JP7341185B2 - 前立腺特異幹細胞抗原に対する抗体およびその使用 - Google Patents

Description

本発明は、前立腺特異幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）に結合する組換え抗体、ならびに診断法および治療におけるその使用に関する。この抗体は、医学、薬学、および生物医学研究の分野での使用に適している。

前立腺癌は、ドイツにおいて、癌に起因する最も頻繁な死因の一つである。原発性臓器限局性前立腺癌での標準治療は、目下のところ、根治的前立腺全摘除術、つまり前立腺、精嚢、およびリンパ節の完全除去である。その対案となる方法は、前立腺に放射性物質を挿入すること（密封小線源療法）によって行われる放射線療法である。原発性局所前立腺癌を患うたいていの患者は、根治的前立腺全摘除術および放射線療法によって効果的に治療することができる。再発は、該当者のおよそ２０～４０％において起こる［Ｒｏｅｈｌ ２００４］（非特許文献１）。

現在では、抗体ベースの様々な治療方法が開発されている。その際、抗体ベースの治療薬用の攻撃部位として利用され得る、癌細胞上の標的構造を同定することが決定的に重要である。前立腺癌を治療するための攻撃部位として適した標的構造は、主に前立腺組織中に存在し正常細胞と比べて悪性細胞上で過剰発現を示す表面タンパク質である。

前立腺特異幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）は、そのような表面分子であって、前立腺細胞上に特異的に存在し、前立腺癌細胞中では、正常組織と比べていっそう多く発現している（腫瘍関連抗原）。ヒトＰＳＣＡは、１２３個のアミノ酸を含み、Ｎ末端のシグナル配列、Ｃ末端のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー配列、および複数のＮ－グリコシル化部位を有する。ＰＳＣＡは、ＧＰＩアンカー型細胞表面分子のＴｈｙ－１／Ｌｙ－６ファミリーに数えられるが、なぜなら、中でも、このファミリーに特徴的な保存システイン残基を有するからである［Ｒｅｉｔｅｒ １９９８］（非特許文献２）。

前立腺腫瘍中での高い発現ゆえ、ＰＳＣＡは、前立腺癌を治療するために適した標的分子であって、ＰＳＣＡを標的として目指す様々な治療戦略がこれまでのところ開発された。ヒトでの癌療法における治療標的としてのＰＳＣＡの有効性の証明が、中でも、あらかじめＰＳＣＡペプチドを含ませた樹状細胞を用いたワクチン接種によりもたらされた。ホルモン療法および化学療法に不応性の１２名の前立腺癌患者での臨床試験（第１相および第２相）は、ＰＳＣＡペプチドを含ませた樹状細胞を用いたワクチン接種が、五名の患者においてＰＳＣＡに対するＴ細胞応答を引き起こし、このＴ細胞応答は、平均すると、生存期間の延長と相関していたということを示した。しかも、一名の患者では、腫瘍量の減少を認めることができた［Ｔｈｏｍａｓ－Ｋａｓｋｅｌ ２００６］（非特許文献３）。

国際特許第２００９／０３２９４９号Ａ２（特許文献１）は、腫瘍ターゲティング用およびその検出用に使用される抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体（１Ｇ８）を開示する。この抗体のＣＤＲ領域は、以下のアミノ酸配列を有する：

１Ｇ８抗体の細胞毒性特性ゆえに、この抗体は、エフェクター細胞のリクルーティングに基づくターゲティング戦略には適さない（Ｇｕ ２００５）（非特許文献４）。

国際特許第２００９／０３２９４９号Ａ２（特許文献１）に開示される抗体は、診断上、好ましくは、機能性マウスモノクローナル抗体および機能性ヒト化モノクローナル抗体、ならびに放射性核種で標識されたＰＳＣＡ特異的ミニ抗体（Ｍｉｎｉｂｏｄｙ）および二重特異性抗体（Ｄｉａｂｏｄｙ）の形態で使用される。

［Ｆｅｌｄｍａｎｎ ２０１０］（非特許文献５）は、ＰＳＣＡに結合するパラトープおよびＣＤ３に結合するパラトープを含む組換え型二重特異性抗体を開発した。この二重特異性抗体のＰＳＣＡ結合性パラトープは、ＰＳＣＡ抗体７Ｆ５から誘導されており［Ｍｏｒｇｅｎｒｏｔｈ ２００７］（非特許文献６）、以下のアミノ酸配列を有するＣＤＲ領域を含む。

［Ｆｅｌｄｍａｎｎ ２０１０］（非特許文献５）で開示された抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、Ｔ細胞が仲介する、ＰＳＣＡ陽性腫瘍細胞の特異的溶解を効果的にもたらした。使用されたＰＳＣＡ陽性腫瘍細胞のおよそ４０％を特異的溶解するためには、エフェクター細胞の、ＰＳＣＡ陽性腫瘍細胞に対する、２０：１という比率において、［Ｆｅｌｄｍａｎｎ ２０１０］（非特許文献５）で開示された二重特異性抗体を少なくとも５ｎｇ使用するべきである。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、［Ｆｅｌｄｍａｎｎ ２０１０］（非特許文献５）において開示された抗体を用いて、使用されたＰＳＣＡ陽性腫瘍細胞の最大限およそ６０％の特異的溶解を達成することができた（５０～１００ｎｇの抗体の存在下において）。効率のさらなる上昇は証明できなかった。１０００ｎｇの二重特異性抗体の存在下でさえも、さらに高い割合のＰＳＣＡ陽性腫瘍細胞を溶解することはできなかった。

公知のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏデータは、ＰＳＣＡが、前立腺癌の免疫療法用の標的抗原として多大な潜在能力を有し、診断上の標的として適していることを示す。

国際特許第２００９／０３２９４９号Ａ２

Ｒｏｅｈｌ ２００４ Ｒｅｉｔｅｒ １９９８ Ｔｈｏｍａｓ－Ｋａｓｋｅｌ ２００６ Ｇｕ ２００５ Ｆｅｌｄｍａｎｎ ２０１０ Ｍｏｒｇｅｎｒｏｔｈ ２００７

本発明の課題は、特に組換え型二重特異性抗体の形態で、低い濃度で治療上有効である上に、ＰＳＣＡ陽性腫瘍細胞を効果的に溶解することができる、改善された、ＰＳＣＡに対する抗体を提供することである。

この課題は、本発明によると、以下のアミノ酸配列：
－軽鎖の可変領域のＣＤＲ：ＣＤＲ１配列番号１、ＣＤＲ２配列番号２、ＣＤＲ３配列番号３、および
－重鎖の可変領域のＣＤＲ：ＣＤＲ１配列番号４、ＣＤＲ２配列番号５、ＣＤＲ３配列番号６
を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する、前立腺特異幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）に結合する抗体（ここでは、抗ＰＳＣＡ抗体とも呼ばれる）によって解決される。

前記のＣＤＲｓを特徴とする、本発明による抗体は、ここでは簡略化してＭＢ１とも呼ばれる。本発明者は、広範囲に及ぶ検査の枠内で、意外なことに、組換えにより製造された二重特異性抗体の形態の、本発明による抗体が、非常にわずかな量においてもＰＳＣＡ陽性腫瘍細胞の特異的溶解を仲介できることを確認した。さらには、意外なことに、新規抗体によって仲介される、ＰＳＣＡ陽性腫瘍細胞の特異的溶解は、より効果的であることが確認された。つまり、本発明による抗ＰＳＣＡ抗体を含有する二重特異性抗体を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ検査では、使用されたＰＳＣＡ陽性腫瘍細胞の９０％超を溶解することができた。したがって、新規の抗ＰＳＣＡ抗体を用いることで、使用される抗体量を明らかに減少させることができる。同時に、本発明による抗体を用いると、ＰＳＣＡ陽性腫瘍細胞をより効果的に溶解することができるため、治療上の有効性が上昇する。本発明の抗体を用いることで有効性が達成可能である濃度は低いため、本発明の抗体によると、転移性ＰＳＣＡ陽性細胞の殺滅の改善も可能である。従来技術から公知の、匹敵する二重特異性コンストラクト中の抗ＰＳＣＡ ７Ｆ５を用いた比較検査は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験（図３）でもｉｎ ｖｉｖｏ試験（図４）でも、本発明による抗体の優位性を明らかに証明する。

好ましい、本発明による抗ＰＳＣＡ抗体は、前記で定義されたようなＣＤＲ領域を含有し、ただし、軽鎖および重鎖の可変領域のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列：
－軽鎖の可変領域配列番号２４、重鎖の可変領域配列番号２６、または
－軽鎖の可変領域配列番号２０、重鎖の可変領域配列番号２２
に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を示す。

そのうち好ましいのは、上記で定義されたＣＤＲ領域を含む、その可変領域がヒト化構造を有する抗ＰＳＣＡ抗体である。特に好ましいのは、その軽鎖可変領域が配列番号２４によるアミノ酸配列を含有し、その重鎖可変領域が配列番号２６によるアミノ酸配列を含有する抗ＰＳＣＡ抗体である。

本発明の主旨での「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合することができるすべての抗体または抗体断片を含む。その際、組換え抗体とは、遺伝子工学的に変化させた生物を利用して製造される抗体のことである。抗体という用語は、完全なモノクローナル抗体と同様にそのエピトープ結合性断片も含む。その際、エピトープ結合性断片（ここでは抗体断片とも呼ばれる）は、抗原に結合することができる抗体部分を含む。本発明の主旨での抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ‘）_２、Ｆｄ、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ）可変断片（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合された可変断片（ｓｄＦｖ）、および軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）または重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）のいずれか一方を含有する断片を含む。抗体断片は、可変領域を、単独か、またはヒンジ領域および定常領域の第一ドメイン、第二ドメイン、第三ドメイン（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３）から選択される別の領域と組み合わせてのいずれか一方で含有する。

さらに、抗体という用語は、二重特異性抗体、三重特異性抗体、および四重特異性抗体のような、組換えにより製造された抗体を含む。同じく抗体という用語に含まれているのは、その抗体の異なる部分が様々な種に由来する、例えば、ヒト定常領域と組み合わされているマウス可変領域を含む抗体のようなキメラ抗体である。ここでは、ヒト化抗体も同じく、抗体という用語に含まれている。抗体をヒト化することの目的は、ヒト系で使用するために、例えばマウス抗体のような異種抗体の免疫原性を低下させることにあって、ただし、完全な結合親和性および抗原特異性は維持されたままである。ヒト化抗体は、例えば、リサーフェシング（Ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）およびＣＤＲグラフティングのような、様々な公知のやり方で製造することができる。リサーフェシングでは、分子モデリング、統計分析、および突然変異誘発の組み合わせにより、抗体表面上のすべての非ＣＤＲ領域を変化させるため、これらの非ＣＤＲ領域が、標的生物の抗体の表面に類似するようになる。ＣＤＲグラフティングでは、ヒト化されるべき抗体のＣＤＲ領域を、ヒトの可変領域に導入する。

抗体断片は、場合によっては、リンカーを介して互いに結合されている。このリンカーは、短い（好ましくは１０～５０個のアミノ酸残基長の）ペプチド配列を含み、このペプチド配列は、その抗体断片が完全な抗体の抗原特異性を示すように、抗体断片がＶ_ＬおよびＶ_Ｈの三次元フォールディングを有するように、選択される。好ましいのは、グリシン－セリンリンカー、または配列番号１３０もしくは配列番号１３１によるアミノ酸配列を有するリンカーペプチドである。

「可変領域」という名称は、ここでは、その配列において抗体間で異なり抗体の特異性およびその抗体の抗原への結合を特定する、抗体の重鎖および軽鎖の部分を意味する。その際、その多様性は、可変領域中に均一に分布しているのではなく、通例は、可変領域の三つの定められた区間、相補性決定領域（ＣＤＲｓ、超可変領域とも呼ばれる）内に集中しており、この領域は、軽鎖の可変領域と同様に重鎖の可変領域中にも含有されている。抗体の抗原結合部位、いわゆるパラトープは、抗体の軽鎖および重鎖の超可変領域（ＣＤＲ）によって特徴づけられている。

抗体を記載する際に、ここでは、その抗体が、その名称の中で記載される抗原に特異的に結合する抗体であることを表すために、抗「抗原」抗体という簡略化された名称も使用される。つまり、例えば、「抗ＰＳＣＡ抗体」とは、本発明の主旨では、抗原ＰＳＣＡに特異的に結合する抗体と理解することができる。ある特定の抗原への、抗体の特異的結合とは、ここでは、ある抗体が、特定の抗原に高い親和性で結合し、別の抗原には明らかに低い親和性で結合し、好ましくは別の抗原には結合しないと理解される。

好ましい抗体は、ｓｃＦｖ断片またはＦ（ａｂ‘）_２断片の形態で存在する。さらに好ましい抗体は、組換えにより製造され二つの異なるパラトープを含有する二重特異性抗体であって、そのパラトープのうちの一方は、ＰＳＣＡに対してであって、もう一方はＰＳＣＡに対してではない。その際、二重特異性抗体の他方のパラトープは、好ましくは、エフェクター細胞上の表面構造に対するか、または１０～５０個のアミノ酸長のペプチド（好ましくは、ヒトＬａタンパク質の１０～５０個アミノ酸長配列、特に好ましくは配列番号７５または配列番号７６によるアミノ酸配列の一つを有するペプチド）に対する。

好ましくは、本発明による抗ＰＳＣＡ抗体（ナイーブ抗体または組換え抗体）はエフェクター群と共役している。共役とは、ここでは、ある物質、つまりエフェクター群の、抗体への結合を意味する。エフェクター群への抗体の結合は、好ましくは、融合タンパク質の形態での組換え発現によるか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ法により製造され、ただし、エフェクター群は、好ましくは、化学リンカー群を介して抗体に結合される（例えば、チオエーテル結合またはジスルフィド結合を介して）。エフェクター群は、中間担体分子、例えば血清アルブミンを介して抗体に結合されていることも可能である。場合によっては、本発明による抗体は、複数のエフェクター群を含有する。その際、エフェクター群は、好ましくは、有効成分、ペプチド（１０～１００個のアミノ酸長）、タンパク質（１００個超のアミノ酸長）、共刺激分子、色素、または造影剤から選択される。

好ましい本発明による抗ＰＳＣＡ抗体は、有効成分、つまり薬学上有効な物質と共役している。好ましい有効成分は、毒素、好ましくは細胞分裂阻害剤を含み、そのうち好ましくはメイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体、タキソイド、ＣＣ－１０６５およびＣＣ－１０６５類似体、ドラスタチンおよびドラスタチン類似体、メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、ミトマイシンＣ、クロラムブシル、ならびにカリケアミシンから選択される。

さらに好ましい本発明による抗ＰＳＣＡ抗体は、造影剤と共役している。好ましい造影剤は、放射性核種であって、そのうち好ましいのは、テクネチウム、レニウム、イットリウム、銅、ガリウム、インジウム、ビスマス、および白金の放射性同位体、特に^９９ｍＴｃ、^９０Ｙ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^６８Ｇａおよび^１１１Ｉｎである。

さらに好ましい本発明による抗ＰＳＣＡ抗体は、タンパク質、好ましくは酵素、好ましくはＡＤＥＰＴ系に適した酵素、共刺激分子、好ましくはＴｏｌｌ様受容体のリガンド、そのうち好ましくはＣｐＧ、または核酸と共役している。

さらに好ましい抗ＰＳＣＡ抗体は、色素、好ましくは蛍光色素と共役している。

さらに好ましい本発明による抗体は、ペプチドと共役しており、このペプチドは、そのペプチドに対して特異的な抗体が特異的に結合する結合領域を含有する。好ましくは、このペプチドは、ヒトＬａタンパク質のアルファへリックス領域の、１０～５０個のアミノ酸長のペプチド配列を含む（ヒトＬａタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号７７に相応する）。特に好ましいのは、配列番号７５または配列番号７６によるアミノ酸配列の一つに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するペプチドである。

特に好ましくは、本発明による抗ＰＳＣＡ抗体は、組換えにより製造される。好ましくは、本発明による組換え抗ＰＳＣＡ抗体は、少なくとも二つの異なる結合単位を含有し、ただし、
－それらの結合単位の少なくとも一つは、ＰＳＣＡに特異的に結合し、この結合単位は、本発明による抗ＰＳＣＡ抗体のパラトープを含有し、
－それらの結合単位の少なくとももう一つは、ＰＳＣＡとは異なる一つの抗原、好ましくはエフェクター細胞の表面構造に結合する。

したがって、ＰＳＣＡ結合性の結合単位は、本発明による抗ＰＳＣＡ抗体を含み、それに応じて、少なくとも以下のＣＤＲ領域：
－以下のアミノ酸配列：ＣＤＲ１配列番号１、ＣＤＲ２配列番号２、ＣＤＲ３配列番号３を含む、軽鎖可変領域のＣＤＲ、および
－以下のアミノ酸配列：ＣＤＲ１配列番号４、ＣＤＲ２配列番号５、ＣＤＲ３配列番号６を含む、重鎖可変領域のＣＤＲ
を含有する。

本発明の主旨での「結合単位」とは、定められた物質または構造を特異的に結合するあらゆる分子構造を意味する。その際、結合される物質または構造に依存して、この結合単位は、様々な構造を有する。したがって、本発明の主旨での「結合単位」という名称により、抗体が含まれている（この場合、結合単位は、少なくとも、抗体の機能性パラトープを含有する）と同様に、抗原と特異的に結合する別の分子、好ましくはタンパク質も含まれている。そのような分子は、好ましくは、細胞、特にエフェクター細胞上の表面構造（例えば表面受容体）に特異的に結合するリガンドである。

本発明による抗体に含有されている好ましい結合単位は、エフェクター細胞に特異的に結合する。本発明の主旨でのエフェクター細胞の定義は、免疫反応を仲介するか、または免疫反応に能動的に関与している、自然免疫系および獲得免疫系の全細胞を含む。好ましくは、エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、および顆粒球から選択される。特に好ましいのは、Ｔリンパ球上の表面構造に対して結合する結合単位である。

本発明による組換え抗体が、少なくとも二つの異なる抗体（少なくとも一つの本発明による抗ＰＳＣＡ抗体、および少なくとももう一つの、ＰＳＣＡに特異的に結合するのではない抗体）を含有する場合、この組換え抗体は、好ましくは、二重特異性抗体、三重特異性抗体、または四重特異性抗体の形態で存在する。そのうち好ましいのは、一本鎖抗体に由来する二重特異性抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃＢｓＤｂ）、または一本鎖抗体に由来する二重特異性タンデム抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｎｄｅｍ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｃＢｓＴａＦｖ）である。特に好ましくは、本発明による組換え抗体は、ｓｃＢｓＴａＦｖの形態で存在する。

本発明による組換え抗体中に含有されている好ましい非ＰＳＣＡ結合性抗体は（この場合は、組換え抗体は二重特異性抗体である）、エフェクター細胞の表面構造に特異的に結合する抗体である。この場合、非ＰＳＣＡ結合性結合単位は、少なくとも、エフェクター細胞の表面構造に結合する抗体のパラトープを含有する。特に好ましくは、この抗体は、エフェクター細胞上の以下の表面構造、つまり、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、活性化ＫＩＲ受容体（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）に対する。特に好ましいのは、ＣＤ３に対する抗体であって（抗ＣＤ３抗体）、ただし、抗ＣＤ３抗体は、以下のアミノ酸配列：
－重鎖可変領域のＣＤＲ：ＣＤＲ１配列番号６６、ＣＤＲ２配列番号６７、ＣＤＲ３配列番号６８、および
－軽鎖可変領域のＣＤＲ：ＣＤＲ１配列番号５８、ＣＤＲ２配列番号５９、ＣＤＲ３配列番号６０
を含むＣＤＲ領域を含有する。

さらに好ましいのは、少なくとも二つの異なる結合単位を含有する組換え抗ＰＳＣＡ抗体であって、ただし、結合単位の少なくとももう一つは、エフェクター細胞上の表面構造に特異的に結合するリガンド（好ましくはタンパク質またはグリカン）である。好ましいリガンドは、（エフェクター）細胞表面への、その結合によって、エフェクター細胞の活性に影響を及ぼす。その際、このリガンドは、リガンドがエフェクター細胞の表面構造に特異的に結合し、その結合によりエフェクター細胞を活性化するためのシグナルカスケードを引き起こすように選択されている。リガンドとして好ましいのは、エフェクター細胞の表面上で特異的に発現される受容体に特異的に結合するタンパク質構造またはグリカンであって、ただし、このリガンドは、受容体へのその結合によって、エフェクター細胞の活性化を引き起こす。特に好ましいのは、ＵＬＢ－Ｐｓ（例えば、ＵＬＢ－Ｐ２）、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、および（例えば、ＩＬ２およびＩＬ１５のような）サイトカインから選択されるタンパク質構造である。

本発明による抗体、特に本発明による組換え抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＳＣＡ陽性細胞への特異的結合に適している。したがって、本発明は、本発明による抗ＰＳＣＡ抗体の、特に、腫瘍疾患好ましくは前立腺癌を治療するための医薬品として、または診断薬としての使用も含む。

本発明は、さらに、腫瘍疾患、特に前立腺癌を治療するための、本発明による抗体を含む。同じく本発明によって含まれているのは、腫瘍疾患、特に前立腺癌の治療薬を製造するための、本発明による抗体の使用である。

本発明による（好ましくは組換え）抗体の好ましい治療的適用は、腫瘍疾患、好ましくは前立腺癌の治療である。治療的適用においては、本発明による抗体を、好ましくは、治療上有効な物質またはエフェクター細胞の、腫瘍組織へのターゲティングに使用する。治療上有効な物質の、腫瘍組織へのターゲティングには、好ましくは、有効成分と共役している本発明による組換え抗体が使用される。エフェクター細胞の、腫瘍組織へのターゲティングには、好ましくは、少なくとも二つの異なる結合単位を含有する本発明による組換え抗体が使用され、ただし、結合単位の少なくとも一つは本発明による抗ＰＳＣＡ抗体であって、結合単位のもう一方は、エフェクター細胞、好ましくはＴ細胞上のＣＤ３に特異的に結合する。そのために、好ましくは、上記の抗体を使用する。

本発明によって、薬学的に許容される希釈剤または担体と関連して本発明による抗体を含有する医薬組成物も含まれている。好ましくは、本発明による医薬組成物は、静脈内投与に適した形態で存在する。

好ましくは、本発明による医薬組成物中の抗体は、組換え形態で、キメラ抗体として、または特に好ましくは、低下した免疫原性を有するヒト化抗体として存在する。

本発明による医薬組成物は、様々な剤形を含み、好ましくは、腸管外投与、特に好ましくは静脈内投与に適している。好ましくは、腸管外医薬組成物は、注入用に適した剤形で存在する。したがって、特に好ましい医薬組成物は、薬学的に許容される希釈剤または担体中での、抗体の溶液、乳濁液、または懸濁液である。

薬学的に許容される担体は、好ましくは無菌液、特に水、緩衝水、０．４％塩溶液、０．３％グリシン等々である。この医薬組成物は、従来の、よく知られた技術によって滅菌される。この組成物は、好ましくは、薬学的に許容される、例えば、およそ生理学的条件をもたらすため、および／または組成物中に含有されている抗体の安定性を上げるために必要とされるような、例えば、ｐＨ値調整剤、および緩衝剤、毒性調整剤（Ｍｉｔｔｅｌ ｚｕｒ Ｅｉｎｓｔｅｌｌｕｎｇ ｄｅｒ Ｔｏｘｉｚｉｔａｅｔ）等々のような補助物質を含有し、好ましくは、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および乳酸ナトリウムから選択される。

好ましくは、この医薬組成物は、０．１～５００ｍｇ／ｍｌの抗体、特に好ましくは０．１～２５０ｍｇ／ｍｌの抗体を、特に、１～５００ｍＭｏｌ／ｌの緩衝液と共に含有する、注入可能な緩衝溶液である。この注入可能な溶液は、好ましくは、液体剤形でも凍結乾燥剤形でも存在する。緩衝液は、好ましくは、ヒスチジン、スクシン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびリン酸カリウムから選択される。

好ましくは、本発明による医薬組成物は、少なくとも二つの異なる（好ましくは組換え）抗体を含有し、ただし、少なくとも一つの本発明による抗ＰＳＣＡ抗体、および本発明による抗ＰＳＣＡ抗体と特異的結合をするもう一つの組換え抗体が含有されている。特に好ましいのは、以下の組み合わせ：
ａ）１０～５０個のアミノ酸長のペプチドと共役している組換え抗ＰＳＣＡ抗体、およびそのペプチドに特異的に結合するもう一つの組換え抗体、または
ｂ）１０～５０個のアミノ酸長のペプチドに結合するさらに一つの抗体を含有する二重特異性抗ＰＳＣＡ抗体、およびＰＳＣＡとは異なる抗原に対して結合し、二重特異性抗ＰＳＣＡ抗体が結合するペプチドを含有するもう一つの組換え抗体
である。

その際、少なくとも二つの異なる抗体は、本発明による医薬組成物中に、好ましくは個別に包装されて存在する。

ａ）で定義される組み合わせを含有する、好ましい医薬組成物は、以下を含む：
－ヒトＬａタンパク質のアルファへリックス領域の、１０～５０個のアミノ酸長のアミノ酸配列を含有するペプチドと共役している組換え抗ＰＳＣＡ抗体（ヒトＬａタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号７７に相応する）。好ましくは、抗ＰＳＣＡ抗体は、配列番号７５または配列番号７６によるアミノ酸配列の一つに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するペプチドと共役している。
－抗ＰＳＣＡ抗体のペプチドに対して特異的に結合するパラトープを含有し、エフェクター細胞の表面構造に特異的に結合するもう一つの結合単位を含有する、もう一つの（好ましくは組換え）抗体。そのうち好ましい結合単位は、上記で定義されたものに対応する。組換え抗ＰＳＣＡ抗体が、配列番号７５または配列番号７６によるアミノ酸配列の一つに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するペプチドと共役している場合には、さらなる組換え抗体は、好ましくは、このペプチドに結合するパラトープとして、以下のアミノ酸配列：
○軽鎖可変領域のＣＤＲ：ＣＤＲ１配列番号７８、ＣＤＲ２配列番号７９、ＣＤＲ３配列番号８０、および重鎖可変領域のＣＤＲ：ＣＤＲ１配列番号８１、ＣＤＲ２配列番号８２、ＣＤＲ３配列番号８３（ここでは「５Ｂ９」パラトープとも呼ばれる）、または
○軽鎖可変領域のＣＤＲ：ＣＤＲ１配列番号８４、ＣＤＲ２配列番号８５、ＣＤＲ３配列番号８６、および重鎖可変領域のＣＤＲ：ＣＤＲ１配列番号８７、ＣＤＲ２配列番号８８、ＣＤＲ３配列番号８９（ここでは「７Ｂ６」パラトープとも呼ばれる）
を含有する。

そのうち好ましい組み合わせは、
－配列番号７５によるアミノ酸配列の一つに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するペプチドを含有する抗ＰＳＣＡ抗体、および５Ｂ９パラトープを含有するもう一つの抗体、または
－配列番号７６によるアミノ酸配列の一つに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するペプチドを含有する抗ＰＳＣＡ抗体、および７Ｂ６パラトープを含有するもう一つの抗体である。

ｂ）で定義される組み合わせを含有する、好ましい医薬組成物は、
－エフェクター細胞の表面構造に特異的に結合し、ヒトＬａタンパク質のアルファへリックス領域の、１０～５０個のアミノ酸長のアミノ酸配列、好ましくは配列番号７５または配列番号７６によるアミノ酸配列の一つに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するペプチドを含有するもう一つの抗体
－ヒトＬａタンパク質のアルファへリックス領域の、１０～５０個のアミノ酸長のアミノ酸配列を特異的に結合する抗体と共役している二重特異性抗ＰＳＣＡ抗体を含む。さらなる組換え抗体が、配列番号７５または配列番号７６によるアミノ酸配列の一つに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するペプチドを含有する場合、二重特異性抗ＰＳＣＡ抗体は、好ましくは、上記で定義された５Ｂ９パラトープまたは７Ｂ６パラトープを含有する。

そのうち好ましい組み合わせは、
－５Ｂ９パラトープを含有する二重特異性抗ＰＳＣＡ抗体、および配列番号７５によるアミノ酸配列の一つに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するペプチドを含有するもう一つの組換え抗体、または
－７Ｂ６パラトープを含有する二重特異性抗ＰＳＣＡ抗体、および配列番号７６によるアミノ酸配列の一つに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するペプチドを含有するもう一つの組換え抗体である。

好ましい診断的適用は、ｉｎ ｖｉｖｏ診断法であって、造影剤と共役した本発明による抗ＰＳＣＡ抗体が、造影剤を、腫瘍組織へと意図的に輸送するために使用される。本発明による抗ＰＳＣＡ抗体の、さらに好ましい診断的適用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断法であって、好ましくは、色素と共役した本発明による抗ＰＳＣＡ抗体が、サンプル中、特に組織サンプル中のＰＳＣＡ陽性細胞を検出するために使用される。

本発明によって、本発明による抗ＰＳＣＡ抗体を含有する診断用組成物も含まれている。その診断用組成物中で、抗ＰＳＣＡ抗体は、好ましくは緩衝溶液中、好ましくは緩衝された塩溶液中に存在する。

本発明は、同様に、そのヌクレオチド配列が本発明による抗ＰＳＣＡ抗体をコードする核酸も含む。好ましくは、軽鎖および重鎖の可変領域のＣＤＲをコードする断片は、以下のヌクレオチド配列：
－軽鎖可変領域のＣＤＲ：ＣＤＲ１配列番号７、ＣＤＲ２配列番号９、ＣＤＲ３配列番号１１および重鎖可変領域のＣＤＲ：ＣＤＲ１配列番号１３、ＣＤＲ２配列番号１５、ＣＤＲ３配列番号１７、または
－軽鎖可変領域のＣＤＲ：ＣＤＲ１配列番号８、ＣＤＲ２配列番号１０、ＣＤＲ３配列番号１２および重鎖可変領域のＣＤＲ：ＣＤＲ１配列番号１４、ＣＤＲ２配列番号１６、ＣＤＲ３配列番号１８を含有する。

本発明の主旨での「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）のほかに、塩基のアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）が適した順序で配置されている（核酸配列）別のすべての鎖状ポリマーも含む。その際、本発明は、（チミンがウラシルで置換されている）対応するＲＮＡ配列、相補性配列、および修飾された核酸骨格または３’末端または５’末端を有する配列も含む。その際、「変化した骨格をもつ核酸配列」という用語は、例えば、ホスホチオエート誘導体化、アミド亜リン酸エステル誘導体化、もしくはＯ－メチル－誘導体化された骨格、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびロックド核酸（ＬＮＡ）、または混合骨格をもつ配列のような、そのポリマー中では塩基のアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）が適した順序で配置されている別のすべての鎖状ポリマーを含む。「修飾された３’末端または５’末端」という用語は、その際、安定化に役立つ修飾と同様にマーカーの結合も含む。マーカーの例は、酵素、色素、または蛍光色素、放射性ヌクレオチド、ならびに、例えばジゴキシゲニンまたはビオチンのようなハプテンである。

本発明によって、本発明による核酸を含有するベクター（同じく：「発現ベクター」）も含まれている。本発明の主旨では、発現ベクターとは、本発明による核酸配列を挿入または取り込みにより組換えて含有するプラスミド、ウイルス、または別の担体と理解される。この発現ベクターは、典型的には複製開始点、プロモーター、ならびに発現ベクターを含有する宿主細胞の表現型選択を可能にする特異的遺伝子配列を含有する。

さらに、本発明は、本発明によるヌクレオチド配列もしくは本発明によるベクターを含有する宿主細胞または非ヒト宿主生物を含む。その際、ヌクレオチド配列またはベクターは、宿主細胞または非ヒト宿主生物中に組換えにより含有されている。

本発明の主旨での宿主細胞は、少なくとも一つの本発明によるベクターを含有する、自然に存在する細胞または形質転換細胞株もしくは遺伝子改変細胞株である。その際、本発明は、少なくとも一つの本発明による発現ベクターがプラスミドまたは人工染色体として含有されている一過性形質転換体（例えば、ｍＲＮＡインジェクションによる）または宿主細胞、ならびに本発明の発現ベクターが宿主のゲノムに安定に組み込まれている宿主細胞を含む。

この宿主細胞は、好ましくは、原核生物および真核生物の細胞から選択される。胚を破壊しながら獲得されたヒト胚性幹細胞は、本発明の主旨での宿主細胞ではない。好ましい原核生物細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの細胞から選択される。好ましい真核生物細胞は、酵母細胞（好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、昆虫細胞、両生類細胞、および哺乳類細胞（好ましくはＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３）から選択される。

非ヒト宿主生物は、宿主生物のゲノムまたは宿主生物の単一細胞のゲノムに安定に組み込まれている本発明によるベクターを含有する。好ましい宿主生物は、植物、無脊椎動物、または脊椎動物、特にＢｏｖｉｄａｅ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ、Ｍｅｄａｋａ、ゼブラフィッシュもしくはＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、または挙げた生物の細胞もしくは胚である。

本発明は、それを使用するとヒトＰＳＣＡをより効率よく結合することができる、抗ＰＳＣＡ抗体およびその抗体に帰属の発現系を記載する。その結果、本発明による抗ＰＳＣＡ抗体は、エフェクター細胞のリクルーティングにより腫瘍細胞の殺滅が仲介可能である治療系での使用に特に適している。本発明の抗体はＰＳＣＡへの親和性がより高いため、（例えば、治療的適用における）結合には、本質的によりわずかな量の抗体しか必要とされない。本発明による抗ＰＳＣＡ抗体は、明らかにより低い濃度かつ明らかにより高い効率で、ＰＳＣＡ陽性腫瘍細胞の特異的溶解を仲介し得るということを示すことができた。このことは、一方では、抗体消費量を軽減できることから、コスト面での利点を有する。他方、治療的適用においては、中でも転移性細胞についても改善されたターゲティングが期待でき、ならびに使用量がよりわずかであるゆえに、見込まれる副作用はよりわずかである。

以下の図および例示的実施形態を手がかりに、それらに本発明を制限することなしに本発明をより詳細に説明する。

本発明による異なる組換え抗体の図解を示す。Ａ）ＰＳＣＡに対する結合単位およびＣＤ３に対する結合単位を含有する、ｓｃＢｓＴａＦｖの形態での二重特異性抗体。Ｂ）同じく図示されている、ＣＤ３に対する結合単位およびヒトＬａタンパク質の５Ｂ９領域に対する結合単位を含有する、ｓｃＢｓＴａＦｖの形態での二重特異性抗体と共に使用するための、ペプチドタグ（５Ｂ９）を含有する、本発明による、ＰＳＣＡに対する組換え抗体。Ｃ）同じく図示されている、ＣＤ３に対する結合単位およびヒトＬａタンパク質の７Ｂ６領域に対する結合単位を含有する、ｓｃＢｓＴａＦｖの形態での二重特異性抗体と共に使用するための、ペプチドタグ（７Ｂ６）を含有する、本発明による、ＰＳＣＡに対する組換え抗体。それぞれのＶ_ＨおよびＶ_Ｌサブユニットは、図に記載されているアミノ酸配列を含むリンカーペプチドを介して結合されている。 組換え抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。レーン１：二重特異性ヒト化抗体ＣＤ３－７Ｂ６（ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－７Ｂ６）；レーン２：二重特異性ヒト化抗体ＣＤ３－５Ｂ９（ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３（Ｇ_４Ｓ）－５Ｂ９）；レーン３：本発明による二重特異性マウス抗体ＣＤ３－ＰＳＣＡ（７Ｆ５）（ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－ＰＳＣＡ（７Ｆ５））；レーン４：本発明による単独特異性ヒト化抗体ｓｃＦｖ ＰＳＣＡ（ＭＢ１）－７Ｂ６；レーン５：二重特異性ヒト化抗体ＣＤ３－ＰＳＣＡ（ＭＢ１）（ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－ＰＳＣＡ（ＭＢ１））；レーン６：本発明による単独特異性ヒト化抗体ｓｃＦｖ ＰＳＣＡ（ＭＢ１）－５Ｂ９。Ｍ．．．断片サイズが（上から下に向かって）７０ｋＤａ、５５ｋＤａ、４０ｋＤａ、３５ｋＤａ、２５ｋＤａ、１５ｋＤａのマーカー。 例示的実施形態４に記載の実験における、^５１Ｃｒを含むＰＣ３－ＰＳＣＡ腫瘍細胞の特異的溶解を示す。バーは、以下の実験に対応する：１（黒色）．．．例示的実施形態１に由来するヒト化二重特異性ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－ＰＳＣＡ（ＭＢ１）；２（白色）．．．例示的実施形態１に由来するマウス二重特異性ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－ＰＳＣＡ（ＭＢ１）；３（縞状）．．．ヒト化二重特異性ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－ＰＳＣＡ（７Ｆ５）（比較例）；４（点状）．．．マウス二重特異性ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－ＰＳＣＡ（７Ｆ５）（比較例）。 例示的実施形態５に記載されるようにＰＳＣＡ陽性腫瘍細胞、Ｔ細胞および抗体を移入した後に形成された腫瘍表面積を示す。Ａ）エフェクター／ターゲット比が１：１；Ｂ）エフェクター／ターゲット比が１０：１。番号の付いたラインは、以下の実験に対応する：１．．．二重特異性対照抗体である抗ＣＤ３ｘ抗５Ｂ９（対照）；２．．．例示的実施形態１に由来する単独特異性ヒト化ｓｃＦｖ抗ＰＳＣＡ（ＭＢ１）（対照）；３．．．抗体を伴わない対照実験（陰性対照）；４．．．例示的実施形態１に由来するヒト化二重特異性ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－ＰＳＣＡ（ＭＢ１）（本発明）；５．．．例３に記載されているようなヒト化二重特異性ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－ＰＳＣＡ（７Ｆ５）（比較例）；６．．．７Ｆ５抗体のＰＳＣＡ結合性可変領域を含有するヒト化二重特異性ｓｃＢｓＤｂ ＣＤ３ｘＰＳＣＡ（７Ｆ５）（比較例）。

例示的実施形態１：ＰＳＣＡに特異的に結合する組換え型二重特異性抗体（ｓｃＢｓＴａＦｖ）の製造（直接的ターゲティング）
ＰＳＣＡ^＋細胞へのターゲティング用に使用するために、一方の結合単位によりＰＳＣＡに、そして他方の結合単位によりＣＤ３に結合する二重特異性抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃＢｓＴａＦｖ）を製造した。この二重特異性抗体は、ここでは、簡略化してＣＤ３－ＰＳＣＡ（ＭＢ１）とも呼ばれ、図１Ａに図解されている。

ＰＳＣＡ結合ドメインは、本発明による抗ＰＳＣＡ ＭＢ１抗体の可変領域（マウス抗ＰＳＣＡ抗体：重鎖配列番号２２、軽鎖配列番号２０；ヒト化抗ＰＳＣＡ抗体：重鎖配列番号２６、軽鎖配列番号２４）を含有する。このＰＳＣＡ結合ドメインは、ＰＳＣＡ陽性腫瘍細胞への結合に利用される。別のドメインは、Ｔ細胞受容体複合体の構成要素であるＣＤ３に結合し、Ｔ細胞の活性化に利用される。その結果、ＰＳＣＡ陽性細胞へのＴ細胞のリクルーティングが可能となり、このやり方で、Ｔ細胞によるＰＳＣＡ陽性細胞の特異的溶解が仲介される。

モノクローナル抗ＰＳＣＡ ＭＢ１抗体を生成するために、Ｈ－２ｄ陽性Ｃ３ＨｘＢａｌｂ／ｃ Ｆ１マウスを、ＰＳＣＡを表面上で組換えにより発現するＰ８１５細胞で免疫化した。脾臓細胞とミエローマ細胞との融合により、モノクローナル抗ＰＳＣＡ抗体を分泌するハイブリドーマ細胞が生じた。このハイブリドーマ細胞を単一クローニングすると、クローンＭＢ１を選択することができた。抗ＰＳＣＡ ＭＢ１組換え抗体を生成するために、抗体重鎖（Ｖ_Ｈ）および抗体軽鎖（Ｖ_Ｌ）の可変ドメインの核酸配列を同定した。そのためには、まず抗ＰＳＣＡ ＭＢ１を分泌するハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに転写（ｕｍｓｃｈｒｅｉｂｅｎ）した。続いて、アイソタイプＩｇＧ１の重鎖の可変ドメインを縮重プライマー（プライマーペア配列番号９０および配列番号９１）を用いて、ならびにκ軽鎖の可変ドメインを縮重プライマー（プライマーペア配列番号９２および配列番号９３）を用いて増幅した。これらのＰＣＲ産物をそれぞれ、ベクターｐＧＥＭ Ｔ－ｅａｓｙにサブクローニングし、シークエンシングした。

三つのグリシン－セリンリンカー（Ｇ_４Ｓ、配列番号１３１）を介して重鎖可変領域が軽鎖可変領域と結合されている、抗ＰＳＣＡ ＭＢ１抗体のマウス一本鎖断片（ｓｃＦｖ）（ここでは簡略化して「ｓｃＦｖ ＭＢ１」と呼ぶ）をクローニングするために、配列番号９４および配列番号９５によるプライマーペアを利用して、抗ＰＳＣＡ ＭＢ１抗体の重鎖可変領域の核酸配列を増幅した。抗ＰＳＣＡ ＭＢ１抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は、配列番号９６および配列番号９７によるプライマーペアを利用して増幅した。増幅した核酸を、オーバーラップＰＣＲを利用して、ｓｃＦｖ ＰＳＣＡ ＭＢ１へと融合し、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩを介して、真核細胞発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ｂにクローニングした（この発現ベクターは、ここでは、「ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ＿ｓｃＦｖ ＭＢ１マウス」とも呼ぶ）。

ＰＳＣＡおよびＣＤ３を対象としておりマウスＭＢ１抗体のＣＤＲ領域を含有する二重特異性タンデム抗体（ｓｃＢｓＴａＦｖ）をクローニングするために、マウス抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの核酸配列を、配列番号９８および配列番号９９によるプライマーペアを利用して増幅し、ＡｐａＩを介してマウスｓｃＦｖ ＭＢ１の３‘側へと、あらかじめ製造した発現ベクター「ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ＿ｓｃＦｖ ＭＢ１マウス」にクローニングすると、ベクター「ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ＿ｓｃＢｓＴａＦｖ ＰＳＣＡ（ＭＢ１）－ＣＤ３マウス」が生じた。

ＰＳＣＡおよびＣＤ３を対象としておりヒト化ＭＢ１抗体のＣＤＲ領域を含有する二重特異性タンデム抗体（ｓｃＢｓＴａＦｖ）をクローニングするために、ＰＳＣＡ ＭＢ１抗体およびＣＤ３抗体の骨格領域（ＦＷＲ）をヒト化した。そのためには、マウス抗体可変ドメインのＦＷＲを、高相同性のヒトＩｇＧ１のヒトＦＷＲ配列で置換した。さらに、ヒト化抗体配列を、その発現および分泌に関して、ヒト細胞株を介して最適化した。マウスｓｃＦｖ ＣＤ３ないしはｓｃＦｖ ＭＢ１をヒト化するために、まずヒト化Ｖ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を個別に、前記のように増幅してから、ＰＣＲを介してアセンブルした。その際、Ｖ_Ｈ配列ないしはＶ_Ｌ配列のヒト化は、重複するオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、続いてヒト化Ｖ_Ｈ核酸配列ないしはＶ_Ｌ核酸配列を増幅することによって行った。重複するオリゴヌクレオチドの配列を決定できるように、まずマウスＶ_Ｈ配列ないしはＶ_Ｌ配列をヒトＩｇＧデータバンク（ＮＣＢＩ ＩｇＢｌａｓｔ）と比較し、相同性が最も高いヒトＩｇＧを同定し、最終的にはヒト化Ｖ_Ｈ配列ないしはＶ_Ｌ配列を理論的に作成し、重複するオリゴヌクレオチドを合成した。長さの異なるリンカーペプチドが使用された様々な二重特異性抗体を構築した。

抗ＣＤ３抗体のヒト化
抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域をヒト化するために、配列番号１００～配列番号１０５によるオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた。続いて、この、抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域のヒト化核酸配列（Ｇ_４Ｓリンカーペプチド、配列番号１３２を含む）を、配列番号１０５および配列番号１０６によるプライマーペアを利用して増幅した。抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域をヒト化するためには、配列番号１０７～配列番号１１２によるオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた。この、抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域のヒト化核酸配列を、配列番号１１２および配列番号１１３によるプライマーペアを利用して増幅した。

重鎖可変領域が、一つのグリシン－セリンリンカー（Ｇ_４Ｓ）を介して軽鎖可変領域と結合されている、抗ＣＤ３抗体のヒト化ｓｃＦｖを生成するために、まず抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域のヒト化核酸配列を、ＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩを介して、発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ｂにクローニングし、続いてＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを介して、抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域のヒト化核酸配列を、その重鎖可変領域ヒト化核酸配列の下流へと、同じ発現ベクターに挿入した。

重鎖可変領域が、三つのグリシン－セリンリンカー（Ｇ_４Ｓ）を介して軽鎖可変領域と結合されている、抗ＣＤ３抗体のヒト化ｓｃＦｖを生成するために、まず、三つのグリシン－セリンリンカー（Ｇ_４Ｓ）を含む、抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域のヒト化核酸配列を製造した。そのためには、抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域のヒト化核酸配列（三つのＧ_４Ｓリンカーペプチドを含む）を、配列番号１０５および配列番号１１４によるプライマーペアを利用して増幅し、ＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩを介して、発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ｂへとクローニングし、続いてＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを介して、抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域のヒト化核酸配列を、その重鎖可変領域ヒト化核酸配列の下流へと、同じ発現ベクターに挿入した。

抗ＰＳＣＡ ＭＢ１抗体のヒト化
抗ＰＳＣＡ ＭＢ１抗体の軽鎖可変領域をヒト化するために、配列番号１１５～配列番号１１８によるオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた。この、抗ＰＳＣＡ ＭＢ１抗体の軽鎖可変領域のヒト化核酸配列を、配列番号１１９および配列番号１２０によるプライマーペアを利用して増幅した。

抗ＰＳＣＡ ＭＢ１抗体の重鎖可変領域をヒト化するために、配列番号１２１～配列番号１２５によるオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた。この、抗ＰＳＣＡ ＭＢ１抗体の重鎖可変領域のヒト化核酸配列を、配列番号１２６および配列番号１２７によるプライマーペアを利用して増幅した。

二重特異性ヒト化抗体ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－ＰＳＣＡ（ＭＢ１）の製造
最終的には、ＭＢ１抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のヒト化核酸配列を、オーバーラップＰＣＲを利用して、配列番号１２８および配列番号１２９によるプライマーを使用しながら、アニーリングさせて増幅した。そのようにして生成された、ヒト化ｓｃＦｖ ＭＢ１をコードする核酸配列（Ｖ_Ｌ－Ｇ_４ＳＧ_４ＳＧＡＳＡＡＧ_４ＳＧ_４Ｓ－Ｖ_Ｈの構成、配列番号１３０によるリンカーペプチド）を、ＸｈｏＩおよびＡｐａＩを介して、前記の、抗ＣＤ３抗体のヒト化ｓｃＦｖ（三つのＧ_４Ｓリンカーペプチドを含む）の下流にクローニングすると、発現ベクター「ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ＿ｓｃＢｓＴａＦｖ ＰＳＣＡ（ＭＢ１）－ＣＤ３ヒト」が生じた。

図１Ａに記載の二重特異性ヒト化抗体を発現するために、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞をこの発現ベクターで形質転換し、分泌された抗体を、ニッケルアフィニティクロマトグラフィを利用し、場合によっては硫酸アンモニウム分別沈殿法と組み合わせて、細胞培養上清から精製した。図２のレーン５は、精製されたこの二重特異性抗体のＳＤＳゲル電気泳動写真を示す。

例示的実施形態２：ＰＳＣＡに特異的に結合する組換え型二重特異性抗体の製造（モジュール式ターゲティング）
本発明による医薬組成物（「モジュール式ターゲティング系１」、図１Ｂに図解）を供給するために、以下の組換え抗体を製造した：
－配列番号７５によるペプチド（ここでは「Ｅ５Ｂ９」とも呼ぶ）を含有する本発明による組換え抗ＰＳＣＡ抗体。この抗体は、以下では、ｓｃＦｖ ＰＳＣＡ（ＭＢ１）－Ｅ５Ｂ９と呼ぶ。
－ＣＤ３および配列番号７５によるペプチドを対象とする二重特異性抗体（ｓｃＢｓＴａＦｖ）。ＣＤ３に対するパラトープは、以下の可変領域アミノ酸配列：重鎖配列番号６５、軽鎖配列番号５７を含む。配列番号７５によるペプチドに対するパラトープは、以下の可変領域超可変領域アミノ酸配列：軽鎖ＣＤＲ１配列番号７８、ＣＤＲ２配列番号７９、ＣＤＲ３配列番号８０、重鎖ＣＤＲ１配列番号８１、ＣＤＲ２配列番号８２、ＣＤＲ３配列番号８３を含む。この抗体を、以下では、ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－５Ｂ９と呼ぶ。抗ＣＤ３抗体のＶＨとＶＬとの間のリンカーペプチドの点でのみ互いに異なる二つの異なるｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－５Ｂ９を製造した（図１Ｂを参照）。

ヒト化ｓｃＦｖ ＰＳＣＡ（ＭＢ１）－Ｅ５Ｂ９のクローニング：
Ｃ末端にＥ５Ｂ９エピトープを有するヒト化ｓｃＦｖ ＰＳＣＡ（ＭＢ１）（ＭＢ１［Ｖ_Ｌ－Ｇ_４ＳＧ_４ＳＧＡＳＡＡＧ_４ＳＧ_４Ｓ－ＭＢ１ Ｖ_Ｈ］－［Ｇ_４Ｓ－Ｅ５Ｂ９］、図１Ｂ下図に図解）を生成するために、例示的実施形態１に記載されたヒト化ｓｃＦｖ ＰＳＣＡ（ＭＢ１）（ＭＢ１ Ｖ_Ｌ－Ｇ_４ＳＧ_４ＳＧＡＳＡＡＧ_４ＳＧ_４Ｓ－ＭＢ１ Ｖ_Ｈ－Ｇ_４Ｓ、配列番号１３０および配列番号１３２によるリンカーペプチド）を、配列番号１３４および配列番号１３５によるプライマーを利用して増幅し、続いてＳｆｉＩおよびＮｏｔＩを介して、ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂにクローニングした。配列番号１３６および配列番号１３７によるオリゴヌクレオチドをアニーリングさせてから、このＥ５Ｂ９用核酸配列を、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩを介して、ヒト化ｓｃＦｖ ＰＳＣＡ（ＭＢ１）の３‘側にクローニングすると、コンストラクト「ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ＿ｓｃＦｖ ＰＳＣＡ（ＭＢ１）－Ｅ５Ｂ９ヒト化」が生じた。

Ｔ細胞およびＥ５Ｂ９ペプチドに結合する二種のエフェクターモジュール「ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３（Ｇ_４Ｓ）－５Ｂ９」および「ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３（３ｘＧ_４Ｓ）－５Ｂ９」のクローニング
図１Ｂに図解されているように、ｓｃＦｖ ＰＳＣＡ（ＭＢ１）－５Ｂ９を含むモジュール式ターゲティング系Ｉを構築するために、二つの、いわゆるエフェクターモジュール（二重特異性抗体ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－５Ｂ９）を製造し、これらのエフェクターモジュールは、抗ＣＤ３ドメインのＶ_Ｈ鎖とＶ_Ｌ鎖との間のリンカーペプチドのグリシン－セリン（Ｇ_４Ｓ）要素の数の点で異なるため、「ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３（Ｇ_４Ｓ）－５Ｂ９」ないしは「ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３（３ｘＧ_４Ｓ）－５Ｂ９」と呼ばれた。

－「ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３（Ｇ_４Ｓ）－５Ｂ９」ヒト化のクローニング（スケッチは図１Ｂ上図を参照）：
５Ｂ９抗体（ペプチド５Ｂ９に対して特異的に方向づけられる）の重鎖可変領域をヒト化するために、配列番号１３８～配列番号１４２によるオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた。続いて、この、５Ｂ９抗体重鎖可変領域のヒト化核酸配列（Ｇ_４Ｓ－リンカーペプチド、配列番号１３２を含む）を、配列番号１４３および配列番号１４４によるプライマーペアを利用して増幅した。５Ｂ９抗体の軽鎖可変領域をヒト化するためには、配列番号１４５～配列番号１４９によるオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた。この、５Ｂ９抗体軽鎖可変領域のヒト化核酸配列を、配列番号１５０および配列番号１５１によるプライマーペアを利用して増幅した。

最終的には、５Ｂ９Ｖ_Ｈおよび５Ｂ９Ｖ_Ｌのヒト化核酸配列を、オーバーラップＰＣＲを利用して、配列番号１５２および配列番号１５３によるプライマーを使用しながら、アニーリングさせて増幅した。そのようにして生成された、ヒト化ｓｃＦｖ ５Ｂ９（Ｖ_Ｈ－３ｘＧ_４Ｓ－Ｖ_Ｌ）の核酸配列を、ＸｈｏＩおよびＡｐａＩを介して、ヒト化ｓｃＦｖ ＣＤ３ Ｖ_Ｈ－Ｇ_４Ｓ－Ｖ_Ｌの下流へと「ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ＿ｓｃＦｖ ＣＤ３ Ｖ_Ｈ－Ｇ_４Ｓ－Ｖ_Ｌ」ヒト化にクローニングすると、ベクター「ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ＿ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３（Ｇ_４Ｓ）－５Ｂ９ヒト化」が生じた。

－「ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３（３ｘＧ_４Ｓ）－５Ｂ９」ヒト化のクローニング（スケッチは図１Ｂ中央図を参照）：
ｓｃＦｖ ５Ｂ９（Ｖ_Ｈ－３ｘＧ_４Ｓ－Ｖ_Ｌ）のヒト化配列を、ＸｈｏＩおよびＡｐａＩを介して、ヒト化ｓｃＦｖ ＣＤ３（Ｖ_Ｈ－３ｘＧ_４Ｓ－Ｖ_Ｌ）の下流へと「ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ＿ｓｃＦｖ ＣＤ３ Ｖ_Ｈ－３ｘＧ_４Ｓ－Ｖ_Ｌ」ヒト化にクローニングすると、ベクター「ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ＿ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３（３ｘＧ_４Ｓ）－５Ｂ９ヒト化」が生じた。

本発明による医薬組成物（「モジュール式ターゲティング系２」、図１Ｃに図解）を供給するために、以下の組換え抗体を製造した：
－配列番号７６によるペプチド（ここでは「Ｅ７Ｂ６」とも呼ぶ）を含有する本発明による組換え抗ＰＳＣＡ抗体。この抗体を、以下では、ｓｃＦｖ ＰＳＣＡ（ＭＢ１）－Ｅ７Ｂ６と呼ぶ。
－ＣＤ３および配列番号７６によるペプチドを対象とする二重特異性抗体（ｓｃＢｓＴａＦｖ）。ＣＤ３に対するパラトープは、以下の可変領域アミノ酸配列：重鎖配列番号６５、軽鎖配列番号５７を含む。配列番号７６によるペプチドに対するパラトープは、以下の可変領域超可変領域アミノ酸配列：軽鎖ＣＤＲ１配列番号８４、ＣＤＲ２配列番号８５、ＣＤＲ３配列番号８６、重鎖ＣＤＲ１配列番号８７、ＣＤＲ２配列番号８８、ＣＤＲ３配列番号８９を含む。この抗体を、以下では、ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－７Ｂ６と呼ぶ。

ヒト化ｓｃＦｖ ＰＳＣＡ（ＭＢ１）－Ｅ７Ｂ６のクローニング：
Ｃ末端にＥ７Ｂ６エピトープを有するヒト化ｓｃＦｖ ＰＳＣＡ（ＭＢ１）（ＭＢ１［Ｖ_Ｌ－Ｇ_４ＳＧ_４ＳＧＡＳＡＡＧ_４ＳＧ_４Ｓ－ＭＢ１ Ｖ_Ｈ］－［Ｇ_４Ｓ－Ｅ７Ｂ６］、図１Ｃ下図に図解）を生成するために、まず配列番号１５４および配列番号１５５によるオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、続いてこのＥ７Ｂ６核酸配列を、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩを介して、「ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ＿ｓｃＦｖ ＰＳＣＡ（ＭＢ１）ヒト化」（Ｖ_Ｌ－Ｇ_４ＳＧ_４ＳＧＡＳＡＡＧ_４ＳＧ_４Ｓ－Ｖ_Ｈ－Ｇ_４Ｓ、前記の、Ｅ５Ｂ９ペプチドを含むコンストラクトに類似）の３‘側にクローニングすると、ベクター「ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ＿ｓｃＦｖ ＰＳＣＡ（ＭＢ１）－Ｅ７Ｂ６ヒト化」が生じた。

Ｔ細胞およびＥ７Ｂ６ペプチドに結合するエフェクターモジュール「ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３（３ｘＧ_４Ｓ）－７Ｂ６」ヒト化のクローニング：
７Ｂ６抗体（ペプチドＥ７Ｂ６に対して特異的に方向づけられる）の重鎖可変領域をヒト化するために、配列番号１５６～配列番号１６０による重複オリゴヌクレオチドをアニーリングさせた。続いて、この、７Ｂ６抗体重鎖可変領域のヒト化核酸配列（Ｇ_４Ｓ－リンカーペプチド、配列番号１３２を含む）を、配列番号１６１および配列番号１６２によるプライマーペアを利用して増幅した。７Ｂ６抗体の軽鎖可変領域をヒト化するためには、配列番号１６３～配列番号１６７によるオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた。この、７Ｂ６抗体軽鎖可変領域のヒト化核酸配列を、配列番号１６８および配列番号１６９によるプライマーペアを利用して増幅した。

最終的には、７Ｂ６Ｖ_Ｈおよび７Ｂ６Ｖ_Ｌのヒト化核酸配列を、オーバーラップＰＣＲを利用して、配列番号１７０および配列番号１７１によるプライマーを使用しながら、アニーリングさせて増幅した。そのようにして生成された、ヒト化ｓｃＦｖ ７Ｂ６（Ｖ_Ｈ－３ｘＧ_４Ｓ－Ｖ_Ｌ）をコードする核酸配列を、ＸｈｏＩおよびＡｐａＩを介して、ヒト化ｓｃＦｖ ＣＤ３ Ｖ_Ｈ－Ｇ_４Ｓ－Ｖ_Ｌの下流へと「ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ＿ｓｃＦｖ ＣＤ３ Ｖ_Ｈ－Ｇ_４Ｓ－Ｖ_Ｌ」ヒト化にクローニングすると、ベクター「ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ＿ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３（Ｇ_４Ｓ）－７Ｂ６ヒト化」が生じた。

モジュール式ターゲティング系１および２の個々の融合タンパク質を発現するために、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞をこれらの発現ベクターで形質転換し、分泌された組換えｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ ＰＳＣＡ－Ｅ５Ｂ９またはｓｃＦｖ ＰＳＣＡ－Ｅ７Ｂ６）および二重特異性抗体（ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３（Ｇ_４Ｓ）－５Ｂ９ないしはｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３（３ｘＧ_４Ｓ）－５Ｂ９およびｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－７Ｂ６）を、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースを介するアフィニティクロマトグラフィ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を利用し（場合によっては硫酸アンモニウム分別沈殿法と組み合わせて）細胞培養上清から精製した。ＳＤＳ－Ｐａｇｅおよびイムノブロットにより、組換え抗体誘導体の純度および安定性を確かめた（図２）。

例示的実施形態３：ＰＳＣＡへの結合の解離定数の特定
抗ＰＳＣＡ ＭＢ１抗体（本発明による）および抗ＰＳＣＡ ７Ｆ５抗体（比較例、［Ｆｅｌｄｍａｎｎ ２０１０］に由来する抗体）を用いた、組換え型二重特異性抗体のそれぞれの抗ＰＳＣＡドメインの親和定数の算定は、ＰＳＣＡ陽性ＰＣ３細胞への結合のフローサイトメトリー解析に基づいた。

組換え型抗ＰＳＣＡ抗体ドメインの結合曲線を生成するために、それぞれ２ｘ１０^５個のＰＳＣＡ陽性細胞を、１００μｌの二重特異性抗体（ＭＢ１および７Ｆ５）と１時間、４℃でインキュベートした。抗体は、それぞれ以下の濃度で使用した：

調合ごとの抗体量（ｎｇ） 抗体濃度（ｐｍｏｌ／ｌ）
１０００ ９００００
１００ ９０００
５０ ４５００
１０ ９００
５ ４５０
１ ９０
０．５ ４５
０．１ ９
０．０５ ４．５
０．０１ ０．９
０．００１ ０．０９

組換え型ＣＤ３－ＰＳＣＡ抗体の特異的結合を検出するために、マウス抗ｃ－ｍｙｃ ＩｇＧ－ＦＩＴＣ検出用抗体（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ社、デュッセルドルフ、ドイツ）を使用し、この検出用抗体を、最初の染色ステップ終了後に、抗ＰＳＣＡ抗体で標識されたＰＳＣＡ陽性細胞と３０分間、４℃においてインキュベーションした。陰性対照としては、そのなかでＰＳＣＡ陽性細胞が、検出用抗体であるマウス抗ｃ－ｍｙｃ ＩｇＧ－ＦＩＴＣでのみ染色されたサンプルを用いて共に行った。これらの細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、ハイデルベルク、ドイツ）を用いて解析し、それらのデータをソフトウェアＷｉｎＭＤＩ ２．８（Ｊｏｓｅｐｈ Ｔｒｏｔｔｅｒ、ラホヤ、米国カリフォルニア州）を用いて評価した。

評価するために、算出されたＭＦＩ値（平均蛍光強度値）を、検査された抗体濃度に対してプロットし、それぞれ、二次多項式回帰型のトレンドラインを算出した。親和定数を算出するためには、二次多項式回帰型のトレンドラインを算出し、挿入した。その結果として生じる結合曲線を、最大ＭＦＩ値の５０％の値、それゆえ結合の半数飽和時に達成される濃度と定義されている親和定数Ｋ_Ｄを算出するための基盤として利用した。この定数を算出するためには、まず、二次関数に従う結合曲線の一次導関数を形成した。この方程式を起点として関数の最大値を算出するために、一次導関数を「ゼロ」とし、ｘについて解いた。得られたｘ値を出力方程式に挿入することにより、関数の最大値ｙ_ｍａｘ、それゆえ結合部位の半数飽和時のＭＦＩ値に対応するｙ_ｍａｘ／２値を算出した。Ｋ_Ｄ値は、ｙ_ｍａｘ／２でのｘ値に対応するため、この値は、ｙ_ｍａｘ／２を、結合曲線の二次関数に挿入し、この方程式をｘに関して置き換えることにより、最終的に算出することができる。

以下のＫ_Ｄ値は、このやり方で、ＰＳＣＡへの結合に関して算出された：

したがって、本発明による抗ＰＳＣＡ抗体の、抗原ＰＳＣＡに対する親和性は、従来技術から公知の抗体７Ｆ５の親和性よりも一桁高いことを示すことができた。

例示的実施形態４：二重特異性抗ＰＳＣＡ抗体を用いた、ＰＳＣＡ^＋細胞の特異的溶解
クロム放出アッセイにおいて、あらかじめ活性化されたＰＢＭＣｓ ５ｘ１０^４個を、^５１Ｃｒを含むＰＣ３－ＰＳＣＡ腫瘍細胞５ｘ１０^３個と一緒に（エフェクター／ターゲット比＝１０：１）、組換え抗体の存在下および不在下に、ＲＰＭＩ培地中におき総体積２００μｌで共培養した。それに加えて、例１に由来する本発明による抗体を使用した（マウス型同様にヒト化型も）。比較例としては、従来技術から公知のマウス抗ＰＳＣＡ（７Ｆ５）抗体を、同様に構成された二重特異性抗体中で使用した。７Ｆ５抗体の可変領域は、重鎖配列番号４８、軽鎖配列番号５０に対応する。以下の具体的な抗体コンストラクトを用いて実験を行った：
１．例示的実施形態１に由来するヒト化二重特異性ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－ＰＳＣＡ（ＭＢ１）
２．例示的実施形態１に由来するマウス二重特異性ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－ＰＳＣＡ（ＭＢ１）
３．ヒト化二重特異性ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－ＰＳＣＡ（７Ｆ５）（比較例）
４．マウス二重特異性ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－ＰＳＣＡ（７Ｆ５）（比較例）

インキュベータ中におき３７℃で２０時間インキュベーションした後、培地中に放出されたクロムを測定した。特異的溶解を以下のように算出した：
特異的溶解（％）＝［放出された^５１Ｃｒ－自然放出された^５１Ｃｒ（最小値）］／［最大限放出された^５１Ｃｒ（最大値）－最小値］ｘ１００％

このｉｎ ｖｉｔｒｏ実験の結果は、図３にグラフで図示されている。図示されているのは、溶解されたＰＣ３細胞の、使用された総ＰＣ３細胞に対する百分率での比率である（ｙ軸）。実験群１および２の、本発明による抗体が、１ｎｇ未満の量ですでに、ＰＳＣＡ陽性細胞の激しい溶解を示すのに対して、匹敵するコンストラクトにおける公知の７Ｆ５抗体の場合（実験群３および４）、数ｎｇの抗体を使用してはじめて検出可能な溶解を認めることができる。最大限で、使用したＰＣ３細胞のおよそ６０％の溶解が認められた。本発明による抗体を用いると、明らかに少量の抗体量の使用においてすでに、使用したＰＣ３細胞のおよそ８０％の溶解を認めることができた。最大限で、使用したＰＣ３細胞の９０％超を、本発明による抗体（実験群１）を用いて溶解することができた。

例示的実施形態５：ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－ＰＳＣＡ（ＭＢ１）ヒト化によるｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長阻害
本発明による抗ＰＳＣＡ ＭＢ１抗体の有効性を証明するために、その抗体から誘導された、例示的実施形態１に基づき製造された二重特異性抗体ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－ＰＳＣＡ（ＭＢ１）（図１Ａ上図に図示）の効果を、マウス腫瘍モデルで検査した。モデル生物としては、ＰＳＣＡ陽性ＰＣ３腫瘍細胞の移入後に腫瘍を形成するヌードマウスを使用した。この実験では、ＰＳＣＡ陽性腫瘍細胞を、Ｔ細胞および抗体と組み合わせて移入した。

そのために以下の抗体を使用し、ただし、マウスごとに１０μｇの抗体を注入した：
（１）二重特異性対照抗体、抗ＣＤ３ｘ抗５Ｂ９（対照）
（２）例示的実施形態１に由来する単独特異性ヒト化ｓｃＦｖ抗ＰＳＣＡ（ＭＢ１）（対照）
（３）抗体を伴わない対照実験（陰性対照）
（４）例示的実施形態１に由来するヒト化二重特異性ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－ＰＳＣＡ（ＭＢ１）
（５）例３に記載されるようなヒト化二重特異性ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－ＰＳＣＡ（７Ｆ５）（比較例）
（６）７Ｆ５抗体のＰＳＣＡ結合性可変領域を含有するヒト化二重特異性ｓｃＢｓＤｂ ＣＤ３ｘＰＳＣＡ（７Ｆ５）（比較例）

二重特異性抗体の効果は、ＣＤ３陽性Ｔ細胞の、ＰＳＣＡ陽性腫瘍細胞へのリクルーティング、およびそれによって仲介される腫瘍細胞の溶解に基づく。

第一実験では、実験群ごとにそれぞれ８匹のヌードマウスに、５ｘ１０^３個のＰＳＣＡ陽性腫瘍細胞および５ｘ１０^３個のＴ細胞を移入した（エフェクター／ターゲット比は１：１）。対照群（１）および（３）では、抗ＰＳＣＡ抗体の不在下において、迅速な腫瘍成長が認められた。単独特異性ｓｃＦｖ抗ＰＳＣＡ（ＭＢ１）が注入された対照実験（２）も、迅速な腫瘍成長を示した。これにより、単独特異性抗体の細胞毒性効果を除外することができ、有効性の理由は、二重特異性コンストラクトにのみあると見なすことができる。形成された腫瘍の腫瘍表面積は、細胞移入から２５日後に算出された。三つの対照群は、腫瘍表面積の著しい相違を示さなかった（図４Ａ）。

抗ＰＳＣＡ－７Ｆ５抗体の可変領域を含有する二重特異性比較抗体（タンデム抗体の形態での比較群（５）および二重特異性抗体の形態での（６））を移入すると、同じく迅速な腫瘍成長が認められた（データは示さない）。腫瘍細胞がエフェクター／ターゲット比１０：１にある（つまり、１０倍量のＴ細胞；５ｘ１０^３個のＰＳＣＡ陽性腫瘍細胞および５ｘ１０^４個のＴ細胞の移入）第二実験においても迅速な腫瘍成長が認められ、この腫瘍成長は、対照群（１）に対して統計的に有意な相違を示さなかった（図４Ｂ）。腫瘍成長は、抗ＰＳＣＡ ７Ｆ５抗体により阻害されたのではなく、単にわずかに遅れただけであった。したがって、Ｔ細胞過剰下においても、抗ＰＳＣＡ ７Ｆ５抗体により腫瘍成長のｉｎ ｖｉｖｏ阻害を認めることはできない。

本発明による、例示的実施形態１に由来する二重特異性抗体ｓｃＢｓＴａＦｖ ＣＤ３－ＰＳＣＡ（ＭＢ１）の、エフェクター／ターゲット比１：１での移入は、腫瘍成長を著しく軽減させることができた。細胞移入から２５日後に、８匹の実験動物のうちの２匹中では、明らかに表面積の少ない腫瘍（直径がおよそ２ｍｍ）が出現した一方で、８匹の実験動物のうちの６匹は、腫瘍を伴わなかった（図４Ａ）。したがって、本発明による抗ＰＳＣＡ ＭＢ１抗体（実験群（４））は、ｉｎ ｖｉｖｏ有効性に関して、同一の実験条件下では、比較可能に構成されている抗ＰＳＣＡ ７Ｆ５抗体（実験群（５））を明らかに上回っている。

引用された非特許文献
Ｆｅｌｄｍａｎｎ Ａ， Ｓｔａｍｏｖａ Ｓ， ＢｉｐｐｅｓＣＣ， Ｂａｒｔｓｃｈ Ｈ， Ｗｅｈｎｅｒ Ｒ， Ｓｃｈｍｉｔｚ Ｍ， Ｔｅｍｍｅ Ａ， ＣａｒｔｅｌｌｉｅｒｉＭ， Ｂａｃｈｍａｎｎ Ｍ． Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ： ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔｓ． Ｐｒｏｓｔａｔｅ． ２０１１ Ｊｕｎ １５；７１（９）：９９８－１０１１． ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏｓ．２１３１５． Ｅｐｕｂ２０１０ Ｄｅｃ ２８．
Ｇｕ Ｚ， Ｙａｍａｓｈｉｒｏ Ｊ， Ｋｏｎｏ Ｅ， Ｒｅｉｔｅｒ ＲＥ． Ａｎｔｉ－ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ １Ｇ８ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈｉｎ ｖｉｖｏ ｖｉａ ａ Ｆｃ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００５ Ｏｃｔ １５；６５（２０）：９４９５－５００．
Ｍｏｒｇｅｎｒｏｔｈ Ａ， ＣａｒｔｅｌｌｉｅｒｉＭ， Ｓｃｈｍｉｔｚ Ｍ， Ｇｕｅｎｅｓ Ｓ， ＷｅｉｇｌｅＢ， Ｂａｃｈｍａｎｎ Ｍ， Ａｂｋｅｎ Ｈ， ＲｉｅｂｅｒＥＰ， Ｔｅｍｍｅ Ａ． Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ （ＰＳＣＡ） ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ． ２００７ Ｊｕｌ １；６７（１０）：１１２１－３１．
Ｒｅｉｔｅｒ， Ｒ．Ｅ．， Ｇｕ， Ｚ．， Ｗａｔａｂｅ，Ｔ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｇ．， Ｓｚｉｇｅｔｉ， Ｋ．， Ｄａｖｉｓ， Ｅ．， Ｗａｈｌ， Ｍ．， Ｎｉｓｉｔａｎｉ，Ｓ．， Ｙａｍａｓｈｉｒｏ， Ｊ．， Ｌｅ Ｂｅａｕ， Ｍ．Ｍ．， Ｌｏｄａ，Ｍ． ｕｎｄ Ｗｉｔｔｅ， Ｏ．Ｎ． Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ： Ａ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ ＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ． ９５（４）： １７３５－４０（１９９８）
Ｒｏｅｈｌ， Ｋ．Ａ．， Ｍ． Ｈａｎ， Ｃ． Ｇ． Ｒａｍｏｓ， Ｊ． Ａ． Ｖ． Ａｎｔｅｎｏｒ，ａｎｄ Ｗ． Ｊ． Ｃａｔａｌｏｎａ． Ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａｎａｔｏｍｉｃａｌ ｒａｄｉｃａｌ ｒｅｔｒｏｐｕｂｉｃｐｒｏｓｔａｔｅｃｔｏｍｙ ｉｎ ３，４７８ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ： ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｒｅｓｕｌｔｓ． Ｊ Ｕｒｏｌ， １７２（３）：９１０－４， Ｓｅｐ ２００４．
Ｔｈｏｍａｓ－Ｋａｓｋｅｌ， Ａ．－Ｋ．， Ｒ． Ｚｅｉｓｅｒ，Ｒ． Ｊｏｃｈｉｍ， Ｃ． Ｒｏｂｂｅｌ， Ｗ． Ｓｃｈｕｌｔｚｅ－Ｓｅｅｍａｎｎ， Ｃ． Ｆ． Ｗａｌｌｅｒ， ａｎｄ Ｈ． Ｖｅｅｌｋｅｎ．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＰＳＣＡ ａｎｄ ＰＳＡｐｅｐｔｉｄｅ－ｌｏａｄｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ＤＴＨ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈｓｕｐｅｒｉｏｒ ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１１９（１０）：２４２８－３４， Ｎｏｖ ２００６．
また、本発明は以下の項目を含む。
［項目１］
－軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下のアミノ酸配列：ＣＤＲ１配列番号１、ＣＤＲ２配列番号２、ＣＤＲ３配列番号３を含み、
－重鎖可変領域のＣＤＲが以下のアミノ酸配列：ＣＤＲ１配列番号４、ＣＤＲ２配列番号５、ＣＤＲ３配列番号６を含む、前立腺特異幹細胞抗原に結合する抗体。
［項目２］
その可変領域がヒト化アミノ酸配列を有する、項目１に記載の抗体。
［項目３］
少なくとも二つの異なる結合単位を含み、
－前記結合単位の少なくとも一つが前立腺特異幹細胞抗原に結合し、項目１で定義された相補性決定領域を含み、
－前記結合単位の少なくとももう一つが前立腺特異幹細胞抗原とは異なる抗原に特異的に結合する、項目１または２に記載の抗体。
［項目４］
さらなる結合単位がエフェクター細胞上の表面構造に特異的に結合し、前記結合単位が、好ましくは、エフェクター細胞の表面構造に結合する抗体またはリガンドの結合単位から選択される、項目３に記載の抗体。
［項目５］
エフェクター細胞が、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、単球、好ましくはＴリンパ球から選択される、項目４に記載の抗体。
［項目６］
さらなる結合単位が、１０～５０個のアミノ酸長のペプチド、好ましくは、１０～５０個のアミノ酸長のヒトＬａタンパク質部分配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチド、特に好ましくは、配列番号７５または配列番号７６によるアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合する、項目３に記載の抗体。
［項目７］
二重特異性抗体、三重特異性抗体、または四重特異性抗体の形態の、項目３～６のいずれか一つに記載の抗体。
［項目８］
特に、腫瘍疾患、好ましくは前立腺癌を治療するための医薬品として、または診断薬としての、項目１～７のいずれか一つに記載の抗体の使用。
［項目９］
そのヌクレオチド配列が、項目１～７のいずれか一つに記載の組換え抗体をコードする核酸。
［項目１０］
項目９に記載のヌクレオチド配列を含有するベクター。
［項目１１］
項目９に記載のヌクレオチド配列もしくは項目１０に記載のベクターを含有する宿主細胞または非ヒト宿主生物。
［項目１２］
好ましくは静脈内投与に適した形態の、薬学的に許容される希釈剤または担体と関連して項目１～７のいずれか一つに記載の組換え抗体を含有する医薬組成物。
［項目１３］
少なくとも二つの異なる組換え抗体、そのうち少なくとも一つの、項目１～７のいずれか一つに記載の抗体、および少なくとも一つの、項目１～７のいずれか一つに記載の抗体と特異的に結合するさらなる組換え抗体を含有する、項目１２に記載の医薬組成物。
［項目１４］
項目１～７のいずれか一つに記載の組換え抗体を含有する診断用組成物。

Claims (20)

1. 前立腺特異幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）陽性腫瘍を治療するための薬剤として使用するための組成物であって、
   少なくとも二つの異なる結合単位を含有する当該抗体を含む前記組成物、
   （ここで、－それらの結合単位の少なくとも一つは、前立腺特異幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）に結合し、
   －軽鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、各々、以下のアミノ酸配列：ＣＤＲ１配列番号１、ＣＤＲ２配列番号２、ＣＤＲ３配列番号３を含み、
   －重鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、各々、以下のアミノ酸配列：ＣＤＲ１配列番号４、ＣＤＲ２配列番号５、ＣＤＲ３配列番号６を含み、
   －それらの結合単位の他の少なくとも一つはＣＤ３を対象とし、
   ＣＤ３に対する前記結合単位が
   －各々、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８のアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む抗体の重鎖可変領域、および
   －各々、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０のアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む抗体の軽鎖可変領域を含む）。
2. 前立腺特異幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）陽性腫瘍を診断するための診断薬として使用するための組成物であって、
   少なくとも二つの異なる結合単位を含有する当該抗体を含む前記組成物、
   （ここで、－それらの結合単位の少なくとも一つは、前立腺特異幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）に結合し、
   －軽鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、各々、以下のアミノ酸配列：ＣＤＲ１配列番号１、ＣＤＲ２配列番号２、ＣＤＲ３配列番号３を含み、
   －重鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、各々、以下のアミノ酸配列：ＣＤＲ１配列番号４、ＣＤＲ２配列番号５、ＣＤＲ３配列番号６を含み、
   －それらの結合単位の他の少なくとも一つはＣＤ３を対象とし、
   ＣＤ３に対する前記結合単位が
   －各々、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８のアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む抗体の重鎖可変領域、および
   －各々、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０のアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む抗体の軽鎖可変領域を含む）。
3. 前記組成物が、薬学的に許容される希釈剤または担体をさらに含む医薬組成物である、請求項１に記載の組成物。
4. 静脈内投与に適した形態である、請求項３に記載の組成物。
5. 前記組成物が、診断用組成物である、請求項２に記載の組成物。
6. 前記可変領域がヒト化されている、請求項１～５のいずれか一つに記載の組成物。
7. 前立腺特異幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）に結合する前記結合単位が
   （ｉ）配列番号２６による抗体の重鎖可変領域であるか、または配列番号２６による抗体の重鎖可変領域に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列；および
   （ｉｉ）配列番号２４による抗体の軽鎖可変領域であるか、または配列番号２４による抗体の軽鎖可変領域に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一つに記載の組成物。
8. ＣＤ３に結合する前記結合単位が、配列番号５７による抗体の軽鎖可変領域および配列番号６５による抗体の重鎖可変領域を含む、請求項１～７のいずれか一つに記載の組成物。
9. 前記抗体が、二重特異性抗体、三重特異性抗体、または四重特異性抗体の形態の、請求項１～８のいずれか一つに記載の組成物。
10. 前立腺特異幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）に結合する前記結合単位がＶ_Ｌ－リンカーペプチド－Ｖ_Ｈ構造を有するｓｃＦｖ断片であり、
    Ｖ_Ｌは軽鎖可変領域であり、Ｖ_Ｈは重鎖可変領域である、請求項１～９のいずれか一つに記載の組成物。
11. 前立腺特異幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）に結合する前記結合単位がＶ_Ｌ－Ｇ_４ＳＧ_４ＳＧＡＳＡＡＧ_４ＳＧ_４Ｓ－Ｖ_Ｈ構造を有するｓｃＦｖ断片であり、
    Ｖ_Ｌは軽鎖可変領域であり、Ｖ_Ｈは重鎖可変領域であり、Ｇ_４ＳＧ_４ＳＧＡＳＡＡＧ_４ＳＧ_４Ｓは配列番号１３０によるリンカーペプチドである、請求項１～１０のいずれか一つに記載の組成物。
12. ＣＤ３に対する前記結合単位がＶ_Ｈ－リンカーペプチド－Ｖ_Ｌ構造を有し、Ｖ_Ｌは軽鎖可変領域であり、Ｖ_Ｈは重鎖可変領域である、請求項１～１１のいずれか一つに記載の組成物。
13. ＣＤ３に対する前記結合単位がＶ_Ｈ－（Ｇ_４Ｓ）_３－Ｖ_Ｌ構造を有し、Ｖ_Ｌは軽鎖可変領域であり、Ｖ_Ｈは重鎖可変領域であり、（Ｇ_４Ｓ）_３は配列番号１３１によるリンカーペプチドである、請求項１～１２のいずれか一つに記載の組成物。
14. 前立腺特異幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）に結合する前記結合単位が、ＣＤ３に対する前記結合単位のＮ末端と結合している、請求項１～１３のいずれか一つに記載の組成物。
15. 前立腺特異幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）に結合する前記結合単位が、ＣＤ３に対する前記結合単位のＣ末端と結合している、請求項１～１３のいずれか一つに記載の組成物。
16. 前立腺特異幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）に結合する前記結合単位が、配列番号１３３によるアミノ酸配列を介して、ＣＤ３に対する前記結合単位のＮ末端またはＣ末端と結合している、請求項１４または１５に記載の組成物。
17. ＰＳＣＡ陽性腫瘍が前立腺癌である、請求項１～１６のいずれか一つに記載の組成物。
18. 抗体を製造するための方法であって、当該方法は、
    （ａ）前記抗体をコードする核酸を含む発現ベクターにより宿主細胞を形質転換すること、および
    （ｂ）細胞培養から前記抗体を精製することを含み、
    前記抗体は、少なくとも二つの異なる結合単位を含有し
    ここで、－それらの結合単位の少なくとも一つは、前立腺特異幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）に結合し、
    －軽鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、各々、以下のアミノ酸配列：ＣＤＲ１配列番号１、ＣＤＲ２配列番号２、ＣＤＲ３配列番号３を含み、
    －重鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、各々、以下のアミノ酸配列：ＣＤＲ１配列番号４、ＣＤＲ２配列番号５、ＣＤＲ３配列番号６を含み、
    －それらの結合単位の他の少なくとも一つはＣＤ３を対象とし、
    ＣＤ３に対する前記結合単位が
    －各々、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８のアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む抗体の重鎖可変領域、および
    －各々、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０のアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む抗体の軽鎖可変領域を含む、前記方法。
19. 前記抗体がニッケルアフィニティクロマトグラフィを使用して精製される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記抗体が硫酸アンモニウム分別沈殿法と組み合わせてニッケルアフィニティクロマトグラフィを使用して精製される、請求項１８に記載の方法。

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