CN107750255A - 用于cdh3和cd3的双特异性抗体构建体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及双特异性抗体构建体，其包含结合靶细胞表面上的人CDH3的第一人结合结构域和结合T细胞表面上的人CDS的第二结合结构域。此外，本发明提供编码所述抗体构建体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体和用所述多核苷酸或载体转化或转染的宿主细胞。另外，本发明提供用于产生本发明的抗体构建体的方法、所述抗体构建体的医药用途和包含所述抗体构建体的试剂盒。

Description

用于CDH3和CD3的双特异性抗体构建体
技术领域
本发明涉及一种双特异性抗体构建体，其包含结合靶细胞表面上的人CDH3的第一人结合结构域和结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域。此外，本发明提供编码该抗体构建体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体和用所述多核苷酸或载体转化或转染的宿主细胞。此外，本发明提供一种用于产生本发明的抗体构建体的方法、所述抗体构建体的医学用途和包含所述抗体构建体的试剂盒。
背景技术
钙粘着蛋白超家族在人类中涵盖100多个成员，包括所谓的典型钙粘着蛋白P-钙粘着蛋白、E-钙粘着蛋白、N-钙粘着蛋白和R-钙粘着蛋白，它们中的每一个在单个组的组织中均有活性(Takeichi M.Development，102：639-55(1988)，van Roy F.，Nature Rev.，V14：121-134(2014))。在成人组织和器官的发育以及各组织的稳态中，钙粘着蛋白均起着至关重要的作用(Conacci-Sorrell M等人，J Clin Invest，109：987-91，(2002))。钙粘着蛋白是跨膜糖蛋白，其通过形成钙依赖性连接(junction)并通过将机械刺激转化为电化学活性(这一过程被称为动力传导)来调节细胞-细胞粘附过程(Gumbiner J.Cell.Biol.，148：399-404(2000)；Yagi等人，Genes Dev.，14：1169-1180(2000，Parades等人，Biochimica et Biophysica Acta 1826，297-311(2012))。
胎盘钙粘着蛋白(P-钙粘着蛋白)，也称为钙依赖性细胞-细胞粘附蛋白3(CDH3)，是一种具有大约800个氨基酸的大的胞外结构域(ECD)的118kDa蛋白。该CDH3 ECD包含五个钙粘着蛋白重复，本文中命名为(胞外)结构域1-5/Dom1-Dom5/D1-D5，每个钙粘着蛋白重复由约110个氨基酸组成。与P-钙粘着蛋白具有最高序列同源性的蛋白是具有53％序列同源性的E-钙粘着蛋白和具有39％同源性N-钙粘着蛋白。
P-钙粘着蛋白的表达水平在健康成人个体中被认为是低的，并被限制在层状上皮细胞的基底部或下层，包括前列腺和皮肤、乳腺肌上皮细胞(Takeichi M.J Cell Biol103：2649-58，(1986)和Shimoyama Y等人，Cancer Res，49：2128-33(1989))。虽然P-钙粘着蛋白功能的缺失在基因敲除的小鼠中不是致死的，但是已表明其与发育缺陷以及乳腺上皮的增生和发育不良有关(G.L.Radice等人，J.Cell Biol.139：1025-1032(1997))。
相对于健康个体中的低基因表达水平，P-钙粘着蛋白的表达在一些疾病(包括如克罗恩病和结肠炎的免疫疾病)的情况下被上调(Hardy等人，Gut50：513-519(2002))。此外，认为P-钙粘着蛋白在癌细胞的原侵袭性方面起重要作用(Furukawa等人，MicroscopyRes.Technique 38(4)：343-352(1997)；Parades等人，Clin Cancer Res.11(16)，5869-5877(2005)；Parades等人，Biochimica et Biophysica Acta 1826，297-311(2012))。P-钙粘着蛋白的上调已见于多种肿瘤中，包括结肠直肠癌、肺癌(NSCLC)、乳腺癌(三阴性)、胰腺癌、头颈癌、甲状腺癌、宫颈癌、卵巢癌和胃(gastric)癌(Milic等人，Cancer Res 68：(19)7760-7768(2008)；Imai等人，Clin Cancer Res 14(20)6487-6495(2008)；Paredes等人，Clin Cancer Res 11(16)5869-5877(2005)；Dasgupta等人，Oral Oncology 42，306-316(2006)；Jarzab等人，Cancer Res；65：(4)1587-1597(2005)；Patel等人，Int.J.Cancer：106，172-177(2003)；Kim等人，Human Pathology 41，877-885(2010))。此外，观察到P-钙粘着蛋白表达的增加与各种癌症类型患者的低存活率有关(Sun L等人，Am J Pathol.2011；179：380-90；Gamallo，Modern Pathology，14：650-654，(2001)；Stefansson等人，J.Clin.Oncol.22(7)：1242-1252(2004)；Parades等人，Cancer Res.64，8309-8317(2004))；Taniuchi K等人，Cancer Res.2005；65：3092-9；Paredes J等人，Clin CancerRes.2005；11：5869-77；Hardy RG等人，Gut.2002；50：513-9；Peralta Soler A等人，Cancer.1999；86：1263-72)。
在心血管疾病之后，肿瘤(neoplasm)在非传染性疾病类的致死疾病中居第二位，2013年其在全球造成约830万人死亡(GBD 2013Lancet 2015；385：117-71)。自1990年以来，癌症病例的绝对值增加了45.6％，其原因可能是世界人口正在增加，人口老龄化和已确定的危险因素(如吸烟、超重、缺乏运动)的流行也在增加(GBD 2013Lancet 2015；385：117-71；Torre LA等人，CA Cancer J Clin.2015；65：87-108)。在男性中，肺癌是导致死亡的主要原因，估计每年约有1,100万例，其次是肝癌和胃(stomach)癌。在女性中，乳腺癌是导致死亡的主要原因，每年约有50万例，其次是肺癌和结肠癌。据估计，2012年全球约有由男性中～1,20万例肺癌和女性中～170万乳腺癌引发的1400万新的癌症病例发生(Torre LA等人，CA Cancer J Clin.2015；65：87-108)。所有的癌症对世界各地构成了巨大的社会负担，因此，对对抗该疾病的治疗选择有很高的需求。
治疗癌症的常见策略涉及手术，然后是化学疗法、放射疗法或最近的靶向疗法或这些疗法的组合(如肿瘤学NCCN指南)。化学疗法试剂涵盖如5-氟尿嘧啶(5-FU)的核苷酸类似物、诸如奥沙利铂和拓扑异构酶抑制剂(如伊立替康)的DNA损伤剂或诸如多西他赛的微管抑制剂，这些试剂均导致肿瘤细胞增殖的抑制。靶向疗法包括例如选择性抑制突变的致癌激酶的小分子化合物，如被批准用于治疗黑色素瘤的BRAF V600E选择性化合物威罗菲尼(Garbe C.等人，Recent Results Cancer Res.2014；201：215-25)或被批准用于治疗肺癌(cancer)的间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂crizotinib和ceritinib(Pall G.Curr OpinOncol.2015；27：118-24)。此外，还有基于抗体的化合物，如被批准用于治疗KRAS野生型结肠癌的识别并灭活表皮生长因子受体(EGFR)的西妥昔单抗和帕尼单抗(Tol J，PuntCJ.Clin Ther.2010；32：437-53)，或被批准用于乳腺癌治疗的识别Her2的曲妥珠单抗(Ahmed S.等人，Breast Cancer.2015；22：101-16)。
尽管治疗介入已广泛发展，但是除了个别例子外，还没有获得这种异质性疾病的治愈。个体肿瘤的异质性导致这样的事实，即只有有限数量的患者对某种疗法有响应，并进一步在肿瘤进展过程中对治疗剂产生抗性(Jamal-Hanjani M.等人，Clin CancerRes.2015；21：1258-1266)。尽管新开发的靶向疗法似乎有更好的耐受，但是最终药物的副作用仍将导致治疗中断或停止(http：//www.cancer.net/navigating-cancer-care/how-cancer-treated/chemo therapy/side-effects-chemotherapy；Sun GC.等人，AnticancerAgents Med Chem.2015Mar 17.[印刷版之前的电子版])。
同样由于这些原因，对新药开发仍有很高的医学需求。
肿瘤细胞中CDH3的过表达提供了通过采用双特异性抗体治疗癌症的新手段的基础，该双特异性抗体识别CDH3过表达肿瘤细胞并通过被该抗体的CD3结合结构域识别的细胞毒性T细胞的再定向来杀死这些CDH3过表达肿瘤细胞。
已经在RNA水平或在主要采用免疫组织化学的蛋白质水平上实施的表达分析证明CDH3在广泛的不同类型的癌症中以高且可检测的水平表达，所述癌症包括结肠癌(Milic等人，Kita等人，Imai等人，http：//www.proteinatlas.org/)、包含非小细胞和小细胞肺癌的肺癌(Imai等人，human protein atlas)、优选为三阴性癌症的乳腺癌(Perou等人，Paredes等人，Turashvili等人，Imai等人)、胰腺癌(Imai等人，Taniuchi等人)、包含舌上鳞状细胞癌的头颈癌(Dasgupta等人；自己未发表的数据)、甲状腺癌(Jarzab等人，Rocha等人，humanprotein atlas)、宫颈癌(Imai等人，Han等人)、优选在阶段II及以上的卵巢癌(Patel等人，human protein atlas)、胃癌(Kim等人，Imai等人)、子宫内膜癌(Sugiyama Y等人，ClinCancer Res.2003；9：5589-600；human protein atlas)、胆管癌(Baek S等人，Anat CellBiol.2010；43：110-7；Imai等人)、膀胱癌(Imai等人，自己未发表的数据)、前列腺癌(Imai等人；自己未发表的数据)、睾丸癌(Imai等人)、软组织肉瘤(Imai等人)、食管癌(自己未发表的数据)、肾癌(自己未发表的数据)。
进一步的分析可能证明其它肿瘤或其亚型的表达升高，这也可能变得与这种疗法有关。例如，Fotouhi等人证明CDH3启动子在小肠神经内分泌肿瘤中的甲基化降低，这可导致CDH3蛋白表达升高(Fotouhi O等人，Epigenetics.2014；9：987-97)。在CDH3表达升高与miR-205(一种似乎是鳞状肺细胞癌的特异性标记物的微RNA)之间观察到正相关(Huang W等人，Chin Med J(Engl).2014；127：272-8)。
相对于在肿瘤组织中CDH3表达升高，CDH3表达在正常组织中是低的或不可检测的(Milic等人，Imai等人，Taniuchi等人，Rocha等人，Dasgupta等人，Han等人，Patel.，Kim等人，Sugiyma等人，Jarzab等人，human protein atlas)。总之，这提供了CDH3是所提出的双特异性抗体方法的合适靶标的证据。
已经描述了多种与P-钙粘着蛋白结合的抗体并且已经在如下专利中公开了其最详尽的特征：WO9919477、WO02/097395、WO04/110345、WO06/114704、WO07/102525、WO2010/001585、WO2010126137；WO2010054007、WO2011056997、WO2011080796、WO2011071541。
本领域已知一些抗体(如抗CDH3抗体PF-03732010)通过例如干扰其粘附特性来阻断CDH3的功能(Zhang CC等人，Clin Cancer Res.2010；16：5177-88)。在体外，这种抗体导致3D球状体(speroid)的破坏并伴随细胞内信号传导的改变，如纳摩尔浓度下的β-连环蛋白的解离，但不抑制增殖。在临床前模型中，以10mg/kg的剂量和取决于CDH3表达水平的方式观察到肿瘤生长的体内抑制和转移的形成以及延长的存活。在机理上，不能排除体内的抗肿瘤作用另外由抗体依赖性细胞毒性(ADCC)过程介导，该过程涉及通过细胞毒性T细胞与免疫球蛋白的Fc结构域的结合来杀死细胞。已将这种作用机制归因于一些请求保护的抗CDH3抗体。尽管已经将P-钙粘着蛋白活性的阻断描述为抑制P-钙粘着蛋白-表达肿瘤生长的方法，但是所获得的结果常常不能令人满意，因为它们延迟肿瘤生长或至多诱导肿瘤停滞，但是不能消除肿瘤。
为了改善抗体对肿瘤生长的抑制作用，可以将抗体与细胞毒性剂或细胞生长抑制剂(如化学治疗剂、毒素、放射性同位素等)缀合从而得到抗体-药物缀合物(ADC)，或广义地说得到免疫缀合物。免疫缀合物允许将药物部分靶向递送至肿瘤，并允许其细胞内积累。这种免疫缀合物在杀死肿瘤细胞方面的效力很大程度上取决于各种参数，如通常以胞外结构域定位在细胞膜中的靶分子的内在化行为，以及相应免疫缀合物的作用模式。总之，与免疫缀合物的偶联显示显著增强各种抗体的抗肿瘤效力。
最近，结合靶分子以及T细胞的双特异性分子已显示了规避上述许多缺点的有益结果。由于药物分子利用了T细胞的非常有效的天然杀伤作用，因此这些药物分子不依靠完全阻断靶细胞的功能或靶细胞的增殖状态。这种双特异性分子的实例是双特异性抗-靶标x抗-CD3单链抗体构建体，其先前已经显示以非常高的效力介导靶细胞的T细胞相关的杀伤，参见如，Blinatumomab。
为了区分一种双特异性scFv分子是否是一种将最终有助于治愈患者的良好药物，必须满足许多不同的标准。这些标准的组合和严格性使得满足这些的分子的出现需要极其罕见和不可预测的事件。最明显的标准是候选药物的效力。
这种分子的效力取决于关于该双特异性分子的靶标结合结构域以及T细胞募集部分的多个参数。特别地，由于双特异性scFv分子的靶标结合部分随靶标分子的性质(包括其三元以及四元结构)而非常强烈地变化，因此双特异性scFv分子的靶标结合部分是不可预测的。在限定效力的参数中，靶标-与双特异性结合分子以及确切的结合区域(也称为结合表位)之间的结合动力学起主要作用。
抗-CDH3单克隆抗体(对于任何其他单克隆抗体一般都是如此)通过高度特异性识别其靶分子而发挥功能。它们仅识别其靶CDH3分子上的单一位点或表位。此外，已经发现许多抗体以物种-特异性的方式发挥其功能。然而，这种不仅CDH3单克隆抗体(和其片段)固有，而且一般单克隆抗体都固有的物种特异性是将其开发为治疗人类疾病治疗剂的重要障碍。为了获得上市许可，任何新的候选药物都必须通过严格的试验。这种试验可细分为临床前阶段和临床阶段；前者在动物中进行，而后者在人类患者中进行。临床前试验的目的是证明候选药物具有期望的活性和最重要的安全性。只有已经在临床前试验中证实了候选药物在动物中的安全性和可能的效力时，该候选药物才可能将会被相关监管机构批准在人中进行临床试验。可以以下三种方式测试候选药物在动物中的安全性，(i)在相关物种中，即在候选药物可识别直向同源抗原的物种中，(ii)在包含人类抗原的转基因动物中和(iii)通过使用可结合动物中存在的直向同源抗原的候选药物的替代物。转基因动物的限制是该技术一般限于啮齿类动物。啮齿类动物与人类之间存在显著的生理学差异，不能将安全性结果简单地外推至人。候选药物的替代物的局限性在于，其与实际候选药物相比不同的物质组成，以及所用动物通常是具有上述局限性的啮齿类动物。因此，在啮齿类动物中产生的临床前数据对于候选药物的预测力有限。
安全性试验的所选方法是使用相关物种，优选灵长类动物，并且由于遗传相似性，优选黑猩猩。然而，黑猩猩被认为是濒危物种，并且由于其类似人的性质，使用这种动物进行药物安全性试验在欧洲已被禁止，而且在别处也受到严格限制。
尽管本领域描述的T细胞参与的双特异性单链抗体对治疗恶性疾病具有巨大的治疗潜力，但是这些双特异性分子中的大部分具有局限性，即它们是物种特异性的并且仅识别人类抗原，且可能的灵长类动物，即猕猴(macaque)对应物。此外，所述双特异性分子中的大部分进一步局限在它们不能跨越物种边界实现其期望的功能，使得它们可识别人类和灵长类同源物但是不能发挥例如T细胞介导的细胞毒性。
发明内容
由于仍然需要用于治疗本文公开的各种癌症类型的其它选择，因此提供了以双特异性抗体构建体的形式来解决此问题的手段和方法，该双特异性抗体构建体具有一个针对CDH3的结合结构域和针对T细胞上CD3的第二结合结构域。
第一方面，本发明提供一种双特异性抗体构建体，其包含结合靶细胞表面上的人CDH3的表位簇的第一结合结构域(优选地人结合结构域)，且包含结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域(优选地人结合结构域)，其中所述人CDH3的表位簇包含在人CDH3的氨基酸位置291-363(SEQ ID NO：36)中。
在本发明的优选实施方案中，该双特异性抗体构建体的特征在于所述第一结合结构域还结合猕猴CDH3，优选地结合食蟹猴(Macaca fascicularis)CDH3。
这种跨物种的功能性意味着相同的分子可以用于临床前动物研究以及人的临床研究。与物种特异性替代分子相比，这种跨物种的功能性将导致高度可比的结果且动物研究的预测能力大大提高。由于本发明的CDH3xCD3双特异性抗体构建体的CD3和CDH3结合结构域均是跨物种特异性和功能性的，即与发挥T细胞介导的细胞毒性的可比较效果的人和猕猴抗原反应，它们均可用于临床前评估安全性、活性和/或这些结合结构域在灵长类动物和以相同形式作为药物在人中的药代动力学概况(profile)。应理解，在优选的实施方案中，本发明抗体构建体的第一和第二结合结构域的跨物种特异性是相同的。
鉴于上述，构建替代CDH3xCD3双特异性构建体用于在远离亲源(人类)的物种中试验的需求消失。结果，可用于动物临床前试验中的分子与预期施用给临床试验中的人以及后续的市场许可和治疗性药物给药的分子相同。能够使用与日后施用给人的相同分子来进行临床前动物试验，实际上消除了或者至少大大降低了在临床前动物试验中所获得的数据对人类方案的适用性有限的危险。简而言之，使用与实际施用给人的相同分子在动物中获得临床前安全性数据，确实会确保该数据对人相关方案适用。相比之下，在使用替代分子的常规方法中，这种替代分子必须被以分子方式适应于用于临床前安全性评价的动物试验体系。因此，待用于人类治疗的分子实际上在序列上以及可能在结构上不同于用于临床前试验药代动力学参数和/或生物活性的替代分子，结果是在临床前动物试验中所获得的数据对于人类方案的适用性/可转移性有限。替代分子的使用需要构建、生产、纯化以及表征全新的构建体。这将导致需要额外的开发成本和时间来获得该分子。总之，除了用于人类治疗的实际药物，还得单独开发替代物，使得不得不进行2种分子的2个开发生产线。因此，显示本文所述的跨物种特异性和功能性(即反应性)的本发明的CDH3xCD3双特异性抗体构建体(优选人CDH3xCD3双特异性抗体构建体)的一个主要优点是，可以将相同的分子用于人以及临床前动物试验中的治疗剂。
在本发明的跨物种特异性CDH3xCD3双特异性抗体构建体的情况下，使试验动物适应于欲施用给人的候选药物，例如，建立转基因动物，也不再是必要的。根据本发明的用途和方法显示跨物种特异性和反应性的本发明CDH3xCD3双特异性抗体构建体(优选人CDH3xCD3双特异性抗体构建体)可直接用于非黑猩猩灵长类动物(如猕猴)的临床前试验，没有动物的任何遗传操作。正如本领域技术人员熟知的，使试验动物适应于候选药物的方法经常承受如下风险：在临床前安全性试验中获得的结果较少有代表性，并且由于该动物的修饰对于人类的预测力较低。例如，在转基因动物中，由转基因编码的蛋白质经常被高度过表达。因此，所获得的抗体对抗该蛋白质抗原的生物活性的数据可能在它们对人(该蛋白质在人中以更低、更生理学的水平表达)的预测值方面有限。
本发明的CDH3xCD3双特异性抗体构建体(优选人CDH3xCD3双特异性抗体构建体)的另一个优点是，当将其作为动物临床前试验(例如在药代动力学动物研究的过程中)的一部分时，提取多个血液样品的能力。非黑猩猩灵长类动物要比低等动物(例如，小鼠)更容易进行多次血液提取。多个血液样品的提取允许持续测试血液参数，以测定由本发明的CDH3xCD3双特异性抗体构建体诱导的生物效应。此外，多个血液样品的提取使研究者能够评估如本文中所定义的本发明的CDH3xCD3双特异性抗体构建体(优选人CDH3xCD3双特异性抗体构建体)的药代动力学概况。此外，反映在血液参数中的可由所述本发明的CDH3xCD3双特异性抗体构建体诱导的可能副作用，可在施用所述抗体过程期间提取的不同血液样品中进行测量。
显示跨物种特异性的如本文中所定义的本发明的CDH3xCD3双特异性抗体构建体的优点，可被简要地概述如下：
第一，用于临床前试验的如本文中所定义的本发明的CDH3xCD3双特异性抗体构建体与用于人类治疗的抗体是相同的。因此，不再需要开发在药代动力学性质以及生物活性上可能不同的2个独立分子。这是高度有利的，原因在于，例如，相比于例如在传统替代方法中，所述药代动力学结果能够更直接转移和应用于人类情况。
第二，与替代方法相比，将如本文中所定义的本发明的CDH3xCD3双特异性抗体构建体用于制备人类的治疗药物，成本和劳动密集度更低。
第三，如本文中所定义的本发明的CDH3xCD3双特异性抗体构建体不仅可以用于在一种灵长类动物物种中，还可以用于在一系列不同的灵长类动物物种中的临床前试验，由此限制了灵长类动物与人类之间潜在的物种差异的风险。
第四，如果期望，作为濒危物种的黑猩猩可避免用于动物试验。
第五，可提取多个血液样本以用于广泛的药物动力学研究。
第六，由于根据本发明的优选实施方案的抗体构建体的人类来源，当给人类患者施用时，产生的对抗所述结合分子的免疫反应被降到最低。排除了诱导出对源自非人类物种的候选药物特异性的抗体的免疫反应，所述非人类物种例如导致出现对抗鼠来源的治疗分子的人类抗小鼠抗体(HAMA)的小鼠。
本发明的CDH3xCD3双特异性抗体构建体的治疗用途提供一种新颖且有创造性的用于癌症的治疗方法，所述癌症优选为实体瘤，更优选为如下所列的癌(carcinomas)和其它癌(cancer)适应症。如在下述实施例中所示的，本发明的CDH3xCD3双特异抗体构建体为杀死表达CDH3的人癌细胞提供了有利的工具。此外，与典型的(单特异性)IgG分子或ADC相比，本发明的CDH3xCD3双特异性抗体构建体的细胞毒性活性提供有利的作用模式。
对于候选药物在动物模型中的表征，对相关动物物种的物种交叉反应性是必须的且种间亲和力差距应保持在10倍的亲和力差异以下，以确保预测性动物模型建立。认为猕猴(macaque monkey)(特别是食蟹猴(cynomolgous))是具有最高预测价值的用于功效和毒性试验的最相关物种。为了分析抗体构建体是否满足效率标准，必须建立并合格化(qualified)相应的细胞毒性分析法。
为了防止不良副反应，需保证该双特异性抗体构建体的靶结合部分特异性地结合P-钙粘着蛋白，且不与上文所述的其最接近的同源物或体内存在的其它蛋白结合。
优选地，本发明的抗体构建体不结合CHD3胞外结构域D1(SEQ ID NO：1的位置108-215)，优选地其不结合CHD3胞外结构域D4(SEQ ID NO：1的位置441-546)，和优选地其不结合CHD3胞外结构域D5(SEQ ID NO：1的位置547-650)。
根据本发明最优选的实施方案，该双特异性抗体构建体的特征在于所述第一结合结构域结合包含在人CDH3的氨基酸位置291-327(SEQ ID NO：34)中的表位。该抗体特异性结合人CDH3的氨基酸位置291-327(SEQ ID NO：34)，优选地不结合人CDH3的CHD3胞外结构域D3(SEQ ID NO：1的位置328-440)。
还可将根据本发明的优选的抗体构建体定义为双特异性抗体构建体，其包含结合靶细胞表面上的人CDH3的表位的第一结合结构域(优选地人结合结构域)和结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域(优选地人结合结构域)，其中该抗体构建体与命名为CDH3-11、CDH3-12、CDH3-13或CDH3-14的抗体结合相同的表位或竞争与CDH3的结合，即，所述抗体包含：
●如SEQ ID NO：155中描绘的VH区和如SEQ ID NO：156中描绘的VL区；
●如SEQ ID NO：165中描绘的VH区和如SEQ ID NO：166中描绘的VL区；
●如SEQ ID NO：175中描绘的VH区和如SEQ ID NO：176中描绘的VL区；或
●如SEQ ID NO：185中描绘的VH区和如SEQ ID NO：186中描绘的VL区。
本发明的另一方面，所述双特异性抗体构建体的特征在于所述第一结合结构域结合包含在人CDH3的氨基酸位置328-363(SEQ ID NO：35)中的表位。
还可将根据本发明的优选的抗体构建体定义为双特异性抗体构建体，其包含结合靶细胞表面上的人CDH3的表位的第一结合结构域(优选地人结合结构域)和结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域(优选地人结合结构域)，其中该抗体构建体与命名为CDH3-24的抗体结合相同的表位或竞争与CDH3的结合，即，所述抗体包含如SEQ ID NO：285中描绘的VH区和如SEQ ID NO：286中描绘的VL区。
还可将根据本发明的另一优选的抗体构建体定义为双特异性抗体构建体，其包含结合靶细胞表面上的人CDH3的表位的第一结合结构域(优选地人结合结构域)和结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域(优选地人结合结构域)，其中该抗体构建体与命名为CDH3-25、CDH3-26或CDH3-27的抗体结合相同的表位或竞争与CDH3的结合，即，所述抗体包含：
●如SEQ ID NO：295中描绘的VH区和如SEQ ID NO：296中描绘的VL区；
●如SEQ ID NO：305中描绘的VH区和如SEQ ID NO：306中描绘的VL区；或
●如SEQ ID NO：315中描绘的VH区和如SEQ ID NO：316中描绘的VL区。
可在诸如竞争ELISA或基于细胞的竞争分析法的竞争分析中测量抗体构建体是否与另一给定抗体构建体竞争结合。还可以采用亲和素偶联的微粒(珠子)。与涂布亲和素的ELISA板类似，当与生物素化的蛋白反应时，这些珠子中的每一个均可用作可在其上进行分析的基底。将抗原涂布到珠子上，然后用第一抗体预涂布。加入第二抗体并测定任何其它结合。通过流式细胞术读数。
在本发明的另一实施方案中，所述双特异性抗体构建体的特征在于所述第一结合结构域结合包含在人CDH3的氨基酸位置328-363(SEQ ID NO：35)中的表位和结合包含在人CDH3的氨基酸位置404-440(SEQ ID NO：390)中的表位。
此外，优选地本发明的抗体构建体不结合包含在如SEQ ID NO：1中描绘的人CDH3的氨基酸位置216-252或253-290中的表位。
此外，优选地本发明的抗体构建体不结合包含在如SEQ ID NO：1中描绘的人CDH3的氨基酸位置364-403中的表位。
所述抗体构建体特异性结合包含在人CDH3的氨基酸位置328-363(SEQ ID NO：35)中的表位，优选地不结合人CDH3的CHD3胞外结构域D2(SEQ ID NO：1的位置216-327)。
本发明的一个优点是提供一种双特异性抗体构建体，其包含结合CD3的结合结构域和能够结合CDH3的结合结构域，而两个结合结构域均对人和猕猴CDH3显示跨物种特异性。出乎意料地，在人和猕猴CDH3分析系统中，发现本发明的CDH3xCD3双特异性抗体构建体不仅特异性结合CDH3的人和猕猴CDH3同源物和CD3，还发挥T细胞介导的细胞毒性。有利地，本发明提供在人和猕猴中显示T细胞介导的细胞毒性的CDH3xCD3双特异性抗体构建体。该优点通过CDH3xCD3双特异性抗体构建体结合包含在人CDH3的氨基酸位置291-363(SEQ IDNO：36)中的表位簇来实现。
必须注意的是，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代。因此，举例而言，对“一种试剂”的指代包括此类不同试剂中的一或多种，且对“所述方法”的指代包括对本领域普通技术人员已知的等效步骤和方法的指代，所述等效步骤和方法可修改或取代本文中所描述的方法。
除非另有说明，否则一系列元素前的术语“至少”应理解为指代该系列中的每一个元素。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文中所描述的本发明的特定实施方式的许多等效物。此类等效物意欲由本发明涵盖。
本文中使用的术语“和/或”均包括“和”、“或”和“由所述术语连接的元素的所有或任何其它组合”的含义。
如本文中所用的术语“约”或“大约”意为在给定值或范围的±20％内，优选在±15％内，更优选在±10％内，和最优选在±5％内。
除非上下文另有需要，否则本说明书和下文的权利要求书全文中，词语“包含(comprise)”和变体(比如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”)应理解为意为包括所述整数或步骤或者整数组或步骤组而不排除任何其他整数或步骤或者整数组或步骤组。当在本文中使用时，术语“包含”可由术语“含有(containing)”或“包括(including)”替代，或当在本文中使用时，有时可由术语“具有(having)”替代。
当在本文中使用时，“由...组成”排除所要求保护的元素中未说明的任何元素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由...组成”不排除不会实质上影响权利要求的基本和新特征的材料或步骤。
在本文的每种情况中，术语“包含”、“基本上由...组成”和“由...组成”中的任一者均可由其它两个术语中的任一者替换。
术语“抗体构建体”是指其中结构和/或功能基于例如全长或完整免疫球蛋白的抗体的结构和/或功能的分子。因此，抗体构建体能够结合其特定靶标或抗原。此外，根据本发明的抗体构建体包括允许靶标结合的抗体的最低结构要求。该最小要求可以例如通过存在至少三个轻链CDR(即，VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即，VH区的CDRl、CDR2和CDR3)来限定，优选地通过存在所有六个CDR来限定。根据本发明的构建体所基于的抗体包括，例如单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、去免疫化抗体、人源化抗体和人抗体。
在根据本发明的“抗体构建体”的定义中的是包括骆驼抗体和通过生物技术或蛋白质工程方法或过程产生的其它免疫球蛋白抗体的全长或完整抗体。这些全长抗体可以是，例如单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、去免疫化抗体、人源化抗体和人抗体。还在“抗体构建体”的定义中的是全长抗体的片段，比如VH、VHH、VL、(s)dAb、Fv、Fd、Fab、Fab’、F(ab’)2或“r IgG”(“半抗体”)。根据本发明的抗体构建体也可以是修饰的抗体片段，也称为抗体变体，比如scFv，二-scFv(di-scFv)或双(s)-scFv、scFv-Fc、scFv-拉链，scFab、Fab2、Fab3、双抗体(diabody)、单链双抗体、串联双抗体(Tandab’s)、串联二-scFv、串联三-scFv、以(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2、((scFv)2-CH3+CH3)、((scFv)2-CH3)或(scFv-CH3-scFv)2的结构为示例的“微型抗体(minibody)”、比如三抗体或四抗体的多抗体，和比如纳米抗体的单结构域抗体或包含仅一个可变结构域(其可为VHH、VH或VL)的单可变结构域抗体，其独立于其他V区或结构域而特异性结合抗原或表位。
此外，术语“抗体构建体”的定义包括单价、二价和多价构建体，并因此包括特异性结合仅一个抗原结构的单特异性构建体以及通过不同的结合结构域特异性结合超过一个(如两个、三个或更多个)抗原结构的双特异性和多特异性构建体。此外，术语“抗体构建体”的定义包括由仅一个多肽链组成的分子以及由超过一个多肽链组成的分子，所述链可以相同(同二聚体、同三聚体或同寡聚体)或不同(异二聚体、异三聚体或异寡聚体)。上述定义的抗体和其变体或衍生物的实例特别描述于Harlow和Lane，Antibodies a laboratorymanual，CSHL Press(1988)和Using Antibodies：a laboratory manual，CSHL Press(1999)；Kontermann和Dübel，Antibody Engineering，Springer，2nd ed.2010；和Little，Recombinant Antibodies for Immunotherapy，Cambridge University Press 2009中。
本发明的抗体构建体优选地为“体外产生的抗体构建体”。该术语是指根据上述定义的抗体构建体，其中所有或部分可变区(例如至少一个CDR)在非免疫细胞选择(例如体外噬菌体展示、蛋白质芯片或任何其他可测试候选序列结合抗原的能力的方法)中产生。因此，此术语优选排斥仅由动物的免疫细胞中的基因组重组产生的序列。“重组抗体”是一种通过采用重组DNA技术或基因组工程制备的抗体。
如本文中所用的术语“单克隆抗体”(mAb)或单克隆抗体构建体是指由基本上均质的抗体的群获得的抗体，即除可少量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)以外，构成该群的各个抗体为相同的。与典型地包括针对不同决定簇(或表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，单克隆抗体具有针对单一抗原位点或抗原上的决定簇的高特异性。除其特异性以外，单克隆抗体由于它们通过杂交瘤培养物合成(因此未受其他免疫球蛋白污染)而是有利的。修饰语“单克隆”表示由基本上均质的抗体的群获得的抗体的特性，且不应理解为需要通过任何特定方法产生该抗体。
对于单克隆抗体的制备，可以采用提供由连续细胞系培养物产生的抗体的任何技术。例如，待使用的单克隆抗体可通过首先由Kohler等人，Nature，256：495(1975)描述的杂交瘤方法产生，或可通过重组DNA方法(参见例如美国专利No.4,816,567)产生。产生人单克隆抗体的其它技术的实例包括三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor，ImmunologyToday 4(1983)72)和EBV杂交瘤技术(Cole等人，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.(1985)，77-96)。
之后，可以采用标准方法筛选杂交瘤，比如酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离子体共振(BiacoreTM)分析，以识别一个或多个产生与特定抗原特异性结合的抗体的杂交瘤。可以使用任何形式的相关抗原作为免疫原，例如，重组抗原、天然存在的形式、其任意变体或片段以及其抗原肽。可以使用如在BIAcore系统中采用的表面等离子体共振来提高结合靶抗原(比如CDH3或CD3ε)的表位的噬菌体抗体的效率(Schier，Human AntibodiesHybridomas 7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods 183(1995)，7-13)。
制备单克隆抗体的另一示例性方法包括筛选蛋白表达文库，如噬菌体展示或核糖体展示文库。噬菌体展示描述于，例如，Ladner等人，美国专利No.5,223,409；Smith(1985)Science 228：1315-1317；Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)中。
除了使用展示文库之外，相关抗原可以用来免疫非人动物，例如，啮齿类动物(比如小鼠、仓鼠、兔或大鼠)。在一个实施方案中，所述非人动物包括至少一部分人免疫球蛋白基因。例如，可以用人Ig(免疫球蛋白)基因座的大片段工程化小鼠抗体产生缺陷的小鼠品系。使用杂交瘤技术，可以生产并选择具有需要的特异性的来源于基因的抗原特异性单克隆抗体。参见，例如，XENOMOUSETM；Green等人，(1994)Nature Genetics 7：13-21；US 2003-0070185；WO 96/34096和WO96/33735。
单克隆抗体还可从非人动物中获得，然后采用本领域已知的重组DNA技术修饰，例如，人源化、去免疫化、使嵌合等等。修饰的抗体构建体的实例包括非人抗体的人源化变体、“亲和力成熟的”抗体(参见，例如Hawkins等人，J.Mol.Biol.254，889-896(1992)和Lowman等人，Biochemistry 30，10832-10837(1991))和具有改变的效应子功能的抗体突变体(参见，例如美国专利5,648,260；Kontermann和Dübel(2010)，在上述引文中；和Little(2009)，在上述引文中)。
在免疫学中，亲和力成熟是通过其在免疫反应进程中B细胞产生对抗原具有增强的亲和力的抗体的方法。随着反复接触相同的抗原，宿主将产生依次更大的亲和力的抗体。类似于天然原型，体外亲和力成熟基于突变和选择的原理。已经将体外亲和力成熟成功地应用于优化抗体、抗体构建体和抗体片段。使用辐射、化学诱变剂或易错PCR引入CDR内的随机突变。此外，通过链替换(shuffling)可增加遗传多样性。使用如噬菌体展示的展示方法的两轮或三轮突变和选择通常导致具有低纳摩尔范围内的亲和力的抗体片段。
所述抗体构建体的氨基酸置换变化的一种优选类型涉及置换亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体与产生它们的亲本抗体相比将具有改进的生物学性质。用于产生此类置换性变体的便利方式涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简言之，若干高变区位点(例如6-7个位点)被突变以在每个位点处产生所有可能的氨基酸置换。由此产生的抗体变体从丝状噬菌体粒子以单价方式展示，作为与包装于每个粒子内的M13的基因III产物的融合物。接着如本文中所公开，筛选经噬菌体展示的变体的生物活性(例如结合亲和力)。为了鉴别用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴别对抗原结合起显著贡献的高变区残基。或者或另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴别结合结构域与例如人CDH3之间的接触点可能是有利的。根据本文中详细说明的技术，此类接触残基和相邻残基为用于置换的候选物。一旦产生此类变体，则使变体的组经受如本文中所描述的筛选且可选择在一或多个相关分析法中具有优良性质的抗体以用于进一步研究。
本发明的单克隆抗体和抗体构建体具体地包括“嵌合(的)”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，同时该链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源；以及这种抗体的片段，只要它们显示所需要的生物活性即可(美国专利No.4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。本文中的目标嵌合抗体包括“灵长类源化的”抗体，其包含源自非人灵长类动物(例如旧世界猴、Ape等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。已经描述了多种用于制备嵌合抗体的方法。参见例如，Morrison等人，Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.81：6851，1985；Takeda等人，Nature 314：452，1985；Cabilly等人，美国专利No.4,816,567；Boss等人，美国专利No.4,816,397；Tanaguchi等人，EP 0171496；EP 0173494；和GB 2177096。
还可通过例如WO 98/52976或WO 00/34317中公开的方法特异性缺失人T细胞表位(称为“去免疫化”的方法)来修饰抗体、抗体构建体或抗体片段。简言之，可针对结合MHC II类的肽，分析抗体的重链和轻链可变结构域；这些肽代表潜在的T细胞表位(如WO 98/52976和WO 00/34317中所定义)。为了检测潜在的T-细胞表位，可应用被称为“肽线程化(peptidethreading)”的计算机建模方法，并且另外可以在人MHC II类结合肽的数据库中检索VH和VL序列中存在的基序，如WO 98/52976和WO 00/34317中所述。这些基序与18种主要MHC II类DR同种异型的任何一种结合，并由此构成潜在的T细胞表位。可通过置换在可变结构域中的少量的氨基酸残基，或优选地，通过单个氨基酸置换来消除检测到的潜在的T-细胞表位。典型地，进行保守性置换。通常可使用与人种系(germline)抗体序列中的位置所共有的氨基酸，但不限于此。人种系序列在例如Tomlinson等人，(1992)J.MoI.Biol.227：776-798；Cook，G.P.等人，(1995)Immunol.Today Vol.16(5)：237-242；和Tomlinson等人，(1995)EMBO J.14：14：4628-4638中公开。VBASE目录提供了人免疫球蛋白可变区序列的详尽目录(由Tomlinson，LA.等人，MRC Centre for Protein Engineering，Cambridge，UK)汇编。这些序列可以用作人序列的来源，例如用于框架区和CDR。例如如美国专利No.6,300,064中所述，也可以使用共有人框架区。
“人源化”抗体、抗体构建体或其片段(比如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原-结合亚序列)是大部分人序列的抗体或免疫球蛋白，其包含极少源自非人免疫球蛋白的序列。多数情况下，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)：其中来自受体的高变区(还有CDR)的残基被来自例如具有所需特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、仓鼠或兔的非人(例如啮齿类动物)物种(供体抗体)的高变区的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替换。此外，如本文中所用的“人源化抗体”还可包含既不存在于受体抗体中也不存在于供体抗体中的残基。进行这样的修饰是为了进一步精制和优化抗体性能。所述人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白的Fc)的至少一部分。有关更多详细信息参见Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann等人，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)。
可以通过替换Fv可变结构域的序列来产生人源化抗体或其片段，所述Fv可变结构域的序列不直接参与抗原与来自人Fv可变结构域的等价序列的结合。Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Oi等人，(1986)BioTechniques4：214；和US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US 5,859,205和US6,407,213提供了用于产生人源化抗体或其片段的示例性方法。这些方法包括分离、操纵及表达编码来自重链或轻链至少之一的所有或部分免疫球蛋白Fv可变结构域的核酸序列。这种核酸可以从杂交瘤中获得，该杂交瘤产生如上文所描述的针对预定靶标的抗体，也可从其它来源获得。编码人源化抗体分子的重组DNA随后可被克隆至合适的表达载体中。
还可以采用转基因动物，比如表达人重链和轻链基因但不能表达内源小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因的小鼠，来产生人源化抗体。Winter描述了一种可以用于制备本文所述人源化抗体的示例性CDR-移植方法(美国专利No.5,225,539)。特定人抗体的所有CDR都可被非人CDR的至少一部分替换，或仅仅一些CDR可被非人CDR替换。其只需替换人源化抗体与预定抗原结合所需的CDR数目。
可以通过保守置换、共有序列置换、种系置换和/或回复突变的引入来优化人源化抗体。这类免疫球蛋白分子的改变可以通过本领域已知的数种技术中任一种来实现(例如Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：7308-7312，1983；Kozbor等人，ImmunologyToday，4：7279，1983；Olsson等人，Meth.Enzymol.，92：3-16，1982；和EP239400)。
术语“人抗体”、“人抗体构建体”和“人结合结构域”包括具有比如与本领域已知的人种系免疫球蛋白序列基本上对应的可变区和恒定区的抗体区的抗体、抗体构建体和结合结构域，包括例如由Kabat等人(1991)(在上述引文中)描述的那些。本发明的人抗体、抗体构建体或结合结构域可包括并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中且特别在CDR3中。人抗体、抗体构建体或结合结构域可具有至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个由并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基替换的位置。如本文中所用的人抗体、抗体构建体和结合结构域的定义还涵盖完全人抗体，其仅包括抗体的非人工和/或遗传改变的人序列，如可通过使用比如Xenomiuse的技术或系统得到的那些。
在一些实施方式中，本发明的抗体构建体为“分离的”或“基本上纯的”抗体构建体。当将“分离的”或“基本上纯的”用于描述本文公开的抗体构建体时，其是指抗体构建体已经从其产生环境的组分中被识别、分离和/或回收。优选地，所述抗体构建体不含或基本上不含与来自其产生环境的所有其它组分的关联。其产生环境的污染组分，比如由重组转染细胞产生的，是将典型地干扰多肽诊断或治疗用途的材料，且可包括酶、激素和其它蛋白质性或非蛋白质性的溶质。所述抗体构建体可例如构成给定样品中全部蛋白质以重量计的至少约5％或至少约50％。应理解，取决于环境，分离的蛋白质可占总蛋白质含量以重量计的5％至99.9％。可通过使用可诱导启动子或高表达启动子来产生显著更高浓度的多肽，使得以增加的浓度水平产生该多肽。该定义包括在本领域已知的多种生物体和/或宿主细胞中产生抗体构建体。在一个优选的实施方案中，所述抗体构建体将纯化至(1)足以通过使用转杯测序仪获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(2)在非还原或还原条件下通过SDS-PAGE使用考马斯亮蓝或优选的银染得到均一性。然而，通常分离的抗体构建体是通过至少一个纯化步骤制备的。
就本发明而言，术语“结合结构域”表征(特异性)结合/识别靶分子(抗原)CDH3和CD3上的给定靶表位或给定靶位点/与靶分子(抗原)CDH3和CD3上的给定靶表位或给定靶位点相互作用的结构域。第一结合结构域(识别CDH3)的结构和功能，和优选地第二结合结构域(CD3)的结构和/或功能同样，基于抗体(例如全长或完整免疫球蛋白分子)的结构和/功能。根据本发明，所述第一结合结构域的特征在于存在三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)。所述第二结合结构域优选地也包含允许靶标结合的抗体的最低结构要求。更优选地，所述第二结合结构域包含至少三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)。设想通过噬菌体展示或文库筛选方法而非通过将来自预先存在的(单克隆)抗体的CDR序列嫁接(grafting)到骨架中来产生或获得所述第一和/或第二结合结构域。
根据本发明，优选的结合结构域是多肽形式。该种多肽可包括蛋白质性部分和非蛋白质性部分(例如化学连接子或化学交联剂，例如戊二醛)。蛋白质(包含其片段，优选生物活性片段，以及通常具有少于30个氨基酸的肽)包含通过共价肽键彼此相连的两个或更多个氨基酸(从而产生氨基酸链)。如本文中所用的术语“多肽”描述了一组通常由超过30个氨基酸组成的分子。多肽可更进一步形成多聚体，比如二聚体、三聚体及更高的寡聚体，即由多于一个多肽分子组成。形成此类二聚体、三聚体等的多肽分子可以相同或不同。这种多聚体的对应较高阶结构因此称为同二聚体或异二聚体，同三聚体或异三聚体等。异多聚体的实例是抗体分子，在其天然存在的形式中由两个相同的轻多肽链和两个相同的重多肽链组成。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”也指经天然修饰的肽/多肽/蛋白，其中所述修饰由例如翻译后修饰(如糖基化、乙酰化、磷酸化等)实现。本文所提到的“肽”、“多肽”或“蛋白质”也可是经化学修饰的，如经聚乙二醇化的。这些修饰是本领域熟知的并在下文描述。
如上文所提及，结合结构域可典型地包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；然而，其无需同时包含该两者。例如，Fd片段具有两个VH区且通常保留完整抗原结合结构域的一定抗原结合功能。(修饰的)抗原-结合抗体片段的实例包括(1)Fab片段，其为具有VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；(2)F(ab′)2片段，其为具有通过在绞链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(3)Fd片段，其具有两个VH和CH1结构域；(4)Fv片段，其具有抗体的单臂的VL和VH结构域，(5)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其具有VH结构域；(6)分离的互补决定区(CDR)，和(7)单链Fv(scFv)，后者是优选的(例如，源自scFV文库)。在例如WO00/006605、WO 2005/040220、WO 2008/119567、WO 2010/037838、WO2013/026837、WO 2013/026833、US 2014/0308285、US 2014/0302037、WO2014/144722、WO2014/151910和WO 2015/048272中描述了根据本发明的抗体构建体的实施方案的实例。
优选地，所述结合CDH3的结合结构域和/或所述结合CD3的结合结构域是人结合结构域。包含至少一个人结合结构域的抗体和抗体构建体避免了一些与具有比如啮齿类动物(如鼠、大鼠、仓鼠或兔)的非人可变区和/或恒定区的抗体或抗体构建体相关的问题。这种源自啮齿类动物的蛋白的存在可以导致抗体或抗体构建体的快速清除，或者可以导致患者针对该抗体或抗体构建体产生免疫反应。为了避免源自啮齿类动物的抗体或抗体构建体的使用，可以通过将人抗体功能引入啮齿类动物，使得啮齿类动物产生全长人抗体，来产生人或完全人抗体/抗体构建体。
在YAC中克隆和重构建百万碱基大小的人基因座并将它们引入小鼠种系中的能力提供强大的说明极大或粗略地定位的基因座的功能组分以及产生人类疾病的有效模型的方法。此外，使用该技术用小鼠基因座的人等效物置换小鼠基因座可提供对于研究期间人类基因产物的表达和调控、它们与其他系统的通信以及它们与疾病诱导和进程的关联的独特见解。
该策略的重要实际应用为小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座引入内源Ig基因已经失活的小鼠，提供了研究程序化表达和抗体组装的潜在机制以及它们在B细胞发育中的作用的机会。此外，该策略可提供用于产生完全人单克隆抗体(mAb)的理想来源——这是朝着在人类疾病中使用抗体疗法的重要里程碑。预期完全人抗体或抗体构建体最小化小鼠或源自小鼠的mAb所固有的免疫原性和过敏性反应，且因此增加所施用的抗体/抗体构建体的功效和安全性。可以预期使用完全人抗体或抗体构建体在需要重复化合物施用的慢性和复发性人类疾病(诸如炎症、自身免疫和癌症)的治疗中提供实质性优点。
一种朝着此目标的方法是用人Ig基因座的大型片段对小鼠抗体产生缺陷的小鼠品系进行工程改造，预期此类小鼠将在无小鼠抗体的情况下产生人抗体的大型谱系(repertoire)。大型人Ig片段将保留大的可变基因多样性以及抗体产生和表达的适当调节。通过利用小鼠机制实现抗体多样化和选择以及对人蛋白质的免疫耐受性不足，这些小鼠品系中所再生的人抗体谱系应产生针对任何目标抗原(包括人抗原)的高亲和力抗体。使用杂交瘤技术，可容易地产生和选择具有所需特异性的抗原特异性人mAb。结合第一XenoMouse小鼠品系的产生来证明该一般策略(参见Green等人，Nature Genetics 7：13-21(1994))。分别用含有人类重链基因座和κ轻链基因座的245kb和190kb大小的种系构造(configuration)片段的酵母人工染色体(YAC)工程改造XenoMouse品系，该片段含有核心可变区和恒定区序列。已证明含有人Ig的YAC在抗体的重排和表达方面均与小鼠系统相容且能够置换失活的小鼠Ig基因。此由其诱导B细胞发育、产生完全人抗体的成人样人谱系和产生抗原特异性人mAb的能力证明。这些结果还表明引入含有较大数目的V基因、其他调节元件和人Ig恒定区的人Ig基因座的较大部分可基本上概括对于感染和免疫的人体液反应的特征性的完全谱系。Green等人的工作最近扩展至通过分别引入人重链基因座和κ轻链基因座的百万碱基大小的种系构造YAC片段来引入大于约80％的人抗体谱系。参见Mendez等人，Nature Genetics 15：146-156(1997)和美国专利申请Ser.No.08/759,620。
XenoMouse小鼠的产生进一步论述和描绘于美国专利申请Ser.No.07/466,008、Ser.No.07/610,515、Ser.No.07/919,297、Ser.No.07/922,649、Ser.No.08/031,801、Ser.No.08/112,848、Ser.No.08/234,145、Ser.No.08/376,279、Ser.No.08/430,938、Ser.No.08/464,584、Ser.No.08/464,582、Ser.No.08/463,191、Ser.No.08/462,837、Ser.No.08/486,853、Ser.No.08/486,857、Ser.No.08/486,859、Ser.No.08/462,513、Ser.No.08/724,752和Ser.No.08/759,620；以及美国专利No.6,162,963、No.6,150,584、No.6,114,598、No.6,075,181和No.5,939,598；和日本专利No.3 068 180 B2、No.3 068506 B2和No.3 068 507 B2。还参见Mendez等人，Nature Genetics15：146-156(1997)以及Green和Jakobovits，J.Exp.Med.188：483-495(1998)、EP 0 463 151 B1、WO 94/02602、WO96/34096、WO 98/24893、WO 00/76310和WO 03/47336。
在替代性方法中，其他机构(包括GenPharm International，Inc.)利用“微型基因座”方法。在微型基因座方法中，通过包含来自Ig基因座的片段(个别基因)来模仿外源Ig基因座。因此，一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、μ恒定区和第二恒定区(优选为γ恒定区)形成为用于插入动物中的构建体。此方法描述于Surani等人的美国专利No.5,545,807以及Lonberg和Kay的美国专利No.5,545,806、No.5,625,825、No.5,625,126、No.5,633,425、No.5,661,016、No.5,770,429、No.5,789,650、No.5,814,318、No.5,877,397、No.5,874,299和No.6,255,458；Krimpenfort和Berns的美国专利No.5,591,669和No.6,023,010；Berns等人的美国专利No.5,612,205、No.5,721,367和No.5,789,215；和Choi和Dunn的美国专利No.5,643,763；以及GenPharm国际美国专利申请Ser.No.07/574,748、Ser.No.07/575,962、Ser.No.07/810,279、Ser.No.07/853,408、Ser.No.07/904,068、Ser.No.07/990,860、Ser.No.08/053,131、Ser.No.08/096,762、Ser.No.08/155,301、Ser.No.08/161,739、Ser.No.08/165,699、Ser.No.08/209,741。还参见EP 0 546 073 B1、WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO97/13852和WO 98/24884以及美国专利No.5，981，175。进一步参见Taylor等人(1992)、Chen等人(1993)、Tuaillon等人(1993)、Choi等人(1993)、Lonberg等人(1994)、Taylor等人(1994)和Tuaillon等人(1995)、Fishwild等人(1996)。
Kirin还证明自小鼠产生人抗体，所述小鼠中已经通过微细胞融合而引入染色体的大型片段或整个染色体。参见欧洲专利申请No.773 288和No.843 961。XenerexBiosciences正研究用于人抗体的潜在产生的技术。在此技术中，用人淋巴细胞(例如B细胞和/或T细胞)将SCID小鼠重构(reconstituted)。接着用抗原使小鼠免疫，然后该小鼠可产生针对抗原的免疫反应。参见美国专利No.5,476,996、No.5,698,767和No.5,958,765。
人抗小鼠抗体(HAMA)响应引导行业制备嵌合或以其他方式人源化的抗体。然而，预期将观察到某些人抗嵌合抗体(HACA)响应，尤其在抗体的长期或多剂量使用中。因此，需要提供包含针对CDH3的完全人结合结构域和针对CD3的完全人结合结构域的抗体构建体，以便使HAMA或HACA响应的问题和/或作用失效。
根据本发明，术语“(特异性地)结合”、“(特异性地)识别”、“(特异性地)针对”和“(特异性地)与...反应”的含义是结合结构域与位于靶蛋白或抗原(CDH3/CD3)上的表位的一个或多个、优选地至少两个、更优选地至少三个和最优选地至少四个氨基酸相互作用或特异性地相互作用。
术语“表位”是指结合结构域(比如抗体或免疫球蛋白或者抗体或免疫球蛋白的衍生物或片段)特异性结合的抗原上的位点。“表位”为抗原性的且因此术语表位在本文中有时还称为“抗原结构”或“抗原决定簇”。因此，结合结构域为“抗原相互作用位点”。所述结合/相互作用还理解为定义“特异性识别”。
“表位”可由邻接氨基酸或非邻接氨基酸形成，该邻接氨基酸或非邻接氨基酸通过蛋白质的三级折叠而并置(juxtapose)。“线性表位”为这样一种表位：其中氨基酸一级序列包含所识别的表位。线性表位在单一序列中典型地包括至少3个或至少4个，且更通常至少5个或至少6个或至少7个，例如约8个至约10个氨基酸，且该线性表位还可以更长并包含至少15个或20个氨基酸，至少25个或30个氨基酸，或甚至更多。
与线性表位不同，“构象表位”为这样一种表位：其中构成表位的氨基酸的一级序列并非所识别的表位的唯一定义组分(例如其中氨基酸的一级序列未必由结合结构域识别的表位)。典型地，构象表位与线性表位相比包含增加的数目的氨基酸。关于构象表位的识别，结合结构域识别抗原(优选肽或蛋白质或其片段)的三维结构(在本发明的上下文中，一个结合结构域的抗原包含于CDH3蛋白质内)。例如，当蛋白质分子折叠形成三维结构时，某些形成构象表位的氨基酸和/或多肽骨架(backbone)变为并置，从而使抗体能够识别表位。确定表位的构象的方法包括、但不限于X射线结晶学、二维核磁共振(2D-NMR)光谱学和定点自旋标记和电子顺磁共振(EPR)光谱学。
所提供的实施例描述了另一种表征给定结合结构域的方法，其包括给定结合结构域是否结合给定蛋白质(尤其是CDH3)的一或多个表位的试验。
如本文中所用的，术语“表位簇”表示位于抗原的所定义的邻接区段中的表位。表位簇可包含一个、两个或更多个表位。抗体构建体还可以结合表位簇内的表位，并且除了该簇外的其它表位，其可对应于不连续表位。不连续表位的特征通常在于其涵盖抗原的不连续的氨基酸区段。例如，抗体构建体可以结合胞外子结构域D3A和D3C，但不结合D3B。“表位簇”的概念还可用于本发明的抗体构建体的特征的表征。如上描述了并在图1中描绘了(在本发明的的上下文中)定义的CDH3胞外结构域中的表位簇和表位。
当人CDH3蛋白中的胞外结构域(D1-D5)或其子结构域(A、B、C)与非人和非灵长类动物(例如鸡或小鼠)CDH3抗原中的相应胞外结构域(D1-D5)或其子结构域(A、B、C)交换时(产生包含人CDH3的构建体，其中一个人胞外结构域或其子结构域被其对应的非人胞外结构域或其子结构域替换)，会出现结合结构域的结合降低。与人CDH3蛋白中的相应表位簇相比，并将与人CDH3蛋白中相应胞外结构域(D1-D5)或其子结构域的结合设定为100％，则所述降低优选为至少10％、20％、30％、40％、50％；更优选为至少60％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。设想前述人CDH3/非人CDH3嵌合体在CHO细胞中表达。还设想人CDH3/非人CDH3嵌合体与不同膜结合蛋白如EpCAM的跨膜结构域和/或胞质结构域融合。
一种测试这种由于与非人(例如鼠，但也可以设想其它动物如大鼠、仓鼠、兔、鸡等)CDH3抗原的相应胞外结构域(D1-D5)或其子结构域交换导致的结合损失的方法描述于实施例2中。另一种测定靶抗原的特定残基对于被抗体构建体或结合结构域识别的贡献的方法是丙氨酸扫描(例如参见，Morrison KL&Weiss GA.Cur Opin Chem Biol.2001Jun；5(3)：302-7)，其中每个待分析的残基例如通过定点诱变被丙氨酸替换。采用丙氨酸的原因在于其体积小、化学惰性、甲基官能团，仍然能够模拟其它多种氨基酸所具有的二级结构参照。在希望保留突变残基尺寸的情况下，有时可使用大体积的氨基酸例如缬氨酸或亮氨酸。丙氨酸扫描是已经使用很长时间的成熟技术。
结合结构域与表位或表位簇之间的相互作用意为结合结构域对特定蛋白质或抗原上的表位或表位簇显示可察觉的亲和力且通常不对除CDH3或CD3以外的蛋白质或抗原显示显著的反应性。“可察觉的亲和力”包括以约10-6M(KD)或更强的亲和力结合。优选地，在结合亲和力为约10-12至10-8M、10-12至10-9M、10-12至10-10M、10-11至10-8M、优选约10-11至10-9M时认为结合为特异性的。可尤其通过将所述结合结构域与靶蛋白质或抗原的反应与所述结合结构域与除CDH3或CD3以外的蛋白质或抗原的反应进行比较来容易地测试结合结构域是否与靶标特异性反应或特异性结合靶标。优选地，本发明的结合结构域基本上不结合或实质上不结合除CDH3或CD3以外的蛋白质或抗原(即第一结合结构域不能结合除CDH3以外的蛋白质且第二结合结构域不能结合除CD3以外的蛋白质)。
术语“基本上/实质上不结合”或“不能结合”意为本发明的结合结构域不结合除CDH3或CD3以外的蛋白质或抗原，即由此分别将与CDH3或CD3的结合设定为100％时，对除CDH3或CD3以外的蛋白质或抗原所显示的反应性不超过30％，优选不超过20％，更优选不超过10％，特别是优选不超过9％、8％、7％、6％或5％。
认为特异性结合由结合结构域和抗原的氨基酸序列中的特异性基序实现。因此，结合作为它们一级、二级和/或三级结构的结果以及所述结构的二级修饰的结果实现。抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用可导致所述位点与抗原的简单结合。此外，抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用可选地或另外可导致信号启动，例如由于抗原的构象的改变、抗原的寡聚化等的诱导。
另一方面，本发明提供一种双特异性抗体构建体，其包含结合靶细胞表面上的人CDH3的第一结合结构域(优选地人结合结构域)和结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域(优选地人结合结构域)，其中所述第一结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区包含选自下述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且所述VL区包含选自下述的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：
a)如SEQ ID NO：149中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO：150中描绘的CDR-H2、如SEQID NO：151中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO：152中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO：153中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO：154中描绘的CDR-L3；
b)如SEQ ID NO：159中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO：160中描绘的CDR-H2、如SEQID NO：161中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO：162中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO：163中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO：164中描绘的CDR-L3；
c)如SEQ ID NO：169中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO：170中描绘的CDR-H2、如SEQID NO：171中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO：172中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO：173中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO：174中描绘的CDR-L3；
d)如SEQ ID NO：179中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO：180中描绘的CDR-H2、如SEQID NO：181中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO：182中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO：183中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO：184中描绘的CDR-L3；
e)如SEQ ID NO：189中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO：190中描绘的CDR-H2、如SEQID NO：191中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO：192中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO：193中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO：194中描绘的CDR-L3；
f)如SEQ ID NO：199中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO：200中描绘的CDR-H2、如SEQID NO：201中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO：202中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO：203中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO：204中描绘的CDR-L3；
g)如SEQ ID NO：209中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO：210中描绘的CDR-H2、如SEQID NO：211中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO：212中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO：213中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO：214中描绘的CDR-L3；
h)如SEQ ID NO：219中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO：220中描绘的CDR-H2、如SEQID NO：221中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO：222中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO：223中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO：224中描绘的CDR-L3；
i)如SEQ ID NO：229中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO：230中描绘的CDR-H2、如SEQID NO：231中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO：232中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO：233中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO：234中描绘的CDR-L3；和
j)如SEQ ID NO：239中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO：240中描绘的CDR-H2、如SEQID NO：241中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO：242中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO：243中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO：244中描绘的CDR-L3。
另一方面，本发明提供一种双特异性抗体构建体，其包含结合靶细胞表面上的人CDH3的第一结合结构域(优选地人结合结构域)和结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域(优选地人结合结构域)，其中所述第一结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区包含选自下述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且所述VL区包含选自下述的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：
a)如SEQ ID NO：279中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO：280中描绘的CDR-H2、如SEQID NO：281中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO：282中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO：283中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO：284中描绘的CDR-L3；
b)如SEQ ID NO：289中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO：290中描绘的CDR-H2、如SEQID NO：291中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO：292中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO：293中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO：294中描绘的CDR-L3；
c)如SEQ ID NO：299中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO：300中描绘的CDR-H2、如SEQID NO：301中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO：302中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO：303中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO：304中描绘的CDR-L3；
d)如SEQ ID NO：309中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO：310中描绘的CDR-H2、如SEQID NO：311中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO：312中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO：313中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO：314中描绘的CDR-L3；
e)如SEQ ID NO：319中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO：320中描绘的CDR-H2、如SEQID NO：321中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO：322中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO：323中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO：324中描绘的CDR-L3；
f)如SEQ ID NO：329中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO：330中描绘的CDR-H2、如SEQID NO：331中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO：332中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO：333中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO：334中描绘的CDR-L3；
g)如SEQ ID NO：339中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO：340中描绘的CDR-H2、如SEQID NO：341中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO：342中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO：343中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO：344中描绘的CDR-L3；和
h)如SEQ ID NO：349中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO：350中描绘的CDR-H2、如SEQID NO：351中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO：352中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO：353中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO：354中描绘的CDR-L3。
术语“可变”是指抗体或免疫球蛋白结构域中显示序列可变性且与确定特定抗体的特异性和结合亲和力有关的部分(即“可变结构域”)。可变重链(VH)和可变轻链(VL)的配对一起形成单一抗原结合位点。将最靠近VH的CH结构域被命名为CH1。通过一个共价二硫键将每个轻(L)链连接至重(H)链，而取决于H链同种型，两个H链通过一个或多个二硫键彼此连接。
可变性在抗体的整个可变结构域中并非均匀分布；其集中于各重链和轻链可变区的子结构域中。这些子结构域称为“高变区”或“互补决定区”(CDR)。可变结构域的较保守(即非高变)的部分称为“框架”区(FRM或FR)，且该部分为三维空间中六个CDR提供骨架以形成抗原结合表面。天然存在的重链和轻链的可变结构域各自包含四个FRM区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其主要采取由三个高变区连接的β折叠构型，该三个高变区形成连接β片结构且在一些情况下形成β片结构的一部分的环。各链中的高变区通过FRM紧邻地保持在一起且与来自其他链的高变区一起促成抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，在上述引文中)。恒定结构域不直接参与抗原结合，但显示各种效应子功能，比如抗体依赖性、细胞介导的细胞毒性和补体活化。
术语“CDR”和其复数“CDRs”是指互补决定区，其中三个构成轻链可变区的结合特性(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)且三个构成重链可变区的结合特性(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)。CDR含有负责抗体与抗原特异性相互作用的大多数残基并由此促成抗体分子的功能活性：它们是抗原特异性的主要决定因素。
精确定义的CDR边界和长度视不同分类和编号系统而定。因此可通过Kabat、Chothia、接触型或任何其他边界定义(包括本文中所描述的编号系统)对CDR进行指代。尽管边界不同，但这些系统中的每一个在构成可变序列中的所谓的“高变区”的那种上有一定程度的重叠。因此，关于相邻框架区，根据这些系统的CDR定义可在长度和边界区域方面不同。参见例如Kabat(基于物种交叉序列可变性的方法)、Chothia(基于抗原-抗体复合物的结晶学研究的方法)和/或MacCallum(Kabat等人，在上述引文中；Chothia等人，J.Mol.Biol，1987，196：901-917；和MacCallum等人，J.MoI.Biol，1996，262：732)。另一种用于表征抗原结合位点的标准是Oxford Molecular′s AbM抗体建模软件使用的AbM定义。参见例如Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody VariableDomains.In：Antibody Engineering Lab Manual(Ed.：Duebel，S.和Kontermann，R.，Springer-Verlag，Heidelberg)。就两种残基识别技术定义重叠区而非相同区而言，可将这两种技术组合来定义杂交CDR。然而，优选根据所谓的Kabat系统的编号。
典型地，CDR形成可分类为正则结构的环结构。术语“正则结构”是指由抗原结合(CDR)环采用的主链构象。由比较性结构研究已发现，六种抗原结合环中的五种仅具有有限的可用构象谱系。每个正则结构可由多肽骨架的扭转角表征。因此，尽管环的大多数部分中具有高氨基酸序列可变性，但抗体之间的对应的环可具有极类似的三维结构(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，1987，196：901；Chothia等人，Nature，1989，342：877；Martin和Thornton，J.Mol.Biol，1996，263：800)。此外，在采用的环结构与围绕其的氨基酸序列之间存在联系。通过环的长度和环内以及保守性框架内(即环外)关键位置处驻留的氨基酸残基来确定特定正则类型的构象。因此可基于这些关键氨基酸残基的存在来分配至特定的正则类别。
术语“正则结构”还可包括对抗体的线性序列的考虑，例如如由Kabat(Kabat等人，在上述引文中)编目。Kabat编号方案(系统)为广泛采用的以一致方式对抗体可变结构域的氨基酸残基进行编号的标准且是还如本文中其他地方提及的用于本发明的优选方案。也可使用其他结构考虑因素确定抗体的正则结构。例如，那些未由Kabat编号完全反映的差异可由Chothia等人的编号系统描述和/或由其他技术揭示，例如结晶学和二维或三维计算建模。因此，可将给定抗体序列归入正则类别，其尤其允许识别合适的基础序列(例如基于文库中包括多种正则结构的需求)。文献中描述了抗体氨基酸序列的Kabat编号以及如由Chothia等人(在上述引文中)描述的结构考虑因素及其对理解抗体结构的正则方面的影响。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构象是本领域熟知的。关于抗体结构的综述参见Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow等人编，1988。
轻链的CDR3和特别是重链的CDR3可构成轻链和重链可变区内抗原结合的最重要的决定因素。在一些抗体构建体中，重链CDR3似乎构成抗原与抗体之间的主要接触区域。可使用仅CDR3变化的体外选择方案以改变抗体的结合特性或确定哪些残基有助于抗原的结合。因此，CDR3典型地为抗体结合位点内分子多样性的最大来源。例如，H3可短至两个氨基酸残基或大于26个氨基酸。
抗体基因的序列在组装和体细胞突变后高度变化，且估计这些变化的基因编码1010种不同抗体分子(Immunoglobulin Genes，第2版，Jonio等人编，Academic Press，SanDiego，CA，1995)。因此，免疫系统提供免疫球蛋白的谱系。术语“谱系”是指至少一种完全或部分地从至少一种编码至少一种免疫球蛋白的序列衍生的核苷酸序列。序列可通过重链的V、D和J区段以及轻链的V和J区段的体内重排产生。可选地，序列可由响应于例如体外刺激而发生重排的细胞产生。或者，可由DNA剪接、核苷酸合成、诱变和其他方法获得部分或所有序列，参见例如美国专利5,565,332。谱系可包括仅一个序列或可包括多个序列，包括遗传上多种多样的集合中的序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含VH区，所述VH区选自如SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：235和SEQ ID NO：245中描绘的VH区。
在本发明的抗体构建体的另一实施方案中，所述第一结合结构域包含VL区，所述VL区选自如SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：226、SEQ ID NO：236和SEQ ID NO：246中描绘的VL区。
在本发明的抗体构建体的另一实施方案中，所述第一结合结构域包含选自VH区和VL区，所述VH区和VL区选自如SEQ ID NO：155+156、SEQ ID NO：165+166、SEQ ID NO：175+176、SEQ ID NO：185+186、SEQ ID NO：195+196、SEQ ID NO：205+206、SEQ ID NO：215+216、SEQ ID NO：225+226、SEQ ID NO：235+236和SEQ ID NO：245+246中描绘的VH区和VL区的配对。
在另一实施方案中，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含VH区，所述VH区选自如SEQ ID NO：285、SEQ ID NO：295、SEQ ID NO：305、SEQ ID NO：315、SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：335、SEQ ID NO：345和SEQ ID NO：355中描绘的VH区。
在本发明的抗体构建体的又一实施方案中，所述第一结合结构域包含VL区，所述VL区选自如SEQ ID NO：286、SEQ ID NO：296、SEQ ID NO：306、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：326、SEQ ID NO：336、SEQ ID NO：346和SEQ ID NO：356中描绘的VL区。
在本发明的抗体构建体的另一实施方案中，所述第一结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区和VL区选自如SEQ ID NO：285+286、SEQ ID NO：295+296、SEQ ID NO：305+306、SEQ ID NO：315+316、SEQ ID NO：325+326、SEQ ID NO：335+336、SEQ ID NO：345+346和SEQID NO：355+356中描绘的VH区和VL区的配对。
如本文中所用的术语“双特异性”是指“至少双特异性”的抗体构建体，即其包含至少第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结合结构域结合一个抗原或靶标(本文：CDH3)，和所述第二结合结构域结合另一抗原或靶标(本文：CD3)。因此，根据本发明的抗体构建体包含针对至少两个不同抗原或靶标的特异性。本发明的术语“双特异性抗体构建体”也涵盖多特异性抗体构建体，例如三特异性抗体构建体，后者包含三个结合结构域，或具有超过三种(例如四种、五种...)特异性的构建体。
鉴于根据本发明的抗体构建体是(至少)双特异性的，其并非天然存在的且与天然存在的产物显著不同。因此，“双特异性”抗体构建体或免疫球蛋白是具有至少两个具有不同特异性的不同结合位点的人工杂交抗体或免疫球蛋白。双特异性抗体可以通过包括杂交瘤的融合或Fab’片段的连接的多种方法产生。参见例如Songsivilai&Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)。
本发明的抗体构建体的至少两个结合结构域和可变结构域可包含或不包含肽连接子(间隔肽)。根据本发明的术语“肽连接子”定义一种氨基酸序列，本发明的抗体构建体的一个(可变和/或结合)结构域和另一(可变和/或结合)结构域的氨基酸序列通过所述氨基酸序列而彼此连接。这种肽连接子的必要技术特征为所述肽连接子不包含任何聚合活性。合适肽连接子包括美国专利4,751,180和4,935,233或WO 88/09344中描述的肽连接子。
若使用连接子，则此连接子优选具有足以确保第一结构域和第二结构域中的每一者可彼此独立地保留其不同结合特异性的长度和序列。对于连接本发明抗体构建体中至少两个结合结构域(或两个可变结构域)的肽连接子，这些肽连接子优选为包含仅少数氨基酸残基(例如12个氨基酸残基或小于12个氨基酸残基)的肽连接子。因此，优选12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸残基的肽连接子。具有小于5个氨基酸的预期肽连接子包含4、3、2或1个氨基酸，其中优选富含Gly的连接子。在所述”肽连接子”的上下文中，尤其优选的“单”氨基酸为Gly。因此，所述肽连接子可由单氨基酸Gly组成。肽连接子的另一优选实施方案由氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(即Gly4Ser(SEQ ID NO：393)，或其聚合物，即(Gly4Ser)x，其中x为1或大于1的整数)表征。所述肽连接子的特征(其包括二级结构的促进作用的缺失)是本领域已知的且描述于例如Dall’Acqua等人(Biochem.(1998)37，9266-9273)；Cheadle等人(Mol Immunol(1992)29，21-30)以及Raag和Whitlow(FASEB(1995)9(1)，73-80)中。优选也不促进任何二级结构的肽连接子。如实施例中所描述的，所述结构域彼此之间的连接(linkage)可由例如遗传工程提供。本领域熟知用于制备融合且可操作地连接的双特异性单链构建体并在哺乳动物细胞或细菌中表达其的方法(例如WO 99/54440或Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，2001)。
由此，本发明提供一种优选的实施方案，其中所述抗体构建体是选自(scFv)2、scFv-单结构域mAb、双抗体及上述形式的任意的寡聚体的形式。术语“是...的形式”不排除所述构建体可如本文中所描述的例如通过附着或融合至其它部分而被进一步修饰。
根据特别优选的实施方案，本发明的抗体构建体为“双特异性单链抗体构建体”，更优选为双特异性“单链Fv”(scFv)。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由独立基因编码的，但它们可使用重组的方法通过合成连接子相连，该合成连接子使它们能够成为单一蛋白质链，在该单一蛋白质链中VL区与VH区配对以形成单价分子；参见例如Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：5879-5883)。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，且片段的功能以与完整或全长抗体相同的方式评估。因此，单链可变片段(scFv)是一种通常用约10至约25个氨基酸、优选约15至20个氨基酸的短连接子肽连接的免疫球蛋白的重链(VH)可变区和轻链(VL)可变区的融合蛋白。该连接子通常富含甘氨酸以获得柔性，以及丝氨酸或苏氨酸以获得溶解度，且该连接子可将VH的N-末端与VL的C-末端相连，反之亦然。尽管移除了恒定区并引入了连接子，但是该蛋白保留了原始免疫球蛋白的特异性。
双特异性单链分子是本领域已知的且描述于WO 99/54440；Mack，J.Immunol.(1997)，158，3965-3970；Mack，PNAS，(1995)，92，7021-7025；Kufer，CancerImmunol.Immunother.，(1997)，45，193-197；Blood，(2000)，95，6，2098-2103；Brühl，Immunol.，(2001)，166，2420-2426；Kipriyanov，J.Mol.Biol.，(1999)，293，41-56中。所描述的用于产生单链抗体的技术(尤其参见美国专利4,946,778；Kontermann和Dübel(2010)，在上述引文中；和Little(2009)，在上述引文中)可适用于产生特异性识别所选靶标的单链抗体构建体。
可通过连接两个scFv分子工程化二价(也称为双价)或双特异性单链可变片段(具有(scFv)2形式的二价-scFv或双价-scFv)。如果这两个scFv分子具有相同的结合特异性，则得到的(scFv)2分子将优选称为二价的(即其对相同靶表位具有两个价)。如果这两个scFv分子具有不同的结合特异性，则得到的(scFv)2分子优选称为双特异性的。所述连接可通过产生具有两个VH区和两个VL区的单肽链，得到串联scFv来完成(参见例如Kufer P.等人，(2004)Trends in Biotechnology 22(5)：238-244)。另一种可能性是产生具有连接子肽的scFv分子，所述连接子肽对于两个可变区来说太短而无法折叠在一起(例如约5个氨基酸)，从而迫使scFv二聚化。这种类型称为双抗体(参见例如Hollinger、Philipp等人，(July1993)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 90(14)：6444-8.)。
根据本发明的抗体构建体的进一步优选实施方案，结合结构域(结合靶抗原CDH3或CD3)的重链(VH)和轻链(VL)不通过如上文所描述的肽连接子直接连接，而是所述结合结构域按照针对双抗体所描述的形成。因此，可通过肽连接子将CD3结合结构域的VH融合至CDH3结合结构域的VL，和通过这样的肽连接子将CDH3结合结构域的VH融合至CD3结合结构域的VL。
单结构域抗体包含仅一个(单体)抗体可变结构域，其独立于其他V区或结构域而选择地结合具体抗原。第一个单结构域抗体自骆驼中发现的重链抗体工程化而来，并将这些抗体命名为VHH片段。软骨鱼也具有重链抗体(IgNAR)，从其可获得称为VNAR片段的单结构域抗体。一种可选的方法是将来自例如人或啮齿类动物的普通免疫球蛋白的二聚体可变结构域分裂为单体，因此获得作为单结构域Ab的VH或VL。尽管对于单结构域抗体的大多数研究目前基于重链可变结构域，但是也已显示源自轻链的纳米抗体特异地结合靶表位。单结构域抗体的实例称为sdAb、纳米抗体或单可变结构域抗体。
因此，(单结构域mAb)2是由(至少)两个单结构域单克隆抗体组成的单克隆抗体构建体，所述单结构域单克隆抗体单独地选自VH、VL、VHH和VNAR。优选地，所述连接子为肽连接子的形式。类似地，“scFv-单结构域mAb”是由至少一个如上文所描述的单结构域抗体和一个如上文所描述的scFv分子组成的单克隆抗体构建体。再次，优选地，所述连接子为肽连接子的形式。
在一个实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自如SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：197、SEQID NO：207、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：237和SEQ ID NO：247中描绘的那些序列。
在另一实施方案中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自如SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：327、SEQID NO：337、SEQ ID NO：347和SEQ ID NO：357中描绘的那些序列。
还预期本发明的抗体构建体除其结合靶分子CDH3和CD3的功能外，还具有其他功能。在此形式中，抗体构建体通过经由结合于CDH3而靶向靶细胞、经由CD3结合而介导细胞毒性T细胞活性和提供其他功能而为三功能或多功能抗体构建体，其他功能诸如经由效应细胞(例如NK细胞)的募集而介导抗体依赖性细胞毒性的完全功能性Fc恒定结构域、标记(荧光的等)、治疗剂(比如毒素或放射性核素)和/或增强血清半衰期的手段等等。
延长本发明抗体构建体的血清半衰期的手段的实例包括融合或以其他方式附着至所述抗体构建体的肽、蛋白或蛋白结构域。肽、蛋白或蛋白结构域的组包括与在人体中具有优选药物动力学概况的其他蛋白(比如血清白蛋白)(参见WO 2009/127691)结合的肽。这些肽的一个实例在SEQ ID NO：437中表示。这种半衰期延长(HLE)肽的另一概念包括与新生儿Fc受体结合的肽(FcRn，参见WO 2007/098420)，其也用于本发明的一些构建体中。附着蛋白质的较大结构域或完整蛋白的概念包括例如融合人血清白蛋白、人血清白蛋白的变体或突变体(参见WO 2011/051489、WO 2012/059486、WO2012/150319、WO 2013/135896、WO2014/072481、WO 2013/075066)或其结构域以及融合免疫球蛋白的恒定区(Fc结构域)和其变体。为了允许期望的二聚体或多聚体配对、消除Fc受体结合(例如Fcγ受体)或出于其他原因而对Fc结构域的这种变体进行优化/修饰。若上文所描述的HLE分子由仅一个单多肽链组成，它们具有以下优点：(i)无需两个独立的表达系统，和(ii)由于不存在“虚拟(dummy)链”，因此这些HLE分子可以高纯度分离。本领域已知的延长所述小蛋白化合物在人体中的半衰期的另一概念是这些化合物(比如本发明的抗体构建体)的聚乙二醇化。
在优选的实施方案中，例如，为了延长所述构建体的血清半衰期，根据本发明的双特异性抗体构建体可与融合配偶体(比如蛋白或多肽或肽)(例如通过肽键)连接。这些融合配偶体可选自人血清白蛋白(“HSA”或“HALB”)及其序列变体、结合HAS的肽、结合FcRn(“FcRn BP”)的肽或包含(衍生自抗体的)Fc区的构建体。这些融合配偶体的示例性序列描绘于SEQ ID NOs：406-421和437-444。通常，所述融合配偶体可直接地(例如通过肽键)或通过比如(GGGGS)n(其中“n”是2或更大的整数(例如2或3或4))的肽连接子与根据本发明的双特异性抗体构建体的N-末端或C-末端连接。合适的肽连接子描绘于SEQ ID NOs：392-400。
为了延长构建体的血清半衰期，将命名为CDH3-13(如SEQ ID NO：178中描绘的双特异性分子的全长序列)的抗体构建体在框架中与选择的融合蛋白或融合肽(参见例如SEQID NOs：437-444)连接。这些融合构建体的相应序列描绘于SEQ ID NOs：379-389。“裸”双特异性抗体构建体的这些融合配偶体的序列也可与本文中公开的任意其它抗体构建体(C-或N-末端，以其对应于CDH3-13和针对CDH3-13所示的方式)连接。
因此，设想本发明的双特异性抗体构建体进一步包含如SEQ ID NO：437中描绘的多肽或白蛋白，优选(具有改善性质(比如对FcRn受体的亲和力和延长的血浆半衰期)的)人白蛋白或其变体，最优选为如SEQ ID NO：443或444描绘的白蛋白。优选这些部分在框架内与双特异性抗体构建体的C-末端融合。
实施例15进一步显示白蛋白与本发明的双特异性抗体构建体C-末端融合涉及的出乎意料的优点。对于那些包含对人和白鬓狨(Callithrix jacchus)、绒顶柽柳猴(Saguinus oedipus)或松鼠猴(Saimiri sciureus)CD3ε链特异性的结合结构域的双特异性T细胞接合(engaging)分子，其中表位是包含在WO2008/119567的SEQ ID NOs：2、4、6或8中的氨基酸序列的部分并至少包含氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu，当以很高浓度使用时，观察到即使不存在靶细胞，这些分子仍显示出T细胞的细胞毒性。这种高浓度问题可与特定施用途径变得相关或与特定靶标设定和所需化合物浓度相关联。优选的这种结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域的实例描述于下文并在SEQ ID NOs：445-537中描绘。参见图13，当将血清白蛋白融合至这种双特异性构建体的C-末端时，避免了T细胞的细胞毒性。不受理论的束缚，可通过抗体构建体经由CD3结合结构域的二聚化或多聚化来解释在存在高浓度T细胞接合双特异性抗体构建体和不存在靶细胞情况下的T细胞活化。这种二聚化或多聚化通过白蛋白或其变体与抗体构建体的C-末端的融合而空间受损，同时维持抗体构建体的T细胞接合作用模式的特征。
因此，优选的根据本发明的抗体构建体从N-至C-末端的顺序包含：
●第一结合结构域，其具有选自SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：227、SEQ IDNO：237、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：347和SEQ ID NO：357的氨基酸序列；
●具有选自SEQ ID NOs：392-400的氨基酸序列的肽连接子；
●第二结合结构域，其具有选自SEQ ID NO：453、SEQ ID NO：462、SEQ ID NO：471、SEQ ID NO：480、SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：516、SEQ IDNO：525、SEQ ID NO：534和SEQ ID NO：537的氨基酸序列；和
●任选地具有选自SEQ ID NOs：392-400的氨基酸序列的肽连接子；和
●具有选自SEQ ID NOs：437、443和444的氨基酸序列的多肽。
根据另一优选的实施方案，本发明的双特异性抗体构建体(除两个结合结构域外)包含第三结构域，该第三结构域包含两个多肽单体，每个单体包含铰链、CH2和CH3结构域，其中所述两个多肽(或多肽单体)通过肽连接子彼此融合。优选地，所述第三结构域从N-至C-末端的顺序包含：铰链-CH2-CH3-连接子-铰链-CH2-CH3。优选的所述第三结构域的氨基酸序列在SEQ ID NOs：414-421中描绘。所述多肽单体的每一个优选具有选自SEQ ID NOs：406-413的氨基酸序列，或具有与这些序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在另一优选的实施方案中，本发明双特异性抗体构建体的所述第一和第二结合结构域通过肽连接子与所述第三结构域融合，所述肽连接子例如选自SEQ ID NOs：392-400中的任意之一，优选地选自SEQ ID NOs：392、393、395、396、397、399和400中的任意之一。
根据本发明，“铰链”是IgG铰链区。该区可通过使用Kabat编号的类比来识别，参见Kabat位置223-243。根据以上所述，对“铰链”的最低要求是根据Kabat编号对应于D231至P243的IgG，序列区段的氨基酸残基。术语CH2和CH3是指免疫球蛋白重链恒定区2和3。这些区也可通过使用Kabat编号的类比来识别，参见对CH2的Kabat位置244-360和对CH3的Kabat位置361-478。应当理解，就免疫球蛋白的IgGl Fc区、IgG2Fc区、IgG3Fc区、IgG4Fc区、IgMFc区域、IgA Fc区、IgD Fc区和IgE Fc区而言，免疫球蛋白之间存在一定差异(参见例如Padlan，Molecular Immunology，31(3)，169-217(1993))。术语Fc单体意指IgA、IgD和IgG的最后两个重链恒定区，以及IgE和IgM的最后三个重链恒定区。Fc单体还可以在这些结构域的N-末端包含柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc单体可包含J链。对于IgG，Fc部分包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3和前两个结构域与CH2之间的铰链。尽管免疫球蛋白的Fc部分的边界可变，但是可将包含功能铰链、CH2和CH3结构域的人IgG重链Fc部分的实例定义为例如分别包含IgG4的(铰链结构域的)残基D231至(CH3结构域的C-末端的)P476，或D231至L476，其中编号依据Kabat。
本发明的抗体构建体因此可从N-至C-末端的顺序包含：
(a)第一结合结构域；
(b)具有选自SEQ ID NOs：393、399和400的氨基酸序列的肽连接子；
(c)第二结合结构域；
(d)具有选自SEQ ID NOs：392、393、395、396、397、399和400的氨基酸序列的肽连接子；
(e)第三结构域的第一多肽单体(包含铰链、CH2和CH3结构域)；
(f)具有选自SEQ ID NOs：402、403、404和405的氨基酸序列的肽连接子；和
(g)第三结构域的第二多肽单体(包含铰链、CH2和CH3结构域)。
还优选地，本发明的抗体构建体从N-至C-末端的顺序包含：
(a)第一结合结构域，其具有选自SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：227、SEQID NO：237、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：347和SEQ ID NO：357的氨基酸序列；
(b)具有选自SEQ ID NOs：393、399和400的氨基酸序列的肽连接子；
(c)第二结合结构域，其具有选自SEQ ID NO：453、SEQ ID NO：462、SEQ ID NO：471、SEQ ID NO：480、SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：516、SEQID NO：525、SEQ ID NO：534和SEQ ID NO：537的氨基酸序列；
(d)具有选自SEQ ID NOs：392、393、395、396、397、399和400的氨基酸序列的肽连接子；
(e)具有选自SEQ ID NOs：414-421的氨基酸序列的第三结构域。
因此，在优选的实施方案中，本发明的抗体构建体包含选自如下的多肽或由选自如下的多肽组成：SEQ ID NO：422、SEQ ID NO：423、SEQ ID NO：424、SEQ ID NO：425、SEQ IDNO：426、SEQ ID NO：427、SEQ ID NO：428、SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：430、SEQ ID NO：431、SEQ ID NO：432、SEQ ID NO：433、SEQ ID NO：434和SEQ ID NO：435中描绘的那些。
还参考实施例15，其显示上文所描述的Fc构建体之一及其在小鼠异种移植模型中的抗肿瘤活性。
抗体构建体的共价修饰也包括在本发明的范围内，且通常但并非始终在翻译后进行。例如，通过使抗体构建体的特定氨基酸残基与能够与所选侧链或N-末端残基或C-末端残基反应的有机衍生剂反应来将抗体构建体的若干种共价修饰引入分子中。
半胱氨酰残基最通常与α-卤代乙酸酯(和相应胺)(比如氯乙酸或氯乙酰胺)反应以产生羧甲基或羧酰氨基甲基衍生物。还通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基(imidozoyl))丙酸、磷酸氯乙酰酯、N-烷基顺丁烯二酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑反应使半胱氨酰残基衍生。
通过与焦碳酸二乙酯在pH 5.5-7.0下反应使组氨酰残基衍生，因为此试剂对组氨酰侧链具有相对特异性。对溴苯甲酰溴也是有用的；反应优选在0.1M二甲胂酸钠中于pH6.0下进行。赖氨酰和氨基末端残基与丁二酸或其他羧酸酐反应。用这些试剂进行的衍生作用具有逆转赖氨酰残基的电荷的作用。其他适用于衍生含有α-氨基的残基的试剂包括亚氨酸酯，比如甲基吡啶亚氨酸甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4-戊二酮；和与乙醛酸的转氨酶催化反应。
通过与一种或若干种常规试剂反应来修饰精氨酰残基，所述试剂包括苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己烷二酮和茚三酮。由于胍官能团的高pKa，精氨酸残基的衍生需要在碱性条件下进行反应。此外，这些试剂可与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基反应。
可进行酪氨酰残基的特定修饰，尤其关注通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷的反应将光谱标记引入酪氨酰残基中。最通常地，分别使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷形成O-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。使用125I或131I将酪氨酰残基碘化以制备经标记的蛋白质以用于放射免疫分析法中，上文所描述的氯胺T方法是合适的。
通过与碳化二亚胺(R′-N＝C＝N--R′)反应来选择性修饰羧基侧基团(天冬氨酰或谷氨酰)，其中R和R′为任选不同的烷基，比如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳化二亚胺。此外，通过与铵离子反应将天冬氨酰和谷氨酰残基转化为天冬酰胺酰和谷胺酰胺酰残基。
用双功能试剂的衍生可用于使本发明的抗体构建体与用于多种方法的水不溶载体基质或表面交联。常用的交联剂包括例如1，1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如与4-叠氮基水杨酸的酯)、同双功能性亚氨酸酯(包括二丁二酰亚胺酯，比如3，3′-二硫基双(琥珀酰亚胺丙酸酯))和双功能性顺丁烯二酰亚胺，比如双-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷。比如甲基-3-[(对叠氮基苯基)二硫基]丙酰亚氨酸酯的衍生剂产生可光活化中间物，其能够在光存在下形成交联。或者，使用反应性水不溶性基质(比如溴化氰活化的碳水化合物)和如美国专利No.3,969,287、No.3,691,016、No.4,195,128、No.4,247,642、No.4,229,537和No.4,330,440中描述的反应性基底进行蛋白质固定。
通常将谷氨酰胺酰残基和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺化为相应的谷氨酰残基和天冬氨酰残基。或者，在温和酸性条件下将这些残基脱酰胺化。这些残基的任一种形式均属于本发明的范围内。
其他修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基中羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structureand Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，1983，第79-86页)，N-末端胺的乙酰化，和任何C-末端羧基的酰胺化。
包含在本发明的范围内的抗体构建体的另一种共价修饰包括改变蛋白质的糖基化模式。如本领域已知，糖基化模式可取决于蛋白质序列(例如存在或不存在特定糖基化氨基酸残基，下文中论述)或产生蛋白质的宿主细胞或生物体。特定表达系统论述于下文中。
多肽的糖基化通常为N-连接的或O-连接的。N-连接的是指碳水化合物部分附着至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为除脯氨酸以外的任何氨基酸)为碳水化物部分与天冬酰胺侧链的酶促附着的识别序列。因此，多肽中存在这些三肽序列中的任一种均产生潜在糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖类N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一者附着至羟基氨基酸，尽管还可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸，但最通常为丝氨酸或苏氨酸。
通过改变氨基酸序列使得其含有一个或多个上文所描述的三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)来便利地实现向抗体构建体添加糖基化位点。还可通过向起始序列添加或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(对于O-连接的糖基化位点)来进行改变。为方便起见，优选通过DNA水平的变化来改变抗体构建体的氨基酸序列，特别是通过使编码多肽的DNA在预先选择的碱基处突变使得产生将翻译为所需氨基酸的密码子。
另一增加抗体构建体上碳水化合物部分的数目的方法为通过糖苷与蛋白质的化学或酶促偶合。这些操作程序的益处在于它们无需在具有进行N-连接和O-连接糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生蛋白质。基于所用的偶合模式，糖可连接至(a)精氨酸和组氨酸，(b)自由羧基，(c)自由硫氢基，比如半胱氨酸的自由硫氢基，(d)自由羟基，比如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的自由羟基，(e)芳族残基，比如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于WO 87/05330以及Aplin和Wriston，1981，CRCCrit.Rev.Biochem.，第259-306页中。
可由化学或酶促方式实现起始抗体构建体上的碳水化合物部分的移除。化学去糖基化需要使蛋白质暴露于化合物三氟甲磺酸或等同化合物。此处理引起除连接糖(N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基半乳糖胺)以外的大部分或所有糖裂解而保留多肽完整。化学去糖基化由Hakimuddin等人，1987，Arch.Biochem.Biophys.259：52和Edge等人，1981，Anal.Biochem.118：131描述。多肽上的碳水化合物部分的酶促裂解可通过使用多种内切糖苷酶和外切糖苷酶实现，如由Thotakura等人，1987，Meth.Enzymol.138：350描述。可通过使用化合物衣霉素(tunicamycin)来防止潜在糖基化位点处的糖基化，如由Duskin等人，1982，J.Biol.Chem.257：3105描述的。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键的形成。
本文还考虑了抗体构建体的其它修饰。例如，抗体构建体的另一种共价修饰包含将抗体构建体以美国专利No.4,640,835、No.4,496,689、No.4,301,144、No.4,670,417、No.4,791,192或No.4,179,337中阐述的方式连接至各种非蛋白质性聚合物，包括但不限于各种多羟基化合物(polyol)，比如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化亚烷基，或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。此外，如本领域已知，例如为了促进聚合物(比如PEG)的添加，可在抗体构建体内的各种位置进行氨基酸置换。
在一些实施方案中，本发明的抗体构建体的共价修饰包含添加一个或多个标记。标记基团可经由各种长度的间隔臂(spacer arm)与抗体构建体偶合以降低潜在位阻。本领域已知多种用于标记蛋白质的方法且可用于实施本发明。术语“标记”或“标记基团”是指任何可检测的标记。通常，基于标记将在何种分析法中被检测而使它们属于多种类别，包括但不限于以下实例：
a)同位素标记，其可为放射性同位素或重同位素，比如放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、89Zr、90Y、99Tc、111In、125I、131I)；
b)磁性标记(例如磁颗粒)；
c)氧化还原活性部分；
d)光学染料(包括但不限于生色团、磷光体和荧光团)，比如荧光基团(例如FITC、若丹明(rhodamine)、镧系元素磷光体)、化学发光基团和可以是“小分子”荧光团(fluore)或蛋白质性荧光团的荧光团；
e)酶基团(例如辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；
f)生物素化基团；
g)由二级报道子(reporter)(例如亮氨酸拉链配对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签等)识别的预定多肽表位。
“荧光标记”意指任何可经由其固有的荧光性质而被检测的分子。合适的荧光标记包括但不限于荧光素、若丹明、四甲基若丹明、曙红(eosin)、藻红(erythrosin)、香豆素(coumarin)、甲基-香豆素、芘、孔雀绿(Malacite green)、芪、荧光黄(Lucifer Yellow)、Cascade BlueJ、得克萨斯红(Texas Red)、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、俄勒冈绿(Oregon green)、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、Cascade蓝(Cascade Blue)、Cascade黄(Cascade Yellow)和R-藻红素(PE)(Molecular Probes，Eugene，OR)、FITC、若丹明和得克萨斯红(Pierce，Rockford，IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science，Pittsburgh，PA)。合适的光学染料(包括荧光团)由Richard P.Haugland描述于分子探针手册(Molecular Probes Handbook)中。
合适的蛋白质性荧光标记还包括但不限于绿色荧光蛋白质，包括GFP的海肾(Renilla)、海笔(Ptilosarcus)或水母(Aequorea)品种(Chalfie等人，1994，Science 263：802-805)、EGFP(Clontech Laboratories，Inc.，Genbank登记号U55762)、蓝色荧光蛋白(BFP，Quantum Biotechnologies，Inc.1801de Maisonneuve Blvd.West，第8层，Montreal，Quebec，Canada H3H 1J9；Stauber，1998，Biotechniques 24：462-471；Heim等人，1996，Curr.Biol.6：178-182)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP，Clontech Laboratories，Inc.)、荧光素酶(Ichiki等人，1993，J.Immunol.150：5408-5417)、β半乳糖苷酶(Nolan等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2603-2607)和海肾(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019，美国专利No.5,292,658、No.5,418,155、No.5,683,888No.5,741,668No.5,777,079、No.5,804,387、No.5,874,304、No.5,876,995、No.5,925,558)。
亮氨酸拉链结构域为促进蛋白质(亮氨酸拉链结构域见于该蛋白质中)的寡聚的肽。亮氨酸拉链最初发现于若干DNA结合蛋白中(Landschulz等人，1988，Science 240:1759)，且随后在多种不同蛋白质中发现。已知亮氨酸拉链包括天然存在的肽及其衍生物(二聚的或三聚的)。适用于产生可溶性寡聚体蛋白质的亮氨酸拉链结构域的实例描述于PCT申请WO 94/10308中，且来源于肺表面活性蛋白质D(SPD)的亮氨酸拉链描述于Hoppe等人，1994，FEBS Letters 344:191中。可允许所融合的异源蛋白质的稳定三聚化的经修饰的亮氨酸拉链的用途描述于Fanslow等人，1994，Semin.Immunol.6：267-78中。在一种方法中，在合适的宿主细胞中表达包含与亮氨酸拉链肽融合的CDH3抗体片段或衍生物的重组融合蛋白质，且从培养物上清液回收所形成的可溶性寡聚体CDH3抗体片段或衍生物。
本发明的抗体构建体还可包含其他结构域，其例如有助于分子的分离或与分子的经调试的药物动力学概况有关。有助于抗体构建体的分离的结构域可从肽基序或第二引入部分中选择，其可以在分离方法(例如分离柱)中捕获。此类其他结构域的非限制性实施方案包含称为Myc-标签、HAT-标签、HA-标签、TAP-标签、GST-标签、甲壳素结合结构域(CBD-标签)、麦芽糖结合蛋白质(MBP-标签)、Flag-标签、Strep-标签及其变体(例如StrepII-标签)以及His-标签的肽基序。所有本文中公开的由所鉴别的CDR表征的抗体构建体均优选包含His-标签结构域，其通常称为分子的氨基酸序列中连续His残基的重复，优选为五个，和更优选地六个His残基(六组氨酸，参见SEQ ID NO：436)。所述His-标签可位于例如抗体构建体的N-末端或C-末端，优选地位于C-末端。最优选地，六组氨酸标签(HHHHHH)经由肽键连接至根据本发明的抗体构建体的C-末端。
本发明的抗体构建体的第一结合结构域结合靶细胞表面上的人CDH3。人CDH3的氨基酸序列由SEQ ID NO：1表示。应理解，在本发明上下文中术语“表面上”意指所述结合结构域特异性结合包含在CDH3胞外结构域(CDH3 ECD)中的表位或表位簇。当根据本发明的第一结合结构域由天然表达细胞或细胞系或者由用CDH3转化或(稳定地/瞬时地)转染的细胞或细胞系表达时，根据本发明的第一结合结构域因此优选地结合CDH3。在优选的实施方案中，当在体外结合分析法(比如BIAcore或Scatchard)中将CDH3用作“靶标”或“配体”分子时，所述第一结合结构域还结合CDH3。“靶细胞”可以是在其表面上表达CDH3的任意原核或真核细胞；优选地，所述靶细胞是人或动物体的部分的细胞，比如肿瘤或癌细胞。
术语“CDH3 ECD”是指CDH3的本质上不含CDH3的跨膜结构域和细胞质结构域的形式。技术人员将理解，鉴别以用于本发明的CDH3多肽的跨膜结构域根据本领域中常规用于鉴别该类型的疏水性结构域的标准进行鉴别。跨膜结构域的精确边界可变化，但该变化在本文中特定提及的结构域的任一端处通常不超过约5个氨基酸。优选的人类CDH3 ECD示于SEQ ID NO：3中。
第一结合结构域对人CDH3的亲和力优选≤15nM，更优选≤10nM，甚至更优选≤5nM，甚至更优选≤1nM，甚至更优选≤0.5nM，甚至更优选≤0.1nM和最优选≤0.05nM。可在例如如实施例中所描述的例如BIAcore分析法或Scatchard分析法中测量所述亲和力。其他测定亲和力的方法为技术人员所熟知。
T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中发挥重要作用的一类淋巴细胞(其本身是一种白细胞)。T细胞有若干亚类，每一类具有不同的功能。可通过细胞表面上存在的T细胞受体(TCR)将T细胞与其他淋巴细胞(比如B细胞和NK细胞)相区分。TCR负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原并由两种不同的蛋白链组成。在95％的T细胞中，TCR由α和β链组成。当TCR与抗原肽和MHC(肽/MHC复合物)接合时，通过由相关酶、共同受体、特化的衔接头(specialized adaptor)分子以及活化或释放的转录因子介导的一系列生物化学事件活化T淋巴细胞。
CD3受体复合物为蛋白质复合物且由四条链组成。在哺乳动物中，复合物含有CD3γ(gamma)链、CD3δ(delta)链和两个CD3ε(epsilon)链。这些链与T细胞受体(TCR)和所谓的ζ(zeta)链关联以形成T细胞受体CD3复合物并产生T淋巴细胞中的活化信号。CD3γ(gamma)、CD3δ(delta)和CD3ε(epsilon)链是包含单个胞外免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3分子的细胞内尾部(intracellular tail)包含称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或简称为ITAM的单个保守基序，其对于TCR的信号传导能力至关重要。CD3ε分子是人类中由存在于染色体11上的CD3E基因编码的多肽。最优选的CD3结合表位对应于人CD3ε胞外结构域的氨基酸残基1-27。
由多特异性(至少双特异性)抗体构建体经由T细胞募集进行的靶细胞的重新定向裂解涉及溶细胞突触形成以及穿孔素和颗粒酶的递送。接合的T细胞能够进行连续靶细胞裂解，且不受免疫逃避机制(其妨碍肽抗原加工和呈递)或克隆性T细胞分化影响；参见例如WO 2007/042261。
可以各种方式测量由CDH3/CD3双特异性抗体构建体介导的细胞毒性。效应细胞可以是例如经刺激的富集的(人)CD8阳性T细胞或未经刺激的(人)外周血液单核细胞(PBMC)。如果靶细胞具有猕猴起源或表达猕猴CDH3或用猕猴CDH3转染，则效应细胞也应具有猕猴起源，比如猕猴T细胞系，例如4119LnPx。靶细胞应表达CDH3例如人或猕猴CDH3(至少其胞外结构域)。靶细胞可为用CDH3(例如人或猕猴CDH3)稳定或瞬时转染的细胞系(诸如CHO)。或者，靶细胞可为CDH3阳性天然表达体细胞系。通常，预期在细胞表面上以较高水平表达CDH3的靶细胞系的情况下，EC50值较低。效应细胞与靶细胞(E：T)的比率通常为约10：1，但也可变化。可在51-铬释放分析法(约18小时温育时间)中或在基于FACS的细胞毒性分析法(约48小时温育时间)中测量CDH3/CD3双特异性抗体构建体的细胞毒性活性。还可修改分析法温育时间(细胞毒性反应)。其他测量细胞毒性的方法已为技术人员熟知且包含MTT或MTS分析法、包括生物发光分析法的基于ATP的分析法、磺酰罗丹明B(sulforhodamine B；SRB)分析法、WST分析法、克隆生成(clonogenic)分析法和ECIS技术。
优选在基于细胞的细胞毒性分析法中测量由本发明的CDH3/CD3双特异性抗体构建体介导的细胞毒性活性。其也可以在51-铬释放分析法中测量。其由EC50值表示，EC50值对应于半最大效应浓度(引起基线值与最大值之间的一半细胞毒性响应的抗体构建体的浓度)。优选地，CDH13xCD3双特异性抗体构建体的EC50值≤5000pg/ml或≤4000pg/ml，更优选≤3000pg/ml或≤2000pg/ml，甚至更优选≤1000pg/ml或≤500pg/ml，甚至更优选≤400pg/ml或≤300pg/ml，甚至更优选≤200pg/ml，甚至更优选≤100pg/ml，甚至更优选≤50pg/ml，甚至更优选≤20pg/ml或≤10pg/ml，和最优选≤5pg/ml。
可通过不同的分析法测量上文给定的EC50值。技术人员意识到可预期与未经刺激的PBMC相比，当将经刺激的/富集的CD8+T细胞用作效应细胞时，EC50值较低。还可预期与低靶表达大鼠相比，当靶细胞表达高数量靶抗原时，EC50值较低。例如，当使用经刺激的/富集的CD8+T细胞作为效应细胞(和采用CDH3转染的细胞(比如CHO细胞)或CDH3阳性天然表达细胞系(比如A431)作为靶细胞)时，CDH3xCD3双特异性抗体构建体的EC50值优选≤1000pg/ml，更优选≤500pg/ml，甚至更优选≤250pg/ml，甚至更优选≤100pg/ml，甚至更优选≤50pg/ml，甚至更优选≤10pg/ml，和最优选≤5pg/ml。当采用人PBMC作为效应细胞时，CDH3xCD3双特异性抗体构建体的EC50值优选≤5000pg/ml或≤4000pg/ml(特别是当靶细胞为CDH3阳性天然表达细胞系(比如A431)时)，更优选≤2000pg/ml(特别是当靶细胞为CDH3转染的细胞(比如CHO细胞)时)，更优选≤1000pg/ml或≤500pg/ml，甚至更优选≤200pg/ml，甚至更优选≤150pg/ml，甚至更优选≤100pg/ml，和最优选≤50pg/ml或更低。当采用猕猴T细胞系(比如LnPx4119)作为效应细胞，和采用猕猴CDH3转染的细胞系(比如CHO细胞)作为靶细胞系时，CDH3xCD3双特异性抗体构建体的EC50值优选≤2000pg/ml或≤1500pg/ml，更优选≤1000pg/ml或≤500pg/ml，甚至更优选≤300pg/ml或≤250pg/ml，甚至更优选≤100pg/ml，和最优选≤50pg/ml。
优选地，本发明的CDH3/CD3双特异性抗体构建体不诱导/介导CDH3阴性细胞(比如CHO细胞)的裂解或基本上不诱导/介导CDH3阴性细胞(比如CHO细胞)的裂解。术语“不诱导裂解”、“基本上不诱导裂解”、“不介导裂解”或“基本上不介导裂解”意指本发明的抗体构建体不诱导或介导CDH3阴性细胞的大于30％的裂解，优选不大于20％，更优选不大于10％，特别优选不大于9％、8％、7％、6％或5％，其中将CDH3阳性细胞系(比如A431)的裂解设定为100％。这通常适用于浓度高达500nM的抗体构建体。本领域技术人员无需再费周折即可知道如何测量细胞裂解。另外，本说明书教导了如何测量细胞裂解的具体说明。
个别CDH3/CD3双特异性抗体构建体的单体同种型与二聚体同种型之间的细胞毒性活性的差异称为“效能差距”。此效能差距可例如计算为分子的单体形式的EC50值与二聚体形式的EC50值之间的比率。本发明的CDH3/CD3双特异性抗体构建体的效能差距优选≤5，更优选≤4，甚至更优选≤3，甚至更优选≤2，和最优选≤1。作为实例，CDH3-13的效能差距测定为0.5，CDH3-13xCD3-HLE (Fc)的效能差距测定为0.9，CDH3-25的效能差距测定为0.7，和CDH3-25xCD3-HALB的效能差距也测定为0.7。
本发明的抗体构建体的第一和/或第二(或任意其它)结合结构域优选是对哺乳动物灵长目的成员跨物种特异性的。跨物种特异性CD3结合结构域例如描述于WO 2008/119567中。根据一个实施方案，除了分别与人CDH3和人CD3结合外，第一和/或第二结合结构域还将结合包括(但不限于)新世界灵长类动物(比如白鬓狨、绒顶柽柳猴或松鼠猴)、旧世界灵长类动物(比如狒狒(baboon)和猕猴)、长臂猿(gibbon)和非人亚科(homininae)的灵长类动物的CDH3/CD3。
本发明的一方面，所述第一结合结构域结合人CDH3并进一步结合猕猴CDH3(比如食蟹猴(Macaca fascicularis)的CDH3(SEQ ID NO：5))，和更优选地，结合猕猴CDH3 ECD。第一结合结构域对猕猴CDH3的亲和力优选≤15nM，更优选≤10nM，甚至更优选≤5nM，甚至更优选≤1nM，甚至更优选≤0.5nM，甚至更优选≤0.1nM，和最优选≤0.05nM或甚至≤0.01nM。
优选地，根据本发明的抗体构建体对结合猕猴CDH3相对于(versus)人CDH3[maCDH3：hu CDH3]的亲和力差距(由如通过BiaCore或通过Scatchard分析确定的，参见实施例)为0.1至10，更优选地为0.2至5，甚至更优选地为0.3至2.5，甚至更优选地为0.4至2，和最优选地为0.5至1。
在本发明抗体构建体的一个实施方案中，所述第二结合结构域结合人和白鬓狨、绒顶柽柳猴或松鼠猴CD3ε。优选地，所述第二结合结构域结合这些CD3ε链的胞外表位。还设想所述第二结合结构域结合人和猕猴属(Macaca)CD3ε链的胞外表位。最优选的CD3ε表位包含在人CD3ε胞外结构域的氨基酸残基1-27中。甚至更具体地，该表位至少包含氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu。白鬓狨和绒顶柽柳猴均为属于狨猴(Callitrichidae)家族的新世界灵长类动物，而松鼠猴是属于卷尾猴(Cebidae)家族的新世界灵长类动物。
对本发明的抗体构建体特别优选地是，结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域包含VL区，所述VL区包含选自如下的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：
(a)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：27中描绘的CDR-L1、如WO2008/119567的SEQID NO：28中描绘的CDR-L2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：29中描绘的CDR-L3；
(b)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：117中描绘的CDR-L1、如WO2008/119567的SEQID NO：118中描绘的CDR-L2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：119中描绘的CDR-L3；和
(c)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：153中描绘的CDR-L1、如WO2008/119567的SEQID NO：154中描绘的CDR-L2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：155中描绘的CDR-L3。
在本发明的抗体构建体的可选地优选实施方案中，结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域包含VH区，所述VH区包含选自下述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3：
(a)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：12中描绘的CDR-H1、如WO2008/119567的SEQID NO：13中描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：14中描绘的CDR-H3；
(b)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：30中描绘的CDR-H1、如WO2008/119567的SEQID NO：31中描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：32中描绘的CDR-H3；
(c)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：48中描绘的CDR-H1、如WO2008/119567的SEQID NO：49中描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：50中描绘的CDR-H3；
(d)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：66中描绘的CDR-H1、如WO2008/119567的SEQID NO：67中描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：68中描绘的CDR-H3；
(e)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：84中描绘的CDR-H1、如WO2008/119567的SEQID NO：85中描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：86中描绘的CDR-H3；
(f)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：102中描绘的CDR-H1、如WO2008/119567的SEQID NO：103中描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：104中描绘的CDR-H3；
(g)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：120中描绘的CDR-H1、如WO2008/119567的SEQID NO：121中描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：122中描绘的CDR-H3；
(h)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：138中描绘的CDR-H1、如WO2008/119567的SEQID NO：139中描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：140中描绘的CDR-H3；
(i)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：156中描绘的CDR-H1、如WO2008/119567的SEQID NO：157中描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：158中描绘的CDR-H3；和
(j)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：174中描绘的CDR-H1、如WO2008/119567的SEQID NO：175中描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：176中描绘的CDR-H3。
对于本发明的抗体构建体进一步优选地，结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域包含选自如WO 2008/119567的SEQ ID NO：35、39、125、129、161或165中描绘的VL区的VL区。
或者优选的是结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域包含选自如WO 2008/119567的SEQ ID NO：15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181中描绘的VH区的VH区。
更优选地，本发明的抗体构建体由结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域表征，该第二结合结构域包含选自如下的VL区和VH区：
(a)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：17或21中描绘的VL区和如WO2008/119567的SEQ ID NO：15或19中描绘的VH区；
(b)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：35或39中描绘的VL区和如WO2008/119567的SEQ ID NO：33或37中描绘的VH区；
(c)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：53或57中描绘的VL区和如WO2008/119567的SEQ ID NO：51或55中描绘的VH区；
(d)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：71或75中描绘的VL区和如WO2008/119567的SEQ ID NO：69或73中描绘的VH区；
(e)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：89或93中描绘的VL区和如WO2008/119567的SEQ ID NO：87或91中描绘的VH区；
(f)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：107或111中描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：105或109中描绘的VH区；
(g)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：125或129中描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：123或127中描绘的VH区；
(h)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：143或147中描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：141或145中描绘的VH区；
(i)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：161或165中描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：159或163中描绘的VH区；和
(j)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：179或183中描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：177或181中描绘的VH区。
上文结合人CD3的并在WO 2008/119567中公开的结合结构域也描绘于本申请的SEQ ID NOs：445-537中。
根据本发明的抗体构建体的优选实施方案，所述结合结构域、特别是第二结合结构域(其结合T细胞表面上的人CD3)具有以下形式：VH区与VL区的配对是单链抗体(scFv)的形式。VH区和VL区以顺序VH-VL或VL-VH排列。优选VH区N-末端地定位至连接子序列，和VL区C-末端地定位至连接子序列。
本发明的上文所描述的抗体构建体的优选实施方案由结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域表征，该第二结合结构域包含选自WO2008/119567中的SEQ ID NO：23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，所述抗体构建体具有选自如SEQ ID NO：158、SEQ IDNO：168、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：238和SEQ ID NO：248中描绘的那些序列的氨基酸序列。
在本发明的另一实施方案中，所述抗体构建体具有选自如SEQ ID NO：379、SEQ IDNO：380、SEQ ID NO：381、SEQ ID NO：382、SEQ ID NO：383、SEQ ID NO：384、SEQ ID NO：385、SEQ ID NO：386、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：388和SEQ ID NO：389中描绘的那些序列的氨基酸序列。
在本发明的另一实施方案中，所述抗体构建体具有选自如SEQ ID NO：288、SEQ IDNO：298、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：348和SEQ ID NO：358中描绘的那些序列的氨基酸序列。
也考虑本文中所描述的抗体构建体的氨基酸序列修饰。例如，可能需要改善抗体构建体的结合亲和力和/或其他生物学性质。通过将适当核苷酸改变引入抗体构建体核酸或通过肽合成来制备抗体构建体的氨基酸序列变体。所有下文所描述的氨基酸序列修饰应得到仍然保留未修饰的亲本分子的所需生物活性(结合CDH3和CD3)的抗体构建体。
术语“氨基酸”或“氨基酸残基”典型地是指具有本领域所认识的定义的氨基酸，比如选自下述的氨基酸：丙氨酸(Ala或A)；精氨酸(Arg或R)；天冬酰胺(Asn或N)；天冬氨酸(Asp或D)；半胱氨酸(Cys或C)；谷氨酰胺(Gln或Q)；谷氨酸(Glu或E)；甘氨酸(Gly或G)；组氨酸(His或H)；异亮氨酸(He或I)：亮氨酸(Leu或L)；赖氨酸(Lys或K)；甲硫氨酸(Met或M)；苯丙氨酸(Phe或F)；脯氨酸(Pro或P)；丝氨酸(Ser或S)；苏氨酸(Thr或T)；色氨酸(Trp或W)；酪氨酸(Tyr或Y)；和缬氨酸(Val或V)，但也可根据需要使用经修饰的、合成的或稀有的氨基酸。通常，氨基酸可分组为具有非极性侧链(例如Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；带负电荷侧链(例如Asp、Glu)；带正电荷侧链(例如Arg、His、Lys)；或不带电荷极性侧链(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr)。
氨基酸修饰包括例如抗体构建体的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或置换。可产生缺失、插入和置换的任意组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有所需特征。氨基酸的变化还可改变抗体构建体的翻译后过程，比如改变糖基化位点的数目或位置。
例如，可在每个CDR中插入或缺失1、2、3、4、5或6个氨基酸(当然，这取决于它们的长度)，而可在每个FR中插入或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25个氨基酸。优选地，氨基酸序列插入包括与含有一百个或更多个残基的多肽的长度在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基范围内的氨基-末端和/或羧基-末端融合，以及单氨基酸残基或多氨基酸残基的序列内插入。本发明的抗体构建体的插入变体包括与酶的抗体构建体的N-末端或C-末端的融合或与增加抗体构建体的血清半衰期的多肽的融合。
最受关注的用于置换诱变的位点包括重链和/或轻链的CDR，特别是高变区，但还考虑重链和/或轻链中的FR变化。该置换优选为如本文中所描述的保守性置换。优选地，取决于CDR或FR的长度，CDR中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸可被置换，而框架区(FR)中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25个氨基酸可被置换。例如，若CDR序列涵盖6个氨基酸，则设想这些氨基酸中的1、2或3个被置换。类似地，若CDR序列涵盖15个氨基酸，则设想这些氨基酸中的1、2、3、4、5或6个氨基酸被置换。
一种用于鉴别抗体构建体中作为用于诱变的优选位置的某些残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells在Science，244：1081-1085(1989)中描述的。此处，抗体构建体内的残基或靶残基的组经鉴别(例如带电荷残基，比如arg、asp、his、lys和glu)并由中性或带负电荷氨基酸(最优选为丙氨酸或聚丙氨酸)替换，以影响氨基酸与表位的相互作用。
接着通过在置换位点处或针对置换位点引入另外或其他的变体来精制那些对置换显示功能性敏感的氨基酸位置。因此，尽管用于引入氨基酸序列变化的位点是预定的，但突变本身的性质无需预定。例如，为了分析或优化给定位点处突变的性能，在靶标密码子或区域处进行丙氨酸扫描或随机诱变，并针对所需活性的最佳组合筛选表达的抗体构建体变体。用于在具有已知序列的DNA中的预定位点处产生置换突变的技术是熟知的，例如M13引物诱变和PCR诱变。采用抗原结合活性(比如CDH3或CD3结合)的分析法进行突变体的筛选。
通常，如果重链和/或轻链的一或多个或全部CDR中的氨基酸被置换，则优选由此获得的“被置换的”序列与“初始”CDR序列具有至少60％、更优选65％、甚至更优选70％、特别优选75％、更特别优选80％的同一性。此意为CDR与“被置换的”序列的同一性程度取决于CDR的长度。例如，具有5个氨基酸的CDR优选与其被置换的序列具有80％的同一性以便使至少一个氨基酸被置换。因此，抗体构建体的CDR可与它们被置换的序列具有不同程度的同一性，例如CDRL1可具有80％，而CDRL3可具有90％。
优选的置换(或替换)为保守性置换。然而，预见任何置换(包括非保守性置换或来自下表1中列出的“示例性置换”中的一个或多个)，只要抗体构建体保留其经由第一结合结构域结合CDH3或经由第二结合结构域结合CD3ε的能力和/或其CDR与由此被置换的序列具有同一性(与“初始”CDR序列具有至少60％、更优选65％、甚至更优选70％、特别优选75％、更特别优选80％的同一性)即可。
保守性置换示于表1中的“优选置换”标题下。如果此类置换引起生物活性的改变，则可引入表1中命名为“示例性置换”或如下文关于氨基酸类别进一步描述的更显著改变，且针对所需特征筛选产物。
表1：氨基酸置换
初始 示例性置换 优选的置换
Ala(A) val、leu、ile val
Arg(R) lys、gln、asn lys
Asn(N) gln、his、asp、lys、arg gln
Asp(D) glu、asn glu
Cys(C) ser、ala ser
Gln(Q) asn、glu asn
Glu(E) asp、gln asp
Gly(G) ala ala
His(H) asn、gln、lys、arg arg
Ile(I) leu、val、met、ala、phe leu
Leu(L) 正亮氨酸、ile、val、met、ala ile
Lys(K) arg、gln、asn arg
Met(M) leu、phe、ile leu
Phe(F) leu、val、ile、ala、tyr tyr
Pro(P) Ala ala
Ser(S) Thr thr
Thr(T) Ser ser
Trp(W) tyr、phe tyr
Tyr(Y) trp、phe、thr、ser phe
Val(V) ile、leu、met、phe、ala leu
本发明的抗体构建体的生物学性质的实质性修饰通过选择它们在保持下述的作用方面显著不同的置换来实现：(a)置换区域中多肽骨架的结构，例如为片状或螺旋状构象，(b)靶标位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。基于常见侧链性质将天然存在的残基分组：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性：cys、ser、thr；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：ash、gin、his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；和(6)芳香族：trp、tyr、phe。
非保守性置换需要将这些类别中的一者的成员变换为另一类别。任何与保持抗体构建体的适当构象无关的半胱氨酸残基均可被置换(通常被丝氨酸置换)以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可向抗体中添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当抗体为抗体片段(比如Fv片段)时)。
对于氨基酸序列，通过使用本领域已知的标准技术测定序列同一性和/或相似性，包括(但不限于)Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2：482的局部序列同一性算法；Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443的序列同一性比对算法；Pearson和Lipman，1988，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.85：2444的相似性检索方法；这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575ScienceDrive，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；由Devereux等人，1984，Nucl.AcidRes.12：387-395描述的最优拟合序列程序，优选使用默认设置，或通过检验。优选地，基于以下参数通过FastDB计算同一性百分比：错配罚分为1；空位罚分为1；空位尺寸罚分为0.33；和接合罚分为30，″Current Methods in Sequence Comparison andAnalysis，″Macromolecule Sequencing and Synthesis，Selected Methods andApplications，第127-149页(1988)，Alan R.Liss，Inc.。
可用算法的实例为PILEUP。PILEUP使用进行性逐对比对从一组相关序列产生多重序列比对。它也可以绘制示出用于创建比对的聚类关系的树。PILEUP使用Feng&Doolittle，1987，J.Mol.Evol.35：351-360的进行性比对方法的简化形式；该方法与由Higgins和Sharp，1989，CABIOS 5：151-153描述的方法类似。可用的PILEUP参数包括默认空位权重3.00、默认空位长度权重0.10和加权端空位。
可用算法的另一实例为BLAST算法，描述于：Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-410；Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402；和Karin等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5873-5787中。特别有用的BLAST程序为WU-BLAST-2程序，其从Altschul等人，1996，Methods in Enzymology 266：460-480获得。WU-BLAST-2使用若干检索参数，其中大部分设定为默认值。通过以下值设定可调整参数：重迭跨度＝1，重迭分数＝0.125，字阈值(T)＝II。HSP S和HSP S2参数为动态值且由程序本身依据特定序列的组成和特定数据库(正针对其检索目标序列)的组成而建立；然而，可调节该值以增加灵敏性。
另一种可用算法为空位BLAST，如由Altschul等人，1993，Nucl.Acids Res.25：3389-3402报导。空位BLAST使用BLOSUM-62取代分数；阈值T参数设定为9；使用二次命中方法触发无空位扩展，空位长度k承担10+k的代价；Xu设定为16，且Xg设定为40以用于数据库检索阶段且设定为67以用于算法的输出阶段。通过对应于约22个位的分数来触发空位比对。
通常，各个变体CDR与本文中描绘的序列之间的氨基酸同源性、相似性或同一性为至少60％，且更典型地优选为更高的同源性或同一性，为至少65％或70％，更优选地至少75％或80％，甚至更优选地至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，和几乎100％。以类似方式，关于本文中鉴别的结合蛋白质的核酸序列的“核酸序列同一性百分比(％)”定义为候选序列中与抗体构建体的编码序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。具体方法使用设定成默认参数的WU-BLAST-2的BLASTN模块，其中重叠跨度和重叠分数分别设定为1和0.125。
通常，编码各个变体CDR的核苷酸序列与本文中描绘的核苷酸序列之间的核酸序列同源性、相似性或同一性为至少60％，且更典型地优选为更高的同源性或同一性，为至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，和几乎100％。因此，“变体CDR”为这样一种CDR：其与本发明的亲本CDR具有指定同源性、相似性或同一性，且共享生物功能，包括但不限于亲本CDR的特异性和/或活性的至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体构建体在标准研究规模条件(如在标准的两步骤纯化过程)下显示高单体产率。优选地，根据本发明的抗体构建体的单体产率≥0.25mg/L上清液，更优选≥0.5mg/L，甚至更优选≥1mg/L，和最优选≥3mg/L上清液。
类似地，可以测定二聚体抗体构建体同种型的产率并因此测定抗体构建体的单体百分比(即单体：(单体+二聚体))。可在例如来自滚瓶中标准化研究规模生产的培养物上清液的SEC纯化步骤中获得单体和二聚体抗体构建体的生产率和计算的单体百分比。在一个实施方案中，抗体构建体的单体百分比≥80％，更优选≥85％，甚至更优选≥90％，和最优选≥95％。
在进一步的实施方案中，根据本发明的抗体构建体与人种系的同一性百分比≥70％或≥75％，更优选≥80％或≥85％，甚至更优选≥90％，和最优选≥95％。参见实施例7。认为与人抗体种系基因产物的同一性是降低治疗过程中治疗蛋白引发患者针对药物的免疫反应风险的重要特征。Hwang&Foote(“Immunogenicity of engineered antibodies”；Methods 36(2005)3-10)证明药物抗体构建体非人部分的减少导致了治疗过程中诱导患者抗药物抗体的风险降低。通过比较大量临床评估的抗体药物和相应的免疫原性数据，表明的趋势为，与携带未改变的非-人V区的抗体(平均23.59％的患者)相比，抗体V区的人源化使得该蛋白的免疫原性降低(平均5.1％的患者)。因此，对于抗体构建体形式的基于V区的蛋白疗法需要与人序列具有较高程度的同一性。为了测定种系同一性，可采用Vector NT软件和通过将相同氨基酸残基除以VL的氨基酸残基总数的以百分比计的计算的氨基酸序列，将VL的V区与人种系V片段和J片段(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)的氨基酸序列进行比对。对于VH片段(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)也是如此，除了由于其高度多样性和缺少现有的人种系VH CDR3比对配偶体，而可排除VH CDR3外。之后可采用重组技术以增加与人抗体种系基因的序列同一性。
在一个实施方案中，抗体构建体优选具有≤5、更优选≤4或≤3.5、甚至更优选≤3或≤2.5、和最优选≤2或≤1.5或≤1的血浆稳定性(具有血浆的EC50与不具有(w/o)血浆的EC50的比率)。可通过在37℃下于人血浆中温育构建体24小时，随后在51-铬释放细胞毒性分析法中测定EC50来测试抗体构建体的血浆稳定性。细胞毒性分析法中的效应细胞可以是经刺激的富集的人CD8阳性T细胞。靶细胞可以是例如用人CDH3转染的CHO细胞。效应细胞与靶细胞的比率(E∶T)可选择为10∶1。用于这一目的的人血浆池(plasma pool)源自由涂布EDTA的注射器收集的健康供体的血液。通过离心除去细胞组分，收集上层血浆相，然后合并。作为对照，在RPMI-1640培养基中，在细胞毒性分析法之前立即稀释抗体构建体。血浆稳定性按EC50(血浆温育后)与EC50(对照)的比率计算。参见实施例11。
优选地，本发明抗体构建体的单体向二聚体的转化是很低的。这种转化可在不同条件下测量并通过高效尺寸排阻色谱分析。例如，抗体构建体的单体同种型的温育可在培养箱中于37℃下和例如100μg/ml或250μg/ml的浓度下进行7天。在这些条件下，优选本发明的抗体构建体显示的二聚体百分比≤5％，更优选≤4％，甚至更优选≤3％，甚至更优选≤2.5％，甚至更优选≤2％，甚至更优选≤1.5％，和最优选≤1％。参见实施例9。
还优选地，本发明的双特异性抗体构建体在多次冷冻/解冻循环后仍呈现非常低的二聚体转化。例如，在通用配方缓冲剂中将抗体构建体单体调节至250μg/ml的浓度并进行三个冷冻/解冻循环(在-80℃下冷冻30min，然后在室温下解冻30min)，然后用高效SEC测定已经转化为二聚体抗体构建体的初始单体抗体构建体的百分比。优选地，例如在三个冷冻/解冻循环后，双特异性抗体构建体的二聚体百分比≤5％，更优选≤4％，甚至更优选≤3％，甚至更优选≤2.5％，甚至更优选≤2％，甚至更优选≤1.5％，和最优选≤1％。
本发明的双特异性抗体构建体优选显示良好的热稳定性，其聚集温度为50℃以上或52℃以上，更优选地为54℃以上或55℃以上，甚至更优选地为56℃以上或57℃以上，和最优选地为58℃以上或59℃以上。热稳定性参数可根据抗体聚集温度如下测定：将浓度为250μg/ml的抗体溶液转移到单次使用的比色杯中并置于动态光散射装置中。将样品以0.5℃/min的加热速率从40℃加热到70℃，其中恒定采集测量的半径(radius)。将表明蛋白质熔融(melting)和聚集的半径增加用于计算抗体的聚集温度。参见实施例10。
可选地，可通过差示扫描量热法(DSC)测定温度熔融曲线以确定抗体构建体的固有生物物理学蛋白质稳定性。采用MicroCal LLC(Northampton，MA，U.S.A)VP-DSC装置进行这些实验。与仅含有制剂缓冲液的样品相比，含抗体构建体的样品的能量吸收记录为20℃至90℃。在例如SEC流动缓冲液中将抗体构建体调节至终浓度为250μg/ml。为了记录相应的熔融曲线，全部样品的温度逐步升高。在每一温度T处记录样品和制剂缓冲液参考品的能量吸收。将样品的能量吸收Cp(kcal/mole/℃)减去参考品的差值对相应的温度绘图。将熔融温度定义为第一次最大能量吸收时的温度。
进一步设想，本发明的CDH3xCD3双特异性抗体不与人CDH3旁系同源物CDH1、CDH2、CDH4和CDH5交叉反应(即不与其结合)。此外，设想本发明的CDH3xCD3双特异性抗体不与猕猴/食蟹猴(cyno)CDH3旁系同源物CDH1、CDH2、CDH4和CDH5交叉反应(即不与其结合)。参见实施例6。
还设想本发明的CDH3xCD3双特异性抗体具有≤0.1、更优选≤0.05的混浊度(如将纯化的单体抗体浓缩至2.5mg/ml并过夜温育后通过OD340测量的)。参见实施例12。
在进一步实施方案中，根据本发明的抗体构建体在酸性pH下稳定。抗体构建物在非生理pH(比如pH 5.5)(运行例如阳离子交换色谱所需的pH)下的耐受性越强，从离子交换色谱柱上洗脱的抗体构建体回收量相对于加载蛋白的总量越高。在pH5.5下从离子(例如阳离子)交换色谱柱的抗体构建体的回收量优选≥30％，更优选≥40％，更优选≥50％，甚至更优选≥60％，甚至更优选≥70％，甚至更优选≥80％，和最优选≥90％。
进一步设想，本发明的双特异性抗体构建体显示治疗功效或抗-肿瘤活性。这一特性可以在例如如实施例14中公开的研究中评估。
技术人员已知如何修饰或调整本研究的某些参数，比如注射的肿瘤细胞的数量、注射部位、移植的人T细胞的数量、双特异性抗体构建体的施用量以及时间轴，而仍达到有意义的和可再现的结果。优选地，所述肿瘤生长抑制T/C[％]为≤70或≤60，更优选≤50或≤40，甚至更优选≤30或≤20，和最优选≤10或≤5或甚至≤2.5。
本发明进一步提供编码本发明抗体构建体的多核苷酸/核酸分子。
多核苷酸是由13个或更多个共价键合在一条链中的核苷酸单体组成的生物聚合物。DNA(比如cDNA)和RNA(比如mRNA)是具有不同生物功能的多核苷酸的实例。核苷酸是用作核酸分子(如DNA或RNA)的单体或亚基的有机分子。核酸分子或多核苷酸可以是双链也可以是单链的，可以是线性的也可以是环形的。所述核酸分子优选包含于载体中，而该载体优选包含于宿主细胞中。所述宿主细胞例如在用本发明载体或多核苷酸转化或转染后，能够表达抗体构建体。为了该目的，将多核苷酸或核酸分子可操作地与控制序列连接。
遗传密码是通过其将编码在遗传物质(核酸)中的信息翻译成蛋白质的一组规则。活细胞中的生物解码是通过核糖体实现的，核糖体按照mRNA指定的顺序连接氨基酸，使用tRNA分子携带氨基酸，并一次读出mRNA三个核苷酸。该密码定义了这些核苷酸三联体(称为密码子)的序列如何指定在蛋白质合成期间接下来将添加哪种氨基酸。除了一些例外，核酸序列中的三核苷酸密码子指定单个氨基酸。因为绝大多数基因是用完全相同的密码编码的，所以这个特定的密码通常被称为规范或标准的遗传密码。尽管遗传密码决定了给定编码区的蛋白质序列，但是其他基因组区可以影响这些蛋白质产生的时间和地点。
此外，本发明提供一种载体，其包含本发明的多核苷酸/和核酸分子。
载体是一种核酸分子，其用作将(外源)遗传物质运送至细胞中的工具。术语“载体”包含但不限于质粒、病毒、粘粒及人工染色体。一般情况下，工程化载体包含复制起点、多克隆位点和可选择标记物。载体本身通常为核苷酸序列，常常是DNA序列，所述序列包括插入物(转基因)和用作载体“骨架”的较大的序列。现代载体除了转基因插入物和骨架还包括另外的特征：启动子、遗传标记物、抗生素抗性、报告基因、靶向序列、蛋白质纯化标签。称为表达载体(表达构建体)的载体具体为用于在靶细胞中表达转基因，该载体通常含有控制序列。
术语“控制序列”是指可操作地连接的编码序列在特定宿主生物体中表达所必须的DNA序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子，可选择地包含操纵子序列及核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸与另一核酸序列处于一种功能性关系时，这种核酸是“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌前导的DNA表达为参与多肽分泌的蛋白前体形式，则将前序列或分泌前导的DNA可操作地连接至多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则将启动子或增强子可操作地连接至该序列；或如果核糖体结合位点被设置以便促进翻译，则将该核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，，“可操作地连接的”指所连接的DNA序列是邻接的，并且在分泌前导的情况下是邻接的且处于阅读相。但是，增强子不必是邻接的。连接通过在方便的限制性位点通过连接反应完成。如果这种位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸的衔接子(adaptor)或连接子。
“转染”是有意将核酸分子或多核苷酸(包括载体)引入靶细胞的过程。该术语主要用于真核细胞中的非病毒方法。转导通常用于描述病毒介导的核酸分子或多核苷酸的转移。动物细胞的转染通常涉及在细胞膜中打开瞬时孔或“洞”，以允许摄取材料。可以使用磷酸钙、通过电穿孔、通过细胞挤压或通过将阳离子脂质与材料混合以产生与细胞膜融合并将它们的运载物沉积入内部的脂质体，进行转染。
术语“转化”用于描述核酸分子或多核苷酸(包括载体)向细菌中和也向非动物真核细胞(包括植物细胞)中的非病毒转移。因此，转化是细菌或非动物真核细胞的基因改变，其通过细胞膜从其周围直接摄取并随后并入外源遗传材料(核酸分子)而产生。转化可以通过人工手段实现。为了发生转化，细胞或细菌必须处于感受态的状态，这种状态可作为对比如饥饿和细胞密度的环境条件的时间限制反应而产生。
此外，本发明提供一种用本发明的多核苷酸/核酸分子或用本发明的载体转化或转染的宿主细胞。
如本文中所用的，术语“宿主细胞”或“接受(recipient)细胞”旨在包括可以是或已经成为编码本发明的抗体构建体的载体、外源核酸分子和多核苷酸的接受体(recipient)和/或抗体构建体自身的接受体的任意单个细胞或细胞培养物。通过转化、转染等途径可将相应材料引入细胞中。术语“宿主细胞”还旨在包括单细胞的后代或潜在后代。因为后代中可能由于天然、意外或特意突变或由于环境影响而存在某些修饰，因此事实上，该后代(在形态上或在基因组或总DNA补体中)可不与亲本细胞完全相同，但仍包括于如本文中所用的术语的范围内。合适的宿主细胞包括原核生物和真核生物的细胞，还包括但不限于细菌、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞，且还包括比如昆虫细胞和哺乳动物细胞(如鼠、大鼠、猕猴或人)的动物细胞。
本发明的抗体构建体可在细菌中产生。在表达后，本发明的抗体构建体在可溶性级分中从大肠杆菌细胞糊状物中分离且可通过例如亲和层析和/或尺寸排阻而纯化。可与用于纯化表达于例如CHO细胞中的抗体的方法类似地进行最终纯化。
除原核生物外，真核微生物(比如丝状真菌或酵母)为适用于本发明的抗体构建体的克隆或表达宿主。在低级真核宿主微生物中，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见的面包酵母(baker′s yeast)为最常用的。然而，多种其他属、物种和株通常可用且适用于本文中，比如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，克鲁维酵母(Kluyveromyces)宿主，比如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆弱克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16045)、魏氏克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24178)、克鲁维雄酵母(K.waltii)(ATCC 56500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；解脂耶氏酵母(yarrowia)(EP 402 226)；毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP 183 070)；念珠菌属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母(Schwanniomyces)，比如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，比如脉孢菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、弯颈霉素(Tolypocladium)和曲菌(Aspergillus)宿主，比如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
适用于本发明的糖基化抗体构建体的表达的宿主细胞源自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴别许多杆状病毒株和变体以及相应的来自宿主(比如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫(caterpillar))、埃及伊蚊(Aedesaegypti)(蚊子(mosquito))、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子(mosquito))、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇(fruit fly))和家蚕(Bombyx mori))的容许昆虫宿主细胞。多种用于转染的病毒株可公开获得，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，且根据本发明，此类病毒可用作本文中的病毒，尤其用于草地夜蛾细胞的转染。
棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、拟南芥和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。可用于在植物细胞培养物中生产蛋白质的克隆和表达载体是本领域技术人员已知的。参见，例如Hiatt等人，Nature(1989)342：76-78；Owen等人(1992)Bio/Technology 10：790-794；Artsaenko等人(1995)The Plant J 8：745-750；和Fecker等人(1996)Plant MolBiol 32：979-986。
然而，人们最感兴趣的是脊椎动物细胞，而在培养(组织培养)中繁殖脊椎动物细胞已经成为一个常规程序。可用哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(生长于悬浮培养物的293细胞或亚克隆的293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCCCCL 75)；人肝细胞(Hep G2，1413 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y Acad.Sci.(1982)383：44-68)；MRC5细胞；FS4细胞；及人肝癌细胞系(Hep G2)。
在进一步的实施方案中，本发明提供一种用于产生本发明的抗体构建体的方法，所述方法包括在允许本发明的抗体构建体表达的条件下培养本发明的宿主细胞，和从培养物中回收所产生的抗体构建体。
如本文中所用的，术语“培养”是指在合适的条件下，在培养基中细胞的体外维持、分化、生长、增殖和/或繁殖。术语“表达”包括涉及于本发明的抗体构建体的产生的任意步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
当采用重组技术时，抗体构建体能够在周质空间中在细胞内产生或直接分泌到培养基中。若抗体构建体是在细胞内产生的，则作为第一步骤，通过例如离心或超滤移除宿主细胞或裂解片段的颗粒碎片。Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了用于分离被分泌到大肠杆菌的周质空间的抗体的过程。简言之，细胞糊状物在乙酸钠(pH3.5)、EDTA及苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下解冻约30分钟。通过离心移除细胞碎片。若抗体分泌到培养基中，则通常首先使用可商购获得的蛋白浓缩过滤器(例如Amicon或MilliporePellicon公司的超滤单元)浓缩来自这种表达系统的上清液。在任意前述步骤中可包括蛋白酶抑制剂例如PMSF，以抑制蛋白质水解，且可包括抗生素以阻止外来污染物的生长。
从宿主细胞制备的本发明的抗体构建体可通过采用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析及亲和层析回收或纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，比如在离子交换柱上分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱法、在肝素SEPHAROSETM上的色谱法、在阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)上的层析法、层析聚焦技术、SDS-PAGE及硫酸铵沉淀。若本发明的抗体构建体包含CH3结构域，则使用Bakerbond ABX树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。
亲和层析是优选的纯化技术。亲和性配体最常连接的基质是琼脂糖，但也可获得其它基质。机械稳定的基质例如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯与用琼脂糖可达到的相比，其允许的流速较快且处理时间更短。
此外，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体。
如本文中所用的，术语“药物组合物”涉及适用于给患者(优选人患者)施用的组合物。本发明的特别优选的药物组合物包含一种或多种优选地治疗有效量的本发明的抗体构建体。优选地，药学组合物包含一种或多种(药学上有效)载体、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的合适制剂。组合物可接受的组成成分优选在所用剂量和浓度下对接受体无毒性。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
本发明的组合物可包含药学上可接受的载体。通常，如本文中所用的，“药学上可接受的载体”是指与药学施用、特别是与胃肠外施用兼容的任何和全部水性溶液和非水性溶液、无菌溶液、溶剂、缓冲剂(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS))、水、悬浮液、乳液(比如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、脂质体、分散介质和包衣。这种介质和试剂在药物组合物中的使用为本领域所熟知，且包含这种载体的组合物可以通过熟知的常规方法配制。
某些实施方案提供药物组合物，其包含本发明的抗体构建体和一种或多种赋形剂，比如在本章节和本文中其它地方示例性描述的赋形剂。在此方面，本发明中可使用赋形剂达成多种目的，比如调节制剂的物理、化学或生物学性质，比如调节粘度，和/或用于本发明的方法中以改进有效性和/或使此类制剂和方法针对由于例如应力引起的降解和损坏稳定化，此类应力在制造、装运、储存、使用前准备、施用和随后过程期间发生。
在某些实施方案中，药物组合物可含有用于修饰、维持或保持例如组合物的pH、容积摩尔渗透浓度(osmolarity)、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的制剂材料(参见REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，(A.R.Genrmo编)，1990，Mack Publishing Company)。在此类实施方案中，合适的制剂材料可包括但不限于：
●氨基酸，比如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、脯氨酸、2-苯丙氨酸，包括带电荷氨基酸，优选赖氨酸、赖氨酸乙酸盐，精氨酸、谷氨酸盐和/或组氨酸；
●抗微生物剂，比如抗菌剂和抗真菌剂；
●抗氧化剂，比如抗坏血酸、甲硫氨酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠；
●缓冲剂、缓冲剂体系和缓冲试剂，其用于将组合物维持在生理pH或稍低的pH下，通常在约5至约8或9的pH范围内；缓冲剂的实例是硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸、琥珀酸盐、磷酸盐、组氨酸和乙酸盐；例如约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液；
●非水性溶剂，比如丙二醇、聚乙二醇、例如橄榄油的植物油和可注射的有机酯(如油酸乙酯)；
●水性载体，包括水、酒精/水行溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质；
●可生物降解的聚合物，如聚酯；
●填充(bulking)剂，比如甘露醇或甘氨酸；
●螯合剂，比如乙二胺四乙酸(EDTA)；
●等渗剂和吸收延迟剂；
●络合剂，比如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟基丙基-β-环糊精；
●填料；
●单糖；双糖；和其他碳水化合物(比如葡萄糖、甘露糖或糊精)；碳水化合物可以是非还原糖，优选海藻糖、蔗糖、八硫酸酯(octasulfate)、山梨糖醇或木糖醇；
●(低分子量)蛋白质、多肽或蛋白质性载体，比如人或牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白，优选为人源的；
●着色剂和调味剂；
●含硫还原剂，比如谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、[α]-单硫代甘油和硫代硫酸钠；
●稀释剂
●乳化剂：
●亲水性聚合物，比如聚乙烯吡咯烷酮；
●成盐抗衡离子，比如钠；
●防腐剂，比如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等等；实例为：苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸或过氧化氢；
●金属络合剂，比如Zn-蛋白络合物；
●溶剂和共溶剂，比如甘油、丙二醇或聚乙二醇；
●糖和糖醇，比如海藻糖、蔗糖、八硫酸酯、甘露醇、山梨醇或木糖醇、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、肌糖(myoinisitose)、半乳糖、乳糖醇、核糖醇、肌糖醇、半乳糖醇、丙三醇、环多醇(如环己六醇)、聚乙二醇和多元糖醇；
●悬浮剂；
●表面活性剂或湿润剂，比如普洛尼克(pluronics)、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(比如聚山梨醇酯20)、聚山梨醇酯、triton、氨基丁三醇(tromethamine)、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；表面活性剂可以是洗涤剂，优选具有＞1.2KD的分子量；和/或聚醚，优选具有＞3KD的分子量；优选洗涤剂的非限制性实例为吐温20、吐温40、吐温60、吐温80和吐温85。优选聚醚的非限制性实例为PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000和PEG5000。
●稳定性增强剂，比如蔗糖或山梨糖醇；
●张力增强剂，比如碱金属卤化物，优选为氯化钠或氯化钾、甘露醇、山梨糖醇；
●胃肠外递送媒介，包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发油；
●静脉内递送媒介，包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(比如基于林格氏葡萄糖的补充剂)。
对本领域技术人员而言显而易见的，药物组合物的不同组成成分(例如上文所列的)可具有不同的作用，例如，氨基酸可作为缓冲剂、稳定剂和/或抗氧剂；甘露醇可以作为填充剂和/或张力增强剂；氯化钠可以作为递送媒介和/或张力增强剂等等。
设想本发明的组合物除包含本文中定义的本发明的多肽外，还可能包含其它生物活性剂，这取决于该组合物的预期用途。这种试剂可以是作用于胃肠系统的药物、作为细胞抑制剂的药物、防止高尿酸血症的药物、抑制免疫反应的药物(例如皮质类固醇)、调节炎症反应的药物、作用于循环系统的药物和/或本领域已知的试剂例如细胞因子。还设想本发明的抗体构建体用于共同治疗，即与另一抗癌药物组合。
在某些实施方案中，最佳的药物组合物将由本领域技术人员根据例如期望施用途径、递送方式和所需剂量决定。参见例如REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，见上文。在某些实施方案中，此类组合物可影响本发明的抗体构建体的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。在某些实施方案中，药物组合物中的主要媒介或载体性质上可为水性的或非水性的。例如，合适的媒介或载体可为注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊髓液，其可补充有用于胃肠外施用的组合物中常用的其他材料。中性缓冲盐水或生理盐水与血清白蛋白的混合物是另外的示例性媒介。在某些实施方案中，本发明组合物的抗体构建体可通过将具有所需纯度的所选组合物与任选的配制试剂(REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES，见上文)以冻干饼状物或水性溶液的形式混合来制备用于储存。此外，在某些实施方案中，本发明的抗体构建体可使用适当赋形剂(比如蔗糖)配制为冻干物。
当考虑胃肠外施用时，本发明中所用的治疗性组合物可以无热原、胃肠外可接受的水性溶液的形式提供，该水性溶液包含在药学上可接受的媒介中的本发明的所需抗体构建体。对于胃肠外注射，特别合适的媒介为无菌蒸馏水，其中本发明的抗体构建体配制为无菌、等渗溶液(适当储存的)。在某些实施方案中，制备可涉及用试剂(比如可注射微球、生物可侵蚀粒子、聚合物(比如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠子或脂质体)的所需分子的配制，该试剂可提供产物的控制释放或持续释放，该产物可经积存注射(depot injection)来递送。在某些实施方案中，还可使用透明质酸(hyaluronic acid)，透明质酸具有促进循环中持续时间的作用。在某些实施方案中，可植入药物递送装置可用于引入所需抗体构建体。
其他药物组合物对本领域技术人员而言是显而易见的，包括涉及持续递送或控制递送/释放制剂中本发明的抗体构建体的制剂。本领域技术人员还已知用于配制多种其他持续递送或控制递送工具(比如脂质体载体、生物可侵蚀微粒或多孔珠子和积存注射物)的技术。参见例如国际专利申请No.PCT/US93/00829，其描述了用于递送药物组合物的多孔聚合物微粒的控制释放。持续释放制备物可包括成形制品形式的半渗透性聚合物基质，例如膜或微胶囊。持续释放基质可包括聚酯、水凝胶、聚乳酸(如美国专利No.3,773,919和欧洲专利申请公开文本No.EP 058481中所公开)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人，1983，Biopolymers 2：547-556)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，1981，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277和Langer，1982，Chem.Tech.12：98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，1981，见上文)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利申请公开文本No.EP133，988)。持续释放组合物还可包括脂质体，此类脂质体可通过本领域已知的若干种方法中的任一种制备。参见例如Eppstein等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688-3692；欧洲专利申请公开文本No.EP 036,676、No.EP 088,046和No.EP 143,949。
也可以将所述抗体构建体包埋于所制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，例如通过凝聚技术或通过界面聚合；包埋于胶状药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中；或包埋于粗乳液中。这些技术公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Oslo，A.，Ed.，(1980)。
用于体内施用的药物组合物通常作为无菌制备物提供。可通过经无菌过滤膜过滤来实现灭菌。当将组合物冻干时，使用此方法的灭菌可在冻干和重构之前或之后进行。用于胃肠外施用的组合物可以冻干形式或溶液储存。通常将胃肠外组合物放置于具有无菌入口的容器(例如具有可由皮下注射针穿透的塞子(stopper)的静脉内溶液袋或小瓶)中。
本发明的另一方面包括本发明制剂的自缓冲抗体构建体，其可用作药物组合物，如国际专利申请WO 06138181A2(PCT/US2006/022599)中所描述。可获得关于在此方面有用的蛋白质稳定和制剂材料和方法的多种说明，比如Arakawa等人，“Solvent interactionsin pharmaceutical formulations，”Pharm Res.8(3)：285-91(1991)；Kendrick等人，“Physical stabilization of proteins in aqueous solution”，in：RATIONAL DESIGNOF STABLE PROTEIN FORMULATIONS：THEORY AND PRACTICE，Carpenter和Manning编，Pharmaceutical Biotechnology.13：61-84(2002)；和Randolph等人，“Surfactant-protein interactions”，Pharm Biotechnol.13：159-75(2002)，特别是参见与用于根据本发明的自缓冲蛋白质制剂的赋形剂及其方法有关的部分，尤其是关于用于兽医和/或人类医疗用途的蛋白质医药产品和方法。
根据本发明的某些实施方案，可将盐用于例如调节制剂的离子强度和/或等渗性和/或改善根据本发明的组合物的蛋白质或其他成分的溶解度和/或物理稳定性。如所熟知的，离子可通过结合于蛋白质表面上的带电荷残基以及通过遮蔽蛋白质中的带电荷和极性基因和降低它们的静电相互作用、吸引力和互相推斥作用的强度来使蛋白质的天然状态稳定化。具体地，离子还可通过结合于特别是蛋白质的变性肽键(--CONH)使蛋白质的变性状态稳定化。此外，与蛋白质中带电荷和极性基因的离子相互作用还可降低分子间静电相互作用并由此防止或降低蛋白质聚集和不可溶性。
离子物质(species)在对蛋白质的作用方面显著不同。已研究多种分类等级的离子和它们对蛋白质的作用，它们可用于配制根据本发明的药物组合物。一个实例为霍夫迈斯特序(Hofmeister series)，其通过离子的和极性非离子的溶质对溶液中蛋白质的构象稳定性的作用而将所述溶质分级。稳定化的溶质称为“亲液的(kosmotropic)”。去稳定化的溶质称为“离液的(chaotropic)”。亲液物通常以高浓度(例如＞1摩尔硫酸铵)使用以使蛋白质从溶液中沉淀(“盐析”)。离液物通常用于使蛋白质变性(denture)和/或溶解(“盐溶”)。离子针对“盐溶”和“盐析”的相对有效性定义它们在霍夫迈斯特序中的位置。
根据本发明的多种实施方案，游离氨基酸可用于本发明制剂的抗体构建体中作为填充剂、稳定剂和抗氧化剂以及其他标准用途。赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸可用于使制剂中的蛋白质稳定化。甘氨酸可用于冻干以确保正确的饼状结构和性质。精氨酸可用于抑制液体和冻干制剂中的蛋白质聚集。甲硫氨酸可用作抗氧化剂。
多羟基化合物包括糖，例如甘露醇、蔗糖和山梨糖醇和多元醇(polyhydricalcohol)，比如，例如，甘油和丙二醇以及(本文中为了讨述目的)聚乙二醇(PEG)和相关物质。多羟基化合物为亲液的。它们为液体和冻干制剂中的有用稳定剂，以保护蛋白质免于物理和化学降解过程。多羟基化合物还可用于调节制剂的张力。可用于本发明的选择实施方案的多羟基化合物包括甘露醇，其通常用于确保冻干制剂中饼状物的结构稳定性。其确保饼状物的结构稳定性。其通常与冻干保护剂(例如蔗糖)一起使用。用于调节张力和作为稳定剂以保护在制造过程期间的运输或主体(bulk)制备过程中免受冷冻/解冻应力影响的优选试剂包括山梨糖醇和蔗糖。还原糖(其含有游离醛或酮基)，比如葡萄糖和乳糖可使表面赖氨酸和精氨酸残基糖化(glycate)。因此，它们通常不属于用于根据本发明的应用的优选多羟基化合物。此外，在此方面，形成此类反应性物质的糖(比如蔗糖，其在酸性条件下水解为果糖和葡萄糖并因此引起糖基化)也不属于本发明的优选多羟基化合物。在此方面，PEG可用于使蛋白质稳定化和作为冷冻保护剂且可用于本发明。
本发明制剂的抗体构建体的实施方案进一步包含表面活性剂。蛋白质分子可对吸附在表面上以及在空气-液体、固体-液体和液体-液体界面处的变性和后续聚集敏感。这些作用的程度通常与蛋白质浓度成反比。这些有害相互作用的程度通常与蛋白质浓度成反比且典型地由物理搅拌(比如在产品装运和操作期间产生的物理搅拌)加剧。表面活性剂通常用于防止、最小化或降低表面吸附。在此方面，可用于本发明的表面活性剂包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱水山梨糖醇聚乙氧基化物的其他脂肪酸酯和泊洛沙姆188。表面活性剂还通常用于控制蛋白质构象稳定性。在此方面，表面活性剂的用途为蛋白质特异性的，因为任何给定表面活性剂典型地将使一些蛋白质稳定化且使其他蛋白质去稳定化。
聚山梨醇酯对氧化降解敏感且通常(在供应时)含有足量的过氧化物以引起蛋白质残基侧链(尤其甲硫氨酸)的氧化。因此，应小心使用聚山梨醇酯，且当使用时，应以它们的最低有效浓度使用。在此方面，聚山梨醇酯例示了赋形剂应以它们的最低有效浓度使用的一般规则。
本发明制剂的抗体构建体的实施方案进一步包含一或多种抗氧化剂。在某种程度上，可通过保持适当环境氧含量和温度以及通过避免暴露于光线来防止药物制剂中蛋白质的有害氧化。还可使用抗氧化赋形剂以防止蛋白质的氧化降解。在此方面，有效抗氧化剂包括还原剂、氧/自由基清除剂和螯合剂。用于根据本发明的治疗性蛋白质制剂的抗氧化剂优选为水可溶性的且在产物的存放期始终保持它们的活性。在此方面，EDTA为根据本发明的优选抗氧化剂。抗氧化剂可损害蛋白质。例如，还原剂，特别是诸如谷胱甘肽可使分子内二硫键断裂。因此，选择用于本发明的抗氧化剂以尤其消除或充分降低它们本身损害制剂中的蛋白质的可能性。
根据本发明的制剂可包括金属离子，其为蛋白质辅助因子且为形成蛋白质配位复合物所必需的，比如形成某些胰岛素悬浮液所必需的锌。金属离子还可抑制一些使蛋白质降解的过程。然而，金属离子还催化使蛋白质降解的物理和化学过程。镁离子(10-120mM)可用于抑制天冬氨酸向异天冬氨酸的异构化。Ca+2离子(至多100mM)可提高人类脱氧核糖核酸酶的稳定性。然而，Mg+2、Mn+2和Zn+2可使rhDNase去稳定化。类似地，Ca+2和Sr+2可使因子VIII稳定化，Mg+2、Mn+2和Zn+2、Cu+2和Fe+2可使因子VIII去稳定化且因子VIII的聚集可由Al+3离子增加。
本发明制剂的抗体构建体的实施方案进一步包含一或多种防腐剂。防腐剂为制备涉及从同一个容器中超过一次提取的多剂量胃肠外制剂时所必需的。它们的主要功能为抑制微生物生长和确保产品在药物产品的存放期或使用期始终无菌。常用防腐剂包括苯甲醇、苯酚和间甲酚。尽管防腐剂具有很长的与小分子胃肠外药物一起使用的历史，但开发包括防腐剂的蛋白质制剂可能具有挑战性。防腐剂几乎始终对蛋白质具有去稳定化作用(聚集)，且这一点已变为限制它们在多剂量蛋白质制剂中应用的主要因素。迄今为止，大部分蛋白质药物已经配制为用于仅单次使用。然而，当可制备多剂量制剂时，它们具有实现患者便利性和增加可售性的附加优点。优良实例为人类生长激素(hGH)，其中保藏制剂的开发引起更便利、多用途注射笔呈现的商业化。目前市场上至少有四种此类含有hGH的保藏制剂的笔装置。健高灵(Norditropin)(液体，Novo Nordisk)、路欧平AQ(Nutropin AQ)(液体，Genentech)&键豪宁(Genotropin)(冻干--双室筒，Pharmacia&Upjohn)含有酚，而索玛托普(Somatrope)(Eli Lilly)用间甲酚配制。在保藏剂型的配制和开发期间需要考虑若干方面。药物产品中的有效防腐剂浓度必须优化。这需要在赋予抗菌剂有效性而不损害蛋白质稳定性的浓度范围内测试剂型中的给定防腐剂。
如可预期的，含有防腐剂的液体制剂的开发比冻干制剂更具有挑战性。冷冻干燥产品可在无防腐剂情况下冻干且在使用时用含有防腐剂的稀释剂重构。这缩短防腐剂与蛋白质的接触时间，从而显著最小化相关稳定性风险。在液体制剂情况下，应在整个产品存放期(约18至24个月)内保持防腐剂有效性和稳定性。一个重要的注意点为应在含有活性药物和所有赋形剂组分的最终制剂中证明防腐剂有效性。
本文公开的抗体构建体还可配制为免疫脂质体。“脂质体”为由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊，其可用于向哺乳动物递送药物。与生物膜的脂质排列类似，脂质体的组分通常以双层形式排列。含有抗体构建体的脂质体通过本领域已知的方法制备，比如Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82:3688(1985)；Hwang等人，Proc.NatlAcad.Sci.USA，77：4030(1980)；美国专利No.4,485,045和No.4,544,545；以及WO 97/38731中所描述。具有增强的循环时间的脂质体公开于美国专利No.5,013,556中。特别可用的脂质体可使用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法产生。经由具有限定孔尺寸的过滤器挤出脂质体以产生具有所需直径的脂质体。本发明抗体构建体的Fab′片段可经由二硫化物互换反应与如Martin等人，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所描述的脂质体缀合。脂质体内可任选含有化学治疗剂。参见Gabizon等人，J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
一旦配制出药物组合物，其可以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或以脱水或冻干粉末形式储存于无菌小瓶中。此类制剂可以即用形式或以在施用之前重构的形式(例如冻干形式)储存。
本文中定义的药物组合物的生物活性可例如通过细胞毒性分析法确定，如以下实施例中、WO 99/54440中或由Schlereth等人(Cancer Immunol.Immunother.20(2005)，1-12)所描述。如本文中所用的“功效”或“体内功效”是指对本发明的药物组合物的疗法的反应，使用例如标准化NCI反应准则。使用本发明的药物组合物的疗法的成果或体内功效是指组合物用于其预期目的的有效性，即组合物引起其所需效果(即消耗病理性细胞，例如肿瘤细胞)的能力。体内功效可由用于各个疾病实体的已建立的标准方法监测，包括但不限于白细胞计数、差异(differential)、荧光活化细胞分选、骨髓穿刺。此外，可使用各种疾病特定临床化学参数和其他已建立的标准方法。此外，可使用计算机辅助断层显像、X-射线、核磁共振断层显像(例如用于基于国立癌症研究所(National Cancer Institute)标准的反应评估[Cheson BD，Horning SJ，Coiffier B，Shipp MA，Fisher RI，Connors JM，Lister TA，Vose J，Grillo-Lopez A，Hagenbeek A，Cabanillas F，Klippensten D，Hiddemann W，Castellino R，Harris NL，Armitage JO，Carter W，Hoppe R，Canellos GP.Report of aninternational workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin′slymphomas.NCI Sponsored International Working Group.J Clin Oncol.1999Apr；17(4)：1244])、正电子发射断层扫描、白血球计数、差异、荧光活化细胞分选、骨髓穿刺、淋巴结活组织检查/组织学和各种淋巴瘤特定临床化学参数(例如乳酸脱氢酶)和其他已建立的标准方法。
药物(比如本发明的药物组合物)开发过程中的另一主要挑战为药物动力学性质的可预测的调节。为此，可建立候选药物的药物动力学概况，即影响特定药物治疗给定病症的能力的药物动力学参数的概况。药物的影响药物治疗某一疾病实体的能力的药物动力学参数包括但不限于：半衰期、分布容积、肝脏首过代谢和血清结合程度。给定药物试剂的功效可受以上所提及的参数中的每一者影响。
“半衰期”意指所施用的药物的50％通过生物过程(例如代谢、排泄等)清除所需的时间。“肝脏首过代谢”意为药物在与肝脏首次接触时(即在其首次通过肝脏期间)的代谢倾向。“分布容积”意为体内各隔室(例如细胞内和细胞外间隙、组织和器官等)中药物的滞留程度，和这些隔室内药物的分布。“血清结合程度”意为药物与血清蛋白(比如白蛋白)相互作用和结合至血清蛋白从而引起药物的生物活性降低或损失的倾向。
药物动力学参数还包括所施用的给定量药物的生物利用度、延迟时间(Tlag)、Tmax、吸收率、更高的起效(onset)和/或Cmax。“生物利用度”意为血液隔室中的药物量。“延迟时间”意为药物施用与其在血液或血浆中的检测和可测量性之间的时间延迟。“Tmax”为之后达到最大血药浓度的时间，且“Cmax”为使用给定药物获得的最大血液浓度。达到药物的生物效应所需的血液或组织浓度的时间受所有参数影响。显示跨物种特异性的双特异性抗体构建体的药物动力学参数(其可如上文所概述在非黑猩猩灵长类动物中于临床前动物试验中测定)还阐述于例如Schlereth等人的公开文件中(Cancer Immunol.Immunother.20(2005)，1-12)。
在一个实施方案中，本发明提供本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体在预防、治疗或改善癌症中的用途。
本文中所描述的制剂作为药物组合物在有此需要的患者中治疗、改善和/或预防如本文中所描述的病理性医学病情中是有用的。术语“治疗”既是指治疗性治疗，也是指预防或防止性措施。治疗包括将制剂应用于或施用于来自患有疾病/障碍、具有疾病/障碍的症状或具有对疾病/障碍的倾向的患者的机体、分离的组织或细胞，其目的是治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、增进或影响疾病、该疾病的症状或罹患该疾病的倾向。
如本文中所用的术语“改善”是指通过向有此需要的受试者施用根据本发明的抗体构建体，具有如本文中所指定的(转移性)肿瘤或癌症类型之一的患者的疾病状态的任何增进。这种改善也可以被看作是患者的(转移性)肿瘤或癌症进展的减慢或停止。如本文中所用的术语“预防”意为通过向有此需要的受试者施用根据本发明的抗体构建体，避免具有如本文中所指定的(转移性)肿瘤或癌症类型之一的患者的发生或再发生。
术语“疾病”是指能够从用本文中所描述的抗体构建体或药物组合物的治疗中获益的任何病况。其包括慢性和急性障碍或疾病，所述障碍或疾病包括使哺乳动物倾向罹患所探讨疾病的那些病理状况。
“瘤”是组织的异常生长，通常但不总是形成块。当也形成块时，其通常称为“肿瘤”。瘤或肿瘤可以是良性的、潜在恶性的(癌前)或恶性的。恶性瘤通常称为癌症。它们通常侵入并破坏周围的组织，并可形成转移，即它们扩散到身体的其他部位、组织或器官。因此，术语“转移性癌症”涵盖对不同于原始肿瘤的组织或器官的其他组织或器官的转移。淋巴瘤和白血病是淋巴性肿瘤。对于本发明的目的，其也由术语“肿瘤”或“癌症”涵盖。
在优选的实施方案中，本发明提供本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体在预防、治疗或改善癌症中的用途，其中所述癌症选自：肺癌、头颈癌、原发性或继发性CNS肿瘤、原发性或继发性脑肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、胶质母细胞瘤、垂体腺瘤、肾上腺皮质癌、食管癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、NSCLC(非小细胞肺癌)、SCLC(小细胞肺癌)、子宫内膜癌、宫颈癌、子宫癌、移行细胞癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、皮肤或眼内黑色素瘤、肝癌、胆管癌、胆囊癌、肾癌、直肠癌、肛门区域的癌症、胃癌、胃肠道(胃、结肠直肠和十二指肠)癌、小肠癌、胆道癌、尿道癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、睾丸癌、皮肤鳞状细胞癌、黑色素瘤、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、骨肉瘤、间皮瘤、，霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、慢性或急性白血病、慢性髓细胞样白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、纤维肉瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和软组织肉瘤，以及衍生自上述任一种的转移性癌症疾病。该(转移性)癌症优选为P钙粘着蛋白阳性的癌症或表达P钙粘着蛋白的癌症。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体在预防、治疗或改善癌症中的用途，其中所述癌症是(转移性)鳞状细胞癌。
本发明还提供一种用于治疗或改善(转移性)肿瘤或癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体的步骤。
在优选的实施方案中，本发明提供一种用于治疗或改善肿瘤或癌症的方法，其中所述癌症选自：肺癌、头颈癌、原发性或继发性CNS肿瘤、原发性或继发性脑肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、肾上腺皮质癌、食管癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、NSCLC(非小细胞肺癌)、SCLC(小细胞肺癌)、子宫内膜癌、宫颈癌、子宫癌、移行细胞癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、皮肤或眼内黑色素瘤、肝癌、胆管癌、胆囊癌、肾癌、直肠癌、肛门区域的癌症、胃癌、胃肠道(胃、结肠直肠和十二指肠)癌、小肠癌、胆道癌、尿道癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、睾丸癌、皮肤鳞状细胞癌、黑色素瘤、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、骨肉瘤、间皮瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、慢性或急性白血病、慢性髓细胞样白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、纤维肉瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和软组织肉瘤，以及衍生自上述任一种的转移性癌症疾病，所述方法包括向有此需要的受试者施用本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体的步骤。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供一种用于治疗或改善肿瘤或癌症或者转移性肿瘤或癌症的方法，其中所述癌症是(转移性)鳞状细胞癌。
术语“有此需要的受试者”或“需要治疗的”那些包括已经罹患障碍的患者以及处于待预防障碍中的患者。有此需要的受试者或“患者”包括接受预防性或治疗性处理的人和其他哺乳动物受试者。
本发明的抗体构建体通常经设计以特别在某些生物利用度和持续性范围内用于特定施用途径和方法、特定施用剂量和施用频率、特定疾病的特定治疗。组合物的材料优选以施用位点可接受的浓度存在。
因此可根据本发明设计制剂和组合物以用于通过任何合适施用途径递送。在本发明的上下文中，施用途径包括但不限于
●局部途径(比如表皮、吸入、鼻、眼、耳/听觉、阴道、粘膜)；
●肠内途径(比如口、胃肠、舌下、唇下、颊(buccal)、直肠)；和
●胃肠外途径(比如静脉内、动脉内、骨内、肌肉内、脑内、脑室内、硬膜外、囊内、皮下、腹膜内、羊膜腔(extra-amniotic)、关节内、心脏内、皮肤内、病灶内、子宫内、膀胱内、玻璃体内、透皮、鼻内、穿粘膜、滑膜内、管腔内)。
本发明的药物组合物和抗体构建体特别可用于胃肠外施用，例如皮下或静脉内递送，例如通过比如推注的注射或通过比如连续输注的输注。药物组合物可以使用医疗装置来施用。用于施用药物组合物的医疗装置的实例描述于美国专利No.4,475,196、No.4,439,196、No.4,447,224、No.4,447,233、No.4,486,194、No.4,487,603、No.4,596,556、No.4,790,824、No.4,941,880、No.5,064,413、No.5,312,335、No.5,312,335No.5,383,851和No.5,399,163。
特别地，本发明提供合适组合物的不间断施用。作为非限制性实例，不间断或基本上不间断(即连续)施用可通过由患者佩戴的小型泵系统实现，该小型泵系统用于对流入患者体内的治疗剂进行计量。包含本发明的抗体构建体的药物组合物可通过使用所述泵系统施用。此类泵系统通常是本领域已知的，且通常依赖于含有待注入治疗剂的药筒的周期性更换。当更换此类泵系统中的药筒时，可能会使治疗剂的本应不间断地流入患者体内的暂时中断。在此类情况下，在药筒替换之前的施用阶段和药筒替换之后的施用阶段仍将视为在医药学手段的含义内且本发明的方法共同组成此类治疗剂的一次“不间断施用”。
本发明的抗体构建体的连续或不间断施用可通过流体递送装置或小型泵系统(包括用于驱动流体离开储器的流体驱动机构和用于启动驱动机构的启动机构)以静脉内或皮下方式进行。用于皮下施用的泵系统可包括用于透过患者皮肤且将合适组合物递送至患者体内的针或套管。所述泵系统可独立于静脉、动脉或血管直接固定或附着至患者皮肤，由此允许泵系统与患者皮肤之间的直接接触。泵系统可附着至患者皮肤保持24小时至若干天。泵系统可为小型尺寸，其具有用于小体积的储器。作为非限制性实例，用于待施用的合适药物组合物的储器的体积可为0.1ml至50ml。
连续施用可通过在皮肤上佩戴贴片且间隔地进行更换而以经皮方式进行。本领域技术人员将意识到用于药物递送的贴片系统适用于此目的。应注意，经皮施用尤其适用于不间断施用，因为更换第一张废弃的贴片可有利地与放置新的第二张贴片(例如在与第一张废弃的贴片紧邻的皮肤表面上且在移除第一张废弃的贴片之前立即)同时完成。不会出现流动中断或电池故障的问题。
如果药物组合物经冻干，则在施用之前首先在合适液体中将冻干物质重构。冻干物质可在例如抑菌注射用水(BWFI)、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或与在冻干之前蛋白质所处的制剂相同的制剂中重构。
本发明的组合物可以合适剂量施用给受试者，该合适剂量可例如通过给非黑猩猩灵长类动物(例如猕猴)施用显示本文中所描述的跨物种特异性的递增剂量的本发明的抗体构建体的剂量递增研究测定。如上文所阐述，显示本文中所描述的跨物种特异性的本发明的抗体构建体可有利地以相同形式用于非黑猩猩灵长类动物中的临床前试验中并作为药物用于人中。剂量方案将由主治医师和临床因素确定。如医学领域中所熟知的，用于任一个患者的剂量取决于多种因素，包括患者体型、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况和同时施用的其他药物。
术语“有效剂量(dose/dosage)”定义为足以实现或至少部分实现所需作用的量。术语“治疗有效剂量”定义为足以在已罹患疾病的患者中治愈或至少部分阻滞该疾病及其并发症的量。有效实现此用途的量或剂量将取决于待治疗的病症(适用症)、所递送的抗体构建体、治疗背景和目标、疾病的严重程度、先前疗法、患者的临床史和对治疗剂的响应、施用途径、患者的体型(体重、体表或器官尺寸)和/或状况(年龄和一般健康)，以及患者自身免疫系统的一般状态。可根据主治医师的判断调节适当剂量使得其可一次性或经一系列施用而施用至患者，以便获得最佳的治疗效果。
取决于上文所提及的因素，典型剂量可在约0.1μg/kg至约30mg/kg或更大的范围内。在特定实施方案中，剂量可在1.0μg/kg至约20mg/kg、任选的10μg/kg至约10mg/kg或100μg/kg至约5mg/kg的范围内。
本发明的抗体构建体的治疗有效量优选引起疾病症状的严重性降低、无疾病症状周期的频率或持续时间增加或防止由疾病痛苦引起的损伤或失能。对于治疗表达CDH3的肿瘤，相对于未经治疗的患者，本发明的抗体构建体(例如抗-CDH3/抗-CD3抗体构建体)的治疗有效量优选抑制细胞生长或肿瘤生长达至少约20％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。可在预示在人类肿瘤中的功效的动物模型中评估化合物抑制肿瘤生长的能力。
药物组合物可作为单一治疗剂或根据需要与另外的比如抗癌症疗法的疗法(例如其它蛋白质性和非蛋白质性药物)组合施用。这些药物可与如本文中所定义的包含本发明的抗体构建体的组合物同时施用或在所述抗体构建体以所限定时间间隔和剂量施用之前或之后单独施用。
如本文中所用的术语“有效且无毒性剂量”是指本发明的抗体构建体的耐受剂量，其足够高以引起病理细胞耗竭、肿瘤消除、肿瘤缩小或疾病稳定，而不存在或基本上不存在较大毒性作用。此类有效且无毒性剂量可通过例如本领域所描述的剂量递增研究测定，且该剂量应当在诱导严重不良副作用的剂量(剂量限制性毒性，DLT)以下。
如本文中所用的术语“毒性”是指在不良事件或严重不良事件中呈现的药物的毒性作用。这些副作用可能是指全身性药物耐受性不足和/或施用后局部耐受性不足。毒性还可包括由药物引起的致畸或致癌作用。
如本文中所用的术语“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”定义不在施用后直接(局部耐受性)和在较长药物施用时间段期间引起严重的不良事件的药物施用。“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”可例如在治疗和后续处理时间段期间以规律间隔进行评估。测量包括临床评估(例如器官表现)和实验室异常(laboratory abnormality)的筛查。可根据NCI-CTC和/或MedDRA标准进行临床评估且记录/编码与正常结果的偏差。器官表现可包括比如过敏/免疫学、血液/骨髓、心律不齐、凝血等标准，如例如不良事件一般评价标准v3.0(Common Terminology Criteria for adverse events；CTCAE)中所阐述。可测试的实验室参数包括例如血液学、临床化学、凝血概况和尿分析以及其他体液(诸如血清、血浆、淋巴或脊髓液、液剂(liquor)等等)的检查。因此可例如通过物理检查、成像技术(即超声、X射线、CT扫描、磁共振成像(MRI))、使用技术装置进行的其他测量方法(即心电图)、生命征象、通过测量实验室参数和记录不良事件来评价安全性。例如，可通过组织病理学和/或组织化学方法检查根据本发明的用途和方法中非黑猩猩类灵长类动物中的不良事件。
上述术语也在例如Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6；ICH Harmonised Tripartite Guideline；ICH SteeringCommittee会议(1997年7月16日召开)中提到。
在另一个实施方式中，本发明提供试剂盒，其包含本发明的抗体构建体、根据本发明的方法产生的抗体构建体、本发明的载体和/或本发明的宿主细胞。
在本发明的上下文中，术语“试剂盒”意为将两种或更多种组分(其中一种对应于本发明的抗体构建体、药物组合物、载体或宿主细胞)一起包装在容器、接受器或其它器具中。因此，可将试剂盒描述为一套足以实现一定目标的产品和/或器具，其可作为单个单元进行销售。
试剂盒可包含含有合适施用剂量(参见上文)的本发明的抗体构建体或药物组合物的任何适当形状、尺寸和材料(优选防水的，例如塑料或玻璃)的一个或多个接受器(比如小瓶、安瓿瓶、容器、注射器、瓶、袋)。该试剂盒可另外地包含使用说明(例如以活页或说明手册的形式)、用于施用本发明的抗体构建体的装置(例如注射器、泵、推注器等)、用于重构本发明的抗体构建体的方法和/或用于稀释本发明的抗体构建体的手段。
本发明还提供用于单剂量施用单元的试剂盒。本发明的试剂盒还可包括含有干的/或冻干的抗体构建体的第一接受器和含有水性制剂的第二接受器。在本发明的某些实施方案中，提供包括单腔室和多腔室的预装注射器(例如液体注射器和冷冻干燥物注射器)的试剂盒。
附图说明
图1：
人CDH3、鼠CDH3和一种示例性嵌合CDH3(本文：“D1B鼠”)的五个胞外结构域D1-D5的图示。图下方再次显示五个结构域和它们中每一个被分成的三个子结构域。示例性FACS信号(参见实施例2中的“表位簇”)的说明示于右下方。
图2：
人CDH3和鼠CDH3的序列比对和不同结构域的示例性指示：信号肽、前肽、胞外结构域D1-D5、跨膜结构域和细胞质结构域。将五个胞外结构域的鼠序列交换引入人CDH3骨架，参见实施例1，然后将嵌合构建体用于表位成簇(表位作图)，参见实施例2。
图3：
如通过流式细胞术显示的CHO细胞表面表达上的人和鼠CDH3以及20种嵌合人-鼠CDH3构建体(五个胞外结构域(ECD)以及每个ECD的三个子结构域)。用鼠交叉反应的单克隆小鼠IgG1抗-人CDH3抗体验证人野生型CDH3、鼠野生型CDH3和嵌合CDH3构建体在CHO细胞上的表达。用抗-小鼠IgG Fcγ-PE(1：100，50μl；Jackson Immunoresearch#115-116-071).D1*)：Hu CDH3D1mu-CHO检测结合的单克隆抗体。
图4：
CDH3构建体的表位作图。如通过嵌合的CDH3构建体的表位作图检测的对不同表位簇/胞外子结构域具有特异性的结合分子的实例，参见实施例2。图4A：D1B结合剂。图4B：D2C结合剂。图4C：D3A结合剂。
图5：
所示细胞系上5μg/mL纯化的双特异性抗体单体的FACS结合分析。还参见实施例5。采用对双特异性抗体的CD3结合部分具有特异性的内部小鼠抗体，随后用山羊抗小鼠Fcγ-PE进行CDH3xCD3双特异性抗体结合的检测。阴性对照为仅缓冲液，随后是检测抗体。
图5A和5B：
分析CDH3xCD3双特异性结合剂(图5A：表位簇/胞外子结构域D2C；图5B：表位簇/胞外子结构域D3A)与人CDH3转染的CHO细胞、人T细胞系HPB-all上的人CD3、食蟹猴(cyno)CDH3转染的CHO细胞、表达食蟹猴(cyno)CD3的T细胞系HSC-F上的食蟹猴(cyno)CD3、人CDH3阳性细胞系A431和鼠CDH3转染的CHO细胞(阴性对照)的结合。除阴性对照外，在所有情况下均检测到结合。
图5C和5D：
分析CDH3xCD3双特异性结合剂(图5C：表位簇/胞外子结构域D2C；图5D：表位簇/胞外子结构域D3A)与人CDH3旁系同源物CDH1、CDH2、CDH4和CDH5的结合。未检测到与旁系同源物的结合。未检测到与dhfr-/-CHO细胞(阴性对照)的结合。
图6：
如在18小时51铬释放分析法中测得的在CDH3xCD3双特异性抗体存在下经刺激的人CD8+T细胞对人CDH3转染的CHO细胞的细胞毒性活性。效应细胞：经刺激的富集的人CD8+T细胞。靶细胞：人CDH3转染的CHO细胞。效应细胞与靶细胞的比率(E：T)为10：1。对表位簇/胞外子结构域D2C(图6A)和D3A(图6B)具有特异性的抗体。
图7：
如在18小时51铬释放分析法中测得的在CDH3xCD3双特异性抗体存在下经刺激的人CD8+T细胞对人CDH3阳性表皮样癌细胞系A431的细胞毒性活性。效应细胞：经刺激的富集的人CD8+T细胞。靶细胞：人A431细胞。效应细胞与靶细胞的比率(E∶T)为10∶1。对表位簇/胞外子结构域D2C(图7A)和D3A(图7B)具有特异性的抗体。
图8：
如在48小时基于FACS的细胞毒性分析法中测得的在CDH3xCD3双特异性抗体存在下未经刺激的人PBMC细胞对人CDH3转染的CHO细胞的细胞毒性活性。效应细胞：未经刺激的人PBMC(CD14-/CD56-)。靶细胞：人CDH3转染的CHO细胞。效应细胞与靶细胞的比率(E∶T)为10∶1。对表位簇/胞外子结构域D2C(图8A)和D3A(图8B)具有特异性的抗体。
图9：
如在48小时基于FACS的细胞毒性分析法中测得的在CDH3xCD3双特异性抗体存在下未经刺激的人PBMC对人CDH3阳性表皮样癌细胞系A431的细胞毒性活性。效应细胞：未经刺激的人PBMC(CD14-/CD56-)。靶细胞：人A431细胞。效应细胞与靶细胞的比率(E∶T)为10∶1。对表位簇/胞外子结构域D2C(图9A)和D3A(图9B)具有特异性的抗体。
图10：
如在48小时基于FACS的细胞毒性分析法中测得的在CDH3xCD3双特异性抗体存在下猕猴T细胞系对猕猴CDH3转染的CHO细胞的细胞毒性活性。效应细胞：猕猴CD3阳性T细胞系LnPx4119。靶细胞：猕猴CDH3转染的CHO细胞。效应细胞与靶细胞的比率(E∶T)为10∶1。对表位簇/胞外子结构域D2C(图10A)、D3A(图10B)和D1B(图10C)具有特异性的抗体。
图11：
在人肿瘤异种移植模型中表位簇/胞外子结构域D2C(CDH3-13)的CDH3xCD3双特异性抗体的抗肿瘤活性(参见实施例14)。所述抗体剂量依赖性地阻止在人PBMC存在下形成A-431肿瘤。由于在第1天注射的大量细胞混合物，测量开始时(第5天)的肿瘤体积高。**p＜0.01；***p＜0.0001。
图12：
在人肿瘤异种移植模型中表位簇/胞外子结构域D2C(CDH3-13)的CDH3xCD3双特异性且半衰期延长的(HLE)抗体的抗肿瘤活性(参见实施例15)。所述HLE抗体剂量依赖性地阻止在人PBMC存在下形成人HCT-116肿瘤。虽然图12A示出了整体结果，但图12B将针对较高抗体浓度(组2)获得的结果区分为响应动物(7/10)和无响应动物(3/10)。
图13：
在构建体的C-末端不存在(上方小图)和存在(下方小图)白蛋白融合物的情况下，在不存在靶细胞下用双特异性抗体构建体的T细胞活化。
具体实施方式
以下实施例说明了本发明。这些实施例不应视为限制本发明的范围。本发明仅由权利要求限制。
实施例1
表达野生型和嵌合的CDH3的CHO细胞的产生
对于构建用于表位作图的嵌合分子，人CDH3的相应5个胞外结构域Doml至Dom5(或D1至D5)及其子结构域(A、B和C)的序列被相应的鼠序列替换。产生了以下20个分子；还参见图1和2。
·Hu CDH3/Doml mu(aa 108-215) SEQ ID NO：13
o Hu CDH3/DomlA mu(aa 108-143) SEQ ID NO：14
o Hu CDH3/DomlB mu(aa 144-179) SEQ ID NO：15
o Hu CDH3/DomlC mu(aa 180-215) SEQ ID NO：16
·Hu CDH3/Dom2mu(aa 216-327) SEQ ID NO：17
o Hu CDH3/Dom2A mu(aa 216-252) SEQ ID NO：18
o Hu CDH3/Dom2B mu(aa 253-290) SEQ ID NO：19
o Hu CDH3/Dom2C mu(aa 291-327) SEQ ID NO：20
·Hu CDH3/Dom3mu(aa 328-440) SEQ ID NO：21
o Hu CDH3/Dom3A mu(aa 328-363) SEQ ID NO：22
o Hu CDH3/Dom3B mu(aa 364-403) SEQ ID NO：23
o Hu CDH3/Dom3C mu(aa 404-440) SEQ ID NO：24
·Hu CDH3/Dom4mu(aa 441-546) SEQ ID NO：25
o Hu CDH3/Dom4A mu(aa 441-474) SEQ ID NO：26
o Hu CDH3/Dom4B mu(aa 475-511) SEQ ID NO：27
o Hu CDH3/Dom4C mu(aa 512-546) SEQ ID NO：28
·Hu CDH3/Dom5mu(aa 547-650) SEQ ID NO：29
o Hu CDH3/Dom5A mu(aa 547-581) SEQ ID NO：30
o Hu CDH3/Dom5B mu(aa 582-616) SEQ ID NO：31
o Hu CDH3/Dom5C mu(aa 617-650) SEQ ID NO：32
上文的列表显示了如SEQ ID NO：1中描绘的人CDH3的氨基酸序列中不同结构域(Doml-Dom5)以及相应子结构域A-C的位置。例如，子结构域D1A位于SEQ ID NO：1的氨基酸位置108-143。对于上文所列的所有其它结构域均是如此。
为了在CHO细胞中表达，上文所描述的嵌合胞外结构域的编码序列在框架中之后是人工Ser/Gly-连接子的编码序列，之后是源自人EpCAM的跨膜/细胞内结构域(如基因库(Genbank)登录号NM_002354中公开的序列的氨基酸266-314)的结构域。所有的嵌合构建体均包含N-末端信号序列(信号肽)和前肽。
为了产生表达人、食蟹猴(cynomolgus macaque)(“cyno”)、小鼠和人/小鼠嵌合CDH3的CHO细胞，将人CDH3(SEQ ID NO：2，还参见基因库登录号NM_001793)、cyno CDH3(SEQID NO：6)、小鼠CDH3(SEQ ID NO：10，还参见基因库登录号NM_001037809)和20种人-小鼠CDH3嵌合体(参见上文)的相应编码序列克隆至命名为pEF-DHFR的质粒(在Raum等人，Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150中描述了pEF-DHFR)。通过采用食蟹猴(cynomolgus)脾cDNA文库(BioChain)和在人CDH3 mRNA转录物(NM_001793)的非翻译区或保守序列区杂交的人序列特异性寡核苷酸(5’GGCCCGCCGTCGCGGCAGC 3’；5’CTCCTTCTCCAGGTTTGCTGGC 3’；5’AACTGAGACCCCTTGGAGATGC 3’；5’TAGTCGTCCTCCCCGCCACC3’；5’GGAGGGTGGGACAAACACAGG 3’；5’ACGTTGAAGTGACCAACGAGGC 3’)的标准克隆获得猕猴CDH3的编码序列。序列分析揭示了核心胞外结构域相比于恒河猴CDH3基因库序列(JU473826，JU473827)的氨基酸序列相似性。全部克隆程序均根据标准规程进行(Sambrook，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，3rd edition，Cold SpringHarbour Laboratory Press，Cold Spring Harbour，New York(2001))。如Kaufman R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566所述，对于每一构建体，将相应质粒转染至DHFR缺陷型CHO细胞以用于真核表达。
使用鼠交叉反应性的单克隆小鼠IgG1抗-人CDH3抗体，在FACS分析法中验证CHO细胞上CDH3(人、鼠和嵌合构建体)的表达。用抗-小鼠IgG Fcγ-PE检测结合的单克隆抗体。作为阴性对照，用PBS/2％FCS代替第一抗体温育细胞。通过流式细胞术测量样品。结果示于图3。用PE-缀合的R&D861-P检测CHO细胞上人和食蟹猴(cyno)CDH3的表达(参见实施例5)。
实施例2
鼠scFv-片段的表位成簇
将用人或鼠CDH3或用嵌合人/小鼠CDH3分子(参见实施例1)转染的细胞用粗制、未稀释的含有与人/猕猴CDH3结合的scFv的周质提取物染色。用小鼠单克隆抗-FLAG-M2抗体(1μg/ml；PBS/2％FCS中50μl；Sigma F1804)，随后用抗-小鼠IgG Fcγ-PE(1∶100，50μl；Jackson Immunoresearch#115-116-071)检测结合的scFv分子。所有抗体均在具有2％FCS的PBS中稀释。作为阴性对照，用PBS/2％FCS代替周质提取物温育细胞。通过流式细胞术测量样品。结果示于图4。
具体而言，图4A示出了识别人CDH3的胞外结构域D1，更确切而言识别子结构域D1B的结合剂(在相应嵌合CDH3构建体中FACS信号丢失)。需注意，命名为CDH3-6的结合剂是CDH3-4的亲本结合剂。命名为CDH3-10的结合剂是CDH3-1、CDH3-2和CDH3-3的亲本结合剂。图4B示出了识别人CDH3的胞外结构域D2，更确切而言识别子结构域D2C的结合剂。需注意，命名为CDH3-21的结合剂是CDH3-11、CDH3-12和CDH3-14的亲本结合剂。命名为CDH3-23的结合剂是CDH3-13的亲本结合剂。最后，图4C示出了识别人CDH3的胞外结构域D3，更确切而言识别子结构域D3A的结合剂。需注意，结合剂CDH3-32进一步结合子结构域D3C。命名为CDH3-32的结合剂是CDH3-25、CDH3-26和CDH3-27的亲本结合剂。命名为CDH3-33的结合剂是CDH3-24的亲本结合剂。术语“亲本结合剂”在本上下文中意为进一步开发这些结合剂以便产生或获得优化的结合剂。
同样对结合剂CDH3-11、CDH3-12、CDH3-13和CDH3-14进行了表位成簇分析，并且已显示它们识别人CDH3的胞外结构域D2，更确切而言识别子结构域D2C(数据未显示)。进一步用结合剂CDH3-24、CDH3-25、CDH3-26和CDH3-27进行了相同的分析。这些结合剂识别人CDH3的胞外结构域D3，更确切而言识别子结构域D3A(数据未显示)。
实施例3
抗体对人和食蟹猴(cynomolgus)CDH3的亲和力的基于Biacore的测定
使用具有人白蛋白(HALB)的重组CDH3(分别为人和食蟹猴(cyno)CDH3)融合蛋白进行Biacore分析实验，来测定本发明抗体的CDH3靶标结合。
具体地，根据制造商的说明书，采用pH 4.5的醋酸盐缓冲液使CM5传感器芯片(GEHealthcare)固定大约600-800RU的相应重组抗原。CDH3xCD3双特异性抗体样品按照五个浓度加载：在HBS-EP运行缓冲液(GE Healthcare)中稀释的50nM、25nM、12.5nM、6.25nM及3.13nM。流速为30μl/min进行3分钟，然后以30μl/ml的流速再应用HBS-EP运行缓冲液8min至20min。使用pH 1.5的10mM甘氨酸、10mM NaCl溶液进行芯片再生。数据集使用BiaEval软件进行分析。通常进行两个独立的实验。
根据本发明的CDH3xCD3双特异性抗体都表现出与人CDH3的高亲和力，其中亲和力在1位纳摩尔范围内。与猕猴CDH3的结合是平衡的，也显示出在相似范围内的亲和力。亲和力值以及计算得到的亲和力差距示于表2。CDH3-25x F12q-HALB和CDH3-13-xI2C-HLE(Fc)各自在单独的分析法中测量并显示分别具有：
●31.8±1.9nM的KD(hu)，40.9±3.89nM的KD(cyno)和1.29的亲和力差距，和
●12.95±0.5nM的KD(hu)，12.35±0.35nM的KD(cyno)和0.95的亲和力差距。
表2：如通过Biacore分析测定的CDH3xCD3双特异性抗体与人和猕猴CDH3的亲和力，以及计算得到的种间亲和力差距。
实施例4：
CDH3xCD3双特异性抗体对靶抗原阳性细胞上的人和猕猴CDH3的亲和力的基于Scatchard的分析和种间亲和力差距的测定
作为用于测量人和猕猴CDH3之间潜在亲和力差距的最可靠方法，还通过Scatchard分析测定了CDH3xCD3双特异性抗体对用人或猕猴CDH3转染的CHO细胞的亲和力。对于Scatchard分析，饱和结合实验采用单价检测系统进行以精确测定CDH3xCD3双特异性抗体与相应细胞系的单价结合。
各细胞系(表达重组人CDH3的CHO细胞系，表达重组猕猴CDH3的CHO细胞系)的2×104个细胞与起始为10-20nM的相应CDH3xCD3双特异性抗体的各50ul一式三份稀释系列(以1∶2进行十二次稀释)一起培养(直至达到饱和)，然后在4℃下搅拌温育16h并进行一次残留洗涤步骤。随后，将所述细胞用30μl CD3xALEXA488缀合物溶液再一起温育一小时。在一次洗涤步骤后，细胞悬浮于150μl包含3.5％甲醛的FACS缓冲液中，再温育15min，离心，重新悬浮于FACS缓冲液中并用FACS Canto II仪器及FACS Diva软件进行分析。数据是由两组独立的实验产生的，每个实验采用一式三份。计算相应的Scatchard分析值，以推断最大结合(Bmax)。测定在半数最大结合时的CDH3xCD3双特异性抗体的浓度，从而反映相应的KD。一式三份测量的值绘制成双曲线及S型曲线，以证明从最小到最佳结合的适当的浓度范围。
示于表3的值由每个CDH3xCD3双特异性抗体的两个独立实验得到。基于细胞的Scatchard分析证实，本发明的CDH3xCD3双特异性抗体与人CDH3的亲和力是纳摩尔至亚纳摩尔的，且具有约1的很小的食蟹猴(cyno)/人种间CDH3亲和力差距。CDH3-25x F12q-HALB和CDH3-13x I2C-HLE(Fc)各自在单独的分析法中测量并显示分别具有：
●0.37±0.11nM的基于细胞的亲和力(hu)，0.35±0.08nM的基于细胞的亲和力(cyno)和0.95的亲和力差距，和
●0.32±0.003nM的基于细胞的亲和力(hu)，0.5±0.09nM的基于细胞的亲和力(cyno)和1.56的亲和力差距。
表3：如在基于细胞的Scatchard分析中测定的CDH3xCD3双特异性抗体的亲和力(KD)并计算亲和力差距KD猕猴CDH3/KD人CDH3。在两个独立的实验中测量抗体，每个实验采用一式三份。
实施例5
双特异性结合和种间交叉反应性
为了确认与人CDH3和CD3和与食蟹猴(cyno)CDH3和CD3的结合，采用
●分别被人和食蟹猴(cyno)CDH3转染的CHO细胞，
●人CDH3阳性表皮样癌细胞系A431，
●表达CD3的人T细胞白血病细胞系HPB-all(DSMZ，Braunschweig，ACC483)，和
●表达食蟹猴(cynomolgus)CD3的T细胞系HSC-F，
通过流式细胞术测试双特异性抗体。
另外，鼠CDH3转染的CHO细胞用作阴性对照。
对于流式细胞术而言，相应细胞系的200,000个细胞与50ul浓度为5μg/ml纯化的双特异性抗体在冰上温育30分钟。细胞在PBS/2％FCS中洗涤两次并用对CD3结合部分具有特异性的内部(in-house)小鼠抗体检测构建体的结合。洗涤后，用山羊抗小鼠Fcγ-PE检测结合的小鼠抗体。通过流式细胞术测量样品。
结果示于图5A和5B。本发明的CDH3xCD3双特异性抗体使采用人CDH3和食蟹猴(cyno)CDH3转染的CHO细胞染色，且还使人CDH3阳性表皮样癌细胞系A431(天然表达子)以及表达CD3的人和食蟹猴(cyno)T细胞染色。此外，未使阴性对照细胞(鼠CDH3转染的CHO)染色。
实施例6：
未结合人和猕猴旁系同源物的证实
将人和猕猴CDH3旁系同源物(CDH1＝E-钙粘着蛋白、CDH2＝N-钙粘着蛋白、CDH4＝R-钙粘着蛋白和CDH5＝VE-钙粘着蛋白)稳定地转染至dhfr-/-CHO细胞。在FACS分析中用对相应旁系同源物具有特异性的抗体证实蛋白质表达。抗体为R&D MAB18381(用于CDH1)、eBioscience 12-3259-41(用于CDH2)、R&D Systems polyclonal AF2217(用于CDH4)和BDBioscience#555661(用于CDH5)。
如在本实施例中使用的旁系同源物的序列在序列表中鉴定(SEQ ID NOs：41-44)。其也可见于以下基因库登录号：
NM_004360[人CDH1]
NM_001792[人CDH2]
NM_001794[人CDH4]
NM_001795[人CDH5]
按照实施例5中所描述进行流式细胞术分析。结果示于图5C和5D。该分析证实本发明的CDH3xCD3双特异性抗体均不与所测试的人CDH3旁系同源物的任意之一交叉反应。
还证明本发明的抗体不与猕猴CDH3旁系同源物CDH1、CDH2、CDH4和CDH5交叉反应(数据未显示)。采用如上文所描述用于人旁系同源物的相同抗体来证明CHO细胞上的猕猴旁系同源物表达。如在本实施例中所用的猕猴旁系同源物的序列在序列表中鉴定(SEQ IDNOs：45-48)。其也可见于以下基因库登录号：
XM_002802516[猕猴CDH1]
JU321883[猕猴CDH2]
XM_002802511[猕猴CDH5]
此外，从Ensembl Genome Browser(ENSMMUT00000017252)中获得猕猴CDH4序列并使其N-末端在框架中与人CDH4信号肽(氨基酸1-19)融合。
实施例7：
与人种系的同一性
为了分析抗体序列与人抗体种系基因的同一性/相似性，将本发明的CDH3结合剂按照如下比对：比对包括所有CDR的全部VL；将包括CDR1和CDR2但不包括CDR3的全部VH与人抗体种系基因(Vbase)比对。更多详情可见于本申请的说明书中。结果示于下表4：
表4：VH和VL与人种系的同一性
CDH3xCD3双特异性抗体 VH和VL与种系的同一性[％]
CDH3-11 92.7
CDH3-12 93.6
CDH3-13 87.8
CDH3-14 94.1
CDH3-24 89.4
CDH3-25 89.8
CDH3-26 89.8
CDH3-27 90.7
实施例8：
细胞毒性活性
在五个体外细胞毒性分析法中分析了本发明的CDH3xCD3双特异性抗体在将效应T细胞重新定向至表达CDH3的靶细胞中的效力：
●在18小时51-铬释放分析法中测量了CDH3xCD3双特异性抗体在将经刺激的人CD8+效应T细胞重新定向至人CDH3转染的CHO细胞中的效力。结果见图6。
●在18小时51-铬释放分析法中测量了CDH3xCD3双特异性抗体在将经刺激的人CD8+效应T细胞重新定向至CDH3阳性人癌细胞系A431中的效力。结果见图7。
●在48小时基于FACS的细胞毒性分析法中测量了CDH3xCD3双特异性抗体在将未经刺激的人PBMC中的T细胞重新定向至人CDH3转染的CHO细胞中的效力。结果见图8。
●在48小时基于FACS的细胞毒性分析法中测量了CDH3xCD3双特异性抗体在将未经刺激的人PBMC中的T细胞重新定向至CDH3阳性人癌细胞系A431中的效力。结果见图9。
●为了证实交叉反应性CDH3xCD3双特异性抗体能够将猕猴T细胞重新定向至猕猴CDH3转染的CHO细胞，用猕猴T细胞系作为效应T细胞进行48小时基于FACS的细胞毒性分析法。结果见图10。
实施例8.1
采用经刺激的人T细胞的铬释放分析法
富集CD8+T细胞的经刺激的T细胞按如下描述获得。在37℃下，将皮氏培养皿(直径为145mm，Greiner bio-one GmbH，Kremsmünster)涂布最终浓度为1μg/ml的市售抗-CD3特异性抗体(OKT3，Orthoclone)达1小时。使用PBS通过一次洗涤步骤移除未结合的蛋白。将3-5×107个人PBMC添加到预涂布的皮氏培养皿中的具有稳定的谷氨酰胺/10％FCS/IL-220U/ml(Chiron)的120ml RPMI 1640中，并刺激2天。第三天，收集细胞并用RPMI1640洗涤一次。添加IL-2至终浓度为20U/ml并在如上文相同的细胞培养基中再次培养细胞一天。根据制造商的方案，通过使用Dynal-Bead耗竭CD4+T细胞和CD56+NK细胞，富集CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
采用PBS洗涤两次由食蟹猴(cyno)CDH3-或人CDH3-转染的CHO靶细胞，并于37℃下在具有50％FCS的终体积为100μl的RPMI中用11.1MBq51Cr标记60分钟。随后，将标记的靶细胞用5ml RPMI洗涤三次然后用于细胞毒性分析法。所述分析法在96孔板中以E∶T比为10∶1在总体积为200μl的补充的RPMI中进行。采用起始浓度为0.01-1μg/ml的纯化的双特异性抗体及其三倍稀释物。该分析法的温育时间为18小时。细胞毒性按照上清液中释放的铬相对于最大裂解(添加Triton-X)与自发裂解(没有效应细胞)之间差异的相对值进行测定。所有的测量均一式四份进行。上清液中铬活性的测量在Wizard 3”γ计数器(Perkin ElmerLife Sciences GmbH，Germany)上进行。使用针对Windows的Prism 5(5.0版，GraphPad Software Inc.，San Diego，California，USA)进行结果分析。将通过分析程序从S形剂量响应曲线计算的EC50值用于细胞毒性活性的比较。
实施例8.2
将经刺激的人效应T细胞重新定向至人CDH3转染的CHO细胞的效力
使用用人CDH3转染的CHO细胞作为靶细胞，及经刺激的人CD8+T细胞作为效应细胞，在51-铬(51Cr)释放细胞毒性分析法中分析根据本发明的CDH3xCD3双特异性抗体的细胞毒性活性。该实验如实施例8.1中所描述地实施。
结果示于图6和表5。CDH3xCD3双特异性抗体对人CDH3转染的CHO细胞显示强效的(potent)细胞毒性活性，甚至低至1位皮摩尔范围。因此请求保护的抗体(其对对应于人CDH3的位置291-363的表位簇具有特异性)呈现出十分有利的表位活性关系，从而支持了强效的双特异性抗体介导的细胞毒性活性。CDH3-25xF12q-HALB和CDH3-13xI2C-HLE(Fc)各自在单独的分析法中测量，并分别显示出具有3.6pM和8.9pM的EC50。
表5：使用用人CDH3转染的CHO细胞作为靶细胞，及经刺激的人CD8T细胞作为效应细胞，在51-铬(51Cr)释放细胞毒性分析法中分析的CDH3xCD3双特异性抗体的EC50值[pg/ml]。
CDH3xCD3双特异性抗体 EC50[pg/ml]
CDH3-11 76
CDH3-12 370
CDH3-13 7.2
CDH3-14 138
CDH3-24 14
CDH3-25 4.9
CDH3-26 21
CDH3-27 61
实施例8.3
将经刺激的人效应T细胞重新定向至CDH3阳性人癌细胞系A431的效力
使用CDH3阳性人表皮样癌细胞系A431作为靶细胞源，及经刺激的人CD8+T细胞作为效应细胞，在51-铬(51Cr)释放细胞毒性分析法中分析CDH3xCD3双特异性抗体的细胞毒性活性。该分析法如实施例8.1中所描述地实施。
根据采用经刺激的富集的人CD8+淋巴细胞作为效应细胞和人CDH3转染的CHO细胞作为靶细胞的51-铬释放分析法的结果，本发明的CDH3xCD3双特异性抗体对天然表达靶细胞也显示强效的细胞毒性活性(图7和表6)。CDH3-25xFl2q-HALB和CDH3-13xI2C-HLE(Fc)各自在单独的分析法中测量，并分别显示出具有1.2pM和16pM的EC50。
表6：采用CDH3阳性人癌细胞系A431作为靶细胞源，及经刺激的富集的人CD8T细胞作为效应细胞，在18小时51-铬(51Cr)释放细胞毒性分析法中分析CDH3xCD3双特异性抗体的EC50值[pg/ml]。
CDH3xCD3双特异性抗体 EC50[pg/ml]
CDH3-11 47
CDH3-12 362
CDH3-13 62
CDH3-14 385
CDH3-24 5.8
CDH3-25 4.6
CDH3-26 19
CDH3-27 31
实施例8.4
用未经刺激的人PBMC的基于FACS的细胞毒性分析法
效应细胞的分离
通过Ficoll密度梯度离心法，从富集的淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)中制备人外周血单核细胞(PBMC)，所述制备物为血库采集输注用血的副产物。血沉棕黄层由当地血库供应并且在血液采集的同一天制备PBMC。Ficoll密度离心并用Dulbecco’s PBS(Gibco)充分洗涤后，通过用红细胞裂解缓冲液(155mM NH4Cl，10mM KHCO3，100μM EDTA)温育从PBMC中移除残留的红细胞。通过PBMC在100×g离心从上清液中移除血小板。保留的淋巴细胞主要包括B淋巴细胞和T淋巴细胞、NK细胞和单核细胞。PBMC在具有10％FCS(Gibco)的RPMI培养基(Gibco)中于37℃/5％CO2下继续培养。
CD14+和CD56+细胞的耗竭
对于CD14+细胞的耗竭，采用人CD14微珠(Milteny Biotec，MACS，#130-050-201)，对于NK细胞的耗竭，采用人CD56微珠(MACS，#130-050-401)。对PBMC进行计数并在室温下用300×g离心10分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重新悬浮于MACS分离缓冲液[80μL/107个细胞；PBS(Invitrogen，#20012-043)，0.5％(v/v)FBS(Gibco，#10270-106)，2mM EDTA(Sigma-Aldrich，#E-6511)]中。加入CD14微珠和CD56微珠(20μL/107个细胞)并在4-8℃下温育15分钟。用MACS分离缓冲液(1-2mL/107个细胞)洗涤细胞。离心后(参见上文)，弃去上清液并将细胞重新悬浮于MACS分离缓冲液中(500μL/108个细胞)。然后使用LS柱(MiltenyiBiotec，#130-042-401)分离CD14/CD56阴性细胞。将不具有(w/o)CD14+/CD56+细胞的PBMC在37℃的温育箱中的RPMI完全培养基中培养直至使用，所述培养基即补充有10％FBS(BiochromAG，#S0115)、1x非必需氨基酸(Biochrom AG，#K0293)、10mM Hepes缓冲液(Biochrom AG，#L1613)、1mM丙酮酸钠(Biochrom AG，#L0473)和100U/mL青霉素/链霉素(Biochrom AG，#A2213)的RPMI1640(BiochromAG，#FG1215)。
靶细胞标记
对于细胞裂解在流式细胞术分析法中的分析，使用荧光膜染料DiOC18(DiO)(Molecular Probes，#V22886)标记作为靶细胞的人CDH3-或猕猴CDH3-转染的CHO细胞，并将所述细胞从效应细胞中区分出来。简言之，将细胞收获、用PBS洗涤一次并且在包含2％(v/v)FBS和膜染料DiO(5μL/106个细胞)的PBS中调节至106个细胞/mL。在37℃下温育3min后，细胞在完全RPMI培养基中洗涤两次并且将细胞数量调节至1.25×105个细胞/mL。采用0.5％(v/v)的等渗EosinG溶液(Roth，#45380)测定细胞活力。
基于流式细胞术的分析
设计这一分析法，以量化在CDH3双特异性抗体的系列稀释液存在下经食蟹猴(cyno)或人CDH3转染的CHO细胞的裂解。等体积的Dio标记的靶细胞和效应细胞(即不具有CD14+细胞的PBMC)混合，使E∶T细胞比为10∶1。将160μl的此悬浮液转移至96-孔板的每个孔中。添加40μL CDH3xCD3双特异性抗体的系列稀释液和阴性对照双特异性物(一种识别不相关靶抗原的基于CD3的双特异性抗体)或作为另外的阴性对照的RPMI完全培养基。由双特异性抗体介导的细胞毒性反应在7％CO2加湿温育箱中进行48小时。然后将细胞转移至新的96孔板并且通过添加最终浓度为1μg/mL的碘化丙碇(PI)对靶细胞膜的完整性缺失进行监测。PI是一种膜不渗透染料，其通常被活细胞排除在外，而进入死细胞使其可通过荧光发射而被识别。
样品在FACSCanto II仪器上通过流式细胞术测量并用FACSDiva软件(两者都来自Becton Dickinson)进行分析。靶细胞被识别为DiO-阳性细胞。PI-阴性靶细胞归类为活的靶细胞。根据下式计算细胞毒性的百分比：
n＝事件数目
使用GraphPad Prism 5软件(Graph Pad Software，San Diego)，将细胞毒性百分比相对于相应双特异性抗体浓度作图。采用用于评估具有固定斜率的S型剂量响应曲线的四参数logistic回归模型进行剂量响应曲线分析，并计算EC50值。
实施例8.5
将未经刺激的人PBMC重新定向至人CDH3转染的CHO细胞的效力
采用人CDH3转染的CHO细胞作为靶细胞，及未经刺激的人PBMC作为效应细胞，在基于FACS的细胞毒性分析法中分析CDH3xCD3双特异性抗体的细胞毒性活性。该分析法如上文实施例8.4中所描述地实施。
采用未经刺激的人PBMC作为效应细胞和人CDH3转染的CHO细胞作为靶细胞的基于FACS的细胞毒性分析法的结果示于图8和表7。CDH3-25xF12q-HALB和CDH3-13xI2C-HLE(Fc)各自在单独的分析法中测量，并分别显示出具有4.6pM和5.6pM的EC50。
表7：如采用未经刺激的人PBMC作为效应细胞和用人CDH3转染的CHO细胞作为靶细胞，在48小时基于FACS的细胞毒性分析法中测量的CDH3xCD3双特异性抗体的EC50值[pg/ml]。
CDH3xCD3双特异性抗体 EC50[pg/ml]
CDH3-11 462
CDH3-12 1021
CDH3-13 129
CDH3-14 1885
CDH3-24 19
CDH3-25 10
CDH3-26 47
CDH3-27 61
实施例8.6
将未经刺激的人PBMC重新定向至CDH3阳性人癌细胞系A431的效力
采用CDH3阳性人表皮样癌细胞系A431作为靶细胞源和未经刺激的人PBMC作为效应细胞，在基于FACS的细胞毒性分析法中进一步分析CDH3xCD3双特异性抗体的细胞毒性活性。该分析法如上文实施例8.4中所描述地实施。结果示于图9和表8。CDH3-25xF12q-HALB和CDH3-13xI2C-HLE(Fc)各自在单独的分析法中测量，并分别显示出具有2.3pM和32pM的EC50。
表8：如采用未经刺激的人PBMC作为效应细胞和人A431细胞系作为靶细胞源，在48小时基于FACS的细胞毒性分析法中测量的CDH3xCD3双特异性抗体的EC50值[pg/ml]。
CDH3xCD3双特异性抗体 EC50[pg/ml]
CDH3-11 389
CDH3-12 3141
CDH3-13 83
CDH3-14 4842
CDH3-24 15
CDH3-25 9.2
CDH3-26 35
CDH3-27 41
如所预期地，与采用经刺激的人CD8+T细胞的细胞毒性分析法相比，使用未经刺激的PBMC作为效应细胞的细胞毒性分析法中的EC50值普遍更高。
实施例8.7
将猕猴T细胞重新定向至表达猕猴CDH3的CHO细胞的效力
最后，使用经食蟹猴(cyno)CDH3转染的CHO细胞作为靶细胞，猕猴T细胞系作为效应细胞源，在基于FACS的细胞毒性分析法中分析CDH3xCD3双特异性抗体的细胞毒性活性。猕猴T细胞系4119LnPx(Knappe等人，Blood 95：3256-61(2000))用作效应细胞源。经猕猴CDH3-转染的CHO细胞的靶细胞标记和基于流式细胞术的细胞毒性活性分析如上文所描述地进行。
结果示于图10和表9。由本发明的CDH3xCD3双特异性抗体(即结合人CDH3的表位簇的抗体，所述表位簇对应于人CDH3的位置291-363并且涵盖相邻的子结构域D2C(位置291-327)和D3A(位置328-363))诱导源自细胞系4119LnPx的猕猴T细胞有效杀死经猕猴CDH3转染的CHO细胞。在这一分析法中，所述抗体呈现出2-位至非常低的4-位pg/ml的EC50值的效力，这证实这些抗体在猕猴系统中是非常活跃的。
在表位成簇(参见实施例2)中已鉴定了另一组抗-CDH3抗体，其结合胞外结构域D1，并更具体地结合人CDH3的子结构域D1B。出乎意料地，该组的CDH3xCD3双特异性抗体(尽管对用人CDH3转染的CHO细胞具有强效的细胞毒性活性)被证明对猕猴CDH3转染的CHO细胞显示非常弱的细胞毒性活性(参见图10C和表9)。该组抗体显示显著较弱的效力，其EC50值在非常高的4-位和甚至5-位pg/ml范围。CDH3-25xF12q-HALB和CDH3-13xI2C-HLE(Fc)各自在单独的分析法中测量，并分别显示出具有1.4pM和4.0pM的EC50。
因此，在猕猴系统中，本发明的CDH3xCD3抗体(其结合对应于位置291-363的CDH3的表位簇)是结合胞外结构域D1，更具体而言结合CDH3子结构域D1B的抗体的效力的约5至约1000倍强。
表9：如采用猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞和用猕猴CDH3转染的CHO细胞作为靶细胞，在48小时基于FACS的细胞毒性分析法中测量的结合对应于位置291-363(1-8行)的CDH3表位簇的CDH3xCD3双特异性抗体和结合CDH3表位簇/子结构域D1B(9-12行)的CDH3xCD3双特异性抗体的EC50值[pg/ml]。
实施例9
在(i)三次冷冻/解冻循环和(ii)250μg/ml下温育7天后的单体向二聚体的转化
使双特异性CDH3xCD3抗体单体经受不同的应力(stress)条件，随后进行高效SEC来测定已经转化为抗体二聚体的初始单体抗体的百分比。
(i)采用通用配方(formulation)缓冲液将15μg的单体抗体调节至浓度为250μg/ml，并且随后在-80℃下冷冻30min，之后在室温下解冻30min。三次冷冻/解冻循环后通过HP-SEC测定二聚体含量。
(ii)采用通用配方缓冲液将15μg的单体抗体调节至浓度为250μg/ml，随后在37℃下温育7天。通过HP-SEC测定二聚体含量。
将高分辨度的SEC柱TSK Gel G3000SWXL(Tosoh，Tokyo-日本)与配有A905自动进样器的Purifier 10FPLC(GE Lifesciences)连接。柱的平衡及运行缓冲液由100mMKH2PO4-200mM Na2SO4组成并调成pH 6.6。将抗体溶液(15μg蛋白)施加至平衡柱中并以流速为0.75ml/min在最大压力7MPa下进行洗脱。整个运行过程以280、254和210nm吸光度监测。通过记录在Unicorn软件运行评估表中的210nm信号的峰值积分进行分析。通过将二聚体峰面积除以单体加上二聚体峰的总面积计算二聚体的含量。
所得结果示于下表10。在三次冷冻/解冻循环以及在37℃下温育7天后，结合至表位簇/胞外子结构域D2C的CDH3xCD3双特异性抗体呈现的二聚体百分比≤1％，更准确地说二聚体百分比为0.0％，这被认为是非常好的。表位簇/胞外子结构域D3A的CDH3xCD3双特异性抗体的二聚体转化率达到≤2％的值，更准确地说在0.2至1.8之间，这被认为是良好的。CDH3-25xF12q-HALB和CDH3-13xI2C-HLE(Fc)各自在单独的分析法中测量，并在三次冷冻/解冻循环后分别显示出具有1.1和0.84的二聚体百分比，以及在7天温育后显示出具有0.0的二聚体百分比(均为HLE构建体)。
表10：如通过高效尺寸排阻色谱(HP-SEC)测定的单体相对于(versus)二聚体CDH3xCD3双特异性抗体的百分比
实施例10
热稳定性
如下测定抗体聚集温度：将40μl的250μg/ml抗体溶液转移到单次使用的比色杯中，并置于Wyatt动态光散射装置DynaPro Nanostar(Wyatt)中。以0.5℃/min的加热速率将样品从40℃加热至70℃并恒定采集所测量的半径(radius)。将表明蛋白质熔融和聚集的半径的增加由与DLS设备交付的软件包用于计算抗体的聚集温度。
如下文表11中所示，本发明所有测试的CDH3xCD3双特异性抗体均表现出非常有利的热稳定性，其聚集温度在54℃以上。CDH3-25x F12q-HALB在单独的分析法中测量并显示出具有56.3℃的热稳定性。
表11：如通过DLS(动态光散射)测定的双特异性抗体的热稳定性
实施例11：
在人血浆中温育24小时后的稳定性
以终浓度2-20μg/ml在37℃下，将纯化的双特异性抗体以1∶5的比率在人血浆池中温育24h-96h。血浆温育后，以0.01-0.1μg/ml的起始浓度和效应细胞与靶细胞(E∶T)比为10∶1，在51-铬释放分析法中采用经刺激的人T细胞和CDH3转染的CHO细胞比较所述抗体(如实施例8.1采用经刺激的人T细胞的铬释放分析法中所描述的分析法)。包括未温育的、新鲜解冻的双特异性抗体作为对照。结果示于表12。所有测试的抗体均具有≤4的有利的血浆稳定性(EC50血浆/EC50对照)，结合D3A的抗体组甚至具有≤3的血浆稳定性。CDH3-25x F12q-HALB和CDH3-13x 12C-HLE(Fc)各自在单独的分析法中测量并显示分别具有：
●4.4pM的具有血浆的EC50，3.6pM的不具有血浆的EC50，和1.2的血浆与对照比，和
●3.4pM的具有血浆的EC50，8.9pM的不具有血浆的EC50，和0.4的血浆与对照比。
表12：抗体的具有和不具有血浆温育的EC50值和计算的血浆/对照的值
实施例12
2500μg/ml抗体浓度下的浊度
1ml的250μg/ml纯化的单体抗体通过自旋浓缩单元浓缩至2500μg/ml。在5℃下储存16小时后，通过OD340nm光学吸收测量相对于通用配方缓冲液测定抗体溶液的浊度。所得结果示于下文表13。所有测试的抗体均具有≤0.05的非常有利的浊度。CDH3-25x F12q-HALB和CDH3-13x I2C-HLE(Fc)各自在单独的分析法中测量并显示在2500μg/ml下分别具有0.066和0.026的浊度。
表13：浓缩至2.5mg/ml过夜后的抗体的浊度
CDH3xCD3双特异性抗体 2500μg/ml下的浊度
CDH3-11 0.035
CDH3-12 0.025
CDH3-13 0.030
CDH3-14 0.025
CDH3-24 0.019
CDH3-25 0.026
CDH3-26 0.028
CDH3-27 0.022
实施例14：
CDH3xCD3双特异性抗体在人肿瘤异种移植模型中的治疗功效
在研究的第1天，在雌性NOD/SCID小鼠的右背侧面以皮下方式共同注射人表皮样癌细胞系A-431的细胞和新鲜分离的人PBMC(E∶T细胞比为1∶2)。溶媒(vehicle)对照组1(n＝5)的小鼠并未接受效应细胞并用作未移植的对照，用于与溶媒对照组2(n＝10，接受效应细胞)比较，以监测在不存在抗体的情况下PBMC对肿瘤生长的影响。
在第1天肿瘤细胞注射后约2小时开始，通过每天静脉内推注0.5mg/kg/天(组3，n＝10)、0.05mg/kg/天(组4，n＝10)或0.005mg/kg/天(组5，n＝10)的特异性结合胞外结构域CDH3子结构域D2C的CDH3xCD3双特异性抗体治疗小鼠达连续10天。
在研究期间采用卡尺测量肿瘤并通过肿瘤体积(TV)的组间比较来评估进展。通过如T/C％＝100×(分析组的中值TV)/(对照组2的中值TV)计算TV来测定肿瘤生长抑制T/C[％]。
结果示于图11。以0.5mg/kg/天剂量水平的CDH3xCD3双特异性抗体的小鼠治疗导致了肿瘤形成的完全抑制，并且直到研究结束(第40天)，没有一只动物形成肿瘤。
实施例15：
CDH3xCD3双特异性HLE抗体在HCT-116肿瘤模型中的抗肿瘤活性
该分析法在皮下注射人HCT-116结肠癌细胞的雌性NOD/SCID小鼠中进行。使效应细胞体外扩增并使人CD3+T细胞活化(第12天)。当肿瘤体积达到～200mm3时(第17天)，开始治疗。对照组为采用T细胞的q5d溶媒治疗组。通过静脉内推注，每5天(q5d)以5mg/kg/施用(组2)和0.5mg/kg/施用(组3)的浓度施用具有SEQ ID NO：425的抗体。结果示于图12A和12B。特别地，图12B以响应动物(7/10)和无响应动物(3/10)区分结果。尽管30％的动物无响应的原因并不明确，但图12B显示以5mg/kg的浓度向响应动物施用半衰期延长的双特异性构建体导致从抗体施用那一刻开始的肿瘤生长终止。
实施例16
T细胞活化激活分析法
将来自健康人供体的分离的PBMC与递增浓度的CDH3-13xI2C或CDH3-13xI2C-HALB双特异性抗体构建体一起培养48小时(0.001pM-20μM的系列稀释)。通过免疫染色和流式细胞术以及抗原特异性缀合物mAb测定CD4+和CD8+T细胞上的活化标记物CD69的表达。结果示于图13并在本文中的上文阐述。
实施例17
半衰期延长的CDH3xCD3构建体的食蟹猴(cyno)药代动力学研究
使雌性食蟹猴(cynomolgous monkey)接受静脉内输注0.015mg/kg的缓冲液中的半衰期延长的CDH3xCD3双特异性抗体构建体(施用体积1ml/kg)达60分钟。测试的三种HLE形式为P156、HALB和HALB变体1(参见SEQ ID NOs：437、443和444)，每一种均融合至相应构建体的C-末端。在食蟹猴(cyno)模型中基于在施用后96个小时与研究终止之间的4个(P156)和6个(HALB、HALB变体1)时间点分析的血浆浓度计算这些HLE构建体的半衰期。结果是，分别地，具有P156的HLE构建体显示出57小时的半衰期，具有HALB的HLE构建体显示出63-85小时的半衰期，和具有HALB变体1的HLE构建体显示出68小时的半衰期。这些PK性质表明人中的每周一次静脉内给药。

Claims (32)

1.一种双特异性抗体构建体，其包含结合靶细胞表面上的人CDH3的表位簇的第一人结合结构域，且包含结合T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域，其中所述人CDH3的表位簇包含在人CDH3的氨基酸位置291-363(SEQ ID NO:36)中。
2.根据权利要求1所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域结合包含在人CDH3的氨基酸位置291-327(SEQ ID NO:34)中的表位。
3.根据权利要求1所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域结合包含在人CDH3的氨基酸位置328-363(SEQ ID NO:35)中的表位。
4.根据权利要求3所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域还结合包含在人CDH3的氨基酸位置404-440(SEQ ID NO:390)中的表位。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域还结合猕猴CDH3，优选地结合食蟹猴CDH3。
6.根据权利要求1、2和5中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区包含选自下述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且所述VL区包含选自下述的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：
a)如SEQ ID NO:149中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO:150中描绘的CDR-H2、如SEQ IDNO:151中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO:152中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO:153中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO:154中描绘的CDR-L3；
b)如SEQ ID NO:159中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO:160中描绘的CDR-H2、如SEQ IDNO:161中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO:162中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO:163中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO:164中描绘的CDR-L3；
c)如SEQ ID NO:169中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO:170中描绘的CDR-H2、如SEQ IDNO:171中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO:172中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO:173中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO:174中描绘的CDR-L3；
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i)如SEQ ID NO:229中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO:230中描绘的CDR-H2、如SEQ IDNO:231中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO:232中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO:233中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO:234中描绘的CDR-L3；和
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7.根据权利要求1、3、4和5中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区包含选自下述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且所述VL区包含选自下述的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：
a)如SEQ ID NO:279中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO:280中描绘的CDR-H2、如SEQ IDNO:281中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO:282中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO:283中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO:284中描绘的CDR-L3；
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h)如SEQ ID NO:349中描绘的CDR-H1、如SEQ ID NO:350中描绘的CDR-H2、如SEQ IDNO:351中描绘的CDR-H3、如SEQ ID NO:352中描绘的CDR-L1、如SEQ ID NO:353中描绘的CDR-L2和如SEQ ID NO:354中描绘的CDR-L3。
8.根据权利要求6所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域包含VH区，所述VH区选自如SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:195、SEQID NO:205、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:235和SEQ ID NO:245中描绘的VH区。
9.根据权利要求7所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域包含VH区，所述VH区选自如SEQ ID NO:285、SEQ ID NO:295、SEQ ID NO:305、SEQ ID NO:315、SEQ ID NO:325、SEQID NO:335、SEQ ID NO:345和SEQ ID NO:355中描绘的VH区。
10.根据权利要求6或8所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域包含VL区，所述VL区选自如SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:236和SEQ ID NO:246中描绘的VL区。
11.根据权利要求7或9所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域包含VL区，所述VL区选自如SEQ ID NO:286、SEQ ID NO:296、SEQ ID NO:306、SEQ ID NO:316、SEQ ID NO:326、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:346和SEQ ID NO:356中描绘的VL区。
12.根据权利要求6、8或10中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区和VL区选自如SEQ ID NO:155+156、SEQ ID NO:165+166、SEQ ID NO:175+176、SEQ ID NO:185+186、SEQ ID NO:195+196、SEQ ID NO:205+206、SEQ ID NO:215+216、SEQ ID NO:225+226、SEQ ID NO:235+236和SEQ ID NO:245+246中描绘的VH区和VL区的配对。
13.根据权利要求7、9或11中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区和VL区选自如SEQ ID NO:285+286、SEQ ID NO:295+296、SEQ ID NO:305+306、SEQ ID NO:315+316、SEQ ID NO:325+326、SEQ ID NO:335+336、SEQ ID NO:345+346和SEQ ID NO:355+356中描绘的VH区和VL区的配对。
14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体是选自(scFv)2、scFv-单结构域mAb、前述形式的双抗体和寡聚体的形式。
15.根据权利要求6、8、10、12或14中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域包含选自SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:237和SEQ ID NO:247中描绘的那些的氨基酸序列。
16.根据权利要求7、9、11、13或14中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域包含选自SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:297、SEQ ID NO:307、SEQ ID NO:317、SEQ ID NO:327、SEQ ID NO:337、SEQ ID NO:347和SEQ ID NO:357中描绘的那些的氨基酸序列。
17.根据前述权利要求中任一项所述的抗体构建体，其中所述第二结合结构域结合人和普通狨、绒顶柽柳猴或松鼠猴CD3ε。
18.根据权利要求6、8、10、12、14、15或17中任一项所述的抗体构建体，其包含选自SEQID NO:158、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:238和SEQ ID NO:248中描绘的那些的氨基酸序列。
19.根据权利要求7、9、11、13、14、16或17中任一项所述的抗体构建体，其包含选自SEQID NO:288、SEQ ID NO:298、SEQ ID NO:308、SEQ ID NO:318、SEQ ID NO:328、SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:348和SEQ ID NO:358中描绘的那些的氨基酸序列。
20.根据权利要求6、8、10、12、14、15、17或18中任一项所述的抗体构建体，其包含选自SEQ ID NO:379、SEQ ID NO:380、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:383、SEQ IDNO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:422、SEQ ID NO:423、SEQ ID NO:424、SEQ ID NO:425、SEQ ID NO:426和SEQ IDNO:427中描绘的那些的氨基酸序列。
21.一种多核苷酸，其编码如前述权利要求中任一项所述的抗体构建体。
22.一种载体，其包含如权利要求21所述的多核苷酸。
23.一种宿主细胞，其用如权利要求21所述的多核苷酸或如权利要求22所述的载体转化或转染。
24.一种用于产生根据权利要求1至20中任一项所述的抗体构建体的方法，所述方法包括在允许如权利要求1至20中任一项所述的抗体构建体表达的条件下培养如权利要求23所述的宿主细胞，和从培养物中回收所产生的抗体构建体。
25.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至20中任一项所述的抗体构建体或根据权利要求24所述的方法产生的抗体构建体。
26.根据权利要求1至20中任一项所述的抗体构建体或根据权利要求24所述的方法产生的抗体构建体，其用于在预防、治疗或改善肿瘤或癌症中使用。
27.根据权利要求26所述的抗体构建体，其中所述癌症选自肺癌、头颈癌、原发性或继发性CNS肿瘤、原发性或继发性脑肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、肾上腺皮质癌、食管癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、NSCLC(非小细胞肺癌)、SCLC(小细胞肺癌)、子宫内膜癌、宫颈癌、子宫癌、移行细胞癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、皮肤或眼内黑色素瘤、肝癌、胆管癌、胆囊癌、肾癌、直肠癌、肛门区域的癌症、胃癌、胃肠道(胃、结肠直肠和十二指肠)癌、小肠癌、胆道癌、尿道癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、睾丸癌、皮肤鳞状细胞癌、黑色素瘤、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、骨肉瘤、间皮瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、慢性或急性白血病、慢性髓细胞样白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、纤维肉瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和软组织肉瘤。
28.根据权利要求27所述的抗体构建体，其中所述癌症是鳞状细胞癌。
29.一种用于治疗、预防或改善肿瘤或癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用根据权利要求1至20中任一项所述的抗体构建体或根据权利要求24所述的方法产生的抗体构建体的步骤。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述癌症选自肺癌、头颈癌、原发性或继发性CNS肿瘤、原发性或继发性脑肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、肾上腺皮质癌、食管癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、NSCLC(非小细胞肺癌)、SCLC(小细胞肺癌)、子宫内膜癌、宫颈癌、子宫癌、移行细胞癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、皮肤或眼内黑色素瘤、肝癌、胆管癌、胆囊癌、肾癌、直肠癌、肛门区域的癌症、胃癌、胃肠道(胃、结肠直肠和十二指肠)癌、小肠癌、胆道癌、尿道癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、睾丸癌、皮肤鳞状细胞癌、黑色素瘤、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、骨肉瘤、间皮瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、慢性或急性白血病、慢性髓细胞样白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、纤维肉瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和软组织肉瘤。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述癌症是鳞状细胞癌。
32.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至20中任一项所述的抗体构建体、根据权利要求24所述的方法产生的抗体构建体、如权利要求22所述的载体和/或如权利要求23所述的宿主细胞。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110582297A (zh) * 2017-02-02 2019-12-17 安进研究(慕尼黑)有限责任公司 包含T细胞接合抗体构建体的低pH药物组合物

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2547600C2 (ru) * 2008-10-01 2015-04-10 Эмджен Рисерч (Мьюник) Гмбх Pscaxcd3, cd19xcd3, c-metxcd3, эндосиалинxcd3, epcamxcd3, igf-1rxcd3 или fap-альфаxcd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
EA039859B1 (ru) * 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
KR20180103084A (ko) 2016-02-03 2018-09-18 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 Bcma 및 cd3 이중특이성 t 세포 맞물림 항체 작제물
JP7366755B2 (ja) 2017-05-30 2023-10-23 ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ オクラホマ 抗ダブルコルチン様キナーゼ１抗体および使用方法
JP7409669B2 (ja) * 2017-12-04 2024-01-09 ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ オクラホマ 抗ｄｃｌｋ１抗体およびキメラ抗原受容体、ならびにこれらの組成物および使用方法
TW201940518A (zh) * 2017-12-29 2019-10-16 美商安進公司 針對ｍｕｃ１７和ｃｄ３之雙特異性抗體構建體
EP3740505A1 (en) * 2018-01-16 2020-11-25 Lakepharma Inc. Bispecific antibody that binds cd3 and another target
AU2019222760A1 (en) * 2018-02-14 2020-09-10 Yale University Compositions for modulation of a TREM or TREML protein and methods of use
WO2020094834A1 (en) * 2018-11-09 2020-05-14 Euchloe Bio Pte. Ltd. Il2rbeta/common gamma chain antibodies
EP3973000A4 (en) * 2019-06-07 2023-09-06 Adimab, LLC HIGH AFFINITY ANTI-CD3 ANTIBODIES AND METHODS OF GENERATION AND USE THEREOF
CN114786720A (zh) * 2019-12-05 2022-07-22 艾贝乐医药科技有限公司 TriAx抗体的组合物及其制备和使用方法
CN116096751A (zh) * 2020-02-25 2023-05-09 璟尚生物制药公司 三特异性t细胞接合器
WO2022204516A1 (en) * 2021-03-26 2022-09-29 The General Hospital Corporation Humanized mab107

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008124858A2 (en) * 2007-04-11 2008-10-23 F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges. M.B.H. Targeted receptor
CN102137929A (zh) * 2008-06-30 2011-07-27 肿瘤疗法科学股份有限公司 用放射性同位素标记物标记的抗cdh3抗体及其用途
CN102753579A (zh) * 2009-05-01 2012-10-24 国立大学法人东京大学 抗钙粘着蛋白抗体
CN102781964A (zh) * 2009-12-28 2012-11-14 肿瘤疗法科学股份有限公司 抗cdh3抗体及其用途
CN106661119A (zh) * 2014-07-01 2017-05-10 辉瑞公司 双特异性异二聚化双抗体及其用途

Family Cites Families (182)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US556A (en) 1838-01-09 Machine foe
US4447A (en) 1846-04-04 Car- wheel
US233A (en) 1837-06-14 Improvement in plows
US5013A (en) 1847-03-13 Improvement in apparatus for the manufacture of malleable iron
US462837A (en) 1891-11-10 Indicating device for water-tanks
US3180193A (en) 1963-02-25 1965-04-27 Benedict David Machines for cutting lengths of strip material
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3691016A (en) 1970-04-17 1972-09-12 Monsanto Co Process for the preparation of insoluble enzymes
CA1023287A (en) 1972-12-08 1977-12-27 Boehringer Mannheim G.M.B.H. Process for the preparation of carrier-bound proteins
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4195128A (en) 1976-05-03 1980-03-25 Bayer Aktiengesellschaft Polymeric carrier bound ligands
US4330440A (en) 1977-02-08 1982-05-18 Development Finance Corporation Of New Zealand Activated matrix and method of activation
CA1093991A (en) 1977-02-17 1981-01-20 Hideo Hirohara Enzyme immobilization with pullulan gel
US4229537A (en) 1978-02-09 1980-10-21 New York University Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
EP0088046B1 (de) 1982-02-17 1987-12-09 Ciba-Geigy Ag Lipide in wässriger Phase
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
JPS58166634A (ja) 1982-03-29 1983-10-01 Toshiba Corp 有機溶媒電池用正極
JPS58166633A (ja) 1982-03-29 1983-10-01 Toshiba Corp 有機溶媒電池用正極
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
DE3474511D1 (en) 1983-11-01 1988-11-17 Terumo Corp Pharmaceutical composition containing urokinase
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
JPS62170639A (ja) 1986-01-22 1987-07-27 株式会社システムメンテナンス 防蟻板の取付け工法
EP0272253A4 (en) 1986-03-07 1990-02-05 Massachusetts Inst Technology METHOD FOR IMPROVING GLYCOPROTE INSTABILITY.
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
ATE120761T1 (de) 1987-05-21 1995-04-15 Creative Biomolecules Inc Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung.
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
DE3850753T2 (de) 1987-12-09 1995-03-16 Omron Tateisi Electronics Co Induktives Datenübertragungssystem.
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
US5683888A (en) 1989-07-22 1997-11-04 University Of Wales College Of Medicine Modified bioluminescent proteins and their use
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5292658A (en) 1989-12-29 1994-03-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Boyd Graduate Studies Research Center Cloning and expressions of Renilla luciferase
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
FR2664073A1 (fr) 1990-06-29 1992-01-03 Thomson Csf Moyens de marquage d'objets, procede de realisation et dispositif de lecture.
WO1992003917A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International Homologous recombination in mammalian cells
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0575319B1 (en) 1991-03-11 1999-11-10 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cloning and expression of renilla luciferase
WO1992022670A1 (en) 1991-06-12 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Early detection of transgenic embryos
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5470582A (en) 1992-02-07 1995-11-28 Syntex (U.S.A.) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous polymeric microparticles
EP0648265A4 (en) 1992-06-18 1996-12-04 Genpharm Int PROCESS FOR THE PRODUCTION OF NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS HAVING AN ARTIFICIAL YEAST CHROMOSOME.
ATE381614T1 (de) 1992-07-24 2008-01-15 Amgen Fremont Inc Bildung von xenogenen antikörpern
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
AU678787B2 (en) 1992-10-23 1997-06-12 Immunex Corporation Methods of preparing soluble, oligomeric proteins
US5981175A (en) 1993-01-07 1999-11-09 Genpharm Internation, Inc. Methods for producing recombinant mammalian cells harboring a yeast artificial chromosome
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
AU694745B2 (en) 1993-09-10 1998-07-30 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Uses of green fluorescent protein
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
WO1995021191A1 (en) 1994-02-04 1995-08-10 William Ward Bioluminescent indicator based upon the expression of a gene for a modified green-fluorescent protein
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
US5777079A (en) 1994-11-10 1998-07-07 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
ES2304786T3 (es) 1995-04-27 2008-10-16 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos anti-il-8 humanos, derivados a partir de xenoratones inmunizados.
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
EP0859841B1 (en) 1995-08-18 2002-06-19 MorphoSys AG Protein/(poly)peptide libraries
AU718138B2 (en) 1995-08-29 2000-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Chimeric animal and method for constructing the same
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US5804387A (en) 1996-02-01 1998-09-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP)
US5876995A (en) 1996-02-06 1999-03-02 Bryan; Bruce Bioluminescent novelty items
US5925558A (en) 1996-07-16 1999-07-20 The Regents Of The University Of California Assays for protein kinases using fluorescent protein substrates
US5976796A (en) 1996-10-04 1999-11-02 Loma Linda University Construction and expression of renilla luciferase and green fluorescent protein fusion genes
DK1500329T3 (da) 1996-12-03 2012-07-09 Amgen Fremont Inc Humane antistoffer, der specifikt binder TNF-alfa
WO1998026277A2 (en) 1996-12-12 1998-06-18 Prolume, Ltd. Apparatus and method for detecting and identifying infectious agents
EP1724282B1 (en) 1997-05-21 2013-05-15 Merck Patent GmbH Method for the production of non-immunogenic proteins
ATE302273T1 (de) 1997-10-15 2005-09-15 Pharis Biotec Gmbh Cadherin derived growth factor und seine verwendung
EP1064360B1 (en) 1998-03-27 2008-03-05 Prolume, Ltd. Luciferases, gfp fluorescent proteins, their nucleic acids and the use thereof in diagnostics
PT1071752E (pt) 1998-04-21 2003-11-28 Micromet Ag Polipeptidos especificos para cd19xcd3 e suas utilizacoes
ATE251181T1 (de) 1998-07-28 2003-10-15 Micromet Ag Heterominikörper
US7254167B2 (en) 1998-10-30 2007-08-07 Broadcom Corporation Constellation-multiplexed transmitter and receiver
AU776910B2 (en) 1998-12-08 2004-09-23 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Modifying protein immunogenicity
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
CA2445611A1 (en) 2001-05-31 2002-12-05 Chiron Corporation P-cadherin as a target for anti-cancer therapy
US7230167B2 (en) 2001-08-31 2007-06-12 Syngenta Participations Ag Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor
JP2005510253A (ja) 2001-11-30 2005-04-21 アブジェニックス インコーポレイテッド ヒトＩｇλ軽鎖遺伝子を保有するトランスジェニック動物
US8486859B2 (en) 2002-05-15 2013-07-16 Bioenergy, Inc. Use of ribose to enhance plant growth
WO2004110345A2 (en) 2002-10-29 2004-12-23 Pharmacia Corporation Differentially expressed genes involved in cancer, the polypeptides encoded thereby, and methods of using the same
US7904068B2 (en) 2003-06-06 2011-03-08 At&T Intellectual Property I, L.P. System and method for providing integrated voice and data services utilizing wired cordless access with unlicensed spectrum and wired access with licensed spectrum
KR101229731B1 (ko) 2003-10-16 2013-03-07 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 다중특이적 탈면역화된 ｃｄ3-바인더
DE602006017460D1 (de) 2005-03-14 2010-11-25 Omron Tateisi Electronics Co Programmierbares Steuersystem
BRPI0608096A2 (pt) 2005-04-26 2009-11-10 Pfizer anticorpos p-caderina
ES2776657T3 (es) 2005-06-14 2020-07-31 Amgen Inc Formulaciones de proteínas autotamponantes
US8234145B2 (en) 2005-07-12 2012-07-31 International Business Machines Corporation Automatic computation of validation metrics for global logistics processes
BRPI0604215A (pt) 2005-08-17 2007-04-10 Biosigma Sa método para projetar oligonucleotìdeos para técnicas de biologia molecular
AU2006301492B2 (en) 2005-10-11 2011-06-09 Amgen Research (Munich) Gmbh Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
JP2007122396A (ja) 2005-10-27 2007-05-17 Hitachi Ltd ディスクアレイ装置及びその障害対応検証方法
TW200745163A (en) 2006-02-17 2007-12-16 Syntonix Pharmaceuticals Inc Peptides that block the binding of IgG to FcRn
US7919297B2 (en) 2006-02-21 2011-04-05 Cornell Research Foundation, Inc. Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase
EP2004687A1 (en) 2006-02-28 2008-12-24 Oncotherapy Science, Inc. Methods for damaging cells using effector functions of anti-cdh3 antibodies
US7574748B2 (en) 2006-03-07 2009-08-18 Nike, Inc. Glove with support system
US7990860B2 (en) 2006-06-16 2011-08-02 Harris Corporation Method and system for rule-based sequencing for QoS
US8430938B1 (en) 2006-07-13 2013-04-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Control algorithm for autothermal reformer
KR101146588B1 (ko) 2006-08-11 2012-05-16 삼성전자주식회사 Ｆｉｎ 구조체 및 이를 이용한 핀 트랜지스터의 제조방법
CN100589507C (zh) 2006-10-30 2010-02-10 华为技术有限公司 一种拨号提示系统及方法
US7466008B2 (en) 2007-03-13 2008-12-16 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. BiCMOS performance enhancement by mechanical uniaxial strain and methods of manufacture
LT2520590T (lt) 2007-04-03 2018-09-10 Amgen Research (Munich) Gmbh Susijusioms rūšims specifinis rišantis domenas
NZ581395A (en) 2007-05-14 2012-08-31 Biogen Idec Inc Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
US8209741B2 (en) 2007-09-17 2012-06-26 Microsoft Corporation Human performance in human interactive proofs using partial credit
US8464584B2 (en) 2007-10-19 2013-06-18 Food Equipment Technologies Company, Inc. Beverage dispenser with level measuring apparatus and display
DE112008003168B4 (de) 2007-11-29 2022-01-05 Schaeffler Technologies AG & Co. KG Kraftübertragungsvorrichtung, insbesondere zur Leistungsübertragung zwischen einer Antriebsmaschine und einem Abtrieb
US8376279B2 (en) 2008-01-23 2013-02-19 Aurora Flight Sciences Corporation Inflatable folding wings for a very high altitude aircraft
WO2009127691A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
AU2009299794B2 (en) 2008-10-01 2015-08-13 Amgen Research (Munich) Gmbh Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
DK2356270T3 (da) 2008-11-07 2016-12-12 Fabrus Llc Kombinatoriske antistofbiblioteker og anvendelser deraf
MY152352A (en) 2009-03-04 2014-09-15 Nissan Motor Exhaust gas purifying catalyst and method for manufacturing the same
US8463191B2 (en) 2009-04-02 2013-06-11 Qualcomm Incorporated Beamforming options with partial channel knowledge
CN105567699A (zh) 2009-10-30 2016-05-11 诺维信生物制药丹麦公司 白蛋白变体
AU2010315101B2 (en) 2009-11-04 2016-01-28 Fabrus Llc Methods for affinity maturation-based antibody optimization
WO2011071541A2 (en) 2009-12-11 2011-06-16 The Scripps Research Institute Cadherin modulatory agents
JP2014015396A (ja) 2010-10-29 2014-01-30 Perseus Proteomics Inc 高い親和性を有する抗ｃｄｈ３抗体
WO2012059486A1 (en) 2010-11-01 2012-05-10 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
WO2012089373A1 (de) 2010-12-30 2012-07-05 C. Rob. Hammerstein Gmbh & Co. Kg Längsverstellvorrichtung eines kraftfahrzeugsitzes mit zwei schienenpaaren
EP2699598B1 (en) * 2011-04-19 2019-03-06 Pfizer Inc Combinations of anti-4-1bb antibodies and adcc-inducing antibodies for the treatment of cancer
US8822417B2 (en) 2011-05-05 2014-09-02 Novozymes Biopharma DIC A/S Albumin variants
US9127061B2 (en) 2011-06-24 2015-09-08 Perseus Proteomics Inc. Anti-human P-cadherin (CDH3) recombinant antibody
CN103748114B (zh) 2011-08-23 2017-07-21 罗切格利卡特公司 T细胞活化性双特异性抗原结合分子
US20130078250A1 (en) 2011-08-23 2013-03-28 Oliver Ast Bispecific t cell activating antigen binding molecules
WO2013075066A2 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Eleven Biotherapeutics, Inc. Proteins with improved half-life and other properties
BR112014018679A2 (pt) 2012-03-16 2017-07-04 Novozymes Biopharma Dk As variantes de albumina
MX2015005363A (es) 2012-11-08 2015-11-06 Novozymes Biopharma Dk As Variantes de albumina.
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
US20140308285A1 (en) 2013-03-15 2014-10-16 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies
EP3424952A1 (en) 2013-03-15 2019-01-09 Amgen, Inc Heterodimeric bispecific antibodies
JP6071725B2 (ja) 2013-04-23 2017-02-01 カルソニックカンセイ株式会社 電気自動車の駆動力制御装置
EP3733710A1 (en) 2013-09-25 2020-11-04 Amgen, Inc Hetrodimeric v-c-fc-v-c antibody
WO2015114751A1 (ja) * 2014-01-29 2015-08-06 日本精工株式会社 電動パワーステアリング装置
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof
US10105142B2 (en) 2014-09-18 2018-10-23 Ethicon Llc Surgical stapler with plurality of cutting elements
US11147886B2 (en) 2015-07-15 2021-10-19 Zymeworks Inc. Drug-conjugated bi-specific antigen-binding constructs
US11284893B2 (en) 2019-04-02 2022-03-29 Covidien Lp Stapling device with articulating tool assembly

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008124858A2 (en) * 2007-04-11 2008-10-23 F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges. M.B.H. Targeted receptor
CN102137929A (zh) * 2008-06-30 2011-07-27 肿瘤疗法科学股份有限公司 用放射性同位素标记物标记的抗cdh3抗体及其用途
CN102753579A (zh) * 2009-05-01 2012-10-24 国立大学法人东京大学 抗钙粘着蛋白抗体
CN102781964A (zh) * 2009-12-28 2012-11-14 肿瘤疗法科学股份有限公司 抗cdh3抗体及其用途
CN106661119A (zh) * 2014-07-01 2017-05-10 辉瑞公司 双特异性异二聚化双抗体及其用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
姚新生等: "抗CD3/抗肿瘤抗原双特异性抗体介导T淋巴细胞抗肿瘤效应与机制研究进展", 《中国肿瘤生物治疗杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110582297A (zh) * 2017-02-02 2019-12-17 安进研究(慕尼黑)有限责任公司 包含T细胞接合抗体构建体的低pH药物组合物

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