CN102137929A - 用放射性同位素标记物标记的抗cdh3抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗CDH3抗体，其能用放射性同位素标记。此外，本发明提供包含抗CDH3抗体作为活性组分的药物组合物和方法。由于CDH3在胰腺、肺、结肠、前列腺、乳腺、胃或肝癌细胞中强烈表达，本发明在胰腺、肺、结肠、前列腺、乳腺、胃或肝癌治疗中是有用的。

Description

用放射性同位素标记物标记的抗CDH3抗体及其用途

技术领域

优先权

本申请要求2008年6月30日提交的美国临时申请流水号61/076,982的权益，并通过提述将其全部内容并入本文。

本发明涉及使用缀合有放射性同位素标记物的抗CDH3抗体来破坏癌细胞的方法，或涉及用于此目的的组合物。

背景技术

钙粘蛋白是细胞-细胞粘附糖蛋白，它们形成钙依赖性细胞间连接点，而且在系统发生中及在成年组织和器官的发育和维持中发挥至关重要的作用(Conacci-Sorrell M等，J Clin Invest，109：987-91，2002)。在胚胎发生期间，特定钙粘蛋白的细胞表达导致嗜同性相互作用，这些相互作用在细胞分选和组织分层的过程中是至关重要的(NoseA等，Cell，54：993-1001，1988；Steinberg MS等，Proc Natl Acad Sci USA，91：206-9，1994及Takeichi M，Science，251：1451-5，1991)。这些细胞附着的改变在细胞失稳中发挥重要作用，而且可改变受到细致调节的上皮结构分化过程(Daniel CW等，Dev Biol，169：511-9，1995及Nose A和Takeichi M，J Cell Biol，103：2649-58，1986)。因为这个原因，已经有人暗示钙粘蛋白的功能丧失或过表达以及编码这些蛋白的基因的背后的控制分子机制与癌发生有关(Behrens，J.Cancer MetastasisRev，18：15-30，1999)。

钙粘蛋白家族细分成多个亚家族，包括经典的E-、P-、和N-钙粘蛋白，每个亚家族表现出独特的组织分布(Takeichi M，Development，102：639-55，1988)。虽然E-钙粘蛋白在所有上皮组织中表达，但是P-钙粘蛋白(CDH3)的表达仅仅局限于分层的上皮的基底层或下层，包括前列腺和皮肤，而且还局限于乳腺肌上皮细胞(Takeichi M，J Cell Biol，103：2649-58，1986及ShimoyamaY等，Cancer Res，49：2128-33，1989)。

现在有大量的证据也揭示异常P-钙粘蛋白表达与细胞增殖及与结肠、乳腺、肺、甲状腺、和宫颈的肿瘤有关(Gamallo，Modern Pathology，14：650-654，2001；及Stefansson等，J.Clin.Oncol.，22(7)：1242-1252，2004)。人P-钙粘蛋白据报告是被针对外阴表皮样癌生成的NCC-CAD-299单克隆抗体识别的抗原(Shimoyama等，Cancer Res.，49：2128-2133，1989)。预期对P-钙粘蛋白介导的粘附和细胞内信号传导的调控会导致体内肿瘤细胞增殖和存活降低。因而，鉴于P-钙粘蛋白似乎在细胞增殖和实体瘤进展中拥有关键作用，期望生成针对P-钙粘蛋白的抗体，它能给具有多种癌症的患者提供治疗效益。

针对癌症特异性分子的单克隆抗体已经证明在癌症治疗中是有用的(Harris M，Lancet Oncol，5，292-302，2004)。除了用于乳腺癌、恶性淋巴瘤和结肠癌的人源化或嵌合抗体诸如曲妥单抗(Baselga，J.Oncology，61，增刊2，14-21，2004)、利妥昔单抗(Maloney DG等，Blood，90：2188-2195，1997)和贝伐单抗(Ferrara N等，Nat Rev Drug Discov，3：391-400，2004)等临床应用的成功例子之外，有若干针对其它分子靶标的单克隆抗体正处于开发中，而且人们正在评估它们的抗肿瘤活性。预期这些单克隆抗体会给具有没有有效疗法的肿瘤的患者带来希望。关于这些单克隆抗体的其它重要问题之一，是实现针对癌细胞的选择性治疗效果，而避免由于它们对表达靶分子的细胞的特异性反应而造成的严重毒性(Crist WM等，J Clin Oncol，19：3091-3102，2001；Wunder JS等，J Bone Joint Surg Am，80：1020-1033，1998；Ferguson WS和Goorin AM，Cancer Invest，19：292-315，2001；WO2002/097395；WO2004/110345；WO2006/114704；WO2007/102525)。

发明概述

本发明提供针对CDH3的单克隆抗体，它们特异性识别具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽。除了利用放射性核素进行的常规方法之外，借助利用近红外荧光的荧光体内成像系统证明了这种抗体的体内肿瘤结合活性。本发明提供了携带数种癌细胞系的异种移植物小鼠中显著抗肿瘤效果的证据，其中用⁹⁰Y标记的抗CDH3单克隆抗体(克隆#6)及其嵌合物(ch-#6)施用一次或两次来处理所述小鼠。

具体而言，本发明涉及下面各项：

[1]一种抗体或其片段，其特异性识别具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽。在典型的实施方案中，本发明的抗体或片段包含H(重)链V(可变)区和L(轻)链V区，所述H链V区包含具有SEQ ID NO：13、14和15所示氨基酸序列的互补决定区(CDR)或与其功能上等同(即结合相同抗原决定簇)的CDR，所述L链V区包含具有SEQ ID NO：16、17和18所示氨基酸序列的CDR或与其功能上等同(即结合相同抗原决定簇)的CDR，且其能够特异性结合CDH3蛋白或其部分肽。在更典型的实施方案中，所述抗体选自下组：小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体片段、和单链抗体。

[2]本发明的抗体或其片段可以用放射性同位素标记物标记。在典型的实施方案中，所述放射性同位素标记物选自下组：⁹⁰钇(⁹⁰Y)、¹²⁵碘(¹²⁵I)和¹¹¹铟(¹¹¹In)。

[3]一种用于治疗或预防癌症的组合物，其包含药学有效量的本发明的抗体或其片段。在典型的实施方案中，所述癌症是胰腺、肺、结肠、前列腺、乳腺、胃或肝癌。

[4]一种用于在受试者中治疗或预防癌症的方法，该方法包括给所述受试者施用药学有效量的本发明的抗体或其片段。在典型的实施方案中，所述癌症是胰腺、肺、结肠、前列腺、乳腺、胃或肝癌。

[5]一种用于受试者中与CDH3有关的疾病或发生该疾病的倾向的诊断或预后的方法，其包括

(a)使来自所述受试者的样品或标本接触本发明的抗体或片段；

(b)检测所述样品或标本中CDH3蛋白的有无；并

(c)基于与对照相比CDH3蛋白的相对丰度来确定所述受试者是否患有或有风险发生所述疾病。

在典型的实施方案中，所述癌症是胰腺、肺、结肠、前列腺、乳腺、胃或肝癌细胞。

[6]一种用于与CDH3有关的疾病的诊断或预后的试剂盒，其包含本发明的抗体或片段。在典型的实施方案中，所述癌症是胰腺、肺、结肠、前列腺、乳腺、胃或肝癌。

附图简述

图1显示细胞系中CDH3表达的结果。上部小图显示使用每一种抗体进行的流式细胞术分析。KLM-1和H358是CDH3阳性癌细胞系。MIAPaCa-2是阴性对照细胞系。抗erbB2用作阳性对照。所有所公开的抗CDH3抗体克隆都能特异性识别表达CDH3的细胞。下部小图是描绘癌细胞系中CDH3基因的半定量RT-PCR分析的结果的照片。

[图2A-B]图2A显示携带肿瘤的小鼠在注射每一种Alexa 647标记的抗体克隆后的体内荧光成像。荧光标记的抗体克隆是静脉内施用的。所有荧光图像是在注射后3、24、48和72小时时获取的。来自Alexa 647的荧光信号是假着色的，其表示红色是高强度。图2B分别显示EBC1人肺癌异种移植物小鼠中¹¹¹In标记的抗CDH3抗体的生物分布(B：克隆1)。

[图2C-D]图2C-D显示EBC1人肺癌异种移植物小鼠中¹¹¹In标记的抗CDH3抗体各自的生物分布(C：克隆3，D：克隆4)。

[图2E-F]图2E-F显示EBC1人肺癌异种移植物小鼠中¹¹¹In标记的抗CDH3抗体各自的生物分布(E：克隆5，F：克隆6)。

[图3A-B]图3A-B显示¹¹¹In标记的克隆#6抗体或对照抗体的生物分布。注射后48小时分离移植的肿瘤(A：EBC-1，B：SW948)、肝、肾、肠、胃、脾、胰、肺、心、肌肉和骨，并测量放射性。黑框显示抗CDH3抗体向每一种组织的累积。

[图3C-D]图3C-D显示¹¹¹In标记的克隆#6抗体或对照抗体的生物分布。注射后48小时分离移植的肿瘤(C：KLM-1，D：H1373)、肝、肾、肠、胃、脾、胰、肺、心、肌肉和骨，并测量放射性。黑框显示抗CDH3抗体向每一种组织的累积。

[图3E]图3E显示¹¹¹In标记的抗CDH3嵌合抗体或小鼠抗体#6，或者作为对照的正常人IgG或小鼠IgG1的生物分布。注射后48小时分离移植的肿瘤(H1373)、肝、肾、肠、胃、脾、胰、肺、心、肌肉和骨，并测量放射性。黑框显示抗CDH3嵌合抗体向每一种组织的累积。白框显示抗CDH3小鼠抗体向每一种组织的累积。

[图4A-B]图4显示⁹⁰Y标记的抗CDH3抗体(克隆#6)对肿瘤生长的影响。图4A显示了单次施用⁹⁰Y标记的抗CDH3抗体(克隆#6)遏制裸鼠中移植的EBC-1细胞的生长。图4B显示注射后肿瘤组织的HE染色。如右部小图所示，肿瘤组织替代被曙红(红色)染色的纤维组织。

[图5A-B]图5A显示单次施用⁹⁰Y标记的抗CDH3抗体(克隆#6)遏制裸鼠中移植的SW948细胞的生长。图5B显示肿瘤外观的照片。注射⁹⁰Y标记的抗CDH3抗体后，肿瘤明显缩小。

[图6]图6显示单次施用⁹⁰Y标记的抗CDH3抗体(克隆#6)遏制裸鼠中移植的KLM-1细胞的生长。

[图7]图7显示单次和两次施用⁹⁰Y标记的抗CDH3抗体(克隆#6)都遏制裸鼠中移植的SW948细胞的生长。

[图8]图8显示了单次施用⁹⁰Y标记的抗CDH3嵌合抗体(ch-#6)遏制裸鼠中移植的KLM-1细胞的生长。CHX和SCN分别代表p-SCN-Bn-CHX-A″-DTPA和p-SCN-Bn-DTPA。将抗体与这些双功能螯合剂缀合以便用⁹⁰Y放射性标记。

实施方案详述

本发明涉及抗CDH3抗体和组合物及它们在治疗或预防癌症中的用途。在一个典型的实施方案中，所述抗体是用放射性同位素标记物标记的。

已经报告了用于对自胰腺癌患者收集的胰腺癌细胞和正常细胞进行基因表达分析的cDNA微阵列(Nakamura等，Oncogene，23：2385-400，2004)。随后鉴定了在胰腺癌细胞中表达特异性增强的多种基因。在胰腺癌细胞中表达改变的这些基因中，选择一种基因，即编码在主要器官中表达水平低的细胞质膜蛋白的胎盘钙粘蛋白(P-钙粘蛋白；CDH3)(Genbank登录号No.NM_001793；SEQ ID NO：1、2)基因作为胰腺癌疗法的靶基因。通过选择在主要器官中表达水平低的基因，避免副作用的危险。另外，在其它癌细胞系中确认了类似的CDH3过表达，诸如肺、结肠直肠、前列腺、乳腺、胃和肝癌细胞系(WO/2007/102525)。

定义

如本文中使用的，术语“抗体”意图包括与指定蛋白质或其肽特异性起反应的免疫球蛋白及其片段。抗体可以包括人抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体、融合至其它蛋白质或放射性标记物的抗体、和抗体片段。另外，本文中的抗体以最广义使用，而且明确覆盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、自至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现期望的生物学活性。“抗体”指所有类(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。

“抗体片段”指完整抗体的一部分，一般包含完整抗体的抗原结合区或可变区。因而，在本发明中，抗体片段可以包含完整抗体的抗原结合部分。如本文中使用的，术语抗体的“抗原结合部分”(或仅仅简单地说“抗体部分”或“抗体片段”)指抗体保留特异性结合抗原(例如CDH3)的能力的一种或多种免疫学活性片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来实施。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)₂、和Fv片段；线性抗体；和单链抗体分子。不管结构如何，抗体片段结合被完整抗体识别的同一抗原。术语“抗体片段”还包括结合特定抗原的合成的或遗传工程改造的多肽，诸如由轻链可变区组成的多肽、由重链和轻链可变区组成的“Fv”片段、其中轻链和重链可变区通过肽接头相连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)、和由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位。

本领域技术人员会理解，包含基本上与本发明抗体的序列对应的可变区(包括互补决定区)的抗体可以相对于所指序列有所变异且仍特异性识别相同抗原决定簇。这种相对于序列的变异可以就序列内相同氨基酸的百分比而言来陈述。在一些实施方案中，这种百分比是约90％至约100％，例如95，96，97，98，99，或100％。

在两个或更多个多肽序列的语境中，术语“相同”或百分比“同一性”是指两个或更多个序列或子序列相同或具有规定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即当它们进行比较和比对，以实现在比较窗口或指定区域上的最大对应度时，规定区域上90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或更高的同一性)，如使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法及缺省参数(如下文描述的)，或通过手工比对和目测检查(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/处的NCBI网站等等)而测量的。然后说这样的序列“基本上相同”。这种定义也指，或者也适用于测试序列的互补物。该定义还包括具有删除和/或添加的序列，以及具有替代的序列。如下所述，优选的算法可以考虑缺口等等。优选的是，在长度为至少约25个氨基酸的区域上存在同一性，或更优选的是，在长度为50-100个氨基酸的区域上存在同一性。

为了序列比较，通常由一个序列充当参照序列，将测试序列与之比较。在使用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机，在必要时指派子序列坐标，并指派序列算法程序参数。优选地，可使用默认程序参数，或者可指派其他参数。然后由序列比较算法基于程序参数来计算测试序列相对于参照序列的百分比序列同一性。

如本文中使用的，“比较窗口”包括援引具有选自下组的任一个数的连续位置的区段：20个至600个，通常是约50至约200个，更通常的是约100个至约150个，其中可以将某个序列与具有相同个数的连续位置的参照序列进行最优比对，然后比较这两个序列。为了比较而比对序列的方法是本领域公知的。用于比较的最优序列比对可以通过例如Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson & Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性搜索法、通过这些算法的计算机化实现(Wisconsin遗传学软件包(Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)、或通过手工比对和目测检查(参见例如Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编，1987-2005，Wiley Interscience)来进行。

适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个优选例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别记载于Altschul等，Nuc.Acids Res.25：3389-3402(1977)及Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。BLAST和BLAST 2.0与本文中描述的参数一起使用来确定本发明核酸和蛋白质的百分比序列同一性。用于实施BLAST分析的软件是公众经由(美国)国家生物技术信息中心可得的。

抗体的生成

本发明使用针对CDH3的抗体。这些抗体将通过已知方法来提供。

描述了用于生成依照本发明使用的抗体的例示技术。

(i)多克隆抗体

多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原(例如SEQ ID NO：3)和佐剂来生成。使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(经半胱氨酸残基的偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(经赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl₂、或R¹N＝C＝NR，其中R和R¹是不同的烃基，将相关抗原与在待免疫的物种中有免疫原性的蛋白质，例如匙孔

血蓝蛋白(KLH)、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂，加以偶联，可能是有用的。

用抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫动物，方法是通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于家兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和，并将该溶液皮内注射于多个部位。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用含1/5-1/10初始量的肽或偶联物的弗氏完全佐剂对动物进行强化免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行强化直到滴度达到稳定的高水平。优选地，用抗原相同但偶联于不同蛋白质和/或经由不同交联剂的偶联物对动物进行强化免疫。偶联物还可在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物来制备。此外，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。

(ii)单克隆抗体

单克隆抗体是从一群基本上同质的抗体获得的，基本上同质即构成群体的各个抗体是相同的，除了可能以极小量存在的天然突变外。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的这样的特征，即其不是分立(discrete)抗体的混合物。

例如，单克隆抗体可通过最初由Kohler等，Nature 256：495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(美国专利4,816,567)。

在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物，诸如仓鼠，以引发出生成或能够生成会特异性结合用于免疫的蛋白质抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，《MonoclonalAntibodies：Principles and Practice》，59-103，Academic Press，1986)。

将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。

优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的骨髓瘤细胞。在这些细胞中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠源骨髓瘤系，诸如可从Salk Institute CellDistribution Center(San Diege，California，USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的衍生鼠源骨髓瘤系，及可从American Type Culture Collection(Manassas，Virginia，USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur等人，《Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications》，51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。

对于其中生长着杂交瘤细胞的培养基，可以测定培养基中针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定，诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。

单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等，Anal.Biochem.107：220(1980)的30 Scatchard分析来测定。

在鉴定得到生成具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，所述克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding，《Monoclonal Antibodies：Principles and Practice》，59-103，AcademicPress，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPML-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。

可通过常规免疫球蛋白纯化流程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。

编码单克隆抗体的DNA易于通过常规流程分离并测序(例如使用能够特异性结合编码鼠源抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是所述DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到宿主细胞中，诸如原本不产生免疫球蛋白蛋白质的大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.5：256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.130：151-188(1992)。

另一种生成针对CDH3反应性的特异性抗体或抗体片段的方法是用CDH3蛋白或肽筛选在细菌中表达的编码免疫球蛋白基因或其部分的表达文库。例如，可以使用噬菌体表达文库在细菌中表达整个Fab片段、VH区和Fv区。参见例如Ward等，Nature，341：544-546(1989)；Huse等，Science，246：1275-1281(1989)；及McCafferty等，Nature，348：552-554(1990)。用例如CDH3肽筛选此类文库能鉴定出与CDH3反应性的免疫球蛋白片段。或者，可使用SCID-hu小鼠(可得自Genpharm)来生成抗体或其片段。

在另一个实施方案中，可从使用McCafferty等，Nature 348：552-554(1990)所述技术构建的抗体噬菌体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson等，Nature352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠源和人源抗体。后续出版物描述了通过链改组(Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992))，以及作为构建非常大的噬菌体文库的策略的组合感染和体内重组(Waterhouse等，Nuc.Acids Res.21：2265-2266(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人源抗体。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。

还可以修饰DNA，例如通过用人重链和轻链恒定区的编码序列替代同源鼠源序列(美国专利4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851(1984))，或通过共价偶联免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。

通常，用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生这样的嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点，和对另一种不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。

任何可结合具有氨基酸序列SEQ ID NO：3的CDH3蛋白胞外域的抗体均可用于本发明。因而，只要抗体识别SEQ ID NO：3，此类抗体就可用于本发明的方法或组合物。在优选的实施方案中，识别氨基酸序列SEQ ID NO：3的抗体可结合表达至少包含其跨膜和胞外结构域的CDH3的细胞。

同时，本发明还提供适合于治疗或诊断CDH3相关疾病的抗体。特别地，以下面的特性限定的抗体优选有意用于此类用途。

本发明抗体的VH和VL结构域个包括由框架区分隔开的三个CDR，称作CDR1、CDR2、和CDR3。CDR的氨基酸序列不受特别限制，只要抗体能特异性结合CDH3。优选的CDR氨基酸序列的例子包括但不限于：

VH CDR1：SYWIH(SEQ ID NO：13)，

VH CDR2：EIDPSDNYTYYNQNFKG(SEQ ID NO：14)，

VH CDR3：SGYGNLFVY(SEQ ID NO：15)，

VL CDR1：SATSSVTYMY(SEQ ID NO：16)，

VL CDR2：RTSNLAS(SEQ ID NO：17)，和

VL CDR3：QHYHIYPRT(SEQ ID NO：18)

CDR的预测方法之一记载于Kabat E.A.等(1991)Sequence of Proteins ofImmunological Interest，第5版，NIH Publication No.91-3242。

在一个更优选的实施方案中，VH对应于氨基酸序列SEQ ID NO：11，而VL对应于氨基酸序列SEQ ID NO：12。

依照本发明，单克隆抗体及其结合片段可表征为：

i)包含由氨基酸序列SEQ ID NO：11和12限定的可变区的抗体；

ii)能够与由本文所述CDR氨基酸序列限定的单克隆抗体结合相同抗原决定簇的抗体；

iii)由所述氨基酸序列限定的单克隆抗体的结合片段；或

iv)能够与由所述氨基酸序列限定的单克隆抗体结合相同抗原决定簇的单克隆抗体的结合片段。

可使用常规分子生物学技术来制备编码嵌合产物和CDR移植产物的DNA序列。编码感兴趣抗体的CDR的基因可例如通过使用聚合酶链式反应(PCR)自抗体生成细胞的RNA合成可变区来制备(参见例如Larrick等，″Methods：a Companion to Methods in Enzymology″，第2卷，第106页，1991；Courtenay-Luck，″Genetic Manipulation of Monoclonal Antibody″inMonoclonal Antibody：Production，Engineering and Clinical Application，Ritter等编，第166页，Cambridge University Press，1995，及Ward等，″GeneticManipulation and Expression of Antibody″in Monoclonal Antibody：Principlesand Applications，Birch等编，第137页，Wiley-Liss，Inc.，1995)。可以使用寡核苷酸合成技术来完全地或部分地合成编码嵌合和CDR移植产物的DNA序列。可以视情况适宜使用定点诱变和聚合酶链式反应技术。例如，可以使用如Jones等，(1986)Nature，321：522-5描述的寡核苷酸指导的合成。还有，可以使用寡核苷酸指导对已存在的可变区的诱变，如例如Verhoeyen等，(1988)Science，239：1534-6或Riechmann等，见上文记载的。还有，可以使用T4DNA聚合酶进行带缺口的寡核苷酸的酶促填平，如例如Queen等，(1989)Proc NatlAcad Sci USA，86：10029-33；PCT公开文本WO 90/07861记载的。

任何合适的宿主细胞/载体系统均可用于表达编码CDR移植的重链和轻链的DNA序列。可使用细菌(例如大肠杆菌)和其它微生物系统，特别是用于表达抗体片段，诸如FAb和(Fab′)₂片段，尤其是Fv片段和单链抗体片段，例如单链Fv。可使用真核(例如哺乳动物)宿主细胞表达系统，特别是用于生成较大的CDR移植的抗体产物，包括完整抗体分子。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞和骨髓瘤或杂交瘤细胞系。

(iii)人源化抗体

本领域已经描述了用于将非人抗体人源化的方法。优选的是，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常是从“输入”可变域取出的。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法进行(Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Reichmann等，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988))，通过用高变区序列替代相应的人抗体序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中实质上少于整个的人可变区被替代为来自非人物种的相应序列。在实践中，人源化抗体通常是这样的人抗体，其中一些高变区残基，可能还有一些FR残基，被替代为来自啮齿类抗体中类似位点的残基。

用于制备人源化抗体的人可变域(包括轻链和重链)的选择，对于降低抗原性非常重要。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体可变域序列对整个已知人可变域序列文库进行筛选。然后接受与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架区(FR)(Suns等，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.151：2623(1993))。

另外，重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目的，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域熟练技术人员所熟悉。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像可以分析残基在候选免疫球蛋白序列功能行使中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得所需抗体特征，诸如更高的对靶抗原的亲和力。通常，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。

(iv)人抗体

作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成这样的转基因动物(如小鼠)，其能够在被免疫后生成完整的人抗体库，而没有内源免疫球蛋白生成。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature 362：255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno.7：33(1993)；及美国专利5,591,669、5,589,369和5,545,807。

或者，可以利用噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature 348：552-553(1990))在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因库生成人抗体和抗体片段。按照这种技术，将抗体V区基因合框克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行选择，也就会导致选择编码展示那些特性的抗体的基因。于是，噬菌体可模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以采取多种形式进行；有关综述参见例如Johnson，Kevin S.and Chiswell，David J.，Current Opinion inStructural Biology 3：564-571(1993)。数种来源的V基因区段可用于噬菌体展示。

Clackson等，Nature 352：624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠的脾的小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗噁唑酮抗体。可实质上依照Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith等，EMBO J.12：725-734(1993)所述技术，由未免疫人供体构建V基因全集，并分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利5,565,332和5,573,905。

还可通过体外激活B细胞(参见美国专利5,567,610和5,229,275)来生成人抗体。一种使用SCID小鼠生成人抗体的优选手段披露于共同所有的、共同未决的申请。

(v)抗体片段

已经开发了多种生成抗体片段的技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来得到这些片段(参见例如Morimoto等，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24：107-117(1992)及Brennan等，Science 229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可从上文讨论的噬菌体抗体库分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段，并通过化学方法偶联形成F(ab′)₂片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)₂片段。用于生成抗体片段的其它技术对从业人员是显而易见的。在其它实施方案中，优选的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利5,571,894；和美国专利5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利5,641,870中所述。所述线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。

(vi)双特异性抗体

双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例如，可以将抗癌细胞标志物臂与可结合白细胞上的触发分子诸如T细胞受体分子(如CD2或CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)，诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合，使得细胞防御机制聚焦于癌细胞。双特异性抗体还可用于将胞毒剂定位于癌细胞。这些抗体拥有癌细胞标志物结合臂及结合胞毒剂(如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(如F(ab′)₂双特异性抗体)。

用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统的全长双特异性抗体制备，当两种链具有不同的特异性时，是基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达(Millstein等，Nature 305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成可能有10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化，其通常通过亲和层析步骤进行，相当麻烦且产物产量低。WO 93/08829及Traunecker等，EMBO J.10：3655-3659(1991)中公开了类似的流程。

按照一种不同的方法，将具有所需的结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。融合优选是与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域融合。优选的是，在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物以及，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入各别的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时可提供最优产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，在至少两种多肽链的同比例表达可导致高产量时或在该比例没有特别意义时，将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一个载体是可能的。

在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。人们发现这种不对称结构便于将所需双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开，这是由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径。该方法公开于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的其它细节参见例如Suresh等，Methods inEnzymology 121：210(1986)。

依照美国专利5,731,168中描述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，从而使得从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含抗体恒定域的至少一部分C_H3域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(如酪氨酸或色氨酸)替换。在第二抗体分子的界面上通过用较小氨基酸侧链(如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链而产生针对大侧链的相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了提高异二聚体相对于其它非期望的终产物诸如同二聚体的产量的机制。

双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980)，和用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且连同许多交联技术一起公开于美国专利4,676,980。

文献中还描述了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等，Science 229：81(1985)描述了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)₂片段的方法。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。

最近的进展使得从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段变得更加容易，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.175：217-225(1992)描述了生成完全人源化的双特异性抗体F(ab′)₂分子。由大肠杆菌各别分泌每个Fab′片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。

还描述了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。(Kostelny等，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992))。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区被还原而形成单体，然后重新氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的轻链可变区(V_L)和重链可变区(V_H)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的V_H和V_L结构域与另一个片段上的互补V_L和V_H结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，J.Immunol.152：5368(1994)。

涵盖具有效价高于2的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.147：60(1991)。

抗体偶联物和其它修饰

本文中方法中使用的或制品中包括的抗体任选偶联至细胞毒剂或治疗剂。

如本文中使用的，治疗剂包括任何可用于治疗癌症的化疗剂。化疗剂的例子包括烷化剂类，诸如噻替哌(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸酯类，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，诸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥类，诸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲类，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、加利车霉素(calicheamicin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达比星(idambicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培来霉素(peplomycin)、poffiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿啶(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素类，诸如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；醋酸羟吡咔唑(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK&commat；雷佐生(razoxane)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；噻替哌；类紫杉醇(taxoid)，例如帕立他塞(paclitaxel)(

Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和多西他塞(doxetaxel)(

Rh6ne-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱(vinblastine)、铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C(mitomycinC)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞宾(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；柔红霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊拜膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他滨(capecitabine)；及上述任何物质的药学可接受的盐、酸或衍生物。在此治疗剂中还包括作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素类，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、奥那司酮(onapristone)、和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；和抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin)；及上述任何物质的药学可接受的盐、酸或衍生物。

本文还设想了抗体与一个或多个小分子毒素(如加利车霉素、美登木素(美国专利5,208,020)、单端孢霉素和CC1065)的偶联物。在本发明的一个优选实施方案中，将抗体偶联至一个或多个美登木素分子(例如约1个至约10个美登木素分子每个抗体分子)。例如可以将美登木素转变成May SS-Me，May SS-Me可以还原成May-SH3并与经修饰的抗体反应(Chari等，CancerResearch 52：127-131(1992))以生成美登木素生物碱-抗体偶联物。

或者，可以将抗体偶联至一个或多个加利车霉素分子。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和OI1(Hinman等，CancerResearch 53：3336-3342(1993)及Lode等，Cancer Research 58：2925-2928(1998))。

可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(PhytolacaAmericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌毒素(tricothecenes)。参见例如1993年10月28日公开的WO 93/21232。

本发明进一步涵盖偶联有多种放射性同位素的抗体。例子包括¹¹¹In、²¹¹At、¹³¹I、¹²⁵I、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹²Bi、³²P和Lu的放射性同位素。在本发明中，本发明的抗体可以在即将使用前用放射性核素标记，或者作为放射性标记的抗体来提供。熟练从业人员会认识到有多种放射性核素和化疗细胞毒剂可通过公知技术偶联至肿瘤特异性抗体并投递至某部位以特异性破坏肿瘤细胞和组织(参见例如W A.Blattler等的美国专利4,542,225,1985年9月17日公告；及Pastan等，1986，Cell，47：641-648)。例如，适合于使用的成像和细胞毒性试剂包括¹²⁵I、123I、¹¹¹In(例如Sumerdon等，1990，Nucl.Med.Biol.，17：247-254)、和^99mTc；荧光标记物，诸如荧光素和罗丹明；化学发光标记物，诸如萤光素；和用于磁共振成像的顺磁性离子(Lauffer等，1991，Magnetic Resonance in Medicine，22：339-342)。可以使用在本领域已知的并得到实践的方案和技术用此类试剂标记抗体。可以从例如Wenzel和Meares，Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy，Elsevier，New York，1983；Colcer等，1986，Meth.Enzymol.，121：802-816；及Monoclonal Antibodyfor Cancer Detection and Therapy，Baldwin等编，Academic Press，1985，pp.303-316中参考放射性标记抗体的技术。钇-90(⁹⁰Y)标记的单克隆抗体已有记载用于使投递至肿瘤或癌细胞和/或组织的剂量最大化，同时限制对正常组织的毒性(例如Goodwin和Meares，1997，Cancer Supplement，80：2675-2680)。其它细胞毒性放射性核素，包括但不限于碘-131(¹³¹I)和铼-186也可用于标记本发明的单克隆抗体。在放射性核素中，钇-90(⁹⁰Y)可适合于放射免疫疗法，这是由于钇-90(⁹⁰Y)提供胜过碘-131(¹³¹I)的优点，因为前者可对肿瘤投予更高的贝塔能(2.3MeV比0.61MeV)，且具有5-10mm的路径长度，从而具有更好的杀死靶细胞及邻近细胞的能力，这一点在大体积或显影不良的肿瘤中是特别有利的。依照要使用的成像模式来选择所使用的可检测/检测标记物。例如，放射性标记物，诸如铟-111(¹¹¹In)、锝-99m(^99mTc)、或碘-131(¹³¹I)可用于平面扫描或单光子发射计算机断层照相术(SPECT)。还有，发射正电子的标记物，诸如氟-19可用于正电子发射断层照相术(PET)。顺磁性离子，诸如钆(III)或锰(II)可用于磁共振成像(MRI)。单克隆抗体还可用不透射线的标记物标记以在注射后通过例如X射线、CATscan、或MRI来显现癌细胞。特别地，对于CDH3相关疾病(例如癌症)，通过对标记物在癌症内的定位，可以确定疾病的扩散。例如，表达CDH3的癌症内存在的和可检测的标记物的量容许确定要诊断的受试者中癌症或肿瘤的有无。

抗体与细胞毒剂的偶联物的制备可使用多种双功能蛋白质偶联剂，诸如3-(2-吡啶基二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己胺-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚胺二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Charm等，Cancer Research 52：127-131(1992))。

或者，可例如通过重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。

在另一个实施方案中，可将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联，用于肿瘤的预定位，其中对患者施用抗体-受体偶联物，随后使用清除剂从循环中除去未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(如放射性核苷酸)偶联的“配体”(例如亲合素)。

可以将本发明的抗体与前体药物活化酶偶联，所述前体药物活化酶将前体药物(例如肽基化疗剂，参见WO 81/01145)转变为活性抗癌药。参见例如WO 88/07378和美国专利4,975,278。

此类偶联物的酶组分包括任何这样的酶，其能够以一定的方式作用于前体药物从而将其转变为更有活性的、具有细胞毒性的形式。

可用于本发明方法的酶包括但不限于可将含磷酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的碱性磷酸酶；可将含硫酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的芳基硫酸酯酶；可将无毒的5-氟胞嘧啶转变为抗癌药氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；可将含肽的前体药物转变为游离药物的蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶(serratia protease)、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；可用于转化含D-氨基酸替代物的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；可将糖基化前体药物转变为游离药物的碳水化合物切割酶，诸如13-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可用于将13-内酰胺衍生药物转变为游离药物的13-内酰胺酶；及可用于将氨基氮分别被苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生化的药物转变成游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可使用具有酶活性的抗体，本领域也称作“抗体酶”，将本发明的前体药物转变为游离活性药物(参见例如Massey，Nature328：457-458(1987))。可如本文所述制备抗体-抗体酶偶联物，用于将抗体酶递送至肿瘤细胞群。

可通过本领域众所周知的技术将本发明的酶与抗体共价结合，诸如使用上文所讨论的异双功能交联剂。或者，可使用本领域众所周知的重组DNA技术构建这样的融合蛋白，其包含与本发明酶的至少功能活性部分连接的本发明抗体的至少抗原结合区(参见例如Neuberger等，Nature 312：604-608(1984))。

本文还涵盖抗体的其它修饰。例如，可将抗体与多种非蛋白质性聚合物中的一种，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物连接。

本文公开的抗体还可配制成脂质体。可通过本领域已知的方法来制备包含抗体的脂质体，诸如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；美国专利4,485,045和4,544,545；及1997年10月23日公布的WO 97/38731中描述的。美国专利5,013,556中公开了循环时间延长的脂质体。

特别有用的脂质体可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法生成。将脂质体挤过具有设定孔径的滤器，以产生具有所需直径的脂质体。可如Martin等，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所述，将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂。参见Gabizon等，J.National Cancer Inst.81(19)：1484(1989)。

涵盖本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可以改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过将适当的核苷酸改变引入抗体编码核酸或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列中的残基删除和/或插入和/或替代。只要最终的构建物具有所需特性，可进行删除、插入和替代的任何组合以获得最终的构建物。氨基酸变化还可改变抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。

一种可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描突变”，如Cunningham and Wells，Science 244：1081-1085(1989)所述。这里，鉴定一个或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲那些显示出对替代的功能敏感性的氨基酸位置。因此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。例如，为了分析在指定位点处的突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描诱变或随机突变，并从所表达的抗体变体中筛选所需活性。

氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-末端的融合，长度范围从一个残基至包含上百或更多残基的多肽，还包括单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括在抗体的N-或C-末端融合酶或提高抗体血清半衰期的多肽。

另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基被替换成不同的残基。抗体中最有兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但FR改变也在考虑之内。

通过选择替代来实现对抗体生物学特性的实质性修饰，这些替代在保持(a)被替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)分子的靶位点处的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小等方面的效果上显著不同。

根据共同的侧链特性，将天然存在残基如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr；

(3)酸性的：Asp、Glu；

(4)碱性的：Asn、Gln、His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和

(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。

非保守替代将需要用这些类别之一中的成员交换另一类别的成员。

对任何不涉及抗体正确构象的维持的半胱氨酸残基也可加以替代，通常替换成丝氨酸，以改善分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向抗体中添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当抗体是片段诸如Fv片段时)。

特别优选的一类替代变体牵涉替代亲本抗体(如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改进的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利方法是使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，产生各个位点上所有可能的氨基酸替代。将如此产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。所述接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选者。产生这样的变体后，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体进行进一步的开发。

抗体的另一类氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化样式。“改变”意味着删除在抗体中出现的一个或多个碳水化合物模块，和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。

多肽的糖基化通常或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块连接于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促连接于天冬酰胺侧链的识别序列。

因此，这些三肽序列其中任一者在多肽中的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一连接于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。

抗体中糖基化位点的添加可便利地通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个如上所述的三肽序列而实现(用于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可通过向原始抗体的序列中加入或替入一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来实现(用于O-连接的糖基化位点)。

编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的场合)，或者通过对早先制备的变体或非变体型抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。

可以修饰本发明中使用的抗体以改善效应器功能，以便例如增强抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而容许该区中形成链间二硫键。如此产生的同二聚体抗体可具有改善的内化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.Exp.Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.148：2918-2922(1992)。

具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff等，CancerResearch 53：2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂来制备。或者，可工程改造出这样的抗体，其具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。

为了提高抗体的血清半衰期，可如例如美国专利5,739,277中所述将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(如IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄)Fc区中负责提高IgG分子体内血清半衰期的表位。

与CDH3有关的疾病或发生该疾病的倾向的诊断

本发明的抗CDH3抗体可用作诊断与CDH3有关的疾病的标志物。

更具体地，可通过用本发明的抗CDH3抗体检测样品中的CDH3蛋白诊断与CDH3有关的疾病。据此，本发明提供通过用本发明的抗CDH3抗体检测受试者中的CDH3蛋白来诊断受试者中与CDH3有关的疾病或发生与CDH3有关的疾病的倾向的方法。该方法包括下述步骤：

(a)使来自受试者的样品或标本接触本发明的抗体或片段；

(b)检测样品或标本中的CDH3蛋白；并

(c)基于CDH3蛋白与对照相比的相对丰度来判断受试者是否患有或有风险发生疾病。

在一个典型的实施方案中，与CDH3有关的疾病是胰腺、肺、结肠、前列腺、乳腺、胃或肝癌。

或者，在另一个实施方案中，本发明的抗CDH3抗体可用于活体中癌症的检测或成像。更具体地，本发明提供癌症检测或成像的方法，其包括下述步骤：

(1)给受试者施用抗CDH3抗体或其结合片段；

(2)检测活体中抗体的累积或定位；并

(3)确定患者中抗体或其结合片段的位置。

或者，依照本发明，可检测患者中的癌细胞或组织。例如，本发明提供用于检测患者中CGH3在肿瘤组织中表达的癌症的方法，包括：给受试者施用抗体或抗体片段，容许抗体或抗体片段特异性结合细胞或组织中的CDH3；使细胞或组织中结合的抗体可视化；并将细胞或组织中结合的抗体的水平与正常对照细胞或组织比较，其中结合于患者细胞或组织的抗体的水平相当于正常对照细胞或组织升高指示患者中有癌症。

优选地，为了追踪施用入活体的抗体，可以用可检测分子标记抗体。例如，可以追踪用荧光物质、发光物质、或放射性同位素标记的抗体的体内行为。用此类分子标记抗体的方法是本领域公知的。

可以观察(例如使用内窥镜或腹腔镜)用荧光物质或发光物质标记的抗体。在使用放射性同位素时，抗体的定位可通过放射性同位素的放射性示踪来成像。在本发明中，抗CDH3抗体体内定位证明癌细胞的存在。

或者，本发明的抗CDH3抗体可用于体内成像。具体而言，可使用为检测而标记过的本发明抗CDH3抗体以使活体中的CDH3蛋白可视化。例如，可以体内追踪用荧光物质、发光物质、或放射性同位素标记的抗体的行为。用荧光物质或发光物质标记的抗体可使用生物成像系统来观察。在使用放射性同位素时，抗体的定位可通过免疫闪烁成像术来成像。

本发明的另一个实施方案提供用于表达CDH3的癌症和肿瘤的诊断剂、诊断方法和成像方法，其中使用本发明的单克隆抗体或结合片段。本发明抗体的诊断用途涵盖原发性肿瘤和癌症，以及转移。在优选的实施方案中，表达CDH3的癌症可选自下组：胰腺、肺、结肠、前列腺、乳腺、胃或肝癌。

依照本发明的诊断方法包括施用、导入、或输注如本文所述的单克隆抗体或其结合片段，其偶联或未偶联可检测模块，诸如放射性同位素。在施用或输注时，抗体或结合片段结合肿瘤或癌细胞，之后检测结合的抗体或片段的位置。对于经可检测标记的抗体或片段，例如那些用放射性同位素标记的，可使用成像设备来鉴定身体中试剂的位置。对于未标记的抗体或片段，可施用第二可检测试剂，其可定位结合的抗体或片段，使得它们能被合适地检测。相似的方法已经被用于其它抗体，熟练从业人员会知道适合于身体内结合的抗体或片段的位置成像的多种方法。作为非限制性指导，施用约10-1000微克(meg.)、优选约50-500meg、更优选约100-300meg、更优选约200-300meg纯化的抗体。例如，人的可应用剂量包括约100-200mcg/kg体重或350-700mg/m²体表面积。

依照本发明，可提供检查受试者状况的中间结果。此类中间结果可以与别的信息组合来帮助医生、护士、或其它从业人员确定受试者患有与CDH3有关的疾病、或者，本发明可用于检测来源于受试者的组织中的癌性细胞，及给医生提供有用的信息来确定受试者患有胰腺、肺、结肠、前列腺、乳腺、胃或肝癌。

与CDH3有关的疾病的监测和预后

评估治疗功效

差异表达的CDH3基因还容许监测和评估与CDH3有关的疾病，例如胰腺癌细胞(PaC细胞)、肺癌细胞(LuC细胞)、结肠癌细胞(CC细胞)、前列腺癌细胞(例如PrC细胞)、乳腺癌细胞(BC细胞)、胃癌细胞(GC细胞)、或肝癌细胞(LiC细胞)的治疗过程。或者，依照本发明，可提供监测PaC、LuC、CC、PrC、BC、GC、或LiC治疗过程的中间结果。此类中间结果可以与别的信息组合以帮助医生、护士、或其它从业人员确定受试者患有胰腺、肺、结肠、前列腺、乳腺、胃或肝癌。如此，CDH3基因或由其编码的蛋白质是用于监测PaC、LuC、CC、PrC、BC、GC、或LiC临床结果的有用的预后标志物。或者，本发明可用于检测来源于受试者的组织中的癌性细胞，及给医生提供有用的信息来评估PaC、LuC、CC、PrC、BC、GC、或LiC的治疗过程。在这种方法中，提供来自正在接受PaC、LuC、CC、PrC、BC、GC、或LiC治疗的受试者的测试细胞群。如果需要，在处于治疗之前、期间、和/或之后的各种时间点从受试者获得测试细胞群。然后测定测试细胞群中的CDH3基因的表达，并与参照细胞群中同一基因的表达比较，所述参照细胞群包括PaC、LuC、CC、PrC、BC、GC、或LiC状态已知的细胞。在本发明的语境中，参照细胞应尚未暴露于感兴趣治疗。

在监测和评估PaC、LuC、CC、PrC、BC、GC、或LiC具体治疗过程的语境中，生物学样品应衍生自正在接受胰腺、肺、结肠、前列腺、乳腺、胃或肝癌治疗的受试者。优选地，在治疗之前、期间或之后的多个时间点从受试者获得多份测试生物学样品。

如果参照细胞群含有非PaC细胞、非LuC细胞、非CC细胞、非PrC细胞、非BC细胞、非GC细胞、或非LiC细胞，那么测试细胞群和参照细胞群中CDH3基因表达相似指示感兴趣治疗是有效的。然而，测试细胞群和正常对照参照细胞群中CDH3基因表达差异指示不太有利的临床结果或预后。类似地，如果参照细胞群含有PaC细胞、LuC细胞、CC细胞、PrC细胞、BC细胞、GC细胞、或LiC细胞，那么测试细胞群和参照细胞群中CDH3基因表达差异指示感兴趣治疗是有效的，而测试群和PaC、LuC、CC、PrC、BC、GC、或LiC对照参照细胞群中CDH3基因表达相似指示不太有利的临床结果或预后。

另外，可以将在治疗后获得的来自受试者的生物学样品中测定到的CDH3基因表达水平(即治疗后水平)与在治疗开始前获得的来自受试者的生物学样品中测定到的CDH3基因表达水平(即治疗前水平)比较。治疗后样品中表达水平的降低指示感兴趣治疗是有效的，而治疗后样品中表达水平的升高或维持指示不太有利的临床结果或预后。

如本文中使用的，术语“有效”指示治疗导致受试者中CDH3基因表达降低或PaC、LuC、CC、PrC、BC、GC、或LiC的大小、普遍性(prevalence)、或转移潜力降低。当感兴趣治疗是预防性地应用时，术语“有效”意味着治疗可延迟或预防肺癌和/或食道癌的形成或延迟、预防、或缓解临床PaC、LuC、CC、PrC、BC、GC、或LiC症状。对胰腺、肺、结肠、前列腺、乳腺、胃或肝肿瘤的评估可使用标准临床方案来进行。

另外，可结合用于PaC、LuC、CC、PrC、BC、GC、或LiC诊断或治疗的任何已知方法来确定有效性。可例如通过组织病理学或者通过鉴定症状异常(例如体重减轻、食欲减退、腹痛、背痛、食欲缺乏、恶心、呕吐和全身不适、虚弱、和黄疸)来诊断PaC、LuC、CC、PrC、BC、GC、或LiC。

评估具有与CDH3有关的疾病的受试者的预后

本发明还提供评估具有与CDH3有关的疾病(例如PaC、LuC、CC、PrC、BC、GC、或LiC)的受试者预后的方法，此类方法包括比较测试细胞群中的CDH3基因表达与来自一系列疾病阶段的患者的参照细胞群中的CDH3基因表达的步骤。通过比较测试细胞群和参照细胞群中的CDH3基因的基因表达，或通过比较来自受试者的测试细胞群中基因表达随时间的样式，可以评估受试者的预后。

或者，依照本发明，可提供评估具有PaC、LuC、CC、PrC、BC、GC、或LiC的受试者的预后的中间结果。此类中间结果可以与别的信息组合来帮助医生、护士、或其它从业人员确定受试者患有肺癌或食道癌。或者，本发明可用于检测来源于受试者的组织中的癌性细胞，及给医生提供有用的信息来评估具有PaC、LuC、CC、PrC、BC、GC、或LiC的受试者的预后。

例如，与正常对照样品相比测试样品中CDH3基因的表达升高指示不太有利的预后。相反，与正常对照样品相比测试样品中CDH3基因表达的相似性指示受试者更有利的预后。

用于与CDH3有关的疾病的诊断、预后、或治疗的试剂盒和试剂

本发明提供用于与CDH3有关的疾病的诊断或预后的试剂盒。具体而言，试剂盒包括用于检测CDH3蛋白的试剂。用于检测CDH3蛋白的合适试剂包括针对CDH3蛋白的抗体。优选地，为了追踪施用入活体的抗体，可以用可检测分子标记抗体。例如，可以用荧光物质、发光物质、或放射性同位素标记抗体。标记抗体和检测带标记抗体的方法是本领域公知的，本发明可采用任何标记物和方法。

另外，试剂盒可包括阳性和阴性对照试剂和用于检测针对CDH3蛋白的抗体的第二抗体。例如，自预后好或差的受试者获得的组织样品可充当有用的对照试剂。本发明的试剂盒可进一步包括从商业和用户立场看可取的其它材料，包括缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器、和印有使用说明的包装插页(例如书面的、磁带、CD-ROM等)。这些试剂和此类可以装在带有标签的容器中。合适的容器包括瓶、管形瓶、和试管。容器可以由各种材料制成，诸如玻璃或塑料。

在其它实施方案中，本发明进一步提供用于要诊断的受试者内癌症的检测、成像或治疗的试剂盒，其包括针对CDH3蛋白的抗体。在优选的实施方案中，本发明的抗体可以用放射性同位素标记。例如，本发明的试剂盒可以含有识别CDH3的抗体，其经过螯合剂和放射性物质的修饰。MX-DOPA是用于修饰抗体的优选螯合剂。同时，铟-111(¹¹¹In)可用作用于生物成像的示踪剂。或者，为了表达CDH3的癌症的放射免疫疗法，可以用贝塔核素例如钇-90(⁹⁰Y)标记抗体。在本发明中，也可以以其盐或溶液的形式提供铟-111(¹¹¹In)或钇-90(⁹⁰Y)。铟-111(¹¹¹In)或钇-90(⁹⁰Y)的合适的盐是氯化物。

在一个优选的实施方案中，与CDH3有关的疾病是胰腺、肺、结肠、前列腺、乳腺、胃或肝癌。

治疗用途

下面描述的是使用本发明的抗体来治疗和/或预防癌症的方法和药物组合物。癌症包括但不限于胰腺、肺、结肠、前列腺、乳腺、胃或肝癌细胞。

具体而言，依照本发明在受试者中治疗和/或预防癌症的方法包括给有所需要的受试者施用上文所述抗体或片段。

术语“受试者”在本文中指患有癌症的受试者，包括但不限于胰腺、肺、结肠、前列腺、乳腺、胃或肝癌细胞。本发明中的受试者可以是动物，包括哺乳类和鸟类动物。例如，哺乳动物可以包括人、小鼠、大鼠、猴、家兔、和犬。

本文所述抗体或其片段能特异性结合CDH3蛋白，所以当给受试者施用抗体或其片段时，它结合受试者中的CDH3蛋白，而且表达CDH3的细胞的生长可受到遏制。或者，当抗体或其片段可偶联有治疗性模块并施用于受试者时，它被投递至受试者中表达CDH3蛋白的区域(即患病区域)，从而治疗性模块可以被选择性地投递到患病区域并作用于它。这样的治疗性模块可以是已知的或将会被开发的对癌症具有治疗功效的任何治疗剂，包括但不限于放射性同位素标记物和化疗剂。可根据多种因素来选择可用作治疗剂的放射性同位素标记物，这些因素包括贝塔射线能及其发射效率、发射的伽马射线的有无、其能量和发射效率、物理半衰期、和标记方法。一般地，可使用基于钇(诸如⁹⁰Y)和碘(诸如¹²⁵I和¹³¹I)的放射性同位素标记物。化疗剂可以是已知的或将会被开发的用于治疗癌症的任何试剂，包括但不限于甲氨蝶呤、泰素、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、顺铂、卡铂、丝裂霉素、博来霉素、多柔比星、伊达比星、柔红霉素、放线菌素D、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、帕立他塞、和多西他赛。本文所述抗体或其片段能选择性结合CDH3蛋白且不结合正常细胞，所以能有效避免由抗体或其片段或者放射性同位素或化疗剂引起的副作用，因此可以有高的治疗功效。

可以以有效治疗或预防CDH3相关疾病的剂量将本文所述抗体或其片段施用于受试者。有效剂量指抗体或其片段足以在所治疗受试者中产生有益健康的好处的量。下文描述了药物组合物含有本发明抗体时可采用的制剂和施用方法。

要进一步理解，在必要或想要时，可施用不同单克隆抗体的鸡尾酒(cocktail)，诸如本文中描述的具体的单克隆抗体或其结合片段的混合物，以缓解癌症。确实，在鸡尾酒中使用单克隆抗体或其结合片段的混合物来靶定癌细胞上的数种抗原或不同表位是一种有利的办法，特别是用于预防由于肿瘤细胞和/或癌细胞因抗原之一的下调所致的逃逸(evasion)。

依照本发明使用的药物组合物可以以常规方式使用一种或多种药学可接受载体或赋形剂来配制。

抗体或其片段可配制成供通过注射进行的胃肠外施用(即静脉内或肌肉内)，经由例如推注注射或连续输注。供注射用的配制剂可以以单位剂量形式与添加的防腐剂一起在例如安瓿或多剂量容器中提供。组合物可采取油性或水性媒介中的悬浮液、溶液、或乳状液等形式，而且可含有配方剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，抗体可以是冻干粉形式，以便于在使用前用合适的媒介例如无菌无热原水构建。

抗体或片段、或其偶联的治疗性模块的毒性和治疗功效，可按照标准药学规程在细胞培养物或实验动物(例如用于测定LD50(使群体的50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％中有治疗效果的剂量))中确定。毒性和治疗性效果之间的剂量之比为治疗指数，其可表述为比值LD/ED。

表现大的治疗指数的抗体或治疗性模块是优选的。虽然可使用表现毒性副作用的抗体或模块，但是应小心设计使该抗体或模块靶向患病组织部位的投递系统，以使对未受感染的细胞的潜在破坏最小化，由此降低副作用。

自细胞培养物测定和动物研究获得的数据可用于确定供人体使用的剂量范围。这样的抗体的剂量优选在包括ED50在内的循环血浆浓度范围之内，毒性很小或没有毒性。根据所采用的剂量形式、所利用的施用路径及所偶联的治疗性模块的类型和量，剂量可以在此范围内变化。对于本发明的方法中使用的任何抗体，有效剂量首先可以根据细胞培养物测定来估算。可以在动物模型中配制实现包括IC50(即测试抗体实现症状抑制最大值半数的浓度)在内的循环血浆浓度范围的剂量，如在细胞培养物中测定的。可以利用这样的信息更准确地确定在人体中有用的剂量。血浆中的水平可通过例如高效液相层析来测量。

根据受试者的状况和年龄和/或施用路径，本领域技术人员能选择本发明药物组合物的适宜剂量。例如，以如下的量施用本发明的药物组合物，使得在1天中依照本发明的抗体被施用于受试者的量为约3至约15mcg每kg受试者体重，优选约10至约15mcg每kg受试者体重。可以考虑受试者的状况和年龄、施用路径、及对药物组合物的响应来选择施用间隔和时间。例如，药物组合物可以施用于受试者1至5次，优选1次1天，持续5至10天。

在另一个方面，当胃肠外施用包含放射性同位素标记的抗体的组合物时，单个成人一次施用剂量为0.1mCi/kg至1.0mCi/kg，优选0.1mCi/kg至0.5mCi/kg，更优选0.4mCi/kg。

药物组合物可系统地或局部地施用。优选以靶向投递方式施用，以便将活性成分投递至患病部位。

在具体的实施方案中，本发明的方法和组合物与一种或一组化疗剂一起用于治疗或预防癌症，所述化疗剂包括但不限于甲氨蝶呤、泰素、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、顺铂、卡铂、丝裂霉素、博来霉素、多柔比星、伊达比星、柔红霉素、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、帕立他塞、和多西他赛。

关于放射疗法，根据要治疗的癌症的类型，可使用任何放射疗法方案。例如，但非限制，可施用X射线照射。也可施用发射伽马射线的放射性同位素，诸如镭、钴、和其它的元素的放射性同位素以暴露组织。

在另一个实施方案中，施用化学疗法或放射疗法，优选在使用含有本发明抗体的方法和组合物之后至少1小时、5小时、12小时、1天、1周、1个月、更优选几个月(例如长至3个月)。在使用依照本发明的方法和组合物的治疗之前、同时、或之后施用的化学疗法或放射疗法可通过本领域已知的任何方法来施用。

在另一个实施方案中，本发明还提供本发明的抗体在制造用于治疗或预防与CDH3有关的疾病的药物组合物中的用途。特别地，本发明进一步提供放射性标记的本发明抗体在制造用于治疗或预防癌症的药物组合物中的用途。

或者，本发明进一步提供供治疗或预防与CDH3有关的疾病用的本发明抗体。特别地，还提供供癌症放射性免疫疗法中使用的放射性标记的本发明抗体。

或者，本发明进一步提供制造用于治疗或预防与CDH3有关的疾病的药物组合物的方法或工艺，其中该方法或工艺包括将作为活性组分的本发明抗体与药学或生理学可接受的载体一起配制的步骤。特别地，本发明进一步提供制造用于治疗或预防癌症的药物组合物的方法或工艺，其中该方法或工艺包括将作为活性组分的放射性标记的本发明抗体与药学或生理学可接受的载体一起配制的步骤。

在另一个实施方案中，本发明还提供制造用于治疗或预防与CDH3有关的疾病的药物组合物的方法或工艺，其中该方法或工艺包括将活性组分与药学或生理学可接受的载体混合的步骤，其中所述活性组分是本发明的抗体。特别地，本发明进一步提供制造用于治疗或预防癌症的药物组合物的方法或工艺，其中该方法或工艺包括将放射性标记的本发明抗体与药学或生理学可接受的载体混合的步骤。

在又一个实施方案中，本发明提供用于要诊断的受试者体内癌症的生物成像或免疫闪烁成像术的本发明抗体。或者，本发明提供本发明抗体在制造用于受试者体内癌症的生物成像或免疫闪烁成像术的诊断剂中的用途。本发明进一步提供制造用于受试者体内癌症的生物成像或免疫闪烁成像术的诊断剂的方法或工艺，其中该方法或工艺包括将本发明的抗体与药学或生理学可接受的载体混合的步骤。

通过述及完整并入本文中引用的所有现有技术参考文献。

实施例

下面，基于实施例来进一步解释本发明。

材料和方法

抗体生成

从来源于癌细胞的cDNA池扩增CDH3基因编码的胞外域(SEQ ID NO：3)。将产物克隆入pcDNA3.1(Invitrogen，CA)。为了生成CDH3特异性抗体，每两周给小鼠皮下免疫接种域表达载体(17.5mcg/次注射)，持续一个月。确认抗血清的滴度后，自小鼠提取脾细胞并与骨髓瘤细胞融合以制备杂交瘤。我们筛选了能识别癌细胞表面上的天然CDH3抗原的杂交瘤。通过筛选表明，杂交瘤克隆#6以高水平生成抗原特异性抗体，因此选择了这个克隆来生成抗体供进一步实验用。使用杂交瘤克隆#6腹膜内注射小鼠。2至3周后回收腹水。最后，使用蛋白A柱(GE Healthcare，NJ)自腹水纯化抗体。

细胞培养

使用了六种癌细胞系：EBC-1，H1373和H358，作为非小细胞肺癌系；KLM-11111111和MIAPaCa-2，作为胰腺癌系；SW948，作为结肠直肠癌系。所有细胞系都得自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassasm，VA)，而且在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的EMEM(EBC-1、MIAPaCa-2)、RPMI(H358、KLM-1、H1373)和L-15(SW948)中于37℃在5％CO₂的增湿气氛中维持。

流式细胞仪

H358、KLM-1和MIAPaCa-2维持在各自的推荐培养基中直至汇合早期(early-confluency)。随后用细胞解离液(SIGMA，MO)解离细胞以避免细胞表面抗原变性。用PBS悬浮细胞(1x10⁷细胞/mL)并于4℃与测试抗体(50mcg/mL)一起温育1小时。用PBS清洗两次后，将细胞与含有7AAD(2.5mcg/mL)的20mcg/mL Alexa Fluor488山羊抗小鼠IgG(H+L)(Invitrogen，CA)混合并在黑暗中于4℃温育30分钟。通过FACS Calibur(Becton Dickinson，NJ)依照制造商的用法说明来评估测试抗体的结合模式和特异性。

放射性标记

用两种不同同位素即铟-111(¹¹¹In)和钇-90(⁹⁰Y)标记由杂交瘤克隆#6生成的抗CDH3小鼠单克隆抗体(克隆6)、由293T生成的克隆6的嵌合抗体(ch-#6)和对照抗体即正常小鼠IgG1(Nordic immunological laboratories，Tiburg，The Netherlands)和正常人IgG。藉由双功能金属离子螯合剂p-SCN-Bn-DTPA或p-SCN-Bn-CHX-A″-DTPA(Macrocyclics，Dallas，TX，USA)用¹¹¹In和⁹⁰Y标记抗体。在二甲基甲酰胺中以1∶5的摩尔比将一毫克抗体与这些螯合剂缀合。于37℃温育20小时后，使用Biospin柱6(Bio-Rad，Tokyo，Japan)纯化抗体-螯合剂复合物。分别将¹¹¹InCl₃(Nihon Medi-Physics，Hyogo，Japan)和⁹⁰YCl₃(QSA Global，Brauschweig，Germany)与0.25M乙酸(pH 5.5)一起于室温平行预温育5分钟。为了获得¹¹¹In和⁹⁰Y标记的抗体，分别将抗体-螯合剂复合物与经预温育的^111InCl₃和⁹⁰YCl₃溶液一起于37℃温育1小时。使用Biospin柱6依照制造商的用法说明纯化经标记的抗体。确认了在标记过程期间没有观察到这些抗体的降解。

异种移植物模型

依照群马大学动物使用和动物委员会的规定实施动物护理和处理。将100mcL EBC1、SW948、KLM-1和H1373细胞悬浮液(1x10⁷细胞)皮下接种入雌性3-5周龄裸鼠(Charles River Laboratories Japan Inc.Yokohama，Japan)的右胁。饲养这些小鼠数周以形成肿瘤。自携带肿瘤的小鼠分离建立的肿瘤，并切割成边长2mm的立方体组织碎块。将这些碎块陆续移植入裸鼠。移植后，饲养这些小鼠直至平均肿瘤体积达到100-600mm³。

生物分布研究

随机选择携带建立的人肺癌肿瘤EBC-1的裸鼠并指派至两组。给小鼠静脉内注射Alexa647标记和¹¹¹In标记的(0.5mCi/mg)抗体。对于基于荧光的研究，处理后48小时用IVIS 200生物成像系统(Caliper Life Sciences，MA)评估Alexa647标记的抗体的生物分布。对于基于放射性同位素的研究，注射后3、24、48和72小时分别分离移植的肿瘤、以及血液、肝、肾、肠、胃、脾、胰、肺、心、肌肉和骨。对所有组织称重，并在伽马井式计数器上对放射性计数，并确定百分比注射剂量每克(％ID/g)。具体而言，在48小时时，分别使用携带建立的肿瘤(EBC-1、SW948、KLM-1和H1373)的裸鼠分析了¹¹¹In标记的克隆6。

放疗(单次施用)

将异种移植物小鼠随机指派至三个不同处理组。如上所述制备⁹⁰Y标记的抗体(4-10mCi/mg)。给小鼠静脉内注射⁹⁰Y标记的克隆6或作为对照的⁹⁰Y标记的正常小鼠IgG1。将所注射抗体的放射性调整至100mcCi每只动物。在注射⁹⁰Y标记的抗体后的4周时间里监测经处理的异种移植物小鼠的体重和肿瘤体积。使用下面的公式计算肿瘤体积(mm³)：(最短的直径)²x(最长的直径)x0.5。

放疗(两次施用)

将SW948异种移植物小鼠随机指派至四个不同处理组。为了用⁹⁰Y放射性标记，将抗体缀合于p-SCN-Bn-DTPA。如上所述制备⁹⁰Y标记的抗体(4-10mCi/mg)。给小鼠静脉内注射⁹⁰Y标记的克隆6或作为对照的⁹⁰Y标记的正常IgG1。第一次注射14天后用⁹⁰Y标记的克隆6实施第二次注射。所注射的抗体的放射性调整至100mcCi每只动物。在第一次注射⁹⁰Y标记的抗体后7周时间内监测经处理异种移植物小鼠的体重和肿瘤体积。使用下面的公式计算肿瘤体积(mm³)：(最短的直径)²x(最长的直径)x0.5。

HE染色

在干冰上用Lab-Tek OCT化合物(Sakura Finetek USA，CA)包埋分离的肿瘤以制备冷冻组织切片。用蒸馏水清洗冷冻切片以除去OCT化合物，并用二甲苯处理5分钟，两次。为了洗去过量的二甲苯和复水，将切片分别用100％、90％、80％、70％和50％乙醇漂洗10秒钟。将切片载玻片在Mayer氏苏木精(Muto Pure Chemicals，Japan)中浸泡5分钟，并用流水洗去过量的苏木精。接着，用1％曙红Y(Muto Pure Chemicals，Japan)处理后，使用50％、70％、80％、90％和100％乙醇实施脱水。最后，将切片用二甲苯处理5分钟，三次，用Malinol(DAIDO SANGYO，Japan)依次封装。

氨基酸序列

使用RNeasy迷你试剂盒(QIAGEN)自杂交瘤克隆#6提取总RNA。使用SuperScript II逆转录酶(Invitrogen)自总RNA合成cDNA。使用NovaTaq DNA聚合酶(Novagen)和小鼠Ig引物集(Novagen)扩增单克隆抗体可变区的序列。使用5′引物和3′引物扩增单克隆抗体可变区的序列；用于克隆#6重链的MuIgVH5′-B；5′-GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT-3′(SEQ ID NO：4)，和用于轻链的MuIgκVL5′-G；5′-ACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT-3′(SEQ ID NO：5)，5′-ACTAGTCGACATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT-3′(SEQ ID NO：6)，5′-ACTAGTCGACATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG-3′(SEQ ID NO：7)和5′-ACTAGTCGACATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG-3′(SEQ ID NO：8)；用于重链的MuIgGVH3′-2；5′-CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG-3′(SEQ ID NO：9)和用于轻链的MuIgκVL3′-1；5′-CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3′(SEQ ID NO：10)。将PCR产物克隆入pCR2.1-TOPO(Invitrogen)。对插入物区域测序并确定克隆#6的可变区(信号序列除外)的序列。

以下面的符号表示引物序列中的不同核苷酸；

B为C、G或T，D为A、G或T，H为A、C或T，I为肌苷，K为G或T，M为A或C，R为A或G，S为C或G，V为A、C或G，W为A或T，Y为C或T。

嵌合小鼠/人抗体

使用GS基因表达系统(Lonza，Switzerland)制备基于小鼠单克隆抗体克隆#6的嵌合小鼠/人抗体ch-#6。通过交叠延伸聚合酶链式反应扩增重链和轻链。使用引物SEQ ID NO：23和24通过PCR扩增重链可变区。使用引物SEQID NO：27和28通过PCR扩增人IgG1恒定区。这两种PCR产物在末端含有用于交叠延伸的共同序列。然后用这两种PCR产物，使用引物SEQ ID NO：31和28通过交叠延伸PCR扩增重链基因。同样，使用引物SEQ ID NO：25和26通过PCR扩增轻链可变区。使用引物SEQ ID NO：29和30通过PCR扩增人κ恒定区。利用这两种在末端含有共同序列的PCR产物，使用引物SEQ ID NO：32和30通过交叠延伸PCR扩增轻链基因。通过PCR分别扩增带有人κ(SEQ IDNO：19，其编码SEQ ID NO：21)和人IgG1(SEQ ID NO：20，其编码SEQID NO：22)的恒定区的与轻链和重链可变区各自的相应基因，并使用限制酶HindIII和EcoRI分别克隆入抗体表达载体pEE12.4和pEE6.4。用限制酶NotI和PvuI消化这两种单一基因载体(SGV)。经消化的重链SGV DNA含有hCMV-MIE启动子-重链-SV40转录单元，而经消化的轻链SGV DNA含有GS转录单元和hCMV-MIE启动子-轻链表达盒。连接这两种经纯化的片段以构建双重基因表达载体。将载体转化入大肠杆菌，然后分离。将表达H链和L链二者的载体转染入293T细胞。用无血清培养基(DMEM；GIBCO，11965-092)更换培养基，并经蛋白A柱纯化培养物上清液中含有的嵌合抗体。

表1

用于制备ch#6的引物组

结果

第一，为了评估抗CDH3抗体的特异性，测定了数种细胞系中的CDH3表达。CDH3抗原被呈递在H358和KLM-1的表面上，但是不被呈递在MIAPaCa-2的表面上(图1)。使用流式细胞仪来筛选表现出令人满意的与H358和KLM-1而非MIAPaCa-2的反应性的抗体。如图1所示，所有被筛选的抗CDH3抗体都正确且特异性地识别天然CDH3蛋白。

第二，使用异种移植物模型检查了抗CDH3抗体的生物分布。与其它克隆和对照抗体相比，Alexa 647标记的抗体#4和#6以很高的水平在肿瘤中累积(图2A)。选择#6来用⁹⁰Y进行放疗，因为与其它相比，¹¹¹In标记的#6显示出更快的血液清除和高肿瘤靶向性，且在正常器官中没有意外的累积(图2B-F)。克隆6在注射后48小时进入肿瘤的峰值摄取量分别为32.0+/-3.5％ID/g(EBC-1)、21.4+/-2.3％ID/g(SW948)、24.2+/-1.2％ID/g(KLM-1)、23.8+/-3.1％ID/g(H1373)(图3A-D)。同样地，克隆6的嵌合抗体，即ch-#6，在注射后48小时进入肿瘤的峰值摄取量为38.0+/-3.2％ID/g(H1373)(图3E)。与之形成对照的是，对照IgG在每一只小鼠中的摄取从未超过10％ID/g(图3A-E)。克隆6和ch-#6的这种肿瘤特异性的摄取时间依赖性地升高(数据未显示)。如图3A-E所示，正常组织展示相当低水平的摄取，这与CDH3的排他性表达特征是吻合的。在生物分布研究观察到克隆6的摄取对于呈递CDH3的肿瘤是特异性的。因此，该抗体具有开发成为放射性同位素标记的抗体药物的理想特性。

第三，使用异种移植物小鼠实施了用⁹⁰Y标记的克隆6和ch-#6进行的放疗。与克隆6(图4A、5A、6、7)和ch-#6(图8)缀合的钇-90发出的辐射显著降低了所有肿瘤的生长速率。另一方面，⁹⁰Y标记的对照抗体没有显示出对肿瘤生长的影响(图4A、5A、6、7、8)。因此，这种治疗效果似乎依赖于抗原-抗体反应。，对EBC-1(肺癌)的处理只注射了一次即表现病情稳定一个月(图4A)。放疗后分离肿瘤并实施HE染色。如图4B所示，通过用⁹⁰Y标记的克隆6处理，肿瘤细胞数显著降低，而且观察到显著的纤维化。值得注意的是，在用⁹⁰Y标记的对照IgG处理的肿瘤中没有观察到纤维化(图4B)。类似地，通过处理，SW948(结肠癌)肿瘤显示出部分响应(图5)。注射⁹⁰Y标记的克隆6后21天，每一只小鼠中移植的肿瘤均几乎消失(图5B)。虽然通过处理KLM-1(胰腺癌)肿瘤显示出病情稳定或略有进展(图6)，但是，用⁹⁰Y标记的克隆6处理与未标记的抗体相比是有效的。在每一只小鼠中两次施用⁹⁰Y标记的克隆6均比单次施用更有效(图7)。另外，⁹⁰Y标记的ch-#6(即克隆6的嵌合抗体)显示出与对照相比较高的功效(图8)。图8中的CHX和SCN代表材料和方法中描述的接头。

总之，抗CDH3抗体克隆6和ch-#6缀合的钇-90针对这些肿瘤发挥出显著的治疗效果。因此，CDH3作为这些肿瘤的治疗靶标是非常吸引人的，而且抗CDH3抗体是可以用于此类治疗的治疗药物的候选者。

最后，测定了小鼠Ig H链可变区和L链可变区的氨基酸序列如下：

克隆#6，H链可变区(信号序列除外)：

QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKSSGYTFTSYWIHWVKQRPGHGLEWIGEIDPSDNYTYYNQNFKGKATLTIDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVFYCARSGYGNLFVYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：11)；和

克隆#6，L链可变区(信号序列除外)：

QIVLTQSPAIMSSSPGEKVTMSCSATSSVTYMYWYQQKPGSSPKPWIFRTSNLASGVPTRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQHYHIYPRTFGGGTKL(SEQ ID NO：12)。

抗体的CDR(互补决定区)序列以Kabat定义确定如下：

克隆#6，SYWIH(SEQ ID NO：13)为VH CDR1、EIDPSDNYTYYNQNFKG(SEQ ID NO：14)为VH CDR2而SGYGNLFVY(SEQ ID NO：15)为VH CDR3，SATSSVTYMY(SEQ ID NO：16)为VL CDR1、RTSNLAS(SEQ ID NO：17)为VL CDR2，QHYHIYPRT(SEQ ID NO：18)为VL CDR3。

工业实用性

本发明至少部分基于如下的发现，即在体内表达CDH3的癌症可以用放射性同位素标记的抗CDH3抗体来治疗。发明人确认了CDH3是在胰腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌或肝癌中强烈表达的基因。因此，癌症(例如胰腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌或肝癌)的治疗可以使用用放射性同位素标记物标记的抗CDH3抗体方便地进行。

Claims (15)

1.一种抗体或其片段，其特异性识别具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽。

2.依照权利要求1的抗体或其片段，其包含H(重)链V(可变)区和L(轻)链V区，所述H链V区包含具有SEQ ID NO：13、14和15所示氨基酸序列的互补决定区(CDR)或与其功能上等同的CDR，所述L链V区包含具有SEQ IDNO：16、17和18所示氨基酸序列的CDR或与其功能上等同的CDR，且能够结合CDH3蛋白或其部分肽。

3.依照权利要求2的抗体或其片段，其中所述抗体选自下组：小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段、和单链抗体。

4.依照权利要求3的抗体或其片段，其中所述抗体包含具有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的H链和/或具有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的L链。

5.依照权利要求3的抗体或其片段，其中所述嵌合抗体包含具有SEQ IDNO：11所示氨基酸序列的H链V区。

6.依照权利要求3的抗体或其片段，其中所述嵌合抗体包含具有SEQ IDNO：12所示氨基酸序列的L链V区。

7.依照权利要求4的抗体或其片段，其中所述嵌合抗体包含具有SEQ IDNO：11所示氨基酸序列的H链V区和具有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的L链V区。

8.依照权利要求2的抗体或其片段，其中所述抗体是人源化抗体。

9.依照权利要求8的抗体或其片段，其中所述人源化抗体还包含人抗体FR(框架)区和/或人抗体C区。

10.依照权利要求1-9中任一项的抗体或其片段，其与细胞毒剂、治疗剂、放射性同位素标记物或荧光标记物缀合。

11.依照权利要求10的抗体或其片段，其中所述放射性同位素标记物选自⁹⁰钇(⁹⁰Y)和¹¹¹铟(¹¹¹In)。

12.一种用于治疗或预防受试者中与CDH3有关的疾病的方法，其包括给所述受试者施用有效量的依照权利要求10或11中任一项的抗体或片段。

13.一种用于受试者中与CDH3有关的疾病或发生该疾病的倾向的诊断或预后的方法，其包括

(a)使来自所述受试者的样品或标本接触依照权利要求1-11中任一项的抗体或片段；

(b)检测所述样品或标本中的CDH3蛋白；并

(c)基于与对照相比CDH3蛋白的相对丰度来判断所述受试者是否患有或有风险发生所述疾病。

14.一种用于治疗或预防与CDH3有关的疾病的药物组合物，其包含依照权利要求10或11中任一项的抗体或片段和药学可接受载体或赋形剂。

15.一种用于与CDH3有关的疾病的诊断或预后的试剂盒，其包含依照权利要求1-11中任一项的抗体或片段。

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