ES2924722T3 - Unión de inmunofusión de scFv biespecífico (BIf) a CD123 y CD3 - Google Patents

Abstract

Ciertas realizaciones están dirigidas a una inmunoglobulina biespecífica que es capaz de unirse a moléculas de la superficie celular en una célula diana, como células cancerosas, y moléculas de superficie celular en células efectoras inmunitarias, como linfocitos T citotóxicos, lo que da como resultado la destrucción dirigida de células diana. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Unión de inmunofusión de scFv biespecífico (BIf) a CD123 y CD3

La primera generación de anticuerpos biespecíficos se desarrollaron hace más de 20 años. Desde entonces un número de estudios clínicos han ensayado anticuerpos biespecíficos manipulados para dirigirse a antígenos de superficie de células cancerosas. Este grupo de proteínas de fusión anticáncer contiene dos o más dominios funcionales que localizan células efectoras inmunológicas en la proximidad de células cancerosas objetivo para alcanzar actividad anticáncer.

Un agente terapéutico de esta familiar, Catumaxomab, fue aprobado en 2009 por la Unión Europea para el tratamiento de ascitis maligna. Catumaxomab es una inmunoglobulina híbrida de anticuerpos de ratón y rata que tiene un primer sitio de unión para EpCAM en la superficie de células tumorales y un segundo sitio de unión para CD3 de linfocitos T. Mientras las células T activadas proporcionan la citotoxicidad celular principal, la región Fc a través de los receptores de Fc también llevan macrófagos, células citolíticas naturales (NK), y granulocitos a las células objetivo activando las respuestas de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Sin embargo, los anticuerpos terapéuticos que portan Fc de orígenes animales típicamente son inmunógenos en seres humanos y los pacientes tratados podrían reaccionar de forma adversa a estos agentes terapéuticos, reduciendo su semivida y eficacias. Los anticuerpos murinos también se asocian con la generación de reacciones alérgicas graves.

Según se desarrolló la tecnología de anticuerpos biespecíficos, se generó un grupo diferente de proteínas de fusión llamadas captadores de células T biespecíficos (BiTE) conectando dos regiones variables monocatenarias de anticuerpo (scFv) solo (no se incluyeron segmentos de aminoácidos de Fc) con un enlazador flexible, una scFv se une a células objetivo y la otra se une a CD3 en la superficie de células T. Un BiTE, blinatumomab, con actividades de unión biespecíficas CD19xCD3 mostró resultados prometedores en ensayos clínicos en fase II para pacientes con enfermedad residual mínima en leucemia linfoblástica aguda de linaje B.

Dafne Mueller y Roland Kontermann divulgan perspectivas actuales en anticuerpos biespecíficos para inmunoterapia contra el cáncer (Biodrugs, Clinical Immunotherapeutics, Biopharmaceuticals and Gene Therapy, Adis International, vol. 24, no. 2, páginas 89-98). Gregory L. Moore et al divulgan un formato de anticuerpo biespecífico que permite la coactivación simultánea bivalente y monovalente de distintos antígenos objetivo (mAbs, vol. 3, no. 6, páginas 546­ 557). Stein Christoph et al divulgan conjugados de fragmentos de anticuerpos Fv monocatenarios que son específicos para el antígeno de células madre CD123 y que median potente muerte de células de leucemia mieloide aguda", (British Journal Of Haematology, Blackwell Publishing Ltd, vol. 148, no. 6, páginas 879-889). Anja Henn et al divulgan la caracterización preclínica de MT114, un anticuerpo BiTE novedoso biespecífico de CD33/CD3 para el tratamiento de leucemia mieloide aguda (LMA) (Cancer Research, vol. 72, página 3523). Roland Kontermann divulga estrategias de direccionamiento duales con anticuerpos biespecíficos (mAbs, Landes Bioscience, US, vol. 4, no. 2, páginas 182­ 197).

A pesar de estos avances en la tecnología de anticuerpos biespecíficos, permanece una necesidad para agentes terapéuticos contra el cáncer adicionales, en particular esos que de forma eficaz se dirigen a y destruyen células cancerosas ya sea directa o indirectamente.

Compendio

En un aspecto de la invención, se proporciona un homodímero de inmunofusión de scFv biespecífico en donde cada subunidad del homodímero comprende un Fv monocatenario anti-CD123 en el extremo N, un Fv monocatenario anti-CD3 en el extremo C, y un enlazador de la región constante de inmunoglobulina que acopla operativamente el scFv anti-CD123 y el scFv antiCD3, en donde el enlazador de la región constante de inmunoglobulina es un dominio bisagra-CH2-CH3 de IgG1 humana.

Aspectos adicionales de la invención se exponen en las reivindicaciones acompañantes. Las formas de realización se dirigen a agentes terapéuticos de inmunoglobulina biespecíficos (inmunofusiones de scFv biespecíficas, BIf) y agentes terapéuticos para uso en tales métodos. Una BIf es un polipéptido que comprende un primer dominio de unión a una diana que específicamente se une a una célula cancerosa, un segundo dominio de unión a un efector que específicamente se une a un efector inmunológico, y un enlazador de la región constante de inmunoglobulina que acopla operativamente el primer y segundo dominios de unión. Como se usan en el presente documento los términos “unión específica” o “se une específicamente” se refiere a un dominio polipeptídico que tiene una afinidad de unión principalmente para un tipo celular o proteína diana y se une a su diana con una afinidad 10, 100, 1000 veces o mayor en comparación a células o proteínas no diana.

Un dominio de unión a una diana específicamente se une a un polipéptido de superficie celular que está específicamente expresado por una célula cancerosa o está sobreexpresado por una célula cancerosa. En un aspecto adicional, la célula cancerosa es una célula de leucemia, incluyendo, pero no limitada a leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), o leucemia plasmacitoide. En un aspecto adicional, la célula cancerosa puede ser, pero no está limitada a, una célula de cáncer colorrectal, de pulmón, mama, riñón, cerebro, próstata, páncreas o sangre, o una célula de tumor maligno sólido.

El polipéptido de superficie celular es CD123. CD123 también es conocido como el receptor de interlequina-3 (IL-3). IL-3 es una citoquina soluble que puede ser secretada por células T activadas. Un ejemplo de dominio de unión a CD123 comprende las regiones variables del anticuerpo anti-CD123 12F1 (aminoácidos 1 a 113, y 132 a 250 de SEQ ID NO: 2). En ciertos aspectos, las regiones variables del dominio de unión a CD123 son, independientemente el 80, 85, 90, 95, 98 o 100 % idénticas a las regiones variables de SEQ ID NO: 2. En ciertos aspectos, el dominio de unión a CD123 es el 80, 85, 90, 95, 98 o 100 % idéntico a SEQ ID NO: 2.

En divulgaciones adicionales, el polipéptido de superficie celular es el polipéptido marcador endotelial tumoral 8 (“TEM8”). TEM8 es un receptor de superficie celular de tipo integrina de 85 kDa que se identificó originalmente como uno de varios genes no relacionados (llamados TEM1-TEM9) sobreexpresados en células endoteliales vasculares derivadas de tejidos colorrectales tumorales frente a normales. TEM8 está sobreexpresada en los vasos sanguíneos de una variedad de tipos de cáncer humano. Un ejemplo de un dominio de unión a TEM8 comprende la región variable de la cadena ligera DIVMTQTPPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTL RISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIKRA (SEQ ID NO:14) y/o la región variable de la cadena pesada QVKLEESGAELVRPGVSVKISCKGSGYTFTDYAMHWVKQSHAKSLEWIGVISTYFGDATYNQKFKGKATMTVDSSST AYMELARLTSEDSAIYYCAREDYVPFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:15).

En divulgaciones aún adicionales, el polipéptido de superficie celular es el polipéptido antígeno de membrana específico de próstata (“PSMA”). PSMA (también conocido como glutamato carboxipeptidasa II) es una glucoproteína de membrana integral de tipo 2 encontrado en tejidos de próstata y unos pocos otros tejidos. Un ejemplo de un dominio de unión a PSMA comprende la región variable de la cadena ligera WDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIICKASQDVGTAVDWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTIT NVQSEDLADYFCQQYNSYPLTFGAGTMLDLK (SEQ ID NO:16) y/o la región variable de la cadena pesada EVQLQQSGPELKKPGTSVRISCKTSGYTFTEYTIHWVKQSHGKSLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDKATLTVDKSSST AYMELRSLTSEDSAVYYCAAGWNFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:17).

En otras divulgaciones, el polipéptido de superficie celular es un polipéptido CD33. CD33 es un antígeno de superficie celular de 67 kDa específicamente expresado en células mieloides incluyendo células de leucemia mieloide. Es el miembro más pequeño de la familia siglec (lectinas relacionadas con Ig que se unen a ácido siálico). Un ejemplo de una unión de CD33 comprende la región variable de la cadena ligera DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSVLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ PEDFATYYCQQFNSSITFGQGTKLEIKR (SEQ ID NO:18) y/o la región variable de la cadena QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGVANYAQKFQGRVTITADKSTR TAYMELSSLRSEDTAVYYCARNWADAFDIWGEGTMVTVSS (SEQ ID NO:19).

Ciertos aspectos pueden incluir dominios de unión a diana que se unen específicamente a antígenos cancerosos que incluyen, pero no están limitados a, MAGE (incluyendo, pero no limitado a, MAGE3, MAGEA6, MAGEA10), NY-ESO-1, gp100, tirosinasa, EGFR, PSA, VEG-F, PDGFR, KIT, CEA, HER2/neu, Muc-1, hTERT, MART1, TRP-1, y TRP-2.

Una BIf comprende un segundo dominio de unión al efector que se une a una célula efectora inmunológica. En ciertos aspectos, la célula efectora inmunológica es un linfocito T citotóxico. En ciertos aspectos, el dominio de unión al efector se une a la proteína CD3. CD3 es un correceptor de células T que está compuesto de cuatro cadenas polipeptídicas distintas. En mamíferos, el complejo contiene una cadena CD3^y, una cadena CD38, y dos cadenas ^c D3^e. Estas cadenas se asocian con una molécula conocida como el receptor de células T (TCR) y la cadena Z para generar una señal de activación en células T. En un aspecto adicional, el dominio de unión al efector comprende las regiones variables de UHCT1 (aminoácidos 1 a 107 y 126 a 247 de SEQ ID NO: 3). En ciertos aspectos, las regiones variables del dominio de unión a CD3 son independientemente el 80, 85, 90, 95, 98 o 100 % idénticas a las regiones variables de SEQ ID NO: 3. En ciertos aspectos, el dominio de unión a CD123 es el 80, 85, 90, 95, 98 o 100 % idéntico a SEQ ID NO: 3.

Las regiones variables de un dominio de unión están operativamente unidas por un enlazador peptídico. El dominio de unión a la diana y el dominio de unión al efector están operativamente unidas por un enlazador. El enlazador se puede diseñar para expresión óptima en células de mamífero. En ciertos aspectos, los dominios de unión están unidos usando un dominio bisagra-CH2-CH3 de la región constante de IgG1 humana como un enlazador. En ciertos aspectos, la región constante de IgG1 es humana. En ciertos aspectos, la región constante de inmunoglobulina es el 80, 85, 90, 95, 98 o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 4.

La invención se dirige a una inmunofusión que comprende un dominio de unión a la diana operativamente unido por un dominio bisagra-CH2-CH3 de una región constante de inmunoglobulina a un dominio de unión al efector que se une específicamente a un linfocito que expresa CD3, como se define en las reivindicaciones.

El término “operativamente unido” u “operablemente unido” o similar, cuando se usa para describir proteínas de fusión, se refiere a secuencias polipeptídicas que están colocadas en una relación física y funcional entre sí. En ciertas formas de realización, las funciones de los componentes polipeptídicos de la molécula de fusión están sin cambiar comparados a las actividades funcionales de las partes en aislamiento.

El primer dominio de unión, el enlazador, y el segundo dominio de unión están comprendidos como una proteína de fusión. En ciertos aspectos, la BIf es el 80, 85, 90, 95, 98 o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1.

Los ácidos nucleicos que codifican los dominios de unión y/o el enlazador pueden tener codones optimizados. En aspectos adicionales, la secuencia de aminoácidos de los dominios de unión y/o el enlazador es humana o humanizada.

En ciertas formas de realización, un paciente de cáncer se trata para cáncer proporcionando una cantidad eficaz de una BIf descrita en el presente documento. El término “proporcionar” se usa según su significado normal para indicar “suministrar o dar para uso”. En algunas formas de realización, la proteína se proporciona directamente administrando la proteína, mientras en otras formas de realización, la proteína se proporciona de forma eficaz administrando un ácido nucleico que codifica la proteína.

El término “anticuerpo” o “ inmunoglobulina” se usa para incluir anticuerpos intactos y fragmentos/segmentos de unión de los mismos. Típicamente, los fragmentos compiten con el anticuerpo intacto del que se derivaron para unión específica a un antígeno. Los fragmentos incluyen cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras, Fab, Fab', F(ab')2, Fabc y Fv. En ciertos aspectos, los polipéptidos son Fv monocatenarios (scFv). En un aspecto adicional, el scFv se puede modificar adicionalmente por una fusión carboxi terminal con un segundo dominio de unión de anticuerpo. Los fragmentos/segmentos se producen por técnicas de ADN recombinante, o por separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. El término “anticuerpo” también incluye una o más cadenas de inmunoglobulinas que están químicamente conjugadas a, o expresadas como, proteínas de fusión. El término “anticuerpo” también incluye un anticuerpo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes.

El término “anticuerpo humanizado” se refiere a anticuerpos en los que el marco y/o “regiones determinantes de complementariedad” (CDR) se presentan en una inmunoglobulina de una especie diferente en comparación a la de la inmunoglobulina parental de la que se derivó la CDR. En una forma de realización preferida, una CDR murina se injerta en la región marco de un anticuerpo humano para preparar el “anticuerpo humanizado”. Véase, por ejemplo, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; y Neuberger, M. S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. Otras formas de “anticuerpos humanizados” abarcados por la presente invención son esas en las que la región constante se ha modificado o cambiado adicionalmente de la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a unión a C1q y/o unión al receptor de Fc (FcR).

El término “anticuerpo humano”, como se usa en el presente documento, se pretende que incluya anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos se conocen bien en el estado de la técnica (van Dijk, M. A., y van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Los anticuerpos humanos también se pueden producir en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras inmunización, de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulinas endógenas. La transferencia de la gama de genes de inmunoglobulinas de la línea germinal humana en tales ratones mutantes en la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras exposición a antígeno (véase, por ejemplo, Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40). Los anticuerpos humanos también se pueden producir en genotecas de presentación en fagos (Hoogenboom, H. R., y Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Las técnicas de Cole, et al. y Boerner, et al., también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); y Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). El término “anticuerpo humano” como se usa en el presente documento también comprende tales anticuerpos que están modificados en la región constante para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a unión a C1q y/o unión a FcR, por ejemplo, por “cambio de clase”, es decir, cambio o mutación de partes de Fc (por ejemplo, de IgG1 a IgG4 y/o mutación IgG1/IgG4).

El término “anticuerpo humano recombinante”, como se usa en el presente documento, se pretende que incluya todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tal como anticuerpos aislados de una célula huésped, tal como una célula NS0 o CHO o de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humanos o anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes en una forma reorganizada. Los anticuerpos recombinantes humanos según la invención se han sometido a hipermutación somática in vivo. Por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, mientras derivadas de y relacionadas con secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir de forma natural en el repertorio de la línea germinal de anticuerpos humana in vivo.

El “dominio variable” (incluyendo el dominio variable de una cadena ligera (VL) y la región variable de una cadena pesada (VH)) como se usa en el presente documento indica cada uno del par de cadenas ligera y pesada que están implicadas directamente en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios de las cadenas ligera y pesada humanas variables tienen la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones marco (FR) cuyas secuencias están muy conservadas y conectadas por tres “regiones hipervariables” (o regiones determinantes de complementariedad, CDR). Las regiones marco adoptan una conformación de lámina p y las CDR pueden formar bucles que conectan la estructura de lámina p. Las c Dr en cada cadena se mantienen en su estructura tridimensional por las regiones marco y forman junto con las CDR de la otra cadena el sitio de unión a antígeno. Las regiones CDR3 de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo desempeñan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de unión de los anticuerpos según la invención.

Los términos “región hipervariable” o “porción de unión a antígeno de un anticuerpo” cuando se usan en el presente documento se refieren a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables para unión a antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de las “regiones determinantes de complementariedad” o “CDR”. Las regiones “marco” o “FR” son esas regiones del dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable como se definen en el presente documento. Por tanto, las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo comprenden del extremo N al C los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, y FR4. Las CDR en cada cadena están separadas por tales aminoácidos marco. Especialmente, la CDR3 de la cadena pesada es la región que contribuye más a la unión a antígeno. Las regiones CDR y FR se determinan según la definición estándar de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991).

El término “región constante” como se usa en las presentes solicitudes indica la suma de los dominios de un anticuerpo diferente de la región variable. La región constante no está implicada directamente en la unión de un antígeno, pero muestra varias funciones efectoras. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos se dividen en las clases: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases, tal como IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, IgA1 e IgA2. Las regiones constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se llaman a, 8, £, ^y, y M, respectivamente. Las regiones constantes de la cadena ligera (CL) que se pueden encontrar en todas las cinco clases de anticuerpos se llaman k (kappa) y A (lambda).

El término “región constante derivada de origen humano” como se usa en la presente solicitud indica una región de cadena pesada constante de un anticuerpo humano de la subclase IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4 y/o una región kappa o lambda de la cadena ligera constante. Tales regiones constantes se conocen bien en el estado de la técnica y, por ejemplo, se describen por Kabat, E. A., (véase, por ejemplo, Johnson, G. y Wu, T. T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788).

La frase que una molécula “se une específicamente” a una diana se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la molécula en presencia de una población heterogénea de otras sustancias biológicas. Por tanto, en las condiciones designadas, una molécula especificada se une preferentemente a una diana particular y no se une en una cantidad significativa a otras sustancias biológicas presentes en la muestra. La unión específica de un anticuerpo a una diana en tales condiciones requiere que el anticuerpo se seleccione por su especificidad hacia la diana. Se puede usar una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, inmunoensayos ELISA en fase sólida se usan rutinariamente para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunorreactivos con una proteína. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988), para una descripción de formatos de inmunoensayo y condiciones que se pueden usar para determinar inmunorreactividad específica. La unión específica entre dos entidades significa una afinidad de al menos 10'6, 10'7, 10'8, 10'9, 10'1° M o mayor.

El término “aislado” se puede referir a un ácido nucleico o polipéptido que está sustancialmente libre de material celular, material bacteriano, material vírico, o medio de cultivo (cuando se produce por técnicas de ADN recombinante) de su fuente de origen, o precursores químicos u otras sustancias químicas (cuando se sintetiza químicamente). Además, un compuesto aislado se refiere a uno que se puede administrar a un sujeto como un compuesto aislado; en otras palabras, el compuesto puede no simplemente considerarse “aislado” si está adherido a una columna o embebido en un gel de agarosa. Además, un “fragmento de ácido nucleico aislado” o “péptido aislado” es un fragmento de ácido nucleico o proteína que no es natural como un fragmento y/o no está típicamente en el estado funcional.

Las fracciones de la invención, tal como polipéptidos, se pueden conjugar o unir de forma covalente o no covalente a otras fracciones tal como adyuvantes, proteínas, péptidos, soportes, fracciones fluorescentes, o marcadores. El término “conjugado” o “inmunoconjugado” se usa en sentido amplio para definir la asociación operativa de una fracción con otro agente y no se pretende que se refiera solamente a cualquier tipo de asociación operativa, y particularmente no está limitado a “conjugación” química. Las proteínas de fusión recombinantes se contemplan en particular.

Otras formas de realización de la invención se discuten a lo largo de esta solicitud. Cualquier forma de realización discutida con respecto a un aspecto de la invención aplica a otros aspectos de la invención también y viceversa. Cada forma de realización descrita en el presente documento se entiende que son formas de realización de la invención que son aplicables a todos los aspectos de la invención. Se contempla que cualquier forma de realización discutida en el presente documento se pueda implementar con respecto a cualquier método o composición de la invención, y viceversa. Además, las composiciones y kits de la invención se pueden usar para alcanzar métodos de la invención.

El uso de la palabra “un” o “una” cuando se usa junto con el término “comprender” en las reivindicaciones y/o la especificación puede significar “uno”, pero también es consistente con el significado de “uno o más”, “al menos uno”, y “uno o más de uno”.

A lo largo de esta solicitud, el término “aproximadamente” se usa para indicar que un valor incluye la desviación estándar del error para el dispositivo o método que se emplea para determinar el valor.

El uso del término “o” en las reivindicaciones se usa para significar “y/o” a menos que se indique explícitamente que se refiere a alternativas solo o las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación apoya una definición que se refiere a solo alternativas e “y/o”.

Como se usa en esta especificación y reivindicación(es), las palabras “comprender” (y cualquier forma de comprender, tal como “comprenden” y “comprende”), “tener” (y cualquier forma de tener, tal como “tienen” y “tiene”), “incluir” (y cualquier forma de incluir, tal como “incluye” e “incluyen”) o “contener” (y cualquier forma de contener, tal como “contiene” o “contienen”) son inclusivas o abiertas y no excluyen elementos o etapas de método adicionales, no enumeradas.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada. Se debe entender, sin embargo, que la siguiente descripción detallada y los ejemplos específicos, mientras indican formas de realización específicas de la invención, se dan a modo de ilustración solo.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor mediante referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las formas de realización de la especificación presentadas en el presente documento.

Fig. 1. 12F1scFv-Fc y BIf CD123xCD3. Se muestra un diagrama esquemático de 12F1scFv-Fc y BIf CD123xCD3 en (A) y (B), respetivamente. (C) SDS-PAGE (12,5 %) de 12F1scFv-Fc y BIf CD123xCD3 purificadas en condiciones reducidas (panel derecho) y no reducidas (panel izquierdo).

Fig. 2. Unión a superficie celular de 12F1scFv-Fc y BIf CD123xCD3. La unión de 1 pg/ml de (A) 12F1; (B) BIf CD123xCD3 y (C) 12F1scFv-Fc a CHO-CD123 se analizó por citometría de flujo con anticuerpos secundarios conjugados a PE. El histograma de puntos representaba la reacción con IgG1 humana control. El eje y representaba las cuentas celulares. (D) Una placa de 96 pocillos recubierta con 5 x 104 células CHO-CD123/pocillo se fijó y probó por titulaciones en serie de 12F1 (cuadrado); 12F1scFv-Fc (triángulo); y BIf CD123xCD3 (círculo) y se detectó con anticuerpo de cabra anti-ratón (12F1) o de cabra anti-humano (12F1scFv-Fc y BIf CD123xCD3) conjugados a HRP. La media de tres conjuntos de reacciones se representó por GraphicPad Prism.

Fig. 3. Unión a superficie de células T de BIf CD123xCD3. La unión de 1 pg/ml de (A) BIf CD123xCD3; y (B) UCHT1 a células T Jurkat se analizó por citometría de flujo con anticuerpos secundarios conjugados a PE. El histograma de puntos representaba la reacción con IgG1 humana control. El eje y representaba las cuentas celulares. (C) Se usaron titulaciones en serie de UCHT1 (cuadrado) y BIf CD123xCD3 (triangulo) en el análisis citométrico de flujo con células T Jurkat. Los valores medios del eje X se representaron frente a concentraciones de proteína para análisis de Kd.

Fig. 4. Imágenes fluorescentes de células marcadas con CellTrace. Se sembraron 4 x 104 células CHO-K1 o CHO-CD123 marcadas con CFSE en cada pocillo de una placa negra de 96 pocillos con fondo de vidrio. (A) Se añadieron 4 x 105 linfocitos T purificados (E/T = 10) en cada pocillo con (derecha) o sin (izquierda) 10 nM de BIf CD123xCD3 y se incubó a 37 °C, CO2 al 5 % durante la noche. Las imágenes fluorescentes se tomaron directamente sin lavar. En ausencia de BIf, la mayoría de las células CHO-CD123 permanecieron adheridas. Al contrario, en presencia de BIf, la mayoría de las células CHO-CD123 tratadas se despegaron de la placa. (B) Igual que en (A), pero cada pocillo se lavó dos veces con PBS. Las células CHO-K1 no diana no estaban afectadas, pero la mayoría de las células CHO-CD123 se eliminaron en el lavado.

Fig. 5. Ensayos de citotoxicidad celular de células T mediada por BIf CD123xCD3. Cuando se usó 10 nM de BIf CD123xCD3, las citotoxicidades celulares a diferentes proporciones E/T se midieron cuantitativamente por (A) cuentas fluorescentes de CFSE de células CHO-K1 (barras rayadas) y CHO-CD123 (barras claras); o (B) ^lD^h liberada de células CHO-K1 (barras rayadas) y CHO-CD123 (barras claras). Las cuentas fluorescentes totales en células no tratadas; y actividades de LDH del mismo número de células lisadas con Triton se definieron como el 100 % en (A) y (B) , respectivamente. 10*: E/T = 10, pero sin BIf.

Fig. 6. La proporción E/T óptima. Se usaron ensayos de liberación de LDH para definir la proporción E/T óptima en presencia (+) o ausencia (-) de BIf CD123xCD310 nM. Se usaron células CHO-K1 (barras rayadas) y CHO-CD123 (barras claras) como células no diana y diana. Las actividades de LDH totales del mismo número de células lisadas con Triton se definieron como el 100 %.

Fig. 7. Respuestas a dosis de BIf CD123xCD3. Cuando se ajustó la E/T a 5, diferentes cantidades de BIf CD123xCD3 se titularon en células CHO-CD123 marcadas con CFSE. 0*: en ausencia tanto de BIf como de células T y definido como el 100 %.

Fig. 8. ADCC frente a citotoxicidades de células T . Se añadieron 2 x 105 LSP a una placa de 96 pocillos negra con fondo de vidrio con 4 x 104 células CHO-CD123 marcadas con CFSE (E/T = 5) y diferentes concentraciones de 12F1scFv-Fc (barras rayadas) o BIf CD123xCD3 (barras claras) según se indica en el eje X. Las cuentas fluorescentes totales de células sin tratar se ajustaron como el 100 %; y la línea de puntos indicaba las actividades de los LSP en ausencia de proteínas de fusión.

Figura 9. Efectos citotóxicos hacia líneas celulares de LMA. Las líneas celulares de LMA TF1-Hras (barras rayadas) y U-937 (barras claras) se trataron con LSP a una proporción E/T de 5 y BIf CD123xCD3 a las concentraciones indicadas en el eje X. Las actividades de LDH totales del mismo número de células lisadas con Triton se definieron como el 100 %.

Descripción

Una inmunofusión de scFv biespecífica o BIf como se describe en el presente documento es capaz de unirse a moléculas de superficie celular en una célula diana, tal como células cancerosas, y moléculas de superficie celular en células inmunoefectoras, tal como linfocitos T citotóxicos, produciendo la destrucción dirigida de células diana a baja proporción de efector a diana y/o dosis de fármaco.

La BIf se dirige a leucemia CD123+. Un ejemplo de una BIf que se dirige a leucemia comprende un dominio Fv monocatenario (scFv) anti-CD123 fusionado en el extremo N de bisagra-CH2-CH3 de IgG1 humana, y un scFv anti-CD3 fusionado en el extremo C (BIf CD123xCD3). En ciertos aspectos, las secuencias de Fc de IgG1 humana pueden proporcionar ventajas funcionales. Primero, el dominio Fc puede formar un dímero que proporciona una estructura de anticuerpo más natural. La afinidad de unión a la célula diana es entre 10 a 100 veces mayor que otras construcciones de scFv monoméricas. En ciertos aspectos, el diseño estructural puede ser un formato de polipéptido único que simplifica la producción de proteína. En un aspecto adicional, el polipéptido puede tener una cadena ligera y una cadena pesada separadas que tienen una estructura similar a anticuerpo quimérico. Segundo, los polipéptidos se pueden unir a receptores de Fc en células NK, granulocitos y macrófagos e involucrar funciones de ADCc . A diferencia de anticuerpos biespecíficos tradicionales, el dominio Fc de IgG1 humana no produce efectos secundarios asociados con inmunogenicidad. Tercero, mediante el sistema de rescate, la región Fc desempeña un papel en sostener la semivida del anticuerpo en suero del paciente. Por último, el peso molecular de aproximadamente 140 kDa puede ayudar a prevenir depuración renal. Por tanto, los polipéptidos descritos en el presente documento tienen una semivida en suero más larga y mejores capacidades de dirigirse a tumores.

La expresión de la BIf CD123xCD3 en una célula huésped (por ejemplo, células CHO-S), produce un homodímero de BIf CD123xCD3. El homodímero de BIf proporciona una estructura de dominio que se dirige a tumor N-terminal que se parece mucho a un anticuerpo natural. La estructura dimérica de CD123xCD3 también proporciona afinidad de unión a células tumorales CD123+ con una Kd de 10'10 M, que es de 1 a 2 órdenes de magnitud más fuerte que construcciones de anticuerpos biespecíficos tradicionales. La localización del scFv anti-CD3 en el extremo C de la BIf reduce la afinidad de unión a células T CD3+ en 2 órdenes, lo que ayuda a prevenir la activación de células T no específica. La BIf CD123xCD3 es capaz de lograr actividades de destrucción de células diana mediada por células T a niveles pM bajos con proporciones E/T tan bajos como 2. En conjunto, la inclusión de la región constante de IgG1 humana en la construcción BIf aumenta la afinidad de unión a célula diana y proporciona activación de citotoxicidades celulares mediadas por anticuerpo adicionales.

I. Células madre de leucemia

Ciertas formas de realización se dirigen a atacar células cancerosas CD123+. Un ejemplo de una célula cancerosa CD123+ es la célula madre de leucemia (LSC). Las LSC se definen como una pequeña población de blastos de leucemia con marcadores de superficie celular CD34+/CD38' que se parecen a las células madre hematopoyéticas (HSC) (Bonnet y Dick, 1997). Las LSC aisladas de pacientes de leucemia tienen la capacidad de repoblar tejidos hematopoyéticos en ratones NOD/SCID (Bonnet y Dick, 1997; Guan y Hoggs, 2000; Guzman et al, 2001; Hope et al, 2003; Hope et al, 2004; Lapidot et al, 1994; Wang y Dick, 2005), y poseen multirresistencia a fármacos a una variedad de agentes quimioterapéuticos (Costello et al, 2000; Ishikawa et al, 2007). Clínicamente, se ha atribuido mala supervivencia a alta frecuencia de CD34+/CD38' en el momento del diagnóstico en pacientes de leucemia mieloide aguda (van Rhenen et al, 2005). Se espera que los agentes terapéuticos que se dirigen a LSC podrían ser capaces de lograr remisiones durables (Abutalib y Tallman, 2006; Aribi et al, 2006; Morgan y Reuter, 2006; Park et al, 2009; Stone, 2007).

El marcador de superficie celular CD123 distingue LSC de células madre hematopoyéticas (HSC) (Djokic et al, 2009; Florian et al, 2006; Graf et al, 2004; Hauswirth et al, 2007; Jordan et al, 2000; Munoz et al, 2001; Riccioni et al, 2004; Sperr et al, 2004; Testa et al, 2002; Yalcintepe et al, 2006). CD123 es la subunidad a de receptores de interleuquina-3 (IL-3R). La función de interleuquina-3 (IL-3) mediada a través de la unión de los IL-3R es fomentar la supervivencia y proliferación celular (Bagley et al, 1997; Blalock et al, 1999; Miyajima et al, 1993; Yen y Yang-Yen, 2006), que es una característica principal de las células madre cancerosas que las hace más resistentes a agentes quimioterapéuticas convencionales. Los agentes terapéuticos que se dirigen a CD123 o IL-3R tendrían el potencial para eliminar la mayoría de las LSC, y por tanto, tendrían una mejor posibilidad de lograr una supervivencia sin enfermedad más larga en pacientes tratados.

Se han usado dos enfoques en ensayos clínicos de LMA de fase I para dirigirse a los IL-3R. El primero es usar un anticuerpo anti-CD123 quimérico (CSL360) derivado del anticuerpo monoclonal de ratón 7G3 (Jin et al, 2009; Sun et al, 1996). Estudios animales con un modelo en ratón de leucemia mostraron que 7G3 elimina de forma eficaz LMA-LSC mediante el bloqueo del efecto de migración dirigida de LSC, así como la activación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (Jin et al, 2009). Mientras la administración de CSL360 es segura para pacientes, los primeros datos de fase I mostraron eficacia mínima (Roberts et a., 2010). El otro ensayo en fase I es una inmunotoxina, DT388IL3 (Liu et al, 2010). DT388IL3 es una proteína de fusión que consiste en los dominios catalítico y de translocación de la toxina de la difteria (DT388) fusionados a IL-3 humana (Frankel et al, 2008; Frankel et al, 2000; Urieto et al, 2004). La unión de IL-3 a los IL-3R lleva a la internalización celular de DT388IL3 y produce la activación de apoptosis y muerte celular (Sandvig y van Deurs, 2002; Thorburn et al, 2004). Se encontró que DT388IL3 era específicamente citotóxica hacia líneas celulares de LMA y LMA-LSC, pero no HSC (Feuring-Buske et al, 2002). DT388IL3 se ha ensayado en pacientes con LMA resistente o con recaída o síndrome mielodisplásico de alto riesgo, y a los niveles de dosis actuales, no se observó toxicidad hepática o renal irreversible. Hubo 2 casos de remisiones completas y varias remisiones parciales (Liu et al, 2010). Aunque la tasa de respuesta a DT388IL3 es baja, los resultados proporcionaron la prueba de principio que dirigirse a los IL-3R es relativamente seguro y podría tener impacto en el tratamiento de LMA.

La infusión de linfocitos de donantes se ha utilizado para neoplasias malignas hematológicas después de trasplante de células madre alogénico (Kolb et al, 2009; Ringden et al, 2009). Se ha mostrado que la actividad del injerto contra la leucemia después de la infusión de linfocitos produce remisiones durables. Sin embargo, estas respuestas clínicas solo se observaron en un número limitado de pacientes (Oliansky et al, 2008). Además, complicaciones graves de la enfermedad del injerto contra el huésped tienen el potencial de inducir morbilidad y mortalidad durante la terapia (Biagi et al, 2007). En conjunto, estos hallazgos clínicos han impulsado la investigación traslacional para novedosos enfoques terapéuticos para aumentar los beneficios clínicos de la terapia de infusión de linfocitos mientras se minimiza el potencial para efectos secundarios indeseados.

Ciertos polipéptidos descritos en el presente documento se pueden usar como un agente terapéutico para dirigirse a blastos de leucemia CD123+ y LSC, por ejemplo, el polipéptido CD123xCD3. Estas novedosas proteínas de fusión pertenecen a una familia de anticuerpos biespecíficos (Kontermann 2012; Choi et al, 2011). El anticuerpo monoclonal murino anti-CD123 12F1, la mayor afinidad de unión obtenida por Kuo et al (2009) se eligió para ser usado en construcción de BIf. El anticuerpo anti-CD3 monocatenario se derivó de UCHT1 (Woo et al, 2008; Thompson et al, 2001; Hexham et al, 2001) con uso de codón optimizado y diseño de enlazador para expresión en células de mamífero. A diferencia de BiTE, estos dos scFv se unieron por puente con un dominio bisagra-Chi2-CH3 de la región constante de IgG1 humana. Un tipo similar de construcción se describió antes (Croasdale et al, 2012; Dong et al, 2011; Coloma y Morrison, 1997) que porta una estructura tetramérica cadena pesada/ligera natural, pero con un scFv adicional a un antígeno secundario fusionado al extremo C de la cadena pesada. Cuando se expresa y secreta de un único plásmido en células CHO-S cultivadas en suspensión, la proteína de fusión BIf forma un homodímero. Los pares N y C terminales de los sitios scFv con orientaciones de unión en forma de Y comparten la misma región Fc que el tallo vertical. Cada scFv fue capaz de unirse a antígeno de superficie celular específico y llevar linfocitos T citotóxicos para destruir las células diana a baja proporción de efector respecto a diana y dosis de fármaco.

La inclusión de secuencias de Fc de IgG1 humana en una inmunoglobulina biespecífica servía varias ventajas funcionales. Primero, el dominio Fc forma dímero que proporciona una estructura de anticuerpo más natural para el dominio que se dirige a células tumorales. Los datos mostraron que la afinidad de unión a células diana de la BIf CD123xCD3 es aproximadamente 5 veces menor que el anticuerpo parental 12F1, pero esta actividad de dirigirse a células tumorales es 1-2 órdenes de magnitud mayor que otras construcciones scFv monoméricas (Stein et al, 2010; Hammond et al, 2007; Buhler et al, 2008; Moore et al, 2011). Debido a su estructura similar a anticuerpo natural, la humanización adicional de CD123xCD3 para reducir la inmunogenicidad es posible. Segundo, CD123xCD3 tiene el potencial de unirse a receptores de Fc en células NK, granulocitos, macrófagos e involucrar funciones ADCC (Croasdale et al, 2012). Pero, a diferencia de catumaxomab, el dominio Fc de IgG1 humana no producirá los efectos secundarios asociados con inmunogenicidad. Tercero, mediante el sistema de rescate mediado por FcRn, la región Fc de IgG1 humana podría desempeñar un papel en sostener la semivida del anticuerpo en suero del paciente. Además, comparado con BiTE a 50 kDa, CD123xCD3 tiene un peso molecular de 140 kDa que también ayudaría a prevenir la depuración renal. En conjunto, se contempla que CD1123xCD3 tendrá semivida en suero más larga y mejores capacidades de dirigirse a tumores.

Hay un anticuerpo biespecífico CD123xCD16 descrito que recluta células NK para destruir células tumorales (Kugler et al, 2010; Stein et al, 2010). Comparado con CSL360, CD123xCD16 trajo actividades de destrucción celular CD123+ adicionales. Sin embargo, cuando se usaron CMSP en sus estudios, la proporción E/T requerida era mayor de 20. Los inventores eligieron involucrar células T citotóxicas por su alto potencial citotóxico, abundancia, y capacidad para penetrar tumores sólidos. Además, los linfocitos T citotóxicos han demostrado antecedentes para su potencial para destruir enfermedades malignas en pacientes.

II. Composiciones de polipéptidos

Las composiciones de la invención incluyen varias BIf como se ha descrito anteriormente. Como se usa en el presente documento, una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos es “sustancialmente la misma que” o “sustancialmente similar a” una secuencia de referencia si la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos tiene al menos el 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de referencia sobre una ventana de comparación determinada. Por tanto, secuencias sustancialmente similares incluyen las que tiene, por ejemplo, al menos el 85 % de identidad de secuencia, al menos el 90 % de identidad de secuencia, al menos el 95 % de identidad de secuencia o al menos el 99% de identidad de secuencia. Dos secuencias que son idénticas entre sí también son sustancialmente similares.

La identidad de secuencia se calcula basado en una secuencia de referencia. En la técnica se conocen algoritmos para el análisis de secuencia, tal como BLAST, descrito en Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, pp. 403-10 (1990). En un aspecto, se realizan comparaciones de secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos con software Blast proporcionado por el Centro Nacional para Información de Biotecnología usando un alineamiento con huecos con parámetros por defecto, se puede usar para determinar el nivel de identidad y similitud entre secuencias de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos.

Los mutantes o variantes puede retener propiedades biológicas de la inmunoglobulina biespecífica (SEQ ID NO: 1, 2, 3 y/o 4). Las mutaciones o sustituciones incluyen cambios de aminoácidos únicos, deleciones o inserciones de uno o más aminoácidos, truncamientos o extensiones N-terminales, truncamientos o extensiones C-terminales y similares. Cada componente polipeptídico de la inmunoglobulina biespecífica se puede variar de tal modo que produzca una variante o mutante de la proteína definida en SEQ ID NO: 1, 2, 3 y/o 4.

Se pueden generar mutantes o variantes usando técnicas estándar de biología molecular como se describe en detalle en la sección “Moléculas de ácido nucleico”. Dada la orientación proporcionada en los ejemplos, y usando técnicas estándar, los expertos en la materia pueden fácilmente generar una amplia variedad de mutantes adicionales y ensayar si una propiedad biológica se ha alterado. Por ejemplo, se pueden medir afinidades de unión o eficacia de destrucción usando ensayos in vitro.

Las proteínas de la invención objeto están presentes en un entorno no natural, por ejemplo, son proteínas recombinantes o manipuladas. Las proteínas de la presente invención pueden estar presentes en la forma aislada, mediante lo cual se quiere decir que la proteína está sustancialmente libre de otras proteínas y otras moléculas biológicas naturales, tal como oligosacáridos, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, y similares, donde el término “sustancialmente libre” en este caso significa menos del 70 %, habitualmente menos del 60 % y más habitualmente menos del 50 % de la composición que contiene la proteína aislada es alguna otra molécula biológica natural. En ciertas formas de realización, las proteínas están presentes en forma sustancialmente purificada, donde mediante “forma sustancialmente purificada” se quiere decir al menos el 95 %, habitualmente al menos el 97 % y más habitualmente al menos el 99 % pura. En otros aspectos, las proteínas descritas en el presente documento se pueden expresar in vitro o in vivo, incluyendo expresión en células transgénicas o animales modelo transgénicos.

Las proteínas objeto se pueden producir sintéticamente, por ejemplo, expresando una secuencia codificante de ácido nucleico recombinante que codifica la proteína de interés en un huésped adecuado, como se ha descrito anteriormente. Se puede emplear cualquier procedimiento de purificación de proteínas conveniente, en donde metodologías de purificación de proteínas adecuadas se describen en Guide to Protein Purification, (Deuthser ed., Academic Press, 1990). Por ejemplo, se puede preparar un lisado de la fuente original y purificar usando HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, y similares.

III. Moléculas de ácido nucleico

La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican una BIf como se describe en el presente documento. En una forma de realización, la BIf tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y puede incluir varios mutantes o variantes de la misma. Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes más cortas o más largas de la BIf o sus variantes también están en el ámbito de la invención.

Una molécula de ácido nucleico como se usa en el presente documento es una molécula de ADN, tal como una molécula de ADNc, o una molécula de ARN, tal como una molécula de ARNm. El término “ADNc” como se usa en el presente documento se pretende que incluya ácidos nucleicos que comparten la organización de elementos de secuencia encontrados en especies de ARNm maduro, donde los elementos de secuencia son exones, y regiones 5' y 3' no codificantes.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican la BIf de la invención se pueden sintetizar a partir de nucleótidos trifosfato apropiados o aislar de fuentes biológicas recombinantes. Ambos métodos utilizan protocolos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la disponibilidad de información de secuencia de aminoácidos proporcionada en el presente documento, permite la preparación de moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención por síntesis de oligonucleótidos o por técnicas recombinantes. En el caso de información de la secuencia de aminoácidos, se puede sintetizar un número de ácidos nucleicos que se diferencian entre sí debido al código degenerado. Los métodos para seleccionar variantes de uso de codón para huéspedes deseados, tal como seres humanos, se conocen bien en la técnica.

Se pueden preparar oligonucleótidos sintéticos por el método de la fosforamidita, y las construcciones resultantes se pueden purificar según métodos conocidos en la técnica, tal como cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) u otros métodos como se describe en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., y bajo las regulaciones descritas en, por ejemplo, las Directrices para Investigación de ADN Recombinante del Dept. de HHS de los Estados Unidos, Instituto Nacional de Salud (NIH). Las moléculas de ADN bicatenario, largas de la presente invención se pueden sintetizar sintetizando varios segmentos menores de complementariedad apropiada que comprenden extremos cohesivos apropiados para unión de un segmento adyacente. Los segmentos adyacentes se pueden unir usando ADN ligasa o métodos basados en PCR.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican los dominios y/o enlazadores descritos en el presente documento o su equivalente también se pueden clonar de fuentes biológicas o ácido nucleicos recombinantes conocidos.

En ciertas formas de realización, una molécula de ácido nucleico de la invención es una molécula de ADN (o ADNc) que comprende un marco abierto de lectura que codifica las inmunoglobulinas biespecíficas descritas en el presente documento y es capaz, en las condiciones apropiadas (por ejemplo, condiciones fisiológicas celulares), de expresarse como una inmunoglobulina biespecífica según la invención. La invención también abarca ácidos nucleicos que son homólogos, sustancialmente iguales a, idénticos a, o variantes de los ácidos nucleicos que codifican las proteínas descritas en el presente documento. Los ácidos nucleicos objeto son ácidos nucleicos recombinantes, es decir, son ácidos nucleicos manipulados no presentes en la naturaleza.

La presente invención proporciona además un ácido nucleico que codifica un polipéptido BIf que es una variante de la secuencia de aminoácidos de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1. Un ácido nucleico que codifica tal polipéptido puede mostrar más del 60, 70, 80, 90, 95, o 99 % de identidad con un ácido nucleico que codifica SEQ ID NO: 1.

Se pueden generar ácidos nucleicos variante sobre un ácido nucleico molde seleccionado de los ácidos nucleicos anteriormente descritos modificando, delecionando, o añadiendo uno o más nucleótidos en la secuencia molde, o una combinación de los mismos, para generar una variante del ácido nucleico molde. Las modificaciones, adiciones o deleciones se pueden introducir por cualquier método conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Gustin et al., Biotechniques (l993) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 111-123; y Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199:537-539, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp. 15.3-15.108) incluyendo PCR propensa a errores, mezclado, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, PCR de ensamblaje, mutagénesis por PCR, mutagénesis in vivo, mutagénesis de casete, mutagénesis de agrupación recurrente, mutagénesis de agrupación exponencial, mutagénesis dirigida, mutagénesis aleatoria, reensamblaje de genes, mutagénesis saturada de sitio génico (GSSM), reensamblaje por ligación sintética (SLR), o una combinación de las mismas. Las modificaciones, adiciones o deleciones también se pueden introducir por un método que comprende recombinación, recombinación de secuencia recurrente, mutación de ADN modificado con fosfotionato, mutagénesis de molde que contiene uracilo, mutagénesis por dúplex con huecos, mutagénesis por reparación de mal emparejamiento puntual, mutagénesis de cepa huésped deficiente en reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis por deleción, mutagénesis por restricción-selección, mutagénesis por restricción-purificación, síntesis de genes artificiales, mutagénesis de agrupación, creación de multímeros de ácido nucleico quimérico y una combinación de los mismos.

Además, también se proporcionan variantes degeneradas de los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de la presente invención. Las variantes degeneradas de ácidos nucleicos comprenden sustituciones de los codones del ácido nucleico con otros codones que codifican los mismos aminoácidos. En particular, las variantes degeneradas de los ácidos nucleicos se generan para aumentar su expresión en una célula huésped. En esta forma de realización, los codones del ácido nucleico que son no preferidos o menos preferidos en genes en la célula huésped se sustituyen con codones sobrerrepresentados en secuencias codificantes en genes en la célula huésped, en donde dichos codones sustituidos codifican el mismo aminoácido. Las versiones humanizadas de los ácidos nucleicos de la presente invención son de particular interés. Como se usa en el presente documento, el término “humanizado” se refiere a cambios hechos a la secuencia de ácidos nucleicos para optimizar los codones para expresión de la proteína en células de mamífero (humanas) (Yang et al., Nucleic Acids Research (1996) 24: 4592-4593). Véase también la patente en EE UU No. 5.795.737, que describe humanización de proteínas.

También se proporcionan vectores y otras construcciones de ácido nucleico que comprenden los ácidos nucleicos objeto. Los vectores adecuados incluyen vectores víricos y no víricos, plásmidos, cósmidos, fagos, etc., preferiblemente plásmidos, y usados para clonación, amplificación, expresión, transferencia etc. de la secuencia de ácido nucleico de la presente invención en el huésped apropiado. La elección de un vector apropiado está dentro de la capacidad de la técnica, y muchos de tales vectores están disponibles comercialmente. Para preparar las construcciones, el ácido nucleico parcial o de longitud completa se inserta en un vector típicamente por medio de unión con ADN ligasa a un sitio cortado con enzimas de restricción en el vector. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos deseada se puede insertar por recombinación homóloga in vivo, típicamente uniendo regiones de homología al vector en los flancos de la secuencia de nucleótidos deseada. Las regiones de homología se añaden por ligación de oligonucleótidos, o por reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores que comprenden tanto la región de homología como una porción de la secuencia de nucleótidos deseada, por ejemplo.

También se proporcionan casetes o sistemas de expresión usados entre otros para la producción de la inmunoglobulina biespecífica objeto o para la replicación de las moléculas de ácido nucleico objeto. El casete de expresión puede existir como un elemento extracromosómico o puede estar integrado en el genoma de la célula como resultado de la introducción de dicho casete de expresión en la célula. Para la expresión, el producto génico codificado por el ácido nucleico de la invención se expresa en cualquier sistema de expresión conveniente, incluyendo, por ejemplo, sistemas bacterianos, de levadura, insecto, anfibio o mamífero. En el vector de expresión, un ácido nucleico objeto está operativamente unido a una secuencia reguladora que puede incluir promotores, potenciadores, terminadores, operadores, represores e inductores. Los métodos para preparar casetes o sistemas de expresión capaces de expresar el producto deseado los conoce un experto en la materia.

Se pueden seleccionar líneas celulares, que expresan de forma estable las proteínas de la presente invención, por los métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, la cotransfección con un marcador seleccionable tal como dhfr, gpt, neomicina, higromicina, permite la identificación y el aislamiento de las células transfectadas que contienen el gen integrado en un genoma).

Los sistemas de expresión anteriormente descritos se pueden usar en huéspedes procariotas o eucariotas. Se pueden usar células huésped tal como E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, células de insecto en combinación con vectores baculovirus, o células de un organismo superior tal como vertebrados, por ejemplo, células COS 7, HEK 293, CHO, ovocitos de Xenopus, células primarias, etc., para la producción o expresión de la proteína.

Cuando cualquiera de las células huésped anteriormente referenciadas, u otras células u organismos huésped apropiados se usan para replicar y/o expresar los ácidos nucleicos de la invención, el ácido nucleico replicado resultante, proteína o polipéptido expresado está en el ámbito de la invención como un producto de la célula u organismo huésped. El producto se puede recuperar por un medio apropiado conocido en la técnica.

IV. Composiciones farmacéuticas y administración de las mismas.

Un aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende una BIf como se describe en el presente documento. Otra divulgación es el uso de anticuerpo biespecífico para la fabricación de una composición farmacéutica. Una divulgación adicional es un método para la fabricación de una composición farmacéutica que comprende una inmunoglobulina biespecífica como se describe en el presente documento. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene una inmunoglobulina biespecífica como se describe en el presente documento, formulada junto con un soporte farmacéutico.

Una forma de realización de la invención es una inmunoglobulina biespecífica como se describe en el presente documento para el tratamiento del cáncer. Otra forma de realización se dirige a pretratar productos de transfusión sanguínea o trasplante, tejidos, u órganos para reducir el número de células CD123+ en el candidato a transfusión o trasplante.

Otro aspecto de la invención es dicha composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.

Otra divulgación es el uso de una inmunoglobulina biespecífica como se describe en el presente documento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

Otra divulgación es un método de tratamiento de un paciente que padece cáncer administrando una inmunoglobulina biespecífica como se describe en el presente documento a un paciente en necesidad de tal tratamiento.

Como se usa en el presente documento, “soporte farmacéutico” incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el soporte es adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, raquídea o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión).

Una composición de la presente invención se puede administrar por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como apreciará el experto en la materia, la ruta y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Para administrar un compuesto de la invención por ciertas rutas de administración, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o coadministrar el compuesto con, un material para prevenir su inactivación. Por ejemplo, el compuesto se puede administrar a un sujeto en un soporte apropiado, por ejemplo, liposomas, o un diluyente. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina y soluciones tampón acuosas. Los soportes farmacéuticos incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersión inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica.

Las frases “administración parenteral” y “administrado por vía parenteral” como se usan en el presente documento significan modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, habitualmente por inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intrarraquídea, epidural e intracisternal.

El término cáncer como se usa en el presente documento se refiere a enfermedades proliferativas, tal como leucemias y cualquier otro cáncer en el que se pueden detectar células cancerosas CD123+, incluyendo versiones resistentes de cualquiera de los cánceres anteriores, o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tal como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes de dispersión. La prevención de la presencia de microorganismos se puede asegurar tanto por procedimientos de esterilización, supra, como por la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tal como azúcares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede producir mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción tal como monoestearato de aluminio y gelatina.

Independientemente de la ruta de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que se pueden usar en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas posológicas farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales que conocen los expertos en la materia.

Los niveles de dosis reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar de modo que se obtenga una cantidad del principio activo que sea eficaz para alcanzar la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particulares, sin que sea tóxico para el paciente. El nivel de dosis seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, la ruta de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se emplea, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, estado, salud general y antecedentes médicos previos del paciente que se trata, y factores similares bien conocidos en la técnicas médicas.

La composición debe ser estéril y fluida al nivel de que la composición sea administrable por jeringa. Además de agua, el soporte preferiblemente es una solución salina tamponada isotónica.

La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, y cloruro de sodio en la composición.

V. Ejemplos

Los siguientes ejemplos, así como las figuras se incluyen para demostrar formas de realización preferidas de la invención. Los expertos en la materia deben apreciar que las técnicas divulgadas en los ejemplos o las figuras representan técnicas que los inventores descubrieron funcionan bien en la práctica de la invención, y por tanto se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica.

EJEMPLO 1

Inmunoglobulinas biespecíficas CD123xCD3

A. Materiales y Métodos

Líneas celulares y anticuerpos . Las células Jurkat, TF1/H-ras (Kiser et al, 2001) y U-937 se mantuvieron en medio RPMI que contenía SBF al 10 %. Las células CHO-K1 (ATCC) se mantuvieron en medio F-12K formulado por ATCC que contenía SBF al 10 %. Las células CHO-K1 transfectadas establemente con CD123 humana (CHO-CD123) se mantuvieron en medio F-12K suplementado con SFB al 10 % y zeocina (Invitrogen) 0,4 mg/ml. Las células CHO-S FreeStyle (Life Technology/Invitrogen) se mantuvieron en medio de expresión CHO FreeStyle suplementado con L-glutamina 8 mM. Las células de hibridoma que producen anticuerpo murino anti-CD123 humana 12F1 se describieron previamente (Kuo et al, 2009).

Construcción de plásmidos de expresión de 12F1scFv-Fc y BIf CD123xCD3 . El ADN complementario de las regiones variables de 12F1 se amplificó por RT-PCR usando kit de extracción de ARN total RNeasy (Qiagen), kit de RT-PCR One-step (Qiagen) y conjuntos de cebadores de Ig de ratón (EMD Bioscience). Los fragmentos de ADN amplificados se clonaron en el vector de clonación pDrive TA lineal (Qiagen) y los insertos de PCR se secuenciaron. Las secuencias variables de la cadena ligera (V^l) y variable de la cadena pesada (V^h) correctas se verificaron comparando con bases de datos de secuencias de inmunoglobulinas de ratón (AntibodyResource.com). El scFv de 12F1, en el orden de V^l-218L-V^h, se creó posteriormente por amplificación de PCR solapante de V^l y V^h usando los siguientes pares de cebadores: P1 (GATATCGGACATTATGATGTCACAG) (SEQ ID NO:5) y P2 (TTCACCGCTTCCCGGTTTTCCGGAGCCAGAGGTGCTACCTTTGATTTCCAGTTTGGT) (SEQ ID NO:6); y P3 (TCCGGAAAACCGGGAAGCGGTGAAGGGTCCACCAAGGGTGTGCAGCTTCAGGAGTCG) (SEQ ID NO:7) y P4 (AGATCTGGCTGAGGAGACTGTGAGAGT) (SEQ ID NO:8), respectivamente. Los cebadores P2 y P3 tienen un solapamiento complementario de 24 pares de bases y cada uno codificaba un enlazador de 18 residuos 218L (GSTSGSGKPGSGEGSTKG) (SEQ ID NO:9) (Whitlow et al, 1993; Vallera et al, 2009). El 12F1scFv se clonó después en los sitios EcoRV y BglII del vector pINFUSE-hIgG1-Fc2 (InvivoGen) para generar el plásmido de expresión de 12F1scFv-Fc p12F1scFv-hIg. La secuencia del anticuerpo anti-CD3 monocatenaria con codones optimizados se derivó del Acm murino UCHT1 con una secuencia enlazadora anterior (AGATCTGGATCACCATGG) (s Eq ID NO:10), seguida por V^l, enlazador 218L, V^h y un codón de terminación posterior & secuencias enlazadoras (TAACTCGAGGCTAGC) (SEQ ID NO:11). El ADN se sintetizó por GenScript (Piscataway, NJ) y se clonó en los sitios BglII y NheI de p12F1scFv-hIg para generar p12F1scFv-scUCHT1. El fragmento bisagra-CH2-CH3 de IgG1 humana se obtuvo por PCR con los cebadores P5 (AGATCTGACAAAACTCACACATGC) (SEQ ID NO:12) y P6 (CCATGGTTTACCCGGAGACAGGGA) (SEQ ID NO:13) y se clonó en los sitios BglII y NcoI de psc12F1-scUCHT1 para generar el plásmido que expresa BIf CD123xCD3, pCD123xCD3BIf. De los extremos 5' a 3', la secuencia de la región codificante es: VL(12F1)-218L-VH(12F1)-bisagra-CH2-CH3-VL(UCHT1)-218L-VH(UCHT1).

Expresión y purificación de 12F1scFv-Fc y BIf CD123xCD3 . 12F1scFv-Fc o BIf CD123xCD3 secretados se expresaron en células CHO-S de forma transitoria con los plásmidos p12F1scFv-hIg o pCD123xCD3BIf usando reactivos de transfección TransIT-PRO (Mirus). El sobrenadante del cultivo se recogió 6 días después de la transfección y se mezcló con 0,5 ml de perlas de proteína G Sepharosa (GE Healthcare) a 4 °C durante 16-18 horas. Las proteínas se eluyeron con trietilamina 100 mM pH 11,0 y se neutralizaron inmediatamente con 1/10 volumen de fosfato de sodio 1 M pH 6,0. Se usó la columna de desalado PD-10 (GE Healthcare) pata intercambiar el tampón de la proteína purificada a solución salina tamponada en fosfato (PBS) pH 7,4. Las proteínas se esterilizaron a través de un filtro de jeringa de 0,2 pm (PALL). Las concentraciones de proteínas se midieron por ensayo de Bradford (Bio-Rad) con BSA (Pierce) como estándar y se verificó por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS al 12,5 % reducido en condiciones reductoras o no reductoras, y tinción con azul de Coomassie R.-250. El rendimiento de proteína es 2­ 5 mg/l.

Análisis citométrico de flujo . Las células en monocapa en crecimiento en fase logarítmica se recogieron con solución de tripsina/EDTA (ATCC) y se lavaron una vez con medio de cultivo y una vez con PBS que contenía BSA al 1 %. Se resuspendieron 1 x 106 células en 200 pl de solución de tinción (PBS, BSA al 1 %, suero normal de cabra al 3 % y la concentración indicada de 12F1, 12F1scFv-Fc o BIf CD123xCD3) a temperatura ambiente durante 1 hora. Se usó IgG1 humana (Sigma) como control. Las células se enjuagaron dos veces con PBS que contenía BSA al 1 % y se incubaron con anticuerpo de cabra anti-humano o anti-ratón conjugado a PE (Jackson Lab) a temperatura ambiente durante 1 hora. Las células se lavaron tres veces con PBS que contenía BSA al 1 %, se resuspendieron en 500 pl de PBS y se analizaron en un citómetro de flujo Beckman Coulter Cytomic FC 500.

Enzimoinmunoanálisis de adsorción celular (CELISA) . Un día antes del experimento, 5 x 104 células CHO-K1 o CHO-CD123 se sembraron en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano. Al día siguiente, las células se lavaron con PBS y se fijaron con formaldehído al 3 % en PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las células fijadas se lavaron tres veces con PBS que contenía Tween-20 al 0,5 % (PBST) y se incubaron en solución de bloqueo (PBS con suero de cabra la 10 %) durante 30 minutos. Se añadió después una titulación de 12F1, 12F1scFv-Fc o BIf CD1234xCD3 a temperatura ambiente durante 60 minutos, seguido por lavado con PBST y después incubación de 45 minutos con anticuerpos secundarios anti-ratón o anti-humano conjugados a HRP (Lackson Lab) a temperatura ambiente. La actividad de HRP se detectó por sustrato de HRP (R&D) durante 10 minutos y se paró por H2SO40,5 N. Las placas se leyeron por un lector de placas ajustado a 450 nm.

Determinación de las afinidades de unión . Para antígeno en células cultivadas en monocapa (CHO-CD123), se usó enizoinmunoanálisis de adsorción celular (CELISA, véase anteriormente) para evaluar las afinidades de unión (Kuo et al, 2009). La concentración de la proteína de fusión o anticuerpo que tiene el 50 % de las capacidades de unión máximas se definió como Kd. Para células cultivadas en suspensión, se usó citometría de flujo para medir las afinidades de unión. Las concentraciones de la proteína de fusión o anticuerpo que alcanzan el valor medio del eje X al 50 % del valor medio máximo se definió como Kd.

Células diana marcadas con CFSE . Se recogieron células CHO-K1 y CHO-CD123 y se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en 1 ml de PBS. Dos pl de CSFE (5 mM en DMSO) de CellTrace (Invitrogen) recién preparado se añadieron a la suspensión celular y se incubó a 37 °C durante 15 minutos. Las células marcadas se lavaron dos veces con PBS, se resuspendieron en medio de cultivo y se sembraron en una placa de fondo de vidrio de 96 pocillos negra (Costar) a 4 x 104 células/pocillo para ensayos de citotoxicidad celular.

Aislamiento de linfocitos de sangre periférica y linfocitos T . Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humana de capas leucocíticas recientes de donantes sanos con consentimiento usando solución de centrifugación en gradiente Ficoll-Paque Premium (GE Healthcare) o compradas de Astarte Biologics (Redmond, WA). Después de incubación durante la noche a 37 °C, CO2 al 5 % en medio RPMI que contenía SBF inactivado por calor al l0 % y 100 unidades/ml de IL-2 humana recombinante (eBioscience), la fracción no adherente de las CMSP se recogió y usó como linfocitos de sangre periférica (LSP).

Se enriquecieron linfocitos T humanos de sangre reciente de donantes con consentimiento usando mezcla de enriquecimiento RosetteSep HLA (StemCell Technologies) y se cultivaron a 37 °C, CO2 al 5 % en medio RPMI que contenía SBF inactivado por calor al 10 % y 100 unidades/ml de IL-2 humana recombinante.

Ensayos de citotoxicidad celular . La citotoxicidad se midió en un ensayo de medida de la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) cuantitativo colorimétrico estándar (Promega) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, 4 x 104 células diana se mezclaron con diferentes cantidades a 12F1scFv-Fc o BIf CD123xCD3 y fracción de linfocitos T en la proporción indicada de efector respecto a diana (E/T). Las células se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % durante 18-24 horas. Después de centrifugación, se retiraron 50 pl de sobrenadante claro de cada pocillo, se transfirieron a otra placa de 96 pocillos y se mezclaron con 50 pl de sustrato de ensayo de LDH a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las actividades ^l D^h liberadas del mismo número de células diana tratadas con solución de lisis de Triton, después de restar la liberación de LDH espontánea de las células diana, se definió como el 100 % de actividad de lisis.

Para células CHO-K1 y CHO-CD123, también se probaron ensayos de toxicidad en células diana marcadas con CFSE. Las células marcadas se sembraron en placas de 96 pocillos negras con fondo de vidrio durante 4-6 horas para asegurar la unión apropiada. Se añadieron proteínas de fusión y células efectoras en las cantidades indicadas y se incubó a 37 °C, CO2 al 5 % durante 18-24 horas. Las células se lavaron dos veces con PBS. Se midieron las cuentas fluorescentes de CFSE en las células restantes con un lector de placas fluorescentes GloMax (Promega). La lectura de fluorescencia de células diana tratadas control se definió como el 100 %. También se tomaron imágenes por microscopio de fluorescencia y marcadas por Adobe Photoshop.

B. Resultados

Construcción de 12F1scFv-Fc y BIf CD123xCD3 . Las estructuras de proteína predichas de 12F1scFv-Fc y BIf CD123xCD3 se mostraron en las figuras 1A y 1B. La única diferencia entre estas dos proteínas de fusión es que la BIf porta las secuencias del anticuerpo anti-CD3 monocatenario C-terminal adicionales. Cuando se expresaron de forma transitoria de células CHO-S, 12F1scFv-Fc tuvo un mayor rendimiento a 5 mg/ml frente a BIf CD123xCD3 a 2 mg/ml. La purificación con proteína G Sepharosa en una única etapa da altas purezas de ambas proteínas de fusión (Fig. 1C).

Actividades de unión a CD123 de superficie celular . Se examinaron las capacidades de 12F1scFv-Fc y BIf CD123xCD3 de unirse a CD123 de superficie celular por citometría de flujo usando CHO-K1 y CHO-CD123. Se usó el anticuerpo monoclonal murino 12F1 como control positivo. A 1 pg/ml, todas las tres proteínas mostraron fuertes actividades de unión a células CHO-CD123 (Fig. 2A a 2C), pero no a células CHO-K1 (datos no mostrados). Las afinidades de unión se ensayaron en ELISA celular con células CHO-CD123. 12F1scFv-Fc y BIf CD123xCD3 mostraron menores afinidades de unión que 12F1 (Fig. 2D), pero los valores de Kd todavía están a entre 10'11 y 10'1° M, una afinidad por célula diana que es 1-2 órdenes mayor que cualquier anticuerpo biespecífico actualmente desarrollado con scFv monomérico (Stein et al, 2010; Hammond et al, 2007; Buhler et al, 2008; Moore et al, 2011).

Actividades de unión a células T . Se usaron células T Jurkat para ensayar las capacidades de BIf CD123xCD3 de reclutar células T. A 1 pg/ml, BIf CD123xCD3 ya mostró menores actividades de unión que el anticuerpo UCHT1 original a células Jurkat en análisis citométrico de flujo (Fig. 3A y 3B). Cuando se usaron titulación en serie de anticuerpos y los valores medios del eje X para medir las afinidades de unión, BIf CD123xCD3 mostró una Kd a 10'8 M, 2 órdenes mayor que la de UCHT1 (Fig. 3C). Esta afinidad de unión a células T reducida ayudaría a prevenir activación de células T no específica.

Citotoxicidades de células T mediadas por BIf . Puesto que nuestra construcción BIf contiene la región Fc de secuencias de IgG1 humana, es posible que se una a receptores de Fc en células efectoras y que active ADCC. Para

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un homodímero de inmunofusión de scFv biespecífico en donde cada subunidad del homodímero comprende un Fv monocatenario anti-CD123 en el extremo N, un Fv monocatenario anti-CD3 en el extremo C, y un enlazador de la región constante de inmunoglobulina que acopla operativamente el scFv anti-CD123 y el scFv anti-CD3, en donde el enlazador de la región constante de inmunoglobulina es un dominio bisagra-CH2-CH3 de IgG1 humana.

2. El homodímero de inmunofusión de scFv biespecífico de la reivindicación 1, en donde el Fv monocatenario anti-CD123 comprende regiones variables que tienen una secuencia de aminoácidos de las regiones variables de SEQ ID NO: 2.

3. El homodímero de inmunofusión de scFv biespecífico de la reivindicación 1, en donde el Fv monocatenario anti-CD123 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

4. El homodímero de inmunofusión de scFv biespecífico de la reivindicación 1, en donde el scFv anti-CD3 comprende las regiones hipervariables de SEQ ID NO: 3.

5. El homodímero de inmunofusión de scFv biespecífico de la reivindicación 1, en donde el scFv anti-CD3 comprende regiones variables que tienen una secuencia de aminoácidos idéntica a SEQ ID NO: 3.

6. El homodímero de inmunofusión de scFv biespecífico de la reivindicación 1, en donde la región constante de inmunoglobulina tiene una secuencia de aminoácidos que es el 95 % idéntica a SEQ ID NO: 4.

7. El homodímero de inmunofusión de scFv biespecífico de la reivindicación 6, en donde la región constante de inmunoglobulina tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a SEQ ID NO: 4.

8. El homodímero de inmunofusión de scFv biespecífico de la reivindicación 1 que tiene una secuencia de aminoácidos que es el 90 % idéntica a SEQ ID NO: 1.

9. El homodímero de inmunofusión de scFv biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso en terapia.

10. El homodímero de inmunofusión de scFv biespecífico de la reivindicación 9 para uso en un método de tratar cánceres en los que se pueden detectar células cancerosas CD123+.

11. El homodímero de inmunofusión de scFv biespecífico para el uso de la reivindicación 10 en donde el cáncer es leucemia.