CN114786720A - TriAx抗体的组合物及其制备和使用方法 - Google Patents

TriAx抗体的组合物及其制备和使用方法 Download PDF

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Abstract

一种具有N‑端和C‑端的多特异性抗体，其包括第一单体、第二单体和至少第一结合结构域，该第一单体包括从N‑端至C‑端的VL结构域、第一接头和第一Fc结构域，该第二单体包括从N‑端至C‑端的VH结构域、第二接头和第二Fc结构域，以及该第一结合结构域连接至多特异性抗体的N‑端或C‑端，其中该第一单体和该第二单体通过VL结构域与VH结构域之间的相互作用配对，并且其中该多特异性抗体通过第一接头与第二接头之间的二硫键稳定。

Description

TriAx抗体的组合物及其制备和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求根据35 U.S.C.119(e)于2019年12月5日提交的美国临时申请序列号62/944,230的申请日的权益，其全部公开内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及癌症免疫疗法的技术领域，并且更具体地涉及具有多种抗原结合特异性的经修饰的抗体的组合物。
背景技术
除非本文另有说明，否则本部分中描述的材料不是本申请中权利要求的现有技术，并且不通过包括在本部分中而被承认是现有技术。
尽管最近在药物发现和临床影像方面取得了进展，但癌症仍然是人类最致命的疾病中的一个。我们对肿瘤如何开始、如何在应激下存活、定居/转移至远处器官和部位，以及如何变得对药物有抗性的理解仍然有限。美国癌症协会估计2014年美国新的癌症病例为160万，对于大多数主要类型的癌症没有被批准的治愈性治疗。
胃肠(GI)癌(结肠直肠癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、胆管癌和肝癌)是全世界发病率和死亡率的主要原因。仅结肠直肠癌(CRC)代表所有癌症诊断的大约10％，并且是全世界癌症死亡的第二主要原因。在中国，肝癌和胃癌是全世界最致命的恶性肿瘤之一，并且超过一半的发病率被诊断，导致全球每年>142万人死亡，这被认为可归因于病毒/细菌地方病(乙型肝炎病毒[HBV]和幽门螺杆菌感染)、化学中毒、环境污染和食品污染。没有有效的治疗方法。因此，针对这些侵袭性癌症的潜在药物开发需要新的生物标志物和治疗靶点。经证实能消除或抑制这些癌症生长的分子靶向剂将具有重要的临床价值和显著的市场影响。如果疾病在早期被诊断，这些肿瘤可以通过手术有效切除。不幸并且非常常见的是，大多数GI癌症是无症状的并且当在临床中出现时在非常晚期阶段被检测到。在没有有效治疗的情况下，这些患者在诊断后不久死亡或在挽救治疗后复发。
CDH17是显著的癌症生物标志物，其特征在于其在肝癌和胃癌两者中的过表达，但不是来自健康成人的正常组织。抗CDH17单克隆抗体显示了对肝和胃肿瘤细胞的生长抑制作用。CDH17在转移癌中高表达，并且阻断CDH17表达和功能可以明显降低肝细胞癌(HCC)的肺转移。这些观察指示人源化抗CDH17抗体可以被开发为用于治疗具有肿瘤组织和/或血清样品中CDH17生物标志物的适应症的癌症患者的靶点治疗剂。尽管抗体药物缀合物作为抗体疗法是有希望的，但多特异性抗体治疗剂利用对癌症的免疫应答并且激活T细胞介导的对癌细胞的细胞毒性。
靶点CD3阳性T细胞和CD19阳性B细胞的双特异性抗体被证明可有效治疗血液恶性肿瘤(Labrijn 2019,Yu 2017,Suurs 2019,和Bates 2019)。然而，靶向实体瘤的尝试示出了有限的成功，可能是由于缺乏进入实体瘤细胞和合适的免疫调节信号。需要用于有效靶向多种肿瘤抗原和免疫细胞抗原或产物的基于抗体的支架，以生成更有效的免疫治疗剂，其更好地解决促肿瘤微环境和肿瘤逃逸机制的复杂性。
发明内容
在一方面，本申请提供多特异性抗体。抗体可以是双特异性、三特异性、四特异性的或五特异性的。抗体可以具有截断的结构。
在一个实施例中，本申请提供了具有N-端和C-端的多特异性抗体，其包括第一单体、第二单体和至少第一结合结构域，该第一单体包括从N-端至C-端的VL结构域、第一接头和第一Fc结构域，该第二单体包括从N-端至C-端的VH结构域、第二接头和第二Fc结构域，以及该第一结合结构域连接至多特异性抗体的N-端或C-端，其中第一单体和第二单体通过VL结构域与VH结构域之间的相互作用配对，并且其中多特异性抗体通过第一接头与第二接头之间的二硫键稳定。
在一个实施例中，第一结合结构域连接至N-端处的VH结构域、N-端处的VL结构域、C-端处的第一Fc结构域，或C-端处的第二Fc结构域。
在一个实施例中，多特异性抗体进一步包括第二结合结构域，并且抗体是三特异性的。在一个实施例中，第一结合结构域连接至第一Fc结构域的C-端并且第二结合结构域连接至第二Fc结构域处的C-端。在一个实施例中，第一结合结构域连接至VH结构域处的N-端并且第二结合结构域连接至第一Fc结构域的C-端。
在一个实施例中，多特异性抗体进一步包括第二结合结构域，并且抗体是三特异性抗体。在一个实施例中，第一结合结构域和第二结合结构域连接至抗体的相对端。在一个实施例中，第一结合结构域和第二结合结构域连接至抗体的同一端。在一个实施例中，第一结合结构域连接至VH结构域处的N-端并且第二结合结构域连接至VL结构域处的N-端。
在一个实施例中，多特异性抗体进一步包括第三结合结构域，并且抗体是四特异性抗体。在一个实施例中，第一结合结构域连接至VH结构域处的N-端，第二结合结构域连接至VL结构域处的N-端，并且第三结合结构域连接至第一Fc结构域处的C-端或第二Fc结构域处的C-端。
在一个实施例中，上述多特异性抗体进一步包括第四结合结构域，并且该抗体是五特异性的。在一个实施例中，第三结合结构域连接至第一Fc结构域处的C-端，并且第四结合结构域连接至第二Fc结构域处的C-端。
所有结合结构域可以具有对不同抗原的结合亲和力。可替代地，某些结合结构域可以具有与另一个结合结构域对相同抗原的结合亲和力。在一个实施例中，第一结合和第二结合是相同的。在一个实施例中，第一结合和第二结合是不同的。在一个实施例中，第一结合结构域、第二结合结构域和第三结合结构域彼此不同。在一个实施例中，第一结合结构域、第二结合结构域和第三结合结构域彼此不同，并且其中第四结合结构域与第一结合结构域、第二结合结构域和第三结合结构域中的一个相同。
每个第一结合结构域可以独立地选自由scFv结构域、配体、单结构域纳米抗体、天然蛋白的结合区、趋化因子和细胞因子组成的组。
在一个实施例中，双特异性抗体可以具有包括与SEQ ID NO.1具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第一单体，以及包括与SEQ ID NO.2具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第二单体。
在一个实施例中，双特异性抗体可以具有包括与SEQ ID NO.1具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第一单体，以及包括与SEQ ID NO.3具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第二单体。在一个实施例中，双特异性抗体可以具有包括与SEQ ID NO.1具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第一单体，以及包括与SEQ ID NO.4具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第二单体。在一个实施例中，双特异性抗体可以具有包括与SEQ IDNO.5具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第一单体，以及包括与SEQ ID NO.6具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第二单体。
在一个实施例中，三特异性抗体可以具有包括与SEQ ID NO.7具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第一单体，以及包括与SEQ ID NO.8具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第二单体c。在一个实施例中，三特异性抗体可以具有包括与SEQ ID NO.9具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第一单体，以及包括与SEQ ID NO.10具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第二单体。在一个实施例中，三特异性抗体可以具有包括与SEQID NO.11具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第一单体，以及包括与SEQ ID NO.2具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第二单体。在一个实施例中，三特异性抗体可以具有包括与SEQ ID NO.12具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第一单体，以及包括与SEQ ID NO.4具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第二单体。在一个实施例中，三特异性抗体可以具有包括与SEQ ID NO.12具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第一单体，以及包括与SEQ ID NO.2具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第二单体。
在一个实施例中，三特异性抗体可以具有包括与SEQ ID NO.14具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第一单体，以及包括与SEQ ID NO.15具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第二单体。
在一个实施例中，三特异性抗体可以具有包括与SEQ ID NO.14具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第一单体，以及包括与SEQ ID NO.16具有至少98％序列同一性的氨基酸序列的第二单体。
在一个实施例中，结合结构域可以通过接头与多特异性抗体附接。在一个实施例中，接头包括富含脯氨酸的氨基酸序列。在一个实施例中，接头可以包括至少20％、30％或50％的脯氨酸残基。在一个实施例中，接头可以包括约2至约31个氨基酸。
在另一方面，本申请提供了编码如其所公开的多特异性抗体的分离的核酸序列。
在又一方面，本申请提供了包括如其所公开的分离的核酸序列的表达载体。
在又一方面，本申请提供了包括如其所公开的分离的核酸序列的宿主细胞。
在又一方面，本申请提供了用于产生如其所公开的多特异性抗体的方法。在一个实施例中，该方法包括培养宿主细胞使得表达编码多特异性抗体的DNA序列，和纯化所述多特异性抗体的步骤。
在又一方面，本申请提供了制备多特异性抗体的方法。在一个实施例中，该方法包括在产生所述多特异性抗体的条件下培养宿主细胞和回收所述抗体的步骤。
在又一方面，本申请提供了免疫缀合物。在一个实施例中，免疫缀合物包括多特异性抗体和细胞毒性剂。在一个实施例中，免疫缀合物包括多特异性抗体和成像剂。
在又一方面，本申请提供了药物组合物。在一个实施例中，药物组合物包括多特异性抗体和药学上可接受的载体。在一个实施例中，药物组合物可以进一步包括放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗剂、化疗剂或其组合。在一个实施例中，药物组合物可以包括如上所公开的免疫缀合物和药学上可接受的载体。
在又一方面，本申请提供了用于治疗或预防受试者中的癌症的方法。在一个实施例中，该方法包括向受试者施用包括本文中所公开的纯化的多特异性抗体的药物组合物的步骤。在一个实施例中，治疗患有癌症的受试者的方法包括向受试者施用有效量的本文中所公开的多特异性抗体的步骤。在一个实施例中，该方法可以进一步包括联合施用有效量的治疗剂。在一个实施例中，治疗剂包括抗体、化疗剂、酶或其组合。受试者可以是人。
在又一方面，本申请提供了包括有效浓度的本文中所公开的多特异性抗体的溶液，其中该溶液是受试者的血浆。
附图说明
现在可以参考附图描述根据本公开的实施例，其中相同的附图标记表示相同的元件。
图1描绘了三轴抗体的统称为TriAx的一类多特异性抗体的构型，包括但不限于TriAx-A、TriAx-C、TriAx-D、TriAx-E、TriAx-I和TriAx-J抗体；
图2示出了TriAx-A抗体的产生、异源二聚化和纯化；
图3示出了TriAx-C抗体的产生和结合特异性；
图4示出了TriAx抗体的热稳定性；
图5示出了通过TriAx-A抗体靶向TROP2的重定向T细胞细胞毒性；
图6示出了通过TriAx-A抗体靶向FAP的重定向T细胞细胞毒性；
图7描绘了具有氨基酸取代的低亲和力抗CD3结合结构域；
图8示出了含有L4的TriAx-A显示降低的T细胞亲和力和活化；
图9示出了含有L4的TriAx-A介导与没有L4突变的TriAx-A相当的细胞毒性；
图10展示了通过TriAx-E抗体的T细胞细胞毒性结合特异性和重定向T细胞细胞毒性；
图11描绘了额外的结合结构域对TriAx核心功能(诸如抗CD3结合亲和力)的空间效应；
图12描绘了TriAx抗体中的稳定化的scFv(LocV)结合结构域；以及
图13描述了TriAx抗体中稳定的低抗原性接头。
具体实施方式
在下面的具体实施方式中，参考形成本文一部分的附图。在附图中，类似的符号通常表示类似的部件，除非上下文另有规定。在具体实施方式、附图和权利要求中描述的说明性实施例并不意味着限制。可以利用其它实施例，并且可以在不脱离本文中所呈现的主题的精神或范围的情况下作出其它改变。将容易理解，如本文中大体描述和附图中所绘示的，本公开的各方面可以以多种不同的构型来排列、取代、组合、分离和设计，所有这些构造都是本文明确设想的。
为了使免疫治疗剂能够更有效地治疗癌症，尤其是实体瘤，组合治疗剂是极为重要的，其结合了超过典型双特异性抗体的多种靶点特异性和/或作用机制。基本上是如本文中所描述的组合治疗的治疗剂对于有效治疗癌症和更频繁地实现完全和持久的反应是必需的。具体地，需要具有某些特性的支架，以创造相对于被批准的双特异性抗体具有有利的作用机制、制造、药代动力学和低抗原特性的组合治疗剂。基于全抗体的许多双特异性抗体可以具有相对于本文所描述的三特异性抗体更大的质量。尽管基于抗体片段具有较小质量的抗体可能具有较大的肿瘤渗透，但它们通常具有相对较差的药代动力学特性，诸如FDA批准的不具有Fc区的双特异性抗体Blincyto。此外，许多双特异性抗体基于knob-into-hole在Ig结构的恒定结构域内具有突变，这可能有助于抗药物抗体(ADA)应答。在本文中，在此描述为三轴或TriAx抗体的一组经修饰的抗体不需要在任何恒定结构域中的突变，但具有多种抗原结合特异性。
所有形式的TriAx抗体均含有特征性核心结构，该核心结构包括限定第一抗原结合特异性的单对VH和VL(Fv)，同时还正确地驱动两个含Fc的单体的异源二聚化。通过在Fv区的C-端形成多个二硫键来稳定该核心结构。最低限度地，第三接头(“三轴”核心)用于添加至少一个额外的抗原结合区，诸如scFv。可以为第二scFv添加第二接头，并且以此类推以增加肿瘤细胞结合特异性或调节免疫应答。这些“TriAx”抗体可以进一步用工程化的富含脯氨酸的刚性肽接头修饰以定位结合结构域用于最佳配体结合。TriAx抗体可以完全由人、人源化和低抗原性接头序列组成，以降低ADA应答的风险。
TriAx抗体被设计为结合两种或更多种效应细胞受体以诱导两种或更多种抗肿瘤活性机制，例如T或NK介导的细胞毒性(CD3、NKG2D)、肿瘤细胞吞噬作用(FcR、CR3、CR4、AXL、CD13、CD206)或细胞凋亡(DR5，即死亡受体5)、免疫细胞刺激(CD40、OX40)、免疫检查点抑制(PD-L1、TIGIT、PD1、CTLA4)或肿瘤相关巨噬细胞(TAM)从免疫抑制向炎性表型的转变(CD206、TREM-2)。
如图1所示，TriAx平台允许生成TriAx-A、TriAx-C、TriAx-D、TriAx-E、TriAx-I和TriAx-J抗体。多特异性抗体，即双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体和五特异性抗体可以根据这些形式生成。TriAx抗体核心的特征在于在不存在CH1的情况下直接连接至Fc结构域的成对的VL和VH的Fv区，并且该核心可以通过经由二硫桥(Ig铰链或其它接头)配对两个不对称单体，即LC和HC单体，来形成和稳定(表1)。该Fv-Fc核心具有至少一个连接至结合至靶抗原/配体的抗原结合结构域的额外接头。TriAx-A是双特异性抗体形式，其中添加一个共价连接至VH的N-端的scFv结构域。TriAx-C是三特异性抗体形式，其中添加一个共价连接至VH的N-端的scFv结构域和共价连接至CH3结构域的C-端的第二scFv结构域。TriAx-D是三特异性抗体形式，其中在其C-端处添加两个不同的scFv结构域。TriAx-E是三特异性抗体形式，其中在其N-端处添加两个不同的scFv结构域并且分别连接至VL和VH。TriAx-I是四特异性抗体形式，其中将第三scFv结构域添加至Trix-E的C-端；并且TriAx-J是五特异性抗体形式，其中将第四scFv结构域添加至Trix-I的C-端。其它多特异性抗体形式不具有指导和共价稳定该多特异性异二聚体形式的TriAx核心结构，包括BiTE、DART-Fc、IgG-scFv、TandAb、DVD-Ig、CrossMab、Duobody、Fab-scFv-Fc、ADAPTIR、ImmTac、TriKE、scFv-scFv-scFv、CODV-Ig、Two-in-one、Tandem-scFv-Fc、scFv-Fc knobs-Into-holes、F(ab')2和scDiabody-Fc(Labrijn 2019,Yu2017,Suurs 2019,和Bates 2019)。在上下文中，下面的实例说明了不仅可以产生TriAx抗体，而且按照设计的效率和稳定性发挥作用。这些TriAx抗体的产生表明正确形成的异二聚体相对于其它经修饰的抗体，诸如如knob-into-hole抗体类型，的百分比更高。
本文中使用的术语“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”被定义为意指“一个或多个”并且包括复数，除非上下文不合适。
术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体地涵盖单一单克隆抗体(包括激动剂和拮抗剂抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物，以及抗体片段，诸如Fab、F(ab')2和Fv，只要它们表现出所需的生物活性。在一些实施例中，抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、多特异性抗体、多有效抗体、人抗体和人源化抗体。与已知抗原结合的活性抗体片段的实例包括Fab、F(ab')2、scFv和Fv片段，以及Fab免疫球蛋白表达文库的产物和上述任何抗体和片段的表位结合片段。在一些实施例中，抗体可以包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性地结合至抗原的结合位点的分子。免疫球蛋白可以是免疫球蛋白分子的任何类型(IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)或类别(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类。在一个实施例中，抗体可以是全抗体和衍生自全抗体的任何抗原结合片段。典型的抗体是指通常包括两条重(H)链和两条轻(L)链的异四聚体蛋白。每条重链由重链可变结构域(缩写为VH)和重链恒定结构域组成。每条轻链部分由轻链部分可变结构域(缩写为VL)和轻链部分恒定结构域组成。VH和VL区可以进一步细分为高变互补决定区(CDR)的结构域和称为构架区(FR)的更保守的区。每个可变结构域(VH或VL)通常由三个CDR和四个FR组成，按以下顺序排列：从氨基端到羧基端的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在重链和轻链的可变区内存在与抗原相互作用的结合区。
本文中所使用的术语“多特异性”抗体表示具有至少两个结合位点的抗体各自对抗原的表位具有结合亲和力。本文中所使用的术语“双特异性、三特异性、四特异性或五特异性”抗体表示具有两个、三个、四个、五个或六个抗原结合位点的抗体。
术语“人源化抗体”抗体是指其具有衍生自非人供体免疫球蛋白的CDR的工程抗体类型，分子的其余免疫球蛋白衍生部分衍生自一种(或多种)人免疫球蛋白。此外，可以改变框架支持残基以保持结合亲和力。获得“人源化抗体”的方法是本领域技术人员熟知的(参见Queen等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl Acad Sci USA)》，1989；Hodgson等人，《生物/技术(Bio/Technology)》，1991)。在一个实施例中，“人源化抗体”可以通过遗传工程方法获得，该方法能够在大动物诸如例如兔中产生亲和力成熟的人样多克隆抗体(参见美国专利号7,129,084)。
术语“抗原”是指可以在有机体，特别是动物，更特别是包括人的哺乳动物中诱导免疫应答的实体或其片段。该术语包括免疫原及其负责抗原性或抗原决定簇的区。
术语“表位”，也称为“抗原决定簇”，是被免疫系统，特别是抗体、B细胞或T细胞识别的抗原部分，并且是结合至抗体的抗原的特异性部分。
术语“免疫原性”是指在人或动物中引发或增强针对免疫原性剂的抗体、T细胞或其它反应性免疫细胞的产生并且有助于免疫应答的物质。当个体产生足够的针对所施用的本申请的免疫原性组合物的抗体、T细胞和其它反应性免疫细胞以缓和或减轻待治疗的病症时，发生免疫应答。
本文中所使用的术语“肿瘤抗原”是指在肿瘤细胞中产生的抗原分子。肿瘤抗原可以在宿主中引发免疫应答。在一个实施例中，肿瘤细胞表达肿瘤抗原，包括但不限于肿瘤特异性抗原(TSA)、新抗原和肿瘤相关抗原(TAA)。
本文中所使用的术语“特异性结合至”或“特异性地结合至”或“特异性针对”特定抗原或表位是指可测量地不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可以通过确定与对照分子的结合相比的分子的结合来测量，该对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。特异性结合可以通过与类似于靶点的对照分子比较来确定。对于特定抗原或表位的特异性结合可以通过具有至少约10-4M，至少约10-5M，至少约10-6M，至少约10-7M，至少约10- 8M，至少约10-9，可替代地至少约10-10M，至少约10-11M，至少约10-12M或更大的抗原或表位的KD的抗体来表现，其中KD是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。在一些实施例中，特异性地结合至抗原的多特异性抗体对于对照分子将具有相对于抗原或表位大20-、50-、100-、500-、1000-、5,000-、10,000-或更多倍的KD。此外，相对于对照，抗原或表位的KA或Ka比表位大至少20-、50-、100-、500-、1000-、5,000-、10,000-或更多倍的抗体可以表现出对特定抗原或表位的特异性结合，其中KA或Ka是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率。
实例
参考以下实例进一步描述本公开。提供这些实例仅用于说明的目的，并且不旨在限制，除非另有说明。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修饰以产生基本相同或类似结果的各种非关键参数。
实例1、TriAx抗体的特性特征
TriAx抗体是异二聚体，其特征在于从N-到C-端包括Fv区、经修饰的Ig铰链和IgFc区的Fv-Fc核心结构，如图1所示。额外的结合结构域可以是scFv、scFab、Fab、单结构域VH或天然蛋白片段。
TriAx核心组分包括将Fv的VH和VL链共价连接至CH2-CH3单体的两个接头(例如，融合至截短的Ig铰链的富含甘氨酸的接头)。这种富含甘氨酸的柔性接头与Ig铰链可以促进有效的VH-VL配对。TriAx结合结构域可以通过柔性富含甘氨酸的接头(诸如PAGGGGS)或更刚性的富含脯氨酸的接头(诸如PAGPPP)附接。接头的长度通常为4至7个残基。TriAx Fc可以由具有S228P取代的IgG1铰链或IgG4铰链组成。IgG1铰链的前7个N-端氨基酸EPKSCDK可以用富含甘氨酸的接头诸如GAPGGGG或PAGGGGS替代。在位置234和235的铰链残基(G1编号)可以是LL、FL或AA以调节FcR结合的程度(Saunders 2019)。CH2和CH3结构域可以都是IgG1或IgG4或组合，诸如G1 CH2和G4 CH3。TriAx分子可以具有取代的CH3，以产生knob-into-hole(Merchant 1998)。
构建在中心TriAx Fv-Fc核心结构上，TriAx-A是具有连接至Fv的VH或VL的单个scFv的二价抗体形式，诸如h10Ta、h5Ta、h8Ta和hB2Ta抗体，其结构特征列于表1中。TriAx-C是三价抗体形式，其中将一个scFv添加至VH或VL的N-端，将第二scFv或蛋白结合结构域添加至CH2-CH3单体的C-端，诸如hC3dh10Tc抗体，其结构特征列于表1中。TriAx-D是具有连接至Fv-Fc核心的每个CH3的C-端的scFv的三价抗体，诸如h8C3dTa抗体，其结构特征列于表1中。TriAx-E是三价抗体形式，其中两个scFv分别连接至Fv-Fc核心的VH和VL。诸如h10Te、h8Te和h8h10Te的TriAx-E抗体的实例的结构特征和序列ID列于表1中。TriAx-I是四价抗体形式，其中在每个VH和VL的N-端处添加一个scFv，加上在任一CH2-CH3单体的C-端处添加一个scFv。TriAx-J是五价形式，其中在每个VH和VL的N-端和每个CH2-CH3单体的C-端处添加一个scFv。
实例2、TriAx-A抗体
h8Ta是靶向TROP2和CD3(SEQ ID NO.1和4，同样参见表1)的TriAx-A双特异性抗体。TROP2是跨膜糖蛋白，其在所有癌症类型中都不依赖于TROP2表达的基线水平而失调。TROP2是靶向治疗剂的理想候选物。早期临床试验中的几种靶向TROP2的抗体治疗剂已经证明了治疗三阴性乳腺癌、铂抗性尿路上皮癌和小细胞肺癌的安全性和临床益处。
通过PEI共转染重(核心Fv VH)和轻(核心Fv Vk)链的质粒，在HEK293细胞中产生h8Ta。转染后第3天，对培养基样品进行SDS-PAGE，如图2所示；转染的细胞培养基(泳道1和2)、模拟转染的培养基(泳道3)。一步的蛋白-A纯化后，h8Ta抗体在非还原和还原条件下进行SDS-PAGE，分别如图2泳道4和5所示。在非还原条件下，该TriAx-A抗体以与其计算的异二聚体大小一致的～116kDa蛋白质迁移。在还原条件下，重链为～70kDa，并且轻链为～44kDa，与其计算的大小一致。异源二聚化的效率为大约90％或更高。与模拟对照培养基相比，未检测到其它显著的TriAx产物或片段。这些TriAx-A可以具有不同长度和组成的接头和Fc序列以修饰FcR结合和循环半衰期。
实例3、TriAx-C抗体
生成了两种对吞噬细胞受体CR3具有结合特异性的TriAx-C抗体。h10Cd3Tc是靶向CDH17、CR3和CD3的TriAx-C三特异性抗体(SEQ ID NO.7和8)。h8C3dTd是靶向TROP2、CR3和CD3的TriAx-D三特异性抗体(SEQID 9和10)。TROP2和CDH17都是显著的癌症生物标志物，其特征在于它们在包括胃、结肠、胰腺、肝和肝脏的各种形式的实体瘤中的过表达。CDH17在转移癌中高表达，并且阻断CDH17表达和功能可以明显降低肝细胞癌(HCC)的肺转移。抗CDH17单克隆抗体和抗CDH17/CD3双特异性抗体均显示对肝脏和胃肿瘤细胞的生长抑制作用(参见本申请人的申请WO/2019/222428，其全文并入本文)。CR3或补体受体3是α(CD11b)和β(CD18)跨膜糖蛋白的异二聚体。含有α整联蛋白的I-结构域与β2链(ITGB2)结合形成称为巨噬细胞受体1(‘Mac-1’)或灭活的C3b(iC3b)受体3的白细胞特异性整联蛋白。在调理过程期间，C3d沉积在靶细胞表面，在那里它作为巨噬细胞CR3配体用于吞噬作用。经由其配体诸如C3d或活化抗体结合至CR3，可以将主要吞噬细胞受体导向肿瘤细胞并且广泛诱导肿瘤细胞吞噬作用和促炎巨噬细胞极化。在上下文中，TriAx-C抗体，诸如h8C3dTd和h10C3dTc，可以结合肿瘤细胞上的TROP2、CDH17或二者，然后其呈递C3d用于巨噬细胞CR3依赖性吞噬作用。TriAx-C抗体还可以结合FcR，其可以进一步激活和增强巨噬细胞CR3肿瘤细胞吞噬作用。这些TriAx-C抗体可以广泛地靶向不同的肿瘤类型，相对于靶向CD47或CD24吞噬细胞检查点能够实现更大的效力和安全性。
除了抗CD3 Fv和抗CDH17 scFv结构域之外，h10Cd3Tc包括C3d作为CR3结合结构域。当在HEK293细胞中表达时，将h10Cd3Tc的重链(核心Fv Vh)和轻链(核心Fv Vk)以1:1、4:1、6:1和12:1(Vh:Vk)的比例共转染。转染后3天，通过Octet(BLI)确定抗体表达水平。生产水平为104ug/ml(1:1)、27.3ug/ml(4:1)、22ug/ml(6:1)、21.7ug/ml(8:1)和14.6ug/ml(12:1)。对生产培养基样品进行SDS-PAGE。如图3A所示，h10C3dTc的分子量为大约180kDa，其稍大于～150kDa的计算重量。与模拟对照培养基相比，未检测到其它显著的TriAx产物或片段。由于h10Cd3Tc的重链和轻链单体具有类似大小，所以通过标准SDS-PAGE不能容易地区分同源二聚体的形成。当在ELISA中将浓度全部调节至5ug/ml以定量结合至固定的CR3 I结构域时，当质粒比例为6:1时，I-结构域结合达到峰值(图3B)。由于C3d结合至I结构域的亲和力(～400nM)低，ELISA中的OD值低。但峰结合比来自模拟转染的HEK293的对照培养基高大约7倍。在ELISA中确定h10C3dTc与CDH17和CD3的结合，其中样品抗体结合至可溶形式的CD3，然后固定CDH17，并且随后是结合至重组CD3的HRP缀合物。如图3C所示，4:1的质粒比导致峰结合，指示当质粒以一定比例共转染到HEK293细胞中时，可能发生最佳的异源二聚化。在ELISA中示出的结合活性指示可以产生三特异性TriAx-C抗体。这些TriAx-C抗体可以具有不同长度和组成的接头和Fc序列以修饰FcR结合和循环半衰期。
实例4、TriAx抗体的热稳定性
在热转移测定中使用SYPRO橙确定TriAx抗体的热稳定性(Kinget等人2011)。对诸如h8Ta(SEQ ID 1和4)、hB2Ta(SEQ ID 1和5)和hA12Ta(SEQ ID 1和6)(参见表1)的TriAx-A抗体进行分析。将这些PBS中的TriAx-A抗体在微量离心机中离心10分钟，并且将浓度调节至5uM。将TriAx-A(50ul)和SYPRO橙(1ul)的混合物(125X在PBS中；最终2.5X)转移至光学透明的96孔板中用于在qPCR仪器中进行测定。温度以每分钟1℃的速率从25℃增加至99℃，对于每次测量保持一分钟，其中在470nm处激发并且在586nm处发射。图4示出了在66℃(hB2Ta)、68℃(hA12Ta)和72℃(h8Ta)处的初始解折叠峰，其指示TriAx平台抗体对于进一步开发是足够稳定的。
实例5、靶向TROP2和CD3的TriAx-A抗体的重定向T细胞细胞毒性
为了评价TriAx平台抗体h8Ta的功能，评估TriAx-A双特异性抗体(参见实例2)的重定向T细胞细胞毒性。将三种表达荧光素酶的GI肿瘤细胞系DLD1(结肠直肠癌)、SW480(结肠直肠癌)和AGS(胃癌)用于24小时测定，其中E:T比为4。洗涤除去死细胞后，使用Bio-Glo(普洛麦格(Promega))和多模式平板读数器定量活细胞。如图5所示(上图)，在流式细胞荧光测定法分析(flow cytofluorimetry analysis)中使用h8Ta来检测TROP2在所有三种肿瘤细胞系中的表达(图5A、图5B和图5C)。在没有T细胞的情况下，细胞活性在h8Ta抗体的浓度范围内没有降低。在T细胞存在下，确定h8Ta抗体依赖性肿瘤细胞杀伤的EC50值：DLD为0.8pM，AGS为2pM，SW480为11pM(图5下图，图5D、图5E和图5F)。SW480的较低EC50值似乎与其TROP2表达的较低水平相关。因此，该双特异性TriAx-A抗体可以介导有效的亚pM肿瘤细胞杀伤。
实例6、靶向FAP和CD3的TriAx-A抗体的重定向T细胞细胞毒性
成纤维细胞活化蛋白α(FAP)是97kDa的II型细胞表面糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶家族。在结肠直肠癌(CRC)转移中，成纤维细胞活化蛋白-α(FAPα)起关键作用。据报道，在所检查的所有CRC样品中，FAPα在癌症相关成纤维细胞中表达，但在正常结肠、增生性息肉或腺瘤样品中不表达。
生成TriAx-A双特异性抗体hB2Ta(SEQ ID 5和6)以靶向CD3(经由Fv)和FAP(经由scFv)。为了确定其重定向T细胞细胞毒性活性，将FAP mRNA电穿孔到同样表达荧光素酶的DLD1细胞(DLD1-FAP)中。第二天，在有和没有扩增的T细胞(E:T为4)的情况下，开始进行微量滴定板细胞毒性测定。在与DLD1或DLD1-FAP的混合物中添加实验浓度范围的抗体后，将该测定孵育24小时，然后洗涤，添加Bio-Glo底物和测量荧光素酶活性的多模式平板读数器。如图6A所示，在存在T细胞和DLD1-FAP(EC50＝41pM)的情况下，h1B2Ta介导浓度依赖性肿瘤细胞细胞毒性，而在不存在表达FAP的肿瘤细胞或T细胞的情况下，此类细胞毒性未检测到或未经证实。在开始测定时通过流式细胞荧光测定法确定DLD1细胞中的FAP表达(图6B)。表达FAP的DLD1细胞的百分比为68％(MFI＝4,256)似乎与～70％的最大细胞毒性相关。因此，对FAP具有结合特异性的TriAx抗体有效地杀死具有低FAP表达的肿瘤细胞。
实例7、L4，低亲和力抗CD3结合结构域
为了降低肿瘤外T细胞信号传导和T细胞和淋巴组织沉降的风险，将低亲和力单价CD3结合区L4(SEQ ID 13)引入TriAx平台抗体中。UCHT1 Vh和Vk的CDR(Shalaby 1992)用人种系序列部分或完全替代以生成低亲和力和低抗原性抗CD3变体。用IGKV1-33*01种系序列取代Vk CDR1产生较低亲和力的突变体L4，其并入若干TriAx抗体的核心Fv中。因此，该抗CD3变体的氨基酸序列包括UCTH1CDR序列，除了CDRL1取代，R24Q和R30S，如图7所示。
实例8、由具有L4的TriAx抗体介导的T细胞亲和力和活化
为了评估它们对T细胞亲和力和活化的能力，通过流式细胞荧光测定法确定具有L4或其亲本Fv Vk CDR1(“wt”)的TriAx抗体，即h10Ta-L4(SEQ ID 1和2)和h10Ta-wt。在图8A所示的浓度范围内确定结合至外周血T细胞的抗体对T细胞的亲和力。绘制MFI并且使用GraphPad PRISM确定亲和力(EC50)。指示了三次独立的亲和力确定及其平均值。结果指示，相对于亲本Fv(60nM)，L4中经修饰的CDRL1(320nM)导致T细胞亲和力降低5倍。使用具有用于荧光素酶表达的NFAT诱导型启动子的T细胞系(Jurkat普洛麦格试剂盒NFAT J1621)确定T细胞信号传导。h10Ta抗体均接合CDH17(在DLD1上)和CD3。根据制造商的方案，在24小时使用所指示的抗体浓度范围和每微量滴定孔(96孔板)100×103的Jurkat报告细胞和30×103的DLD1细胞确定信号传导。使用多模式平板读数器测量荧光素酶表达/活性。如图8B所示，相对于具有亲本Fv的h10Ta-wt，h10Ta-L4的T细胞信号传导降低了2倍。对照不包括抗体或CD3、CD28、CD2激动剂(Immunocult；干细胞)以诱导最大刺激。
实例9、由具有L4的TriAx抗体介导的肿瘤细胞细胞毒性
确定h10Ta-L4和h10Ta-wt的重定向T细胞细胞毒性。此外，在试验中包括h10Ta-L4c，其通过携带Vk ACys43和Vh Q114C取代以产生稳定的域间二硫化物而衍生自h10Ta-L4。在24小时的测定中，在E:T比为4的情况下，在抗体浓度范围内确定表达结肠癌细胞系DLD1和胃癌细胞系AGS的荧光素酶的T细胞杀伤。洗涤除去死细胞后，使用Bio-Glo(普洛麦格(Promega))和多模式平板读数器定量活细胞。在T细胞存在下，杀伤DLD1的EC50对于h10Ta-wt是0.5pM，对于h10Ta-L4是0.4pM，对于h10Ta-L4c是1.2pM。AGS杀伤的EC50对于h10Ta-wt是1.4pM，对于h10Ta-L4是2pM，并且对于h10Ta-L4c是4.7pM。图9中呈现的这些结果证明，L4中对CD3的较低亲和力没有显著降低细胞毒活性，如在该测定中所确定的。关于具有L4c的TriAx抗体，结果指示相对于具有亲本L4的抗体，细胞毒活性略微降低，表明域间二硫化物可以通过改变参与CDH17结合的CDR残基位置而发挥负面位置效应。
实例10、TriAx-E抗体
h8h10Te(SEQ ID 12和2)是在抗CD3核心Fv的N-端包括抗TROP2(h8)和CDH17(h10)scFv结合结构域的TriAx-E三特异性抗体(表1)。通过流式细胞荧光测定法证明了h8h10Te抗体(具有亲本抗CD3 Fv)与所有三种抗原的结合。图10示出了h8h10Te与表达跨膜形式的CDH17或Trop2的HEK293转染子特异性地结合。h8h10Te也特异性地结合至表达CD3的Jurkat细胞。因此，可以生成TriAx-E三特异性抗体并且能够结合至所有3种靶抗原。图10中描述了TriAx-E函数。h8h10Te在使用E:T比为4的24小时细胞毒性测定中支持DLD1肿瘤细胞的有效重定向T细胞杀伤。
实例11、多特异性TriAx抗体的空间效应
当抗CD3结合结构域位于TriAx核心结构的Fv位置时，添加一个或多个结合结构域，诸如scFv结构域，可以影响抗体结合至细胞CD3的效力。在这方面，使用具有相同抗CD3Fv区(wt)的TriAx-A抗体h10Ta(SEQ ID 1和2)和TriAx-E抗体h10Te进行比较。使用5ug/ml的每种TriAx抗体通过流式细胞荧光测定法确定结合至CD3的活性。图11示出了相对于TriAx-A抗体的结合，TriAx-E抗体的结合降低大约2至6倍(中值荧光强度；MFI)。作为TriAx-E核心，结合至抗CD3 Fv的降低可能是空间抑制的结果。如同TriAx-E，连接至核心FvVh和Vk的scFv的TriAx形式，诸如TriAx-I和TriAx-J，也可以证明结合至CD3或其它核心Fv特异性的降低。相对于某些其它形式，施用这些TriAx抗体可以导致较少的T细胞或淋巴组织沉降和较多的肿瘤组织生物分布。因此，该结构可以提供更大的肿瘤微环境(TME)定位活性、更大的效力和安全性。然而，相对于TriAx-E或典型的全抗体，具有单个N-端scFv并且因此具有较小N-端质量的TriAx-A或TriAx-C形式可以能够更有效地结合至肿瘤抗原。
实例12、TriAx抗体中的稳定的scFv(LocV)
TriAx-A scFv特异性针对TROP2(h8v5和h8v6)或CDH17(h10v3)的稳定版本是通过对人源化版本h8v4和h10v2的框架残基进行反向突变，以增强Vh-Vk界面(h8v5、h8v6和h10v3)，并且通过在Vh结构域内用半胱氨酸取代两个残基来创造第二二硫键(h8v6)而生成的(Ewert 2004,McConnell 2012,Weatherill 2012)。如图12所示，这些人源化和人源化稳定的变体用Fc:G1G4G1(A和C)或Fc:G1G4(B和D)在HEK293细胞中表达。与CDH17和TROP2的结合(其通过标准PEI-转染在HEK293细胞中表达)通过流式细胞荧光测定法使用5ug/ml的每种TriAx确定。h8v4、v5和v6的结合水平(MFI)类似(A和B)。h10v2和v3的结合也类似(C和D)。数据指示生成的用于scFv稳定的取代没有显著的负面结构影响。相反，稳定的scFv(LocV)改善了TriAx抗体与肿瘤抗原的结合。
实例13、稳定的低抗原性接头
ARB202是具有IgG-scFv形式的特异性针对CDH17和CD3的双特异性抗体(参见申请人的申请WO/2019/222428，其全文并入本文)，用于比较3种富含脯氨酸的接头的稳定性：A＝PAGPPA、B＝PAGPAP以及C＝PAGPPP。接头从Fc的C-端延伸到抗CD3 scFv结构域的N-端。将双特异性抗体(1mg/ml)在37℃下在10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)中储存56天。在指示的时间点，通过UPLC分析样品的降解。如图13所示，相对于接头A(47.1％)和接头B(32.5％)，赋予接头C更大的稳定性(77.5％)。在结合和信号传导测定中，三种双特异性抗体的功能在第0天和14天后在37℃的血浆中相等。因此，接头C能够实现更大的稳定性而不降低功能。
实例14、TriAx-I和TriAx-J抗体
h8h10B2Ti(SEQ ID 14和15)是包括对肿瘤相关抗原、TROP2、CDH17和FAP(在癌症相关成纤维细胞或CAF上表达)的结合特异性的四特异性TriAx-I抗体的实例。该TriAx-I抗体还结合至CD3以触发表达TROP2、CDH17或二者的GI癌细胞的T细胞定向杀伤，使得可以降低由于肿瘤靶抗原表达丧失而导致肿瘤逃逸的可能性。通过结合至FAP，这种TriAx-I抗体也定向杀伤肿瘤相关的CAF。CAF可以是肿瘤微环境中的主要细胞类型，其通过促进细胞外基质重塑、血管生成和免疫抑制来支持肿瘤生长。
h8h10B2D5Tj(SEQ ID 14和16)是除了TROP2、CDH17、FAP、DR5和CD3之外还包括对DR5的结合特异性的五特异性TriAx-J抗体的实例，如TriAx-I抗体h8h10B2Ti中那样。DR5，也称为死亡受体5、TRAIL受体2和肿瘤坏死因子受体超家族成员10B，是TNF-受体超家族的细胞表面受体，其结合TRAIL并且介导细胞凋亡。在上下文中，h8h10B2D5Tj抗体获得h8h10B2Ti的功能并且通过参与GI癌细胞的DR5信号传导发挥诱导肿瘤细胞凋亡的额外能力。
上述说明和实例提供了对示范性实施例的结构和使用的完整描述。尽管上文已经以一定程度的特殊性或参考一个或多个单独的实施例描述了某些实施例，但是本领域的技术人员可以在不脱离本申请的范围的情况下对所公开的实施例做出多种改变。例如，虽然上述实例可以在某些位置包括结合结构域，但是它们仅通过比较而非限制的方式提供。因此，本申请的说明性实施例并不旨在限于所公开的特定实施例。相反，它们包括落入本公开范围内的所有修改和替换。此外，在适当的情况下，上文所描述的任何实例的方面可以与所描述的任何其它实例的方面组合以形成具有相当或不同特性并且解决相同或不同问题的其它实例。类似地，应理解，上文所描述的益处和优点可以涉及一个实施例或可以涉及若干实施例。
表1、TriAx平台抗体及其SEQ ID。
Figure BDA0003673525960000131
Figure BDA0003673525960000141
序列表
>序列ID 1:h10Ta、h5Ta、h8Ta和hA12Ta的LC单体
MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGAPGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>序列ID 2:h10Ta、h8h10Te和h10Te的HC单体
MEFGLSWVFLVALLRGVQCEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVAVIDSNGGSTYYPDTVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSSYTNLGAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISGYLNWLQQKPGKAIKRLIYTTSTLDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYASSPFTFGGGTKVEIKPAGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGAPGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>序列ID 3:h5Ta的HC单体
MAVLGLLFCLVTFPSCVLSQVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSAYAFSSSWMNWVQQAPGKGLEWIGRIYPRDGDTNYNGKFKGRVTLTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYFCAREGDGYYWYFDVWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSIRNYLHWYQQKPGQPPKLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSNSWPLTFGAGTKLELKPAGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGAPGGGTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>序列ID 4:h8Ta和h8Te的HC单体
MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIDNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAATNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHYYSNQLTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVANINSDGYNIYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRCSYYSYDYFDYWGQGTLVTVSSPAGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGAPGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>序列ID 5:hB2Ta的LC单体
MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYTMNWVRQAPGQGLEWMGVINPNHGISSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVRRKISYDYDEGYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQNLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLVFFAATRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIKPAGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGAPGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>序列ID 6:hB2Ta和hA12Ta的HC单体
MEFGLSWVFLVALLRGVQCEVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFKIQDAYIHWVQQAPGKGLEWMGRIDPANGNSKYDPKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRALDGYYVGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSNVNYMYWYQQKPGQAPRLLIYDTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPYTFGQGTKLEIKPAGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYTMNWVRQAPGQGLEWMGVINPNHGISSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVRRKISYDYDEGYAMDYWGQGTLVTVSSGAPGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>序列ID 7:hC3dh10Tc的LC单体
MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGAPGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKPAGGGGVDAERLKHLIVTPSGAGEQNMIGMTPTVIAVHYLDETEQWEKFGLEKRQGALELIKKGYTQQLAFRQPSSAFAAFVKRAPSTWLTAYVVKVFSLAVNLIAIDSQVLCGAVKWLILEKQKPDGVFQEDAPVIHQEMIGGLRNNNEKDMALTAFVLISLQEAKDICEEQVNSLPGSITKAGDFLEANYMNLQRSYTVAIAGYALAQMGRLKGPLLNKFLTTAKDKNRWEDPGKQLYNVEATSYALLALLQLKDFDFVPPVVRWLNEQRYYGGGYGSTQATFMVFQALAQYQKDAP
>序列ID 8:hC3dh10Tc的HC单体
MEFGLSWVFLVALLRGVQCEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVAVIDSNGGSTYYPDTVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSSYTNLGAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISGYLNWLQQKPGKAIKRLIYTTSTLDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYASSPFTFGGGTKVEIKPAGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGAPGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>序列ID 9:h8C3dTa的LC单体
MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIDNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAATNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHYYSNQLTFGQGTKLEIKGAPGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKPAGGGGVDAERLKHLIVTPSGAGEQNMIGMTPTVIAVHYLDETEQWEKFGLEKRQGALELIKKGYTQQLAFRQPSSAFAAFVKRAPSTWLTAYVVKVFSLAVNLIAIDSQVLCGAVKWLILEKQKPDGVFQEDAPVIHQEMIGGLRNNNEKDMALTAFVLISLQEAKDICEEQVNSLPGSITKAGDFLEANYMNLQRSYTVAIAGYALAQMGRLKGPLLNKFLTTAKDKNRWEDPGKQLYNVEATSYALLALLQLKDFDFVPPVVRWLNEQRYYGGGYGSTQATFMVFQALAQYQKDAP
>序列ID 10:h8C3dTa的HC单体
MEFGLSWVFLVALLRGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVANINSDGYNIYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRCSYYSYDYFDYWGQGTLVTVSSGAPGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKPAGGGGVDAERLKHLIVTPSGAGEQNMIGMTPTVIAVHYLDETEQWEKFGLEKRQGALELIKKGYTQQLAFRQPSSAFAAFVKRAPSTWLTAYVVKVFSLAVNLIAIDSQVLCGAVKWLILEKQKPDGVFQEDAPVIHQEMIGGLRNNNEKDMALTAFVLISLQEAKDICEEQVNSLPGSITKAGDFLEANYMNLQRSYTVAIAGYALAQMGRLKGPLLNKFLTTAKDKNRWEDPGKQLYNVEATSYALLALLQLKDFDFVPPVVRWLNEQRYYGGGYGSTQATFMVFQALAQYQKDAP
>序列ID 11:h10Te的LC单体
MEFGLSWVFLVALLRGVQCEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVAVIDSNGGSTYYPDTVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSSYTNLGAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISGYLNWLQQKPGKAIKRLIYTTSTLDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYASSPFTFGGGTKVEIKPAGGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGAPGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>序列ID 12:h8Te和h8h10Te的HL单体
MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIDNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAATNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHYYSNQLTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVANINSDGYNIYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRCSYYSYDYFDYWGQGTLVTVSSPAGGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGAPGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>序列ID 13:L4，具有R24Q和R30S的种系CDR-L1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIK
>序列ID 14:h8h10hB2Ti和h8h10hB2D5Ti的LC单体
MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIDNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAATNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHYYSNQLTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVANINSDGYNIYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRCSYYSYDYFDYWGQGTLVTVSSPAGGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGAPGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKPGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYTMNWVRQAPGQGLEWMGVINPNHGISSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVRRKISYDYDEGYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQNLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLVFFAATRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIK
>序列ID 15:h8h10hB2Ti的HC单体
MEFGLSWVFLVALLRGVQCEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVAVIDSNGGSTYYPDTVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSSYTNLGAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISGYLNWLQQKPGKAIKRLIYTTSTLDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYASSPFTFGGGTKVEIKPAGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGAPGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>序列ID 16:h8h10hB2D5Ti的HC单体
MEFGLSWVFLVALLRGVQCEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVAVIDSNGGSTYYPDTVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSSYTNLGAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISGYLNWLQQKPGKAIKRLIYTTSTLDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYASSPFTFGGGTKVEIKPAGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGAPGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKPGGGGSEVQLVQSGGGVERPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRVTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKILGAGRGWYFDLWGKGTTVTVSGGGGSGGGGSGGGGSSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHVVFGGGTKLTVL
>序列ID 17:
RASQDIRNY
序列表
<110> 艾贝乐公司
<120> TriAx抗体的组合物及其制备和使用方法
<130> A-R-T-I-9-0-6-PCT
<141> 2021-06-10
<150> 62944230
<151> 2019-12-05
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 358
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 1
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly Ser Ser Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn
100 105 110
Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
115 120 125
Ala Pro Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
130 135 140
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
145 150 155 160
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
165 170 175
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
180 185 190
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
195 200 205
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
210 215 220
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
225 230 235 240
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
245 250 255
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
260 265 270
Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
275 280 285
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
290 295 300
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys
305 310 315 320
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
325 330 335
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
340 345 350
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 2
<211> 618
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 2
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Val Ile Asp Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Thr Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Asn Leu Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
165 170 175
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820 825 830
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
835 840 845
Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
850 855 860
Ile Lys
865
<210> 15
<211> 618
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 15
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Val Ile Asp Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Thr Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Asn Leu Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
165 170 175
Gln Asp Ile Ser Gly Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys
180 185 190
Ala Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val
195 200 205
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln
225 230 235 240
Tyr Ala Ser Ser Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
245 250 255
Lys Pro Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
275 280 285
Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln
290 295 300
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys
305 310 315 320
Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser
325 330 335
Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
340 345 350
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly
355 360 365
Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
370 375 380
Val Ser Ser Gly Ala Pro Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
385 390 395 400
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
405 410 415
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
420 425 430
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
435 440 445
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
450 455 460
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
465 470 475 480
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
485 490 495
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
500 505 510
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
515 520 525
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
530 535 540
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
545 550 555 560
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
565 570 575
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
580 585 590
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
595 600 605
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
610 615
<210> 16
<211> 867
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 16
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Val Ile Asp Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Thr Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Asn Leu Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
165 170 175
Gln Asp Ile Ser Gly Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys
180 185 190
Ala Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val
195 200 205
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln
225 230 235 240
Tyr Ala Ser Ser Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
245 250 255
Lys Pro Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
275 280 285
Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln
290 295 300
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys
305 310 315 320
Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser
325 330 335
Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
340 345 350
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly
355 360 365
Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
370 375 380
Val Ser Ser Gly Ala Pro Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
385 390 395 400
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
405 410 415
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
420 425 430
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
435 440 445
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
450 455 460
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
465 470 475 480
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
580 585 590
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
595 600 605
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Pro Gly Gly Gly Gly Ser
610 615 620
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Glu Arg Pro Gly Gly
625 630 635 640
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
645 650 655
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
660 665 670
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
675 680 685
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
690 695 700
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
705 710 715 720
Ala Lys Ile Leu Gly Ala Gly Arg Gly Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
725 730 735
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740 745 750
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala
755 760 765
Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp
770 775 780
Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
785 790 795 800
Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile
805 810 815
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr
820 825 830
Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser
835 840 845
Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
850 855 860
Thr Val Leu
865
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 17
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
1 5

Claims (46)

1.一种具有N-端和C-端的多特异性抗体，其包括
第一单体，其包括从所述N-端至所述C-端的VL结构域、第一接头和第一Fc结构域，
第二单体，其包括从所述N-端至所述C-端的VH结构域、第二接头和第二Fc结构域，以及
至少第一结合结构域，其连接至所述多特异性抗体的所述N-端或所述C-端，
其中所述第一单体和所述第二单体通过所述VL结构域与所述VH结构域之间的相互作用配对，并且
其中所述多特异性抗体通过所述第一接头与所述第二接头之间的二硫键稳定。
2.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述第一结合结构域连接至所述N-端处的所述VH结构域、所述N-端处的所述VL结构域、所述C-端处的所述第一Fc结构域，或所述C-端处的所述第二Fc结构域。
3.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其进一步包括至少第二结合结构域，其中所述第一结合结构域和所述第二结合结构域连接至所述多特异性抗体的相对端。
4.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其进一步包括第二结合结构域，其中所述第一结合结构域和所述第二结合结构域连接至所述多特异性抗体的同一端。
5.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其进一步包括第二结合结构域，其中第一结合结构域连接至所述VH结构域处的所述N-端，并且所述第二结合结构域连接至所述VL结构域处的所述N-端。
6.根据权利要求5所述的多特异性抗体，其进一步包括第三结合结构域，其中所述第一结合结构域连接至所述第一Fc结构域处的所述C-端或所述第二Fc结构域处的所述C-端。
7.根据权利要求5所述的多特异性抗体，其进一步包括第三结合结构域和第四结合结构域，其中所述第三结合结构域连接至所述第一Fc结构域处的所述C-端，并且所述第四结合结构域连接至所述第二Fc结构域处的所述C-端。
8.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其进一步包括第二结合结构域，其中第一结合结构域连接至所述第一Fc结构域的所述C-端，并且所述第二结合结构域连接至所述第二Fc结构域处的所述C-端。
9.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其进一步包括第二结合结构域，其中第一结合结构域连接至所述VH结构域处的所述N-端，并且所述第二结合结构域连接至所述第一Fc结构域的所述C-端。
10.根据权利要求3至5或8至9中的一项所述的多特异性抗体，其中所述第一结合和所述第二结合是相同的。
11.根据权利要求3至5或8至9中的一项所述的多特异性抗体，其中所述第一结合和所述第二结合是不同的。
12.根据权利要求7所述的多特异性抗体，其中所述第一结合结构域、所述第二结合结构域和所述第三结合结构域彼此不同。
13.根据权利要求8所述的多特异性抗体，其中所述第一结合结构域、所述第二结合结构域和所述第三结合结构域彼此不同，并且其中所述第四结合结构域与所述第一结合结构域、所述第二结合结构域和所述第三结合结构域中的一个相同。
14.根据权利要求1或2中的一项所述的多特异性抗体，其中所述第一结合结构域包括scFv结构域、配体、单结构域纳米抗体、天然蛋白的结合区、趋化因子或细胞因子。
15.根据权利要求1或2所述的多特异性抗体，其中所述第一单体包括与SEQ ID NO.1具有至少98％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述第二单体包括与SEQ ID NO.2具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
16.根据权利要求1或2所述的多特异性抗体，其中所述第一单体包括与SEQ ID NO.1具有至少98％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述第二单体包括与SEQ ID NO.3具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
17.根据权利要求1或2所述的多特异性抗体，其中所述第一单体包括与SEQ ID NO.1具有至少98％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述第二单体包括与SEQ ID NO.4具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
18.根据权利要求1或2所述的多特异性抗体，其中所述第一单体包括与SEQ ID NO.5具有至少98％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述第二单体包括与SEQ ID NO.6具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
19.根据权利要求3至5或8至9中的一项所述的多特异性抗体，其中所述第一结合结构域和所述第二结合结构域独立地选自scFv结构域、配体、单结构域纳米抗体、天然蛋白的所述结合区、趋化因子或细胞因子。
20.根据权利要求3至5或8至9中的一项所述的多特异性抗体，其中所述第一单体包括与SEQ ID NO.7具有至少98％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述第二单体包括与SEQID NO.8具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
21.根据权利要求3至5或8至9中的一项所述的多特异性抗体，其中所述第一单体包括与SEQ ID NO.9具有至少98％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述第二单体包括与SEQID NO.10具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
22.根据权利要求3至5或8至9中的一项所述的多特异性抗体，其中所述第一单体包括与SEQ ID NO.11具有至少98％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述第二单体包括与SEQ ID NO.2具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
23.根据权利要求3至5或8至9中的一项所述的多特异性抗体，其中所述第一单体包括与SEQ ID NO.12具有至少98％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述第二单体包括与SEQ ID NO.4具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
24.根据权利要求3至5或8至9中的一项所述的多特异性抗体，其中所述第一单体包括与SEQ ID NO.12具有至少98％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述第二单体包括与SEQ ID NO.2具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
25.根据权利要求7所述的多特异性抗体，其中所述第一结合结构域、所述第二结合结构域和所述第三结合结构域独立地选自scFv结构域、配体、单结构域纳米抗体、天然蛋白的所述结合区、趋化因子或细胞因子。
26.根据权利要求7所述的多特异性抗体，其中所述第一单体包括与SEQ ID NO.14具有至少98％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述第二单体包括与SEQ ID NO.15具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
27.根据权利要求8所述的多特异性抗体，其中所述第一结合结构域、所述第二结合结构域、所述第三结合结构域和所述第四结合结构域独立地选自scFv结构域、配体、单结构域纳米抗体、天然蛋白的所述结合区、趋化因子或细胞因子。
28.根据权利要求8所述的多特异性抗体，其中所述第一单体包括与SEQ ID NO.14具有至少98％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述第二单体包括与SEQ ID NO.16具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
29.一种分离的核酸序列，其编码权利要求1至28所述的多特异性抗体。
30.一种表达载体，其包括权利要求29所述的分离的核酸序列。
31.根据权利要求30所述的表达载体，其包括权利要求29所述的分离的核酸序列。
32.一种宿主细胞，其包括权利要求29所述的分离的核酸序列。
33.一种宿主细胞，其包括权利要求30所述的表达载体。
34.一种用于产生权利要求1至18所述的多特异性抗体的方法，其包括:培养宿主细胞，使得编码权利要求1至18所述的多特异性抗体的DNA序列被表达，以及
纯化所述多特异性抗体。
35.一种制备权利要求1至18所述的多特异性抗体的方法，其包括在产生权利要求1至18所述的多特异性抗体的条件下培养宿主细胞并且回收所述抗体。
36.一种免疫缀合物，其包括权利要求1至18所述的多特异性抗体和细胞毒性剂。
37.一种免疫缀合物，其包括权利要求1至18所述的多特异性抗体和成像剂。
38.一种药物组合物，其包括权利要求1至18所述的多特异性抗体和药学上可接受的载体。
39.根据权利要求38所述的药物组合物，其进一步包括放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗剂、化疗剂或其组合。
40.一种药物组合物，其包括权利要求36或37所述的免疫缀合物和药学上可接受的载体。
41.一种用于治疗或预防受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括权利要求1至18的纯化的多特异性抗体的药物组合物。
42.一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至18所述的多特异性抗体。
43.根据权利要求42所述的方法，其进一步包括联合施用有效量的治疗剂。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述治疗剂包括抗体、化疗剂、酶或其组合。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述受试者是人。
46.一种溶液，其包括有效浓度的权利要求1至18所述的多特异性抗体，其中所述溶液是受试者的血浆。
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