ES2711978T3

ES2711978T3 - Anticuerpos contra el antígeno de células madre específico de la próstata y su uso

Info

Publication number: ES2711978T3
Application number: ES12729996T
Authority: ES
Inventors: Michael Bachmann
Original assignee: Gemoab Monoclonals GmbH
Current assignee: Avencell Europe GmbH
Priority date: 2011-06-30
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2019-05-08
Anticipated expiration: 2032-06-29
Also published as: LT2726507T; TR201901991T4; DK2726507T3; SI2726507T1; CY1121249T1; RS58448B1; HUE042008T2; JP2019193652A; DE102011118022A1; HRP20190289T1; EP2726507B1; JP2014528696A; AU2012277784A1; PT2726507T; EP2726507A1; JP7341185B2; JP6549622B2; US9200078B2; JP2017104113A; DE102011118022B4

Abstract

Un anticuerpo que se une con antígeno de células madre específico de la próstata, en donde - las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la región variable de la cadena liviana comprende las siguientes secuencias de aminoácidos: CDR1 SEQ ID NO. 1, CDR2 SEQ ID NO. 2, CDR3 SEQ ID NO. 3 y - las CDR de la región variable de la cadena pesada comprenden las siguientes secuencias de aminoácidos: CDR1 SEQ ID NO. 4, CDR2 SEQ ID NO. 5, CDR3 SEQ ID NO. 6.

Description

DESCRIPCION

Anticuerpos contra el antfgeno de celulas madre especffico de la prostata y su uso

La invencion se refiere a los anticuerpos recombinantes de union al antfgeno de celulas madre especffico de la prostata (PSCA) y su uso en diagnosticos y terapia. Los anticuerpos son adecuados para su uso en el campo de la medicina, la farmacia y la investigacion biomedica.

El cancer de prostata es una de las causas de muerte relacionadas con el cancer mas comunes en Alemania. La terapia estandar para el cancer de prostata primario limitado a organos es actualmente la prostatectomfa radical, es decir, eliminacion completa de prostata, vesfculas seminales y ganglios linfaticos. Una alternativa a esto es la radioterapia, que se logra al fijar la prostata con material radioactivo (braquiterapia). La mayorfa de los pacientes con cancer de prostata local y primario pueden tratarse con exito mediante prostatectomfa radical y radioterapia. La recurrencia ocurre en aproximadamente el 20 al 40% de los afectados [Roehl 2004].

En la actualidad, se estan desarrollando varios metodos de terapia basados en anticuerpos. Es crucial identificar estructuras diana en las celulas cancerosas que pueden servir como objetivos para terapias basadas en anticuerpos. Un sitio de orientacion adecuado para el tratamiento del cancer de prostata son las protefnas de superficie que estan predominantemente presentes en el tejido de la prostata y que muestran una sobreexpresion en celulas malignas en comparacion con las sanas.

El antfgeno de celulas madre especffico de la prostata (PSCA) es una de esas moleculas de superficie que es especffica de las celulas de la prostata y se expresa cada vez mas en las celulas de cancer de prostata en comparacion con el tejido sano (antfgeno asociado al tumor). El PSCA humano comprende 123 aminoacidos y tiene una secuencia de senal N-terminal, una secuencia de anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) C-terminal y varios sitios de N-glicosilacion. Se considera que PSCA es parte de la familia Thy-1/Ly-6 de moleculas de superficie celular ancladas a GPI, ya que presenta, entre otros, los residuos de cistefna conservados caracterfsticos de esta familia [Reiter 1998].

Debido al aumento de la expresion en los tumores de prostata, el PSCA es una molecula diana adecuada para el tratamiento del cancer de prostata y hasta el momento se han desarrollado diferentes estrategias terapeuticas dirigidas al PSCA como objetivo. Se ha reportado evidencia de la eficacia del PSCA como un objetivo terapeutico en la terapia del cancer en humanos, entre otros, por vacunacion con celulas dendrfticas previamente cargadas con un peptido de PSCA. Los ensayos clfnicos (Fase 1 y 2) con 12 pacientes con cancer de prostata refractarios a terapia hormonal y quimioterapia mostraron que la vacunacion con celulas dendrfticas cargadas con peptido PSCA en cinco de los pacientes causo una respuesta de celulas T a PSCA que promedio con un tiempo de supervivencia prolongado correlacionado. En un paciente, incluso se observo una reduccion en la masa tumoral [Thomas-Kaskel 2006]. El documento WO 2009/032949 A2 describe anticuerpos monoclonales anti-PSCA (1G8) utilizados para el direccionamiento de tumores y su deteccion. Las regiones CDR de los anticuerpos tienen las siguientes secuencias de aminoacidos:

Debido a las propiedades citotoxicas del anticuerpo 1G8, no es adecuado para estrategias de focalizacion basadas en el reclutamiento de celulas efectoras (Gu 2005).

Los anticuerpos descritos en el documento WO 2009/032949 A2 se usan de manera diagnostica, preferiblemente en forma de anticuerpos monoclonales murinos y humanizados funcionales, asf como minicuerpos y diacuerpos especfficos de PSCA marcados con radionuclidos.

[Feldmann 2010] desarrollo anticuerpos recombinantes biespecfficos con un paratopo de union a PSCA y un paratopo de union a CD3. El paratopo de union a PSCA de los anticuerpos biespecfficos se deriva del anticuerpo PSCA 7F5 [Morgenroth 2007] y comprende regiones CDR con las siguientes secuencias de aminoacidos:

Los anticuerpos biespecfficos descritos en [Feldmann 2010] llevaron con exito a la lisis especffica mediada por celulas T de celulas tumorales positivas a PSCA in vitro. Para una lisis especffica de aproximadamente el 40% de las celulas tumorales positivas a PSCA utilizadas, en una proporcion de celulas efectoras a celulas tumorales positivas a PSCA de 20:1, se deben usar al menos 5 ng de los anticuerpos biespecfficos descritos en [Feldmann 2010]. In vitro, con el anticuerpo descrito en [Feldmann 2010], se podrfa lograr una lisis especffica de como maximo el 60% de las celulas tumorales positivas a PSCA utilizadas (en presencia de 50-100 ng del anticuerpo). Un aumento adicional en la efectividad no pudo ser probado. Incluso en presencia de 1000 ng del anticuerpo biespecffico, no se pudo lisar una proporcion mayor de celulas tumorales positivas a PSCA.

Los datos conocidos in vitro e in vivo muestran que el PSCA tiene un gran potencial como antfgeno diana para la inmunoterapia de los carcinomas de prostata y es adecuado como diana de diagnostico. El objeto de la invencion es proporcionar anticuerpos mejorados contra PSCA, que son terapeuticamente eficaces en particular en forma de anticuerpos recombinantes biespecfficos en baja concentracion y pueden lisar eficazmente celulas tumorales positivas a PSCA.

El objetivo se logra de acuerdo con la invencion mediante un anticuerpo de union al antfgeno de celulas madre especffico de la prostata (PSCA) (tambien denominado aquf anticuerpo anti-PSCA) que contiene regiones determinantes de la complementariedad (CDR) con las siguientes secuencias de aminoacidos:

- CDR de la region variable de la cadena liviana: CDR1 SEQ ID NO. 1, CDR2 SEQ ID NO. 2, CDR3 SEQ ID NO. 3 y - CDR de la region variable de la cadena pesada: CDR1 SEQ ID NO. 4, CDR2 SEQ ID NO. 5, CDR3 SEQ ID NO. 6. El anticuerpo de la invencion caracterizado por las CDR anteriores tambien se denomina en este documento simplemente como MB1. Los inventores encontraron sorprendentemente en extensas investigaciones que el anticuerpo de acuerdo con la invencion en forma de anticuerpos biespecfficos producidos de forma recombinante puede mediar la lisis especffica de celulas tumorales positivas a PSCA incluso en cantidades muy pequenas. Ademas, se encontro sorprendentemente que la lisis especffica de celulas tumorales positivas a PSCA mediadas por los nuevos anticuerpos es mas efectiva. Por lo tanto, en investigaciones in vitro con anticuerpos biespecfficos que contienen un anticuerpo anti-PSCA de acuerdo con la invencion, mas del 90% de las celulas tumorales positivas a PSCA utilizadas podrfan ser lisadas. Se puede reducir significativamente con el nuevo anticuerpo anti-PSCA, por lo tanto, la cantidad de anticuerpo utilizado. Al mismo tiempo, aumenta la eficacia terapeutica, ya que las celulas tumorales positivas a PSCA pueden lisarse mas eficazmente con el anticuerpo de acuerdo con la invencion. Debido a la baja concentracion en la que se puede lograr una eficacia con el anticuerpo de acuerdo con la invencion, tambien es posible una mejor destruccion de las celulas metastasicas positivas a PSCA de acuerdo con la invencion. Los estudios comparativos con anti-PSCA 7F5 conocido de la tecnica anterior en un constructo biespecffico comparable confirman claramente la superioridad del anticuerpo de la invencion tanto en estudios in vitro (Fig. 3) como in vivo (Fig. 4).

Los anticuerpos anti-PSCA preferidos de la invencion contienen las regiones CDR como se definio anteriormente, en donde la secuencia de aminoacidos de las regiones variables de cadena liviana y pesada tiene al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, mas preferiblemente al menos el 95% de identidad de secuencia de aminoacidos con la siguiente secuencia de aminoacidos:

- region variable de la cadena liviana SEQ ID NO. 24, region variable de la cadena pesada SEQ ID NO. 26 o - region variable de la cadena liviana SEQ ID NO. 20, region variable de la cadena pesada SEQ ID NO. 22.

Se prefieren los anticuerpos anti-PSCA que tienen las regiones CDR definidas anteriormente cuyas regiones variables tienen una estructura humanizada. Son particularmente preferidos los anticuerpos anti-PSCA cuya region variable de la cadena liviana contiene la secuencia de aminoacidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 24 y su region variable de la cadena pesada contiene la secuencia de aminoacidos de acuerdo con SEQ ID NO. 26.

El termino "anticuerpo" en el sentido de la invencion incluye todos los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos capaces de unirse especfficamente a un antfgeno. En el caso de los anticuerpos recombinantes, se trata de anticuerpos producidos utilizando organismos geneticamente modificados. El termino anticuerpo abarca tanto los anticuerpos monoclonales completos como sus fragmentos de union a epftopo. Aquf, los fragmentos de union a epftopo (tambien denominados aquf fragmentos de anticuerpo) incluyen aquellas partes del anticuerpo que son capaces de unirse al antfgeno. Los fragmentos de anticuerpos dentro del significado de la invencion incluyen Fab, Fab', F(ab')², Fd, fragmentos de cadena unica variable (scFv), anticuerpos de cadena unica, fragmentos de variable unida por disulfuro (SDFV) y fragmentos que contienen una region variable de la cadena liviana (V^l) o una region variable de la cadena pesada (V^h). Los fragmentos de anticuerpos contienen las regiones variables, ya sea solas o en combinacion con otras regiones seleccionadas de la region bisagra, y las regiones primera, segunda y tercera de la region constante (C^h1, C^h2, C^h3).

Ademas, el termino anticuerpo comprende anticuerpos producidos de forma recombinante, tales como diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos. El termino anticuerpo tambien abarca anticuerpos quimericos en los que diferentes partes del anticuerpo son de diferentes especies, tales como anticuerpos con una region variable murina combinada con una region constante humana. Los anticuerpos humanizados tambien estan incluidos en el presente documento por el termino anticuerpo. El objetivo de humanizar los anticuerpos es reducir la inmunogenicidad de un anticuerpo xenogenico, como los anticuerpos murinos, para su uso en el sistema humano mientras se mantiene la afinidad de union completa y la especificidad antigenica. Los anticuerpos humanizados se pueden preparar por varias vfas conocidas, como la renovacion de superficies y el injerto de CDR. En la renovacion, una combinacion de modelado molecular, analisis estadfstico y mutagenesis altera todas las regiones no CDR en la superficie del anticuerpo para parecerse a la superficie de los anticuerpos del organismo diana. En el injerto de CDR, las regiones de CDR del anticuerpo a humanizar se introducen en regiones variables humanas.

Los fragmentos de anticuerpo estan opcionalmente ligados entre sf a traves de un enlazador. El enlazador comprende una secuencia peptfdica corta (preferiblemente de 10 a 50 residuos de aminoacidos de largo) seleccionada de modo que el fragmento de anticuerpo tenga un plegamiento tridimensional de VL y VH que tenga la especificidad antigenica del anticuerpo completo. Se da preferencia a los enlazadores de glicina-serina o peptidos enlazadores que tienen una secuencia de aminoacidos de acuerdo con SEQ ID NO. 75 o SEQ ID NO. 76.

La expresion "region variable" como se usa en la presente significa las partes de las cadenas pesada y liviana de los anticuerpos que difieren en su secuencia entre los anticuerpos y determinan la especificidad del anticuerpo y la union a su antfgeno. La variabilidad aquf no esta distribuida uniformemente en la region variable, sino que generalmente se concentra dentro de tres segmentos definidos de la region variable, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, tambien denominadas regiones hipervariables), que estan contenidas en las regiones variables de las cadenas livianas y pesadas. El sitio de union al antfgeno de un anticuerpo, llamado paratopo, se caracteriza por las regiones hipervariables (CDR) de las cadenas liviana y pesada del anticuerpo.

Para describir anticuerpos, el termino simplificado anticuerpo anti-"antfgeno" tambien se usa en la presente para indicar que es un anticuerpo que se une especfficamente al antfgeno indicado en el termino. Asf, por ejemplo, un "anticuerpo anti-PSCA" en el sentido de la invencion significa un anticuerpo que se une especfficamente al antfgeno PSCA. Por union especffica de un anticuerpo a un antfgeno particular se entiende aquf que un anticuerpo con una alta afinidad se une al antfgeno particular y se une con una afinidad significativamente menor y, con preferencia, no se une a otros antfgenos.

Los anticuerpos preferidos estan en forma de un fragmento scFv o un fragmento F(ab')². Otros anticuerpos preferidos son anticuerpos biespecfficos que se producen de forma recombinante y que contienen dos paratopos diferentes, uno de los cuales esta dirigido contra el PSCA y otro no contra el PSCA. El otro paratopo del anticuerpo biespecffico esta dirigido preferiblemente contra una estructura superficial en una celula efectora o contra un peptido de 10 a 50 aminoacidos de largo (preferiblemente una secuencia de 10 a 50 aminoacidos de largo de la protefna La humana, con preferencia particular, contra un peptido con una de las secuencias de aminoacidos segun la SEQ ID NO. 75 o la SEQ ID NO. 76).

Se da preferencia a los anticuerpos anti-PSCA de acuerdo con la invencion (anticuerpos naffs o recombinantes) conjugados con un grupo efector. La conjugacion aquf significa el acoplamiento de una sustancia, es decir, el grupo efector, al anticuerpo. La conexion del anticuerpo al grupo efector se produce preferiblemente por expresion recombinante en forma de una protefna de fusion o por metodos in vitro, en donde el grupo efector se une preferiblemente al anticuerpo a traves de grupos enlazadores qufmicos (por ejemplo, a traves de enlaces tioeter o enlaces disulfuro). Tambien pueden estar unidos al anticuerpo por una molecula portadora intermedia, por ejemplo, albumina de suero. Opcionalmente, un anticuerpo de acuerdo con la invencion contiene varios grupos efectores. Los grupos efectores se seleccionan preferiblemente de sustancias activas, peptidos (con una longitud de 10 a 100 aminoacidos), protefnas (con una longitud de mas de 100 aminoacidos), moleculas coestimuladoras, colorantes o agentes de contraste.

Los anticuerpos anti-PSCA preferidos de acuerdo con la invencion se conjugan con sustancias activas, es decir, con sustancias farmaceuticamente activas. Los ingredientes activos preferidos incluyen toxinas, preferiblemente citostaticos, preferiblemente seleccionados entre maytansinoides y analogos de maytansinoides, taxoides, analogos de CC-1065 y CC-1065, dolastatina y analogos de dolastatina, metotrexato, daunorrubicina, doxorrubicina, vincristina, vinblastina, melfalano, mitomicina C, clorambucilo y caliqueamicina.

Otros anticuerpos anti-PSCA preferidos de acuerdo con la invencion se conjugan con agentes de contraste. Los agentes de contraste preferidos son radionuclidos, de los cuales se prefieren los isotopos radiactivos de tecnecio, renio, itrio, cobre, galio, indio, bismuto y platino, en particular, 99mTc,90Y,186Re,188Re,68Ga y 111In.

Otros anticuerpos anti-PSCA preferidos de acuerdo con la invencion se conjugan con una protefna, preferiblemente una enzima, preferiblemente una enzima adecuada para el sistema ADEPT, una molecula coestimuladora, preferiblemente un ligando de receptor tipo Toll, preferiblemente CpG o conjugado con un acido nucleico.

Otros anticuerpos anti-PSCA preferidos de acuerdo con la invencion se conjugan con un colorante, preferiblemente un colorante fluorescente.

Otros anticuerpos preferidos de la invencion se conjugan a un peptido que contiene una region de union a la que se une especfficamente un anticuerpo especffico para el peptido. Preferiblemente, el peptido comprende una secuencia peptfdica de 10 a 50 aminoacidos de largo de una region alfa-helicoidal de la protefna La humana (la secuencia de aminoacidos de la protefna La humana corresponde a la SEQ ID NO. 77). Son particularmente preferidos los peptidos que tienen una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, mas preferiblemente al menos el 99% con una de las secuencias de aminoacidos de acuerdo con SEQ ID NO.

75 o SEQ ID NO. 76.

Se da preferencia particular a la produccion recombinante de anticuerpos anti-PSCA de acuerdo con la invencion. Preferiblemente, los anticuerpos anti-PSCA recombinantes de la invencion contienen al menos dos unidades de union diferentes, en donde

- al menos una de las unidades de union se une especfficamente a PSCA, que contiene el paratopo del anticuerpo anti-PSCA de acuerdo con la invencion, y

- al menos una mas de las unidades de union se une especfficamente a un antfgeno distinto del PSCA, preferiblemente a una estructura de superficie en una celula efectora.

a unidad de union de union a PSCA comprende asf un anticuerpo anti-PSCA de acuerdo con la invencion y, en consecuencia, contiene al menos las siguientes regiones CDR:

- CDR de la region variable de la cadena liviana que comprende las siguientes secuencias de aminoacidos: CDR1 SEQ ID NO. 1, CDR2 SEQ ID NO. 2, CDR3 SEQ ID NO. 3 y

- CDR de la region variable de la cadena pesada que comprende las siguientes secuencias de aminoacidos: CDR1 SEQ ID NO. 4, CDR2 SEQ ID NO. 5, CDR3 SEQ ID NO. 6

Una "unidad de union" en el sentido de la invencion se refiere a cualquier estructura molecular que se une especfficamente a sustancias o estructuras definidas. Dependiendo de la sustancia o estructura que esta unida, la unidad de enlace tiene diferentes estructuras. La expresion "unidad de union" en el sentido de la invencion, por lo tanto, incluye tanto anticuerpos (en este caso la unidad de union contiene al menos el paratopo funcional del anticuerpo) como otras moleculas, preferiblemente protefnas, que experimentan una union especffica con un antfgeno. Dichas moleculas son preferiblemente ligandos que se unen especfficamente a una estructura de superficie (por ejemplo, un receptor de superficie) en una celula, en particular una celula efectora.

Las unidades de union preferidas contenidas en los anticuerpos de la invencion se unen especfficamente a una celula efectora. La definicion de celulas efectoras de acuerdo con la invencion abarca todas las celulas del sistema inmune innato y adaptativo que median o participan activamente en las reacciones inmunes. La celula efectora se selecciona preferiblemente de linfocitos T, celulas NK, monocitos, macrofagos, celulas dendnticas y granulocitos. Particularmente preferidas son unidades de union que se unen a estructuras superficiales en linfocitos T.

Si un anticuerpo recombinante de acuerdo con la invencion contiene al menos dos anticuerpos diferentes (al menos un anticuerpo anti-PSCA de acuerdo con la invencion y al menos un anticuerpo adicional que no se une espedficamente a PSCA), entonces esto esta preferiblemente en forma de diacuerpo, triacuerpo o tetracuerpo. Se prefieren los anticuerpos biespedficos de anticuerpos de cadena simple (diacuerpo biespedfico de cadena simple, scBsDb) o anticuerpos tandem biespedficos de anticuerpos de cadena simple (anticuerpo tandem biespedfico de cadena simple, scBsTaFv). Se da preferencia muy particular a un anticuerpo recombinante de acuerdo con la invencion en forma de un scBsTaFv.

Los anticuerpos que no se unen a PSCA preferidos contenidos en un anticuerpo recombinante de la invencion (en cuyo caso el anticuerpo recombinante es un anticuerpo biespedfico) son anticuerpos que se unen espedficamente a una estructura de superficie de una celula efectora. En este caso, la unidad de union que no se une a PSCA contiene al menos el paratopo del anticuerpo que se une a una estructura superficial de una celula efectora. Se prefieren en especial los anticuerpos dirigidos contra las siguientes estructuras de superficie en celulas efectoras: CD3, CD8, CD4, CD25, CD28, CD16, NKG2D, NKp46, NKp44, receptores activantes de KIR (activating Killer Cell Immunoglobulin-like Receptors). Los mas preferidos son los anticuerpos dirigidos contra CD3 (anticuerpo anti-CD3), el anticuerpo anti-CD3 que contiene regiones CDR que tienen las siguientes secuencias de aminoacidos:

- CDR de la region variable de la cadena pesada: CDR1 SEQ ID NO. 66, CDR2 SEQ ID NO. 67, CDR3 SEQ ID NO.

68 y

- CDR de la region variable de la cadena liviana: CDR1 SEQ ID NO. 58, CDR2 SEQ ID NO. 59, CDR3 SEQ ID NO.

60.

Mas preferidos son los anticuerpos anti-PSCA recombinantes que contienen al menos dos unidades de union diferentes, en donde al menos una mas de las unidades de union es un ligando (preferiblemente una protema o un glicano) que se une espedficamente a una estructura de superficie en una celula efectora. Los ligandos preferidos influyen en la actividad de las celulas efectoras por su union a la superficie celular (efectora). El ligando se selecciona de modo que se una espedficamente a las estructuras superficiales de las celulas efectoras y dispara las cascadas de senalizacion para la activacion de las celulas efectoras. Se prefiere como ligando una estructura de protema o un glicano que se une espedficamente a un receptor que se expresa espedficamente en la superficie de las celulas efectoras, en donde el ligando provoca una activacion del efector por su union al receptor. Particularmente preferidas son las estructuras de protemas seleccionadas de ULB-Ps (por ejemplo, ULB-P2), MICA, MICB y citoquinas (tales como, por ejemplo, IL2 e IL15).

Los anticuerpos de acuerdo con la invencion, en particular los anticuerpos recombinantes de acuerdo con la invencion, son adecuados para la union espedfica a celulas positivas a PSCA in vivo e in vitro. Por lo tanto, la invencion tambien abarca el anticuerpo anti-PSCA de acuerdo con la invencion para usar como medicamento, en particular para el tratamiento de enfermedades tumorales, preferiblemente cancer de prostata, o como agente de diagnostico.

La invencion abarca ademas los anticuerpos de acuerdo con la invencion para la terapia de enfermedades tumorales, en particular cancer de prostata. Una aplicacion terapeutica preferida de los anticuerpos (preferiblemente recombinantes) de la invencion es el tratamiento de enfermedades tumorales, preferiblemente cancer de prostata. En la aplicacion terapeutica, los anticuerpos de acuerdo con la invencion se usan preferiblemente para dirigir sustancias terapeuticamente activas o celulas efectoras al tejido tumoral. Para dirigir sustancias terapeuticamente activas al tejido tumoral, se utilizan preferiblemente anticuerpos recombinantes de la invencion, que se conjugan con un ingrediente activo. Los anticuerpos recombinantes de acuerdo con la invencion que contienen al menos dos unidades de union diferentes se usan preferiblemente para dirigir celulas efectoras a tejido tumoral, en donde al menos una de las unidades de union es un anticuerpo anti-PSCA de acuerdo con la invencion y otra de las unidades de union se une espedficamente a una celula efectora, preferiblemente a CD3 en celulas T, Preferiblemente, los anticuerpos mencionados anteriormente se usan para este proposito.

La invencion tambien abarca una composicion farmaceutica que contiene un anticuerpo de la invencion en asociacion con un diluyente o portador farmaceuticamente aceptable. Preferiblemente, la composicion farmaceutica de la invencion esta en una forma adecuada para administracion intravenosa.

Preferiblemente, los anticuerpos estan presentes en la composicion farmaceutica de la invencion en forma recombinante como anticuerpos quimericos o mas preferiblemente humanizados que tienen inmunogenicidad reducida.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion comprenden diversas formas de dosificacion y son preferiblemente adecuadas para administracion parenteral, mas preferiblemente para administracion intravenosa. Preferiblemente, la composicion farmaceutica parenteral esta en una forma de dosificacion adecuada para inyeccion. Las composiciones farmaceuticas particularmente preferidas son, por lo tanto, soluciones, emulsiones o suspensiones del anticuerpo en un diluyente o portador farmaceuticamente aceptable.

Los portadores farmaceuticamente aceptables son preferiblemente lfquidos esteriles, especialmente agua, agua tamponada, solucion salina al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. Las composiciones farmaceuticas se esterilizan mediante tecnicas convencionales bien conocidas. Las composiciones contienen preferiblemente excipientes farmaceuticamente aceptables, tales como los necesarios para proporcionar aproximadamente condiciones fisiologicas y/o aumentar la estabilidad de los anticuerpos contenidos en la composicion, tales como reguladores del pH y agentes tamponantes, agentes reguladores de la toxicidad y similares, preferiblemente seleccionados de entre acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio y lactato de sodio.

Preferiblemente, la composicion farmaceutica es una solucion tamponada inyectable que contiene entre 0,1 y 500 mg/ml de anticuerpo, mas preferiblemente entre 0,1 y 250 mg/ml de anticuerpo, especialmente junto con 1 a 500 mmol/l de tampon. La solucion inyectable esta preferiblemente en forma de dosificacion lfquida o liofilizada. El tampon se selecciona preferiblemente de histidina, succinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio y fosfato de potasio.

Una composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion contiene preferiblemente al menos dos anticuerpos diferentes (preferiblemente recombinantes), en donde esta contenido al menos un anticuerpo anti-PSCA de acuerdo con la invencion y al menos un anticuerpo recombinante adicional que se une especfficamente con el anticuerpo anti-PSCA de acuerdo con la invencion. Particularmente preferidas son las siguientes combinaciones:

a) un anticuerpo anti-PSCA recombinante conjugado con un peptido de 10 a 50 aminoacidos de largo y otro anticuerpo recombinante que se une especfficamente al peptido o

b) un anticuerpo anti-PSCA biespecffico que adicionalmente contiene un anticuerpo que se une a un peptido de 10 a 50 aminoacidos de largo y otro anticuerpo recombinante que se une a un antfgeno distinto del PSCA y que contiene un peptido al que se une el anticuerpo anti-PSCA biespecffico.

Los al menos dos anticuerpos diferentes estan presentes preferiblemente empaquetados por separado en la composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion.

Una composicion farmaceutica preferida que contiene la combinacion definida en a) comprende:

- Un anticuerpo anti-PSCA recombinante conjugado a un peptido que contiene una secuencia de aminoacidos de 10 a 50 aminoacidos de largo de una region alfa-helicoidal de la protefna La humana (la secuencia de aminoacidos de la protefna La humana corresponde a la SEQ ID NO: 77). Preferiblemente, el anticuerpo anti-PSCA esta conjugado con un peptido que tiene una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, particularmente preferiblemente al menos el 99% con respecto a una de las secuencias de aminoacidos de acuerdo con SEQ ID NO. 75 o SEQ ID NO. 76.

- Un anticuerpo adicional (preferiblemente recombinante) que contiene un paratopo que se une especfficamente al peptido del anticuerpo anti-PSCA y que contiene una unidad de union adicional que se une especfficamente a una estructura de superficie de una celula efectora. Las unidades de union preferidas corresponden a las definidas anteriormente. En el caso de que el anticuerpo anti-PSCA recombinante este conjugado con un peptido tenga una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos el 90%, preferiblemente de al menos el 95%, con preferencia particular, de al menos el 99% con respecto a una de las secuencias de aminoacidos de acuerdo con la SEQ ID NO.

75 o SEQ ID NO. 76, el anticuerpo recombinante adicional, preferiblemente como un paratopo, que se une al peptido contiene las siguientes secuencias de aminoacidos:

o CDR de la region variable de la cadena liviana: CDR1 SEQ ID NO. 78, CDR2 SEQ ID NO. 79, CDR3 SEQ ID NO. 80 y CDR de la region variable de la cadena pesada: CDR1 SEQ ID NO. 81, CDR2 SEQ ID NO. 82, CDR3 SEQ ID NO. 83 (en este caso, tambien denominado como paratopo "5B9") o

o CDR de la region variable de la cadena liviana: CDR1 SEQ ID NO. 84, CDR2 SEQ ID NO. 85, CDR3 SEQ ID NO. 86 y CDR de la region variable de la cadena pesada: CDR1 SEQ ID NO. 87, CDR2 SEQ ID NO. 88, CDR3 SEQ ID NO. 89 (en este caso, tambien denominado como paratopo "7B6").

De ellas, son combinaciones preferidas

- un anticuerpo anti-PSCA que contiene un peptido que tiene una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, mas preferiblemente al menos el 99% con una de las secuencias de aminoacidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 75 con otro anticuerpo que contiene el paratopo 5B9 o

- un anticuerpo anti-PSCA que contiene un peptido que tiene una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, mas preferiblemente al menos el 99% con una de las secuencias de aminoacidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 76 con otro anticuerpo que contiene el paratopo 7B6.

Una composicion farmaceutica preferida que contiene la combinacion definida en b) comprende:

- Un anticuerpo adicional que se une especfficamente a una estructura superficial de una celula efectora y que contiene una secuencia de aminoacidos de 10 a 50 aminoacidos de largo de una region alfa-helicoidal de la protefna La humana, preferiblemente un peptido que tiene una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, de manera particularmente preferible al menos el 99% de una de las secuencias de aminoacidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 75 o SEQ ID NO. 76.

- Un anticuerpo biespecffico anti-PSCA conjugado con un anticuerpo que se une especfficamente a la secuencia de aminoacidos de 10 a 50 aminoacidos de largo de una region alfa-helicoidal de la protefna La humana. En el caso de que el anticuerpo recombinante adicional contenga un peptido con una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, con preferencia particular al menos el 99% con una de las secuencias de aminoacidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 75 o SEQ ID NO. 76, el anticuerpo anti-PSCA biespecffico contiene preferiblemente un paratopo 5B9 o paratopo 7B6 como se definio anteriormente.

De ellas, son combinaciones preferidas

- un anticuerpo anti-PSCA biespecffico que contiene el paratopo 5B9 y otro anticuerpo recombinante que contiene un peptido con una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, mas preferiblemente al menos el 99% con una de las secuencias de aminoacidos segun la SEQ ID NO. 75 o - un anticuerpo anti-PSCA biespecffico que contiene el paratopo 7B6 y otro anticuerpo recombinante que comprende un peptido que tiene una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, mas preferiblemente al menos el 99% con una de las secuencias de aminoacidos segun la SEQ ID NO. 76. Una aplicacion de diagnostico preferida es el diagnostico in vivo en el que se usa un anticuerpo anti-PSCA conjugado con agente de contraste de la invencion para el transporte dirigido de agentes de contraste al tejido tumoral. Una aplicacion diagnostica preferida adicional de los anticuerpos anti-PSCA segun la invencion es el diagnostico in vitro, prefiriendose el uso de un anticuerpo anti-PSCA de la invencion conjugado con colorante para detectar celulas positivas a PSCA en una muestra, en particular en una muestra de tejido.

La invencion tambien abarca una composicion de diagnostico que contiene un anticuerpo anti-PSCA de acuerdo con la invencion. El anticuerpo anti-PSCA esta presente preferiblemente en una solucion tamponante, preferiblemente en solucion salina tamponada.

La invencion tambien abarca un acido nucleico cuya secuencia de nucleotidos codifica un anticuerpo anti-PSCA de acuerdo con la invencion. Preferiblemente, las secciones que codifican la CDR de las regiones variables de la cadena liviana y pesada contienen las siguientes secuencias de nucleotidos:

- CDR de la region variable de la cadena liviana: CDR1 SEQ ID NO. 7, CDR2 SEQ ID NO. 9, CDR3 SEQ ID NO. 11 y CDR de la region variable de la cadena pesada: CDR1 SEQ ID NO. 13, CDR2 SEQ ID NO. 15, CDR3 SEQ ID NO.

17 o

- CDR de la region variable de la cadena liviana: CDR1 SEQ ID NO. 8, CDR2 SEQ ID NO. 10, CDR3 SEQ ID NO. 12 y CDR de la region variable de la cadena pesada: CDR1 SEQ ID NO. 14, CDR2 SEQ ID NO. 16, CDR3 SEQ ID NO.

18.

La expresion "acidos nucleicos" en el sentido de la invencion, ademas de los acidos desoxirribonucleicos (ADN) y los acidos ribonucleicos (ARN), tambien incluye todos los demas polfmeros lineales en los cuales las bases adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T) o uracilo (U) estan dispuestas en una secuencia correspondiente (secuencia de acido nucleico). La invencion tambien abarca las secuencias de ARN correspondientes (en las que la timina se reemplaza por uracilo), secuencias complementarias y secuencias con esqueleto de acido nucleico modificado o el termino 3' o 5'. La expresion "secuencias de acido nucleico con esqueleto alterado" abarca todos los otros polfmeros lineales en los que las bases adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T) o uracilo (U) estan dispuestas en una secuencia correspondiente, tales como, por ejemplo, secuencias con un fosforotioato, fosforamidato o esqueleto derivatizado de O-metilo, acidos nucleicos peptfdicos (PNA) y acidos nucleicos bloqueados (LNA) o esqueletos mixtos. La expresion "termino 3' o 5' modificado” incluye tanto modificaciones que sirven para la estabilizacion como tambien la union de marcadores. Los ejemplos de marcadores son enzimas, colorantes o colorantes fluorescentes, radionucleotidos y haptenos, tales como, por ejemplo, digoxigenina o biotina.

La invencion tambien abarca un vector (tambien: "vector de expresion") que contiene un acido nucleico de acuerdo con la invencion. Para los fines de la invencion, un vector de expresion significa un plasmido, virus u otro portador que contiene una secuencia de acido nucleico de acuerdo con la invencion de forma recombinante por insercion o incorporacion. El vector de expresion contiene tfpicamente un origen de replicacion, un promotor, asf como secuencias genicas especfficas que permiten la seleccion fenotfpica de las celulas huesped que contienen vectores de expresion.

La invencion comprende ademas una celula huesped o un organismo huesped no humano que comprende una secuencia de nucleotidos de acuerdo con la invencion o un vector de acuerdo con la invencion. La secuencia de nucleotidos o el vector estan contenidos de forma recombinante en la celula huesped o en el organismo huesped no humano.

Una celula huesped segun la invencion es una celula natural o una lfnea celular transformada o modificada geneticamente que contiene al menos un vector segun la invencion. La invencion abarca transfectantes transitorios (por ejemplo, mediante inyeccion de ARNm) o celulas huesped en las que al menos un vector de expresion segun la invencion esta contenido como un plasmido o cromosoma artificial, asf como celulas huesped en las que un vector de expresion segun la invencion esta integrado de forma estable en el genoma del huesped.

La celula huesped se selecciona preferiblemente de celulas de procariotas y eucariotas. Las celulas madre embrionarias humanas obtenidas destruyendo embriones no son celulas huesped en el sentido de la invencion. Las celulas procarioticas preferidas se seleccionan de Escherichia coli y Bacillus subtilis. Las celulas eucariotas preferidas se seleccionan de celulas de levadura (preferiblemente Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris), celulas de insecto, celulas de anfibios y celulas de mamfferos (preferiblemente CHO, HeLa, HEK293).

Los organismos huesped no humanos contienen un vector de la invencion que esta integrado de manera estable en el genoma del organismo huesped o celulas individuales del organismo huesped. Los organismos huesped preferidos son plantas, invertebrados o vertebrados, en particular Bovidae, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Xenopus laevis, Medaka, Zebrafish o Mus musculus, o celulas o embriones de dichos organismos.

La invencion proporciona anticuerpos anti-PSCA y sistemas de expresion asociados, con los cuales el PSCA humano puede unirse de manera mas efectiva. Como resultado, el anticuerpo anti-PSCA de la invencion es particularmente adecuado para usar en sistemas terapeuticos en los que la destruccion de celulas tumorales puede estar mediada por el reclutamiento de celulas efectoras. Debido a la mayor afinidad del anticuerpo de acuerdo con la invencion por PSCA, solo se requiere una cantidad significativamente menor de anticuerpo para una union (por ejemplo, en uso terapeutico). Podrfa mostrarse que el anticuerpo anti-PSCA de acuerdo con la invencion puede mediar la lisis especffica de celulas tumorales positivas a PSCA en concentraciones significativamente mas bajas y con una eficiencia significativamente mayor. Por un lado, esto tiene ventajas de costo, ya que el consumo de anticuerpos puede reducirse. Por otro lado, en la aplicacion terapeutica, se espera una mejor seleccion de objetivos sobre todo de las celulas metastatizantes, asf como menos efectos secundarios debido a la menor cantidad utilizada.

Con referencia a las siguientes figuras y realizaciones, la invencion se explicara con mas detalle, sin limitar la invencion a estas.

Fig. 1 Representacion esquematica de diferentes anticuerpos recombinantes inventivos. A) Anticuerpo biespecffico en forma de scBsTaFv que contiene una unidad de union contra PSCA y una unidad de union contra CD3. B) Un anticuerpo recombinante contra PSCA que contiene una etiqueta peptfdica (5B9) de acuerdo con la invencion, para usar con el anticuerpo biespedfico tambien mostrado en forma de scBsTaFv que contiene una unidad de union contra CD3 y una unidad de union contra la region 5B9 de la protema La humana. C) Anticuerpo recombinante contra PSCA que contiene una etiqueta peptfdica (7B6) de acuerdo con la invencion, para uso con el anticuerpo biespedfico que tambien se muestra en forma de scBsTaFv que contiene una unidad de union contra CD3 y una unidad de union contra la region 7B6 de la protema La humana. Las respectivas subunidades VH y VL estan unidas a traves de los peptidos enlazadores a las secuencias de aminoacidos que se indican en las figuras.

Fig. 2 anticuerpo recombinante segun SDS-PAGE. Carril 1: anticuerpo humanizado biespedfico CD3-7B6 (scBsTaFv CD3-7B6); carril 2: anticuerpo humanizado biespedfico CD3-5B9 (scBsTaFv CD3 (G4S)-5B9); carril 3: anticuerpo murino biespedfico de la invencion CD3-PSCA (7F5) (scBsTaFv CD3-PSCA (7F5)); carril 4: anticuerpo humanizado monoespedfico scFv PSCA (MB1)-7B6 segun la invencion; carril 5: anticuerpo humanizado biespedfico CD3-PSCA (MB1) (scBsTaFv CD3-PSCA (^mBⁱ)); carril 6: anticuerpo humanizado monoespedfico scFv PSCA (MB1)-5B9 de acuerdo con la invencion. M... marcadores con tamanos de fragmentos (de arriba a abajo): 70 kDa, 55 kDa, 40 kDa, 35 kDa, 25 kDa, 15 kDa.

Fig. 3 celulas tumorales PC3-PSCA cargadas con Lyse51Cr espedficas en un experimento de acuerdo con el Ejemplo 4. Las barras corresponden a los siguientes experimentos: 1 (negro) ... scBsTaFv CD3-PSCA biespedfico humanizado (MB1) de la realizacion 1; 2 (blanco) ... scBsTaFv CD3-PSCA biespedfico murino (MB1) de la realizacion 1; 3 (rayado) ... scBsTaFv CD3-PSCA humanizado biespedfico (7F5) (ejemplo comparativo); 4 (punteado) ... scBsTaFv CD3-PSCA biespedfico murino (7F5) (ejemplo comparativo)..

Fig. 4 Area tumoral formada despues de la transferencia de celulas tumorales positivas a PSCA, celulas T y anticuerpos como se describe en el Ejemplo 5. A) Relacion objetivo-efector 1:1; B) Relacion efector-objetivo 10:1. Las lmeas numeradas corresponden a los siguientes experimentos: 1 ... anticuerpo de control biespedfico anti-CD3xanti-5B9 (control); 2 ... scFv anti-PSCA(MB1) humanizado monoespedfico del ejemplo de realizacion 1 (control); 3 ... ensayo de control sin anticuerpo (control negativo); 4 ... scBsTaFv CD3-PSCA(MB1) humanizado biespedfico del ejemplo de realizacion 1 (segun la invencion); 5 ... scBsTaFv CD3-PSCA(7F5) humanizado biespedfico como se describe en el Ejemplo 3 (ejemplo comparativo); 6 ... scBsDb CD3xPSCA(7F5) humanizado biespedfico que contiene regiones variables de union a PSCA del anticuerpo 7F5 (ejemplo comparativo).

Ejemplo de realizacion 1: Preparacion de anticuerpos recombinantes biespecfficos (scBsTaFv) que se unen especfficamente a PSCA (direccionamiento directo)

Con el proposito de dirigirse a las celulas PSCA+, se preparo un anticuerpo biespedfico (diacuerpo biespedfico de cadena simple, scBsTaFv) que se une al PSCA con una unidad de union y a ^cD3 con la otra unidad de union. El anticuerpo biespedfico tambien se denomina aqrn mas simplemente como CD3-PSCA(MB1) y se muestra esquematicamente en la Figura 1A.

El dominio de union a PSCA que contiene la region variable del anticuerpo anti-PSCA MB1 de la invencion (anticuerpo murino anti-PSCA: cadena pesada SEQ ID NO: 22, cadena liviana SEQ ID NO: 20, anticuerpo anti-PSCA humanizado: cadena pesada SEQ ID NO 26, cadena liviana SEQ ID NO 24). Sirve para unirse a las celulas tumorales positivas a PSCA. El otro dominio se une a CD3, un componente del complejo receptor de celulas T, y sirve para activar las celulas T. Esto permite el reclutamiento de celulas T en las celulas positivas a PSCA, mediando asf la lisis espedfica de las celulas positivas a PSCA por parte de las celulas T.

Para la generacion de anticuerpos monoclonales anti-PSCA MB1, se inmunizaron ratones H-2d C3Hx Balb/cF1 positivos con celulas P815 que expresaban PSCA recombinantemente en la superficie. Por fusion de celulas de bazo y celulas de mieloma se produjeron celulas de hibridoma que secretan anticuerpos monoclonales anti-PSCA. Despues de la clonacion de celulas individuales de estas celulas de hibridoma, se pudo seleccionar el clon MB1. Para la generacion de anticuerpos MB1 anti-PSCA recombinantes, se identificaron las secuencias de acido nucleico del dominio variable de la cadena de anticuerpos pesada (V^h) y liviana (V^l). Primero, se aislo el ARNm de las celulas de hibridoma secretoras de MB1 anti-PSCA y se transcribio en ADNc. Posteriormente, el dominio variable de la cadena pesada del isotipo IgG1 se amplifico con cebadores degenerados (par de cebadores SEQ ID NOs: 90 y 91) y el dominio variable de la cadena liviana ^kusando cebadores degenerados (par de cebadores SEQ ID NOs: 92 y 93). Los productos de la PCR se subclonaron cada uno en el vector pGEM T-easy y se secuenciaron.

Para la clonacion del fragmento murino de una sola cadena (scFv) del anticuerpo anti-PSCA MB1 (denominado en este documento "scFv MB1") en el que la region variable de la cadena pesada esta unida a traves de tres enlazadores de glicina-serina (G4S, SEQ ID NO. 131) vinculada a la variable de la region de la cadena liviana, la secuencia de acidos nucleicos de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo MB1 anti-PSCA se amplified con ayuda del par de cebadores de acuerdo con la SEQ ID NO. 94 y 95. La secuencia de acidos nucleicos de la region variable de la cadena liviana del anticuerpo MB1 anti-PSCA se amplifico con ayuda del par de cebadores de acuerdo con la SEQ ID NO. 96 y 97. Los acidos nucleicos amplificados se fusionaron mediante PCR superpuesta al scFv PSCA MB1 y se clonaron a traves de Sfil y Notl en el vector de expresion eucariotico pSecTag2B (el vector de expresion tambien se conoce aquf como "pSecTag2B_scFv MB1 murino").

Para la clonacion del anticuerpo en tandem biespecffico (scBsTaFv), que esta dirigido contra PSCA y CD3 y que contiene las regiones CDR del anticuerpo MB1 murino, se amplifico la secuencia de acido nucleico de un scFv anti -CD3 murino con un par de cebadores de acuerdo con la SEQ ID NO. 98 y 99 y se clono a traves del lado 3' Apal del scFv MB1 murino en el vector de expresion previamente producido "pSecTag2B_scFv MB1 murino", de modo que se creo el vector "pSecTag2B_ scBsTaFv PSCA (MB1)-CD3 murino".

Para la clonacion del anticuerpo tandem biespecffico (scBsTaFv), que se dirige contra PSCA y CD3 y que contiene las regiones CDR del anticuerpo MB1 humanizado, se humanizaron las regiones marco (FWR) de los anticuerpos PSCA MB1 y CD3. Para hacer esto, los FWR de los dominios de anticuerpos murinos variables se reemplazaron con las secuencias FWR humanas de una IgG1 humana altamente homologa. Ademas, las secuencias de anticuerpos humanizados se optimizaron para su expresion y secrecion por lfneas celulares humanas. Para la humanizacion de scFv CD3 murino o scFv MB1, primero las secuencias Vh y Vl humanizadas se amplificaron individualmente como se describio con anterioridad y luego se unieron por PCR. La humanizacion de la secuencia de V^ho V^lse llevo a cabo mediante el ensamblaje de oligonucleotidos superpuestos y la posterior amplificacion de la secuencia de acido nucleico de Vh o Vl humanizada. Para poder determinar las secuencias de los oligonucleotidos superpuestos, la secuencia Vh o Vl murina se alineo primero contra una base de datos de IgG humana (NCBI IgBlast), que identifica la IgG humana con la mayor homologfa y, en ultima instancia, crea la secuencia Vh o Vl humanizada teoricamente y sintetiza los oligonucleotidos superpuestos. Se construyeron varios anticuerpos biespecfficos utilizando peptidos enlazadores de diferentes longitudes.

Humanizacion del anticuerpo anti-CD3

Para la humanizacion de la region variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CD3, se reunieron los oligonucleotidos de acuerdo con SEQ ID NO. 100 a 105. Posteriormente, la secuencia de acido nucleico humanizado de la region variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CD3 (con un peptido enlazador G4S, SEQ ID NO: 132) se amplifico utilizando el par de cebadores de acuerdo con la SEQ ID NO. 105 y 106. Para la humanizacion de la region variable de cadena liviana del anticuerpo anti-CD3, se reunieron oligonucleotidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 107 a 112. La secuencia de acidos nucleicos humanizada de la region variable de cadena liviana del anticuerpo anti-CD3 se amplifico con el par de cebadores de acuerdo con la SEQ ID NO. 112 y 113.

Para la generacion del scFv humanizado del anticuerpo anti-CD3, en el que la region variable de la cadena pesada a traves de un enlace glicina-serina (G4S) esta vinculada a la region variable de la cadena liviana, primero se clono la secuencia de acidos nucleicos humanizados de la region variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CD3 a traves de SfiI y BamHI se clono en el vector de expresion pSecTag2B y luego se coloco a traves de BamHI y Notl la secuencia de acidos nucleicos humanizados de la region variable de cadena liviana del anticuerpo anti-CD3 corriente abajo en el mismo vector de expresion.

Para la generacion del scFv humanizado del anticuerpo anti-CD3, en la cual la region variable de la cadena pesada esta unida a traves del enlazador de glicina-serina (G⁴S) con la region variable de la cadena liviana, se preparo primero la secuencia de acidos nucleicos humanizados de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD3 con tres enlazadores de glicina-serina (G⁴S). Para este proposito, se amplifico la secuencia de acidos nucleicos humanizados de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD3 (con tres peptidos enlazadores G⁴S) con ayuda del par de cebadores de acuerdo con la SEQ ID NO. 105 y 114 y se clono a traves de SfiI y BamHI en el vector de expresion pSecTag2B y luego se coloco a traves de BamHI y Notl la secuencia de acidos nucleicos humanizados de la region variable de la cadena liviana del anticuerpo anti-CD3 corriente abajo en el mismo vector de expresion.

Humanizacion del anticuerpo anti-PSCA MB1

Para la humanizacion de la region variable de la cadena liviana del anticuerpo anti-PSCA MB1 se reunieron oligonucleotidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 115 a 118. La secuencia de acidos nucleicos humanizados de la region variable de la cadena liviana del anticuerpo anti-PSCA MB1 se amplified con el par de cebadores de acuerdo con la SEQ ID NO. 119 y 120.

Para la humanizacion de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-PSCA MB1 se reunieron oligonucleotidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 121 a 125. La secuencia de acidos nucleicos humanizados de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-PSCA MB1 se amplifico con el par de cebadores de acuerdo con la SEQ ID NO. 126 y 127.

Preparacion del anticuerpo humanizado biespecifico scBsTaFv CD3-PSCA(MB1)

Finalmente, las secuencias de acidos nucleicos humanizados de la region variable de la cadena pesada y de la region variable de la cadena liviana del anticuerpo MB1 se reunieron mediante PCR de superposicion usando los cebadores de acuerdo con la SEQ ID NO. 128 y 129 y se amplificaron. La secuencia de acido nucleico asf generada que codifica el scFv MB1 humanizado (en la organizacion V^L-G⁴SG⁴SGASAAG⁴SG⁴S-V^H, peptido enlazador segun la SEQ ID NO: 130) se clono mediante XhoI y ApaI corriente abajo del scFv humanizado con anticuerpo anti-CD3 descrito anteriormente (con tres peptidos enlazadores de G⁴S), por lo que se genero el vector de expresion "pSecTag2B_ scBsTaFv PSCA(MB1 )-CD3 humano".

Para la expresion del anticuerpo humanizado biespecifico segun la Figura 1A, las celulas Hek293T se transfectaron con el vector de expresion y los anticuerpos secretados se purificaron de los sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatograffa por afinidad de nfquel, opcionalmente en combinacion con una precipitacion de sulfato de amonio fraccionado. La Fig. 2, carril 5, muestra un registro de electroforesis en gel SDS del anticuerpo biespecifico purificado.

Ejemplo de realizacion 2: preparacion de anticuerpos recombinantes biespecfficos que se unen especfficamente con PSCA (direccionamiento modular)

Para proporcionar una composicion farmaceutica segun la invencion ("modulares Targeting System 1", representado esquematicamente en la Fig. 1B), se prepararon los sgs anticuerpos recombinantes:

- anticuerpo anti-PSCA recombinante segun la invencion que contiene un peptido de acuerdo con la SEQ ID NO. 75 (aquf tambien "E5B9"). Este anticuerpo se denomina a continuacion scFv PSCA(MB1)-E5B9.

- anticuerpo biespecifico (scBsTaFv), que esta dirigido contra CD3 y el peptido de acuerdo con la SEQ ID NO. 75. El paratopo dirigido contra CD3 comprende las siguientes secuencias de aminoacidos de las regiones variables: cadena pesada SEQ ID NO. 65, cadena liviana SEQ ID NO. 57. El paratopo dirigido contra el peptido de acuerdo con la SEQ ID NO. 75 comprende las siguientes secuencias de aminoacidos de las regiones variables: cadena liviana CDR1 SEQ ID NO. 78, CDR2 SEQ ID NO. 79, CDR3 SEQ ID NO. 80, cadena pesada CDR1 SEQ ID NO. 81, CDR2 SEQ ID NO. 82, CDR3 SEQ ID NO. 83. Este anticuerpo se denomina a continuacion scBsTaFv CD3-5B9. Se prepararon dos diferentes scBsTaFv CD3-5B9, que se distinguen entre si unicamente en el peptido de enlazador entre VH y VL del anticuerpo anti-CD3 (ver la Fig. 1B).

Clonacion del scFv PSCA(MB1)-E5B9 humanizado:

Para la generacion del scFv PSCA(MB1) humanizado con el epitope E5B9 en el termino C (MB1 [Vl-G⁴SG⁴SGASAAG⁴SG⁴S-MB1 V^h]-[G4S-E5B9], representado en la Fig. 1B abajo), se amplifico el scFv PSCA(MB1) humanizado descrito en el Ejemplo de realizacion 1 (MB1 V^L-G⁴SG⁴SGASAAG⁴SG⁴S-MB1 V^H-G⁴S, peptidos enlazadores de acuerdo con la SeQ ID NO. 130 y 132) por medio del cebador de acuerdo con la SEQ ID NO. 134 y 135 y luego se clono por SfiI y Notl en pSecTag2B. Despues del ensamblaje de los oligonucleotidos de acuerdo con la ^sE^qID NO. 136 y 137, se clono la secuencia de acidos nucleicos para E5B9 a traves de Notl y XhoI del lado 3' del scFv PSCA(MB1) humanizado, produciendose el constructo "pSecTag2B_ scFv PSCA(MB1)-E5B9 humanizado". Clonacion de dos modulos efectos que se unen con celulas T y con el peptido E5B9 "scBsTaFv CD3(G⁴S)-5B9" y "scBsTaFv CD3(3xG⁴S)-5B9"

Como se representa esquematicamente en la Fig. 1B, se prepararon para la estructuracion del sistema de direccionamiento modular I que comprende el scFv PSCA(MB1)-5B9 dos llamados modulos efectores (anticuerpos biespecfficos scBsTaFv CD3-5B9), que se distinguen en la cantidad de los elementos de glicina-serina (G⁴S) del peptido enlazador entre la cadena Vh y Vl del dominio anti-CD3 y, por ello, se designaron como "scBsTaFv c D3(G4S)-5B9" o bien "scBsTaFv CD3(3xG⁴S)-5B9".

- Clonacion de "scBsTaFv CD3(G4S)-5B9" humanizado (para el esquema, ver la Fig. 1B anterior):

Para la humanizacion de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 5B9 (espedficamente dirigido contra el peptido E5B9), se reunieron oligonucleotidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 138 a 142. Luego se amplifico la secuencia de acidos nucleicos humanizados de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 5B9 (con un peptido enlazador G4S, SEQ ID NO. 132) con ayuda del par de cebadores de acuerdo con la SEQ ID NO. 143 y 144. Para la humanizacion de la region variable de la cadena liviana del anticuerpo 5B9, se reunieron los oligonucleotidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 145 a 149. La secuencia de acidos nucleicos humanizados de la region variable de la cadena liviana del anticuerpo 5B9 se amplifico con el par de cebadores de acuerdo con la SEQ ID NO. 150 y 151. Finalmente, se reunieron las secuencias de acidos nucleicos humanizados para 5B9 V^hy 5B9 V^lpor medio de PCR de superposicion usando el cebador de acuerdo con la SEQ ID NO. 152 y 153 y se amplificaron. La secuencia de acidos nucleicos asf generada para el scFv 5B9 humanizado (V^h-3^xG4S-V^l) se clono a traves de Xhol y ApaI corriente abajo del scFv CD3 Vh-G4S-Vl humanizado en el "pSecTag2B_scFv CD3 Vh-G4S-Vl" humanizado, produciendose el vector "pSecTag2B_scBsTaFv CD3(G4S)-5B9 humanizado".

- Clonacion del "scBsTaFv CD3(3xG4S)-5B9" humanizado (para el esquema, ver la Fig. 1B centro):

La secuencia humanizada para scFv 5B9 (Vh-3xG4S-Vl) se clono a traves de Xhol y ApaI corriente abajo de scFv CD3 humanizado (V^h-3^xG4S-V^l) en el "pSecTag2B_scFv CD3 V^h-3^xG4S-V^l" humanizado, produciendose el vector "pSecTag2B_scBsTaFv CD3(3^xG4S)-5B9 humanizado".

Para proporcionar una composicion farmaceutica segun la invencion ("modulares Targeting System 2", representado esquematicamente en la Fig. 1C), se prepararon los siguientes anticuerpos recombinantes:

- anticuerpo anti-PSCA recombinante segun la invencion que contiene un peptido de acuerdo con la SEQ ID NO. 76 (aqrn tambien denominado "E7B6"). Este anticuerpo se denomina a continuacion scFv PSCA(MB1)-E7B6.

- anticuerpo biespedfico (scBsTaFv), que esta dirigido contra CD3 y el peptido de acuerdo con la SEQ ID NO. 76. El paratopo dirigido contra CD3 comprende las siguientes secuencias de aminoacidos de las regiones variables: cadena pesada SEQ ID NO. 65, cadena liviana SEQ ID NO. 57. El paratopo dirigido contra el peptido de acuerdo con la SEQ ID NO. 76 comprende las siguientes secuencias de aminoacidos de las regiones hipervariables de las regiones variables: cadena liviana CDR1 SEQ ID NO. 84, CDR2 SEQ ID NO. 85, CDR3 SEQ ID NO. 86, cadena pesada CDR1 SEQ ID NO. 87, CDR2 SEQ ID NO. 88, CDR3 SEQ ID NO. 89. Este anticuerpo se designa a continuacion como scBsTaFv CD3-7B6.

Clonacion del scFv PSCA(MB1)-E7B6 humanizado:

Para la generacion del scFv PSCA(MB1) humanizado con el epitope E7B6 en el termino C MB1 [VL-G4SG4SGASAAG4SG4S-MB1 Vh]-[G4S-E7B6], representado en la Fig. 1C abajo), primero se llevo a cabo el ensamblaje de los oligonucleotidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 154 y 155 y luego la clonacion de la secuencia de acidos nucleicos E7B6 a traves de Notl y XhoI del lado 3' en "pSecTag2B_ scFv PSCA(MB1) humanizado" (V^l-G4SG4SGASAAG4SG4S-VH-G4S, analogamente al constructo arriba descrito con el peptido E5B9), produciendose el vector "pSecTag2B_ scFv PSCA(MB1 )-E7B6 humanizado".

Clonacion de un modulo efecto que se une a celulas T y al peptido E7B6 "scBsTaFv CD3(3^xG4S)-7B6" humanizado: Para la humanizacion de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 7B6 (espedficamente dirigido contra el peptido E7B6), se reunieron oligonucleotidos superpuestos de acuerdo con la SEQ ID NO. 156 y 160. Luego se amplifico la secuencia de acidos nucleicos humanizados de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 7B6 (con un peptido enlazador de G4S, SEQ ID NO. 132) con ayuda de un par de cebadores de acuerdo con la s Eq ID NO. 161 y 162. Para la humanizacion de la region variable de la cadena liviana del anticuerpo 7B6, se reunieron oligonucleotidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 163 a 167. La secuencia de acidos nucleicos humanizados de la region variable de la cadena liviana del anticuerpo 7B6 se amplifico con el par de cebadores de acuerdo con la SEQ ID NO. 168 y 169.

Finalmente, se reunieron y amplificaron las secuencias de acidos nucleicos humanizados para 7B6 V^hy 7B6 V^lpor medio de PCR de superposicion usando el cebador de acuerdo con la SEQ ID NO. 170 y 171. La secuencia de acidos nucleicos asf generada para scFv 7B6 humanizado (Vh-3xG4S-Vl) se clono a traves de Xhol y ApaI corriente abajo del scFv CD3 V^h-G4S-V^lhumanizado en el "pSecTag2B_scFv CD3 V^h-G4S-V^l" humanizado, produciendose el vector "pSecTag2B_scBsTaFv CD3(G4S)-7B6 humanizado".

Para la expresion de las distintas protefnas de fusion de los sistemas de direccionamiento modular 1 y 2, se transfectaron celulas Hek293T con los vectores de expresion y scFv (scFv PSCA-E5B9 o scFv PSCA-E7B6) recombinantes secretados y los anticuerpos biespecfficos (scBsTaFv CD3(G4S)-5B9 o bien scBsTaFv CD3(3xG4S)-5B9 y scBsTaFv CD3-7B6) se purificaron del sobrenadante del cultivo celular con ayuda de cromatograffa por afinidad sobre Ni-NTA Agarosa (Qiagen, Hilden, Alemania) (opcionalmente en combinacion por medio de una precipitacion de sulfato de amonio fraccionado). Por SDS-Page e Immunoblot se comprobaron la pureza y la estabilidad de los derivados de anticuerpos recombinantes (Fig. 2)

Ejemplo de realizacion 3: Determinacion de la constante de disociacion de union a PSCA

La determinacion de la constante de afinidad para el dominio anti-PSCA respectivo de los anticuerpos biespecfficos recombinantes con el anticuerpo anti-PSCA MB1 (segun la invencion) y el anticuerpo anti-PSCA 7F5 (ejemplo comparativo, anticuerpo de [Feldmann 2010]) se baso en un analisis de citometrfa de flujo de la union con celulas PC3 positivas a PSCA.

Para la generacion de las curvas de union de los dominios de anticuerpos anti-PSCA recombinantes se incubaron en cada caso 2x105 celulas positivas a PSCA con 100 pl de los anticuerpos biespecfficos (MB1 y 7F5) durante 1 h a 4 °C. Los anticuerpos se usaron en cada caso en las siguientes concentraciones:

Cantidad de anticuerpo por preparacion en ng_____ Concentracion de anticuerpo en pmol/l

1000 90000

100 9000

50 4500

10 900

5 450

1 90

0,5 45

0,1 9

0,05 4,5

0,01 0,9

0,001 0,09

Para detectar la union especffica de los anticuerpos CD3-PSCA recombinantes, se uso un anticuerpo de deteccion de IgG-FITC anti-c-myc de raton (AbD Serotec, Dusseldorf, Alemania), que despues de completar la primera etapa de tincion durante 30 min a 4 °C se incubaron con celulas positivas a PSCA marcadas con anticuerpos anti-PSCA. Como control negativo, se llevo una muestra en la que las celulas positivas a PSCA se tineron solo con el anticuerpo de deteccion anti-c-myc IgG-FITC de raton. Las celulas se analizaron en un citometro de flujo Calibur BD FACS ^{( B d}Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Alemania) y los datos se evaluaron utilizando el software WinMDI 2.8 (Joseph Trotter, La Jolla, CA, EE. UU.).

Para la evaluacion, los valores de MFI determinados (valores medios de intensidad de fluorescencia) se representaron en funcion de las concentraciones de anticuerpos analizadas y, en cada caso, se calculo una lfnea de tendencia del tipo de regresion polinomica de segundo orden. Para encontrar la constante de afinidad, se calculo e inserto un tipo de lfnea de tendencia de tipo de regresion polinomial. La curva de union resultante sirvio como base para el calculo de la constante de afinidad KD, que se define como la concentracion alcanzada en el valor del 50% del valor maximo de MFI y, por lo tanto, en la mitad de la saturacion maxima de la union. Para calcular esta constante, se formo por primera vez la primera derivada de la curva de enlace, que sigue una funcion cuadratica. Para determinar el maximo de la funcion sobre la base de esta ecuacion, la primera derivada "cero" se establecio y resolvio en x. Al sustituir el valor de x obtenido en la ecuacion inicial, se calculo el maximo de la funcion ymax y, por lo tanto, ymax/2, que corresponde al valor de MFI a la mitad de la maxima saturacion de los sitios de union. Como el valor de KD corresponde al valor de x en ymax/2, esto se puede calcular finalmente insertando el valor de ymax/2 en la funcion cuadratica de la curva de enlace y cambiando la ecuacion a x.

Se determinaron los siguientes valores ^Kd de este modo para la union con PSCA:

Con ello, se pudo mostrar que la afinidad del anticuerpo anti-PSCA segun la invencion con el antfgeno PSCA es un orden de magnitud mayor que aquel del anticuerpo 7F5 conocido del estado de la tecnica.

Ejemplo de realizacion 4: lisis especffica de celulas PSCA+ con anticuerpos biespecfficos anti-PSCA En el ensayo de liberacion de cromo, las PBMC preactivadas 5x104 se cocultivaron con 5x103 celulas tumorales PC3-PSCA cargadas con 51Cr (relacion objetivo-efector = 10:1) en presencia y ausencia de los anticuerpos recombinantes en medio RPMI en un volumen total de 200 pl. Para este proposito, se usaron los anticuerpos de acuerdo con la invencion del Ejemplo 1 (tanto en forma murina como humanizada). Como ejemplo comparativo, el anticuerpo anti-PSCA (7F5) murino conocido de la tecnica anterior se uso en un anticuerpo biespecffico construido de manera similar. Las regiones variables del anticuerpo 7F5 corresponden a: la cadena pesada SEQ ID NO. 48, cadena liviana SEQ ID NO. 50. Los experimentos se llevaron a cabo con las siguientes construcciones de anticuerpos especfficos:

1. scBsTaFv CD3-PSCA(MB1) biespecffico humanizado del Ejemplo de realizacion 1

2. scBsTaFv CD3-PSCA(MB1) biespecffico murino del Ejemplo de realizacion 1

3. scBsTaFv CD3-PSCA(7F5) biespecffico humanizado (ejemplo comparativo)

4. scBsTaFv CD3-PSCA(7F5) biespecffico humano (ejemplo comparativo)

Despues de la incubacion durante 20 horas a 37 °C en la incubadora, se midio el cromo liberado en el medio. La lisis especffica se calculo como sigue:

Lisis especffica en % [51Cr liberado - 51Cr liberado espontaneamente (mfnimo)]/ (51Cr liberado maximo (maximo) -mfnimo] x 100%

Los resultados del experimento in vitro se muestran graficamente en la FIG. 3. Se muestra el porcentaje de celulas PC3 lisadas en el total de celulas PC3 utilizadas (eje y). Mientras que los anticuerpos de acuerdo con la invencion de los grupos experimentales 1 y 2 ya muestran una fuerte lisis de las celulas positivas a PSCA en cantidades menores a 1 ng, en el anticuerpo 7F5 conocido en un constructo comparable (grupos de prueba 3 y 4) se ha de determina una lisis solo cuando se usan varios ng del anticuerpo. A lo sumo, se encontro una lisis de aproximadamente el 60% de las celulas PC3 utilizadas. Con los anticuerpos de acuerdo con la invencion, ya se pudo detectar una lisis de aproximadamente el 80% de las celulas PC3 utilizadas cuando se usa una cantidad significativamente menor de anticuerpo. A lo sumo, mas del 90% de las celulas PC3 utilizadas podrfan lisarse con un anticuerpo de acuerdo con la invencion (grupo de prueba 1).

Ejemplo de realizacion 5: Inhibicion del crecimiento tumoral por scBsTaFv CD3-PSCA(MB1) humanizado in vivo

Para demostrar la eficacia del anticuerpo MB1 anti-PSCA de la invencion, se probo el efecto de un anticuerpo biespecffico scBsTaFv CD3-PSCA (MB1) derivado de un ejemplo de realizacion 1 (mostrado esquematicamente en la Fig. 1A, supra) en el modelo de tumor murino. Como organismo modelo, se usaron ratones desnudos, que forman tumores despues de la transferencia de celulas tumorales PC3 positivas a PSCA. En el experimento, las celulas tumorales positivas a PSCA se transfirieron en combinacion con celulas T y un anticuerpo.

Se utilizaron los siguientes anticuerpos, con 10 pg de anticuerpo inyectado por raton:

(1) Anticuerpo de control biespecffico anti-CD3xanti-5B9 (control)

(2) scFv anti-PSCA (MBl) humanizado monoespecffico del Ejemplo de realizacion 1 (control)

(3) Experimento de control sin anticuerpo (control negativo)

(4) scBsTaFv CD3-PSCA (MB1) humanizado del Ejemplo de realizacion 1

(5) scBsTaFv CD3-PSCA (7F5) humanizado como se describe en el ejemplo 3 (ejemplo comparativo)

(6) scBsDb CD3xPSCA (7F5) biespecffico humanizado que contiene las regiones variables de union a PSCA del anticuerpo 7F5 (Ejemplo comparativo)

El efecto de los anticuerpos biespecfficos se basa en el reclutamiento de las celulas T positivas a CD3 en las celulas

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une con antfgeno de celulas madre especffico de la prostata, en donde

5 - las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la region variable de la cadena liviana comprende las siguientes secuencias de aminoacidos: CDR1 SEQ ID NO. 1, CDR2 SEQ ID NO. 2, CDR3 SEQ ID NO. 3 y

- las CDR de la region variable de la cadena pesada comprenden las siguientes secuencias de aminoacidos: CDR1 SEQ ID NO. 4, CDR2 SEQ ID NO. 5, CDR3 SEQ ID NO. 6.

10

2. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 1, cuyas regiones variables presentan una secuencia de aminoacidos humanizada.

3. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, que comprende al menos dos unidades de union distintas, en 15 donde

- al menos una de las unidades de union se une con antfgeno de celulas madre especffico de la prostata y comprende las regiones determinantes de complementariedad definidas en la reivindicacion 1 y

20 - al menos otra de las unidades de union se une especfficamente con otro antfgeno distinto del antfgeno de celulas madre especffico de la prostata.

4. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde la unidad de union adicional se une especfficamente con la estructura de superficie en una celula efectora, en donde la unidad de union se selecciona preferiblemente de una 25 unidad de union de un anticuerpo o ligando que se une con la estructura de superficie de una celula efectora.

5. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde la celula efectora se selecciona de linfocitos T, celulas NK y monocitos, preferiblemente linfocitos T.

30 6. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde la unidad de union adicional se une especfficamente con un peptido de 10 a 50 aminoacidos de largo, preferiblemente un peptido con una secuencia de aminoacidos que equivale a una secuencia parcial de 10 a 50 aminoacidos de largo de la protefna La humana, con preferencia particular, un peptido con una de las secuencias de aminoacidos de acuerdo con la SEQ ID NO. 75 o SEQ ID NO.

76.

35

7. Anticuerpo de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 6 en forma de un diacuerpo, triacuerpo o tetracuerpo.

8. Anticuerpo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7 para usar como medicamento, en especial para el tratamiento de enfermedades tumorales, con preferencia, cancer de prostata, o como diagnostico.

40

9. Acido nucleico, cuya secuencia nucleotfdica codifica un anticuerpo recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7.

10. Vector que contiene una secuencia de nucleotidos de acuerdo con la reivindicacion 9.

45

11. Celula huesped u organismo huesped no humano que contiene una secuencia nucleotfdica de acuerdo con la reivindicacion 9 o un vector de acuerdo con la reivindicacion 10.

12. Composicion farmaceutica que contiene un anticuerpo recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 50 1 a 7 en asociacion con un diluyente o portador farmaceuticamente aceptable, con preferencia, en una forma apropiada para la administracion intravenosa.

13. Composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 12, que contiene al menos dos anticuerpos recombinantes distintos, de ellos al menos un anticuerpo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7 y al 55 menos un anticuerpo recombinante adicional que forma una union especffica con el anticuerpo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7.

14. Composicion diagnostica que contiene un anticuerpo recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7.

60