JP2023538945A - 抗ｒｏｒ１抗体及び関連の二重特異性結合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
本明細書において、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）を認識する抗体、二重特異性ＲＯＲ１／ＣＤ３結合タンパク質（ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質及びＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質等）、並びに造血器ガン及び固形腫瘍を治療するための抗体及び二重特異性結合タンパク質の使用が提供される。
Description
技術分野
本開示は、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）を認識することが可能な抗体及び関連の二重特異性結合タンパク質（二重特異性ＲＯＲ１／ＣＤ３結合タンパク質（例えば、ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質及びＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質）等）に関する。本明細書に開示される抗体及び二重特異性結合タンパク質は、造血器ガン及び固形腫瘍等の疾患を治療するために有用であり得る。
本開示は、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）を認識することが可能な抗体及び関連の二重特異性結合タンパク質（二重特異性ＲＯＲ１／ＣＤ３結合タンパク質（例えば、ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質及びＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質）等）に関する。本明細書に開示される抗体及び二重特異性結合タンパク質は、造血器ガン及び固形腫瘍等の疾患を治療するために有用であり得る。
背景技術
受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1)（ＲＯＲ１）は、ＲＯＲサブファミリーに属す、進化的に保存されたＩ型膜タンパク質である。ＲＯＲ１は、ＲＯＲファミリーの唯一の他のメンバーであるＲＯＲ２と５８％のアミノ酸（ａａ）配列同一性を有する。ＲＯＲ１及びＲＯＲ２は、１つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン、１つのフリッズルド(frizzled)（Ｆｚ）ドメイン及び１つのクリングル(kringle)（Ｋｒ）ドメインを含んでなる特徴的な細胞外領域、次いで、膜貫通領域、並びにチロシンキナーゼドメインを含む細胞内領域から構成される(Baskar, S., et al, (2008) Clinical Cancer Research, 14(2), 396-404)。
受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1)（ＲＯＲ１）は、ＲＯＲサブファミリーに属す、進化的に保存されたＩ型膜タンパク質である。ＲＯＲ１は、ＲＯＲファミリーの唯一の他のメンバーであるＲＯＲ２と５８％のアミノ酸（ａａ）配列同一性を有する。ＲＯＲ１及びＲＯＲ２は、１つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン、１つのフリッズルド(frizzled)（Ｆｚ）ドメイン及び１つのクリングル(kringle)（Ｋｒ）ドメインを含んでなる特徴的な細胞外領域、次いで、膜貫通領域、並びにチロシンキナーゼドメインを含む細胞内領域から構成される(Baskar, S., et al, (2008) Clinical Cancer Research, 14(2), 396-404)。
ＲＯＲ１の発現は、発生学的に調節され、胎児の発育過程で減弱する。Ｂ細胞悪性腫瘍の及び正常Ｂリンパ球の遺伝子発現プロファイリングにより、ＲＯＲ１及びリンパ球性白血病細胞におけるその特徴的な発現の発見に至った（Baskar et al., 2008, 前掲参照）。高感受性マウス抗ヒトＲＯＲ１ ｍＡｂ ６Ｄ４を使用することにより、ＲＯＲ１は、特定のタイプの固形腫瘍（卵巣ガン、トリプルネガティブ乳ガン、肺腺ガン及び膵臓腺ガンを含む）において、典型的には膜状で均一に発現していると特徴付けられている。更に、ＲＯＲ１の細胞表面発現は、特定の正常組織（例えば、副甲状腺、膵島、及びヒト腸の幾つかの領域）において観察されたが、他の組織（例えば、脳、心臓、肺及び肝臓）には見られなかった(Berger et al., 2016, Clinical Cancer Research, 23(12), 3061-3071)。
ＲＯＲ１は、ガン治療のための標的として提案されている。例えば、国際公開第２００５／１００６０５号、国際公開第２００７／０５１０７７号、国際公開第２００８／１０３８４９号及び国際公開第２０１２／０９７３１３号には、ＲＯＲ１に対する抗体と、固形腫瘍（乳ガン等）及び血液腫瘍（慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）等）を含む腫瘍を標的とした治療薬としてのそれらの使用について記載されている。国際公開第２０１２／０９７３１３号の抗ＲＯＲ１抗体 Ｄ１０によって結合されたエピトープをマッピングすることにより作製されたシルムツズマブは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含む様々なガンに対して臨床試験中であるヒト化モノクローナル抗体である。シルムツズマブは、ＲＯＲ１がそのリガンドであるＷｎｔ５ａに結合するのを阻害し得、Ｗｎｔ５ａにより誘導されるＮＦ－κＢ活性化の刺激を抑制し得、それによりＣＬＬにおける自己分泌ＩＬ－６依存性のＳＴＡＴ３－活性化を抑制し得る(Chen et al, 2019, Blood, 134(13), 1084-1094)。シルムツズマブは、細胞に内在化し得、抗ＲＯＲ１抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の標的部分としての使用に関して評価されている。シルムツズマブに基づくＭＭＡＥ含有ＡＤＣであるＶＬＳ－１０１は、ＲＯＲ１陽性悪性腫患者の治療に対して開発されている。
ＲＯＲ１及び第２の抗原に対する二重特異性抗体（例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ））は、別の治療モダリティとして開発されている。国際公開第２０１４／１６７０２２号は、ゆっくりと内在化する抗ＲＯＲ１抗体（Ｒ１２）を一方のアームとし、抗ＣＤ３ε抗体をもう一方のアームとする、二重特異性抗体を開示している。Gohil et al., 2017 (Onco Immunology, 6(7), 1-11)では、ＲＯＲ１のフリッズルドドメインを標的とする単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を使用してＢｉＴＥを作製し、マウスモデルにおける膵臓腫瘍異種移植片の生着を防止した。Qi et al., 2018 (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 115(24), E5467-E5476)は、膜近位エピトープのＲ１１を有するＲＯＲ１標的化ｓｃＦｖを開示し、ヘテロ二量体とアグリコシル化Ｆｃドメインに基づくＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性抗体を使用したｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで構築される場合に、強力かつ選択性の高い抗腫瘍活性を明らかにした。
ＢｉＴＥは、Ｔ細胞／ＣＤ３複合体の定常成分と腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する二重特異性抗体である。これらの二重特異性抗体には、ＭＨＣに制限されない様式で、悪性腫瘍に対するＴ細胞の細胞傷害活性をリダイレクトする等の特定の利点がある。近年、ブリナツモマブで見られた臨床的奏功に伴い、ガン免疫療法のためのＣＤ３標的化ＢｉＴＥへの関心が高まっている。しかしながら、この治療モダリティの有効性及び毒性／安全性に関する課題が浮上してきた。
例えば、厳密に腫瘍に特異的な抗原に対しては、親和性を高めた抗体が所望され得る。しかしながら、腫瘍で過剰発現しているが正常組織でも発現している腫瘍関連抗原に対しては、腫瘍と正常組織での抗原発現を識別する抗体の能力が有利となり得る。また、抗体の内在化特性も治療適用に影響を及ぼし得る。例えば、抗体結合時の強い内在化は、複合化された毒素を抗体複合体が標的細胞に効率的に送達するために所望され得る。しかしながら、ＢｉＴＥを細胞表面に留めておくことがＴ細胞の会合による細胞傷害活性を惹起するために所望され得るため、内在化は、Ｔ細胞エンゲージャーにとって有利でない可能性がある。更に、抗体薬の固形腫瘍への浸透性及び有効性は、抗体の親和性及び抗原の内在化よって影響を受ける得ることも示されている。Rudnick et al, 2011 (Rudnick et al., Cancer Res; 71(6); 2250-9)によれば、高い親和性及び迅速な内在化が抗体の腫瘍への浸透を制限し得、一方で、相対的に低い親和性と低い内在化が固形腫瘍へのより効果的な浸透をもたらし得る。
当技術分野では、ＢｉＴＥのｉｎ ｖｉｖｏ効力及び腫瘍選択性に影響を及ぼす多くの要因が言及されている。そして、しばしば、標的／エピトープの性質に応じて、Ｔ細胞エンゲージャーに異なる特性を採用することが所望され得る。
例えば、James et al. (Antigen sensitivity of CD22-specific chimeric TCR is modulated by target epitope distance from the cell membrane, J.Immunol. 180 (10) (2008) 7028-7038)は、ＢｉＴＥの有効性及び／又は腫瘍選択性を高めるために、膜へのエピトープ距離を調節することを記載している。Ｊａｍｅｓらは、ＣＡＲ－Ｔ細胞で膜までの距離が様々なＣＤ２２のエピトープを標的化することにより、中間ドメインの標的化がＢ細胞株の効率的な溶解をもたらす一方で、正常Ｂ細胞の溶解が検出されないことを発見した。同様に、Ｑｉらは、ＲＯＲ１上のエピトープの位置が、ｓｃＦｖ－ＦｃフォーマットのＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性抗体の活性に影響を与え得ることを見出した（Qi et al., 2018,前掲参照）。ＲＯＲ１上の異なるエピトープを有するｍＡｂのパネルをスクリーニングすることによって、Ｑｉらのデータは、Ｒ１１によって標的とされるＲＯＲ１のＫｒドメインにおける膜近位エピトープが二特異性抗体によるＴ細胞会合に好適な部位であるかもしれず、一方で、Ｒ１２により標的化されるＦｚ及びＫｒドメインの接合部の膜遠位エピトープがそうではないかもしれないことを示唆している。抗体 Ｒ１２のアームを有する二重特異性抗体は、腫瘍に対して弱いｉｎ ｖｉｖｏ活性を示すに過ぎなかった。
サイズ、価数及び幾何学を含む抗体フォーマットの操作により腫瘍細胞の優先的な会合を高めるための様々なアプローチが記載されている。Slaga et al. (Avidity-based binding to HER2 results inselective killing of HER2-overexpressing cells by anti-HER2/CD3, Sci. Transl. Med.10 (463) (2018).)は、多価抗体フォーマットにおけるアビディティに基づく戦略を探求し、ＨＥＲ２を低密度又は高密度に発現する細胞間の識別性を高めるように選択された親和性を有する二重特異性抗体を開発した。G.L. Moore, et al. (A robust heterodimeric Fc platform engineered for efficient development of bispecific antibodies of multiple formats, Methods (2018))は、同様の戦略を報告している。
更に、二重特異性抗体の開発において考慮すべき問題は、製造に適しているかどうかである。低い生産収率及び著しい凝集形成は、抗体薬が前臨床及び臨床段階の評価を行う上で実用的でないものとし得る特性である。
上記を考慮し、ＲＯＲ１がガン治療における有望な標的であることを考慮すると、異なる結合能及び／又若しくは結合部位又は内在化特性を有する多様な抗ＲＯＲ１分子を開発すること、多様な抗体フォーマットを開発すること、治療有用性及び製造適性を拡大及び／又は改善することが、当技術分野において依然として必要である。
概要
本開示は、新規な抗ＲＯＲ１抗体、抗ＣＤ３抗体及びＲＯＲ１とＣＤ３の両方に結合する操作された二重特異性タンパク質を提供することによって上記の必要性に取り組む。
本開示は、新規な抗ＲＯＲ１抗体、抗ＣＤ３抗体及びＲＯＲ１とＣＤ３の両方に結合する操作された二重特異性タンパク質を提供することによって上記の必要性に取り組む。
特に、幾つかの実施形態では、本開示は、抗ＲＯＲ１抗体（例えば、ＲＯＲ１発現細胞に対して高い結合能を有し、かつ、内在化の割合が遅いもの）を提供する。幾つかの実施形態では、本開示はまた、ＣＤ３に結合する抗体（例えば、ＣＤ３に高い親和性で結合するもの）も提供する。幾つかの実施形態では、本開示はまた、ＲＯＲ１とＣＤ３の両方に反応性である、Ｆａｂｓ－ｉｎ－Ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリン（ＦＩＴ－Ｉｇ）フォーマット又は一価非対称タンデムＦａｂ二重特異性抗体(monovalent asymmetric tandem Fab bispcific antibody)（ＭＡＴ－Ｆａｂ）フォーマットのＲＯＲ１／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質も提供する。幾つかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒトＲＯＲ１若しくはヒトＣＤ３を検出するために、ＲＯＲ１シグナル伝達を阻害するために、及び／又はヒトＲＯＲ１に媒介される腫瘍成長若しくは腫瘍転移を抑制するために有用である（総てｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ）。更に、幾つかの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性多価結合タンパク質は、ＲＯＲ１発現悪性細胞に対して、ＲＯＲ１－リダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性及び／又はｉｎ ｖｉｖｏにおける強力な抗腫瘍活性を誘導するのに有用である。
幾つかの実施形態では、本開示はまた、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１抗体及び抗ＣＤ３抗体並びにＲＯＲ１／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質を作製及び使用する方法も提供する。種々の組成物（例えば、サンプルにおいてＲＯＲ１及び／若しくはＣＤ３を検出する方法、又は個体においてＲＯＲ１及び／若しくはＣＤ３活性に関連する障害を治療若しくは予防する方法において使用され得るもの）も開示される。
詳細な説明
本開示は、抗ＲＯＲ１抗体、抗ＣＤ３抗体、それらの抗原結合部分、及びＲＯＲ１とＣＤ３の両方に結合する多価の二重特異性結合タンパク質（ＦＩＴ－Ｉｇ又はＭＡＴ－Ｆａｂ等）に関する。本開示の様々な側面は、抗ＲＯＲ１抗体及び抗ＣＤ３抗体並びに抗体フラグメント、ヒトＲＯＲ１とヒトＣＤ３に結合するＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質及びＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質、並びにそれらの医薬組成物、並びに、そのような抗体、機能的抗体フラグメント及び結合タンパク質を作製するための核酸、組換え発現ベクター及び宿主細胞に関する。ヒトＲＯＲ１、ヒトＣＤ３、又はその両方を検出するために；ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏにおいてヒトＲＯＲ１及び／又はヒトＣＤ３活性を調節するために；並びにＲＯＲ１及びＣＤ３がそれらの各リガンドに結合することにより媒介される疾患（特に、ガン）を治療するために、本開示の抗体、機能的抗体フラグメント及び二重特異性結合タンパク質を使用する方法も本開示に包含される。
本開示は、抗ＲＯＲ１抗体、抗ＣＤ３抗体、それらの抗原結合部分、及びＲＯＲ１とＣＤ３の両方に結合する多価の二重特異性結合タンパク質（ＦＩＴ－Ｉｇ又はＭＡＴ－Ｆａｂ等）に関する。本開示の様々な側面は、抗ＲＯＲ１抗体及び抗ＣＤ３抗体並びに抗体フラグメント、ヒトＲＯＲ１とヒトＣＤ３に結合するＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質及びＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質、並びにそれらの医薬組成物、並びに、そのような抗体、機能的抗体フラグメント及び結合タンパク質を作製するための核酸、組換え発現ベクター及び宿主細胞に関する。ヒトＲＯＲ１、ヒトＣＤ３、又はその両方を検出するために；ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏにおいてヒトＲＯＲ１及び／又はヒトＣＤ３活性を調節するために；並びにＲＯＲ１及びＣＤ３がそれらの各リガンドに結合することにより媒介される疾患（特に、ガン）を治療するために、本開示の抗体、機能的抗体フラグメント及び二重特異性結合タンパク質を使用する方法も本開示に包含される。
定義
本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、本明細書で別段の定義がない限り、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。いかなる潜在的な曖昧さがある場合、本明細書に記載された定義が、いかなる辞書又は外部の定義よりも優先される。更に、文脈により別段のことが要求されない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。本願において、「又は」の使用は、特に断りのない限り、「及び／又は」を意味する。更に、「含む(including)」という用語並びに「含む(includes)」及び「含まれる(included)」等の他の形態の使用は、限定的なものではない。また、「要素」又は「構成」等の用語は、具体的に断りのない限り、１つのユニットを含む要素及び構成と、２つ以上のサブユニットを含む要素及び構成の両方を包含する。
本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、本明細書で別段の定義がない限り、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。いかなる潜在的な曖昧さがある場合、本明細書に記載された定義が、いかなる辞書又は外部の定義よりも優先される。更に、文脈により別段のことが要求されない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。本願において、「又は」の使用は、特に断りのない限り、「及び／又は」を意味する。更に、「含む(including)」という用語並びに「含む(includes)」及び「含まれる(included)」等の他の形態の使用は、限定的なものではない。また、「要素」又は「構成」等の用語は、具体的に断りのない限り、１つのユニットを含む要素及び構成と、２つ以上のサブユニットを含む要素及び構成の両方を包含する。
本明細書で使用する場合、重鎖及び軽鎖の総ての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載のＫａｂａｔナンバリングシステムによりナンバリングされ、本明細書では「Ｋａｂａｔによるナンバリング」と称する。具体的には、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＫａｂａｔナンバリングシステムは、κ及びλアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに対して使用され、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステム（６６１～７２３頁参照）は、定常重鎖ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、この場合、「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従うナンバリング」と呼ぶことによって更に明確にされる）に対して使用される。
ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖の配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に示されている。
用語「単離されたタンパク質」又は「単離されたポリペプチド」は、その起源又は派生源によって、その天然状態で付随する天然に関連する構成と関連せず、同じ種からの他のタンパク質を実質的に含まないか、異なる種からの細胞によって発現されるか、又は自然界に存在しない、タンパク質又はポリペプチドである。化学的に合成されたか又は自然に由来する細胞とは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、その自然に関連する構成から「単離」され得る。タンパク質はまた、当技術分野で周知のタンパク質精製技術を使用して、単離によって天然に関連する成分を実質的に含まないようにし得る。
抗体、結合タンパク質又はペプチドと第２の化学種との相互作用に関して「特異的結合」又は「特異的に結合する」という用語は、相互作用が第２の化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存していることを意味する。例えば、抗体は、一般的にタンパク質ではなく、特定のタンパク質構造を認識し、結合する。一般的に、抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識された「Ａ」と抗体を含む反応において、エピトープＡを含む分子（又は遊離の非標識Ａ）が存在すると、抗体に結合する標識されたＡの量が減少する。
「抗体」という用語は、２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖の４つのポリペプチド鎖を含む任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、又はＩｇ分子の必須のエピトープ結合特徴を保持する、その任意の機能的フラグメント、突然変異体、変異体若しくは誘導体を広く指す。このような突然変異体、変異体又は誘導体の抗体フォーマットは、当技術分野で知られており、非限定的な実施形態が以下に議論される。
全長抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＶＨと略記）と重鎖定常領域を含んでなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（即ち、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含んでなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＶＬと略記）と軽鎖定常領域を含んでなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインのＣＬを含んでなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域と、点在しているフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存性の高い領域に更に細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲを含んでなり、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。ＶＨドメインの第１、第２及び第３のＣＤＲは、一般的にＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３として列挙され、同様に、ＶＬドメインの第１、第２及び第３のＣＤＲは、一般的にＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３として列挙される。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであり得る。
「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用され、インタクトな抗体のパパイン消化によって作製されてもよい。Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域又は変異体Ｆｃ領域であり得る。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般的に２つの定常ドメイン（即ち、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン）を含んでなり、場合によりＣＨ４ドメイン（例えば、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体のＦｃ領域の場合等）を含んでなる。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤ抗体のＦｃ領域は、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含んでなる。これに対し、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体のＦｃ領域は、ヒンジ領域を欠くが、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインを含んでなる。抗体のエフェクター機能を変更するためのＦｃ部分のアミノ酸残基の置換を有する変異体Ｆｃ領域が当技術分野で公知である（例えば、Winter et al., 米国特許第５，６４８，２６０号明細書及び同第５，６２４，８２１号明細書を参照されたい）。抗体のＦｃ部分は、抗体及び抗原抗体複合体の１以上のエフェクター機能（例えば、サイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、貪食作用、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、及び／又は、半減期／クリアランス速度）に介在し得る。これらのエフェクター機能は、治療目的によって、ある場合においては治療用抗体として望ましいかもしれないし、他の場合においては不要であるか又はむしろ有害かもしれない。特定のヒトＩｇＧアイソタイプ（特に、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３）は、それぞれＦｃＲ及び補体Ｃ１ｑへの結合を介して、ＡＤＣＣ及びＣＤＣに介在する。更に別の実施形態では、抗体のエフェクター機能が変更されるように、抗体の定常領域（例えば、抗体のＦｃ領域）において少なくとも１つのアミノ酸残基が置換される。免疫グロブリンの２つの同一の重鎖の二量体形成は、ＣＨ３ドメインの二量体形成によって媒介され、ＣＨ１定常ドメインをＦｃ定常ドメイン（例えば、ＣＨ２及びＣＨ３）に連結するヒンジ領域内のジスルフィド結合によって安定化される。ＩｇＧの抗炎症活性は、ＩｇＧ ＦｃフラグメントのＮ－結合グリカンのシアリル化に依存する。抗炎症活性のための正確なグリカン要件は、適切なＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントが作出され得るように決定されており、それによって、効力が大幅に増強された完全組換え型シアリル化ＩｇＧ１ Ｆｃが作製されている（Anthony et al., Science, 320:373-376 (2008)を参照されたい）。
抗体の「抗原結合部分」及び「抗原結合フラグメント」又は「機能的フラグメント」という用語は、互換可能に使用され、抗原（即ち、その部分又はフラグメントが由来する全長抗体と同じ抗原（例えば、ＲＯＲ１、ＣＤ３））に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントによって実行され得ることが示されている。このような抗体の実施形態はまた、二重特異性、デュアル特異性又は多重特異性フォーマットであってもよく；２つ以上の異なる抗原（例えば、ＲＯＲ１及び異なる抗原（ＣＤ３等））に特異的に結合する。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる１価のフラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含んでなる２価のフラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる、Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなる、Ｆｖフラグメント；（ｖ）単一可変ドメインを含んでなる、ｄＡｂフラグメント(Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)；国際公開第９０／０５１４４号）；並びに（ｖｉ）独立した相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。更に、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬとＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、これらは、組換え法を用いて、ＶＬ及びＶＨ領域が対合して一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988);及びHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988)を参照されたい）としての作製を可能にする合成リンカーによって連結され得る。このような単鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語及び上記に示された等価の用語の範囲内に包含されることが意図される。ダイアボディ等の他の形態の単鎖抗体もまた、包含される。ダイアボディは、ＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによってドメインが別の鎖の相補的ドメインと対合することを余儀なくされ、２つの抗原結合部位が作出される、二価の二重特異性抗体である（例えば、Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)を参照されたい）。このような抗体結合部分は、当技術分野で公知である(Kontermann and Dubel編集, Antibody Engineering (Springer-Verlag, New York, 2001), p. 790 (ISBN 3-540-41354-5))。更に、単鎖抗体にはまた、相補的な軽鎖ポリペプチドとともに一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含んでなる「線形抗体」も含む（(Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995)；及び米国特許第５，６４１，８７０号明細書））。
免疫グロブリン定常（Ｃ）ドメインは、重鎖（ＣＨ）又は軽鎖（ＣＬ）定常ドメインを指す。マウス及びヒトＩｇＧ重鎖及び軽鎖定常ドメインアミノ酸配列は、当技術分野で公知である。
「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、集団に含まれる個々の抗体は、微量に存在し得る自然発生の突然変異の可能性を除けば同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原決定基（エピトープ）に対するものであり、特異性が高い。更に、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各ｍＡｂは、抗原上の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」という修飾語は、特定の方法による抗体の製造を要求するものと解釈されるべきではない。
本願による抗体又は結合タンパク質の軽鎖定常ドメインＣＬ、重鎖定常ドメインＣＨ及びＦｃ領域に関して、「ヒト配列」という用語は、その配列がヒト免疫グロブリン配列のものであるか、又はヒト免疫グロブリン配列に由来することを意味する。本開示のヒト配列は、天然ヒト配列であってもよいし、１以上（例えば、最大２０、１５、１０）のアミノ酸残基変化を含んでなるその変異体であってもよい。
「キメラ抗体」という用語は、ある種に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列と別の種に由来する定常領域配列とを含んでなる抗体（例えば、ヒト定常領域に連結されたマウス重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体）を指す。
「ＣＤＲグラフト抗体」という用語は、ある種の重鎖及び軽鎖可変領域配列を含んでなるが、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ領域の１以上の配列が他の種のＣＤＲ配列で置換されている抗体（例えば、ヒトのＣＤＲの１以上がマウスのＣＤＲ配列で置換されたヒト重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体）を指す。
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種（例えば、マウス）からの重鎖及び軽鎖可変領域配列を含んでなるが、ＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部がより「ヒト様」になるように（即ち、よりヒト生殖系列可変配列に類似するように）変更された抗体を指す。ヒト化抗体の１つのタイプは、非ヒト種（例えば、マウス）由来のＣＤＲ配列がヒトＶＨ及びＶＬフレームワーク配列に導入されたＣＤＲグラフト抗体である。ヒト化抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域及び定常領域を含んでなるが、非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する、目的の抗原に免疫特異的に結合する抗体又はその変異体、誘導体、アナログ若しくはフラグメントである。本明細書で使用する場合、ＣＤＲの文脈における「実質的に」という用語は、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）の実質的に総てを含んでなり、ＣＤＲ領域の総て又は実質的に総てが非ヒト免疫グロブリン（即ち、ドナー抗体）のものと対応し、フレームワーク領域の総て又は実質的に総てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ある実施形態において、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的には、ヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部を含んでなる。幾つかの実施形態では、ヒト化抗体は、軽鎖と、重鎖の少なくとも可変ドメインとの両方を含む。抗体はまた、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４領域を含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖のみを含む。幾つかの実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖のみを含む。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖可変ドメイン及び／又はヒト化重鎖のみを含む。
ヒト化抗体は、免疫グロブリンの任意のクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含む）及び任意のアイソタイプ（これらに限定されるものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む）から選択されてもよい。ヒト化抗体は、２以上のクラス又はアイソタイプからの配列を含んでいてもよく、特定の定常ドメインは、当技術分野で周知の技術を用いて、所望のエフェクター機能を最適化するために選択されてもよい。
ヒト化抗体のフレームワーク領域及びＣＤＲ領域は、親配列に正確に対応する必要はなく、例えば、ドナー抗体ＣＤＲ又はアクセプターフレームワークは、少なくとも１つのアミノ酸残基を置換、挿入及び／又は欠失により突然変異させ、その部位のＣＤＲ又はフレームワーク残基がドナー抗体又はコンセンサスフレームのいずれにも対応しないようにしてもよい。しかしながら、例示的な実施形態において、そのような突然変異は広範ではないであろう。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％は、親ＦＲ及びＣＤＲ配列のものに対応する。ドナー抗体のその位置に現れるのと同じアミノ酸を復元するための特定のフレームワーク位置での復帰突然変異は、特定のループ構造を保持するために又は標的抗原との接触のために、ＣＤＲ配列を正しく配向させるためにしばしば利用される。
「ＣＤＲ」とは、抗体可変ドメイン配列内の相補性決定領域を指す。重鎖及び軽鎖の各可変領域には３つのＣＤＲが存在し、それらはＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３と称される。「ＣＤＲセット」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原と結合することが可能な単一の可変領域に存在する３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムに従って異なる定義がなされてきた。Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1987)及び(1991))によって記載されたシステムは、抗体の任意の可変領域に適用可能な明確な残基ナンバリングシステムを提供するだけでなく、３つのＣＤＲを定義する正確な残基境界も提供する。
当技術分野で認識されている、抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲに関連して「Ｋａｂａｔナンバリング」という用語は、抗体又はその抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域において他のアミノ酸残基よりも可変（即ち、超可変）であるアミノ酸残基にナンバリングするシステムを指す。Kabat et al., Ann. NY Acad. Sci., 190: 382-391 (1971);及びKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)を参照されたい。
過去２０年間の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域のアミノ酸配列の広範な公開データベースの成長と分析により、可変領域配列内のフレームワーク領域（ＦＲ）とＣＤＲ配列の間の典型的な境界の理解に至り、Ｋａｂａｔナンバリング、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリング又は他のシステムに従ってＣＤＲを当業者が正確に決定することができるようになった。例えばMartin, "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," In Kontermann and Dubel編, Antibody Engineering (Springer-Verlag, Berlin, 2001), 第31章, 432-433頁を参照されたい。
「多価結合タンパク質」という用語は、２つ以上の抗原結合部位を含んでなる結合タンパク質を表す。多価結合タンパク質は、ある特定の場合には、３以上の抗原結合部位を有するように操作され、一般的に、天然に存在する抗体ではない。「二重特異性結合タンパク質」という用語（これは、別段の記載がない限り、「二重特異性抗体」という用語と互換可能に使用され得る）は、特異性が異なる２つの標的と結合することが可能な結合タンパク質を指す。本開示のＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、４つの抗原結合部位を含んでなり、典型的には４価の結合タンパク質である。本開示のＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、２つの抗原結合部位を含んでなり、典型的には２価の結合タンパク質である。本開示によるＦＩＴ－Ｉｇ又はＭＡＴ－Ｆａｂは、ＲＯＲ１及びＣＤ３の両方に結合し、二重特異性である。
２つの長い（重）Ｖ－Ｃ－Ｖ－Ｃ－Ｆｃ鎖ポリペプチドと４つの短い（軽）Ｖ－Ｃ鎖ポリペプチドを含んでなるＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、４つのＦａｂ抗原結合部位（ＶＬ－ＣＬと対合したＶＨ－ＣＨ１、ＶＨ－ＣＨ１：：ＶＬ－ＣＬと表記されることもある）を呈する６量体を形成する。ＦＩＴ－Ｉｇの各半分は、重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドを含んでなり、ＶＨ－ＣＨ１及びＶＬ－ＣＬ要素の３つの鎖の相補的免疫グロブリン対合により、タンデムに配置された２つのＦａｂ構造抗原結合部位が生じる。本開示では、Ｆａｂ要素を含んでなる免疫グロブリンドメインが、ドメイン間リンカーを使用せずに、重鎖ポリペプチド中で直接融合していることが好ましい。即ち、長い（重）ポリペプチド鎖のＮ末端Ｖ－Ｃ要素は、そのＣ末端で別のＶ－Ｃ要素のＮ末端と直接融合し、このＶ－Ｃ要素は次にＣ末端Ｆｃ領域に連結される。二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質において、タンデムＦａｂ要素は、異なる抗原と反応性であってもよい。各Ｆａｂ抗原結合部位は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインを含んでなり、抗原結合部位につき合計６つのＣＤＲを有する。
ＦＩＴ－Ｉｇ分子の設計、発現及び特徴付けに関する記述は、国際公開第２０１５／１０３０７２号に提供されている。そのようなＦＩＴ－Ｉｇ分子の一例は、重鎖と２つの異なる軽鎖を含んでなる。重鎖は、ＣＬがＶＨＢに直接融合している構造式ＶＬＡ－ＣＬ－ＶＨＢ－ＣＨ１－Ｆｃ（即ち、「ＬＨフォーマット」）又はＣＨ１がＶＬＢに直接融合しているＶＨＡ－ＣＨ１－ＶＬＢ－ＣＬ－Ｆｃ（即ち、「ＨＬフォーマット」）を含んでなり、ＦＩＴ－Ｉｇの２つの軽ポリペプチド鎖も相応に、式ＶＨＡ－ＣＨ１とＶＬＢ－ＣＬ（「ＬＨフォーマット」の場合）又はＶＬＡ－ＣＬとＶＨＢ－ＣＨ１（「ＨＬフォーマットの場合）をそれぞれ有し；ＶＬＡは、抗原Ａと結合する親抗体由来の可変軽ドメインであり、ＶＬＢは、抗原Ｂと結合する親抗体由来の可変軽ドメインであり、ＶＨＡは、抗原Ａと結合する親抗体由来の可変重ドメインであり、ＶＨＢは、抗原Ｂと結合する親抗体由来の可変重ドメインであり、ＣＬは、軽鎖定常ドメインであり、ＣＨ１は、重鎖定常ドメインであり、Ｆｃは、免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ１抗体の重鎖のＣ末端ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３部分）である。二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇの実施形態では、抗原Ａ及び抗原Ｂは、異なる抗原、又は同じ抗原の異なるエピトープである。本開示では、Ａ及びＢの一方がＲＯＲ１であり、他方がＣＤ３である（例えば、Ａは、ＲＯＲ１であり、Ｂは、ＣＤ３である）。
１つの長い（重）Ｖ－Ｃ－Ｖ－Ｃ－Ｆｃ鎖ポリペプチド、２つの短い（軽）Ｖ－Ｃ鎖ポリペプチド、及び１つの免疫Ｆｃ鎖ポリペプチドを含んでなるＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、タンデムに配置した２つのＦａｂ抗原結合部位（ＶＬ－ＣＬと対合したＶＨ－ＣＨ１、ＶＨ－ＣＨ１：：ＶＬ－ＣＬと表記されることもある）と１つのＦｃ：Ｆｃ二量体を呈する４量体を形成する。２つのＣＨ３ドメインのヘテロ二量体形成に有利となるように、ＭＡＴ－Ｆａｂ重鎖のＦｃ領域のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３ｍ１ドメインと略記される）及びＭＡＴ－Ｆａｂ Ｆｃポリペプチド鎖のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３ｍ２ドメインと略記される）にも、修飾がしばしば導入される。これらの修飾は、「ノブ・イン・ホール」（ＫＩＨ）突然変異であり得、例えば、相補的な構造ホールを含んでなるＦｃ鎖のＣＨ３ｍ２ドメインと対合するための構造ノブを重鎖のＣＨ３ｍ１ドメインに形成するための突然変異がなされる。しかしながら、他の修飾（ドメインに塩橋又は静電相互作用が導入されたもの等）もまた有用である。定常領域はまた、他の修飾（例えば、ＭＡＴ－Ｆａｂ分子を安定化するためのＣｙｓ残基、及び／又はＦｃエフェクター機能を防止若しくは損なうための突然変異）がなされていてもよい。好ましくは、本明細書に記載のＭＡＴ－Ｆａｂ二重特異性抗体の構造の特徴は、総ての隣接する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン並びに定常ドメインが、合成アミノ酸又はペプチドリンカーの介在なく互いに直接連結される。
ＭＡＴ－Ｆａｂ分子の設計、発現及び特徴付けに関する記述は、国際公開第２０１８／０３５０８４号に提供されている。そのようなＭＡＴ－Ｆａｂ分子の一例は、Ｆｃ領域における「ノブ」を有する重鎖、２つの異なる軽鎖、及び「ホール」を有する１つのＦｃポリペプチド鎖を含んでなる。幾つかの実施形態では、重鎖は、ＣＬがＶＨＢに直接融合している構造式ＶＬＡ－ＣＬ－ＶＨＢ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ｍ１（即ち、「ＬＨフォーマット」）、又はＣＨ１がＶＬＢに直接融合しているＶＨＡ－ＣＨ１－ＶＬＢ－ＣＬ－Ｆｃ（即ち、「ＨＬフォーマット」）を含んでなり、ＭＡＴ－Ｆａｂの２つの軽ポリペプチド鎖も相応に、式ＶＨＡ－ＣＨ１とＶＬＢ－ＣＬ（「ＬＨフォーマット」の場合）又はＶＬＡ－ＣＬとＶＨＢ－ＣＨ１（「ＨＬフォーマット」の場合）をそれぞれ有し；ＶＬＡは、抗原Ａと結合する親抗体由来の可変軽ドメインであり、ＶＬＢは、抗原Ｂと結合する親抗体由来の可変軽ドメインであり、ＶＨＡは、抗原Ａと結合する親抗体由来の可変重ドメインであり、ＶＨＢは、抗原Ｂと結合する親抗体由来の可変重ドメインであり、ＣＬは、軽鎖定常ドメインであり、ＣＨ１は、重鎖定常ドメイン１であり、ＣＨ３ｍ１は、ノブ突然変異（Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ等）を有する重鎖定常ドメイン３である。Ｆｃポリペプチド鎖は、ＣＨ３ｍ２のノブ突然変異に相補的なホール突然変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ等の）を有する、免疫グロブリン（ＩｇＧ抗体等）の重鎖のＣ末端ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３部分であってもよい。二重特異性ＭＡＴ－Ｆａｂの実施形態において、抗原Ａ及び抗原Ｂは、異なる抗原、又は同じ抗原の異なるエピトープである。本開示では、抗原Ａ及びＢの一方は、ＲＯＲ１であり、他方は、ＣＤ３である（例えば、Ａは、ＲＯＲ１であり、Ｂは、ＣＤ３である）。
「ｋｏｎ」（「Ｋｏｎ」、「ｋｏｎ」も）という用語は、本明細書で使用する場合、当技術分野で知られているように、結合タンパク質（例えば、抗体）が抗原と会合して会合複合体（例えば、抗体／抗原複合体）を形成することに対するオンレート定数を指すことを意図する。「ｋｏｎ」はまた、本明細書において互換可能に用いられるように、「会合速度定数」又は「ｋａ」という用語によっても知られる。この値は、以下の式：
で示されるように、抗体のその標的抗原への結合速度、又は抗体と抗原との複合体形成速度を示す
「ｋｏｆｆ」（「Ｋｏｆｆ」、「ｋｏｆｆ」も）という用語は、本明細書で使用する場合、当技術分野で知られているように、会合複合体（例えば、抗体／抗原複合体）からの結合タンパク質（例えば、抗体）の解離に対するオフレート定数（即ち、「解離速度定数」）を指すことを意図する。この値は、以下の式：
で示されるように、標的抗原からの抗体の解離速度、又はＡｂ－Ａｇ複合体の遊離抗体と遊離抗原への経時的な分離を示す。
「ＫＤ」（「Ｋｄ」も）という用語は、本明細書で使用する場合、「平衡解離定数」を指すことを意図し、平衡状態での滴定測定で得られる値、又は解離速度定数（ｋｏｆｆ）を会合速度定数（ｋｏｎ）で除すことによって得られる値を指す。会合速度定数（ｋｏｎ）、解離速度定数（ｋｏｆｆ）及び平衡解離定数（ＫＤ）は、抗体の抗原に対する結合親和性を表すために使用される。会合速度定数及び解離速度定数を決定するための方法は、当技術分野で周知である。蛍光に基づく技術の使用は、高感度性と、平衡状態の生理学的バッファー中のサンプルを調べるための性能とを提供する。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）アッセイ等の他の実験的アプローチ及び装置（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ、ａ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｃｏｍｐａｎｙ（ウプサラ、スウェーデン）から入手可能な装置）も使用され得る。例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６システム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＬＬＣ）を用いたＢｉｏｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）は、別のアフィニティーアッセイ技術である。更に、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）アッセイ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ボイジー、アイダホ州）から入手可能）も使用され得る。
「単離された核酸」という用語は、人為的な介入により、自然界に見られるポリヌクレオチドの総て又は一部に付随していないか；自然界で結合していないポリヌクレオチドと作動可能に結合しているか；又はより大きな配列の一部として自然界に存在しない、ポリヌクレオチド（例えば、ゲノム、ｃＤＮＡ若しくは合成由来、又はそれらの幾つかの組合せ）を意味する。
「ベクター」という用語は、本明細書で使用する場合、それが連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指すことを意図する。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされてもよい円形の二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされてもよい。ある種のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、及びエピソーム哺乳動物ベクター）は、それらが導入される宿主細胞において自律的な複製が可能である。他のベクター（例えば、非エピソーム型哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよく、それにより宿主ゲノムとともに複製される。更に、ある種のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することが可能である。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本明細書では、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、「プラスミド」と「ベクター」が互換可能に使用され得る。しかしながら、本開示は、等価の機能を果たすそのような他の形態の発現ベクター（ウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）等）を含むことを意図する。
「作動可能に連結された」という用語は、記載された構成が、それらが意図された方法で機能することを許容する関係にある並置を指す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、そのコード配列の発現が制御配列に適合可能な条件下で達成されるような方法でライゲーションされる。「作動可能に連結された」配列には、目的の遺伝子と連続している発現制御配列と、目的の遺伝子を制御するためにトランス又はある距離で作用する発現制御配列の両方が含まれる。「発現制御配列」という用語は、本明細書で使用する場合、それらがライゲーションされるコード配列の発現及びプロセシングに影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列には、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列及びエンハンサー配列；スプライシング及びポリアデニル化シグナル等の効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（又はＫｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を高める配列；及び所望の場合にはタンパク質分泌を高める配列が含まれる。このような制御配列の性質は、宿主生物によって異なり；原核生物では、このような制御配列は一般的にプロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含み；真核生物では、このような制御配列は一般的にプロモーター及び転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、その存在が発現及びプロセシングに必須である構成を含むことを意図し、また、その存在が有利である追加の構成（例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列）も含み得る。
本明細書で定義する「形質転換」とは、外来ＤＮＡが宿主細胞に入る任意のプロセスを指す。形質転換は、当技術分野で周知の様々な方法を用いて、自然の又は人工的な条件下で起こってもよい。形質転換は、原核生物又は真核生物の宿主細胞へ外来核酸配列を挿入するための任意の既知の方法に依存してもよい。この方法は、形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、これらに限定されるものではないが、トランスフェクション、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクション及び粒子衝撃を含んでもよい。このような「形質転換」細胞には、自律的に複製するプラスミドとして又は宿主染色体の一部として、挿入されたＤＮＡを複製することが可能な安定的に形質転換された細胞が含まれる。また、挿入されたＤＮＡ又はＲＮＡを、限定された期間、一過性に発現する細胞も含まれる。
「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）という用語は、外来性ＤＮＡが導入された細胞を指すことを意図する。ある実施形態では、宿主細胞は、抗体をコードする２つ以上の（例えば、複数の）核酸を含んでなる（例えば米国特許第７，２６２，０２８号に記載されている宿主細胞等）。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代も指すことを意図する。突然変異又は環境の影響のいずれかに起因して、特定の改変が後続世代で起こり得るため、このような後代は、実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書で使用する場合の「宿主細胞」という用語の範囲内になお含まれる。ある実施形態では、宿主細胞としては、生物界のいずれかから選択される原核細胞及び真核細胞が挙げられる。別の実施形態では、真核細胞としては、原生生物、真菌、植物及び動物細胞が挙げられる。別の実施形態では、宿主細胞としては、これらに限定されるものではないが、原核細胞株の大腸菌(Escherichia coli)；哺乳動物細胞株のＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＮＳ０、ＳＰ２及びＰＥＲ．Ｃ６；昆虫細胞株のＳｆ９；並びに真菌細胞のサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、障害若しくはその1以上の症状の重症度及び／若しくは持続期間を軽減するか又は改善する、障害の進行を防ぐ、障害の退行を引き起こす、障害に関連する1以上の症状の再発、発症又は進行を防ぐ；障害を検出する；或いは、別の治療（例えば、予防剤又は治療剤）の予防効果若しくは治療効果を増強するか又は改善するのに十分な治療量を意味する。
本開示による抗体、その機能的フラグメント及び結合タンパク質は、抗体及び結合タンパク質を精製するために、当技術分野で利用可能な様々な方法及び材料の１以上を使用することによって（意図された使用のために）精製されてもよい。そのような方法及び材料には、これらに限定されるものではないが、意図する用途に許容可能な純度を得るための、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ又は抗体、その機能的フラグメント若しくは結合タンパク質の特定のリガンドと結合された、樹脂、粒子又は膜を用いる）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、イオン交換粒子又は膜を用いる）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」；例えば、疎水性粒子又は膜を用いる）、限外濾過、ナノ濾過、透析濾過、サイズ排除クロマトグラフィー（「ＳＥＣ」）、低ｐＨ処理（混入ウイルスを不活化するため）及びこれらの組合せが挙げられる。混入ウイルスを不活化するための低ｐＨ処理の非限定的な例は、本開示の抗体、その機能的フラグメント又は結合タンパク質を含んでなる溶液又は懸濁液のｐＨを、１８℃～２５℃で、６０～７０分間、０．５Ｍリン酸を用いてｐＨ３．５に下げることが挙げられる。
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成並びに組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）については、標準的な技術が使用されてもよい。酵素反応及び精製技術は、製造者の仕様書に従って、又は当技術分野で一般的に達成されるように若しくは本明細書に記載されるように、実施されてもよい。前述の技術及び手順は、一般的には、当技術分野で周知の従来の方法に従って、並びに本明細書を通じて引用及び議論される様々な一般的な参考文献及びより特定の参考文献に記載されているとおりに、実施されてもよい。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２編 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)を参照されたい。
抗ＲＯＲ１及び抗ＣＤ３単一特異性抗体
本開示の抗ＲＯＲ１抗体及び抗ＣＤ３抗体は、当技術分野で公知の多数の技術のいずれによって製造されもよい。例えば、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトさせるという宿主細胞からの発現がある。「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、原核生物又は真核生物宿主細胞への外来ＤＮＡの導入に一般的に用いられる広範な技術（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション等）を包含することが意図される。本開示の抗体を原核生物宿主細胞又は真核生物宿主細胞のいずれでも発現させることが可能であるが、真核生物細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）における抗体の発現が特に企図され、これはそのような真核細胞（特に、哺乳動物細胞）が、原核細胞よりも、適切に折り畳まれて免疫的に活性な抗体を組み立てて分泌し得るからである。
本開示の抗ＲＯＲ１抗体及び抗ＣＤ３抗体は、当技術分野で公知の多数の技術のいずれによって製造されもよい。例えば、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトさせるという宿主細胞からの発現がある。「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、原核生物又は真核生物宿主細胞への外来ＤＮＡの導入に一般的に用いられる広範な技術（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション等）を包含することが意図される。本開示の抗体を原核生物宿主細胞又は真核生物宿主細胞のいずれでも発現させることが可能であるが、真核生物細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）における抗体の発現が特に企図され、これはそのような真核細胞（特に、哺乳動物細胞）が、原核細胞よりも、適切に折り畳まれて免疫的に活性な抗体を組み立てて分泌し得るからである。
幾つかの実施形態では、本開示の組換え抗体を発現するための哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980)に記載され、例えば、Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982)に記載されるようなＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用されるｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、宿主細胞における抗体の発現又は宿主細胞が増殖している培養培地への抗体の更なる分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって、抗体が製造される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培養培地から回収することができる。
宿主細胞はまた、機能的抗体フラグメント（Ｆａｂフラグメント又はｓｃＦｖ分子等）を製造するために使用され得る。上記の手順の変形は、本開示の範囲内であることが理解されるであろう。例えば、本開示の抗体の軽鎖及び／又は重鎖のいずれかの機能的フラグメントをコードするＤＮＡで宿主細胞をトランスフェクトすることが所望され得る。組換えＤＮＡ技術はまた、目的の抗原への結合に必要でない軽鎖及び重鎖のいずれか又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全部を除去するために使用されてもよい。このような末端切断されたＤＮＡ分子から発現される分子も、本開示の抗体に包含される。更に、標準的な化学的架橋法により本開示の抗体を第２の抗体に架橋することにより、一方の重鎖及び一方の軽鎖が本開示の抗体であり、他方の重鎖及び軽鎖が目的の抗原以外の抗原に特異的である、二機能性抗体が作製されてもよい。
本開示の抗体又はその抗原結合部分を組換え発現させるための例示的な系では、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターは、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションによってｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞に導入される。この組換え発現ベクターでは、抗体重鎖及び抗体軽鎖の遺伝子は、それぞれＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター制御要素に作動可能に連結されてそれらの遺伝子の高レベルの転写を駆動する。組換え発現ベクターはまた、ＤＨＦＲ遺伝子も保持し、メトトレキサート選択／増幅を用いて、ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択を可能にする。選択されたトランスフェクト宿主細胞は、抗体重鎖及び軽鎖の発現を可能にするために培養され、インタクトな抗体が培養培地から回収される。組換え発現ベクターの作製、宿主細胞のトランスフェクト、トランスフェクタントの選択、宿主細胞の培養及び培養培地からの抗体の回収には、標準的な分子生物学技術が使用される。更に本開示は、本開示の組換え抗体が製造されるまで、本開示のトランスフェクトされた宿主細胞を好適な培養培地中で培養することによって、組換え抗ＲＯＲ１抗体又は抗ＣＤ３抗体を作製する方法を提供する。本方法は、組換え抗体を培養培地から単離することを更に含んでいてもよい。
抗ＲＯＲ１抗体
幾つかの実施形態では、本開示は、ＲＯＲ１ Ｉｇ様ドメインのＣ末端においてＲＯＲ１と結合する抗体を提供する。本明細書に開示される抗体は、幾つかの実施形態では、高い細胞結合能を有し、及び／又は低い内在化の割合（例えば、細胞に基づくアッセイにおいて測定）によって特徴付けられる。
幾つかの実施形態では、本開示は、ＲＯＲ１ Ｉｇ様ドメインのＣ末端においてＲＯＲ１と結合する抗体を提供する。本明細書に開示される抗体は、幾つかの実施形態では、高い細胞結合能を有し、及び／又は低い内在化の割合（例えば、細胞に基づくアッセイにおいて測定）によって特徴付けられる。
幾つかの実施形態では、本開示は、ＲＯＲ１と特異的に結合する単離された抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントを開示する。更なる実施形態では、抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３である６つのＣＤＲのセットを含んでなり、
ＣＤＲ－Ｈ１は、ＲＳＷＭＮ（配列番号１）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｈ２は、ＲＩＹＰＧＮＧＤＩＫＹＮＧＮＦＫＧ（配列番号２）又はＲＩＹＰＧＮＡＤＩＫＹＮＡＮＦＫＧ（配列番号４）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｈ３は、ＩＹＹＤＦＹＹＡＬＤＹ（配列番号３）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｌ１は、ＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＴ（配列番号５）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｌ２は、ＹＴＳＴＬＱＰ（配列番号６）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｌ３は、ＬＱＹＤＳＬＬＷＴ（配列番号７）の配列を含んでなり、
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングにより定義される。
ＣＤＲ－Ｈ１は、ＲＳＷＭＮ（配列番号１）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｈ２は、ＲＩＹＰＧＮＧＤＩＫＹＮＧＮＦＫＧ（配列番号２）又はＲＩＹＰＧＮＡＤＩＫＹＮＡＮＦＫＧ（配列番号４）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｈ３は、ＩＹＹＤＦＹＹＡＬＤＹ（配列番号３）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｌ１は、ＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＴ（配列番号５）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｌ２は、ＹＴＳＴＬＱＰ（配列番号６）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｌ３は、ＬＱＹＤＳＬＬＷＴ（配列番号７）の配列を含んでなり、
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングにより定義される。
幾つかの実施形態では、抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＫａｂａｔナンバリングによるＨ３１－Ｈ３５、Ｈ５０－Ｈ６５及びＨ９５－Ｈ１０２の位置に、（ｉ）配列番号１、２、３；又は（ｉｉ）配列番号１、４、３からなる群より選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列を含んでなる。
１つの実施形態では、抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＫａｂａｔナンバリングによるＬ２４～３４、Ｌ５０～５６及びＬ８９～９７の位置に、それぞれＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３について、配列番号５、６及び７のアミノ酸配列を含んでなる。
特定の実施形態では、抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＫａｂａｔナンバリングによるＧ５５Ａ及びＧ６１Ａの突然変異をＶＨドメイン中に含んでなる。幾つかの実施形態では、突然変異は、抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントにおけるアスパラギンの脱アミド化の傾向を小さくする。幾つかの実施形態では、これらの突然変異を有する抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、突然変異のない親抗体に比べて高い安定性を有する。
幾つかの実施形態では、抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１～３及び５～７のＣＤＲ配列に、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、多くとも５つの残基の改変を含んでなる。幾つかの実施形態では、抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１、４、３及び５～７のＣＤＲ配列に、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、多くとも５つの残基の改変を含んでなる。アミノ酸改変は、アミノ酸の置換、欠失及び／又は付加（例えば、保存的置換）であってもよい。
１つの実施形態では、本開示による抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下のＶＨ／ＶＬ配列対：配列番号８／９、１７／９、１０／１３、１０／１４、１０／１５、１０／１６、１１／１３、１１／１４、１１／１５、１１／１６、１２／１３、１２／１４、１２／１５、１２／１６及び２１／１３からなる群より選択される、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖可変ドメインＶＬのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を含んでなる。ＣＤＲは、最も広いＣＤＲ定義スキーム（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＩＭＧＴの定義）を用いて当業者により定義され得る。
１つの実施形態では、本開示による抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖可変ドメインＶＬを含んでなり、
ＶＨドメインは、配列番号８若しくは１７、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列、の配列を含んでなり、及び／又は
ＶＬドメインは、配列番号９、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列、の配列を含んでなる。
ＶＨドメインは、配列番号８若しくは１７、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列、の配列を含んでなり、及び／又は
ＶＬドメインは、配列番号９、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列、の配列を含んでなる。
別の実施形態では、本開示による抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖可変ドメインＶＬを含んでなり、
ＶＨドメインは、配列番号１０～１２及び２１から選択される配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなり、並びに／或いは
ＶＬドメインは、配列番号１３～１６から選択される配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなる。
ＶＨドメインは、配列番号１０～１２及び２１から選択される配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなり、並びに／或いは
ＶＬドメインは、配列番号１３～１６から選択される配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなる。
幾つかの実施形態では、抗ＲＯＲ１抗体は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ配列を含んでなり、参照配列と比べて置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含みつつも、同等であるか又は改善された結合特性（例えば、オフレート及び／又は内在化の割合）でＲＯＲ１に結合する能力を保持する。幾つかの実施形態では、配列番号８、１７又は配列番号１０～１２若しくは２１において、合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある実施形態では、置換、挿入又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（即ち、ＦＲ内）で生じる。場合により、抗ＲＯＲ１抗体は、配列の翻訳後修飾を含む配列番号８、１７又は配列番号１０～１２若しくは２１のＶＨ配列を含んでなる。特定の実施形態では、ＶＨは、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２／４のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ－Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含んでなる。幾つかの実施形態では、ＶＨ配列は、ヒト化ＶＨ配列である。
幾つかの実施形態では、抗ＲＯＲ１抗体は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬ配列を含んでなり、参照配列と比べて置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含みつつも、同等であるか又は改善された結合特性（例えば、オフレート及び／又は内在化の割合）でＲＯＲ１に結合する能力を保持する。幾つかの実施形態では、配列番号１３において合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある実施形態では、置換、挿入又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（即ち、ＦＲ内）に生じる。場合により、抗ＲＯＲ１抗体は、その配列の翻訳後修飾を含む配列番号１３のＶＬ配列を含んでなる。特定の実施形態では、ＶＬ配列は、（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ－Ｌ１、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ－Ｌ３から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含んでなる。幾つかの実施形態では、ＶＬ配列は、ヒト化ＶＬ配列である。
１つの実施形態では、本開示による抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２１を含んでなるか又は配列番号２１からなる重鎖可変ドメインＶＨ、及び配列番号１３を含んでなるか又は配列番号１３からなる軽鎖可変ドメインＶＬを含んでなる。
１つの実施形態では、本開示による単離された抗ＲＯＲ１抗体又は抗原結合フラグメントは、キメラ抗体又はヒト化抗体である。幾つかの実施形態では、抗ＲＯＲ１抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体である。
幾つかの実施形態では、本開示による単離されたヒト化抗ＲＯＲ１抗体又は抗原結合フラグメントは、結合特性を改良するためにフレームワーク領域の位置に１以上の復帰突然変異を含んでなる。幾つかの実施形態では、本開示によるヒト化抗ＲＯＲ１抗体又は抗原結合フラグメントのＶＨドメインは、Ｋａｂａｔナンバリングにより、ヒトから、以下：１番の位置のＧｌｕ（１Ｅ）、２７番の位置のＴｙｒ（２７Ｙ）、９４番の位置のＨｉｓ（９４Ｈ）、並びに、場合により、３８番の位置のＬｙｓ（３８Ｋ）、４８番の位置のＩｌｅ（４８Ｉ）、６６番の位置のＬｙｓ（６６Ｋ）及び６７番の位置のＡｌａ（６７Ａ）のうち１以上の残基、への復帰突然変異を含んでなる。１つの実施形態では、本開示によるヒト化抗ＲＯＲ１抗体又は抗原結合フラグメントのＶＬドメインは、Ｋａｂａｔナンバリングにより、ヒトから、以下：７１番の位置のＴｙｒ（７１Ｙ）、及び、場合により、４番の位置のＬｅｕ（４Ｌ）、６９番の位置のＡｒｇ（６９Ｒ）、４９番の位置のＨｉｓ（４９Ｈ）、５８番の位置のＩｌｅ（５８Ｉ）のうち１以上の残基、への復帰突然変異を含んでなる。
１つの実施形態では、本開示による単離された抗ＲＯＲ１抗体又は抗原結合フラグメントは、ＶＨドメイン中に以下：（ｉ）１Ｅ、２７Ｙ及び９４Ｈ、（ｉｉ）１Ｅ、２７Ｙ、４８Ｉ、６７Ａ及び９４Ｈ、（ｉｉｉ）１Ｅ、２７Ｙ、３８Ｋ、４８Ｉ、６７Ａ、６６Ｋ及び９４Ｈ（総てＫａｂａｔナンバリングによる）、からなる群より選択される復帰突然変異アミノ酸残基；並びに／又は、ＶＬドメイン中に以下：（ｉ）７１Ｙ；（ｉｉ）４９Ｈ、６９Ｒ及び７１Ｙ、（ｉｉｉ）４Ｌ、６９Ｒ及び７１Ｙ、並びに（ｉｖ）４Ｌ、４９Ｈ、５８Ｉ、６９Ｒ及び７１Ｙ（総てＫａｂａｔナンバリングに従う）、からなる群より選択される復帰突然変異アミノ酸残基、を含んでなるヒト化抗体である。
１つの実施形態では、本開示による単離された抗ＲＯＲ１抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔナンバリングにより、ＶＨドメイン中に１Ｅ、２７Ｙ及び９４Ｈのアミノ酸残基、ＶＬドメイン中に７１Ｙのアミノ酸残基を含んでなるヒト化抗体である。更なる実施形態では、本開示による単離された抗ＲＯＲ１抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔナンバリングにより、ＶＨドメイン中にＧ５５Ａ及びＧ６１Ａの突然変異を更に含んでなる。
幾つかの実施形態では、本開示による単離された抗ＲＯＲ１抗体又は抗原結合フラグメントは、以下の表からなる群より選択されるＶＨ配列とＶＬ配列の組合せ：
を含んでなる。
幾つかの実施形態では、上記抗体は、配列番号２１の配列を含んでなるか又は配列番号２１の配列からなるＶＨドメイン、及び配列番号１３の配列を含んでなるか又は配列番号１３の配列からなるＶＬドメインを含んでなる。
本開示による抗ＲＯＲ１抗体又は抗原結合フラグメントの幾つかの実施形態では、上記抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域を含んでなり、このＦｃ領域は、天然型の又は変異型のＦｃ領域であってもよい。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＤ由来のヒトＦｃ領域である。抗体の有用性に応じて、少なくとも１つのエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ）を変化させる（例えば、低減させるか又は消失させる）ために変異型Ｆｃ領域を使用することが所望され得る。幾つかの実施形態では、本開示は、少なくとも１つのエフェクター機能を変化させるための１以上の突然変異（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ）を有するＦｃ領域を含んでなる抗ＲＯＲ１抗体又は抗原結合フラグメントを提供する。
幾つかの実施形態では、本開示による抗ＲＯＲ１抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；又は単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）であってもよい。
１つの実施形態では、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＲＯＲ１細胞外ドメイン又はその一部に結合する。幾つかの実施形態では、ＲＯＲ１細胞外ドメインは、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ Ｑ０１９７３－１のヒトＲＯＲ１タンパク質のアミノ酸配列(squence)Ｑ３０－Ｙ４０６、或いは、配列番号４１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなる。
１つの実施形態では、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＲＯＲ１ Ｉｇ様ドメインのＣ末端においてＲＯＲ１と結合する。１つの実施形態では、上記抗体は、配列番号８及び９のＶＨ／ＶＬ配列(seqeunce)対を有する抗体（例えば、ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４）と同じエピトープにおいてＲＯＲ１と結合する。１つの実施形態では、上記抗体は、ＲＯＲ１との結合について、配列番号４２と４３のＶＨ／ＶＬ配列対を有する抗体（例えば、国際公開第２０１２／０９７３１３号のＤ１０抗体）と競合する。
ある実施形態では、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、バイオレイヤー干渉又は表面プラズモン共鳴によって測定した場合、ヒトＲＯＲ１に対するオンレート定数（ｋｏｎ）が少なくとも１×１０４Ｍ－１ｓ－１、少なくとも３×１０４Ｍ－１ｓ－１、少なくとも５×１０４Ｍ－１ｓ－１、少なくとも７×１０４Ｍ－１ｓ－１、少なくとも９×１０４Ｍ－１ｓ－１、少なくとも１×１０５Ｍ－１ｓ－１である。
別の実施形態では、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉によって測定した場合、ヒトＲＯＲ１に対するオフレート定数（ｋｏｆｆ）が５×１０－３ｓ－１未満、３×１０-３ｓ－１未満、２×１０－３ｓ－１未満、１×１０－３ｓ－１未満である。更なる実施形態では、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体であり、かつ、ヒトＲＯＲ１に対するｋｏｆｆが同じ抗体フォーマットにおける配列番号８と９のＶＨ／ＶＬ配列対を有する抗体のヒトＲＯＲ１に対するｋｏｆｆ値の約１～１００％（例えば、約３～５０％）である。オフレートは、抗体のその抗原との結合持続時間を特徴付けるために使用されてもよい。一般的に、長いオフレートは、形成された複合体の遅い解離と相関し、短いオフレートは、速い解離と相関する。１つの実施形態では、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、国際公開第２０１２／０９７３１３号に記載されるとおりのＤ１０に関して見られたよりも遅いオフレートを有し、標的ＲＯＲ１により長く結合して留まり、これはＲＯＲ１発現（「ＲＯＲ１＋」）腫瘍細胞へのエフェクター分子の動員の促進に有利となり得る。
１つの実施形態では、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＲＯＲ１に対して、ナノモル（１０－７～１０－９）範囲（例えば、８×１０－７Ｍ未満、５×１０－７Ｍ未満、３×１０－７Ｍ未満、１×１０－７Ｍ未満、８×１０－８Ｍ未満、５×１０－８Ｍ未満、３×１０－８Ｍ未満、２×１０－８Ｍ未満、１×１０－８Ｍ未満、８×１０－９Ｍ未満、６×１０－９Ｍ未満、４×１０－９Ｍ未満、２×１０－９Ｍ未満、又は１×１０－９Ｍ未満）の解離定数（ＫＤ）を有する。
１つの実施形態では、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＲＯＲ１＋標的細胞（ＲＯＲ１を発現する、ＣＨＯ細胞株又は骨髄腫細胞株等）上に提示されるＲＯＲ１と特異的に結合する。細胞に基づくアッセイにおいてフローサイトメトリーにより測定されるように、抗ＲＯＲ１抗体は、ＲＯＲ１＋細胞に対して、国際公開第２０１２／０９７３１３号に記載されるとおりのＤ１０に関して見られたものよりも強い結合能を示す。幾つかの実施形態では、細胞結合能は、抗体の飽和濃度又は約１００ｎＭの抗体濃度で検出されるＭＦＩにより反映される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１抗体又は抗原結合フラグメントは、標的細胞上に提示されるＲＯＲ１に対して、配列番号４４と４５のＶＨ／ＶＬ配列対を有する抗体（国際公開第２０１４／１６７０２２号の抗体Ｒ１２等）、又はＲＯＲ１のＩｇ及びＦｚドメインの接合部におけるＲ１２と同じエピトープに結合する抗体に比べて高い結合能を示す。１つの実施形態では、ＲＯＲ１発現細胞に対する抗体の結合能は、実施例１．３に記載されるように細胞に基づくアッセイで測定される。
幾つかの実施形態では、期待されるとおり、ナノモル範囲でＲＯＲ１に対する親和性が比較的低いが強い細胞表面結合能を有する本明細書に記載の抗ＲＯＲ１抗体は、腫瘍への分布に有利であり得、及び／又はより高密度の標的を発現する腫瘍細胞のより選択的な標的化につながり得る。
１つの実施形態では、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＲＯＲ１発現細胞の細胞表面に結合した際に示される内在化が最小限である。１つの実施形態では、内在化の割合は、細胞に基づくアッセイで測定した場合、多くとも２０％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％若しくは１０％であるか、又は抗体が内在化しない。内在化の割合は、フローサイトメトリーにより検出される場合、平均蛍光強度（ＭＦＩ）において、３７℃で２時間のインキュベーション後のＲＯＲ１発現細胞の表面に結合する抗体のパーセンテージが４℃で同じ時間維持された対照に対して低下することが反映され得る。１つの実施形態では、抗ＲＯＲ１抗体の内在化(internlization)は、ＲＯＲ１発現骨髄腫細胞株を用いて特徴付けられる。１つの実施形態では、ＭＦＩが検出される前に、試験抗体とＲＯＲ１発現細胞とのインキュベーションが細胞の細胞表面ＲＯＲ１に抗体を結合させるために一定の時間（例えば、４℃で３０分間）実施され、その後、内在化させるために細胞が３７℃で２時間インキュベートされるか又は対照とするために４℃で同じ時間維持される。１つの実施形態では、内在化の割合は、フェニルアルシンオキシド（ＰＡＯ）等の内在化阻害剤の存在下、３７℃でのインキュベーションにおいて測定された内在化の割合に対して、較正される。１つの実施形態では、内在化の程度は、実施例８に記載されるとおりの細胞に基づくアッセイにおいて測定される。
１つの実施形態では、この抗体は、ＲＯＲ発現細胞の細胞表面上において、ＲＯＲ１がそのリガンドであるＷｎｔ５ａに結合しないように遮断し得る。別の実施形態では、この抗体は、ＲＯＲ１／ｗｎｔ５シグナル伝達の阻害に使用され得る。更なる実施形態では、この抗体は、ＲＯＲ１／ｗｎｔ５Ａ経路に関連するガンの成長及び転移の阻害に使用され得る。
抗ＣＤ３抗体
本開示はまた、ヒトＣＤ３と結合することが可能な抗体も提供する。
本開示はまた、ヒトＣＤ３と結合することが可能な抗体も提供する。
幾つかの実施形態では、本開示による抗ＣＤ３抗体は、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の６つのＣＤＲのセットを含んでなり、
ＣＤＲ－Ｈ１は、ＮＹＹＶＨ（配列番号２５）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｈ２は、ＷＩＳＰＧＳＤＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２６）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｈ３は、ＤＤＹＧＮＹＹＦＤＹ（配列番号２７）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｌ１は、ＫＳＳＱＳＬＬＮＡＲＴＲＫＮＹＬＡ（配列番号２８）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｌ２は、ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号２９）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｌ３は、ＫＱＳＹＩＬＲＴ（配列番号３０）の配列を含んでなり、
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングにより定義される。
ＣＤＲ－Ｈ１は、ＮＹＹＶＨ（配列番号２５）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｈ２は、ＷＩＳＰＧＳＤＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２６）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｈ３は、ＤＤＹＧＮＹＹＦＤＹ（配列番号２７）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｌ１は、ＫＳＳＱＳＬＬＮＡＲＴＲＫＮＹＬＡ（配列番号２８）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｌ２は、ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号２９）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｌ３は、ＫＱＳＹＩＬＲＴ（配列番号３０）の配列を含んでなり、
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングにより定義される。
幾つかの実施形態では、本願による抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメントは、
配列番号２２若しくは２３の配列、又はそれと少なくとも８０％～９０％若しくは９５％～９９％の同一性を有する配列を含んでなるＶＨドメイン、及び／或いは
配列番号２４の配列、又はそれと少なくとも８０％～９０％若しくは９５％～９９％の同一性を有する配列を含んでなるＶＬドメイン
を含んでなる。
配列番号２２若しくは２３の配列、又はそれと少なくとも８０％～９０％若しくは９５％～９９％の同一性を有する配列を含んでなるＶＨドメイン、及び／或いは
配列番号２４の配列、又はそれと少なくとも８０％～９０％若しくは９５％～９９％の同一性を有する配列を含んでなるＶＬドメイン
を含んでなる。
幾つかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２２の配列を含んでなるＶＨドメイン及び配列番号２４の配列を含んでなるＶＬドメインを含んでなる。他の実施形態において、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２３の配列を含んでなるＶＨドメイン及び配列番号２４の配列を含んでなるＶＬドメインを含んでなる。
幾つかの実施形態では、本開示による抗ＲＯＲ１抗体又は本開示による抗ＣＤ３抗体は、当技術分野において十分に確立された技術によって、同じ標的抗原を認識する誘導体結合タンパク質を作製するために使用されてもよい。このような誘導体は、例えば、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント（Ｆａｂ）、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及びジスルフィド結合Ｆｖであってもよい。このような誘導体は、例えば、本開示による抗ＲＯＲ１抗体又は本開示による抗ＣＤ３抗体を含んでなる融合タンパク質又は複合体であってもよい。融合タンパク質は、多重特異性抗体又はＣＡＲ分子であってもよい。複合体は、抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）、又は放射性同位元素等の検出剤と結合された抗体であってもよい。
ＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性結合タンパク質
別の側面において、本開示は、ＲＯＲ１及びＣＤ３の両方に結合することが可能な、ＲＯＲ１／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質（特に、Ｆａｂｓ－ｉｎ－Ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリン（ＦＩＴ－Ｉｇ）及び一価非対称タンデムＦａｂ二重特異性抗体（ＭＡＴ－Ｆａｂ））を提供する。ＦＩＴ－Ｉｇ又はＭＡＴ－Ｆａｂ中の各可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）は、標的抗原（即ち、ＲＯＲ１又はＣＤ３）の一方と結合する１以上の「親」モノクローナル抗体から得られてもよい。ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、本明細書に開示されるとおりの抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体及び抗ＣＤ３モノクローナル抗体の可変ドメイン配列を用いて作出してもよい。例えば、親抗体は、ヒト化抗体である。
別の側面において、本開示は、ＲＯＲ１及びＣＤ３の両方に結合することが可能な、ＲＯＲ１／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質（特に、Ｆａｂｓ－ｉｎ－Ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリン（ＦＩＴ－Ｉｇ）及び一価非対称タンデムＦａｂ二重特異性抗体（ＭＡＴ－Ｆａｂ））を提供する。ＦＩＴ－Ｉｇ又はＭＡＴ－Ｆａｂ中の各可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）は、標的抗原（即ち、ＲＯＲ１又はＣＤ３）の一方と結合する１以上の「親」モノクローナル抗体から得られてもよい。ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、本明細書に開示されるとおりの抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体及び抗ＣＤ３モノクローナル抗体の可変ドメイン配列を用いて作出してもよい。例えば、親抗体は、ヒト化抗体である。
本開示のある側面は、ＦＩＴ－Ｉｇ分子又はＭＡＴ－Ｆａｂ分子において望まれる少なくとも１つ以上の特性を有する親抗体を選択することに関する。ある実施形態では、抗体特性は、抗原特異性、抗原に対する親和性、解離速度、細胞結合能、内在化の割合、生物学的機能、エピトープ認識、安定性、溶解性、生産効率、免疫原性、薬物動態、バイオアベイラビリティ、組織交差反応性及びオーソロガスな抗原結合からなる群より選択される。
幾つかの実施形態では、本開示による二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ及びＭＡＴ－Ｆａｂタンパク質は、ドメイン間ペプチドリンカーを用いずに構成される。一方、タンデム結合部位を有する多価の操作された免疫グロブリンフォーマットでは、結合部位を空間的に分離するためのフレキシブルリンカーを使用しない限り、隣接する結合部位が互いに干渉する、と当技術分野では一般的に理解されていた。しかしながら、本開示のＲＯＲ１／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ及びＭＡＴ－Ｆａｂについて、本明細書に開示される鎖式に従った免疫グロブリンドメインの配置は、トランスフェクトされた哺乳動物細胞において十分に発現され、適切に集合し、標的抗原であるＲＯＲ１及びＣＤ３と結合する二重特異性で多価の免疫グロブリン様結合タンパク質として分泌されるポリペプチド鎖をもたらすことが判明している。後述する実施例を参照されたい。更に、結合タンパク質から合成リンカー配列を除くことにより、哺乳動物の免疫系によって認識されることが可能な抗原部位の創出を回避することができ、この方法において、リンカーを除去することでＦＩＴ－Ｉｇ及びＭＡＴ－Ｆａｂの免疫原性の可能性が低下し、天然抗体のような循環半減期をもたらし、即ち、ＦＩＴ－Ｉｇ及びＭＡＴ－Ｆａｂは、免疫オプソニン化及び肝臓での捕捉によって急速に除去されない。
幾つかの実施形態では、本願によるＲＯＲｌ×ＣＤ３二重特異性結合タンパク質は、
ａ）ＲＯＲｌと特異的に結合する第１の抗原結合部位；及び
ｂ）ＣＤ３と特異的に結合する第２の抗原結合部位
を含んでなる。
ａ）ＲＯＲｌと特異的に結合する第１の抗原結合部位；及び
ｂ）ＣＤ３と特異的に結合する第２の抗原結合部位
を含んでなる。
１つの実施形態では、本明細書に記載されるとおりの二重特異性結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質のＲＯＲ１結合部位を形成するために、本願による、本明細書に記載される任意の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントに由来するＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の６つのＣＤＲのセットを含んでなる。幾つかの更なる実施形態では、本明細書に記載されるとおりの二重特異性結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質のＲＯＲ１結合部位を形成するために、本願による、本明細書に記載される、任意の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントに由来するＶＨ／ＶＬ対を含んでなる。
１つの実施形態では、本明細書に記載されるとおりの二重特異性結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質のＣＤ３結合部位を形成するために、本願による、本明細書に記載される任意の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメントに由来するＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の６つのＣＤＲのセットを更に含んでなる。幾つかの更なる実施形態では、本明細書に記載されるとおりの二重特異性結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質のＣＤ３結合部位を形成するために、本願による、本明細書に記載される任意の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメントに由来するＶＨ／ＶＬ対を含んでなる。
１つの実施形態では、本願による二重特異性ＲＯＲ１／ＣＤ３結合タンパク質におけるＲＯＲ１結合部位及びＣＤ３結合部位は、それぞれヒト化ＶＨ／ＶＬ配列を含んでなり、ヒト化されている。
二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質
１つの実施形態では、本願によるＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性結合タンパク質は、ＲＯＲ１及びＣＤ３と結合することが可能な二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質である。Ｆａｂｓ－ｉｎ－Ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリン（ＦＩＴ－Ｉｇ）結合タンパク質は、６つのポリペプチド鎖を含んでなり、２つの外部Ｆａｂ結合領域と２つの内部Ｆａｂ結合領域を伴う４つの機能的Ｆａｂ結合領域を有する、単量体の二重特性四価結合タンパク質である。図１０Ａに示されるように、この結合タンパク質は、（外部Ｆａｂ－内部Ｆａｂ－Ｆｃ）×２のフォーマットを採用し、抗原Ａと抗原Ｂの両方に結合する。１つの側面において、本願によるＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性結合タンパク質は、二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質であり、このＦＩＴ－Ｉｇタンパク質の２つのＦａｂドメインは、ＲＯＲｌと特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し；ＦＩＴ－Ｉｇタンパク質の他の２つのＦａｂドメインは、ＣＤ３と特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する。幾つかの実施形態では、本開示によるＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、免疫グロブリンドメイン間にリンカーを用いていない。
１つの実施形態では、本願によるＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性結合タンパク質は、ＲＯＲ１及びＣＤ３と結合することが可能な二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質である。Ｆａｂｓ－ｉｎ－Ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリン（ＦＩＴ－Ｉｇ）結合タンパク質は、６つのポリペプチド鎖を含んでなり、２つの外部Ｆａｂ結合領域と２つの内部Ｆａｂ結合領域を伴う４つの機能的Ｆａｂ結合領域を有する、単量体の二重特性四価結合タンパク質である。図１０Ａに示されるように、この結合タンパク質は、（外部Ｆａｂ－内部Ｆａｂ－Ｆｃ）×２のフォーマットを採用し、抗原Ａと抗原Ｂの両方に結合する。１つの側面において、本願によるＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性結合タンパク質は、二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質であり、このＦＩＴ－Ｉｇタンパク質の２つのＦａｂドメインは、ＲＯＲｌと特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し；ＦＩＴ－Ｉｇタンパク質の他の２つのＦａｂドメインは、ＣＤ３と特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する。幾つかの実施形態では、本開示によるＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、免疫グロブリンドメイン間にリンカーを用いていない。
更なる実施形態では、本開示は、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖を含んでなる二重特異性Ｆａｂｓ－ｉｎ－Ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリン（ＦＩＴ－Ｉｇ）結合タンパク質であって、
（ｉ）ＬＨフォーマットでは、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＡ－ＣＬ－ＶＨＢ－ＣＨ１－Ｆｃを含んでなり、ＣＬは、ＶＨＢに直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＡ－ＣＨ１を含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＢ－ＣＬを含んでなるか；又は
（ｉｉ）ＨＬフォーマットでは、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＡ－ＣＨ１－ＶＬＢ－ＣＬ－Ｆｃを含んでなり、ＣＨ１は、ＶＬＢに直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＡ－ＣＬを含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＢ－ＣＨ１を含んでなり；
ＶＬは、軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは、軽鎖定常ドメインであり、ＶＨは、重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は、重鎖定常ドメインであり、Ｆｃは、免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ１のＦｃ）（例えば、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含んでなるＦｃ）であり、
ＶＬＡ－ＣＬは、ＶＨＡ－ＣＨ１と対合して、第１の抗原Ａと特異的に結合する第１のＦａｂを形成し、ＶＬＢ－ＣＬは、ＶＨＢ－ＣＨ１と対合して、第２の抗原Ｂと特異的に結合する第２のＦａｂを形成し、
第１の抗原Ａは、ＲＯＲ１であり、第２の抗原Ｂは、ＣＤ３であるか、又は、第１の抗原Ａは、ＣＤ３であり、第２の抗原Ｂは、ＲＯＲ１であり、
第１のポリペプチド鎖の２つ、第２のポリペプチド鎖の２つ、及び第３のポリペプチド鎖の２つは、会合してＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質を形成する、
二重特異性Ｆａｂｓ－ｉｎ－Ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリン（ＦＩＴ－Ｉｇ）結合タンパク質を提供する。
（ｉ）ＬＨフォーマットでは、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＡ－ＣＬ－ＶＨＢ－ＣＨ１－Ｆｃを含んでなり、ＣＬは、ＶＨＢに直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＡ－ＣＨ１を含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＢ－ＣＬを含んでなるか；又は
（ｉｉ）ＨＬフォーマットでは、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＡ－ＣＨ１－ＶＬＢ－ＣＬ－Ｆｃを含んでなり、ＣＨ１は、ＶＬＢに直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＡ－ＣＬを含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＢ－ＣＨ１を含んでなり；
ＶＬは、軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは、軽鎖定常ドメインであり、ＶＨは、重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は、重鎖定常ドメインであり、Ｆｃは、免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ１のＦｃ）（例えば、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含んでなるＦｃ）であり、
ＶＬＡ－ＣＬは、ＶＨＡ－ＣＨ１と対合して、第１の抗原Ａと特異的に結合する第１のＦａｂを形成し、ＶＬＢ－ＣＬは、ＶＨＢ－ＣＨ１と対合して、第２の抗原Ｂと特異的に結合する第２のＦａｂを形成し、
第１の抗原Ａは、ＲＯＲ１であり、第２の抗原Ｂは、ＣＤ３であるか、又は、第１の抗原Ａは、ＣＤ３であり、第２の抗原Ｂは、ＲＯＲ１であり、
第１のポリペプチド鎖の２つ、第２のポリペプチド鎖の２つ、及び第３のポリペプチド鎖の２つは、会合してＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質を形成する、
二重特異性Ｆａｂｓ－ｉｎ－Ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリン（ＦＩＴ－Ｉｇ）結合タンパク質を提供する。
本願による二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質の幾つかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＡ－ＣＬ－ＶＨＢ－ＣＨ１－Ｆｃを含んでなり、抗原Ａは、ＲＯＲ１であり、抗原Ｂは、ＣＤ３であるか、又は、抗原Ａは、ＣＤ３であり、抗原Ｂは、ＲＯＲ１である。
幾つかの実施形態では、ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質におけるＶＬ－ＣＬとＶＨ－ＣＨ１が対合することにより形成された（例えば、ＡがＲＯＲ１である場合、ＶＬＡ－ＣＬとＶＨＡ－ＣＨ１により形成されたか；又は、ＢがＲＯＲ１である場合、ＶＬＢ－ＣＬとＶＨＢ－ＣＨ１により形成された）ＲＯＲ１に結合するＦａｂは、二重特異性結合タンパク質のＲＯＲ１結合部位を形成するために、本願による、本明細書に記載される任意の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントに由来する６つのＣＤＲ（即ち、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３）のセットを含んでなる。幾つかの更なる実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３はそれぞれ、配列番号１、２、３及び５、６、７の配列；又は配列番号１、４、３及び５、６、７の配列を含んでなる。
幾つかの実施形態では、ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質のＲＯＲ１に結合するＦａｂは、本願による、本明細書に記載される任意の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントに由来するＶＨ／ＶＬ対を含んでなる。幾つかの更なる実施形態では、ＶＨ／ＶＬ対は、以下のＶＨ／ＶＬ配列対：配列番号８／９、１７／９、１０／１３、１０／１４、１０／１５、１０／１６、１１／１３、１１／１４、１１／１５、１１／１６、１２／１３、１２／１４、１２／１５、１２／１６及び２１／１３からなる群より選択される配列、又はそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有する配列を含んでなる。幾つかの実施形態では、ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質のＲＯＲ１に結合するＦａｂは、配列番号２１のＶＨ配列及び配列番号１３のＶＬ配列を含んでなる。
幾つかの実施形態では、ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質におけるＶＬ－ＣＬとＶＨ－ＣＨ１が対合することにより形成された（例えば、ＡがＣＤ３である場合、ＶＬＡ－ＣＬとＶＨＡ－ＣＨ１により形成されたか；又は、ＢがＣＤ３である場合、ＶＬＢ－ＣＬとＶＨＢ－ＣＨ１により形成された）ＣＤ３に結合するＦａｂは、二重特異性結合タンパク質のＣＤ３結合部位を形成するために、本願による、本明細書に記載される任意の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメントに由来する６つのＣＤＲ（即ち、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３）のセットを含んでなる。幾つかの実施形態では、ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質におけるＶＬ－ＣＬとＶＨ－ＣＨ１が対合することにより形成されたＣＤ３に結合するＦａｂは、６つのＣＤＲのセットを含んでなり、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３はそれぞれ、配列番号２５、２６、２７及び２８、２９、３０の配列を含んでなる。幾つかの更なる実施形態では、ＣＤ３に結合するＦａｂは、配列番号２２及び２４の配列、又はそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有する配列；或いは、配列番号２３及び２４の配列、又はそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有する配列を含んでなるＶＨ／ＶＬ対を含んでなる。
更なる実施形態では、本開示は、第１、第２及び第３のポリペプチド鎖を含んでなる、二重特異性Ｆａｂｓ－ｉｎ－Ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリン（ＦＩＴ－Ｉｇ）結合タンパク質を提供し、
（ｉ）ＬＨフォーマットでは、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＡ－ＣＬ－ＶＨＢ－ＣＨ１－Ｆｃを含んでなり、ＣＬは、ＶＨＢに直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＡ－ＣＨ１を含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＢ－ＣＬを含んでなるか；又は
（ｉｉ）ＨＬフォーマットでは、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＡ－ＣＨ１－ＶＬＢ－ＣＬ－Ｆｃを含んでなり、ＣＨ１は、ＶＬＢに直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＡ－ＣＬを含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＢ－ＣＨ１を含んでなり；
ＶＬは、軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは、軽鎖定常ドメインであり、ＶＨは、重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は、重鎖定常ドメインであり、Ｆｃは、免疫グロブリンＦｃ領域であり、Ａは、ＲＯＲ１のエピトープであり、Ｂは、ＣＤ３のエピトープであるか、又は、Ａは、ＣＤ３のエピトープであり、Ｂは、ＲＯＲ１のエピトープである。本開示によれば、このようなＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、ＲＯＲ１とＣＤ３の両方に結合する。
（ｉ）ＬＨフォーマットでは、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＡ－ＣＬ－ＶＨＢ－ＣＨ１－Ｆｃを含んでなり、ＣＬは、ＶＨＢに直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＡ－ＣＨ１を含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＢ－ＣＬを含んでなるか；又は
（ｉｉ）ＨＬフォーマットでは、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＡ－ＣＨ１－ＶＬＢ－ＣＬ－Ｆｃを含んでなり、ＣＨ１は、ＶＬＢに直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＡ－ＣＬを含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＢ－ＣＨ１を含んでなり；
ＶＬは、軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは、軽鎖定常ドメインであり、ＶＨは、重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は、重鎖定常ドメインであり、Ｆｃは、免疫グロブリンＦｃ領域であり、Ａは、ＲＯＲ１のエピトープであり、Ｂは、ＣＤ３のエピトープであるか、又は、Ａは、ＣＤ３のエピトープであり、Ｂは、ＲＯＲ１のエピトープである。本開示によれば、このようなＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、ＲＯＲ１とＣＤ３の両方に結合する。
幾つかの実施形態では、このようなＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質のＦａｂフラグメントは、抗原ＲＯＲ１及びＣＤ３の一方に結合する親抗体由来のＶＬＡ－ＣＬ及びＶＨＡ－ＣＨ１ドメインを組み込み、かつ、抗原ＲＯＲ１及びＣＤ３の他方に結合する異なる親抗体由来のＶＬＢ－ＣＬ及びＶＨＢ－ＣＨ１ドメインを組み込んでいる。幾つかの実施形態では、ＶＨ－ＣＨ１：：ＶＬ－ＣＬの対合は、ＲＯＲ１及びＣＤ３の両方を認識するタンデムＦａｂ部分を生じる。
本開示によれば、ＲＯＲ１／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、第１、第２及び第３のポリペプチド鎖を含んでなり、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＲＯＲ１－ＣＬ－ＶＨＣＤ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含んでなり、ＣＬは、ＶＨＣＤ３に直接融合され、第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＲＯＲ１－ＣＨ１を含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＣＤ３－ＣＬを含んでなる。代替的な実施形態では、ＲＯＲ１／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、第１、第２及び第３のポリペプチド鎖を含んでなり、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＲＯＲ１－ＣＨ１－ＶＬＣＤ３－ＣＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含んでなり、ＣＨ１は、ＶＬＣＤ３に直接融合され、第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＲＯＲ１－ＣＬを含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＣＤ３－ＣＨ１を含んでなる。幾つかの実施形態では、ＶＬＲＯＲ１は、抗ＲＯＲ１抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは、軽鎖定常ドメインであり、ＶＨＲＯＲ１は、抗ＲＯＲ１抗体の重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は、重鎖定常ドメインであり、ＶＬＣＤ３は、抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨＣＤ３は、抗ＣＤ３抗体の重鎖可変ドメインであり；場合により、ドメインＶＬＣＤ３－ＣＬは、抗ＣＤ３親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインＶＨＣＤ３－ＣＨ１は、抗ＣＤ３親抗体の重鎖可変及び重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインＶＬＲＯＲ１－ＣＬは、抗ＲＯＲ１親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインＶＨＲＯＲ１－ＣＨ１は、抗ＲＯＲ１親抗体の重鎖可変ドメイン及び重鎖定常ドメインと同じである。
ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質に関する前述の式において、Ｆｃ領域は、天然の又は変異型のＦｃ領域であってもよい。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＤ由来のヒトＦｃ領域である。特定の実施形態では、Ｆｃは、ＩｇＧ１由来のヒトＦｃ、又は少なくとも１つのＦｃエフェクター機能（例えば、ＦｃγＲへのＦｃの結合、ＡＤＣＣ及び／若しくはＣＤＣ）を低減若しくは消失するための１以上の突然変異を含んでなる改変型ヒトＦｃである。これらの突然変異は、例えば、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによりナンバリング）であってもよい。１つの実施形態では、Ｆｃ領域は、以下の表８（配列番号３１のａａ１０４～ａａ２２７）等のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの突然変異を有するヒトＩｇＧ１のものである。１つの実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号３１のａａ１０４～ａａ２２７の配列、又はそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなる。
本開示によるＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質の幾つかの実施形態では、ＣＨ１、ＣＬ及びＦｃドメインは、ヒト配列のものであるか、又はヒト配列に由来する。本開示によるＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質の幾つかの実施形態では、ＣＨ１は、例えば、配列番号３３の配列、又はそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を有するヒトＩｇＧ１定常ＣＨ１ドメインである。ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質に関する前述の式では、ＣＬは、例えば、配列番号３２の配列、又はそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を有するヒト定常κＣＬドメインである。
ある実施形態では、本開示のＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、親抗体の１以上の特性を保持する。幾つかの実施形態では、ＦＩＴ－Ｉｇは、標的抗原（即ち、ＣＤ３及びＲＯＲ１）に対して、親抗体のそれに相当する結合親和性を保持し、これは、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉によって測定した場合に、ＲＯＲ１及びＣＤ３抗原標的に対するＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質の結合親和性が、それらの各標的抗原に対する親抗体の結合親和性と比較して１０倍を超える変化ではないことを意味する。
１つの実施形態では、本開示のＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、ＲＯＲ１及びＣＤ３と結合し、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖を含んでなり、
第１のポリペプチド鎖は、配列番号３４若しくは３７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなり、
第２のポリペプチド鎖は、配列番号３５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなり、かつ
第３のポリペプチド鎖は、配列番号３６のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなる。
第１のポリペプチド鎖は、配列番号３４若しくは３７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなり、
第２のポリペプチド鎖は、配列番号３５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなり、かつ
第３のポリペプチド鎖は、配列番号３６のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなる。
１つの実施形態では、本開示のＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、ＲＯＲ１及びＣＤ３と結合し、配列番号３４若しくは３７の配列を含んでなるか、配列番号３４若しくは３７の配列から本質的になるか、又は配列番号３４若しくは３７の配列からなる、第１のポリペプチド鎖；配列番号３５の配列を含んでなるか、配列番号３５の配列から本質的になるか、又は配列番号３５の配列からなる、第２のポリペプチド鎖；及び、配列番号３６の配列を含んでなるか、配列番号３６の配列から本質的になるか、又は配列番号３６の配列からなる、第３のポリペプチド鎖；を含んでなる。
二重特異性ＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質
１つの実施形態では、本願によるＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性結合タンパク質は、ＲＯＲ１及びＣＤ３と結合することが可能な二重特異性ＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質である。一価非対称タンデムＦａｂ（ＭＡＴ－Ｆａｂ）二重特異性結合タンパク質は、４つのポリペプチド鎖を含んでなり、タンデムの２つの機能的Ｆａｂ結合領域を有する、単量体の二重特異性二価結合タンパク質である。図１０Ｂに示されるように、この結合タンパク質は、外部Ｆａｂ－内部Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆｃ二量体フォーマットを採用し、抗原Ａと抗原Ｂの両方に結合する。幾つかの実施形態では、本願によるＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性結合タンパク質は、二重特異性ＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質であり、ＭＡＴ－Ｆａｂタンパク質の一方のＦａｂドメインは、ＲＯＲｌと特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し；ＭＡＴ－Ｆａｂタンパク質の他方のＦａｂドメインは、ＣＤ３と特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する。
１つの実施形態では、本願によるＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性結合タンパク質は、ＲＯＲ１及びＣＤ３と結合することが可能な二重特異性ＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質である。一価非対称タンデムＦａｂ（ＭＡＴ－Ｆａｂ）二重特異性結合タンパク質は、４つのポリペプチド鎖を含んでなり、タンデムの２つの機能的Ｆａｂ結合領域を有する、単量体の二重特異性二価結合タンパク質である。図１０Ｂに示されるように、この結合タンパク質は、外部Ｆａｂ－内部Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆｃ二量体フォーマットを採用し、抗原Ａと抗原Ｂの両方に結合する。幾つかの実施形態では、本願によるＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性結合タンパク質は、二重特異性ＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質であり、ＭＡＴ－Ｆａｂタンパク質の一方のＦａｂドメインは、ＲＯＲｌと特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し；ＭＡＴ－Ｆａｂタンパク質の他方のＦａｂドメインは、ＣＤ３と特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する。
更なる実施形態では、本開示は、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖を含んでなる二重特異性一価非対称タンデムＦａｂ（ＭＡＴ－Ｆａｂ）結合タンパク質であって、
（ｉ）ＬＨフォーマットでは、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＡ－ＣＬ－ＶＨＢ－ＣＨ１－Ｆｃを含んでなり、ＣＬは、ＶＨＢに直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＡ－ＣＨ１を含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＢ－ＣＬを含んでなり；第４のポリペプチド鎖は、Ｆｃを含んでなるか；又は
（ｉｉ）ＨＬフォーマットでは、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＡ－ＣＨ１－ＶＬＢ－ＣＬ－Ｆｃを含んでなり、ＣＨ１は、ＶＬＢに直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＡ－ＣＬを含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＢ－ＣＨ１を含んでなり；第４のポリペプチド鎖は、Ｆｃを含んでなり；
ＶＬは、軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは、軽鎖定常ドメインであり、ＶＨは、重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は、重鎖定常ドメインであり、Ｆｃは、免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ１のＦｃ）（例えば、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含んでなるＦｃ）であり、
ＶＬＡ－ＣＬは、ＶＨＡ－ＣＨ１と対合して、第１の抗原Ａと特異的に結合する第１のＦａｂを形成し、ＶＬＢ－ＣＬは、ＶＨＢ－ＣＨ１と対合して、第２の抗原Ｂと特異的に結合する第２のＦａｂを形成し、
第１の抗原Ａは、ＲＯＲ１であり、第２の抗原Ｂは、ＣＤ３であるか、又は、第１の抗原Ａは、ＣＤ３であり、第２の抗原Ｂは、ＲＯＲ１であり、
第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖は、会合してＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質を形成する、
二重特異性一価非対称タンデムＦａｂ（ＭＡＴ－Ｆａｂ）結合タンパク質を提供する。
（ｉ）ＬＨフォーマットでは、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＡ－ＣＬ－ＶＨＢ－ＣＨ１－Ｆｃを含んでなり、ＣＬは、ＶＨＢに直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＡ－ＣＨ１を含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＢ－ＣＬを含んでなり；第４のポリペプチド鎖は、Ｆｃを含んでなるか；又は
（ｉｉ）ＨＬフォーマットでは、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＡ－ＣＨ１－ＶＬＢ－ＣＬ－Ｆｃを含んでなり、ＣＨ１は、ＶＬＢに直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＡ－ＣＬを含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＢ－ＣＨ１を含んでなり；第４のポリペプチド鎖は、Ｆｃを含んでなり；
ＶＬは、軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは、軽鎖定常ドメインであり、ＶＨは、重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は、重鎖定常ドメインであり、Ｆｃは、免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ１のＦｃ）（例えば、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含んでなるＦｃ）であり、
ＶＬＡ－ＣＬは、ＶＨＡ－ＣＨ１と対合して、第１の抗原Ａと特異的に結合する第１のＦａｂを形成し、ＶＬＢ－ＣＬは、ＶＨＢ－ＣＨ１と対合して、第２の抗原Ｂと特異的に結合する第２のＦａｂを形成し、
第１の抗原Ａは、ＲＯＲ１であり、第２の抗原Ｂは、ＣＤ３であるか、又は、第１の抗原Ａは、ＣＤ３であり、第２の抗原Ｂは、ＲＯＲ１であり、
第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖は、会合してＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質を形成する、
二重特異性一価非対称タンデムＦａｂ（ＭＡＴ－Ｆａｂ）結合タンパク質を提供する。
本開示によるＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質の幾つかの実施形態では、Ｆｃは、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含んでなる免疫グロブリンＦｃ領域であり、ヒンジ－ＣＨ２は、免疫グロブリン重鎖のヒンジ－ＣＨ２領域であり、ヒンジ－ＣＨ２は、ＣＨ３に直接融合され、第１のポリペプチド鎖のＦｃ領域は、第１のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３ｍ１ドメイン）を含んでなり、第４のポリペプチド鎖のＦｃ領域は、第２のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３ｍ２ドメイン）を含んでなる。更なる実施形態では、第１及び第４のポリペプチド鎖のＦｃ領域は、特にそれらのＣＨ３ドメインにおいて、２つのＦｃ領域のホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成に有利であるヘテロ二量体形成修飾を含んでなる。幾つかの実施形態では、ノブ・イントゥ・ホール（knob-into-hole）ヘテロ二量体形成技術は、鎖のヘテロ二量体形成を有利とするために使用される。場合により、ＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、第１のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３ｍ１ドメイン）及び第２のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３ｍ２ドメイン）に、これら２つのＣＨ３ドメインが対合した際にジスルフィド結合の形成に有利なようにシステイン残基を導入するための突然変異を更に含んでなる。
幾つかの実施形態では、１以上のノブ・イントゥ・ホール（ＫｉＨ）突然変異は、第１の鎖中の第１のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３ｍ１ドメイン）及び第４の鎖中の第２のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３ｍ２ドメイン）に導入される。更なる実施形態では、第１の鎖中の第１のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３ｍ１ドメイン）が構造上のノブを形成するように変異されている場合、第４の鎖中の第２のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３ｍ２ドメイン）は、第１のＣＨ３ドメインと第２のＣＨ３ドメインの対合に有利となるように相補的な構造上のホールを形成するように変異されているか；或いは、第１の鎖中の第１のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３ｍ１ドメイン）が構造上のホールを形成するように変異されている場合、第４の鎖中の第２のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３ｍ２ドメイン）は、第１のＣＨ３ドメインと第２のＣＨ３ドメインの対合に有利となるように相補的な構造上のノブを形成するように変異されている。幾つかの実施形態では、「ノブ」突然変異は、Ｔ３６６Ｗの置換であり、相補的な「ホール」突然変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖの置換である。
幾つかの実施形態では、本開示による二重特異性結合タンパク質は、第１のＣＨ３ドメイン中に典型的なノブ（Ｔ３６６Ｗ）置換及び第２のＣＨ３ドメイン中に対応するホール置換（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）を有し、場合により、２つ追加の導入システイン残基であるＳ３５４Ｃ／Ｙ３４９Ｃ（各対応するＣＨ３配列に含まれる）を有する、ＭＡＴ－Ｆａｂタンパク質である。例えば、第１のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３ｍ１ドメイン）は、ノブ置換であるＴ３６６Ｗと導入システイン残基であるＳ３５４Ｃとを含んでいてもよく、第２のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３ｍ２ドメイン）は、ホール置換としてのＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖと導入システイン残基であるＹ３４９Ｃとを含んでなる。
ノブ・イントゥ・ホール二量体形成モジュール及び抗体操作におけるそれらの使用は、当技術分野で周知であり、例えば、Ridgway et al., 1996, Protein Engineering 9(7) 617-621に記載されている。ＣＨ３ドメインにおける追加のジスルフィド橋の導入は、例えば、Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681で報告されている。
本願による二重特異性ＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質の幾つかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＡ－ＣＬ－ＶＨＢ－ＣＨ１－Ｆｃを含んでなり、抗原Ａは、ＲＯＲ１であり、抗原Ｂは、ＣＤ３であるか、又は、抗原Ａは、ＣＤ３であり、抗原Ｂは、ＲＯＲ１である。
幾つかの実施形態では、ＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質におけるＶＬ－ＣＬとＶＨ－ＣＨ１が対合することにより形成された（例えば、ＡがＲＯＲ１である場合、ＶＬＡ－ＣＬとＶＨＡ－ＣＨ１により形成された）ＲＯＲ１に結合するＦａｂは、二重特異性結合タンパク質のＲＯＲ１結合部位を形成するために、本願による、本明細書に記載される任意の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントに由来する６つのＣＤＲ（即ち、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３）のセットを含んでなる。幾つかの実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３は、それぞれ配列番号１、２、３及び５、６、７の配列を含んでなるか；又はそれぞれ配列番号１、４、３及び５、６、７の配列を含んでなる。幾つかの実施形態では、ＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質のＲＯＲ１に結合するＦａｂは、二重特異性結合タンパク質のＲＯＲ１結合部位を形成するために、本願による、本明細書に記載される任意の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントに由来するＶＨ／ＶＬ対を含んでなる。幾つかの実施形態では、ＶＨ／ＶＬ対は、以下のＶＨ／ＶＬ配列対：配列番号８／９、１７／９、１０／１３、１０／１４、１０／１５、１０／１６、１１／１３、１１／１４、１１／１５、１１／１６、１２／１３、１２／１４、１２／１５、１２／１６及び２１／１３からなる群より選択される配列、又はそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有する配列を含んでなる。幾つかの実施形態では、ＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質のＲＯＲ１に結合するＦａｂは、配列番号２１のＶＨ配列及び配列番号１３のＶＬ配列を含んでなる。
幾つかの実施形態では、ＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質におけるＶＬ－ＣＬとＶＨ－ＣＨ１が対合することにより形成された（例えば、ＢがＣＤ３である場合には、ＶＬＢ－ＣＬとＶＨＢ－ＣＨ１により形成された）ＣＤ３に結合するＦａｂは、二重特異性結合タンパク質のＣＤ３結合部位を形成するために、本願による、本明細書に記載される任意の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメントに由来する６つのＣＤＲのセット（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３）を含んでなる。幾つかの実施形態では、ＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質におけるＶＬ－ＣＬとＶＨ－ＣＨ１が対合することにより形成されたＣＤ３に結合するＦａｂは、それぞれ配列番号２５、２６、２７及び２８、２９、３０の配列を含んでなる６つのＣＤＲのセット（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３）を含んでなる。幾つかの更なる実施形態では、ＣＤ３に結合するＦａｂは、配列番号２２及び２４の配列、又はそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有する配列；或いは、配列番号２３及び２４の配列、又はそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有する配列；を含んでなるＶＨ／ＶＬ対を含んでなる。
更なる実施形態では、この開示は、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖を含んでなる二重特異性一価非対称タンデムＦａｂ（ＭＡＴ－Ｆａｂ）結合タンパク質であって、
（ｉ）ＬＨフォーマットでは、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＡ－ＣＬ－ＶＨＢ－ＣＨ１－Ｆｃを含んでなり、ＣＬは、ＶＨＢに直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＡ－ＣＨ１を含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬ Ｂ －ＣＬを含んでなり；第４のポリペプチド鎖は、Ｆｃを含んでなるか；又は
（ｉｉ）ＨＬフォーマットでは、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨ Ａ －ＣＨ１－ＶＬ Ｂ －ＣＬ－Ｆｃを含んでなり、ＣＨ１は、ＶＬ Ｂ に直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬ Ａ －ＣＬを含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨ Ｂ －ＣＨ１を含んでなり；第４のポリペプチド鎖は、Ｆｃを含んでなり；
ＶＬは、軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは、軽鎖定常ドメインであり、ＶＨは、重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は、重鎖定常ドメインであり、Ｆｃは、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含んでなる免疫グロブリンＦｃ領域であり、Ａは、ＲＯＲ１のエピトープであり、Ｂは、ＣＤ３のエピトープであるか、又は、Ａは、ＣＤ３のエピトープであり、Ｂは、ＲＯＲ１のエピトープである、
二重特異性一価非対称タンデムＦａｂ（ＭＡＴ－Ｆａｂ）結合タンパク質を提供する。本開示によれば、このようなＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、ＲＯＲ１とＣＤ３の両方に結合する。
（ｉ）ＬＨフォーマットでは、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＡ－ＣＬ－ＶＨＢ－ＣＨ１－Ｆｃを含んでなり、ＣＬは、ＶＨＢに直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＡ－ＣＨ１を含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬ Ｂ －ＣＬを含んでなり；第４のポリペプチド鎖は、Ｆｃを含んでなるか；又は
（ｉｉ）ＨＬフォーマットでは、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨ Ａ －ＣＨ１－ＶＬ Ｂ －ＣＬ－Ｆｃを含んでなり、ＣＨ１は、ＶＬ Ｂ に直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬ Ａ －ＣＬを含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨ Ｂ －ＣＨ１を含んでなり；第４のポリペプチド鎖は、Ｆｃを含んでなり；
ＶＬは、軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは、軽鎖定常ドメインであり、ＶＨは、重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は、重鎖定常ドメインであり、Ｆｃは、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含んでなる免疫グロブリンＦｃ領域であり、Ａは、ＲＯＲ１のエピトープであり、Ｂは、ＣＤ３のエピトープであるか、又は、Ａは、ＣＤ３のエピトープであり、Ｂは、ＲＯＲ１のエピトープである、
二重特異性一価非対称タンデムＦａｂ（ＭＡＴ－Ｆａｂ）結合タンパク質を提供する。本開示によれば、このようなＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、ＲＯＲ１とＣＤ３の両方に結合する。
幾つかの実施形態では、このようなＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質のＦａｂフラグメントは、抗原ＲＯＲ１及びＣＤ３の一方に結合する親抗体（本明細書に記載の抗ＲＯＲ１又は抗ＣＤ３等）由来のＶＬＡ－ＣＬ及びＶＨＡ－ＣＨ１ドメインを組み込み、かつ、抗原ＲＯＲ１及びＣＤ３の他方に結合する異なる親抗体（本明細書に記載の抗ＲＯＲ１又は抗ＣＤ３等）由来のＶＬＢ－ＣＬ及びＶＨＢ－ＣＨ１ドメインを組み込んでいる。幾つかの実施形態では、ＶＨ－ＣＨ１：：ＶＬ－ＣＬ対合は、ＲＯＲ１とＣＤ３の両方を認識するタンデムＦａｂ部分を生じる。
本開示によれば、ＲＯＲ１／ＣＤ３ ＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、第１、第２、第３及び第４のポリペプチド鎖を含んでなり、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＲＯＲ１－ＣＬ－ＶＨＣＤ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ｍ１を含んでなり、ＣＬは、ＶＨＣＤ３に直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＲＯＲ１－ＣＨ１を含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＣＤ３－ＣＬを含んでなり；第４のポリペプチド鎖は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ｍ２を含んでなるＦｃポリペプチド鎖である。代替的な実施形態では、ＲＯＲ１／ＣＤ３ ＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、第１、第２、第３及び第４のポリペプチド鎖を含んでなり、第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＲＯＲ１－ＣＨ１－ＶＬＣＤ３－ＣＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ｍ１を含んでなり、ＣＨ１は、ＶＬＣＤ３に直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＲＯＲ１－ＣＬを含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＣＤ３－ＣＨ１を含んでなり；第４のポリペプチド鎖は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ｍ２を含んでなるＦｃポリペプチド鎖である。幾つかの実施形態では、ＶＬＲＯＲ１は、抗ＲＯＲ１抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは、軽鎖定常ドメインであり、ＶＨＲＯＲ１は、抗ＲＯＲ１抗体の重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は、重鎖定常ドメインであり、ＶＬＣＤ３は、抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨＣＤ３は、抗ＣＤ３抗体の重鎖可変ドメインであり、ＣＨ３ｍ１ドメインとＣＨ３ｍ２ドメインのヘテロ二量体形成に有利になるように、ＣＨ３ｍ１ドメイン及びＣＨ３ｍ２ドメインに１以上の「ノブ・イン・ホール」突然変異が導入され；ドメインＶＬＣＤ３－ＣＬは、抗ＣＤ３親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインＶＨＣＤ３－ＣＨ１は、抗ＣＤ３親抗体の重鎖可変ドメイン及び重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインＶＬＲＯＲ１－ＣＬは、抗ＲＯＲ１親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインＶＨＲＯＲ１－ＣＨ１は、抗ＲＯＲ１親抗体の重鎖可変ドメイン及び重鎖定常ドメインと同じである。
ＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質の第１のポリペプチド鎖についての前述の式において、Ｆｃ領域は、天然の又は変異型のＦｃ領域であってもよい。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＤ由来のヒトＦｃ領域である。特定の実施形態では、Ｆｃは、ＩｇＧ由来のヒトＦｃ又はその変異体である。幾つかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能（例えば、ＦｃγＲへのＦｃの結合、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ）を低減又は消失するための突然変異を含んでなる変異体Ｆｃ領域である。これらの突然変異は、例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによりナンバリング）であってもよい。１つの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの突然変異を有するヒトＩｇＧ１のものである。
本開示によるＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質の幾つかの実施形態では、ＣＨ１、ＣＬ及びＦｃドメインは、ヒト配列のものであるか、又はヒト配列に由来する。本開示によるＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質の幾つかの実施形態では、ＣＨ１は、例えば、配列番号３３の配列、又はそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を有する、重鎖定常ドメイン（例えば、ヒトＩｇＧ１定常ＣＨ１ドメイン）である。ＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質に関する前述の式では、ＣＬは、例えば、配列番号３２の配列、又はそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を有する、軽鎖定常ドメイン（例えば、ヒト定常κＣＬドメイン）である。
幾つかの実施形態では、本開示によるＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、免疫グロブリンドメイン間にリンカーを用いていない。
ある実施形態では、本開示のＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、親抗体の１以上の特性を保持する。幾つかの実施形態では、ＭＡＴ－Ｆａｂは、標的抗原（即ち、ＣＤ３及びＲＯＲ１）に対して、親抗体のそれに相当する結合親和性を保持し、これは、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉によって測定した場合、ＲＯＲ１及びＣＤ３抗原標的に対するＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質の結合親和性が、それらの各標的抗原に対する親抗体の結合親和性と比較して１０倍を超える変化ではないことを意味する。
１つの実施形態では、本開示のＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、ＲＯＲ１及びＣＤ３と結合し、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖並びに第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチドからなり、
第１のポリペプチド鎖は、配列番号３８若しくは４０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなり、
第２のポリペプチド鎖は、配列番号３５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなり、
第３のポリペプチド鎖は、配列番号３６のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなり；かつ
第４のポリペプチド鎖は、配列番号３９のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列
を含んでなる。
第１のポリペプチド鎖は、配列番号３８若しくは４０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなり、
第２のポリペプチド鎖は、配列番号３５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなり、
第３のポリペプチド鎖は、配列番号３６のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなり；かつ
第４のポリペプチド鎖は、配列番号３９のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列
を含んでなる。
１つの実施形態では、本開示のＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、ＲＯＲ１及びＣＤ３と結合し、配列番号３８若しくは４０の配列を含んでなるか、配列番号３８若しくは４０の配列から本質的になるか、又は配列番号３８若しくは４０の配列からなる、第１のポリペプチド鎖；配列番号３５の配列を含んでなるか、配列番号３５の配列から本質的になるか、又は配列番号３５の配列からなる、第２のポリペプチド鎖；配列番号３６の配列を含んでなるか、配列番号３６の配列から本質的になるか、又は配列番号３６の配列からなる、第３のポリペプチド鎖；及び、配列番号３９のアミノ酸配列を含んでなる第４のポリペプチド鎖；を含んでなる。
二重特異性結合タンパク質の特性
１つの実施形態では、本明細書に記載されるとおりのＣＤ３とＲＯＲ１の両方に結合することが可能な二重特異性ＲＯＲ１／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、ヒト化ＲＯＲ結合部位又はキメラＲＯＲ１結合部位、例えば、ヒト化ＲＯＲ結合部位を含んでなる。１つの実施形態では、ＦＩＴ－Ｉｇタンパク質フォーマット又はＭＡＴ－Ｆａｂタンパク質フォーマットにおけるヒト化ＲＯＲ１結合部位は、配列番号８及び９のＶＨ及びＶＬ対からなる同じＦＩＴ－Ｉｇ又はＭＡＴ－ＦａｂフォーマットのキメラＲＯＲ１結合部位に比べて、ＲＯＲ１結合に関して遅いオフレートを有する。更なる実施形態では、キメラＲＯＲ１結合部位に対するヒト化ＲＯＲ１結合部位のオフレート比は、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉により測定した場合、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％未満である。１つの実施例では、ＲＯＲ１に対する本明細書に記載のＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質のオフレートは、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉により測定した場合、２×１０－３ｓ－１、１×１０－３ｓ－１、８×１０－４ｓ－１、６×１０－４ｓ－１、５×１０－４ｓ－１、４×１０－４ｓ－１、３×１０－４ｓ－１、２×１０－４ｓ－１、１×１０－４ｓ－１、８×１０－５ｓ－１、６×１０－５ｓ－１未満である。１つの実施形態では、本明細書に記載のＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＲＯＲ１に対して、１０－８～１０－１０の範囲（例えば、８×１０－８Ｍ未満、５×１０－８Ｍ未満、３×１０－８Ｍ未満、２×１０－８Ｍ未満、１×１０－８Ｍ未満、８×１０－９Ｍ未満、６×１０－９Ｍ未満、４×１０－９Ｍ未満、２×１０－９Ｍ未満、又は１×１０－９Ｍ未満、８×１０－１０Ｍ未満、６×１０－１０Ｍ未満、４×１０－１０Ｍ未満、２×１０－１０Ｍ未満若しくは１×１０－１０Ｍ未満）の解離定数（ＫＤ）を有する。１つの実施形態では、本明細書に記載のＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＲＯＲ１結合に関して、１×１０－３ｓ－１～１×１０－４ｓ－１の範囲（例えば、２×１０－４ｓ－１未満）のオフレートを有し、１×１０－９ｓ－１～１×１０－１０ｓ－１の範囲（例えば６×１０－１０ｓ－１未満）のＫＤを有する。
１つの実施形態では、本明細書に記載されるとおりのＣＤ３とＲＯＲ１の両方に結合することが可能な二重特異性ＲＯＲ１／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、ヒト化ＲＯＲ結合部位又はキメラＲＯＲ１結合部位、例えば、ヒト化ＲＯＲ結合部位を含んでなる。１つの実施形態では、ＦＩＴ－Ｉｇタンパク質フォーマット又はＭＡＴ－Ｆａｂタンパク質フォーマットにおけるヒト化ＲＯＲ１結合部位は、配列番号８及び９のＶＨ及びＶＬ対からなる同じＦＩＴ－Ｉｇ又はＭＡＴ－ＦａｂフォーマットのキメラＲＯＲ１結合部位に比べて、ＲＯＲ１結合に関して遅いオフレートを有する。更なる実施形態では、キメラＲＯＲ１結合部位に対するヒト化ＲＯＲ１結合部位のオフレート比は、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉により測定した場合、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％未満である。１つの実施例では、ＲＯＲ１に対する本明細書に記載のＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質のオフレートは、表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉により測定した場合、２×１０－３ｓ－１、１×１０－３ｓ－１、８×１０－４ｓ－１、６×１０－４ｓ－１、５×１０－４ｓ－１、４×１０－４ｓ－１、３×１０－４ｓ－１、２×１０－４ｓ－１、１×１０－４ｓ－１、８×１０－５ｓ－１、６×１０－５ｓ－１未満である。１つの実施形態では、本明細書に記載のＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＲＯＲ１に対して、１０－８～１０－１０の範囲（例えば、８×１０－８Ｍ未満、５×１０－８Ｍ未満、３×１０－８Ｍ未満、２×１０－８Ｍ未満、１×１０－８Ｍ未満、８×１０－９Ｍ未満、６×１０－９Ｍ未満、４×１０－９Ｍ未満、２×１０－９Ｍ未満、又は１×１０－９Ｍ未満、８×１０－１０Ｍ未満、６×１０－１０Ｍ未満、４×１０－１０Ｍ未満、２×１０－１０Ｍ未満若しくは１×１０－１０Ｍ未満）の解離定数（ＫＤ）を有する。１つの実施形態では、本明細書に記載のＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＲＯＲ１結合に関して、１×１０－３ｓ－１～１×１０－４ｓ－１の範囲（例えば、２×１０－４ｓ－１未満）のオフレートを有し、１×１０－９ｓ－１～１×１０－１０ｓ－１の範囲（例えば６×１０－１０ｓ－１未満）のＫＤを有する。
１つの実施形態では、本明細書に記載されるとおりのＣＤ３及びＲＯＲ１に結合することが可能な二重特異性ＲＯＲ１／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、トランスフェクトさせた哺乳動物宿主細胞（ＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３細胞等）の培養物において、細胞培養物 １リットル当たりＲＯＲ１／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質が１０ｍｇを超える（＞１０ｍｇ／Ｌ）レベルで発現させ得る。１つの実施形態では、ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質の発現レベルは、１５ｍｇ／Ｌを超える（例えば、１５ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌ、又はそれを超える）。別の実施形態では、ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質の発現レベルは、２０ｍｇ／Ｌより多い。
１つの実施形態では、本明細書に記載されるとおりのＣＤ３及びＲＯＲ１と結合することが可能な二重特異性ＲＯＲ１／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いた細胞培養培地からの一段階精製の後に、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより検出した場合、９０％以上の純度を有する。１つの実施形態では、一段階精製した結合タンパク質は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより検出した場合、９１％、９２％、９３％、９５％、９７％、９９％以上の純度を有する。
１つの実施形態では、本明細書に記載されるとおりの二重特異性ＲＯＲ１／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、ＲＯＲ１発現細胞の細胞表面に結合した際に、細胞による内在化が最小限である。１つの実施形態では、細胞に基づくアッセイにより、内在化の割合は、多くとも２０％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％であるか、又は結合タンパク質は内在化されない。
１つの実施形態では、本明細書に記載されるとおりの二重特異性ＲＯＲ１／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、ＣＤ３発現細胞及びＲＯＲ１発現細胞の両方に結合することが可能である。１つの実施形態では、ＣＤ３発現細胞は、ヒトＴＣＲ／ＣＤ３複合体でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株、又はヒトＴ細胞である。１つの実施形態では、ＲＯＲ１発現細胞は、ＲＯＲ１発現腫瘍細胞（例えば、ヒト非小細胞肺ガン細胞、ヒト乳ガン細胞、肺ガン細胞又は骨髄腫細胞）である。
１つの実施形態では、細胞に基づくアッセイにおいてフローサイトメトリーにより測定した場合、ＲＯＲ１発現細胞に対する二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質の結合能は、二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇタンパク質と同じＲＯＲ１結合のためのＶＨ／ＶＬ配列対を含んでなる対応する親抗ＲＯＲ１モノクローナルＩｇＧ抗体と等価であるか又は相当する。１つの実施形態では、ＣＤ３発現細胞に対する二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質の結合能は、フローサイトメトリー（実施例４に記載されるとおりのアッセイ等）により測定した場合、二重特異性結合タンパク質と同じＣＤ３結合のためのＶＨ／ＶＬ配列対を含んでなる対応する親抗ＣＤ３モノクローナルＩｇＧ抗体と同等であるか又はそれよりも比較的に低い（但し、１０倍以下の違い、例えば、２倍以下、１倍以下、又は５０％の低下）。
１つの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性結合タンパク質は、ＲＯＲ１、ＣＤ３、又は両方の生物学的機能を調節することが可能である。１つの実施形態では、本明細書に記載されるとおりの二重特異性ＲＯＲ１／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、ＲＯＲ１依存性という点で、ＣＤ３シグナル伝達を活性化することが可能である。１つの実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質は、ＲＯＲ１依存的なＴ細胞の活性化を示す。１つの実施形態では、本明細書に記載されるとおりの二重特異性ＲＯＲ１／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、ＲＯＲ１－リダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性を示す。１つの実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質は、ＭＨＣに制限されない様式で、ＲＯＲ１発現細胞に対してＴ細胞の細胞傷害活性をリダイレクトするために使用される。
１つの実施形態では、本明細書に記載されるとおりの二重特異性ＲＯＲ１／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、ＲＯＲ１依存性のＣＤ３活性化を示す。１つの実施形態では、ＲＯＲ１発現細胞に結合すると、二重特異性ＲＯＲ１／ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞上のＣＤ３／ＴＣＲ複合体の架橋及びＣＤ３シグナル伝達の活性化を誘導する。１つの実施形態では、標的ＲＯＲ１発現細胞とエフェクターＴ細胞の比は、約１：１である。更なる実施形態では、二重特異性ＲＯＲ１／ＣＤ３結合タンパク質は、例えば約１：１の標的細胞とエフェクターＴ細胞の比で測定した場合、二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇタンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂタンパク質と同じＣＤ３結合のためのＶＨ／ＶＬ配列対を含んでなる対応する親抗ＣＤ３モノクローナルＩｇＧ抗体に比べて、ＲＯＲ１発現標的細胞の存在下でのＴ細胞活性化の増大、及びＲＯＲ１発現標的細胞の不存在下でのはるかに低い非標的のリダイレクトされたＣＤ３活性化を示す。
１つの実施形態では、本明細書に記載されるとおりの二重特異性ＲＯＲ１／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、ＲＯＲ１発現腫瘍細胞に対してＴ細胞細胞傷害性をリダイレクトする。別の実施形態では、本明細書に記載されるとおりの二重特異性ＲＯＲ１／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、抗腫瘍活性（腫瘍量の低減、腫瘍成長の阻害、又は新生細胞拡大の抑制等）を示す。
医薬組成物
本開示はまた、本開示の抗体若しくはその抗原結合部分又は二重特異性多価結合タンパク質（即ち、主要有効成分）と薬学上許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、組成物は、本開示の１以上の抗体又は結合タンパク質を含んでなる。本開示はまた、本明細書に記載されるとおりの抗ＲＯＲ１抗体と抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントの組合せと、薬学上許容可能な担体と、を含んでなる医薬組成物も提供する。特に、本開示は、ＲＯＲ１及びＣＤ３に結合することが可能な少なくとも１つのＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質と薬学上許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。特に、本開示は、ＲＯＲ１及びＣＤ３に結合することが可能な少なくとも１つのＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質と薬学上許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。本開示の医薬組成物は、少なくとも１つの追加の有効成分を更に含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、このような追加の成分としては、これらに限定されるものではないが、予防剤及び／又は治療剤、検出剤（例えば、抗腫瘍薬、細胞傷害剤、特異性の異なる抗体又はその機能的フラグメント、検出可能な標識又はレポーター）が挙げられる。ある実施形態では、医薬組成物は、ＲＯＲ１活性が有害である障害を治療するための、１以上の追加の予防剤又は治療剤（即ち、本開示の抗体又は結合タンパク質以外の剤）を含んでなる。ある実施形態では、追加の予防剤又は治療剤は、障害又はその１以上の症状の予防、治療、管理又は改善のために、有用であることが知られているか、使用されていたか又は現在使用されている。
本開示はまた、本開示の抗体若しくはその抗原結合部分又は二重特異性多価結合タンパク質（即ち、主要有効成分）と薬学上許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、組成物は、本開示の１以上の抗体又は結合タンパク質を含んでなる。本開示はまた、本明細書に記載されるとおりの抗ＲＯＲ１抗体と抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントの組合せと、薬学上許容可能な担体と、を含んでなる医薬組成物も提供する。特に、本開示は、ＲＯＲ１及びＣＤ３に結合することが可能な少なくとも１つのＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質と薬学上許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。特に、本開示は、ＲＯＲ１及びＣＤ３に結合することが可能な少なくとも１つのＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質と薬学上許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。本開示の医薬組成物は、少なくとも１つの追加の有効成分を更に含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、このような追加の成分としては、これらに限定されるものではないが、予防剤及び／又は治療剤、検出剤（例えば、抗腫瘍薬、細胞傷害剤、特異性の異なる抗体又はその機能的フラグメント、検出可能な標識又はレポーター）が挙げられる。ある実施形態では、医薬組成物は、ＲＯＲ１活性が有害である障害を治療するための、１以上の追加の予防剤又は治療剤（即ち、本開示の抗体又は結合タンパク質以外の剤）を含んでなる。ある実施形態では、追加の予防剤又は治療剤は、障害又はその１以上の症状の予防、治療、管理又は改善のために、有用であることが知られているか、使用されていたか又は現在使用されている。
本開示のタンパク質を含んでなる医薬組成物は、限定されるものではないが、障害の診断、検出若しくはモニタリング；障害若しくはその１以上の症状の治療、管理若しくは改善；及び／又は研究において使用するためのものである。幾つかの実施形態では、上記組成物は、担体、希釈剤又は賦形剤を更に含んでいてもよい。賦形剤は、一般的に、主要有効成分のもの以外（即ち、本開示の抗体、その機能的部分、又は結合タンパク質以外）の所望の特徴を組成物に提供する、任意の化合物又は化合物の組合せである。
核酸、ベクター及び宿主細胞
更なる側面において、本開示は、本開示の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントの１以上のアミノ酸配列をコードする単離された核酸；本開示（thisisclosure）の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメントの１以上のアミノ酸配列をコードする単離された核酸；及びＲＯＲ１とＣＤ３の両方に結合することが可能な、Ｆａｂｓ－ｉｎ－Ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリン（ＦＩＴ－Ｉｇ）及びＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質を含む二重特異性結合タンパク質の１以上のアミノ酸配列をコードする単離された核酸を提供する。このような核酸は、様々な遺伝学的解析を実施するために、又は本明細書に記載の抗体若しくは結合タンパク質の発現、特性決定若しくは１以上の特性を改善するために、ベクターに挿入されてもよい。ベクターは、本明細書に記載の抗体又は結合タンパク質の１以上のアミノ酸配列をコードする１以上の核酸分子を含んでいてもよく、上記１以上の核酸分子は、そのベクターを有する特定の宿主細胞で抗体又は結合タンパク質の発現を許容する適当な転写配列及び／又は翻訳配列に作動可能に連結されている。本明細書に記載の結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸をクローニング又は発現させるためのベクターの例としては、これらに限定されるものではないが、ｐｃＤＮＡ、ｐＴＴ、ｐＴＴ３、ｐＥＦＢＯＳ、ｐＢＶ、ｐＪＶ及びｐＢＪ、並びにそれらの誘導体が挙げられる。
更なる側面において、本開示は、本開示の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントの１以上のアミノ酸配列をコードする単離された核酸；本開示（thisisclosure）の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメントの１以上のアミノ酸配列をコードする単離された核酸；及びＲＯＲ１とＣＤ３の両方に結合することが可能な、Ｆａｂｓ－ｉｎ－Ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリン（ＦＩＴ－Ｉｇ）及びＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質を含む二重特異性結合タンパク質の１以上のアミノ酸配列をコードする単離された核酸を提供する。このような核酸は、様々な遺伝学的解析を実施するために、又は本明細書に記載の抗体若しくは結合タンパク質の発現、特性決定若しくは１以上の特性を改善するために、ベクターに挿入されてもよい。ベクターは、本明細書に記載の抗体又は結合タンパク質の１以上のアミノ酸配列をコードする１以上の核酸分子を含んでいてもよく、上記１以上の核酸分子は、そのベクターを有する特定の宿主細胞で抗体又は結合タンパク質の発現を許容する適当な転写配列及び／又は翻訳配列に作動可能に連結されている。本明細書に記載の結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸をクローニング又は発現させるためのベクターの例としては、これらに限定されるものではないが、ｐｃＤＮＡ、ｐＴＴ、ｐＴＴ３、ｐＥＦＢＯＳ、ｐＢＶ、ｐＪＶ及びｐＢＪ、並びにそれらの誘導体が挙げられる。
本開示は、本明細書に記載の抗体又は結合タンパク質の１以上のアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなるベクターを発現するか又は発現することが可能な宿主細胞も提供する。本開示において有用な宿主細胞は、原核生物又は真核生物であってもよい。例示的な原核生物宿主細胞は、大腸菌(Escherichia coli)である。本開示において宿主細胞として有用な真核細胞としては、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞及び真菌細胞が挙げられる。例示的な真菌細胞は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)を含む酵母細胞である。本開示による宿主細胞として有用な例示的な動物細胞としては、限定されるものではないが、哺乳動物細胞、鳥類細胞及び昆虫細胞が挙げられる。例示的な哺乳動物細胞としては、限定されるものではないが、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞及びＣＯＳ細胞が挙げられる。
製造するための方法
別の側面において、本開示は、抗ＲＯＲ１抗体又はその機能的フラグメントを製造する方法であって、抗体又は機能的フラグメントをコードする発現ベクターを含んでなる宿主細胞を、ＲＯＲ１と結合することが可能な抗体又はフラグメントを宿主細胞に発現させることを生じさせるために十分な条件下、培養培地で培養することを含んでなる、方法を提供する。
別の側面において、本開示は、抗ＲＯＲ１抗体又はその機能的フラグメントを製造する方法であって、抗体又は機能的フラグメントをコードする発現ベクターを含んでなる宿主細胞を、ＲＯＲ１と結合することが可能な抗体又はフラグメントを宿主細胞に発現させることを生じさせるために十分な条件下、培養培地で培養することを含んでなる、方法を提供する。
別の側面において、本開示は、抗ＣＤ３抗体又はその機能的フラグメントを製造する方法であって、抗体又は機能的フラグメントをコードする発現ベクターを含んでなる宿主細胞を、ＣＤ３と結合することが可能な抗体又はフラグメントを宿主細胞に発現させることを生じさせるために十分な条件下、培養培地で培養することを含んでなる、方法を提供する。
別の側面において、本開示は、ＲＯＲ１及びＣＤ３と結合することが可能な二重特異性多価結合タンパク質（具体的には、ＲＯＲ１及びＣＤ３と結合するＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質）を製造する方法であって、ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質をコードする発現ベクターを含んでなる宿主細胞を、ＲＯＲ１及びＣＤ３と結合することが可能な結合タンパク質を宿主細胞に発現させることを生じさせるために十分な条件下、培養培地で培養することを含んでなる、方法を提供する。本明細書に開示される方法により製造されるタンパク質は、単離され得、本明細書に記載の種々の組成物及び方法において使用され得る。
抗体及び結合タンパク質の使用
本明細書に記載の抗体、その機能的フラグメント及び本明細書に記載の二重特異性多価結合タンパク質は、ヒトＲＯＲ１及び／又はＣＤ３に結合するそれらの能力を考慮すれば、（例えば、標的抗原の一方又はその両方を発現する細胞を含有する生体サンプルにおいて）ＲＯＲ１若しくはＣＤ３、又は両方を検出するために使用され得る。本開示の抗体、機能的フラグメント及び結合タンパク質は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、又は免疫組織化学的検査等の従来のイムノアッセイで使用され得る。本開示は、生体サンプルにおいてＲＯＲ１又はＣＤ３を検出するための方法であって、生体サンプルと、本開示の抗体、その抗原結合部分又は結合タンパク質とを接触させること、及び標的抗原との結合が生じるかどうかを検出し、それにより、生体サンプルにおける標的の存在又は不存在を検出することを含んでなる、方法を提供する。抗体、機能的フラグメント又は結合タンパク質は、結合したか又は結合していない抗体／フラグメント／結合タンパク質の検出を容易にするために、検出可能な物質で直接的に又は間接的に標識してもよい。好適な検出可能な物質としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質及び放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ；好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；好適な放射性物質の例としては、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ又は１５３Ｓｍが挙げられる。
本明細書に記載の抗体、その機能的フラグメント及び本明細書に記載の二重特異性多価結合タンパク質は、ヒトＲＯＲ１及び／又はＣＤ３に結合するそれらの能力を考慮すれば、（例えば、標的抗原の一方又はその両方を発現する細胞を含有する生体サンプルにおいて）ＲＯＲ１若しくはＣＤ３、又は両方を検出するために使用され得る。本開示の抗体、機能的フラグメント及び結合タンパク質は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、又は免疫組織化学的検査等の従来のイムノアッセイで使用され得る。本開示は、生体サンプルにおいてＲＯＲ１又はＣＤ３を検出するための方法であって、生体サンプルと、本開示の抗体、その抗原結合部分又は結合タンパク質とを接触させること、及び標的抗原との結合が生じるかどうかを検出し、それにより、生体サンプルにおける標的の存在又は不存在を検出することを含んでなる、方法を提供する。抗体、機能的フラグメント又は結合タンパク質は、結合したか又は結合していない抗体／フラグメント／結合タンパク質の検出を容易にするために、検出可能な物質で直接的に又は間接的に標識してもよい。好適な検出可能な物質としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質及び放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ；好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；好適な放射性物質の例としては、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ又は１５３Ｓｍが挙げられる。
幾つかの実施形態では、本開示の抗体、その機能的フラグメントは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方でヒトＲＯＲ１活性を中和することが可能である。従って、本開示の抗体、その機能的フラグメントは、ヒト対象においてヒトＲＯＲ１活性を阻害する（例えば、ＲＯＲ１発現細胞を含む細胞培養物においてＲＯＲ１により媒介される細胞シグナル伝達を阻害する）ために使用され得るか、又は本開示の抗体、その機能的フラグメント若しくは結合タンパク質が交差反応するＲＯＲ１を有する他の哺乳動物対象において使用され得る。
別の実施形態では、本開示は、ＲＯＲ１活性が有害である疾患又は障害に罹患している対象の治療において使用するための本開示の抗体又は二重特異性結合タンパク質であって、上記抗体又は結合タンパク質が、対象においてＲＯＲ１により媒介される活性が低減されるように対象に投与される、抗体又は二重特異性結合タンパク質を提供する。本明細書で使用する場合、「ＲＯＲ１活性が有害である障害」という用語は、その障害に罹患している対象におけるＲＯＲ１とそのリガンド（Ｗｎｔ－５Ａ）の相互作用が、その障害の病態生理学に関与するか又はその障害の増悪に寄与する因子であるかのいずれかの疾患及びその他の障害を含むことを意図する。従って、ＲＯＲ１活性が有害である障害は、ＲＯＲ１の阻害がその障害の症状及び／又は進行を緩和すると期待される障害である。１つの実施形態では、本開示の抗ＲＯＲ１抗体、その機能的フラグメントは、悪性細胞の成長若しくは生存を阻害するか又は腫瘍量を低減する方法において使用される。
幾つかの実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質（ＦＩＴ－Ｉｇ又はＭＡＴ－Ｆａｂ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で、ＲＯＲ発現細胞に対してＴ細胞細胞傷害性をリダイレクトすることが可能である。従って、本開示の二重特異性結合タンパク質は、ヒト対象において、又は本開示の抗体、その機能的フラグメント若しくは二重特異性結合タンパク質が交差反応するＲＯＲ１を有する他の哺乳動物対象において、ＲＯＲ１発現悪性細胞の成長又は拡大を阻害するために使用され得る。
別の実施形態では、本開示は、対象においてＲＯＲ１発現悪性の治療に使用するためのＣＤ３／ＲＯＲ１二重特異性（ＦＩＴ－Ｉｇ又はＭＡＴ－Ｆａｂ）結合タンパク質であって、上記結合タンパク質が対象に投与される、ＣＤ３／ＲＯＲ１二重特異性（ＦＩＴ－Ｉｇ又はＭＡＴ－Ｆａｂ）結合タンパク質を提供する。幾つかの実施形態では、悪性腫瘍は、固形腫瘍又は造血器悪性腫瘍である。
本開示の抗体（その機能的フラグメントを含む）及び結合タンパク質は、対象への投与に好適な医薬組成物に組み込まれ得る。典型的には、医薬組成物は、本開示の抗体又は結合タンパク質と薬学上許容可能な担体とを含んでなる。本明細書で使用する場合、「薬学上許容可能な担体」は、生理学的に適合し得る任意の及びすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等が含まれる。薬学上許容可能な担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等のうち１以上、及びそれらの組合せが挙げられる。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、糖類、ポリアルコール（例えば、マンニトール若しくはソルビトール）又は塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。薬学上許容可能な担体は、組成物中に存在する抗体又は結合タンパク質の保存寿命又は有効性を高める微量の補助物質（湿潤剤若しくは乳化剤、保存剤又はバッファー等）を更に含んでいてもよい。本開示の医薬組成物は、その意図する投与経路と適合し得るように処方化される。
本開示の方法は、注射による非経口投与（例えば、ボーラス注射又は持続的注入）のために処方化された組成物の投与を含んでもよい。注射用処方物は、添加された保存剤を伴う単位投与形（例えば、アンプル又は多用量容器）で存在してもよい。組成物は、油性若しくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルション等の形態をとってもよく、懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散剤等の処方剤を含んでもよい。或いは、主要有効成分は、使用前に好適なビヒクル（例えば、無菌の発熱性物質除去水）で構成するための粉末形態であってもよい。
本開示の使用は、デポ調製物として処方化された組成物の投与を含んでもよい。このような長期作用処方物は、移植（例えば、皮下若しくは筋肉内）によって又は筋肉内注射によって投与されてもよい。例えば、これら組成物は、好適なポリマー材料又は疎水性材料（例えば、許容可能なオイル中のエマルション）又はイオン交換樹脂とともに、或いは難溶性誘導体（例えば、難溶性塩）として処方化されてもよい。
本開示の抗体、その機能的フラグメント又は結合タンパク質はまた、様々な疾患の治療に有用な１以上の追加の治療薬とともに投与され得る。本明細書に記載の抗体、その機能的フラグメント及び結合タンパク質は、単独で又は追加の薬剤（例えば、追加の治療薬）と組合せて使用され得、追加の薬剤は、その意図する目的について当業者によって選択される。例えば、追加の薬剤は、本開示の抗体又は結合タンパク質によって治療される疾患又は状態を治療するために有用であると当技術分野で認識されている治療薬であり得る。追加の薬剤はまた、治療用組成物に有益な属性を付与する剤（例えば、組成物の粘性に影響を与える剤）であり得る。
治療のための方法及び医学的使用
１つの実施形態では、本開示は、それを必要とする対象において、ＲＯＲ１により媒介されるシグナル伝達活性が関連するか又は有害である障害（例えば、ＲＯＲ＋固形腫瘍又は造血器悪性腫瘍）を治療するための方法であって、上記方法は、対象に本明細書に記載されるとおりの抗ＲＯＲ１抗体又はそのＲＯＲ１結合フラグメントを投与することを含んでなり、上記抗体又は結合フラグメントは、ＲＯＲ１と結合することが可能であり、ＲＯＲ１を発現する細胞においてＲＯＲ１により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能である、方法を提供する。別の実施形態では、本開示は、このような障害の治療における有効量の本明細書に記載の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。別の実施形態では、本開示は、このような障害の治療のための組成物の製造における、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。別の実施形態では、本開示は、このような障害の治療において使用するための、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
１つの実施形態では、本開示は、それを必要とする対象において、ＲＯＲ１により媒介されるシグナル伝達活性が関連するか又は有害である障害（例えば、ＲＯＲ＋固形腫瘍又は造血器悪性腫瘍）を治療するための方法であって、上記方法は、対象に本明細書に記載されるとおりの抗ＲＯＲ１抗体又はそのＲＯＲ１結合フラグメントを投与することを含んでなり、上記抗体又は結合フラグメントは、ＲＯＲ１と結合することが可能であり、ＲＯＲ１を発現する細胞においてＲＯＲ１により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能である、方法を提供する。別の実施形態では、本開示は、このような障害の治療における有効量の本明細書に記載の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。別の実施形態では、本開示は、このような障害の治療のための組成物の製造における、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。別の実施形態では、本開示は、このような障害の治療において使用するための、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
本明細書に記載の方法又は使用の更なる実施形態では、本開示の抗ＲＯＲ１抗体又は抗原結合フラグメントは、ＲＯＲ１と結合し、配列番号１０若しくは２１の配列を含んでなるか、配列番号１０若しくは２１の配列から本質的になるか、又は配列番号１０若しくは２１の配列からなるＶＨドメインと、配列番号１３の配列を含んでなるか、配列番号１３の配列から本質的になるか、又は配列番号１３の配列からなるＶＬドメインと、を含んでなる。
別の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象において、ＲＯＲ１により媒介されるシグナル伝達活性が関連するか又は有害である（例えば、ＲＯＲ＋固形腫瘍又は造血器悪性腫瘍）障害を治療するための方法であって、上記方法は、対象に本明細書に記載されるとおりのＣＤ３及びＲＯＲ１と結合することが可能な二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質を投与することを含んでなり、上記結合タンパク質は、ＣＤ３及びＲＯＲ１と結合することが可能であり、ＲＯＲ１発現腫瘍細胞に対するリダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性を誘導することが可能な、方法を提供する。別の実施形態では、本開示は、このような障害の治療における、有効量の本明細書に記載の二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパクの使用を提供する。別の実施形態では、本開示は、このような障害の治療のための組成物の製造における、本明細書に記載の二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質の使用を提供する。別の実施形態では、本開示は、このような障害の治療における使用のための、本明細書に記載の二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質又はＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質を提供する。
本明細書に記載の方法又は使用の更なる実施形態では、本開示のＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、ＲＯＲ１及びＣＤ３と結合し、配列番号３４若しくは３７の配列を含んでなるか、配列番号３４若しくは３７の配列から本質的になるか、又は配列番号３４若しくは３７の配列からなる、第１のポリペプチド鎖と；配列番号３５の配列を含んでなるか、配列番号３５の配列から本質的になるか、又は配列番号３５の配列からなる、第２のポリペプチド鎖と；配列番号３６の配列を含んでなるか、配列番号３６の配列から本質的になるか、又は配列番号３６の配列からなる、第３のポリペプチド鎖と；を含んでなる。更なる実施形態では、本開示のＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質は、ＲＯＲ１及びＣＤ３と結合し、配列番号３８若しくは４０の配列を含んでなるか、配列番号３８若しくは４０の配列から本質的になるか、又は配列番号３８若しくは４０の配列からなる、第１のポリペプチド鎖と；配列番号３５の配列を含んでなるか、配列番号３５の配列から本質的になるか、又は配列番号３５の配列からなる、第２のポリペプチド鎖と；配列番号３６の配列を含んでなるか、配列番号３６の配列から本質的になるか、又は配列番号３６の配列からなる、第３のポリペプチド鎖と；配列番号３９の配列を含んでなるか、配列番号３９の配列から本質的になるか、又は配列番号３９の配列からなる、第４のポリペプチド鎖と；を含んでなる。
幾つかの実施形態では、本開示による抗体又は結合タンパク質で治療され得る障害としては、悪性細胞の細胞表面にＲＯＲ１を発現する種々の造血器悪性腫瘍及び固形悪性腫瘍が挙げられる。別の実施形態では、上記抗体又は結合タンパク質は、悪性細胞の成長又は生存を阻害する。別の実施形態では、上記抗体又は結合タンパク質は、腫瘍量を低減する。別の実施形態では、ガンは、乳ガン（トリプルネガティブ乳腺ガン等）又は白血病（慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）等）である。
本明細書に記載の治療方法は、それを必要とする対象に、意図する治療目的のために本抗体又は結合タンパク質と組合せて好適に存在する追加の有効成分（例えば、抗腫瘍活性(ant-tumor activity)を有する別の薬物）を投与することを更に含んでなる。本開示の治療方法において、追加の有効成分は、本開示の抗体又は結合タンパク質を含んでなる組成物に組み込まれてもよく、上記組成物は、治療を必要とする対象に投与される。別の実施形態では、本開示の治療方法は、治療を必要とする対象に本明細書に記載の抗体又は結合タンパク質を投与する工程、及び上記対象に本開示の抗体又は結合タンパク質を投与する工程の前に、同時に又は後に上記対象に追加の有効成分を投与する別個の工程を含んでもよい。
以上、本開示を詳細に説明してきたが、以下の実施例を参照することにより、本開示の内容が明確に理解されるであろうが、これらは、単に例示のために含まれるものであり、本開示を限定することが意図されるものではない。
特性が改善されたＲＯＲ１標的化モノクローナル抗体を得るために、従来のハイブリドーマ技術を用いて抗ＲＯＲ１抗体を作製した。次に、ＲＯＲ１ Ｉｇ様ドメインのＣ末端においてＲＯＲ１と結合する抗体 ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４を選択し、特性決定を行った。ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４の配列を、従来のＣＤＲグラフト法によって更にヒト化した。ヒト化配列を設計した。これらの配列の幾つかは、組換えＦＩＴ－Ｉｇとして発現され、それらの結合親和性について特性決定を行った。
ＦＩＴ－Ｉｇタンパク質であるＦＩＴ１００７－１２Ｂ－１７を構築し、そのＭＡＴ－Ｆａｂ対応物であるＭＡＴ１００７－１２Ｂ－１７、並びにその低ＣＤ３親和性比較物であるＦＩＴ１００７－１２Ｂ－１８も作製した。一般的に、同じＩｇ可変配列を有する場合、ＦＩＴ－Ｉｇフォーマットは、ＭＡＴ－Ｆａｂよりも優れたｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍細胞殺傷力及びより高いサイトカイン放出を示した。ＣＤ３親和性の低減もまた、リダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）効果の低下をもたらす。
ＦＩＴ－Ｉｇ及びＭＡＴ－Ｆａｂの両方は、共培養レポート遺伝子アッセイにおいて、ＲＯＲ１標的依存性のＴ細胞活性化を示した。これは、標的ＲＯＲ１が存在しない場合には、Ｔ細胞が有効に活性化され得ないことを示唆する。この現象は、ＦＩＴ－Ｉｇとその親ＣＤ３モノクローナル抗体の間のＣＤ３結合活性の違いと一致する。
ＦＩＴ－Ｉｇ及びＭＡＴ－Ｆａｂは、トリプルネガティブ乳ガン異種移植モデルにおいて強力なｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示した。
実施例１．抗ＲＯＲ１抗体の作製
抗ＲＯＲ１抗体は、組換えヒトＲＯＲ１細胞外ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：Ｑ０１９７３－１）であるヒトＲＯＲ１のＱ３０－Ｙ４０６でＢａｌｂ／ｃ又はＳＪＬマウスを免疫することにより得た。
>ヒト_ROR1_ECD
抗ＲＯＲ１抗体は、組換えヒトＲＯＲ１細胞外ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：Ｑ０１９７３－１）であるヒトＲＯＲ１のＱ３０－Ｙ４０６でＢａｌｂ／ｃ又はＳＪＬマウスを免疫することにより得た。
>ヒト_ROR1_ECD
マウスを２週間隔で免疫し、２回目の注射後、血清力価を週１回モニタリングした。４～６回の免疫の後、脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞株を形成した。融合産物を、ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン（ＨＡＴ）を含有する選択培地中、１×１０５脾細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。融合した７～１０日後に、肉眼で見えるハイブリドーマコロニーを認めた。次に、ハイブリドーマ細胞の上清をスクリーニング及び選択して、ＲＯＲ１特異的マウス抗体を製造する細胞株を同定した。予備的特性決定の際に、１つの抗ＲＯＲ１抗体であるＲＯＲ１－ｍＡｂ００４を選択し、配列決定を行った。
実施例１．１ 重鎖及び軽鎖可変領域配列
重鎖及び軽鎖可変領域を増幅するために、ＴＲＩｚｏｌ（商標）ＲＮＡ抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５９６０１８）を用い、各ハイブリドーマクローンの全ＲＮＡを５×１０６を超える細胞から単離した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｆｉｓｒｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号１８０８０）を製造者の説明書に従って用いてｃＤＮＡを合成し、マウス免疫グロブリン軽鎖及び重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（商標）Ｎｏｖａｇｅｎ（商標）マウスＩｇ－プライマーセット（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号６９８３１３）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物は、１．２％アガロースゲルでの電気泳動により、ＳＹＢＲ（商標）Ｓａｆｅ ＤＮＡゲル染色剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号Ｓ３３１０２）を用いて分析した。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ゲル及びＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、カタログ番号７４０６０９）を製造者の説明書に従って用いて適正な大きさのＤＮＡフラグメントを精製し、個々にｐＭＤ１８－Ｔベクターにサブクローニングした。各形質転換体から１５のコロニーを選択し、挿入フラグメントの配列をＤＮＡシークエンシングにより分析した。マウスｍＡｂ可変領域のタンパク質配列を、配列相同性アラインメントにより分析した。
重鎖及び軽鎖可変領域を増幅するために、ＴＲＩｚｏｌ（商標）ＲＮＡ抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５９６０１８）を用い、各ハイブリドーマクローンの全ＲＮＡを５×１０６を超える細胞から単離した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｆｉｓｒｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号１８０８０）を製造者の説明書に従って用いてｃＤＮＡを合成し、マウス免疫グロブリン軽鎖及び重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（商標）Ｎｏｖａｇｅｎ（商標）マウスＩｇ－プライマーセット（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号６９８３１３）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物は、１．２％アガロースゲルでの電気泳動により、ＳＹＢＲ（商標）Ｓａｆｅ ＤＮＡゲル染色剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号Ｓ３３１０２）を用いて分析した。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ゲル及びＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、カタログ番号７４０６０９）を製造者の説明書に従って用いて適正な大きさのＤＮＡフラグメントを精製し、個々にｐＭＤ１８－Ｔベクターにサブクローニングした。各形質転換体から１５のコロニーを選択し、挿入フラグメントの配列をＤＮＡシークエンシングにより分析した。マウスｍＡｂ可変領域のタンパク質配列を、配列相同性アラインメントにより分析した。
選択された抗ＲＯＲ１抗体の可変ドメイン配列を以下の表に示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をＫａｂａｔナンバリングに基づいて下線で示す。
実施例１．２ 抗ＲＯＲ１抗体の結合速度
抗ＲＯＲ１抗体の結合親和性及び速度定数を、２５℃で、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６バイオレイヤー干渉（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＬＬＣ）を用い、標準的な手順に従って決定した。簡単に述べれば、抗マウスＩｇＧ Ｆｃキャプチャー（ＡＭＣ）バイオセンサーを用いて、精製された抗ＲＯＲ１抗体を捕捉した。次に、センサーを、組換えヒトＲＯＲ１－ＥＣＤタンパク質を含有する溶液に浸漬し、捕捉した抗体に結合する標的タンパク質を検出した。速度定数は、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ分析ソフトウエアを用いて処理し、データを１：１結合モデルにフィッティングすることにより決定した。以下の表２に、従前に記載した２つの抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体と比較した、ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４で得られた結果を示した。ＲＯＲ１－Ｔａｂ１は、国際公開第２０１４／１６７０２２号に記載されるとおりのクローンＲ１２であり、ＲＯＲ１－Ｔａｂ２は、国際公開第２０１２／０９７３１３号に記載されるとおりのクローンＤ１０である。
抗ＲＯＲ１抗体の結合親和性及び速度定数を、２５℃で、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６バイオレイヤー干渉（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＬＬＣ）を用い、標準的な手順に従って決定した。簡単に述べれば、抗マウスＩｇＧ Ｆｃキャプチャー（ＡＭＣ）バイオセンサーを用いて、精製された抗ＲＯＲ１抗体を捕捉した。次に、センサーを、組換えヒトＲＯＲ１－ＥＣＤタンパク質を含有する溶液に浸漬し、捕捉した抗体に結合する標的タンパク質を検出した。速度定数は、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ分析ソフトウエアを用いて処理し、データを１：１結合モデルにフィッティングすることにより決定した。以下の表２に、従前に記載した２つの抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体と比較した、ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４で得られた結果を示した。ＲＯＲ１－Ｔａｂ１は、国際公開第２０１４／１６７０２２号に記載されるとおりのクローンＲ１２であり、ＲＯＲ１－Ｔａｂ２は、国際公開第２０１２／０９７３１３号に記載されるとおりのクローンＤ１０である。
実施例１．３ 抗ＲＯＲ１抗体の細胞表面結合特性
抗ＲＯＲ１抗体の結合特異性及び結合能を、細胞表面結合のタンパク質ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリー分析により特徴決定した。結合ＥＣ５０を算出し、以下の表３に示す。簡単に述べれば、抗ＲＯＲ１抗体の結合特性は、次のようにＥＬＩＳＡを用いて測定した：組換えＲＯＲ１－ＥＣＤタンパク質を９６ウェルプレートに４℃で一晩、１μｇ／ｍＬでコーティングした。プレートを洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳ）で１回洗浄し、ＥＬＩＳＡブロッキングバッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ）で、室温にて２時間ブロッキングした。次に、抗ＲＯＲ１抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ０１６８）を加え、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした後、洗浄バッファーにおいて５回洗浄した。１００μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）発色溶液を各ウェルに加えた。発色後、１規定のＨＣｌで反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度をＶａｒｉｏｓｋａｎ（商標）ＬＵＸマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウエアを用いて結合シグナルを抗体濃度に対してプロットし、それに応じてＥＣ５０を算出した。結果を図１に示す。図１は、モノクローナル抗体 ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４及びＲＯＲ１－Ｔａｂ１のＲＯＲ１－ＥＣＤタンパク質結合活性を示し、無関係なｍＩｇＧ１を陰性対照として使用した。
抗ＲＯＲ１抗体の結合特異性及び結合能を、細胞表面結合のタンパク質ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリー分析により特徴決定した。結合ＥＣ５０を算出し、以下の表３に示す。簡単に述べれば、抗ＲＯＲ１抗体の結合特性は、次のようにＥＬＩＳＡを用いて測定した：組換えＲＯＲ１－ＥＣＤタンパク質を９６ウェルプレートに４℃で一晩、１μｇ／ｍＬでコーティングした。プレートを洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳ）で１回洗浄し、ＥＬＩＳＡブロッキングバッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ）で、室温にて２時間ブロッキングした。次に、抗ＲＯＲ１抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ０１６８）を加え、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした後、洗浄バッファーにおいて５回洗浄した。１００μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）発色溶液を各ウェルに加えた。発色後、１規定のＨＣｌで反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度をＶａｒｉｏｓｋａｎ（商標）ＬＵＸマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウエアを用いて結合シグナルを抗体濃度に対してプロットし、それに応じてＥＣ５０を算出した。結果を図１に示す。図１は、モノクローナル抗体 ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４及びＲＯＲ１－Ｔａｂ１のＲＯＲ１－ＥＣＤタンパク質結合活性を示し、無関係なｍＩｇＧ１を陰性対照として使用した。
抗ＲＯＲ１抗体の細胞結合活性を、ヒトＲＯＲ１トランスフェクトＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ－ＲＯＲ１）及びＲＯＲ１発現骨髄腫細胞株（ＲＰＭＩ８２２６）を用いて測定した。簡単に述べれば、５×１０５細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。細胞を４００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、各ウェルについて、１００μｌの連続希釈抗体を加え、細胞と混合した。４℃での４０分間のインキュベーション後に、プレートを数回洗浄して余分な抗体を除去した。その後、二次蛍光色素結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を加え、細胞とともに室温で２０分間インキュベートした。もう一度遠心分離と洗浄工程を行った後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で読み取るために細胞をＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）読み取り値を抗体濃度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウエアで解析した。図２Ａ～Ｂに示される結果は、ＲＯＲ１発現細胞に対する抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体 ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４及びＲＯＲ１－Ｔａｂ１の結合活性を示す。無関係なｍＩｇＧ１を陰性対照として使用した。
実施例１．４ 抗ＲＯＲ１抗体の内在化の特性決定
抗ＲＯＲ１抗体の結合内在化を、ＲＯＲ１発現骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６を用いて特徴決定した。細胞を採取し、ＦＡＣＳバッファーに３００万／ｍｌの密度で再懸濁した。希釈抗体をチューブに加え、４℃で３０分間インキュベートした。最初のインキュベーションの後、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄して、結合していない抗体を除去した。次に、各抗体処理の細胞をそれぞれ「対照」及び「内在化」の２群に分けた。「内在化」群の細胞を予め温めた培地に再懸濁し、３７℃で２時間インキュベートして内在化可能とし、一方、「対照」群の細胞は４℃で同じ時間維持した。２回目のインキュベーションの後、細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄し、フルオレセインで標識した二次抗体とともに４℃で３０分間インキュベートした。もう一度遠心分離と洗浄工程を行った後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で読み取るために細胞をＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた。無関係なマウスＩｇＧ対照（ＭＦＩバックグラウンド）をバックグラウンド較正に使用した。「対照」と「内在化」のＭＦＩ読み取り値の差（ΔＭＦＩ）は、ＲＯＲ１抗体の内在化を表し、「対照」の較正されたＭＦＩに対するこのような差は、抗体内在化のパーセンテージを表し、以下のように算出され、以下の表４にまとめる。
抗ＲＯＲ１抗体の結合内在化を、ＲＯＲ１発現骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６を用いて特徴決定した。細胞を採取し、ＦＡＣＳバッファーに３００万／ｍｌの密度で再懸濁した。希釈抗体をチューブに加え、４℃で３０分間インキュベートした。最初のインキュベーションの後、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄して、結合していない抗体を除去した。次に、各抗体処理の細胞をそれぞれ「対照」及び「内在化」の２群に分けた。「内在化」群の細胞を予め温めた培地に再懸濁し、３７℃で２時間インキュベートして内在化可能とし、一方、「対照」群の細胞は４℃で同じ時間維持した。２回目のインキュベーションの後、細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄し、フルオレセインで標識した二次抗体とともに４℃で３０分間インキュベートした。もう一度遠心分離と洗浄工程を行った後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で読み取るために細胞をＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた。無関係なマウスＩｇＧ対照（ＭＦＩバックグラウンド）をバックグラウンド較正に使用した。「対照」と「内在化」のＭＦＩ読み取り値の差（ΔＭＦＩ）は、ＲＯＲ１抗体の内在化を表し、「対照」の較正されたＭＦＩに対するこのような差は、抗体内在化のパーセンテージを表し、以下のように算出され、以下の表４にまとめる。
実施例１．５ 抗ＲＯＲ１抗体のエピトープ結合
ＲＯＲ１抗体の結合エピトープを、競合ＥＬＩＳＡを用いて同定した。簡単に述べれば、９６ウェルプレートを１μｇ／ｍＬの精製抗体でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳで洗浄した後、プレートをブロッキングバッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０及び２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）とともに３７℃で２時間ブロッキングした。ＲＯＲ１抗体（サンプル）又は無関係なマウスＩｇＧ（ベースライン）と予め混合したビオチン化ヒトＲＯＲ１－ＥＣＤタンパク質をプレートウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした後、３回洗浄した。次に、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（１：５０００希釈）を各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした後、更に３回洗浄した。発色のためにテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）発色溶液を５分間加えた後、１Ｍ ＨＣｌで反応を停止した。４５０ｎｍでの吸光度（ＯＤ４５０）をマイクロプレートリーダーで測定した。ＯＤ４５０ベースラインは、競合が無い状態でのＲＯＲ１抗体に結合するヒトＲＯＲ１－ＥＣＤのレベルを表し、ＯＤ４５０ベースラインとＯＤ４５０サンプルの差は、プレートにコーティングされたＲＯＲ１抗体と溶液中の抗体との競合を反映する。阻害パーセンテージは、以下の式：
により算出した。
ＲＯＲ１抗体の結合エピトープを、競合ＥＬＩＳＡを用いて同定した。簡単に述べれば、９６ウェルプレートを１μｇ／ｍＬの精製抗体でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳで洗浄した後、プレートをブロッキングバッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０及び２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）とともに３７℃で２時間ブロッキングした。ＲＯＲ１抗体（サンプル）又は無関係なマウスＩｇＧ（ベースライン）と予め混合したビオチン化ヒトＲＯＲ１－ＥＣＤタンパク質をプレートウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした後、３回洗浄した。次に、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（１：５０００希釈）を各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした後、更に３回洗浄した。発色のためにテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）発色溶液を５分間加えた後、１Ｍ ＨＣｌで反応を停止した。４５０ｎｍでの吸光度（ＯＤ４５０）をマイクロプレートリーダーで測定した。ＯＤ４５０ベースラインは、競合が無い状態でのＲＯＲ１抗体に結合するヒトＲＯＲ１－ＥＣＤのレベルを表し、ＯＤ４５０ベースラインとＯＤ４５０サンプルの差は、プレートにコーティングされたＲＯＲ１抗体と溶液中の抗体との競合を反映する。阻害パーセンテージは、以下の式：
以下の表５は、競合ＥＬＩＳＡの結果を阻害率として示し、ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４がＲＯＲ１－Ｔａｂ２と競合するが、ＲＯＲ１－Ｔａｂ１とは競合しないことを示す。
実施例２．ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４のヒト化設計
ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４可変領域遺伝子をヒト化設計のために使用した。この方法の第１の工程において、全体的に最もマッチするヒト生殖細胞系Ｉｇ Ｖ遺伝子配列を見つけるために、ヒトＩｇ Ｖ遺伝子配列の利用可能なデータベースに対して、ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４のＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列を比較した。更に、それぞれマウスＶＨ及びＶＬ領域に対して最高の相同性を有するヒトフレームワークを見つけるために、Ｊ－領域データベースに対して、ＶＨ又はＶＬのフレームワーク４セグメントを比較した。軽鎖については、最も近いヒトＶ遺伝子マッチはＯ１８遺伝子であり、重鎖については、最も近いヒトマッチはＶＨ１－６９遺伝子であった。次に、ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４軽鎖のＶＬドメインのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を、ＣＤＲ－Ｌ３の後にＪＫ４フレームワーク４配列を有するＯ１８遺伝子のフレームワーク配列にそれぞれグラフトし；ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４重鎖のＶＨドメインのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３を、ＣＤＲ－Ｈ３の後にＪＨ６フレームワーク４配列を有するＶＨ１－６９のフレームワーク配列にグラフトした、ヒト化可変ドメイン配列を設計した。次に、ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４の三次元Ｆｖモデルを作成して、マウスアミノ酸がループ構造又はＶＨ／ＶＬ界面の支持に関与するフレームワーク位置があったかどうかを決定した。ヒト化配列中のこれらの残基は、親和性／活性を保持するために同じ位置でマウス残基に復帰突然変異させることができる。ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４ ＶＨ及びＶＬに関して幾つかの望ましい復帰突然変異を特定し、以下の表６に示されるとおりの代替的なＶＨ及びＶＬ設計を構築した。
ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４可変領域遺伝子をヒト化設計のために使用した。この方法の第１の工程において、全体的に最もマッチするヒト生殖細胞系Ｉｇ Ｖ遺伝子配列を見つけるために、ヒトＩｇ Ｖ遺伝子配列の利用可能なデータベースに対して、ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４のＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列を比較した。更に、それぞれマウスＶＨ及びＶＬ領域に対して最高の相同性を有するヒトフレームワークを見つけるために、Ｊ－領域データベースに対して、ＶＨ又はＶＬのフレームワーク４セグメントを比較した。軽鎖については、最も近いヒトＶ遺伝子マッチはＯ１８遺伝子であり、重鎖については、最も近いヒトマッチはＶＨ１－６９遺伝子であった。次に、ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４軽鎖のＶＬドメインのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を、ＣＤＲ－Ｌ３の後にＪＫ４フレームワーク４配列を有するＯ１８遺伝子のフレームワーク配列にそれぞれグラフトし；ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４重鎖のＶＨドメインのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３を、ＣＤＲ－Ｈ３の後にＪＨ６フレームワーク４配列を有するＶＨ１－６９のフレームワーク配列にグラフトした、ヒト化可変ドメイン配列を設計した。次に、ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４の三次元Ｆｖモデルを作成して、マウスアミノ酸がループ構造又はＶＨ／ＶＬ界面の支持に関与するフレームワーク位置があったかどうかを決定した。ヒト化配列中のこれらの残基は、親和性／活性を保持するために同じ位置でマウス残基に復帰突然変異させることができる。ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４ ＶＨ及びＶＬに関して幾つかの望ましい復帰突然変異を特定し、以下の表６に示されるとおりの代替的なＶＨ及びＶＬ設計を構築した。
更に、ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４のＣＤＲ－Ｈ２の２つの「ＮＧ」（Ａｓｎ－Ｇｌｙ）アミノ酸により導入されるアスパラギンの脱アミド化の可能性を回避するために、異なる点突然変異を有する４つのマウスＶＨ配列も設計し、表６の最後の４つのＶＨ配列に示す。抗体のＣＤＲ－Ｈ２における「ＮＧ」（Ａｓｎ－Ｇｌｙ）アミノ酸により誘導されるアスパラギンの脱アミド化及び抗体の安定性に及ぼすその影響については、例えば、Qingrong Yan et al., (2018) Structure Based Prediction of Asparagine Deamidation Propensity in Monoclonal Antibodies, mAbs, 10:6, 901-912を参照されたい。
実施例３．ヒト化抗ＣＤ３抗体の作製及び特性決定
ハイブリドーマにより製造される抗ＣＤ３モノクローナル抗体ｍＡｂＣＤ３－００１を、従来のハイブリドーマ技術を用いて作製し、選択した後、従来のＣＤＲグラフト法によってヒト化した。次に、ヒト化ＶＨ配列に復帰突然変異を導入し、アスパラギンの脱アミド化傾向を除去するために、ヒト化κ鎖のＮＡを置換するためのＮＳ突然変異を作出した（参照によりその全体が本明細書に援用されるＰＣＴ／ＣＮ／１２０９９１に、詳細な記載が提供される）。得られたヒト化ＶＨ及びＶＬ構築物を表７（以下）に示す。
ハイブリドーマにより製造される抗ＣＤ３モノクローナル抗体ｍＡｂＣＤ３－００１を、従来のハイブリドーマ技術を用いて作製し、選択した後、従来のＣＤＲグラフト法によってヒト化した。次に、ヒト化ＶＨ配列に復帰突然変異を導入し、アスパラギンの脱アミド化傾向を除去するために、ヒト化κ鎖のＮＡを置換するためのＮＳ突然変異を作出した（参照によりその全体が本明細書に援用されるＰＣＴ／ＣＮ／１２０９９１に、詳細な記載が提供される）。得られたヒト化ＶＨ及びＶＬ構築物を表７（以下）に示す。
ヒトＶＨ配列とヒトＶＫ配列の対合は、ＨｕＥＭ０００６－０１－２４（配列番号２２及び２４のＶＨ／ＶＬ対を有する）及びＨｕＥＭ０００６－０１－２７（配列番号２３及び２４のＶＨ／ＶＬ対を有する）と呼ばれる２つのヒト化抗体を作出した（表７）。組換えヒト化ｍＡｂをＨＥＫ２９３細胞で一過性に発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。
ヒト化抗ＣＤ３抗体の結合活性を、ヒトＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株でフローサイトメトリーによって試験した。ＦＡＣＳバッファー中のＪｕｒｋａｔ細胞 ５×１０５を９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。細胞を４００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、各ウェルについて、１００μｌの連続希釈抗体を加え、細胞と混合した。４℃での４０分間のインキュベーション後に、プレートを数回洗浄して余分な抗体を除去した。次に、二次蛍光色素結合抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ヤギ抗ヒトＩｇＧ１ Ｈ＆Ｌ；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－６０６－１７０）を加え、室温で２０分間、細胞とともにインキュベートした。もう一度遠心分離及び洗浄工程を行った後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で読み取るために細胞をＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）の読み取り値を抗体濃度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウエアで解析した。抗体 ＨｕＥＭ０００６－０１－２４は、抗体 ＨｕＥＭ０００６－０１－２７よりも高いＣＤ３結合親和性を示した。
実施例４．ＲＯＲ１／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇの作製
ヒトＲＯＲ１及びヒトＣＤ３の両方を認識する一群のＦＩＴ－Ｉｇタンパク質を、抗ＲＯＲ１部分として表６のＶＨ／ＶＬ配列、抗ＣＤ３部分として表７のＶＨ／ＶＬ配列、及び表８のヒト定常領域配列を用いて構築した。
ヒトＲＯＲ１及びヒトＣＤ３の両方を認識する一群のＦＩＴ－Ｉｇタンパク質を、抗ＲＯＲ１部分として表６のＶＨ／ＶＬ配列、抗ＣＤ３部分として表７のＶＨ／ＶＬ配列、及び表８のヒト定常領域配列を用いて構築した。
ＦＩＴ－Ｉｇ分子は、国際公開第２０１５／１０３０７２号に記載される一般的な手順に従って構築した。各ＦＩＴ－Ｉｇは、以下の構造を有する３つのポリペプチド鎖からなった：
鎖＃１（長鎖）：ＶＬＡ－ＣＬ－ＶＨＢ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３；
鎖＃２（第１の短鎖）：ＶＨＡ－ＣＨ１；
鎖＃３（第２の短鎖）：ＶＬＢ－ＣＬ；
ここで、Ａは、ＲＯＲ１を表し、Ｂは、ＣＤ３を表し、ＶＬＲＯＲ１は、ＲＯＲ１を認識するヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨＣＤ３は、ＣＤ３を認識するヒト化モノクローナル抗体の重鎖可変ドメインであり、ＶＬＣＤ３は、ＣＤ３を認識するヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨＲＯＲ１は、ＲＯＲ１を認識するヒト化モノクローナル抗体の重鎖可変ドメインであり、各ＣＬは、軽鎖定常ドメイン（配列番号３２）であり、各ＣＨ１は、第１の重鎖定常ドメイン（配列番号３３）であり、ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３は、ＣＨ１からＦｃ領域の末端までのＣ末端重鎖定常領域（配列番号３１）である。
鎖＃１（長鎖）：ＶＬＡ－ＣＬ－ＶＨＢ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３；
鎖＃２（第１の短鎖）：ＶＨＡ－ＣＨ１；
鎖＃３（第２の短鎖）：ＶＬＢ－ＣＬ；
ここで、Ａは、ＲＯＲ１を表し、Ｂは、ＣＤ３を表し、ＶＬＲＯＲ１は、ＲＯＲ１を認識するヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨＣＤ３は、ＣＤ３を認識するヒト化モノクローナル抗体の重鎖可変ドメインであり、ＶＬＣＤ３は、ＣＤ３を認識するヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨＲＯＲ１は、ＲＯＲ１を認識するヒト化モノクローナル抗体の重鎖可変ドメインであり、各ＣＬは、軽鎖定常ドメイン（配列番号３２）であり、各ＣＨ１は、第１の重鎖定常ドメイン（配列番号３３）であり、ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３は、ＣＨ１からＦｃ領域の末端までのＣ末端重鎖定常領域（配列番号３１）である。
長鎖ベクターを構築するために、ＶＬＲＯＲ１－ＣＬ－ＶＨＣＤ３セグメントをコードするｃＤＮＡをｄｅ ｎｏｖｏ合成し、ヒトＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３のコード配列を含むベクターの多重クローニング部位（ＭＣＳ）に挿入した。総てのドメインフラグメントが適正なリーディングフレーム内にあることを保証するために、得られたベクターにおけるＭＣＳ配列を、相同組換え中に除去した。同様に、第１及び第２の短鎖を構築するために、ＶＨＲＯＲ１及びＶＬＣＤ３構造遺伝子をｄｅ ｎｏｖｏ合成し、それぞれヒトＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインのコードセグメントを含む適当なベクターのＭＣＳに挿入した。
ヒト化ＶＨとヒト化ＶＬの対合は、以下の表９に挙げられているヒト化ＲＯＲ１／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質を作出した。ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４の親マウスＶＨ／ＶＬ及びヒト定常配列を有するキメラ抗体（ＦＩＴ１００７－１２Ｂ）もまた、ヒト化結合タンパク質のランク付けのための陽性対照として作製した。
表１０に挙げられている組換えＦＩＴ－Ｉｇタンパク質を本明細書に記載されるとおりに一過性に発現させ、精製した。各ＦＩＴ－Ｉｇ構築物について、３つのポリペプチド鎖についてそれぞれ３つのプラスミドをＨＥＫ ２９３Ｆ細胞に共トランスフェクトした。約６日間のトランスフェクション後の細胞培養の後に、上清を採取し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーに供した。精製抗体の組成及び純度をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分析した。ＰＢＳ中の精製抗体をＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＳＷ３０００、３００×４．６ｍｍ、ＳＥＣカラム（ＴＯＳＯＨ）に適用した。２８０ｎｍ及び２１４ｎｍでのＵＶ検出を用いたＤＩＯＮＥＸ（商標）ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＳＥＣのために使用した。発現及びＳＥＣ－ＨＰＬＣの結果を以下の表１０に示した。
Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６バイオレイヤー干渉（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＬＬＣ）を用い、ＲＯＲ１／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇタンパク質を解離速度定数（ｋｏｆｆ、「オフレート」）に関してアッセイし、ランク付けを行った。まず、抗体を補足するために、抗ｈＩｇＧ Ｆｃ補足（ＡＨＣ）バイオセンサー（Ｐａｌｌ）を１００ｎＭの濃度で３０秒間抗体に曝し、次に、ランニングバッファー（１×ｐＨ ７．２ ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％ＢＳＡ）に６０秒間浸漬してベースラインを確認した。捕捉した抗体を有するセンサーを１０μｇ／ｍｌの組換えヒトＲＯＲ１ ＥＣＤタンパク質に５分間浸漬して会合を測定し、その後、ランニングバッファーに１２００秒間浸漬して解離を測定した。ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ解析ソフトウエア（Ｐａｌｌ）を用い、会合及び解離曲線を１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングした。結果を以下の表１０に示す。オフレート比を、ＦＩＴ１００７－１２Ｂのオフレートに対する抗体のオフレートにより算出した。比が小さいほど、親キメラ抗体 ＦＩＴ１００７－１２Ｂに比べて、その抗体の解離が遅いことを示す。
ＦＩＴ１００７－１２Ｂ－１のＶＨ／ＶＬヒト化デザインを最高の結合活性として選択した。また、ＦＩＴ１００７－１２Ｂ－１３のＣＤＲ－Ｈ２点突然変異デザインは、他の設計と比較して高い発現力価及び結合活性を示した。「ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４ＶＨ（ＡＡ）」（配列番号１７）の突然変異デザインを、候補分子を作製するための「ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４ＶＨ．１ａ」（配列番号１０）のＶＨヒト化デザインを有する組合せとして選択した。ヒト化ＶＨ配列（即ち、ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４ＶＨ．１ａ（ＡＡ））を以下に示す。
実施例５．ＲＯＲ１／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ及びＭＡＴ－Ｆａｂの構築及び発現
ＦＩＴ－Ｉｇの構築には、実施例４に示したものと同じ方法を使用した。免疫グロブリンドメイン間にリンカーは使用しなかった。ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質の完全配列は、表１１の配列情報に示す。
ＦＩＴ－Ｉｇの構築には、実施例４に示したものと同じ方法を使用した。免疫グロブリンドメイン間にリンカーは使用しなかった。ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質の完全配列は、表１１の配列情報に示す。
また、一群のＲＯＲ１／ＣＤ３ ＭＡＴ－Ｆａｂタンパク質も、国際公開第２０１８／０３５０８４号に記載の手順に従って同じＶＨ／ＶＬ配列の組合せを用いて構築した。各ＭＡＴ－Ｆａｂは、以下の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなった：
鎖＃１（「ノブ」を有する長鎖）：ＶＬＡ－ＣＬ－ＶＨＢ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３；
鎖＃２（第１の短鎖）：ＶＨＡ－ＣＨ１；
鎖＃３（第２の短鎖）：ＶＬＢ－ＣＬ；
鎖＃４（Ｆｃ「ホール」）：ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３；
ここで、鎖＃１は、「ノブ」としてＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有する変異型ヒト定常ＩｇＧ１を有し、鎖＃４は、「ホール」としてＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するＦｃ鎖であり、Ａは、ＲＯＲ１を表し、Ｂは、ＣＤ３を表す。
鎖＃１（「ノブ」を有する長鎖）：ＶＬＡ－ＣＬ－ＶＨＢ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３；
鎖＃２（第１の短鎖）：ＶＨＡ－ＣＨ１；
鎖＃３（第２の短鎖）：ＶＬＢ－ＣＬ；
鎖＃４（Ｆｃ「ホール」）：ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３；
ここで、鎖＃１は、「ノブ」としてＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗの突然変異を有する変異型ヒト定常ＩｇＧ１を有し、鎖＃４は、「ホール」としてＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの突然変異を有するＦｃ鎖であり、Ａは、ＲＯＲ１を表し、Ｂは、ＣＤ３を表す。
ＦＩＴ－Ｉｇに関して従前に示されているものと同様のクローニング法に従い、ＭＡＴ－Ｆａｂポリペプチド鎖のＶＨ／ＶＬ遺伝子を合成的に作製し、次に、個々の定常ドメインを含むベクターに個々にクローニングした。ＭＡＴ－Ｆａｂタンパク質の完全配列を表１２の配列情報に示す。
組換えＦＩＴ－Ｉｇ及びＭＡＴ－Ｆａｂタンパク質を本明細書に記載するとおりに一過性に発現させ、精製した。各ＦＩＴ－Ｉｇ又はＭＡＴ－Ｆａｂについて、対応するポリペプチド鎖をそれぞれコードする３つ又は４つのプラスミドをＨＥＫ ２９３Ｆ細胞に共トランスフェクトした。約６日間のトランスフェクション後の細胞培養の後に、上清を採取し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーに供した。精製抗体の組成及び純度をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分析した。ＰＢＳ中の精製抗体をＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＳＷ３０００、３００×４．６ｍｍ、ＳＥＣカラム（ＴＯＳＯＨ）に適用した。２８０ｎｍ及び２１４ｎｍでのＵＶ検出を用いたＤＩＯＮＥＸ（商標）ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＳＥＣのために使用した。発現及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を以下の表１３に示す。
ヒト化候補物であるＦＩＴ１００７－１２Ｂ－１７及びその親キメラＦＩＴ－Ｉｇ ＦＩＴ１００７－１２ＢのＲＯＲ１結合親和性／速度を、実施例３に記載したものと同じ方法を用いて測定した。各抗体について、６種類の抗原濃度（即ち、５００ｎＭからの３倍希釈）により測定値を滴定した。結合速度及び結合親和性を以下の表１４に示す。ＦＩＴ１００７－１２Ｂ－１８、ＭＡＴ１００７－１２Ｂ－１７及びＭＡＴ１００７－１２Ｂ－１８の結合速度は、ＦＩＴ１００７－１２Ｂ－１７と同等である。これらの候補物は、同じＲＯＲ１結合Ｆａｂを共有している。
実施例６．ヒト化ＦＩＴ－Ｉｇ及びＭＡＴ－Ｆａｂの結合の特性決定
ＲＯＲ１×ＣＤ３抗体の細胞結合活性を、ヒトＴＣＲ／ＣＤ３複合体をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ－ＣＤ３－ＴＣＲ）及びＲＯＲ１発現腫瘍細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ａ５４９及びＲＰＭＩ８２２６）で測定した。簡単に述べれば、５×１０５細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。細胞を４００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、各ウェルについて、１００μｌの連続希釈抗体を加え、細胞を混合した。４℃での４０分間のインキュベーション後に、プレートを数回洗浄して余分な抗体を除去した。次に、二次蛍光色素結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を加え、室温で２０分間、細胞とともにインキュベートした。もう一度遠心分離及び洗浄工程を行った後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）での読み取りのために細胞をＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）の読み取り値を抗体濃度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウエアで解析した。
ＲＯＲ１×ＣＤ３抗体の細胞結合活性を、ヒトＴＣＲ／ＣＤ３複合体をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ－ＣＤ３－ＴＣＲ）及びＲＯＲ１発現腫瘍細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ａ５４９及びＲＰＭＩ８２２６）で測定した。簡単に述べれば、５×１０５細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。細胞を４００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、各ウェルについて、１００μｌの連続希釈抗体を加え、細胞を混合した。４℃での４０分間のインキュベーション後に、プレートを数回洗浄して余分な抗体を除去した。次に、二次蛍光色素結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を加え、室温で２０分間、細胞とともにインキュベートした。もう一度遠心分離及び洗浄工程を行った後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）での読み取りのために細胞をＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）の読み取り値を抗体濃度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウエアで解析した。
図３に示されるように、ＣＨＯ－ＣＤ３－ＴＣＲ結合能は、各分子のＣＤ３結合親和性及び価数に相関していた。ＦＩＴ－Ｉｇをその親抗ＣＤ３モノクローナルＩｇＧ１抗体と比較することにより（即ち、ＦＩＴ１００７－１２Ｂ－１７対ＨｕＥＭ０００６－０１－２４（ＶＨ／ＶＬ配列：配列番号２２及び２４、表７）、又は、ＦＩＴ１００７－１２Ｂ－１８対ＨｕＥＭ０００６－０１－２７（ＶＨ／ＶＬ配列：配列番号２３及び２４、表７））、ＦＩＴ－Ｉｇは、比較的低い結合能を示したが、これは立体障害によるものであり得る。
図４Ａ～Ｄに示されるように、ＲＯＲ１発現腫瘍細胞に対する結合能は、ＦＩＴ－Ｉｇとそれらの共通の親抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体（ＲＯＲ１－ｍＡｂ００４ＶＨ．１ａ（ＡＡ）及びＲＯＲ１－ｍＡｂ００４ＶＫ．１ａの配列（配列番号２１及び１３）を有する、ＨｕＲＯＲ１－ｍＡｂ００４－１）の間で比較的類似している。ＭＡＴ－Ｆａｂの結合曲線は、ＦＩＴ－Ｉｇ及びその親抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体とは異なることが明らかであり、これは標的結合価の違いによるものであり得る。
実施例７．ヒト化ＦＩＴ－Ｉｇ及びＭＡＴ－ＦａｂのリダイレクトされたＣＤ３活性化
ＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ抗体及びＭＡＴ－Ｆａｂ抗体によりリダイレクトされたＣＤ３活性化を測定するために、共培養レポーター遺伝子アッセイを用いた。このアッセイでは、細胞表面ＣＤ３が活性化された場合にＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ｌｕｃ細胞が下流のルシフェラーゼシグナルを惹起する。ＲＯＲ１発現標的細胞として、ＲＯＲ１の結合時に二重特異性ＲＯＲ１×ＣＤ３抗体を介してＴ細胞上のＣＤ３／ＴＣＲ複合体を架橋し得るＲＰＭＩ８２２６細胞を使用した。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ｌｕｃ細胞及びＲＰＭＩ８２２６細胞を洗浄し、アッセイ媒体（１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０）にそれぞれ再懸濁した。両細胞種を９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３９０３）に１×１０５細胞／ウェルで、１：１の比で播種した。ＦＩＴ－Ｉｇ又はＭＡＴ－Ｆａｂ抗体を加え、細胞を混合し、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、製造者の説明書に従ってＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）発光アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１３０）試薬を調製し、ウェルに加えた。プレートの発光シグナルを、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（商標）ＬＵＸマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて読み取った。結果を図５に示す。
ＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ抗体及びＭＡＴ－Ｆａｂ抗体によりリダイレクトされたＣＤ３活性化を測定するために、共培養レポーター遺伝子アッセイを用いた。このアッセイでは、細胞表面ＣＤ３が活性化された場合にＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ｌｕｃ細胞が下流のルシフェラーゼシグナルを惹起する。ＲＯＲ１発現標的細胞として、ＲＯＲ１の結合時に二重特異性ＲＯＲ１×ＣＤ３抗体を介してＴ細胞上のＣＤ３／ＴＣＲ複合体を架橋し得るＲＰＭＩ８２２６細胞を使用した。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ｌｕｃ細胞及びＲＰＭＩ８２２６細胞を洗浄し、アッセイ媒体（１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０）にそれぞれ再懸濁した。両細胞種を９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３９０３）に１×１０５細胞／ウェルで、１：１の比で播種した。ＦＩＴ－Ｉｇ又はＭＡＴ－Ｆａｂ抗体を加え、細胞を混合し、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、製造者の説明書に従ってＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）発光アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１３０）試薬を調製し、ウェルに加えた。プレートの発光シグナルを、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（商標）ＬＵＸマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて読み取った。結果を図５に示す。
１つの無関係な陰性対照であるＦＩＴ－Ｉｇ（抗ＥＧＦＲ×ｃＭＥＴ二重特異性分子（ＥＭＢ０１））及び２つの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（即ち、ＨｕＥＭ０００６－０１－２４及びＨｕＥＭ０００６－０１－２７）も試験した。総ての二重特異性ＲＯＲ１×ＣＤ３結合タンパク質が、ＲＯＲ１発現標的細胞の存在下で、ＲＯＲ１結合活性を持たない単一特異性抗ＣＤ３結合タンパク質に比べて、Ｔ細胞活性化の上昇をもたらした。
非標的のリダイレクトされたＣＤ３活性化を、標的細胞の不存在下でＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ｌｕｃに基づくレポーター遺伝子アッセイを用いて試験した。結果を図６に示す。二重特異性結合タンパク質の共標的を発現する細胞（この場合には、ＲＯＲ１）の不存在下で、このアッセイを行った。二重特異性ＲＯＲ１×ＣＤ３抗体は、ＲＯＲ１発現標的細胞の不存在下で、抗ＣＤ３抗体単独よりも非標的のリダイレクトされた活性化が低かった。
実施例８．ヒト化ＦＩＴ－Ｉｇ及びＭＡＴ－ＦａｂのリダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性
ＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性結合タンパク質の腫瘍細胞殺傷力を、標的細胞としてヒト乳ガン細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びエフェクター細胞としてヒトＴ細胞を使用する、リダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性アッセイで測定した。簡単に述べれば、細胞を採取し、洗浄し、アッセイ媒体（１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０）で再懸濁した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を平底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５９９）に５×１０４細胞／ウェルで播種した。Ｔ細胞を、市販のＰＢＭＣ単離キット（ＥａｓｙＳｅｐ（商標）、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７９５１）を用いてヒトＰＢＭＣから精製し、ウェルに２×１０５細胞／ウェルで加えた。試験抗体を加え、細胞の混合物を３７℃で４８時間インキュベートした。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出を、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ１７８０）で測定した。製造者の説明書に従い、ＯＤ４９０の読み取り値を得た。また、最大及び最小溶解もＣｙｔｏＴｏｘキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ１７８０）説明書に従って求めた。最大溶解は、腫瘍細胞だけを含むサンプルに溶解バッファーを加えることによって求めた。最小溶解は、培養培地バックグラウンドから求めた。最小溶解を総てのサンプルの読み取り値から差し引いた。標的細胞であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１の最大溶解（１００％）－最初溶解（０％）を標準化の分母とした。ＬＤＨ放出のパーセンテージを二重特異性抗体の濃度に対してプロットした。図７に示されるように、ＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性結合タンパク質は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞に対してリダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性を示したが、ＥＧＦＲ×ｃＭＥＴ二重特異性結合ＦＩＴ－Ｉｇ ＥＭＢ０１は、低い細胞傷害活性を示した。
ＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性結合タンパク質の腫瘍細胞殺傷力を、標的細胞としてヒト乳ガン細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びエフェクター細胞としてヒトＴ細胞を使用する、リダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性アッセイで測定した。簡単に述べれば、細胞を採取し、洗浄し、アッセイ媒体（１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０）で再懸濁した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を平底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５９９）に５×１０４細胞／ウェルで播種した。Ｔ細胞を、市販のＰＢＭＣ単離キット（ＥａｓｙＳｅｐ（商標）、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７９５１）を用いてヒトＰＢＭＣから精製し、ウェルに２×１０５細胞／ウェルで加えた。試験抗体を加え、細胞の混合物を３７℃で４８時間インキュベートした。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出を、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ１７８０）で測定した。製造者の説明書に従い、ＯＤ４９０の読み取り値を得た。また、最大及び最小溶解もＣｙｔｏＴｏｘキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ１７８０）説明書に従って求めた。最大溶解は、腫瘍細胞だけを含むサンプルに溶解バッファーを加えることによって求めた。最小溶解は、培養培地バックグラウンドから求めた。最小溶解を総てのサンプルの読み取り値から差し引いた。標的細胞であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１の最大溶解（１００％）－最初溶解（０％）を標準化の分母とした。ＬＤＨ放出のパーセンテージを二重特異性抗体の濃度に対してプロットした。図７に示されるように、ＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性結合タンパク質は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞に対してリダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性を示したが、ＥＧＦＲ×ｃＭＥＴ二重特異性結合ＦＩＴ－Ｉｇ ＥＭＢ０１は、低い細胞傷害活性を示した。
実施例９．ＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性抗体で処置したヒトＰＢＭＣ移植Ｍ－ＮＳＧマウスにおけるＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍の体積
抗腫瘍効果を、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞を欠く免疫不全系統であるＭ－ＮＳＧマウスで評価した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（５×１０６）を右の背の側部に皮下注射した。腫瘍細胞を接種した５日後に、マウスに３．５×１０６ヒトＰＢＭＣの単回腹腔内用量を施した。１５日目に動物を腫瘍サイズ（約１５０～３００ｍｍ３）に基づいて無作為化し、翌日に処置を開始した。腫瘍成長をノギス測定によりモニタリングした。最初の投与後１６日目に試験を終了し、ＧＶＨＤ徴候が表れた際にマウスを安楽死させた。マウスを、週１回、３週間（ＱＷ×３）、１ｍｇ／ｋｇのＦＩＴ１００７－１２Ｂ－１７、ＦＩＴ１００７－１２Ｂ－１８、ＭＡＴ１００７－１２Ｂ－１７又はビヒクルの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射で処置した。図８に示されるように、ＦＩＴ－Ｉｇ及びＭＡＴ－Ｆａｂ処置群マウスは、ビヒクル群と比較することにより、有意に腫瘍成長を阻害した（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ビヒクル群と比較、ダネット検定と組合せた２元配置ＡＮＯＶＡ）。
抗腫瘍効果を、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞を欠く免疫不全系統であるＭ－ＮＳＧマウスで評価した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（５×１０６）を右の背の側部に皮下注射した。腫瘍細胞を接種した５日後に、マウスに３．５×１０６ヒトＰＢＭＣの単回腹腔内用量を施した。１５日目に動物を腫瘍サイズ（約１５０～３００ｍｍ３）に基づいて無作為化し、翌日に処置を開始した。腫瘍成長をノギス測定によりモニタリングした。最初の投与後１６日目に試験を終了し、ＧＶＨＤ徴候が表れた際にマウスを安楽死させた。マウスを、週１回、３週間（ＱＷ×３）、１ｍｇ／ｋｇのＦＩＴ１００７－１２Ｂ－１７、ＦＩＴ１００７－１２Ｂ－１８、ＭＡＴ１００７－１２Ｂ－１７又はビヒクルの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射で処置した。図８に示されるように、ＦＩＴ－Ｉｇ及びＭＡＴ－Ｆａｂ処置群マウスは、ビヒクル群と比較することにより、有意に腫瘍成長を阻害した（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ビヒクル群と比較、ダネット検定と組合せた２元配置ＡＮＯＶＡ）。
実施例１０．ヒト化抗ＲＯＲ１抗体の内在化の特性決定
従前に実施例１．４に記載したものと同様の方法でＲＯＲ１発現骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６を用い、ヒト化抗ＲＯＲ１抗体の結合内在化の特性決定を行った。簡単に述べれば、細胞を採取し、３００万／１ｍＬの密度でＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。希釈抗体をチューブに加え、４℃で３０分間インキュベートした。最初のインキュベーションの後、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄して結合していない抗体を除去した。次に、各抗体処置の細胞を、それぞれ４℃、３７℃、及び３７℃＋ＰＡＯの３群に分けた。３７℃「内在化」群の細胞を予め温めた培地に再懸濁し、３７℃で２時間インキュベートして内在化させ、４℃の「対照」群の細胞は４℃で同じ時間維持した。「３７℃＋ＰＡＯ」群の細胞は、予め温めた培地に再懸濁し、３μＭフェニルアルシンオキシド（膜タンパク質の内在化を防ぐためのエンドサイトーシス阻害剤）の存在下、３７℃で２時間インキュベートした。３７℃＋ＰＡＯ処置群は、抗体解離の効果を較正する目的を果たす。第２のインキュベーションの後、細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄し、フルオレセイン標識二次抗体とともに４℃で３０分間インキュベートした。もう一度遠心分離及び洗浄工程を行った後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）での読み取りのために、細胞をＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。無関係なマウスＩｇＧ対照（ＭＦＩバックグラウンド）を算出し、バックグラウンド較正に使用した。「対照」のＭＦＩ読み取り値と「内在化」の読み取り値の差（ΔＭＦＩ）がＲＯＲ１抗体の内在化を表し、「対照」の較正されたＭＦＩに対するこのような差が抗体内在化のパーセンテージを表し、これらを、以下のように計算し、表１５にまとめる。図９に示されるように、１００ｎＭ抗体濃度で、ＨｕＲＯＲ１－ｍＡｂ００４－１及びその各ＦＩＴ－Ｉｇ／ＭＡＴ－Ｆａｂは、限定された内在化を示した。算出したＨｕＲＯＲ－ｍＡｂ００４－１及びＦＩＴ１００７－１２Ｂ－１７の抗体内在化パーセンテージは、実施例１．４、表４に示した結果と一致していた。
従前に実施例１．４に記載したものと同様の方法でＲＯＲ１発現骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６を用い、ヒト化抗ＲＯＲ１抗体の結合内在化の特性決定を行った。簡単に述べれば、細胞を採取し、３００万／１ｍＬの密度でＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。希釈抗体をチューブに加え、４℃で３０分間インキュベートした。最初のインキュベーションの後、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄して結合していない抗体を除去した。次に、各抗体処置の細胞を、それぞれ４℃、３７℃、及び３７℃＋ＰＡＯの３群に分けた。３７℃「内在化」群の細胞を予め温めた培地に再懸濁し、３７℃で２時間インキュベートして内在化させ、４℃の「対照」群の細胞は４℃で同じ時間維持した。「３７℃＋ＰＡＯ」群の細胞は、予め温めた培地に再懸濁し、３μＭフェニルアルシンオキシド（膜タンパク質の内在化を防ぐためのエンドサイトーシス阻害剤）の存在下、３７℃で２時間インキュベートした。３７℃＋ＰＡＯ処置群は、抗体解離の効果を較正する目的を果たす。第２のインキュベーションの後、細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄し、フルオレセイン標識二次抗体とともに４℃で３０分間インキュベートした。もう一度遠心分離及び洗浄工程を行った後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）での読み取りのために、細胞をＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。無関係なマウスＩｇＧ対照（ＭＦＩバックグラウンド）を算出し、バックグラウンド較正に使用した。「対照」のＭＦＩ読み取り値と「内在化」の読み取り値の差（ΔＭＦＩ）がＲＯＲ１抗体の内在化を表し、「対照」の較正されたＭＦＩに対するこのような差が抗体内在化のパーセンテージを表し、これらを、以下のように計算し、表１５にまとめる。図９に示されるように、１００ｎＭ抗体濃度で、ＨｕＲＯＲ１－ｍＡｂ００４－１及びその各ＦＩＴ－Ｉｇ／ＭＡＴ－Ｆａｂは、限定された内在化を示した。算出したＨｕＲＯＲ－ｍＡｂ００４－１及びＦＩＴ１００７－１２Ｂ－１７の抗体内在化パーセンテージは、実施例１．４、表４に示した結果と一致していた。
ＭＡＴ－Ｆａｂは、３７℃で結合の低下を示し、これは、３７℃での、より低い結合価及びより高い結合解離速度に起因し得る。ＭＡＴ－Ｆａｂの内在化の算出について、結合曲線は１００ｎＭで結合プラトーに達していなかった。
実施例１１．参照ＦＩＴ－Ｉｇの作製及びＦＩＴ１００７－１２Ｂ－１７とのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性の比較
表７に示される抗ＣＤ３抗体配列を用いて、２つの参照抗ＲＯＲ１抗体（ＲＯＲ１－Ｔａｂ１（クローンＲ１２）及びＲＯＲ１－Ｔａｂ２（クローンＤ１０））のうち一方のＶＨ／ＶＬ配列を有するＦＩＴ－Ｉｇを作製した。参照ＦＩＴ－Ｉｇの構築及び作製は、実施例３に記載するとおりに行った。免疫グロブリンドメイン間にリンカーは使用しなかった。ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質の完全配列は、表１６及び１７の配列情報に示す。実施例１．３に記載するとおりの方法を用いて参照ＦＩＴ－Ｉｇの細胞表面結合活性を評価し、実施例６に記載するとおりの方法を用いてリダイレクトされた細胞傷害活性を評価した。
表７に示される抗ＣＤ３抗体配列を用いて、２つの参照抗ＲＯＲ１抗体（ＲＯＲ１－Ｔａｂ１（クローンＲ１２）及びＲＯＲ１－Ｔａｂ２（クローンＤ１０））のうち一方のＶＨ／ＶＬ配列を有するＦＩＴ－Ｉｇを作製した。参照ＦＩＴ－Ｉｇの構築及び作製は、実施例３に記載するとおりに行った。免疫グロブリンドメイン間にリンカーは使用しなかった。ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質の完全配列は、表１６及び１７の配列情報に示す。実施例１．３に記載するとおりの方法を用いて参照ＦＩＴ－Ｉｇの細胞表面結合活性を評価し、実施例６に記載するとおりの方法を用いてリダイレクトされた細胞傷害活性を評価した。
この実施例で使用した２つの参照抗ＲＯＲ１抗体、ＲＯＲ１－Ｔａｂ１（クローンＲ１２）及びＲＯＲ１－Ｔａｂ２（クローンＤ１０）の一方のＶＨ／ＶＬ配列は、以下のとおりある：
図１１は、ＦＩＴ１００７－１２Ｂ－１７と表１６に示した参照ＦＩＴ－Ｉｇ分子との比較を示している。図１１Ａ及び１１Ｂは、ＦＩＴ１００７－１２Ｂ－１７及び参照ＦＩＴ－Ｉｇが、ＲＯＲ１発現ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞の両方に対して同様の細胞表面結合を示すことを示す。しかし、図１１Ｃに示すように、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対するリダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性について、ＦＩＴ１００７－１２Ｂ－１７は、参照ＦＩＴ－Ｉｇ分子よりも強力な細胞傷害性を達成した。
Claims (25)
- ＲＯＲ１に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３である６つのＣＤＲのセットを含んでなり、
ＣＤＲ－Ｈ１は、ＲＳＷＭＮ（配列番号１）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｈ２は、ＲＩＹＰＧＮＧＤＩＫＹＮＧＮＦＫＧ（配列番号２）又はＲＩＹＰＧＮＡＤＩＫＹＮＡＮＦＫＧ（配列番号４）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｈ３は、ＩＹＹＤＦＹＹＡＬＤＹ（配列番号３）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｌ１は、ＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＴ（配列番号５）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｌ２は、ＹＴＳＴＬＱＰ（配列番号６）の配列を含んでなり；かつ
ＣＤＲ－Ｌ３は、ＬＱＹＤＳＬＬＷＴ（配列番号７）の配列を含んでなり、
場合により、前記ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングにより定義される、
単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体が可変重鎖ドメインＶＨ及び可変軽鎖ドメインＶＬを含んでなり、
ＶＨドメインは、配列番号８若しくは１７の配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなり、及び／或いはＶＬドメインは、配列番号９の配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなるか；或いは
ＶＨドメインは、配列番号１０～１２及び２１のいずれか１つから選択される配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなり、及び／或いはＶＬドメインは、配列番号１３～１６のいずれか１つから選択される配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなる、
請求項１に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。 - 前記抗体がキメラ抗体又はヒト化抗体であり、場合により、前記抗体がヒト化抗体であり、
更に場合により、前記抗体のＶＨドメインが、Ｋａｂａｔナンバリングにより、１Ｅ、２７Ｙ及び９４Ｈのアミノ酸残基と、３８Ｋ、４８Ｉ、６６Ｋ及び６７Ａから選択される０～４個の残基とを含んでなり；ＶＬドメインが、Ｋａｂａｔナンバリングにより、７１Ｙのアミノ酸残基と、４Ｌ、４９Ｈ、５８Ｉ及び６９Ｒから選択される０～４個の残基とを含んでなる、
請求項１に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。 - 前記抗体が以下の表からなる群より選択されるＶＨ配列とＶＬ配列の組合せ：
場合により、前記抗体が配列番号２１の配列を含んでなるＶＨドメイン及び配列番号１３の配列を含んでなるＶＬドメインを含んでなる、
請求項１に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。 - 前記抗体が以下の特徴：
（ｉ）ＲＯＲ１発現細胞（例えば、ＲＯＲ１発現骨髄腫細胞株）の細胞表面に結合した際に、内在化する抗体は、細胞に基づくアッセイにおいて測定した場合に、多くとも２０％以下（場合により、１５％以下、又は１４％、１３％、１２％、１１％以下）であり、この内在化は、フローサイトメトリーにより検出される場合、平均蛍光強度（ＭＦＩ）において、３７℃で２時間のインキュベーション後のＲＯＲ１発現細胞（例えば、ＲＯＲ１発現骨髄腫細胞株）の表面に結合する抗体のパーセンテージが４℃で同じ時間維持された対照に対して低下することが反映され得ること；
（ｉｉ）抗体がＲＯＲ１のＩｇ様ドメインのＣ末端においてヒトＲＯＲ１に結合し、場合により、ＲＯＲ１との結合について、配列番号４２及び４３のＶＨ／ＶＬ配列対を有する抗体と競合すること；
（ｉｉｉ）ＲＯＲ１への抗体の結合が抗腫瘍活性（例えば、腫瘍量／成長／細胞拡大の低下）を誘導すること；
のうちの１つ以上を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。 - 請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメントを含んでなる、融合体又は複合体。
- 請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメントをコードする、核酸分子。
- 請求項７に記載の核酸分子を含んでなる、ベクター。
- 請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメントをコードする核酸分子を発現する、宿主細胞。
- 請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された抗体若しくは抗原結合フラグメント、請求項６に記載の融合体若しくは複合体、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター又は請求項９に記載の宿主細胞を含んでなる、医薬組成物。
- 生体サンプルにおいてＲＯＲ１を検出する方法であって、前記生体サンプルを請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された抗体若しくは抗原結合フラグメント又は請求項６に記載の融合体若しくは複合体と接触させることを含んでなる、方法。
- ＲＯＲ１及びＣＤ３と特異的に結合する二重特異性結合タンパク質であって、
ａ）ＲＯＲｌと特異的に結合する第１の抗原結合部位；及び
ｂ）ＣＤ３と特異的に結合する第２の抗原結合部位；
を含んでなり、
第１の抗原結合部位は、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３である６つのＣＤＲのセットを含んでなり、
ＣＤＲ－Ｈ１は、ＲＳＷＭＮ（配列番号１）の配列を含んでなり、
ＣＤＲ－Ｈ２は、ＲＩＹＰＧＮＧＤＩＫＹＮＧＮＦＫＧ（配列番号２）又はＲＩＹＰＧＮＡＤＩＫＹＮＡＮＦＫＧ（配列番号４）の配列を含んでなり、
ＣＤＲ－Ｈ３は、ＩＹＹＤＦＹＹＡＬＤＹ（配列番号３）の配列を含んでなり、
ＣＤＲ－Ｌ１は、ＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＴ（配列番号５）の配列を含んでなり、
ＣＤＲ－Ｌ２は、ＹＴＳＴＬＱＰ（配列番号６）の配列を含んでなり、かつ
ＣＤＲ－Ｌ３は、ＬＱＹＤＳＬＬＷＴ（配列番号７）の配列を含んでなり、
前記ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングにより定義され、
場合により、第１の抗原結合部位は、請求項２～４のいずれか一項で定義されるとおりのＶＨドメイン及びＶＬドメインを含んでなる、
二重特異性結合タンパク質。 - 第２の抗原結合部位がＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３である６つのＣＤＲのセットを含んでなり、
ＣＤＲ－Ｈ１は、ＮＹＹＶＨ（配列番号２５）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｈ２は、ＷＩＳＰＧＳＤＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２６）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｈ３は、ＤＤＹＧＮＹＹＦＤＹ（配列番号２７）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｌ１は、ＫＳＳＱＳＬＬＮＡＲＴＲＫＮＹＬＡ（配列番号２８）の配列を含んでなり；
ＣＤＲ－Ｌ２は、ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号２９）の配列を含んでなり；かつ
ＣＤＲ－Ｌ３は、ＫＱＳＹＩＬＲＴ（配列番号３０）の配列を含んでなり、
前記ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングにより定義され、
場合により、第２の抗原結合部位が、
配列番号２２若しくは２３の配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなるＶＨドメイン、及び／或いは
配列番号２４の配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなるＶＬドメイン
を含んでなる、
請求項１２に記載の二重特異性結合タンパク質。 - 第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖を含んでなり、
（ｉ）第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＡ－ＣＬ－ＶＨＢ－ＣＨ１－Ｆｃを含んでなり、ＣＬは、ＶＨＢに直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＡ－ＣＨ１を含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＢ－ＣＬを含んでなるか；又は
（ｉｉ）第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＡ－ＣＨ１－ＶＬＢ－ＣＬ－Ｆｃを含んでなり、ＣＨ１は、ＶＬＢに直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＡ－ＣＬを含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＢ－ＣＨ１を含んでなり；
ここで、ＶＬは、軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは、軽鎖定常ドメインであり、ＶＨは、重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は、重鎖定常ドメインであり、Ｆｃは、場合によりアミノ末端からカルボキシル末端へヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含んでなる、免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ１のＦｃ）であり、
ＶＬＡ－ＣＬは、ＶＨＡ－ＣＨ１と対合して、第１の抗原Ａと特異的に結合する第１のＦａｂを形成し、ＶＬＢ－ＣＬは、ＶＨＢ－ＣＨ１と対合して、第２の抗原Ｂと特異的に結合する第２のＦａｂを形成し、
第１の抗原Ａは、ＲＯＲ１であり、第２の抗原Ｂは、ＣＤ３であり、
第１のポリペプチド鎖の２つ、第２のポリペプチド鎖の２つ、及び第３のポリペプチド鎖の２つは、会合してＦＩＴ－Ｉｇタンパク質を形成する、
請求項１２又は１３に記載の二重特異性結合タンパク質。 - 第１のポリペプチド鎖が、配列番号３４若しくは３７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなり、
第２のポリペプチド鎖が、配列番号３５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなり、かつ
第３のポリペプチド鎖が、配列番号３６のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなる、
請求項１４に記載の二重特異性結合タンパク質。 - 第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖を含んでなり、
（ｉ）第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＡ－ＣＬ－ＶＨＢ－ＣＨ１－Ｆｃを含んでなり、ＣＬは、ＶＨＢに直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＡ－ＣＨ１を含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＢ－ＣＬを含んでなり；第４のポリペプチド鎖は、Ｆｃを含んでなるか；又は
（ｉｉ）第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＡ－ＣＨ１－ＶＬＢ－ＣＬ－Ｆｃを含んでなり、ＣＨ１は、ＶＬＢに直接融合され；第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＬＡ－ＣＬを含んでなり；第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＶＨＢ－ＣＨ１を含んでなり；第４のポリペプチド鎖は、Ｆｃを含んでなり；
ここで、ＶＬは、軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは、軽鎖定常ドメインであり、ＶＨは、重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は、重鎖定常ドメインであり、Ｆｃは、場合によりアミノ末端からカルボキシル末端へヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含んでなる、免疫グロブリンＦｃ領域であり、
ＶＬＡ－ＣＬは、ＶＨＡ－ＣＨ１と対合して、第１の抗原Ａと特異的に結合する第１のＦａｂを形成し、ＶＬＢ－ＣＬは、ＶＨＢ－ＣＨ１と対合して、第２の抗原Ｂと特異的に結合する第２のＦａｂを形成し、
第１の抗原Ａは、ＲＯＲ１であり、第２の抗原Ｂは、ＣＤ３であり、
第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖は、会合してＭＡＴ－Ｆａｂタンパク質を形成し、
場合により、第１のポリペプチド鎖のＦｃ及び第４のポリペプチド鎖のＦｃは、特にＣＨ３ドメインにおいて、これら２つの鎖のホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成に有利なヘテロ二量体形成修飾を含んでなり、
更に場合により、第１のポリペプチド鎖は、「ノブ」としてＴ３６６Ｗの突然変異を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を有し、第４のポリペプチド鎖は、「ホール」としてＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖの突然変異を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を有し；並びに／又は、第１のポリペプチド鎖は、Ｓ３５４Ｃを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を有し、第４のポリペプチド鎖は、Ｙ３４９Ｃの突然変異を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を有して、ＣＨ３ドメインに追加のジスルフィド橋を形成している、
請求項１２又は１３に記載の二重特異性結合タンパク質。 - 第１のポリペプチド鎖が、配列番号３８若しくは４０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなり、
第２のポリペプチド鎖が、配列番号３５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなり、
第３のポリペプチド鎖が、配列番号３６のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなり、かつ
第４のポリペプチド鎖が、配列番号３９のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれを超える同一性を有する配列を含んでなる、
請求項１６に記載の二重特異性結合タンパク質。 - 請求項１２～１７のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質をコードする、核酸分子。
- 請求項１８の核酸分子を含んでなる、ベクター。
- 請求項１８に記載の核酸分子又は請求項１９に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
- 請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された抗体若しくは抗原結合フラグメント又は請求項１２～１７のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質を調製する方法であって、
請求項９又は請求項２０に記載の宿主細胞を、抗体、抗原結合フラグメント又は二重特異性結合タンパク質の製造を可能とする条件下で培養すること；及び
前記抗体、抗原結合フラグメント又は二重特異性結合タンパク質を前記培養物から回収すること
を含んでなる、方法。 - 請求項１２～１９のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質、請求項２０に記載の核酸、請求項１９に記載のベクター又は請求項２０に記載の宿主細胞を含んでなる、医薬組成物。
- ＲＯＲ１活性が有害である障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に治療上有効な量の請求項１０又は請求項２２に記載の医薬組成物を投与することを含んでなる、方法。
- 前記対象がヒトである、請求項２３に記載の方法。
- 前記障害がガン（例えば、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）等のＲＯＲ１陽性血液悪性腫瘍、又は、肺ガン及び乳ガン（トリプルネガティブ乳ガンを含む）等のＲＯＲ１陽性固形腫瘍）である、請求項２３に記載の方法。
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