圖所示，例示性的接合單元10C包含第一元件。除了下文所述的特徵之外，第1C所示結構與第1B圖相似。首先，中心核11d有五個K殘基，且因此有五個連接臂20a-20e分別與這些K殘基相連。其次，接合單元10C有五個第一元件30a-30e，分別連接於每一連接臂20a-20e。如下文所述，視需要加入的四嗪基72使得所述接合單元可和額外的功能性元件或另一個分子構建體(參見下文第二節或第三節)耦接。
為了要進一步增加所需的效果(如，療效)，本發明接合單元除了第一元件之外還可以包含第二元件。舉例來說，第二元件可以是標的元件或效應元件。在本揭示內容可任選的實施方式中，第一元件是效應元件，而第二元件可以是另一種效應元件，兩者可以累加地或加乘地作用，亦可獨立作用。在另一種例子中，第一與第二元件可發揮不同的性質；譬如，第一元件是標的元件，而第二元件是效應元件，反之亦然。或者是，第一元件是效應元件，而第二元件則能夠改善接合單元的藥動學特性，如水溶性、廓清率、半衰期與生物可用率。在選擇所述接合單元(或多臂接合物)所含的特定第一元件和/或第二元件時，需考量所欲的應用。下文第一節第(iii)部分討論了這些功能性元件的實施例。
在結構上，第二元件可連接到中心核N-或C-端的疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基。具體來說，當有需要時，可將第二元件和短PEG鏈(較佳為具有2至12個EG重複單元)複合，之後再將其連接到位在N-或C-端的帶有疊氮基或炔基的胺基酸殘基(譬如AHA殘基或HPG殘基)。或者是，當有需要時，可將第二元件和短PEG鏈複合，且之後再將其連接於中心核的耦合臂。
根據本揭示內容某些實施方式，中心核的N-或C-端是帶有疊氮基(譬如AHA殘基)的胺基酸殘基；且因此，帶有炔基的第二元件就可以透過CuAAC反應而連接到中心核的N-或C-端。根據本揭示內容其他實施方式，上述中心核 的N-或C-端是帶有炔基(譬如HPG殘基)的胺基酸殘基；而帶有疊氮基的第二元件就可以透過CuAAC反應而連接到中心核的N-或C-端。
第1D圖繪示根據本發明實施例的另一種接合單元10D，其攜帶了複數個第一元件與一個第二元件。在本實施例中，中心核11c包含一個HPG(GHP)殘基以及五個離胺酸(K)殘基。五個連接臂20a-20e分別連接到中心核11c的五個K殘基；而五個第一元件30a-30e則透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應連接到各個連接臂20a-20e。除了第一元件之外，所述接合單元10D更包含一個第二元件50，其係連接於短PEG鏈62的一端。在和中心核11c複合之前，短PEG鏈62的另一端帶有疊氮基。如此一來，疊氮基可和帶有炔基的HPG殘基進行CuAAC反應，而使得第二元件50連接至中心核11c。第1D圖所示的實心圓點40代表HPG殘基和疊氮基間因為CuAAC反應所形成的化學鍵結。
或者是，第二元件透過耦合臂而和中心核連接。根據本揭示內容某些實施方式，耦合臂帶有四嗪基，因此可透過iEDDA反應而有效率地連接到帶有TCO的第二元件。根據本揭示內容其他實施方式，耦合臂帶有TCO基，而第二元件可帶有四嗪基，故兩者可透過iEDDA反應而互相連接。相較於位在端點的炔基，iEDDA反應中所採用的高應力環辛烯基的活化能明顯較低，且因此iEDDA反應不需使用額外催化劑。
接著參照第1E圖，其中接合單元10E的中心核11d包含位於N端的半胱胺酸(C)殘基和五個離胺酸(K)殘基。如第1E圖所示，這五個連接臂20a-20e分別連接到中心核11d的五個K殘基，而五個第一元件30a-30e則透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應而分別連接到五個連接臂20a-20e。半胱胺酸殘基連接於耦合臂60；在接上第二元件之前，耦合臂60的自由端帶有四嗪基或TCO基。在本實施例中，第二元件50可和帶有相應TCO或四嗪基的短PEG鏈62連接，再透過iEDDA反應 而連接到耦合臂60。第1E圖所示的橢圓點70代表耦合臂60和短PEG鏈62間進行iEDDA反應所產生的化學鍵結。
根據本揭示內容其他實施方式，在和第二元件接合之前，耦合臂帶有疊氮基；當第二元件和自由端帶有高應力炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO基)的短PEG鏈連接時，耦合臂和第二元件就可以透過SPAAC反應(參見反應式3)而連接，反之亦然。
接著參照第1F圖，其中接合單元10F的結構和第1E圖的接合單元10E相近，不同之處在於耦合臂60帶有疊氮基或高應力炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO基)而不是四嗪基或TCO基。因此，第二元件50要和帶有相應的高應力炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO)或疊氮基的短PEG鏈62連接，而使得第二元件50和耦合臂60可透過SPAAC反應而連接。第1F圖所示的菱形點90代表耦合臂60與短PEG鏈62之間因為SPAAC反應所形成的化學鍵結。
反應式4為製備本發明接合單元的例示性流程。
在步驟1，先製備中心核，其胺基酸序列包含(GSK)3，且C端為L-疊氮高丙胺酸(AHA)殘基。在步驟2，透過在NHS基與胺基間形成醯胺鍵，而將三個連接臂分別連接到中心核的離胺酸(K)殘基，連接到中心核的連接臂在自由端帶有順丁烯二醯亞胺(Mal)基。在步驟3，透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應將三個抗-纖維素抗原scFv(scFv α纖維素)連接到各連接臂上，此處的scFv α A即為第一元件。同時，在步驟4，將一個tPA類似物和自由端帶有DBCO基的短PEG鏈連接，上述短PEG鏈有4個EG重複單元，此處的tPA類似物即為第二元件。最後，在步驟5，透過SPAAC反應將第二元件連接到中心核的AHA殘基。
<<反應式4 透過連接臂與C-端胺基酸殘基連接兩種不同scFv的接合單元的製備方法>>
反應式5繪示製備本發明接合單元的另一種例示性流程。在步驟1，先製備中心核，其胺基酸序列包含(K-Xaa4)3且C-端有一半胱胺酸殘基。在步驟2，將一端帶有順丁烯二醯亞胺(Mal)基另一端帶有四嗪基的PEG鏈(作為耦合臂)透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應連接到半胱胺酸殘基。之後，在步驟3，將三個連接臂分別連接到中心核的離胺酸(K)殘基。接著，如步驟4所示，透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應將三個抗-纖維素scFv(scFv α纖維素)連接到各連接臂上，此處的scFv α A即為第一元件。同時，在步驟5，將一個tPA類似物和自由端帶有TCO基 的短PEG鏈連接，上述短PEG鏈有3個EG重複單元，此處的scFv α B即為第二元件。最後，在步驟6，透過iEDDA反應將第二元件連接到耦合臂。
<<反應式5 透過連接臂與耦合臂連接兩種不同scFv的接合單元的製備方法>>
聚乙二醇化(PEGylation)是將PEG鏈附接或連接到分子(如，藥物或蛋白)的方法。聚乙二醇化可以改善多種重要的藥理學特性，譬如提升水溶性、延長生命週期以及減少蛋白質分解降解。根據本揭示內容一實施方式，第二元件是PEG鏈，其分子量約為20,000到50,000道耳頓。
第1G圖繪示了另一種例示性的接合單元10G，其中五個第一元件30分別透過連接臂20連接到離胺酸殘基，且中心核11e的HPG(GHP)殘基透過 CuAAC反應與PEG鏈80連接。第1G圖所示的實心圓點40代表HPG殘基與PEG鏈80間因為CuAAC反應所形成的化學鍵結。
第1H圖是本揭示內容的另一種實施例，接合單元10H的中心核11d的N-端是與耦合臂60相連接的半胱胺酸殘基。可透過iEDDA反應而有效率地將PEG鏈80連接到耦合臂60。接合單元10H的橢圓點70代表耦合臂60與PEG鏈80之間因為iEDDA反應所形成的化學鍵結。
第1I圖是本發明接合單元的另一種實施例，所示的接合單元10I結構與第1G圖的接合單元10G相似，不同之處在於PEG鏈80是透過SPAAC反應連接到耦合臂60。第1I圖所繪示的菱形點90代表耦合臂60與PEG鏈80之間因為SPAAC反應所形成的化學鍵結。
根據本揭示內容某些實施方式，除了第一與第二元件之外，本發明接合單元更包含第三元件。在此種實施例中，中心核的N-或C-端是帶有疊氮基或炔基的胺基酸殘基，而另一端是半胱胺酸殘基。中心核的離胺酸殘基分別和連接臂相連接，且每一條連接臂的自由端帶有順丁烯二醯亞胺基；而中心核的半胱胺酸殘基則和自由端帶有四嗪基或高應力炔基的耦合臂相連。如此一來，第一元件可透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應連接於連接臂，而第二元件則可透過iEDDA反應和耦合臂相連接。另外，第三元件則是透過CuAAC反應或SPAAC反應而連接到帶有疊氮基或炔基的末端胺基酸殘基。
接著參照第1J圖的接合單元10J，其中心核11f的N-端為HPG(GHP)殘基，而C-端是半胱胺酸殘基。連接臂20和耦合臂60分別連接到中心核11f的離胺酸(K)殘基以及半胱胺酸(C)殘基。此外，五個第一元件30分別連接到五個連接臂20，第二元件(即，PEG鏈)80和耦合臂60連接，而第三元件50則透過短PEG鏈62連接到HPG殘基。實心圓點40代表HPG殘基和短PEG鏈62之間因為CuAAC反 應所形成的化學鍵結；而橢圓點70代表耦合臂60與PEG鏈80之間因為iEDDA反應所形成的化學鍵結。
第1K圖繪示了本揭示內容的另一種實施方式；接合單元10K的結構與第1J圖所示的接合單元10J相似，不同之處在於短PEG鏈62是透過SPAAC反應而連接到HPG殘基，而非透過iEDDA反應。第1K圖的菱形點90代表短PEG鏈62和HPG殘基之間因為SPAAC反應所形成的化學鍵結。
在本揭示內容較佳的實施方式中，連接臂的自由端帶有順丁烯二醯亞胺基，以便和帶有硫氫基的第一元件透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應而連接。此外，多肽核的一端可以是半胱胺酸殘基或帶有疊氮基或炔基的胺基酸殘基，以供和耦合臂接合，進而連接第二元件。
本發明所屬技術領域具有通常知識者當可想見，可對上述結構進行各種修改。舉例來說，在連接臂的自由端可採用順丁烯二醯亞胺基以外的官能基(譬如疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基)，以便透過CuAAC、iEDDA或SPAAC反應來連接第一元件。此外，半胱胺酸殘基(或帶有疊氮基或炔基的胺基酸殘基)可以位在多肽核N-或C-端以外的位置。更有甚者，可在多肽核中加入二或更多個上述殘基，以供接合多個耦合臂，並進一步連接多個第二元件。
(ii)用於多臂接合物的化合物核
除了本揭示內容第一節第(i)部分所述的述接合單元之外，此處亦揭示了另一種接合單元，其使用化合物(而非多肽)作為中心核。具體來說，所述化合物可以是苯-1,3,5-三胺、2-(胺甲基)-2-甲基丙烷-1,3-二胺、三(2-胺乙基)胺、苯-1,2,4,5-四胺、3,3’,5,5’-四胺-1,1’-聯苯、四(2-胺乙基)甲烷、四(乙胺)肼、N,N,N’,N’,-四(胺乙基)乙二胺、苯-1,2,3,4,5,6-六胺、1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-六(甲胺)-苯-1,3,5-三胺、1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N,-八(甲胺)-苯-1,2,4,5-三胺、苯-1,2,3,4,5,6-六胺或N,N-二[(1-胺基-3,3-二胺乙基)戊基]甲烷二胺。上述化合物 均帶有至少三個相等或對稱構形的胺基。因此，當一化合物的其中一個胺基與一耦合臂複合時，所有由該化合物形成的分子都具有相同的構形。
此處所述的化合物和本揭示內容第一節第(i)部分所述的接合單元相似，都分別包含複數個胺基，且因此，可將複數個帶有NHS基的PEG鏈透過胺基和NHS基之間所形成的醯胺鍵而連接到化合物核上；利用此方式接上來的PEG鏈即為本案所述的連接臂，此連接臂的自由端帶有一官能基(如，NHS基、順丁烯二醯亞胺基、疊氮基、炔基、四嗪基、環辛烯基或環辛炔基)。同時，所述化合物核有至少一個胺基連接到另一PEG鏈，此PEG鏈一端帶有NHS基且另一端帶有一官能基(如，疊氮基、炔基、四嗪基、環辛烯基或環辛炔基)；化合物核與此種PEG鏈同樣透過醯胺鍵結來連接，接上後的此一PEG鏈稱為耦合臂，其自由端帶有上述特殊官能基。
因此，可藉由以下方式將第一元件連接到連接臂上：(1)在兩者間形成醯胺鍵鍵；(2)透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應；(3)透過CuAAC反應；(4)透過iEDDA反應；或(5)透過SPAAC反應。同時，可透過CuAAC反應、iEDDA反應或SPAAC反應將第二元件連接到耦合臂上。
根據本揭示內容某些實施方式，連接臂是具有2至20個EG重複單元的PEG鏈；而耦合臂則是具有2至12個EG重複單元的PEG鏈。
反應式6、7分別繪示了中心化合物核和連接臂之間以及中心化合物核和耦合臂之間的連接關係，其中NHS代表NHS酯類、Mal代表順丁烯二醯亞胺基、azide代表疊氮基且alkyne代表炔基。
作為中心核的化合物應有多對稱且有相同方向的胺基，其理由如下：當利用其中一個胺基來連接一個雙功接合臂(即，一端帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)酯基且另一端帶有炔基、疊氮基、四嗪基或高應力炔基)時，可以得到均質的產物(也就是接有耦合臂的中心核，且耦合臂帶有炔基、疊氮基、四嗪基 或高應力炔基)，故可輕易將其純化。之後可利用此種產物來製備多臂接合單元，將剩餘的胺基都接上自由端帶有順丁烯二醯亞胺基或其他耦合基團的連接臂。若帶有多個胺基的化合物是不對稱的化合物，此種化合物和雙功接合臂/耦合臂接合後所得到的產物就不是均質的產物。
<<反應式6 將分別帶有順丁烯二醯亞胺基與疊氮壓的連接臂與耦合臂連接到中心核>>
<<反應式7 將分別帶有順丁烯二醯亞胺基與炔基的連接臂與耦合臂連接到中心核>>
可進一步修飾上述對稱化合物，以使得其可和更多的連接臂/耦合臂連接。舉例來說，四(2-胺乙基)甲烷是可從一般化合物合成或商業購得的化 合物，可利用此種化合物來建構連接了四個連接臂/耦合臂的接合單元。將四(2-胺乙基)甲烷和雙硫代琥珀醯亞胺辛二酸酯(bis(sulfosuccinimidyl)suberate)進行縮合反應，所得到的產物是N,N-二[(1-胺基-3,3-二胺乙基)戊基]甲烷二胺，此一產物有兩個四(2-胺乙基)甲烷單元，並可用以連接六個連接臂/耦合臂。此處所述的接合單元分別帶有三個、四個與六個連接臂/耦合臂，對於建構具有標的/效應分子的聯合接合物來說，上述連接臂/耦合臂的數目應相當充足。
當可理解，連接臂和/或耦合臂的數目還有與其連接的元件數目都取決於中心核中所含的胺基數目。在某些較佳的實施方式中，連接臂/耦合臂的數目還有與其連接的元件數目是1到7個。
參照第2圖，其中繪示了帶有四個胺基的苯-1,2,4,5-四胺；其中三個胺基分別和連接臂20相連，而另一個胺基則和耦合臂60相連，且耦合臂60的自由端帶有疊氮基。之後，透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應將三個第一元件30分別連接到三個連接臂20上，並透過CuAAC反應將一個第二元件50連接到耦合臂60上。第2圖中所示的實心圓點40代表耦合臂60與第二元件50之間因為CuAAC反應所形成的化學鍵結。
(iii)適用於多臂接合物的功能性元件
當接合單元(或多臂接合物)僅包含第一元件而不帶有第二和/或第三元件時，第一元件是一效應元件，其可於患者體內發揮治療的效果。另一方面，當此處提出的接合單元包含除了第一元件以外的其他元件時，則這兩種元件中應有至少一種是效應元件，而另一者可以是另一效應元件、一標的元件或能夠改善接合單元藥動學特性(如，溶解度、廓清率、半衰期與生物可用率)的元件。譬如，接合單元可帶有兩種不同的效應元件、一效應元件與一標的元件或一提升藥動學特性的元件、兩種不同的標的元件與一種效應元件、兩種不 同的效應元件與一種標的元件；或是可帶有一種標的元件、一種效應元件以及一種可改善接合單元藥動學特性的元件。
根據本揭示內容某些實施方式，本案所述的接合單元可用於預防血栓形成。在這些實施方式中，本案提出的接合單元之第一元件為對纖維素專一的scFv(作為標的元件)，其第二元件為第Xa型凝血因子抑制劑或凝血酶抑制劑(作為效應元件)。在較佳的情形中，所述第Xa型凝血因子抑制劑是選自由阿哌沙班、伊度沙班與利伐沙班所組成的群組；且所述凝血酶抑制劑是阿加曲班或美拉加群。
用於治療血管栓塞的接合單元之第一元件是對纖維素專一的scFv(作為標的元件)，且其第二元件是組織性血漿蛋白原活化因子(作為效應元件)，譬如阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶與拉諾普酶。
(iv)多臂接合物的用途
本揭示內容亦關於利用適當接合單元來治療各種疾病的方法。一般來說，所述方法包含以下步驟：對需要治療個體投予有效量的根據本揭示內容實施方式的接合單元。
相較於既有的治療性構建體，第一節以上段落所述的接合單元至少有以下的優點：
(1)可以視需求和/或用途來調整功能性元件的數目。根據不同用途的需求，本發明接合單元可包含二種元件(即，第一與第二元件)或三種元件(即，第一、第二與第三元件)，上述需求包括欲治療的疾病、接合單元的給藥方法、接合單元所攜抗體的結合力與親和力等等。舉例來說，當要將接合單元直接投遞到特定組織/器官(譬如，治療眼睛)時，可以只使用一種元件作為效應元件，而不需加入標的元件。然而，當透過周邊給藥途徑來投遞接合單元時，譬如經口服、腸胃道、鼻腔、局部或黏膜給藥、或以肌肉內、靜脈 內或腹膜內注射，本發明接合單元就需要包含標的元件，以便將接合單元專一地標的到病灶部位；此外，接合單元還應該包含效應元件，以便在病灶部位發揮治療效果。為了要提高接合單元的標的或治療效果或提升其穩定度，本發明接合單元還可進一步包含第三元件；所述的第三元件可以是第二種標的元件、第二種效應元件或PEG鏈。
(2)第一元件是以成束(bundle)的形式存在。如上文所述，第一元件的數目取決於中心核所包含的離胺酸殘基的數目。如果中心核中離胺酸殘基的數目是2到15，則每一接合單元可帶有至少兩個第一元件。因此，相較於傳統治療性構建體僅能攜帶單一個分子(譬如單一個細胞毒性藥物或抗體分子)，本發明接合單元可同時提供更多的功能性元件(不論是標的元件或效應元件)，進而可大幅提升療效。
在某些治療應用中，可能想要採用單一份的標的或效應元件。譬如，可使用單一份標的元件來避免因為標的元件結合力太強而導致不理想的副作用；當所用的scFv對標的抗原有相對較高的親和力，且當標的抗原是正常細胞(而非所標的的染病細胞)上的細胞表面抗原時，上述考量更顯重要。在一實施例中，當使用對CD3或CD16a專一的scFv來招募T細胞或NK細胞以消滅所標的之細胞(譬如葛瑞夫茲氏症患者的甲狀腺細胞)時，較佳可使用單一份對CD3或CD16a專一的scFv，因而能夠避免因為CD3或CD16a交聯而產生的不良副作用。相似地，在使用對CD3或CD16b專一的scFv來招募吞噬性嗜中性白血球與巨噬細胞來清除與抗體結合的病毒或細菌粒子或其產物時，較佳可使用單一份scFv。此外，在使用對運鐵蛋白受器專一的scFv來攜帶效應藥物分子至BBB以治療CNS疾病時，較佳可使用單一份對運鐵蛋白受器專一的scFv。在又一種例子中，可能想要加入單一份的長鏈PEG，以提升接合單元的藥動學特性；因為使用兩個或更多的長PEG鏈可能會使得PEG鏈纏結而影響標的或效應元件的結合力。
第二節 用以預防血栓形成與治療血管栓塞的Fc型分子構建體及其用途
以廣義的Fc構形來看，可利用免疫球蛋白抗體作為一標的或效應元件的基礎，並將與其搭配的效應或標的元件以scFv區域的形式引入其兩條γ重鏈的C-端。以傳統的「Fc」構形來看，可利用雙鏈IgG.Fc作為分子平台的基礎。每一多肽鏈可和一或兩個標的元件以及一或兩個效應元件融合，使得每一鏈共帶有二至三個元件。具有Fc構形的T-E分子總計可帶有四至六個元件(譬如scFv、生長因子或細胞介素)。在可任選的實施方式中，所述分子構建體的Fc部分亦帶有Fc介導的效應功能，如ADCC和/或補體介導的活化作用。然而在某些其他應用中，不會出現此種Fc介導的效應功能。
藉由挑選本案Fc型分子構建體的T-E元件，所得到的分子構建體可用於預防和/或治療與血液凝集相關的疾病，包括血栓形成與血管栓塞。在某些實施方式中，本揭示內容的優點還包括使用了本揭示內容提出的接合單元，因而提供了一種能夠輕易控制此處提出的Fc型分子構建體的標的與效應元件數量的方法。隨著所選用的標的和/或效應元件不同，本Fc型分子構建體可採用不同的構形，茲分述如下。
在第一類的Fc型分子構建體中，標的元件是抗體或其片段，而效應元件則為一多肽。
第3A圖繪示了根據本揭示內容某些實施方式的Fc型分子構建體1200A包含連接於成對CH2-CH3鏈1210之N-端的一對標的元件T1(此元件為一scFv)，以及連接於成對CH2-CH3鏈1210之C-端的一對效應元件E1(此元件為治療性多肽)。或者是，在第3B圖的Fc型分子構建體1200B中，成對的標的元件T1(此元件為一scFv)係連接於CH2-CH3鏈1210之C-端；而成對的效應元件E1(此元件為治療性多肽)則是連接於成對CH2-CH3鏈1210之N-端。
在某些實施方式中，CH2-CH3鏈是來自人類免疫球蛋白γ1或γ4。一般來說，當想要發揮Fc介導的功能(如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)以及補體介導活性(發炎活化或目標細胞溶解))時，可以選擇γ1。當想要避免Fc介導的功能時，可以選用γ4來建構本發明Fc型分子構建體。
在某些實施方式中，成對的標的元件採用Fab構形(即，由VH-CH1區域與VL-Cκ區域組成)；此種Fab片段係連接於CH2-CH3鏈的N-端，而使得Fc型分子構建體成為IgG構形。在這些情形中，成對的效應元件可連接於成對CH2-CH3區段的C-端
舉例來說，在第3C圖所示的Fc型分子構建體1200C中，兩個標的元件T1分別包含VH-CH1區域820與VL-Cκ區域825，因而形成連接於CH2-CH3鏈810的N-端的Fab構形830，而使得Fc型分子構建體1200C成為IgG構形。在本例中，成對的效應元件E1是連接於成對CH2-CH3鏈810的C-端。
在第二類的Fc型分子構建體中，標的元件是抗體或其片段，而效應元件則為載藥束。
在此類情形中，用以治療患病細胞的Fc型分子構建體的構形如第4A圖的分子構建體1000A或第4B圖的分子構建體1000B所示。在第4A圖中，效應元件E1(如載藥束)係連接於成對CH2-CH3區段1010的C-端，而標的元件T1(於本例中，scFv)則是連接到成對CH2-CH3區段1010的N-端。根據替代性的實施方式，分子構建體1000B(參見第4B圖)的成對標的元件T1採用Fab 1030的構形。具體來說，Fab 1030構形包括VH-CH1區域1020以及VL-Cκ區域1025，其係連接至成對CH2-CH3區段1010的N-端，而使得Fc-型分子構建體1000A成為IgG構形。在本例中，成對的效應元件E1連接至成對CH2-CH3區段1010的C-端。
在某些實施方式中，CH2-CH3鏈是來自人類免疫球蛋白γ1或γ4。一般來說，當想要發揮Fc介導的功能(如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)以及補體介 導活性(發炎活化或目標細胞溶解))時，可以選擇γ1。當想要避免Fc介導的功能時，可以選用γ4來建構本發明Fc型分子構建體。
當可想見，當效應元件E1是載藥束時，可利用本揭示內容所述的接合單元(參見，如第1A圖至第1C圖)作為載藥束。根據本揭示內容的原理與精神，可分別製備標的構建體(包含成對CH2-CH3區段1010以及標的元件T1)與載藥束(作為效應元件E1)，之後再將兩者複合。
根據本揭示內容多個實施方式，上述載藥束包含一中心核、複數個連接臂以及視需要而加入的耦合臂。根據本揭示內容多種實施方式，中心核可以是具有複數個胺基的化合物或包含複數個離胺酸(K)殘基的多肽。每一連接臂的一端藉由和化合物核的胺基或多肽核的K殘基反應，而與中心核連接。連接臂在其自由端帶有順丁烯二醯亞胺基，而每一藥物分子則藉由和順丁烯二醯亞胺基反應以透過連接臂而與中心核連接。在視需要而採用的實施方式中，每一效應元件E1是帶有3至5個治療性分子的載藥束。
在中心核是多肽核的情形中，位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基是半胱胺酸殘基或帶有疊氮基或炔基。根據某些實施方式，當多肽中心核的末端胺基酸殘基帶有疊氮基時，載藥束可以透過發生於上述末端殘基與多肽延伸段C-端之間的SPAAC或CuAAC反應而與其連接。或者是，當多肽中心核的末端胺基酸殘基帶有炔基時，載藥束可以透過發生於上述末端殘基與多肽延伸段C-端之間的CuAAC反應而與其連接。又或者是，當多肽中心核的末端殘基是半胱胺酸或中心核是化合物核時，載藥束更包含上述耦合臂。耦合臂的一端藉由和多肽核的半胱胺酸殘基反應或和化合物核的一胺基反應，而與中心核連接。耦合臂的自由端亦帶有炔基、疊氮基、四嗪基或高應力炔基，而使得載藥束可透過iEDDA反應(耦合臂帶有四嗪基或環辛烯基時)、SPAAC反應(耦合臂帶有疊氮 基或環辛炔基時)、或CuAAC反應(耦合臂帶有炔基或疊氮基時)而連接到多肽延伸段的C-端。
根據某些實施方式，所述用以治療疾病的Fc-型分子構建體更包含一段多肽延伸段1050(參見，第4A與4B圖)，其序列為(G2-4S)2-8C。如圖所示，成對的多肽延伸段1050連接到成對CH2-CH3區段1010的C-端。多肽延伸段C-端的半胱胺酸殘基透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應而和耦合臂1055相連接。此外，在將其和效應元件E1(此處為一載藥束)耦合之前，耦合臂的自由端(即，並未和半胱胺酸殘基相連的一端)經過炔基、疊氮基、高應力炔基或四嗪基的修飾，而使得載藥束可透過iEDDA反應(參見第4A圖)、SPAAC(參見第4B圖)或CUAAC反應(未繪示)而與其相連。
舉例來說，在第4A圖中，效應元件E1(此處為一載藥束)的第二耦合臂1040透過iEDDA反應而連接於CH2-CH3區段1010。第4A圖所示的橢圓點1045代表多肽延伸段1050與效應元件E1間，因為iEDDA反應而產生的化學鍵結。當可理解，iEDDA反應通常發生於四嗪基與環辛烯基(如反式-環辛烯(transcyclooctene，TCO)基)之間。
或者是，在第4B圖中，效應元件E1透過SPAAC反應而連接到CH2-CH3區段1010。第4B圖所示的菱形點1045代表多肽延伸段1050與效應元件E1間，因為SPAAC反應而產生的化學鍵結。具體來說，SPAAC反應通常發生在疊氮基與高應力炔基(如，環辛炔基，包括：二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne，DBCO)、二氟化環辛炔(difluorinated cyclooctyne，DIFO)、二環壬炔(bicyclononyne，BCN)以及二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne，DICO)基)之間。
在第三類的Fc型分子構建體中，標的元件與效應元件其中一種是多肽。
當可想見，上文關於Fc型分子構建體的Fc區域與載藥束的敘述亦適用於此，此處為求簡潔不再贅述。
(ii)適用於Fc型分子構建體的功能性元件
在討論了本案Fc型分子構建體的基本結構之後，下文進一步說明某些由特定效應元件(們)與標的元件(們)所形成的組合。
在建構用於預防和/或治療與血栓相關的疾病/症狀的Fc型分子構建體時，可使用對纖維素專一的抗體或其片段作為標的元件。
在以預防血栓形成為主要目的之應用中，所述Fc型分子構建體可使用帶有多個第Xa型凝血因子抑制劑或凝血酶抑制劑分子的載藥束作為效應元件。例示性的第Xa型凝血因子抑制劑包括阿哌沙班、伊度沙班與利伐沙班。非限制性的凝血酶抑制劑的實施例包括阿加曲班與美拉加群。用以預防血栓形成的Fc型分子構建體可具備如第4A圖或第4B圖所示的構形。
用以治療血管栓塞的Fc型分子構建體則可以使用組織性血漿蛋白原活化物作為效應元件，譬如阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶與拉諾普酶，此類效應元件為單鏈多肽。用以治療血管栓塞的Fc型分子構建體可具備如第3A至3C圖所示的構形。
本發明的精髓在於採用特定標的與效應元件的組合或搭配。在較佳的實施方式中，所述分子構建體採用了Fc融合構形。本發明所屬技術領域具有通常知識者當可想見，亦可利用其他分子平台來連接此處提出的標的與效應元件的組合；上述分子平台諸如多肽、蛋白質(譬如白蛋白)、聚醣、聚乙二醇以及其他類型的聚合物，只要其能夠作為連接多個分子元件的結構基礎即可。
(iii)Fc型分子構建體的用途
本揭示內容亦涉及了利用適當Fc型分子構建體來多種疾病的方法。一般來說，上述方法涉及了對需要此一治療的個體投予治療有效量的Fc型 分子構建體，所述Fc型分子構建體可以是根據本揭示內容各實施方式所述的任一種Fc型分子構建體。
實驗例
實驗例1：合成作為多肽核的多肽1(序列編號：18)，並將半胱胺酸殘基的SH基和作為耦合臂的順丁烯二醯亞胺-PEG 4 -四嗪複合
將將合成多肽1(Chinapeptide Inc.，上海，中國)溶解於100mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.0；含50mM NaCl與5mM EDTA)，最終濃度2mM。利用1mM TCEP使溶解的多肽還原，反應溫度25℃、時間2小時。將多肽和順丁烯二醯亞胺-PEG4-四嗪(Conju-probe Inc.)以1/5的比例混合，並在pH 7、4℃的條件下反應24小時，以使半胱胺酸殘基的SH基和順丁烯二醯亞胺-PEG4-四嗪複合而帶有功能性連接基團四嗪。利用反相HPLC來純化四嗪-多肽複合物；使用Supelco C18管柱(250mm X 10mm；5μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸、線性梯度為0%至100%乙腈、30分鐘，流速1.0mL/min、管柱溫度25℃。
所述合成四嗪-多肽1(如下所示)的分子量為2,185.2道耳頓。
實驗例2：合成作為多肽核的多肽2(序列編號：26)，並將半胱胺酸殘基的SH基和作為耦合臂的順丁烯二醯亞胺-PEG 3 -TCO複合
利用與上文相似的方法來處理合成多肽2(Chinapeptide Inc.，上海，中國)。簡言之，將多肽溶解於100mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.0；含50mM NaCl與5mM EDTA)，最終濃度2mM。利用1mM三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine，簡稱TCEP)使溶解的多肽還原，反應溫度25℃、時間2小時。將多肽和順丁烯二醯亞胺-PEG3-TCO(Conju-probe Inc.)以1/7.5的莫耳比混合，並在pH 7.0、25℃的條件下反應18小時，以使半胱胺酸殘基的SH基 和順丁烯二醯亞胺-PEG3-TCO複合而帶有功能性連接基團TCO。利用反相HPLC來純化TCO-多肽複合物；使用Supelco C18管柱(250mm X 10mm；5μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸、線性梯度為0%至100%乙腈、30分鐘，流速1.0mL/min、管柱溫度25℃。
以MALDI-TOF質譜分析來確認所合成的TCO-多肽(如下所示)。由中央研究院分子生物研究所(臺灣臺北)的核心設施單位進行質譜分析。以Bruker Autoflex III MALDI-TOF/TOF質譜分析儀(Bruker Daltonics,Bremen,Germany)進行測量。
所合成的TCO-多肽2(如下所示)的分子量為2,020.09道耳頓。
實驗例3：將作為連接臂的NHS-PEG 12 -順丁烯二醯亞胺和四嗪-多肽1的胺基複合以合成接合單元
將三個PEG12-順丁烯二醯亞胺連接臂連接到多肽核四嗪-多肽1。交聯物NHS-PEG12-順丁烯二醯亞胺(琥珀醯亞胺-[(N-順丁烯二醯亞胺基-丙醯胺基)-十二乙二醇]酯(succinimidyl-[(N-maleimido-propionamido)-dodecaethyleneglycol]ester)係購自Conju-probe Inc。根據製造商的指示進行接合。將帶有離胺酸殘基的多肽溶解於複合緩衝液磷酸鹽緩衝液(PBS；pH 7.5)中，濃度100mM。在溶解的多肽中加入NHS-PEG12-順丁烯二醯亞胺交聯物，最終濃度1mM(比起0.1mM多肽溶液，莫耳數過量10倍)。使反應混合物在室溫下反應18小時。以反相HPLC純化PEG12-順丁烯二醯亞胺-四嗪-多肽1複合物；使用Supelco C18管柱(250mm X 4.6mm；5μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸、線性梯度為0%至100%乙腈、30分鐘，流速1.0mL/min、管柱溫度25℃。
所述合成PEG12-順丁烯二醯亞胺-四嗪-多肽1複合物接有一條帶有四嗪基的耦合臂以及三條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂，其分子量為4,461道耳頓。
實驗例4：將作為連接臂的NHS-PEG 6 -順丁烯二醯亞胺和TCO-多肽2的胺基複合以合成接合單元
利用上文實驗例所述的方式，將NHS-PEG6-Mal和TCO-多肽2的胺基複合。簡言之，將NHS-PEG6-順丁烯二醯亞胺交聯物加入溶解的多肽中，最終濃度40mM(相對於2mM的多肽溶液過量20倍)。在室溫下使反應混合物反應3小時。
此處合成的PEG6-順丁烯二醯亞胺-多肽2複合物(如下所示)是一種採用多肽核的接合單元，其上接有一個TCO官能基以及五條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂，其分子量為4,478道耳頓(第5圖)。
實驗例5：將阿哌沙班羧酸分子與NH 2 -PEG 3 -S-S-PEG 3 -NH 2 交聯物複合
阿哌沙班羧酸係購自KM3 Scientific Inc.(新北市，臺灣)。使阿哌沙班羧酸分子上經活化的羧基和同型雙功(homo-bifunctional)可剪切交聯物NH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2反應，參見反應式8。
<<反應式8 兩個阿哌沙班羧酸分子與NH 2 -PEG 3 -S-S-PEG 3 -NH 2 交聯物的複合>>
將阿哌沙班羧酸溶於100% DMSO中，最終濃度20mM；而同型雙功可剪切交聯物NH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2則溶於PBS中，最終濃度10mM。將鹽酸1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳二亞胺鹽(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC；購自KM3 Scientific Inc.)以1：2的莫耳比([阿哌沙班]：[EDC])加入阿哌沙班羧酸溶液中，並反應15分鐘，以活化阿哌沙班羧酸的羧基。
將活化的阿哌沙班羧酸溶液加入NH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2交聯物中，最終濃度2mM(相對於0.4mM的NH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2交聯物溶液 過量5倍)。使反應混合物在室溫下反應3小時。
以反相HPLC純化阿哌沙班-PEG3-S-S-PEG3-阿哌沙班；使用Supelco C18管柱(250mm X 4.6mm；5μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸、線性梯度為0%至100%乙腈、30分鐘，流速1.0mL/min、管柱溫度25℃。
本實驗例所合成的阿哌沙班-PEG3-S-S-PEG3-阿哌沙班的質譜分析結果(參見，第6圖)顯示此分子構建體的分子量為1,301.64與1,323.68道耳頓，分別與[M+H]+與[M+Na]+相對應。
實驗例6：將兩個阿加曲班分子和NH 2 -PEG 3 -S-S-PEG 3 -NH 2 交聯物複合
阿加曲班係購自KM3 Scientific Inc.(新北市，臺灣)。利用上文實驗例所述的方式，將NH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2複合至阿加曲班分子的COOH官能基。
<<反應式9阿加曲班分子與NH 2 -PEG 3 -S-S-PEG 3 -NH 2 交聯物的複合>>
簡言之，將阿加曲班溶於100% DMSO，最終濃度20mM。將 EDC溶液加入至阿加曲班溶液並反應15分鐘，以活化阿加曲班的COOH基。將經活化的阿加曲班溶液加入NH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2交聯物溶液中，最終濃度2mM(相對於0.4mM的NH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2交聯物溶液過量5倍)。(參見反應式9)。
第7圖的MALDI-TOF結果顯示，本實驗例所合成的阿加曲班-PEG3-S-S-PEG3-阿加曲班分子量為1,378.61道耳頓。
實驗例7：將阿哌沙班-PEG 3 -SH和阿加曲班-PEG 3 -SH複合至順丁烯二醯亞胺-PEG 6 -TCO-多肽2複合物
在和帶有五條順丁烯二醯亞胺-PEG6連接臂的TCO-多肽2複合之前，先將上文實驗例所製備的阿哌沙班-PEG3-S-S-PEG3-阿哌沙班和阿加曲班-PEG3-S-S-PEG3-阿加曲班和4mM TCEP以3：1的莫耳比([TCEP]：[藥物-交聯物])在室溫下輕微搖晃使其反應90分鐘，以得到帶有自由硫氫基的阿哌沙班-PEG3-SH與阿加曲班-PEG3-SH分子。
所合成的載藥束(如下所示)是帶有一自由TCO官能基以及一組五個阿哌沙班分子(作為效應元件)的接合單元。此一分子構建體的分子量為7,713道耳頓，對應於[M+H]+。
此處合成的另一種載藥束(如下所示)是帶有一自由TCO官能基以及一組五個阿加曲班分子(作為效應元件)的接合單元。此一分子構建體的分子 量為8,112.8道耳頓，對應於[M+H]+。
實驗例8：利用Expi293F過表現系統製備對人類纖維素專一單抗的小鼠scFv
對人類纖維素專一的scFv的VL與VH係來自小鼠單株抗體102-10(日本專利申請公開案第2012-72號)。衍生自上述抗體的scFv經過特殊設計而在C-端帶有可撓性接合物(GGGGSGGGGS)與末端的半胱胺酸殘基。半胱胺酸殘基的硫氫基可和位於各接合單元連接臂自由端的順丁烯二醯亞胺基接合。於製備對人類纖維素專一的單株抗體時，使用編碼上述102-10單抗VL與VH的DNA序列並進行密碼子優化(codon optimization)。合成編碼以下序列的的DNA序列：VL-GSTSGSGKPGSGEGSTKG-VH-(GGGGS)2-C。本發明實驗例中所製備的102-10單抗的scFv之胺基酸序列如序列編號：27所示。
於利用哺乳類動物表現系統來製備scFv蛋白時，使用以Expi293FTM細胞系為基礎的過度表現系統來製備。此系統使用ExpiFectamineTM 293轉染套組(Life Technologies,Carlsbad,USA)，其包含Expi293FTM細胞株、陽離子脂質系ExpiFectamineTM 293試劑、ExpiFectamineTM 293轉染強化劑1與2、以及表現系統所用的培養基(Gibco,New York,USA)。
將編碼scFv的序列置於pG1K表現匣中。將Expi293F細胞以每毫升2.0×106個活細胞的密度播於Expi293F表現培養基中，並維持18至24小時後進 行轉染，以確保進行轉染時細胞處於分裂狀態。進行轉染當日，將帶有7.5×108個細胞的255毫升培養基置於2-L艾氏燒瓶中，並加入ExpiFectamineTM 293轉染試劑。於轉染後，將轉染細胞在37℃下以定軌搖動器(125rpm)培育16至18小時；之後在燒瓶中加入ExpiFectamineTM 293轉染強化劑1與強化劑2，並繼續培育5到6天。收集培養上清液，並使用蛋白L親和力層析法純化培養基中的scFv蛋白。
第8A與8B圖分別是純化對人類纖維素專一單抗的scFv之SDS-PAGE與ELISA分析結果。對人類纖維素專一單抗的scFv在SDS-PAGE中移動到26kDa與30kDa的兩個主要電泳條。利用MALDI-TOF進一步分析同一個蛋白溶液，結果顯示對人類纖維素專一的102-10 scFv的分子量為26,838道耳頓，與計算所得的分子量相符。
實驗例9：經純化對人類纖維素專一的小鼠scFv的ELISA分析
利用美國專利申請公開案US 2016/0011217 A1中所述的方法來製備塗覆纖維蛋白原的孔盤。簡言之，將100μl的人類纖維蛋白原(Sigma)的PBS溶液以1μg/孔的量加入至96孔平底盤(Nunc)，密封平底盤並在4℃下放置一晚。
纖維素盤的製備方式如下。移除纖維蛋白原溶液，之後將100μL的TBS(含0.05U/ml凝血酶(Sigma)、2mM CaCl2與7mM L-半胱胺酸(Sigma))加入孔盤。將經凝血酶處理的孔盤在37℃下培育1小時，以使纖維素形成。接著移除凝血酶溶液，並以10%脫脂牛奶在室溫下處理1小時以使反應中止。
接著，將100μl的102-10 scFv溶液加入纖維蛋白原盤與纖維素盤，並在室溫下搖晃1小時。其後，以TBS-T清洗每一孔盤，再加入50μl的TMB(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,USA)並進行比色分析。加入50μl的1N HCl以使反應中止。接著，利用盤式分析儀測量在450nm下的吸光值(O.D.)。
第8C圖的ELISA分析結果顯示經純化的102-10 scFv可專一地和人類纖維素結合，但不會和纖維蛋白原結合。
實驗例10：構建與選擇對人類纖維素專一的噬菌體-呈現人類scFv
經雙方協議，由中央研究院基因體研究中心(臺北，臺灣)楊安綏博士研究室取得帶有對人類纖維素專一的人類scFv之噬菌體株。GH2 scFv抗體庫的框架序列(framework sequence)衍生自人類IgG抗體片段，即G6抗-VEGF Fab(蛋白庫編碼：2FJG)，將其選殖到噬質體載體pCANTAB5E(GE Healthcare)的限制位SfiI與NotI間，上述噬質體載體帶有胺苄青黴素(ampicillin)抗性基因、lacZ啟動子、有助於將scFv片段分泌至培養上清液中的pelB引導序列(leader sequence)以及用於偵測的E-標籤。基於寡核苷定點突變(oligonucleotide-directed mutagenesis)技術將scFv模板的VH與VL域多樣化；將每一可變區域中的三個CDR同時多樣化。使用帶有超過109個選殖株的scFv抗體庫在人類纖維素上進行篩選。
利用上文實驗例所述的方法製備經凝血酶處理的纖維素盤(每孔1μg/100μl)。使用纖維素盤來淘選抗-纖維素抗體。簡言之，在室溫下以阻隔緩衝液處理經纖維素塗覆的孔盤，阻隔緩衝液是以5%脫脂牛奶溶於PBST(帶有0.1% tween-20的磷酸延緩衝液)，處理時間1小時。將阻隔緩衝液中的重組噬菌體稀釋到8x1011菌落形成單元(colony-forming unit，CFU)/mL的濃度後，加入經塗覆纖維素的孔盤中，並溫和搖晃1小時。接著以PBST劇烈地清洗孔盤十次，再以PBS沖洗六次，以移除未專一結合的噬菌體。利用0.1M HCl/甘胺酸緩衝液(pH 2.2)來沖提結合的噬菌體，並立刻以2M三鹼(Tris-base)緩衝液(pH 9.0)中和沖提液。利用大腸桿菌品系ER2738(OD600=~0.6)在37℃下進行噬菌體感染，處理時間30分鐘；利用胺苄青黴素處理30分鐘，以移除未受感染的大腸桿菌。 在胺苄青黴素處理後，加入帶有康黴素抗性的輔助噬菌體M13KO7繼續培育1小時。從大腸桿菌培養物中選擇可被輔助噬菌體拯救的噬菌體，將其在帶有康黴素的環境中於37℃下劇烈搖晃一晚，以擴增所選的噬菌體。在PEG/NaCl中使擴增的噬菌體析出，之後再重新懸浮於PBS中，以用於下一次的選擇-擴增循環。重複上述選擇-擴增循環，以在纖維素上連續進行三次淘選。
經噬菌體感染的ER2738菌落盤於系列稀釋後，計算其數目與噬菌體效價，以得到每一淘選回合後每毫升的輸出效價(output titer/ml；CFU/ml)。經過三回合淘選後，噬菌體輸出效價由2.5E+06CFU/孔提升了超過1千倍而達到4.3E+09CFU/孔。第9A圖顯示每一回合的噬菌體輸出/輸入效價比。Y軸顯示每一淘選回合的噬菌體輸出/輸入效價比。經過三回合的淘選後，陽性菌落的比例明顯提升。相較於第一回合，第三回合的輸出/輸入效價比提高了500倍，而結合的菌落也逐漸成為抗體庫中的優勢族群。
在一般的選擇程序中，於塗覆人類纖維素的ELISA孔盤上進行三回合的抗原淘選後，約有80%與纖維素結合的噬菌體粒子在ELISA分析中可專一地與所塗覆的纖維素結合。
實驗例11：對人類纖維素專一的噬菌體-呈現人類scFv的單菌落ELISA分析
大腸桿菌品系ER2738經單一菌落噬菌體感染後，分別獲取了各別噬菌體的噬質體內的所選scFv基因；在深孔中加入2YT培養液(含16g/L胰化蛋白、10g/L酵母抽出物以及5g/L NaCl；pH 7.0)以及100μg/ml胺苄青黴素，在37℃下搖晃，以將這些大腸桿菌培養到中對數期(mid-log phase)。在培養液的OD600達到1.0時，加入IPTG，使其最終濃度為1μg/ml。在劇烈搖晃、37℃下將孔盤培育一晚；其後，以4,000g在4℃下將孔盤離心15分鐘。
利用ELISA來進行可溶性scFv結合試驗。簡言之，將Maxisorp 96-孔盤(Nunc)塗覆纖維素(每孔1μg/100μl PBS)或人類纖維蛋白原(作為陰性對照組)，在4℃下搖晃18小時。在以300μl的阻隔緩衝液處理1小時後，將100μl含可溶性scFv的上清液和100μl的阻隔緩衝液混合，而後將此混和物加入經塗覆的孔盤再處理1小時。將山羊抗-E-標籤抗體(與HRP複合，1：4000，型錄編號AB19400，Abcam)加入孔盤處理1小時。將TMB基質(每孔50μl)加入孔盤，並於加入1N HCl(每孔50μl)使反應停止後，測量在450nm下的吸光值。
在經過三輪淘選後，共選出960株噬菌體進行本實驗例的分析。其中有6株scFv和纖維素結合後的OD450差異大於10(相較於人類纖維蛋白原)，進一步對編碼這6株scFv的基因進行DNA定序，並識別出4種不同的DNA序列。第9B圖是scFv株D10的ELISA分析結果。scFv株D10和人類纖維素結合的OD450為1.09，其胺基酸序列如序列編號：29所示。
實驗例12：利用Expi293F過表現系統製備重組瑞替普酶
瑞替普酶的胺基酸序列來自DrugBank。本案所用的重組蛋白經過特殊設計而在C-端帶有可撓性接合物(GGGGSGGGGS)與末端的半胱胺酸殘基。半胱胺酸殘基的硫氫基可和位於各接合單元連接臂自由端的順丁烯二醯亞胺基接合。本發明實驗例中所製備的瑞替普酶之胺基酸序列如序列編號：28所示。
於本實驗例中，將編碼瑞替普酶的序列置於pcDNA3表現匣中。於利用哺乳類動物表現系統來製備瑞替普酶蛋白時，使用以Expi293FTM細胞系為基礎的過度表現系統並根據上文實驗例所述的方法來製備。
第10A與10B圖分別是純化瑞替普酶的SDS-PAGE與ELISA分析結果。重組瑞替普酶在SDS-PAGE中移動到43kDa與48kDa的兩個主要電泳條。利用MALDI-TOF進一步分析同一個蛋白溶液，結果顯示重組瑞替普酶的分子量為43,415道耳頓，與計算所得的分子量相符。
實驗例13：製備TCO-瑞替普酶複合物
將瑞替普酶和5mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)在室溫下以溫和搖晃培育4小時，以使位於C-端的半胱胺酸殘基還原，以利與Mal-PEG3-TCO(Conju-probe,Inc.)複合。利用NAP-10 Sephadex G-25管柱，將經還原蛋白的緩衝液置換為磷酸鈉緩衝液(100mM磷酸鈉(pH7.0)、50mM NaCl與5mM EDTA)。在還原反應與緩衝液交換後，使莫耳比10：1([Mal-PEG3-TCO]：[蛋白])的反應物於室溫下反應一晚以進行複合。利用去鹽管柱移除過量的交聯物，並分析TCO-蛋白複合產物。
MALDI-TOF質譜分析結果指出TCO-瑞替普酶複合物的分子量為45,055道耳頓。用10% SDS-PAGE以考瑪斯藍(Coomassie blue)染色來分析TCO-瑞替普酶複合物的純度。第11圖是TCO-瑞替普酶複合物的質譜分析結果。
實驗例14：將三個對人類纖維素專一的scFv與帶有三條順丁烯二醯亞胺-PEG 12 連接臂的四嗪-多肽1複合
如上文實驗例所示，合成編碼序列編號：27蛋白質的DNA序列並使其表現。將對人類纖維素專一的102-10單抗的純化scFv和5mM DTT在室溫下以溫和搖晃培育4小時，以使位於C-端的半胱胺酸殘基還原，以利與帶有三條PEG12-順丁烯二醯亞胺連接臂的四嗪-多肽1複合。接著，利用NAP-10 Sephadex G-25管柱(GE Healthcare)，將經還原的對102-10 scFv緩衝液置換為順丁烯二醯亞胺-SH耦合反應緩衝液(100mM磷酸鈉(pH7.0)、50mM NaCl與5mM EDTA)。在還原反應與緩衝液交換後，使莫耳比1：4([接合物]：[蛋白])的反應物於4℃下反應一晚，以使其與帶有三條順丁烯二醯亞胺-PEG12連接臂的四嗪-多肽1核複合。
利用粒徑篩析管柱S75，將與三個對人類纖維素專一的102-10 scFv複合的PEG12-順丁烯二醯亞胺-四嗪-多肽1複合物和游離的scFv、游離的 PEG12-順丁烯二醯亞胺-四嗪-多肽1複合物以及與一個或兩個對人類纖維素專一的102-10 scFv複合的PEG12-順丁烯二醯亞胺-四嗪-多肽1複合物互相分離。利用10% SDS-PAGE來純化產物，即，帶有一個自由四嗪官能基且和一組三個三個對人類纖維素專一的102-10 scFv複合的PEG12-順丁烯二醯亞胺-四嗪-多肽1複合物，結果如第12圖所示。
實驗例15：標的接合單元的MALDI-TOF分析；此標的接合單元帶有連接於四嗪-多肽1核上三條順丁烯二醯亞胺-PEG 12 連接臂的三個對人類纖維素專一的scFv
所用的標的接合單元採用四嗪-多肽1核心，其上接有三條順丁烯二醯亞胺-PEG12連接臂，並有三個對人類纖維素專一的102-10 scFv連接於上述連接臂；對此標的接合單元樣本進行MALDI-TOF分析。實驗所得的中位數分子量和三個對人類纖維素專一的102-10 scFv與帶有三條順丁烯二醯亞胺-PEG12連接臂的四嗪-多肽1核耦合產物的理論中位數分子量相符。根據第13圖所示的質譜分析結果，此一標的接合單元的中位數分子量為84,974道耳頓。
如下圖所示，此處合成的標的接合單元帶有一個自由四嗪官能基和一組三個對人類纖維素專一的102-10 scFv作為標的元件。
實驗例16：製備分子構建體；此分子構建體帶有作為標的元件的三個對人類纖維素專一的scFv以及作為效應元件的一個瑞替普酶分子
於本實驗例中，使上述實驗例所製得之標的接合單元的四嗪基和 TCO-瑞替普酶蛋白複合物的TCO基進行iEDDA反應，而將兩者接合。具體來說，所述標的接合單元帶有三個對人類纖維素專一的102-10 scFv以及一個自由四嗪基。
根據製造商(Jena Bioscience GmbH,Jena,Germany)的說明進行四嗪-TCO接合。簡言之，將100μl的標的接合單元(0.3mg/ml)加入含有效應元件的溶液中，兩者的莫耳比為1：1.2([四嗪]：[TCO])。在室溫下將反應混合物培育1小時。
此一產物(如下所示)是一種單一接合單元分子構建體，其具有三個對人類纖維素專一的102-10 scFv(作為標的元件)以及一個瑞替普酶分子(作為效應元件)。以8% SDS-PAGE來分析反應混合物；可觀察到大小約180kDa的電泳條。
實驗例17：阿哌沙班-PEG 3 -SH分子的抑制活性分析
第Xa型凝血因子負責將不具活性的前凝血酶轉換為具活性的凝血酶。阿哌沙班是一種第Xa型凝血因子抑制劑，其可間接地減少由凝血酶所導致的血栓形成。上文實驗例揭示了經修飾阿哌沙班分子(阿哌沙班-PEG3-SH)的合成方式。進行第Xa型凝血因子抑制分析(BioVision,Milpitas,USA)，以瞭解經修飾阿哌沙班分子(阿哌沙班-PEG3-SH)的抑制活性。第Xa型凝血因子抑制分析運用第Xa型凝血因子能夠剪切合成受質的能力，使其釋放出螢光團，進而可用螢光儀偵測此螢光團。當存在第Xa型凝血因子抑制劑時，由第Xa型凝血因子催 化的活性會降低或完全抑制。
在本實驗例中，將50μl的第Xa型凝血因子酵素溶液(製造商提供)加入96孔平底盤(Nunc)中，將10μl的1μM阿哌沙班-PEG3-SH和阿哌沙班羧酸加入含有第Xa型凝血因子酵素溶液的盤中，並在室溫下培育15分鐘。接著，將40μl的第Xa型凝血因子受質溶液(製造商提供)加入盤中，並在37℃中培育30分鐘。利用盤式螢光儀測量螢光團的發光強度(的激發波長：350nm；發光波長450nm)，以測定螢光團的相對螢光強度(relative fluorescence units，RFU)。
第14圖是阿哌沙班-PEG3-SH抑制活性的分析結果。在加入合成受質時，不加入第Xa型凝血因子抑制劑而直接測量第Xa型凝血因子的活性(僅有受質)。結果顯示，和連接臂複合的阿哌沙班分子對於抑制第Xa型凝血因子的生物活性和未經修飾的阿哌沙班羧酸相近。使用第Xa型凝血因子抑制劑(二鹽酸GGACK鹽，製造商提供)作為對照抑制劑。
實驗例18：重組瑞替普酶的生物活性分析
瑞替普酶是一種重組人類組織性血漿蛋白原活化因子，負責催化血漿蛋白原轉換為纖維蛋白溶酶的反應；此一反應是血栓分解反應的一部分。為了瞭解重組瑞替普酶的生物活性，利用96孔平底盤進行顯色分析(chromogenic assay)。
簡言之，將1μl的1μM重組瑞替普酶、25μl的10μM人類血漿蛋白原(Cat.No.7549-1,Biovision)以及62.5μl的100mM Tris緩衝液(pH 8.5)加入孔盤中，並在37℃下培育30分鐘。接著，將1μl的50mM顯色受質--二鹽酸D-纈胺酸-亮胺酸-離胺酸-對-硝基苯胺-硝基苯胺鹽(D-Val-Leu-Lys-p-Nitroanilide dihydrochloride；Cat.No.V7127,Sigma)加入孔盤中並在25℃下反應30分鐘；上述顯色受質是一種合成的纖維蛋白溶酶受質。之 後將31.5μl的10%檸檬酸加入每一孔中，以終止反應。在重組瑞替普酶的催化下，可使血漿蛋白原變為纖維蛋白溶酶，而纖維蛋白溶酶又可進一步剪切顯色受質而釋放出黃色的對-硝基苯胺，並可用盤式分析儀偵測其在405nm下的吸光度。
蛋白酶活性分析結果顯示，重組瑞替普酶的OD405為1.8，而正對照組蛋白(即，可商業取得的tPA蛋白；Cat.No.T0831,Sigma)的OD405為1.5。
實驗例19：建構編碼有含瑞替普酶的雙鏈IgG4.Fc融合蛋白的基因片段
將瑞替普酶透過可撓性鉸鏈區域融合到IgG4.Fc的CH2域N-端，以得到瑞替普酶-CH2-CH3(人類γ4)重組鏈。IgG4.Fc融合蛋白分子構建體中重組鏈的序列如序列編號：30所示。
上述雙鏈Fc-融合分子構建體雙鏈(瑞替普酶)-hIgG4.Fc的構形如下圖所示。
實驗例21：含瑞替普酶的雙鏈IgG4.Fc融合蛋白的表現與純化
在本實驗例中，將編碼的基因序列置於pcDNA3表現匣中。將Expi293F細胞以每毫升2.0×106個活細胞的密度播於Expi293F表現培養基中，並維持18至24小時後進行轉染，以確保進行轉染時細胞處於分裂狀態。進行轉染時，將帶有7.5×108個細胞的255毫升培養基置於2-L艾氏燒瓶中，並加入 ExpiFectamineTM 293轉染試劑。於轉染後，將轉染細胞在37℃下以定軌搖動器(125rpm)培育16至18小時；之後在燒瓶中加入ExpiFectamineTM 293轉染強化劑1與強化劑2，並繼續培育7天。收集培養上清液，並使用蛋白A親和力層析法純化培養基中的重組雙鏈(瑞替普酶)-hIgG4.Fc融合蛋白。將緩衝液置換為PBS，之後利用8% SDS-PAGE測定(瑞替普酶)-hIgG4.Fc蛋白的濃度並進行分析；參見第15圖。在約74kDa的位置觀察到含Fc-融合分子構建體的主要電泳條，其大小與預期相符。
實驗例21：構建編碼含瑞替普酶的雙鏈IgG4.Fc融合蛋以及對人類纖維素專一的scFv的基因片段
將瑞替普酶透過可撓性鉸鏈區域融合到IgG4.Fc的CH2域N-端，並透過可撓性接合物((GGGGS)3)將對人類纖維素專一的102-10 scFv連接到CH3域C-端，以得到瑞替普酶-CH2-CH3-scFv(人類γ4)重組鏈。
上述scFv的方向是VL-接合物-VH。scFv中的VL與VH是透過親水性接合物(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)而連接。IgG4.Fc融合蛋白分子構建體中重組鏈的序列如序列編號：31所示。利用上文實驗例所述的方法，在Expi293F細胞中表現所建構的基因並純化所表現的融合蛋白。利用SDS-PAGE分析來定性所製備的新構建體。第16圖的8% SDA-PAGE結果顯示新構建體的重組鏈大小約為100kDa，和預期大小相符。
上述雙鏈(瑞替普酶)-hIgG4.Fc-(scFv α纖維素)分子構建體的構形如下圖所示。
實驗例22：建構編碼有含瑞替普酶以及對人類纖維素專一的scFv之融合蛋白的基因片段
透過可撓性接合物((GGGGS)3)將瑞替普酶融合到對人類纖維素專一的102-10 scFv之N-端，以得到(瑞替普酶)-scFv重組鏈。
上述scFv的方向是VL-接合物-VH。scFv中的VL與VH是透過親水性接合物(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)而連接。重組融合蛋白分子構建體的序列如序列編號：32所示。利用SDS-PAGE分析來定性所製備的新構建體。第17圖的8% SDA-PAGE結果顯示新構建體的重組鏈大小約為72kDa，和預期大小相符。
上述(瑞替普酶)-(scFv α纖維素)分子構建體的構形如下圖所示。
實驗例23：建構編碼有含替奈普酶(TNK-tPA)的雙鏈IgG4.Fc融合蛋白的基因片段
將TNK-tPA透過可撓性鉸鏈區域融合到IgG4.Fc的CH2域N- 端，以得到(TNK-tPA)-CH2-CH3(人類γ4)重組鏈。IgG4.Fc融合蛋白分子構建體中重組鏈的序列如序列編號：33所示。第18圖的8% SDA-PAGE結果顯示新構建體的重組鏈大小約為98kDa，和預期大小相符。
上述雙鏈(TNK-tPA)-hIgG4.Fc分子構建體的構形如下圖所示。
實驗例24：建構編碼有含TNK-tPA以及對人類纖維素專一的scFv之雙鏈IgG4.Fc融合蛋白的基因片段
將TNK-tPA透過可撓性鉸鏈區域融合到IgG4.Fc的CH2域N-端，並透過可撓性接合物((GGGGS)3)將對人類纖維素專一的D10 scFv連接到CH3域C-端，以得到(TNK-tPA)-CH2-CH3-scFv(人類γ4)重組鏈。
上述scFv的方向是VL-接合物-VH。scFv中的VL與VH是透過親水性接合物(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)而連接。IgG4.Fc融合蛋白分子構建體中重組鏈的序列如序列編號：34所示。
為了偵測表現量較低的重組雙鏈(TNK-tPA)-hIgG4.Fc-(scFv α纖維素)，對利用膠體電泳分離的蛋白進行膠體內水解(In-gel digestion)，再對經胰蛋白酶水解的雙鏈(TNK-tPA)-hIgG4.Fc-(scFv α纖維素)進行級聯質譜分析，以便確認分子構建體。所有質譜分析是利用Bruker Autoflex III MALI TOF/TOF質譜儀(Bremen,Germany)進行，其配備有200Hz Smart Bean Laser，使用正離子模式且在反射模式中使用延遲擷取。利用Flex Control 3.4進行人工資料擷取，並以 Flex-Analysis 3.4進行資料處理(皆來自Bruker Dalton)。
在Mascot搜尋引擎中，利用蛋白質片段在蛋白質資料庫內進行分子質量搜尋，以辨識所述多肽；經比對，在MS/MS光譜中m/z值分別對應於1,617.8223與1,053.5074道耳頓的兩個蛋白片段和兩個TNK-tPA片段的胺基酸序列(VYTAQNPSAQALGLGK與QYSQPQFR)相符。經比對，在MS/MS光譜中m/z值對應於830.4496道耳頓的蛋白片段和人類IgG4.Fc區域的多肽片段(GLPSSIEK)相符。經比對，在MS/MS光譜中m/z值分別對應於737.3866與620.3044道耳頓的兩個蛋白片段和D10 scFv區域的兩個多肽片段的胺基酸序列(NTAYLR與MNSLR)相符。
上述雙鏈(TNK-tPA)-hIgG4.Fc-(scFv α纖維素)分子構建體的構形如下圖所示。
實驗例25：建構編碼有含TNK-tPA以及對人類纖維素專一的scFv之融合蛋白的基因片段
透過可撓性接合物((GGGGS)3)將TNK-tPA融合到對人類纖維素專一的D10 scFv之N-端，以得到(TNK-tPA)-(scFv α纖維素)重組鏈。
上述scFv的方向是VL-接合物-VH。scFv中的VL與VH是透過親 水性接合物(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)而連接。重組融合蛋白分子構建體的序列如序列編號：35所示。為了偵測表現量較低的重組(TNK-tPA)-(scFv α纖維素)，對利用膠體電泳分離的蛋白進行膠體內水解(In-gel digestion)，再對經胰蛋白酶水解的(TNK-tPA)-(scFv α纖維素)進行級聯質譜分析，以便確認分子構建體(參見上文實驗例)。
上述(TNK-tPA)-(scFv α纖維素)分子構建體的構形如下圖所示。
實驗例26：含瑞替普酶以及對人類纖維素專一scFv的融合蛋白的生物活性分析
瑞替普酶是一種重組人類組織性血漿蛋白原活化因子，參與了血栓分解反應。為了瞭解含瑞替普酶以及對人類纖維素專一102-10 scFv的融合蛋白的生物活性，利用塗覆纖維素的孔盤來進行顯色分析(反應式14)。
<<反應式14 含瑞替普酶以及對人類纖維素專一scFv的融合蛋白之顯色分析>>
簡言之，於製備纖維蛋白原盤時，將100μl的人類纖維蛋白原(Sigma)的PBS溶液以10μg/孔的量加入至96孔平底盤(Nunc)，密封平底盤並在 4℃下放置一晚。纖維素盤的製備方式如下。移除纖維蛋白原溶液，之後將100μL的TBS(含0.05U/ml凝血酶(Sigma)、2mM CaCl2與7mM L-半胱胺酸(Sigma))加入孔盤。將經凝血酶處理的孔盤在37℃下培育1小時，以使纖維素形成。接著移除凝血酶溶液，並以10%脫脂牛奶在室溫下處理1小時以使反應中止。
接著，將100μl的樣本溶液加入纖維蛋白原盤與纖維素盤，並在室溫下搖晃1小時。其後，以PBST清洗每一孔盤兩次，再以PBS清洗一次，以移除未專一結合的蛋白。將25μl的10μM人類血漿蛋白原(Cat.No.7549-1,Biovision)加入纖維蛋白原與纖維素孔盤的每一孔中，並在37℃下培育30分鐘。接著，將62.5μl的100mM Tris緩衝液(pH 8.5)、1μl的50mM顯色受質--二鹽酸D-纈胺酸-亮胺酸-離胺酸-對-硝基苯胺-硝基苯胺鹽(D-Val-Leu-Lys-p-Nitroanilide dihydrochloride；Cat.No.V7127,Sigma)加入孔盤中並在25℃下反應30分鐘；上述顯色受質是一種合成的纖維蛋白溶酶受質。之後將31.5μl的10%檸檬酸加入每一孔中，以終止反應。在含瑞替普酶蛋白的催化下，可使血漿蛋白原變為纖維蛋白溶酶，而纖維蛋白溶酶又可進一步剪切顯色受質而釋放出黃色的對-硝基苯胺，並可用盤式分析儀偵測其在405nm下的吸光度。
第19圖的蛋白酶活性分析結果顯示，重組雙鏈(瑞替普酶)-hIgG4.Fc、雙鏈(瑞替普酶)-hIgG4.Fc-(scFv α纖維素)以及(瑞替普酶)-(scFv α纖維素)的蛋白酶活性和正對照組蛋白(即，重組瑞替普酶以及可商業取得的tPA蛋白(Cat.No.T0831,Sigma))相近。以hIgG4.Fc與抗-纖維素102-10 scFv作為負對照組。結合分析結果顯示TPA和瑞替普酶皆可和纖維素結合。此外，瑞替普酶的融合蛋白以及對纖維素專一的scFv(特別是具有G4S連接物者)則展現了較佳的結合活性。
當可理解，上文實施方式的說明僅為例示，且本發明所屬技術領 域具有通常知識者可對其進行各種修飾。上文的說明、實驗例與資料完整地說明了本發明例示性實施方式的結構與用途。雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
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<223> Phage-displayed anti-fibrin scFv D10
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1200A‧‧‧Fc型分子構建體
1210‧‧‧CH2-CH3鏈
E1‧‧‧效應元件
T1‧‧‧標的元件

Claims (7)

  1. 一種分子構建體包含：一對IgG.Fc的CH2-CH3區段；一多肽延伸段，其序列包含具有(G2-4S)2-8C序列並連接於該對CH2-CH3區段的C-端；一第一耦合臂，透過硫氫-順丁烯二亞醯胺反應而連接至該多肽延伸段的C-端；一對標的元件，連接於該成對CH2-CH3區段的N-端，其中每一標的元件為對纖維素專一的一抗體片段；以及一對效應元件，連接於該成對CH2-CH3區段的C-端，其中每一效應元件為一載藥束，該載藥束包含：一中心核、複數個連接臂、複數個第Xa型凝血因子抑制劑或凝血酶抑制劑分子以及視需要而加入的一第二耦合臂，其中：該中心核為包含複數個胺基的一化合物或包含複數個離胺酸(lysine，K)殘基的一多肽，其中該多肽為(1)一第一多肽，包含複數個離胺酸(lysine，K)殘基，其中每一個K殘基和其下一個K殘基間是由一填充序列所隔開，該填充序列包含甘胺酸(glycine，G)以及絲胺酸(serine，S)殘基，且該K殘基的數目為2至15；或(2)一第二多肽，包含(Xaa-K)n序列，其中Xaa為一聚乙二醇化胺基酸(PEGylated amino acid)其具有2至12個乙二醇(ethylene glycol，EG)重複單元，且n為2至15的整數；該些連接臂藉由和該些胺基或K殘基其中之一反應，而以其一端連接於該中心核；每一該些第Xa型凝血因子抑制劑或凝血酶抑制劑分子分別透過以下方式而連接於該些連接臂：於其間形成一醯胺鍵或透過銅催化的疊氮化物-炔羥環加成 (copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)反應、應力促進的疊氮化物-炔羥鏈接化學(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)反應或逆電子需求狄爾斯-阿德(inverse electron demand Diels-Alder，iEDDA)反應；以及位於該中心核N-或C-端的胺基酸殘基有疊氮基或炔基；或位於該中心核N-或C-端的胺基酸殘基為半胱胺酸殘基，且該半胱胺酸殘基的硫氫基與該第二耦合臂連接，其中該第二耦合臂的自由端有該疊氮基、炔基、四嗪基、環辛烯基或環辛炔基，其中：當該些第Xa型凝血因子抑制劑或凝血酶抑制劑分子分別透過CuAAC或SPAAC反應而連接至該些連接臂時，則位於該中心核N-或C-端的胺基酸殘基為半胱胺酸殘基，且該耦合臂的自由端為四嗪基或環辛烯基；或當該些第Xa型凝血因子抑制劑或凝血酶抑制劑分子分別透過iEDDA反應而連接至該些連接臂時，則位於該中心核N-或C-端的胺基酸殘基有疊氮基或炔基，或位於該中心核N-或C-端的胺基酸殘基為半胱胺酸殘基，且該耦合臂的自由端為疊氮基、炔基或環辛炔基；以及該載藥束透過CuAAC反應、SPAAC反應或iEDDA反應而與該第一耦合臂連接。
  2. 如請求項1所述的分子構建體，其中該對CH2-CH3區段係衍生自人類γ1或γ4免疫球蛋白。
  3. 如請求項1所述的分子構建體，其中該對標的元件為一抗原結合片段(antigen-binding fragment，Fab)的形式並連接於該對CH2-CH3區段的N-端，而使得該分子構建體形成一IgG構形。
  4. 如請求項1所述的分子構建體，其中該第Xa型凝血因子抑制劑為阿哌沙班(apixaban)、伊度沙班(edoxaban)或利伐沙班(rivaroxaban)。
  5. 如請求項1所述的分子構建體，其中該凝血酶抑制劑為阿加曲班(argatroban)或美拉加群(melagatran)。
  6. 一種分子構建體於製備藥物的用途，其中該藥物用以防止一個體體內血栓形成，且該分子構建體如請求項1至5任一項所述。
  7. 一種分子構建體於製備藥物的用途，其中該藥物用以治療一個體血管栓塞，且該分子構建體如請求項1至5任一項所述。
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