NL1031818C2

NL1031818C2 - P-Cadherineantilichamen.

Info

Publication number: NL1031818C2
Application number: NL1031818A
Authority: NL
Inventors: Christopher Todd Bauer; Maureen Jeri Bourner; Melanie Boyle; Gerald Fries Casperson; David William Griggs; Richard David Head; William Dean Joy; Allen Mazzarella Richard; Ralph Raymond Minter; Allen Moffat Mark; Barrett Richard Thiele; Todd Lee Vanarsdale
Original assignee: Pfizer
Priority date: 2006-05-15
Filing date: 2006-05-15
Publication date: 2007-11-23

Description

P-CADHERXNEANTILICHAMEN

Deze aanvrage roept de voorrang in van Amerikaanse voorlopige aanvrage 60/675,311, ingediend op 26 april 2005, die hier in haar geheel bij referentie wordt opgenomen .

Gebied van de uitvinding

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op antili-chamen en antigeenbindende gedeelten daarvan die binden aan P-cadherine. De uitvinding heeft ook betrekking op nu-cleïnezuurmoleculen die coderen voor dergelijke antilicha-10 men en antigeenbindende gedeelten, werkwijzen voor het maken van P-cadherineantilichamen en antigeenbindende gedeelten, preparaten die deze antilichamen en antigeenbindende gedeelten omvatten en werkwijzen voor het gebruiken van de antilichamen, antigeenbindende gedeelten en prepa-15 raten.

Achtergrond van de uitvinding Cadherinen zijn een superfamilie van transmembraan-glycoproteïnen die cel-celadhesie gedurende de ontwikkeling en weefselhomeostase reguleren (Gumbiner, J. Cell. 20 Biol., 148:399-404 (2000); Yagi et al., Genes Dev., 14:1169-1180 (2000)) . De intracellulaire domeinen van cad herinen gaan een interactie aan met cytoplasmatische eiwitten zoals cateninen en pl20, die de basis vormen van cadherineaanhechting aan het actinecytoskelet. Cadherinen 2 5 hebben vijf extracellulaire Ca2+-bindingsdomeinen en een klein cytoplasmatisch domein dat in hoge mate geconserveerd is onder de klassieke cadherinen. Leden van de klassieke cadherinefamilie omvatten P-cadherine, E-cadherine en N-cadherine. Het wordt geacht dat cellulaire adhesie-30 moleculen zoals cadherinen een belangrijke rol spelen bij 1031818 2 de cellulaire verbindingen van kanker en metastatische cellen (Furukawa et al., Microscopy Res. Technique 38 (4):343-352 (1997)). P-cadherine-expressie in normale adulte weefsels is laag en is hoofdzakelijk beperkt tot 5 myo-epitheliale cellen en de basale lagen van gelaagd epitheel (Shimoyama et al., Cancer Res. 49:2128-33 (1989)). P-cadherine is naar omhoog gereguleerd bij darmziekten met ontstekingsproces zoals de ziekte van Crohn en colitis (Hardy et al., Gut 50:513-519 (2002)). Een grote 10 hoeveelheid bewijs openbaart nu ook dat afwijkende P- cadherine-expressie is geassocieerd met celproliferatie en met tumoren van het colon, de borst, de long, het thyroid en de cervix (Gamallo, Modern Pathology, 14:650-654, (2001) en Stefansson et al., J. Clin. Oncol. 22(7):1242-15 1252 (2004) ) . Het werd gerapporteerd dat humaan P- cadherine het antigeen is dat wordt herkend door het NCC-CAD-299-monoklonale antilichaam dat is opgewekt tegen een epidermoid carcinoom van de vulva (Shimoyama et al., Cancer Res., 49:2128-2133 (1989)). Het wordt verwacht dat mo-20 dulatie van P-cadherinegemedieerde adhesie en intracellulaire signalering leidt tot verminderde proliferatie en overleving van tumorcellen in vivo. Dienovereenkomstig is het, met het oog op de centrale rol die P-cadherine blijkt te bezitten bij celproliferatie en solide tumor- 25. progressie, wenselijk om antilichamen tegen P-cadherine te genereren die een therapeutisch voordeel kunnen verschaffen voor patiënten met een verscheidenheid aan kankers.

Samenvatting van de uitvinding In één aspect van de onderhavige uitvinding is een P-30 cadherineantilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan, waarbij het antilichaam of antigeenbindende gedeelte daarvan ten minste één van verscheidene functionele eigenschappen heeft, zoals beneden beschreven in A) tot en met K) .

A) In één uitvoeringsvorm hebben de antilichamen of antigeenbindende gedeelten daarvan bijvoorbeeld een grotere bindingsaffiniteit voor P-cadherine (Kq(P)) dan voor E- 3 cadherine (K^E)). In één uitvoeringsvorm hebben de antilichamen of antigeenbindende gedeelten daarvan van de onderhavige uitvinding een KD(E)/KD(P) die groter dan, of gelijk aan 1,5 is. In een verdere uitvoeringsvorm hebben 5 de antilichamen of antigeenbindende gedeelten daarvan van de onderhavige uitvinding een Κρ(Ε)/Κβ(Ρ) die groter dan, of gelijk aan 2, groter dan, of gelijk aan 3, groter dan, of gelijk aan 5, groter dan, of gelijk aan 10, groter dan, of gelijk aan 20, groter dan, of gelijk aan 50, groter 10 dan, of gelijk aan 100, groter dan, of gelijk aan 200, groter dan, of gelijk aan 500 of groter dan, of gelijk aan 1000 is. Er is kenmerkend geen bovengrens met betrekking tot de waarde van KD(E)/KD(P) omdat de KdCE)-waarde zeer klein kan zijn, zoals 0. Voor praktische doeleinden kan 15 een bovengrens van K^Ei/K^P) echter 1 x 106 zijn. Dergelijke KD-waarden voor zowel P-cadherine als voor E-cadherine kunnen worden gemeten met behulp van een willekeurige techniek die bij de gemiddelde vakman bekend is, zoals met behulp van ELISA, RIA, flowcytometrie of opper-20 vlakteplasmonresonantie, zoals BIACORE™.

B) In een andere uitvoeringsvorm bindt het antili-chaam of gedeelte daarvan aan P-cadherine met een Kj, van 1000 nM of minder, zoals gemeten met behulp van oppervlak-teplasmonresonantie. In een verdere uitvoeringsvorm bindt 25 het antilichaam of gedeelte aan P-cadherine met een KD van minder dan 50 0 nM, minder dan 100 nM, minder dan 5 0 nM, minder dan 20 nM, minder dan 10 nM, minder dan 1 nM, minder dan 500 pM of minder dan 100 pM, zoals gemeten met behulp van oppervlakteplasmonresonantie. Er is kenmerkend 30 geen ondergrens met betrekking tot de waarde van Ko. Voor praktische doeleinden kan het echter worden aangenomen dat de ondergrens ongeveer 1 pM is.

C) In een andere uitvoeringsvorm heeft het antilichaam of gedeelte daarvan een af-snelheid (Ka£) voor P- 35 cadherine van minder dan, of gelijk aan 0,01s'1, zoals gemeten met behulp van oppervlakteplasmonresonantie. In bepaalde uitvoeringsvormen heeft het antilichaam of gedeelte 4 bijvoorbeeld een Ka£ voor P- cadherine van minder dan 0,005s'1, minder dan 0,004s'1, minder dan 0,003s'1, minder dan 0,002s"1 of minder dan 0,0 01s'1. Er is kenmerkend geen ondergrens voor de waarde van Ka£. Voor praktische doeleinden 5 kan het echter worden aangenomen dat de ondergrens ongeveer 1 x 10'7 6-1 is .

D) In een andere uitvoeringsvorm heeft het P-cadherineantilichaam of gedeelte daarvan een IC50 van 100 nM of minder, zoals gemeten met behulp van een P-10 cadherineafhankelijke celadhesie-bepaling. In een verdere uitvoeringsvorm is die IC50 minder dan 50 nM, minder dan 40 nM, minder dan 2 0 nM, minder dan 10 nM, minder dan 1 nM, minder dan 500 pM, minder dan 200 pM, minder dan 100 pM of minder dan 10 pM, zoals gemeten met behulp van een P-15 cadherineafhankelijke celadhesie-bepaling. Er is kenmer kend geen ondergrens voor de waarde van IC50 zoals gemeten met behulp van een P-cadherineafhankelijke celadhesie-bepaling. Voor praktische doeleinden kan het echter worden aangenomen dat de ondergrens ongeveer 1 pM is.

E) In een andere uitvoeringsvorm heeft het P- cadherineantilichaam of gedeelte daarvan een IC50 van 100 nM of minder, zoals gemeten met behulp van een P- cadherineafhankelijke celaggregatie-bepaling. In een verdere uitvoeringsvorm is die IC50 minder dan 50 nM, minder 2 5 dan 4 0 nM, minder dan 2 0 nM, minder dan 10 nM, minder dan 1 nM, minder dan 500 pM, minder dan 200 pM, minder dan 100 pM of minder dan 1 pM, zoals gemeten met behulp van een P-cadherineafhankelijke celaggregatie-bepaling. Er is kenmerkend geen ondergrens voor de waarde van IC50 zoals geme-30 ten met behulp van een P-cadherineafhankelijke celaggregatie-bepaling. Voor praktische doeleinden kan het echter worden aangenomen dat de ondergrens ongeveer 1 pM is.

F) In een andere uitvoeringsvorm verhoogt het P-cadherineantilichaam of gedeelte daarvan sferoïdeontwrich-35 ting in een P-cadherineafhankelijke sferoïdeontwrichting-bepaling met een factor van ten minste 2, vergeleken met een controlemonster zonder aanwezig IgG. In een verdere 5 uitvoeringsvorm verhoogt het P-cadherineantilichaam of gedeelte daarvan sferoïdeontwrichting in een P- cadherineafhankelijke sferoïdeontwrichting-bepaling met een factor van ten minste 3, ten minste 4, ten minste 6, 5 ten minste 10 of ten minste 15, vergeleken met een contro-lemonster zonder aanwezig IgG.

G) In een andere uitvoeringsvorm concurreert het P-cadherineantilichaam of gedeelte daarvan met een antili-chaam dat is gekozen uit de groep bestaande uit 194-e06; 10 194 -a02; 194-b09; 195-ell; 194-g09; 196-h02; 194-eOl; 196- dlO; 19 6-g 0 3; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194- b0 9; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194- e06; 129-lc4 en g-129-lc4, om binding aan P-cadherine.

H) In een andere uitvoeringsvorm kruisconcurreert het 15 P-cadherineantilichaam of gedeelte daarvan met een antili- chaam dat is gekozen uit de groep bestaande uit 194-e06; 194 -a02; 194-b09; 195-ell; 194-g09; 196-h02; 194-eOl; 196-dlO; 19 6-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194- b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194- 20 e06; 129-lc4 en g-129-lc4, om binding aan P-cadherine.

I) In een andere uitvoeringsvorm bindt het P- cadherineantilichaam of gedeelte daarvan aan hetzelfde epitoop van P-cadherine als een antilichaam dat is gekozen uit de groep bestaande uit 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195- 25 ell; 194-g09; 196-h02; 194-eOl; 196-dlO; 196-g03; 196-e06; 19 5-a 0 9; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196- g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-lc4 en g-129- lc4 .

J) In een andere uitvoeringsvorm bindt het P-30 cadherineantilichaam of gedeelte daarvan aan P-cadherine met nagenoeg dezelfde KD als een antilichaam dat is gekozen uit de groep bestaande uit 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-ell; 194-g09; 196-h02; 194-eOl; 196-dlO; 196-g03; 196- e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g- 35 196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-lc4 en g- 129-1C4.

K) In een andere uitvoeringsvorm bindt het P-cadherineantilichaam of gedeelte daarvan aan P-cadherine met nagenoeg dezelfde Ka£ als een antilichaam dat is gekozen uit de groep bestaande uit 194-e06; 194-a02; 5 194-bO 9; 195-ell; 194-g09; 196-h02; 194-eOl; 196-dlO; 196- g03; 19 6 -e 0 6; 195-a09; 198-aO9; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-lc4 en g-129-lc4.

Een verder aspect van de onderhavige uitvinding is 10 een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan met ten minste één van de functionele eigenschappen die eerder zijn beschreven in A) tot en met K) , omvattende een VH-domein dat wat betreft aminozuursequentie ten minste 90% identiek is aan één van SEQ ID NO's: 1 tot 13 en 320 tot 15 325. In één uitvoeringsvorm is dat VH-domein wat betreft aminozuursequentie ten minste 91%, ten minste 93%, ten minste 95%, ten minste 97%, ten minste 99% of 100% identiek aan één van SEQ ID NO's: 1 tot 12 en 320 tot 325.

In een verdere uitvoeringsvorm heeft het antilichaam 20 of gedeelte daarvan ten minste één van de functionele eigenschappen die eerder zijn beschreven in A) tot en met K) , omvattende een VH-domein dat bestaat uit één van SEQ ID NO's: 1 tot 13 en 320 tot 325, of verschilt dit van één van SEQ ID NO's: 1 tot 13 en 320 tot 325 door het hebben 25 van ten minste één conservatieve aminozuursubstitutie. Het VH-domein kan bijvoorbeeld met 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 of 10 conservatieve aminozuursubstituties verschillen van één van SEQ ID NO's: 1 tot 13 en 320 tot 325. In een verdere uitvoeringsvorm kan welke van deze conservatieve ami-30 nozuursubstituties ook, vóórkomen in de CDR1-, CDR2- en/of CDR3-gebieden.

Een verder aspect van de onderhavige uitvinding is een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan met ten minste één van de functionele eigenschappen die eerder 3 5 zijn beschreven in A) tot en met K) , omvattende een VL-domein dat wat betreft aminozuursequentie ten minste 90% identiek is aan één van SEQ ID NO’s: 14 tot 23 en 326 tot 7 331. In één uitvoeringsvorm is dat VL-domein wat betreft aminozuursequentie ten minste 91%, ten minste 93%, ten minste 95%, ten minste 97%, ten minste 99% of 100% identiek aan één van SEQ ID NO's: 14 tot 23 en 326 tot 331.

In een verdere uitvoeringsvorm heeft het antilichaam of gedeelte daarvan ten minste één van de functionele eigenschappen die eerder zijn beschreven in A) tot en met K) , en omvat dit een V^-domein dat bestaat uit één van SEQ ID NO's: 14 tot 23 en 326 tot 331, of verschilt dit van 10 één van SEQ ID NO's: 14 tot 23 en 326 tot 331 door het hebben van ten minste één conservatieve aminozuursubstitu-tie. Het VL-domein kan bijvoorbeeld met 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 of 10 conservatieve aminozuursubstituties verschillen van één van SEQ ID NO'S: 14 tot 23 en 326 tot 15 331. In een verdere uitvoeringsvorm kan welke van deze conservatieve aminozuursubstituties ook, vóórkomen in de CDRl-, CDR2- en/of CDR3-gebieden.

Een ander aspect van de onderhavige uitvinding is een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan met ten 20 minste één van de functionele eigenschappen die eerder zijn beschreven in A) tot en met K) , waarbij de VL- en VH-domeinen ieder wat betreft aminozuursequentie ten minste 90% identiek zijn aan respectievelijk de VL- en VH-domeinen van één van antilichamen 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195- 25 ell; 19 4 -g 0 9; 196-h02; 194-eOl; 196-dlO; 196-g03; 196-e06; 195- a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196- g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1C4 en g-129- lc4. De VL- en VH-domeinen zijn bijvoorbeeld ieder wat betreft aminozuursequenties ten minste 91%, 93%, 95%, 97%, 30 99% of 100% identiek aan respectievelijk de VL- en VH- domeinen van één van antilichamen 194-e06; 194-a02; 194- bO 9; 195-ell; 194-g09; 196-h02; 194-eOl; 196-dlO; 196-g03; 196- Θ06; 19 5 -a 0 9; 198-a09; 200-h0 6; g-194-b0 9; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1C4 en g- 35 12 9-lc4.

In een ander aspect van de onderhavige uitvinding is een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan dat is b gekozen uit de groep bestaande uit: a) een antilichaam of gedeelte daarvan dat een VH-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 1, en een VL-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 14, omvat; b) een antilichaam of 5 gedeelte daarvan dat een VH-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 2, en een VL-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 14, omvat; c) een antilichaam of gedeelte daarvan dat een VH-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 2, en een VL-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 15, omvat;

d) een antilichaam of gedeelte daarvan dat een VH-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 3, en een VL-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 16, omvat; e) een antilichaam of gedeelte daarvan dat een VH-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 4, en een VL-domein, zoals uiteengezet in SEQ

ID NO: 17, omvat; f) een antilichaam of gedeelte daarvan

dat een VH-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 4, en een VL-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 23, omvat; g) een antilichaam of gedeelte daarvan dat een VH-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 5, en een VL-domein, zoals 20 uiteengezet in SEQ ID NO: 18, omvat; h) een antilichaam of gedeelte daarvan dat een VH-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 6, en een VL-domein, zoals uiteengezet in SEQ

ID NO: 23, omvat; i) een antilichaam of gedeelte daarvan dat een VH-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 7, en 25 een VL-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 23, omvat;

j) een antilichaam of gedeelte daarvan dat een VH-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 8, en een VL-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 23, omvat; k) een antilichaam of gedeelte daarvan dat een VH-domein, zoals uiteengezet in 30 SEQ ID NO: 9, en een VL-domein, zoals uiteengezet in SEQ

ID NO: 23, omvat; 1) een antilichaam of gedeelte daarvan dat een VH-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 10, en een VL-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 19, omvat; m) een antilichaam of gedeelte daarvan dat een VH-domein, 35 zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 11, en een VL-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 20, omvat; n) een antili chaam of gedeelte daarvan dat een VH-domein, zoals uiteen- 9 gezet in SEQ ID NO: 12, en een VL-domein, zoals uiteenge zet in SEQ ID NO: 21, omvat; o) een antilichaam of gedeelte daarvan dat een VH-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 13, en een VL-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 5 22, omvat; p) een antilichaam of gedeelte daarvan dat een VH-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 320, en een VL-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 326, omvat; q) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan dat een VH-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 321, en een VL-10 domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 327, omvat; r) een antilichaam of gedeelte daarvan dat een VH-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 322, en een VL-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 328, omvat; s) een antilichaam of gedeelte daarvan dat een VH-domein, zoals uiteengezet 15 in SEQ ID NO: 323, en een VL-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 329, omvat; t) een antilichaam of gedeelte daarvan dat een VH-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 324, en een VL-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 330, omvat; en u) een antilichaam of gedeelte daarvan dat 20 een VH-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 325, en een VL-domein, zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 331, omvat.

In een verdere uitvoeringsvorm kunnen, voor een van de antilichamen of gedeelten daarvan zoals boven beschreven in groepen a) tot u) , de VH- en/of VL-domeinen ver-25 schillen van de specifieke SEQ ID NO's die daarin zijn gereciteerd met ten minste één conservatieve aminozuursub-stitutie. De VH- en/of VL-domeinen kunnen bijvoorbeeld verschillen van het gereciteerde SEQ ID NO met 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 of 10 conservatieve aminozuursubstituties. In 30 een verdere uitvoeringsvorm kan welke van deze conservatieve aminozuursubstituties ook, vóórkomen in de CDR1-, CDR2- en/of CDR3-gebieden.

In een andere uitvoeringsvorm verschaft de onderhavige uitvinding een antilichaam of antigeenbindend gedeelte 35 daarvan met ten minste één van de functionele eigenschappen die eerder zijn beschreven in A) tot en met K), omvattende een VH-domein dat onafhankelijk is gekozen uit één 10 van SEQ ID NO's: 1 tot 13 en 320 tot 325, of een sequentie die verschilt van één van SEQ ID NO's: 1 tot 13 en 320 tot 325 met ten minste één conservatieve aminozuur-substitutie, en omvat deze verder een VL-domein dat onaf-5 hankelijk is gekozen uit één van SEQ ID NO's: 14 tot 23 en 326 tot 331, of een sequentie die verschilt van één van SEQ ID NO's: 14 tot 23 en 326 tot 331 met ten minste één conservatieve aminozuursubstitutie. De VH- en VL-domeinen kunnen bijvoorbeeld ieder onafhankelijk verschillen van 10 één van SEQ ID NO's: 1 tot 13, 320 tot 325, 14 tot 23 en 326 tot 331 met 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 of 10 conserva tieve aminozuursubstituties.

In een verdere uitvoeringsvorm verschaft de onderhavige uitvinding een antilichaam of antigeenbindend gedeel-15 te daarvan met ten minste één van de functionele eigenschappen die eerder zijn beschreven in A) tot en met K) , waarbij dat antilichaam of gedeelte een VH-CDR3 omvat, gekozen uit één van SEQ ID NO's: 26 tot 37 en 91 tot 256, of een sequentie die verschilt van één van SEQ ID NO's: 26 20 tot 37 en 91 tot 256 met ten minste één conservatieve aminozuursubstitutie. Het VH-CDR3 kan bijvoorbeeld verschillen van één van SEQ ID NO's: 26 tot 37 en 91 tot 256 met 1, 2, 3 of 4 conservatieve aminozuursubstituties.

In een verdere uitvoeringsvorm verschaft de onderha-25 vige uitvinding een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan met ten minste één van de functionele eigenschappen die eerder zijn beschreven in A) tot en met K) , waarbij dat antilichaam of antigeenbindende gedeelte een VL-CDR3 omvat, gekozen uit één van SEQ ID NO's: 40 tot 47 30 en 257 tot 319, of een sequentie die verschilt van één van SEQ ID NO’s: 40 tot 47 en 257 tot 319 met ten minste één conservatieve aminozuursubstitutie. Het VL-CDR3 kan bijvoorbeeld verschillen van één van SEQ ID NO's: 40 tot 47 en 2 57 tot 319 met 1, 2, 3, 4 of 5 conservatieve amino- 35 zuursubstituties.

In een verdere uitvoeringsvorm verschaft de onderhavige uitvinding een antilichaam of antigeenbindend gedeel- 11 te daarvan, waarbij dat antilichaam of antigeenbindende gedeelte: een V„-CDR1 zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 24, of een sequentie die verschilt van SEQ ID NO: 24 met ten minste één conservatieve aminozuursub-5 stitutie; een VH-CDR2 zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 25 of een sequentie die verschilt van SEQ ID NO: 25 met ten minste één conservatieve aminozuursubstitutie; en een VH-CDR3 dat onafhankelijk is gekozen uit één van SEQ ID NO's: 26 tot 37 en 91 tot 256, of een sequentie die verschilt 10 van één van SEQ ID NO1 s: 2 6 tot 37 en 91 tot 256 met ten minste één conservatieve aminozuursubstitutie, omvat. De boven vermelde VH-CDR1-, -CDR2- en -CDR3-sequenties kunnen bijvoorbeeld ieder onafhankelijk verschillen van de respectieve gereciteerde SEQ ID NO's met 1, 2, 3, 4 of 5 con-15 servatieve aminozuursubstituties.

In een andere uitvoeringsvorm verschaft de onderhavige uitvinding een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan, waarbij dat antilichaam of antigeenbindende gedeelte: een VL-CDR1 zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 38, of 20 een sequentie die verschilt van SEQ ID NO: 38 met ten minste één conservatieve aminozuursubstitutie; een VL-CDR2 zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 39, of een sequentie die verschilt van SEQ ID NO: 39 met ten minste één conservatieve aminozuursubstitutie; en een VL-CDR3 dat onafhanke-25 lijk is gekozen uit één van SEQ ID NO's: 40 tot 47 en 257

tot 319, of een sequentie die verschilt van één van SEQ ID

NO's: 40 tot 47 en 257 tot 319 met ten minste één conser vatieve aminozuursubstitutie, omvat. De boven vermelde VL-CDR1-, -CDR2- en -CDR3-sequenties kunnen bijvoorbeeld ie-30 der onafhankelijk verschillen van de respectieve gereciteerde SEQ ID NO's met 1, 2, 3, 4 of 5 conservatieve ami nozuursubst ituties.

De onderhavige uitvinding verschaft verder een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan, waarbij dat 35 antilichaam of antigeenbindende gedeelte: een VH-CDR1 zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 24; een VH-CDR2 zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 25; een VH-CDR3 dat is gekozen uit i2 één van SEQ ID NO1 s: 26 tot 37 en 91 tot 256; een VL- CDRl zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 38; een Vb-CDR2 zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 39; en een Vb-CDR3 dat is geko zen uit één van SEQ ID NO1s: 40 tot 47 en 257 tot 319, om-5 vat. In een verdere uitvoeringsvorm kunnen de vermelde VH-en Vl-CDR1 -, -CDR2- en -CDR3-sequenties ook ieder onafhankelijk verschillen van de specifieke SEQ ID NO's die boven zijn gereciteerd met ten minste één conservatieve amino-zuursubstitutie. De CDR1-, CDR2- en CDR3- sequenties kunnen 10 bijvoorbeeld ieder onafhankelijk verschillen van de respectieve specifieke SEQ ID NO's die boven zijn gereciteerd met 1, 2, 3, 4 of 5 conservatieve aminozuursubstituties,

De onderhavige uitvinding verschaft verder een anti-lichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan waarbij dat 15 antilichaam of antigeenbindende gedeelte het VH- en Vb-CDR1, het VH- en Vb-CDR2 en het VH- en Vb-CDR3 omvat zoals aangetroffen in een van antilichamen 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-ell; 194-g09; 196-h02; 194-eOl; 196-dlO; 196-g03; 19 6 -e 0 6; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-20 g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1C4 en g-129-lc4.

De onderhavige uitvinding verschaft verder een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan, omvattende een VH-domein dat is gekozen uit één van SEQ ID NO's: 1 tot 13 en 320 tot 325, of verschilt van één van SEQ ID

NO's: 1 tot 13 en 320 tot 325 met 1 tot 10 conservatieve aminozuursubstituties.

De onderhavige uitvinding verschaft verder een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan, omvattende 3 0 een Vb-domein dat is gekozen uit één van SEQ ID NO's: 14 tot 23 en 326 tot 331, of verschilt van één van SEQ ID

NO's: 14 tot 23 en 326 tot 331 met 1 tot 10 conservatieve aminozuursubstituties.

De onderhavige uitvinding verschaft verder een anti-35 lichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan, omvattende een VH-domein dat onafhankelijk is gekozen uit één van SEQ ID NO's: 1 tot 13 en 320 tot 325, of een sequentie die 13 verschilt van één van SEQ ID NO1 s: 1 tot 13 en 320 tot 325 met 1 tot 10 conservatieve aminozuursubst ituties, en verder omvattende een VL-domein dat onafhankelijk is gekozen uit één van SEQ ID NO1s: 14 tot 23 en 326 tot 331, of 5 een sequentie die verschilt van één van SEQ ID NO1 s: 14 tot 23 en 326 tot 331 met 1 tot 10 conservatieve aminozuursubst ituties .

De onderhavige uitvinding verschaft verder een anti-lichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan, waarbij dat 10 antilichaam of antigeenbindende gedeelte: een VH-CDR1 zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 24, of een sequentie die verschilt van SEQ ID NO: 24 met 1 tot 4 conservatieve ami- nozuursubstituties; een VH-CDR2 zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 25, of een sequentie die verschilt van SEQ ID NO: 15 25 met 1 tot 4 conservatieve aminozuursubstituties; en een

Vh-CDR3 dat is gekozen uit één van SEQ ID NO1s: 26 tot 37 en 91 tot 256, of een sequentie die verschilt van één van SEQ ID NO's: 26 tot 37 en 91 tot 256 met 1 tot 4 conservatieve aminozuursubstituties, omvat.

De onderhavige uitvinding verschaft verder een anti lichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan, waarbij dat antilichaam of antigeenbindende gedeelte: een VL-CDR1 zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 38, of een sequentie die verschilt van SEQ ID NO: 38 met 1 tot 4 conservatieve ami-

nozuursubstituties; een VL-CDR2 zoals uiteengezet in SEQ

ID NO: 39, of een sequentie die verschilt van SEQ ID NO: 39 met 1 tot 4 conservatieve aminozuursubstituties; en een

Vl-CDR3 dat is gekozen uit één van SEQ ID NO's: 40 tot 47 en 257 tot 319, of een sequentie die verschilt van één van 30 SEQ ID NO's: 40 tot 47 en 257 tot 319 met 1 tot 4 conser vatieve aminozuursubstituties, omvat.

De onderhavige uitvinding verschaft verder een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan met ten minste één van de functionele eigenschappen die eerder zijn be-3 5 schreven in A) tot en met K) , waarbij dat antilichaam of antigeenbindende gedeelte: een Vh-FR1 zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 48; een V„-FR2 zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 14 49; een VH-FR3 dat is gekozen uit één van SEQ IE NO1s: 50 tot 55; een VH-FR4 dat is gekozen uit één van SEQ ID NO's: 56 en 57; een Vtj-FR1 dat is gekozen uit één van SEQ ID NO's: 58 en 59; een VL-FR2 dat is gekozen uit één 5 van SEQ ID NO'S: 60 tot 62; een VL-FR3 dat is gekozen uit één van SEQ ID NO's: 63 tot 66; en een VL-FR4 zoals uit eengezet in SEQ ID NO: 67, omvat. In een verdere uitvoeringsvorm kunnen de vermelde VH- en VL-FR1-, -FR2-, -FR3- en -FR4-sequenties ook ieder onafhankelijk verschillen van 10 de specifieke SEQ ID NO's die boven zijn gereciteerd met ten minste één conservatieve aminozuursubstitutie. De FR1-, FR2-, FR3- en FR4-sequenties kunnen bijvoorbeeld ieder onafhankelijk verschillen van de respectieve specifieke SEQ ID NO's die boven zijn gereciteerd met 1, 2, 3, 4, 5, 15 6, 7, 8, 9 of 10 conservatieve aminozuursubstituties. In een nog verdere uitvoeringsvorm kan ieder van de FR1-, FR2-, FR3- en FR4-sequenties ieder onafhankelijk zijn gemuteerd, waardoor ze passen bij de respectieve kiemlijnge-raamtesequentie.

In een verdere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding is een van de hierin beschreven antilichamen, waarbij het antilichaam een IgG-, een IgM-, een IgE-, een IgA- of een IgD-molecuul is, of daarvan afgeleid is. Het antilichaam kan bijvoorbeeld een IgG2 of IgG2 zijn. In één uit-25 voeringsvorm is IgG bijvoorbeeld een IgGlf waarbij het constante gebied van de zware keten SEQ ID NO: 344 omvat en waarbij het constante gebied van de lichte keten SEQ ID NO: 345 omvat, met dien verstande dat het C-terminale ly-sineresidu van SEQ ID NO: 344 eventueel is gesplitst.

Een andere uitvoeringsvorm verschaft een van de anti lichamen of antigeenbindende gedeelten die boven zijn beschreven, dat een Fab-fragment, een F (ab') 2-fragment, een Fv-fragment, een Fv-fragment van enkelvoudige keten, een VH-fragment van enkelvoudige keten, een VL-fragment van en-35 kelvoudige keten, een gehumaniseerd antilichaam, een chi-meer antilichaam of een bispecifiek antilichaam is.

In een verder-e uitvoeringsvorm is een gederivatiseerd antilichaam of antigeenbindend gedeelte dat een van de antilichamen of gedeelten daarvan, zoals hierin beschreven, en ten minste één bijkomende moleculai-5 re entiteit omvat. De ten minste één bijkomende moleculaire entiteit kan bijvoorbeeld een ander antilichaam (bv. een bispecifiek antilichaam of een dialichaam), een detec-tieagens, een merkstof, een cytotoxisch agens, een farmaceutisch agens en/of een eiwit of peptide dat de associa-10 tie van het antilichaam of antilichaamgedeelte met een ander molecuul (zoals een streptavidinekerngebied of een po-lyhistidinelabel) kan mediëren, zijn. Bruikbare detectie-agentia waarmee een antilichaam of antigeenbindend gedeelte van de uitvinding kan zijn gederivatiseerd, omvatten 15 bijvoorbeeld fluorescerende verbindingen, waaronder fluo-resceine, fluoresceine-isothiocyanaat, rhodamine, 5-dimethylamine-1-naftaleensulfonylchloride, fyco-erythrine, lanthanidefosfors en dergelijke. Een antilichaam kan ook zijn gemerkt met enzymen die bruikbaar zijn voor detectie, 20 zoals mierikswortelperoxidase, β-galactosidase, lucifera-se, alkalische fosfatase, glucoseoxidase en dergelijke. In een verdere uitvoeringsvorm kunnen de antilichamen of gedeelten daarvan van de onderhavige uitvinding ook zijn gemerkt met biotine, of met een vooraf bepaald polypeptide-25 epitoop dat wordt herkend door een secundaire reporter (bv. leucineritspaarsequenties, bindingsplaatsen voor secundaire antilichamen, metaalbindende domeinen, epitoopla-bels) . In een nog verdere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding kan een van de antilichamen of gedeelten 30 daarvan ook zijn gederivatiseerd met een chemische groep zoals polyethyleenglycol (PEG), een methyl- of ethylgroep, of een koolhydraatgroep.

In sommige uitvoeringsvormen zijn de hierin beschreven P-cadherineantilichamen of antigeenbindende gedeelten 35 vastgehecht aan een vaste drager.

In sommige uitvoeringsvormen is het C-terminale lysine van de zware keten van een van de P-cadherine- 16 antilichamen van de uitvinding gesplitst. In verschillende uitvoeringsvormen van de uitvinding kunnen de zware en lichte ketens van de P-cadherineantilichamen eventueel een N-terminale signaalsequentie omvatten. De 5 signaalsequentie van de zware keten kan bijvoorbeeld SEQ ID NO: 346 zijn, en de signaalsequentie van de lichte keten kan SEQ ID NO: 347 zijn.

In een verdere uitvoeringsvorm heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een van de antilichamen of anti-10 geenbindende gedeelten daarvan, zoals hierin beschreven, waarbij de antilichamen of antigeenbindende gedeelten daarvan van humane oorsprong zijn.

De onderhavige uitvinding verschaft ook een farmaceutisch preparaat dat een van de antilichamen of antigeen-15 bindende gedeelten daarvan, zoals boven beschreven, en een farmaceutisch aanvaardbare drager omvat.

In een andere uitvoeringsvorm heeft de uitvinding betrekking op een geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul dat een nucleotidesequentie omvat die codeert voor een van de an-20 tilichamen of antigeenbindende gedeelten daarvan, zoals hierin beschreven. In één specifieke uitvoeringsvorm is een geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul dat een nucleotidesequentie omvat zoals uiteengezet in één van SEQ ID NO's: 68 tot 90 en 332 tot 343. De uitvinding heeft verder betrek-25 king op een vector die een van de hierin beschreven nucle-inezuurmoleculen omvat, waarbij de vector eventueel een expressieregulatiesequentie omvat die operationeel is verbonden met het nucleïnezuurmolecuul.

Een andere uitvoeringsvorm verschaft een gastheercel 30 die één van de hierin beschreven vectoren omvat of die één van de hierin beschreven nucleïnezuurmoleculen omvat. De onderhavige uitvinding verschaft ook een geïsoleerde cellijn die een van de antilichamen of antigeenbindende gedeelten, zoals hierin beschreven, produceert of die de 35 zware keten of lichte keten van een van die antilichamen of die antigeenbindende gedeelten produceert.

In een andere uitvoeringsvorm heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een werkwijze voor het produceren van een P-cadherineantilichaam of antigeen-bindend gedeelte daarvan, omvattende het kweken van een 5 van de hierin beschreven gastheercellen of cellijnen onder geschikte omstandigheden en het winnen van dat antilichaam of antigeenbindende gedeelte.

De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op een niet-humaan transgeen dier of een transgene plant dat/die 10 een van de hierin beschreven nucleïnezuren omvat, waarbij het niet-humane transgene dier of de transgene plant dat nucleïnezuur tot expressie brengt.

De onderhavige uitvinding verschaft verder een werkwijze voor het isoleren van een antilichaam of antigeen-15 bindend gedeelte daarvan dat bindt aan P-cadherine, omvattende de stap van het isoleren van het antilichaam uit het niet-humane transgene dier of de transgene plant, zoals hierin beschreven.

De onderhavige uitvinding verschaft ook een werkwijze 2 0 voor het behandelen van abnormale celgroei bij een zoogdier dat dit nodig heeft, omvattende de stap van het aan dat zoogdier toedienen van een van de antilichamen of an-tigeenbindende gedeelten daarvan, of een van de farmaceutische preparaten, zoals hierin beschreven. De onderhavige 25 uitvinding verschaft verder een werkwijze voor het behandelen van abnormale celgroei bij een zoogdier dat dit nodig heeft, met een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan dat bindt aan P-cadherine, omvattende de stappen van het aan dat zoogdier toedienen van een effectieve hoe-30 veelheid van een van de hierin beschreven nucleïnezuurmo-leculen onder geschikte omstandigheden die expressie van die nucleinezuurmoleculen mogelijk maken. In een andere uitvoeringsvorm omvat de werkwijze voor het behandelen van abnormale celgroei verder het toedienen van een hoeveel-35 heid van één of meer stoffen, gekozen uit antitumoragen-tia, antiangiogeneseagentia, signaaltransductieremmers en antiproliferatieve agentia, welke hoeveelheden samen ei- 18 fectief zijn bij het behandelen van die abnormale celgroei. In specifieke uitvoeringsvormen is die abnormale celgroei carcinomateus.

De onderhavige uitvinding verschaft verder een werk-5 wijze voor het verminderen van P-cadherineafhankelijke cellulaire aggregatie, omvattende het in contact brengen van de cellen met een van de hierin beschreven antilicha-men of antigeenbindende gedeelten daarvan, of een van de hierin beschreven farmaceutische preparaten.

Een ander aspect van de onderhavige uitvinding is een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan dat een aminozuursequentie van een variabel gebied van een zware keten omvat die gebruik maakt van een humane V„-3-familie-gen. In één uitvoeringsvorm is het humane VH-3 - f amilie-gen 15 bijvoorbeeld VH-3-23.

Een ander aspect van de onderhavige uitvinding verschaft een van de antilichamen of antigeenbindende gedeelten daarvan, zoals hierin beschreven, waarbij dat antilichaam of antigeenbindende gedeelte een humaan antilichaam 20 is. In een verder aspect is dat antilichaam of antigeen-bindende gedeelte een humaan recombinant antilichaam.

De uitvinding verschaft ook een werkwijze voor het produceren van een P-cadherineantilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan, omvattende de stappen van het syn-25 thetiseren van een bibliotheek van humane antilichamen in faag, het screenen van de bibliotheek met P-cadherine of een antigeen gedeelte daarvan, het isoleren van faag die P-cadherine bindt, en het verkrijgen van het antilichaam uit de faag.

Definities en algemene technieken

Tenzij hierin anders gedefinieerd, zullen wetenschappelijke en technische termen die worden gebruikt in verband met de onderhavige uitvinding, de betekenissen hebben die gewoonlijk door de gemiddelde vakman worden begrepen. 35 Verder zullen, tenzij door de context anders vereist, enkelvoudige termen meervoudigheden omvatten en zullen meervoudige termen de enkelvoudsvorm omvatten. Gewoonlijk zijn 19 de nomenclatuur die wordt gebruikt in verband met, en de technieken van cel- en weefselkweek, moleculaire biologie, immunologie, microbiologie, genetica en eiwit- en nu-cleïnezuurchemie en -hybridisatie die hierin worden be-5 schreven, die welke in de techniek algemeen bekend en gewoonlijk gebruikt zijn.

De werkwijzen en technieken van de onderhavige uitvinding worden gewoonlijk uitgevoerd volgens conventionele werkwijzen die in de techniek algemeen bekend zijn, en zo-10 als beschreven in verschillende algemene en specifiekere referenties die door heel de onderhavige beschrijving worden geciteerd en besproken, tenzij anders aangegeven. Zie bv. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 3e ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold 15 Spring Harbor, N.Y. (2 000) ; Ausubel et al. , Short Protocols in Molecular Biology; A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow en Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold 2 0 Spring Harbor, N.Y. (1998) ; en Coligan et al. , Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc.

(2003), waarvan de beschrijvingen hier bij referentie worden opgenomen. Enzymatische reacties en zuiveringstechnieken worden uitgevoerd volgens de specificaties van de fa-25 brikant, zoals gewoonlijk bewerkstelligd in de techniek of zoals hierin beschreven. De nomenclatuur die wordt gebruikt in verband met, en de laboratoriumprocedures en -technieken van analytische chemie, synthetische organische chemie en medicinale en farmaceutische chemie die 30 hierin worden beschreven, zijn die welke in de techniek algemeen bekend zijn en gewoonlijk worden gebruikt. Er worden standaardtechnieken gebruikt voor chemische syntheses, chemische analyses, farmaceutische bereiding, formulering, levering, en behandeling van patiënten.

Het is bekend dat de fundamentele structurele eenheid van een antilichaam een tetrameer omvat. Ieder tetrameer is opgebouwd uit twee identieke paren van polypeptideke- 20 tens, waarbij ieder paar één "lichte" (ongeveer 25 kDa) en één "zware" keten (ongeveer 50-70 kDa) heeft. Het ami-noterminale gedeelte van iedere keten omvat een variabel gebied van ongeveer 100 tot 120 of meer aminozuren dat 5 primair verantwoordelijk is voor antigeenherkenning. Het carboxyterminale gedeelte van iedere keten definieert een constant gebied dat primair verantwoordelijk is voor ef-fectorfunctie. Humane lichte ketens worden geclassificeerd als kappa- en lambda-lichte ketens. Zware ketens worden 10 geclassificeerd als mu, delta, gamma, alfa of epsilon, en definiëren het isotype van het antilichaam als respectievelijk IgM, IgD, IgG, IgA en IgE. Binnen in lichte en zware ketens worden de variabele en constante gebieden verbonden door een "J"-gebied van ongeveer 12 of meer amino-15 zuren, waarbij de zware keten ook een "D"-gebied van ongeveer 3 of meer aminozuren omvat. Zie in het algemeen Fundamental Immunology, Η. 7 (Paul, W., ed. , 2e ed. , Raven Press, N.Y. (1989)) (hier voor alle doeleinden in haar geheel bij referentie opgenomen). De variabele gebieden van 20 ieder zware/lichte keten-paar (VH en Vj vormen de bin-dingsplaats van het antilichaam. Aldus heeft bijvoorbeeld een intact IgG-antilichaam twee bindingsplaatsen. Behalve bij bifunctionele of bispecifieke antilichamen zijn de twee bindingsplaatsen hetzelfde.

De variabele gebieden van de zware en lichte ketens vertonen dezelfde algemene structuur van relatief geconserveerde geraamtegebieden [framework regions] (FR), verbonden door drie hypervariabele gebieden, ook complementariteit sbepalende gebieden [complementarity determining re-30 gions] of CDR1s genoemd. De term "variabel" verwijst naar het feit dat onder antilichamen bepaalde gedeelten van de variabele domeinen wat betreft sequentie uitgebreid verschillen, en worden gebruikt bij de binding en specificiteit van ieder specifiek antilichaam voor zijn specifieke 35 antigeen. De variabiliteit is echter niet gelijkmatig verdeeld door heel de variabele domeinen van antilichamen, maar is geconcentreerd in de CDR's, die worden gescheiden 21 door de meer in hoge mate geconserveerde FR' s. De CDR's die afkomstig zijn van de twee ketens van ieder paar worden op één lijn gebracht door de FR's, daarbij binding aan een specifiek epitoop mogelijk makend. Van N-terminaal 5 tot C-terminaal omvatten zowel de lichte als de zware ketens de domeinen FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 en FR4. De toekenning van aminozuren aan ieder domein geschiedt volgens de definities van Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Be-10 thesda, Md. (1987 en 1991)) , of Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. , 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878- 883 (1989), waarvan de beschrijvingen hier bij referentie worden opgenomen.

Het zal worden begrepen dat de volgende termen, ten-15 zij anders aangegeven, de volgende betekenissen hebben:

Tenzij met name anders aangegeven, verwijst de term "P-cadherine" naar humaan P-cadherine, dat een integraal membraaneiwit en een lid van de klassieke cadherinefamilie van transmembraanglycoproteïnen is die cel-celadhesie re-20 guleren. De klonering en de sequentie van humaan P-cadherine is gerapporteerd, bv. Shimoyama et al., J. Cell Biol., 109 (4 Pt 1), 1787-1794 (1989), waarvan de be schrijving hier bij referentie wordt opgenomen. Het wordt bedoeld dat de term P-cadherine recombinant humaan P-25 cadherine en recombinante chimere vormen van P-cadherine omvat, die kunnen worden bereid met behulp van standaard-recombinantexpressiewerkwijzen, of die commercieel kunnen worden gekocht (R&D Systems 861-PC-100).

Tenzij met name anders aangegeven, verwijst de term 30 "E-cadherine", zoals hierin gebruikt, naar humaan E-cadherine, dat een integraal membraaneiwit en een lid van de klassieke cadherinefamilie van transmembraanglycoprote-inen is die cel-celadhesie reguleren. E-cadherine wordt bijvoorbeeld beschreven in Takeichi, Science 251: 1451- 35 1455 (1991) , waarvan de beschrijving hier bij referentie wordt opgenomen. Het wordt bedoeld dat de term E-cadherine recombinant humaan E-cadherine en recombinante chimere 22 vormen van E-cadherine omvat, die kunnen worden bereid met behulp van standaardrecombinantexpressiewerk-wijzen, of die commercieel kunnen worden gekocht (R&D 648-EC-100).

De term "polypeptide" omvat natieve of kunstmatige eiwitten, eiwitfragmenten en polypeptideanalogons van een eiwitsequentie. Een polypeptide kan monomeer of polymeer zijn.

De term "geïsoleerd eiwit", "geïsoleerd polypeptide" 10 of "geïsoleerd antilichaam" is een eiwit, polypeptide of antilichaam dat op grond van zijn oorsprong of bron van afleiding (1) niet is geassocieerd met van nature geassocieerde componenten die het begeleiden in zijn natieve toestand, (2) vrij is van andere eiwitten die afkomstig 15 zijn van dezelfde soort, (3) tot expressie wordt gebracht door een cel die afkomstig is van een verschillende soort of (4) niet in de natuur vóórkomt. Aldus zal een polypeptide dat chemisch wordt gesynthetiseerd of dat wordt gesynthetiseerd in een cellulair systeem dat verschillend is 20 van de cel vanwaaruit het van nature ontstaat, "geïsoleerd" van zijn van nature geassocieerde componenten zijn. Een eiwit kan ook nagenoeg vrij van van nature geassocieerde componenten worden gemaakt door middel van isolatie, met gebruikmaking van eiwitzuiveringstechnieken die in de 25 techniek algemeen bekend zijn.

Voorbeelden van geïsoleerde antilichamen omvatten een P-cadherineantilichaam dat aan de hand van affiniteit is gezuiverd met gebruikmaking van P-cadherine, en een P-cadherineantilichaam dat in vitro door een cellijn is ge-30 synthetiseerd.

Een eiwit of polypeptide is "nagenoeg zuiver", "nagenoeg homogeen" of "nagenoeg gezuiverd" wanneer ten minste ongeveer 60 tot 75% van een monster een enkelvoudige soort van polypeptide vertoont. Het polypeptide of eiwit kan mo-35 nomeer of multimeer zijn. Een nagenoeg zuiver polypeptide of eiwit kan kenmerkend ongeveer 50%, 60%, 70%, 80% of 90% w/w van een eiwitmonster omvatten, gewoonlijker ongeveer 23 95% en kan bij voorkeur meer dan 99% zuiver zijn. Eiwit-zuiverheid of -homogeniteit kan worden aangegeven op een aantal manieren die in de techniek algemeen bekend zijn, zoals polyacrylamidegelelektroforese van een eiwitmonster, 5 gevolgd door het visualiseren van een enkelvoudige poly-peptideband bij het kleuren van de gel met een in de techniek algemeen bekende kleurstof. Voor bepaalde doeleinden kan een hoger oplossend vermogen worden verschaft met behulp van HPLC of andere manieren die in de techniek voor 10 zuivering algemeen bekend zijn.

De term "polypeptidefragment", zoals hierin gebruikt, verwijst naar een polypeptide dat een aminoterminale en/of carboxyterminale deletie heeft, maar waarbij de overblijvende ami no zuurs equent i e identiek is aan de corresponde-15 rende posities in de van nature vóórkomende sequentie. In sommige uitvoeringsvormen zijn fragmenten ten minste 5, 6, 8 of 10 aminozuren lang. In andere uitvoeringsvormen zijn de fragmenten ten minste 14, ten minste 20, ten minste 50 of ten minste 70, 80, 90, 100, 150 of 200 aminozuren lang.

De term "analogon" of "polypeptideanalogon", zoals hierin gebruikt, verwijst naar een polypeptide dat een segment omvat dat een aanzienlijk identiek-zijn heeft met een of andere referentieaminozuursequentie en in aanzienlijke mate dezelfde functie of activiteit heeft als de re-25 ferentieaminozuursequentie. Polypeptideanalogons omvatten kenmerkend een conservatieve aminozuursubstitutie (of insertie of deletie) met betrekking tot de referentiesequen-tie. Analogons kunnen ten minste 20 of 25 aminozuren lang zijn, of kunnen ten minste 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 of 30 200 aminozuren lang of langer zijn, en kunnen vaak zo lang als het polypeptide van volledige lengte zijn. Sommige uitvoeringsvormen van de uitvinding omvatten polypeptide-fragmenten of polypeptideanalogonantilichamen met 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 of 17 substi-35 tuties op basis van de kiemlijnaminozuursequentie. Fragmenten of analogons van antilichamen of immunoglobulinemo-leculen kunnen door de gemiddelde vakman gemakkelijk wor- 24 den bereid terwijl er wordt gehandeld naar de leren van deze beschrijving.

In bepaalde uitvoeringsvormen zijn aminozuursubstitu-ties ten opzichte van een P-cadherineantilichaam of anti-5 geenbindend gedeelte daarvan, die welke: (1) de gevoelig heid voor proteolyse verminderen, (2) de gevoeligheid voor oxidatie verminderen, (3) de bindingsaffiniteit voor het vormen van eiwitcomplexen wijzigen en (4) andere fysisch-chemische of functionele eigenschappen van dergelijke ana-10 logons verlenen of modificeren, maar nog altijd specifieke binding aan P-cadherine behouden. Analogons kunnen verschillende substituties ten opzichte van dé normaliter vóórkomende peptidesequentie omvatten. Er kunnen bijvoorbeeld enkelvoudige of veelvoudige aminozuursubstituties, 15 bij voorkeur conservatieve aminozuursubstituties worden voortgebracht in de normaliter vóórkomende sequentie, bijvoorbeeld in het gedeelte van het polypeptide buiten het/de domein(en) dat/die intermoleculaire contacten vormt/vormen. Aminozuursubstituties kunnen ook worden 20 voortgebracht in het/de domein(en) dat/die intermoleculaire contacten vormt/vormen die de activiteit van het polypeptide kunnen verbeteren. Een conservatieve aminozuursub-stitutie dient niet in aanzienlijke mate de structurele kenmerken van de moedersequentie te veranderen; een ver-25 vangingsaminozuur dient bv. niet de antiparallelle β-plaat te wijzigen die het immunoglobulinebindingsdomein vormt dat vóórkomt in de moedersequentie, of andere typen van secundaire structuur te ontwrichten die de moedersequentie kenmerkt. Gewoonlijk zouden glycine en proline niet moeten 30 worden gebruikt in een antiparallelle β-plaat. Voorbeelden van in de techniek erkende secundaire en tertiaire structuren van polypeptiden worden beschreven in Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to 35 Protein Structure (C. Branden en J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); en Thornton et al., Nature, 354:105 (1991), hier bij referentie opgenomen.

Zoals hierin gebruikt, is de term "antilichaam" synoniem met immunoglobuline, en deze dient te worden begrepen zoals gewoonlijk in de techniek bekend is. In het bijzonder wordt de term antilichaam niet be-5 perkt door welke specifieke werkwijze voor het produceren van het antilichaam ook. De term antilichaam omvat bijvoorbeeld, zonder beperking, recombinante antilichamen, monoklonale antilichamen en polyklonale antilichamen.

De term "antigeenbindend gedeelte” van een antili-10 chaam (of eenvoudig "antilichaamgedeelte") , zoals hierin gebruikt, verwijst naar één of meer fragmenten van een antilichaam die het vermogen behouden om specifiek te binden aan een antigeen (bv. P-cadherine) . Het is aangetoond dat de antigeenbindende functie van een antilichaam kan worden 15 uitgevoerd door fragmenten van een antilichaam van volledige lengte. Voorbeelden van bindingsfragmenten die worden bevat binnen de term "antigeenbindend gedeelte" van een antilichaam, omvatten (i) een Fab-fragment, een monovalent fragment dat bestaat uit de VL-, VH-, CL- en CH1 -domeinen; 20 (ii) een F (ab1) 2-fragment, een bivalent fragment dat twee Fab-fragmenten omvat die zijn verbonden door middel van een disulfidebrug bij het scharniergebied; (iii) een Fd-fragment dat bestaat uit de VH- en CH1-domeinen; (iv) een Fv-fragment dat bestaat uit de VL- en VH-domeinen van een 25 enkelvoudige arm van een antilichaam, (v) een dAb-fragment (Ward et al., Nature, (1989) 341:544-546), dat bestaat uit een VH-domein; en (vi) een geïsoleerd complementariteits-bepalend gebied (CDR). Verder kunnen, alhoewel voor de twee domeinen van het Fv-fragment, VL en VH, wordt geco-30 deerd door afzonderlijke genen, ze met gebruikmaking van recombinante werkwijzen worden verbonden door middel van een synthetisch koppelstuk dat ze in staat stelt om te worden gemaakt als een enkelvoudige eiwitketen waarin de VL- en VH-gebieden paren, waardoor monovalente moleculen 35 (bekend als Fv van enkelvoudige keten [single chain Fv] (scFv)) worden gevormd; zie bv. Bird et al., Science (1988) 242:423-426 en Huston et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 85:5879-5883 (1988)). Het wordt bedoeld dat dergelijke antilichamen van enkelvoudige keten ook worden bevat binnen de term "antigeenbindend gedeelte" van een antilichaam. Andere vormen van antilichamen van enkel-5 voudige keten, zoals dialichamen, worden ook bevat. Diali-chamen zijn bivalente, bispecifieke antilichamen waarbij VH- en VL-domeinen tot expressie worden gebracht in een enkelvoudige polypeptideketen, maar met gebruikmaking van een koppelstuk dat te kort is om ruimte te laten voor pa-10 ring tussen de twee domeinen in dezelfde keten, daarmee de domeinen dwingend om te paren met complementaire domeinen van een andere keten, en twee antigeenbindingsplaatsen creërend (zie bv. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993); Poljak et al., Structure, 15 2:1121-1123 (1994)).

Nog verder kan een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan een deel van grotere immunoadhesiemoleculen zijn, gevormd door covalente of niet-covalente associatie van het antilichaam of antilichaamgedeelte met één of meer 20 andere eiwitten of peptiden. Voorbeelden van dergelijke immunoadhesiemoleculen omvatten het gebruik van het strep-tavidinekerngebied om een tetrameer scFv-molecuul te maken (Kipriyanov et al., Human Antibodies and Hybridomas, 6:93-101 (1995)) en het gebruik van een cysteïneresidu, een 25 merkerpeptide en een C-terminaal polyhistidinelabel voor het maken van bivalente en gebiotinyleerde scFv-moleculen (Kipriyanov et al., Mol. Immunol., 31:1047-1058 (1994)).

Andere voorbeelden omvatten waar één of meer CDR's die afkomstig zijn van een antilichaam hetzij covalent, hetzij 30 niet-covalent worden geïncorporeerd in een molecuul, waardoor het tot een immunoadhesine wordt gemaakt dat specifiek bindt aan een antigeen van belang, zoals P-cadherine. In dergelijke uitvoeringsvormen kan/kunnen het/de CDR(s) worden geïncorporeerd als een deel van een grotere poly-35 peptideketen, kan/kunnen het/ze covalent worden verbonden met een andere polypeptideketen of kan/kunnen het/ze niet-covalent worden geïncorporeerd. Antilichaamgedeelten, zo 27 als Fab- en F(ab')2- fragmenten, kunnen worden bereid uit gehele antilichamen met gebruikmaking van conventionele technieken, zoals digestie van gehele antilichamen met respectievelijk papaïne of pepsine. Bovendien 5 kunnen antilichamen, antilichaamgedeelten en immunoadhe-siemoleculen worden verkregen met gebruikmaking van stan-daard-recombinant DNA-technieken, zoals hierin beschreven.

Daar waar er hierin met betrekking tot de onderhavige uitvinding wordt verwezen naar een "antilichaam", dient 10 het te worden begrepen dat een antigeenbindend gedeelte daarvan ook kan worden gebruikt. Een antigeenbindend gedeelte concurreert met het intacte antilichaam om specifieke binding. Zie in het algemeen Fundamental Immunology, Η. 7 (Paul, W. , ed., 2e ed., Raven Press, N.Y. (1989)) 15 (voor alle doeleinden in haar geheel bij referentie opgenomen) . Antigeenbindende gedeelten kunnen worden geproduceerd met behulp van recombinant DNA-technieken of door middel van enzymatische of chemische splitsing van intacte antilichamen. In sommige uitvoeringsvormen omvatten anti-20 geenbindende gedeelten Fab-, Fab'-, F(ab')2_» Fd-, Fv-, dAb- en complementariteitsbepalend gebied (CDR)-fragmenten, antilichamen van enkelvoudige keten (scFv), chimere antilichamen, dialichamen en polypeptiden die ten minste een gedeelte van een antilichaam bevatten dat toe-25 reikend is voor het verlenen van specifieke antigeenbin-ding aan het polypeptide. In uitvoeringsvormen met één of meer bindingsplaatsen kunnen de bindingsplaatsen identiek aan elkaar zijn of kunnen verschillend zijn.

Zoals hierin gebruikt, betekent de term "humaan anti-30 lichaam" ieder antilichaam waarin de sequenties van het variabele en constante domein humane sequenties zijn. De term omvat antilichamen met sequenties die zijn afgeleid van humane genen, maar die zijn veranderd, bv. waardoor mogelijke immunogeniteit wordt verlaagd, waardoor affini-35 text wordt verhoogd, waardoor cysteinen worden verwijderd die onwenselijk vouwen zouden kunnen veroorzaken, etc. De term omvat ook dergelijke antilichamen die op recombinante 28 wijze worden geproduceerd in niet-humane cellen, wat giy-cosylering zou kunnen verschaffen die niet kenmerkend is voor humane cellen. Deze antilichamen kunnen op een verscheidenheid aan manieren worden bereid, zoals beneden be-5 schreven.

De term "chimeer antilichaam", zoals hierin gebruikt, betekent een antilichaam dat gebieden omvat die afkomstig zijn van twee of meer verschillende antilichamen, waaronder antilichamen die afkomstig zijn van verschillende 10 soorten. Eén of meer van de CDR's van een chimeer antili-chaam kan/kunnen bijvoorbeeld zijn afgeleid van een humaan P-cadherineantilichaam. In één voorbeeld kunnen de CDR's die afkomstig zijn van een humaan antilichaam worden gecombineerd met CDR's die afkomstig zijn van een niet- 15 humaan antilichaam, zoals muis of rat. In een ander voorbeeld kunnen al de CDR's zijn afgeleid van humane P- cadherineantilichamen. In een ander voorbeeld kunnen de CDR's die afkomstig zijn van meer dan één humaan P- cadherineantilichaam worden gecombineerd in een chimeer 20 antilichaam. Een chimeer antilichaam kan bijvoorbeeld een CDR1 dat afkomstig is van de lichte keten van een eerste humaan P-cadherineantilichaam, een CDR2 dat afkomstig is van de lichte keten van een tweede humaan P-cadherineantilichaam en een CDR3 dat afkomstig is van de lichte ke-25 ten van een derde humaan P-cadherineantilichaam omvatten, en CDR's die afkomstig zijn van de zware keten kunnen zijn afgeleid van één of meer andere P-cadherineantilichamen. Verder kunnen de geraamtegebieden zijn afgeleid van één van de P-cadherineantilichamen waaruit één of meer van de 30 CDR's worden genomen, of van één of meer verschillende humane antilichamen. Verder wordt het bedoeld dat de term "chimeer antilichaam" welke van de boven vermelde combinaties ook omvat waar de combinaties humane en niet-humane antilichamen met zich meebrachten.

Zoals hierin gebruikt, verwijst de term "gehumani seerd antilichaam" naar antilichamen van niet-humane oorsprong, waarbij de aminozuurresiduen die kenmerkend zijn 29 voor antilichaamsequenties van de niet-humane soorten, worden vervangen door residuen die worden aangetroffen op de corresponderende posities van humane antilichamen. Het wordt gedacht dat dit "humanisatie"-proces de immunogeni-5 teit van het resulterende antilichaam bij mensen vermindert. Het zal worden erkend dat antilichamen van niet-humane oorsprong kunnen worden gehumaniseerd met gebruikmaking van in de techniek algemeen bekende technieken. Zie bv. Winter et al., Immunol. Today, 14:43-46 (1993) . Het 10 antilichaam van belang kan met behulp van recombinant DNA-technieken worden gemanipuleerd opdat de CH1-, CH2-, CH3-, scharnierdomeinen, en/of het geraamtedomein worden gesubstitueerd met de corresponderende humane sequentie. Zie bv. WO 92/02190 en Amerikaanse octrooien 5,530,101, 15 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350 en 5,777,085).

De term "gehumaniseerd antilichaam", zoals hierin gebruikt, omvat binnen zijn betekenis chimere humane antilichamen en CDR-geënte antilichamen. Chimere humane antilichamen van de uitvinding omvatten het VH en VL van een an-20 tilichaam van een niet-humane soort en de CH- en CL-domeinen van een humaan antilichaam. De CDR-overgeplante antilichamen van de uitvinding komen voort uit de vervanging van CDR' s van het VH en VL van een humaan antilichaam door die van respectievelijk het VH en VL van een antili-25 chaam van een dier anders dan een mens.

Zoals hierin gebruikt, verwijst de term "ELISA" [enzyme-linked immunosorbent assay] naar een bepaling met een met enzym verbonden immunoabsorberende stof. Deze bepaling is bij de gemiddelde vakman algemeen bekend. Voorbeelden 30 van deze bepaling kunnen worden gevonden in zowel Vaughan, T.J. et al., Nat. Biotech. , 14 :309-314 (1996), als in

Voorbeeld 7 van de onderhavige aanvrage.

De term "oppervlakteplasmonresonantie", zoals hierin gebruikt, verwijst naar een optisch fenomeen dat ruimte 35 laat voor de analyse van biologisch specifieke interacties in ware tijd door middel van de detectie van wijzigingen in eiwitconcentraties binnen in een biosensormatrix, bij- 30 voorbeeld met gebruikmaking van het BIACORE™-systeem (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Zweden en Piscataway, N.J.) . Voor verdere beschrijvingen, zie Jonsson et al., Ann. Biol. Clin., 51:19-26 (1993); Jonsson et al. ; Bio- 5 techniques, 11:620-627 (1991); Jonsson et al., J. Mol. Recognita 8:125-131 (1995) en Johnsson et al., Anal. Bio- chem., 198:268-277 (1991).

De term "KV verwijst naar de bindingsaffiniteits-evenwichtsconstante van een specifieke antilichaam-10 antigeeninteractie. Het wordt gezegd dat een antilichaam specifiek een antigeen bindt wanneer de K„ < 1 mM is, bij voorkeur < 100 nM en met de meeste voorkeur < 10 nM. Een KD-bindingsaffiniteitsconstante kan worden gemeten met behulp van oppervlakteplasmonresonantie, bijvoorbeeld met 15 gebruikmaking van het BIACORE™-systeem zoals besproken in Voorbeeld 6.

De term "Kaf" verwijst naar de dissociatiesnelheids-constante van een specifieke antilichaam-antigeen-interactie. Een Ka£-dissociatiesnelheidsconstante kan wor-20 den gemeten met behulp van oppervlakteplasmonresonantie, bijvoorbeeld met gebruikmaking van het BIACORE™-systeem zoals besproken in Voorbeeld 6.

Zoals hierin gebruikt, verwijst de term "P-cadherineafhankelijke celadhesie-bepaling" naar een bepa-2 5 ling die wordt gebruikt om het vermogen van een P-cadherineantilichaam te meten om de adhesie van cellen aan een receptor-P-cadherine te verhinderen dat is geïmmobiliseerd op een vaste drager. Dit type bepaling kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd door middel van het immobiliseren 30 van P-cadherine op een vaste drager, zoals plastic. Men laat cellen die P-cadherine tot overexpressie brengen vervolgens hechten aan de vaste drager via P-cadherine-P-cadherine-interacties. Het niveau van adhesie kan vervolgens worden gekwantificeerd met en zonder een P-35 cadherineantilichaam. Adhesie als een functie van antili-chaamconcentratie kan vervolgens worden gebruikt voor het bepalen van een IC50-waarde. Voorbeeld 3 verschaft verdere 31 details van een P- cadherineafhankelijke celadhesie-bepaling die werd gebruikt voor het meten van IC50-waarden voor P-cadherineantilichamen.

Zoals hierin gebruikt, verwijst de term "P-5 cadherineafhankelijke celaggregatie-bepaling" naar een bepaling voor het meten van het vermogen van een P~ cadherineantilichaam om de aggregatie van cellen te verhinderen die P-cadherine op hun oppervlakken tot expressie brengen. Dit type bepaling kan bijvoorbeeld een cellijn 10 gebruiken die P-cadherine tot overexpressie brengt, waarbij de cellen in suspensie worden geplaatst en men ze P-cadherineafhankelijke aggregaten laat vormen. De aggrega-tiebepaling wordt vervolgens gebruikt voor het kwantificeren van het vermogen van een P-cadherineantilichaam om de-15 ze aggregatie te voorkomen door middel van het meten van de grootte van cellulaire aggregaten die het gevolg zijn met en zonder het antilichaam. Celaggregaatgrootte als een functie van P-cadherineantilichaamconcentratie kan vervolgens worden gebruikt voor het bepalen van een IC50-waarde. 20 Voorbeeld 4 verschaft verdere details van een P-cadherineafhankelijke aggregatie-bepaling die werd gebruikt voor het meten van IC50-waarden voor verscheidene P-cadherineant ilichamen.

Zoals hierin gebruikt, verwijst de term "P-25 cadherineafhankelijke sferoxdeontwrichting-bepaling" naar een bepaling voor het meten van het vermogen van een P-cadherineantilichaam om vooraf gevormde P-cadherine-afhankelijke cellulaire aggregaties te ontwrichten. Door middel van het meten van de groottevermindering van aggre-30 gaten als een functie van antilichaamconcentratie kan een ICS0-waarde worden bepaald. Voorbeeld 5 verschaft verdere details van een P-cadherineafhankelijke sferoïdeontwrich-ting-bepaling die werd gebruikt voor het meten van leswaarden voor P-cadherineantilichamen.

Zoals hierin gebruikt, verwijst de term "moleculaire selectiviteit" naar de bindingsaffiniteit van een antilichaam voor een specifiek antigeen die groter is dan voor 32 een gerelateerd antigeen. De antilichamen van de onderhavige uitvinding kunnen bijvoorbeeld selectief zijn voor P-cadherine boven E-cadherine, wat betekent dat de bindings -affiniteit van het antilichaam voor P-cadherine ten minste 5 2 keer groter is, bijvoorbeeld 4 keer, of 10 keer, of 50 keer, of 100 keer of meer, dan voor E-cadherine. Dergelijke bindingsaffiniteiten kunnen worden gemeten met gebruikmaking van standaardtechnieken die bij de gemiddelde vakman bekend zijn.

De term "epitoop" omvat iedere eiwitdeterminant die in staat is tot specifieke binding aan een immunoglobuline of T-celreceptor of om op een andere manier een interactie aan te gaan met een molecuul. Epitoopdeterminanten bestaan gewoonlijk uit chemisch actieve oppervlaktegroeperingen 15 van moleculen zoals aminozuren of koolhydraat- of suiker-zijketens, en hebben gewoonlijk zowel specifieke driedimensionale structurele kenmerken als specifieke ladings-kenmerken. Een epitoop kan "lineair" of "conformationeel" zijn. Bij een lineair epitoop komen al de punten van in-20 teractie tussen het eiwit en het molecuul dat een interactie aangaat (zoals een antilichaam) lineair langs de primaire aminozuursequentie van het eiwit voor. Bij een conformationeel epitoop komen de punten van interactie voor over aminozuurresiduen in het eiwit die van elkaar ge-25 scheiden zijn. Zodra een gewenst epitoop in een antigeen is bepaald, is het mogelijk om antilichamen tegen dat epitoop te genereren, bv. met gebruikmaking van de technieken die worden beschreven in de onderhavige uitvinding. Alternatief kunnen tijdens het ontdekkingsproces de generatie 30 en de karakterisering van antilichamen licht werpen op informatie over wenselijke epitopen. Op basis van deze informatie is het vervolgens mogelijk om competitief antilichamen te screenen op binding aan hetzelfde epitoop. Een benadering om dit tot stand te brengen, is het uitvoeren 35 van kruiscompetitiestudies om antilichamen te vinden die competitief met elkaar binden, i.e. de antilichamen concurreren om binding aan het antigeen. Een werkwijze met 33 hoge doorvoércapaciteit voor "het vergaren" van antilicha-men, gebaseerd op hun kruiscompetitie, wordt beschreven in internationale octrooipublicatie WO 03/48731.

De term "concurreren", zoals hierin gebruikt met be-5 trekking tot een antilichaam, betekent dat een eerste an-tilichaam, of een antigeenbindend gedeelte daarvan, met een tweede antilichaam, of een antigeenbindend gedeelte daarvan, concurreert om binding, waarbij de binding van het eerste antilichaam met zijn cognate epitoop detecteer-10 baar wordt verlaagd in de aanwezigheid van het tweede antilichaam, vergeleken met de binding van het eerste antilichaam in de afwezigheid van het tweede antilichaam. Het alternatief, waar de binding van het tweede antilichaam aan zijn epitoop ook detecteerbaar wordt verlaagd in de 15 aanwezigheid van het eerste antilichaam, kan het geval zijn, maar dit hoeft niet. Dat wil zeggen, een eerste antilichaam kan de binding van een tweede antilichaam aan zijn epitoop remmen, zonder dat dat tweede antilichaam de binding van het eerste antilichaam aan zijn respectieve 20 epitoop remt. Daar waar echter ieder antilichaam detecteerbaar de binding van het andere antilichaam met zijn cognate epitoop of ligand remt, of het nu in dezelfde, hogere of mindere mate is, wordt het gezegd dat de antili-chamen met elkaar "kruisconcurreren" om binding van hun 25 respectieve epito(o)p(en). Zowel concurrerende als kruis-concurrerende antilichamen worden door de onderhavige uitvinding bevat. Ongeacht het mechanisme door middel waarvan dergelijke competitie of kruiscompetitie plaatsvindt (bv. sterische verhindering, conformationele verandering of 30 binding aan een gemeenschappelijk epitoop, of gedeelte daarvan, en dergelijke) , zou de gemiddelde vakman, gebaseerd op de hierin verschafte leren, moeten erkennen dat dergelijke concurrerende en/of kruisconcurrerende antilichamen worden bevat en bruikbaar kunnen zijn voor de hier-35 in beschreven werkwijzen.

Zoals hierin gebruikt, betekent de term "maakt gebruik van", met betrekking tot een specifiek gen, dat de 34 arr.inozuurseguentie van sen specifiek gebied in een antilichaam uiteindelijk was afgeleid van dat gen gedurende B-celrijping. De frase "een aminozuursequentie van een variabel gebied van een zware keten die gebruik maakt van 5 een humane V„-3-familie-gen" verwijst bijvoorbeeld naar de situatie waar het VH-gebied van het antilichaam werd afgeleid van de VH-3-familie van gensegmenten gedurende de B-celrijping. In humane B-cellen zijn er meer dan 30 onderscheiden, functionele variabele zware keten-genen waarmee 10 er antilichamen worden gegenereerd. Het gebruik van een specifiek variabele zware keten-gen is daarom kenmerkend voor een voorkeursbindingsmotief van de antilichaam-antigeeninteractie met betrekking tot de gecombineerde eigenschappen van binding aan het antigeen en functionele 15 activiteit. Zoals zal worden erkend, verschaft gengebruik-analyse slechts een beperkt overzicht van antilichaam-structuur. Aangezien humane B-cellen stochastisch V-D-J-zware of V-J-kappa-lichte keten-transcripten genereren, is er een aantal secundaire processen dat plaatsvindt, waar-20 onder, zonder beperking, somatische hypermutatie, n-toevoegingen en CDR3-uitbreidingen. Zie bijvoorbeeld Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997).

Zoals hierin gebruikt, volgen de twintig conventionele aminozuren en hun afkortingen conventioneel gebruik. 25 Zie Immunology - A Synthesis (2e editie, E.S. Golub en D.R. Gren, eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), hier bij referentie opgenomen.

De term "polynucleotide", zoals waarnaar hierin wordt verwezen, betekent een polymere vorm van nucleotiden van 30 ten minste 10 basen wat betreft lengte, hetzij ribonucleo-tiden of desoxynucleotiden, hetzij een gemodificeerde vorm van één van beide typen nucleotide. De term omvat enkelen dubbelstrengsvormen.

De term "geïsoleerd polynucleotide", zoals hierin ge-35 bruikt, betekent een polynucleotide van genomische, cDNA-of synthetische oorsprong, of een of andere combinatie daarvan, welk, op grond van zijn oorsprong, het "geïso- 35 leerde polynucleotide" (1) niet is geassocieerd met alles of een gedeelte van polynucleotiden waarmee het "geïsoleerde polynucleotide" wordt aangetroffen in de natuur, (2) operationeel is verbonden met een polynucleotide waar-5 mee het niet is verbonden in de natuur, of (3) niet in de natuur vóórkomt als een deel van een grotere sequentie.

De term "van nature vóórkomende nucleotiden", zoals hierin gebruikt, omvat desoxyribonucleotiden en ribonucle-otiden. De term "gemodificeerde nucleotiden", zoals hierin 10 gebruikt, omvat nucleotiden met gemodificeerde of gesubstitueerde suikergroepen en dergelijke. De term "oligonu-cleotidekoppelingen" waarnaar hierin wordt verwezen, omvat oligonucleotidekoppelingen zoals een fosforthioaat, fos-fordithioaat, fosforselenoaat, fosfordiselenoaat, fosfora-15 nilothioaat, fosforaniladaat, fosforamidaat en dergelijke. Zie bv. LaPlanche et al., Nucl. Acids Res., 14:9081 (1986); Stee et al., J. Am. Chein. Soc. , 106:6077 (1984);

Stein et al., Nucl. Acids Res., 16:3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design, 6:539 (1991); Zon et al., 20 Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pag. 87-108 (F. Eckstein, ed., Oxford University Press, Oxford,

Engeland (1991)); Amerikaans octrooi 5,151,510; Uhlmann en Peyman, Chemical Reviews, 90:543 (1990), waarvan de be schrijvingen hier bij referentie worden opgenomen. Een 25 oligonucleotide kan een merkstof voor detectie omvatten, indien gewenst.

"Operationeel verbonden" sequenties omvatten zowel expressieregulatiesequenties die grenzen aan het gen van belang, als expressieregulatiesequenties die in trans of 3 0 op een afstand werken, waardoor het gen van belang wordt gereguleerd.

De term "expressieregulatiesequentie", zoals hierin gebruikt, betekent polynucleotidesequenties die noodzakelijk zijn voor het bewerkstelligen van de expressie en be-35 werking van coderende sequenties waarmee ze zijn geli-geerd. Expressieregulatiesequenties omvatten gepaste transcriptie-initiatie-, -terminatie-, promotor- en ver- 36 sterkersequenties; efficiënte RNA- bewerkingssignalen zoals splicing- en polyadenyleringssig-nalen; sequenties die cytoplasmatisch mRNA stabiliseren; sequenties die de translatie-efficiëntie versterken (i.e.

Kozak-consensussequentie) ; sequenties die de eiwitstabili-teit versterken; en, wanneer gewenst, sequenties die ei-witafscheiding versterken. De aard van dergelijke regula-tiesequenties verschilt afhankelijk van het gastheerorga-nisme; bij prokaryoten omvatten dergelijke regulatiese-10 quenties gewoonlijk promotor, ribosomale bindingsplaats en transcriptieterminatiesequentie; bij eukaryoten omvatten dergelijke regulatiesequenties gewoonlijk promotoren en transcriptieterminatiesequentie. Het wordt bedoeld dat de term "regulatiesequenties" minimaal alle componenten omvat 15 waarvan de aanwezigheid essentieel is voor expressie en bewerking, en deze term kan ook bijkomende componenten omvatten waarvan de aanwezigheid gunstig is, bijvoorbeeld leidersequenties en fusiepartnersequenties.

De term "vector", zoals hierin gebruikt, betekent een 20 nucleinezuurmolecuul dat in staat is tot het transporteren van een ander nucleïnezuur waarmee hij is verbonden. In sommige uitvoeringsvormen is de vector een plasmide, i.e. een cirkelvormig dubbelstrengsstuk DNA waarin bijkomende DNA-segmenten kunnen zijn geligeerd. In sommige uitvoe-25 ringsvormen is de vector een virale vector, waarbij bijkomende DNA-segmenten in het virale genoom kunnen zijn geligeerd. In sommige uitvoeringsvormen zijn de vectoren in staat tot autonome replicatie in een gastheercel waarin ze zijn ingebracht (bv. bacteriële vectoren met een bacterië-30 le oorsprong van replicatie en episomale zoogdiervecto-ren) . In andere uitvoeringsvormen kunnen de vectoren (bv. niet-episomale zoogdiervectoren) in het genoom van een gastheercel worden geïntegreerd bij het inbrengen in de gastheercel, en worden daardoor samen met het gastheerge-35 noom gerepliceerd. Bovendien zijn bepaalde vectoren in staat om de expressie van genen te leiden waarmee ze functioneel zijn verbonden. Dergelijke vectoren worden hierin 37 "recombinante expressievectoren" (of eenvoudig "expressievectoren") genoemd.

De term "recombinante gastheercel" (of eenvoudig "gastheercel"), zoals hierin gebruikt, betekent een cel 5 waarin een recombinante expressievector is ingebracht. Het dient te worden begrepen dat "recombinante gastheercel" en "gastheercel" niet alleen de specifieke onderhavige cel betekenen, maar ook het nageslacht van zo'n cel. Omdat bepaalde modificaties kunnen plaatsvinden in volgende gene-10 raties als gevolg van hetzij mutatie, hetzij omgevingsinvloeden, is dergelijk nageslacht in feite wellicht niet identiek aan de moedercel, maar dit nageslacht wordt toch binnen de omvang van de term "gastheercel" bevat, zoals hierin gebruikt.

Zoals hierin gebruikt, verwijst de term "kiemlijn" naar de nucleotidesequenties van de antilichaamgenen en -gensegmenten zoals ze worden doorgegeven van ouders naar nakomelingen via de kiemcellen. Deze kiemlijnsequentie is onderscheiden van de nucleotidesequenties die coderen voor 20 antilichamen in rijpe B-cellen die zijn gewijzigd door re-combinatie- en hypermutatiegebeurtenissen tijdens de loop van de B-celrijping.

De term "percentage sequentie-identiek-zijn" in de context van nucleïnezuursequenties, betekent de residuen 25 in twee sequenties die hetzelfde zijn wanneer op één lijn gebracht voor maximale correspondentie. De lengte van de sequentie-identiek-zijn-vergelijking kan over een stuk van ten minste ongeveer negen nucleotiden zijn, gewoonlijk ten minste ongeveer 18 nucleotiden, gewoonlijker ten minste 30 ongeveer 24 nucleotiden, kenmerkend ten minste ongeveer 28 nucleotiden, kenmerkender ten minste ongeveer 32 nucleotiden, en bij voorkeur ten minste ongeveer 36, 48 of meer nucleotiden. Er is in de techniek een aantal verschillende algoritmen bekend die kunnen worden gebruikt voor het me-35 ten van nucleotidesequentie-identiek-zijn. Polynucleotide-sequenties kunnen bijvoorbeeld worden vergeleken met gebruikmaking van FASTA, Gap of Bestfit, die programma's 38 zijn in het Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, dat bv. de programma's FASTA2 en FASTA3 omvat, verschaft op één lijn brengingen en percentage sequentie-identiek-5 zijn van de gebieden van de beste overlapping tussen de vraag- en zoeksequenties (Pearson, Methods Enzymol., 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol., 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol., 266:227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998); hier bij referentie 10 opgenomen). Tenzij anders gespecificeerd, worden voor een specifiek programma of algoritme defaultparameters gebruikt. Het percentage sequentie-identiek-zijn tussen nu-cleinezuursequenties kan bijvoorbeeld worden bepaald met gebruikmaking van FASTA met zijn defaultparameters (een 15 woordgrootte van 6 en de NOPAM-factor voor de scoringsma-trix) , of met gebruikmaking van Gap met zijn def aultparameters zoals verschaft in GCG Version 6.1, hier bij referentie opgenomen.

Een verwijzing naar een nucleotidesequentie omvat 20 haar complement, tenzij anders gespecificeerd. Aldus dient het te worden begrepen dat een verwijzing naar een nuclei-nezuur met een specifieke sequentie zijn complementaire streng omvat, met zijn complementaire sequentie.

De term "aanzienlijke overeenkomst" of "aanzienlijke 25 sequentieovereenkomst", wanneer er wordt verwezen naar een nucleïnezuur of fragment daarvan, betekent dat, wanneer optimaal op één lijn gebracht met gepaste nucleotide-inserties of -deleties met een ander nucleïnezuur (of zijn complementaire streng), er nucleotidesequentie-identiek-30 zijn is wat betreft ten minste ongeveer 85%, bij voorkeur ten minste ongeveer 90% en met meer voorkeur ten minste ongeveer 95%, 96%, 97%, 98% of 99% van de nucleotidebasen, zoals gemeten met behulp van welk algemeen bekend algoritme van sequentie-identiek-zijn ook, zoals FASTA, BLAST of 35 Gap, zoals boven besproken.

De term "percentage sequentie-identiek-zijn" in de context van aminozuursequenties, betekent de residuen in 39 twee sequenties die hetzelfde zijn wanneer op één lijn gebracht voor maximale correspondentie. De lengte van de sequentie-identiek-zijn-vergelijking kan over een stuk van ten minste ongeveer vijf aminozuren zijn, gewoon-5 lijk ten minste ongeveer 20 aminozuren, gewoonlijker ten minste ongeveer 30 aminozuren, kenmerkend ten minste ongeveer 50 aminozuren, kenmerkender ten minste ongeveer 100 aminozuren en zelfs kenmerkender ongeveer 150, 200 of meer aminozuren. Er is in de techniek een aantal verschillende 10 algoritmen bekend die kunnen worden gebruikt voor het meten van aminozuursequentie-identiek-zijn. Aminozuursequen-ties kunnen bijvoorbeeld worden vergeleken met gebruikmaking van FASTA, Gap of Best fit, die programma's zijn in het Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer 15 Group (GCG), Madison, Wisconsin.

Zoals toegepast op polypeptiden, betekent de term "aanzienlijk identiek-zijn" of "aanzienlijke overeenkomst" dat twee aminozuursequenties, wanneer optimaal op één lijn gebracht, zoals met behulp van de programma's GAP of BEST-20 FIT met gebruikmaking van defaulttussenruimtegewichten, zoals geleverd met de programma's, ten minste 70%, 7 5% of 80% sequentie-identiek-zijn, bij voorkeur ten minste 90% of 95% sequentie-identiek-zijn en met meer voorkeur ten minste 97%, 98% of 99% sequentie-identiek-zijn delen. In 25 bepaalde uitvoeringsvormen verschillen residuposities die niet identiek zijn, aan de hand van conservatieve amino-zuursubstituties.

Zoals de term hierin wordt gebruikt, is een "conservatieve aminozuursubstitutie" er één waarbij een amino-30 zuurresidu wordt gesubstitueerd met een ander aminozuurre-sidu dat een zijkéten-R-groep heeft met vergelijkbare chemische eigenschappen (bv. lading of hydrofobiciteit). Gewoonlijk zal een conservatieve aminozuursubstitutie niet in aanzienlijke mate de functionele eigenschappen van een 35 eiwit veranderen. In gevallen waar twee of meer aminozuursequenties van elkaar verschillen aan de hand van conservatieve substituties, kan het percentage sequentie- 40 identiek-zijn naar omhoog worden bijgesteld om te corrigeren voor de conservatieve aard van de substitutie. Manieren voor het maken van deze bijstelling zijn bij de gemiddelde vakman algemeen bekend. Zie bv. Pearson, Me-5 thods Mol. Biol., 243:307-31 (1994). Voorbeelden van groepen van aminozuren die zij ketens hebben met vergelijkbare chemische eigenschappen omvatten 1) alifatische zijketens: glycine, alanine, valine, leucine en isoleucine; 2) alifa-tische-hydroxylzijketens : serine en threonine; 3) amidebe-10 vattende zijketens: asparagine en glutamine; 4) aromatische zijketens: fenylalanine, tyrosine en tryptofaan,- 5) basische zijketens: lysine, arginine en histidine; 6) zure zijketens: asparaginezuur en glutaminezuur; en 7) zwavel-bevattende zijketens: cysteine en methionine. Groepen van 15 conservatieve aminozuursubstitutie kunnen bijvoorbeeld: valine-leucine-isoleucine, fenylalanine-tyrosine, lysine-arginine, alanine-valine, glutamaat-aspartaat en asparagine-glutamine zijn.

Alternatief is een conservatieve vervanging iedere 20 verandering met een positieve waarde in de PAM250-log-waarschijnlijkheidsmatrix die wordt beschreven in Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992), hier bij referentie opgenomen. Een "matig conservatieve" vevanging is iedere verandering met een niet-negatieve waarde in de PAM250-25 log-waarschijnlijkheidsmatrix.

Sequentie-identiek-zijn voor polypeptiden wordt kenmerkend gemeten met gebruikmaking van sequentieanaly-sesoftware. Eiwitanalysesoftware brengt sequenties met elkaar in overeenstemming met gebruikmaking van maateenheden 30 van overeenkomst die zijn toegekend aan verschillende substituties, deleties en andere modificaties, waaronder conservatieve aminozuursubstituties. GCG bevat bijvoorbeeld programma's zoals "Gap" en "Bestfit" die kunnen worden gebruikt met defaultparameters, zoals gespecificeerd door de 35 programma's, voor het bepalen van sequentiehomologie of sequentie-identiek-zijn tussen nauw gerelateerde polypeptiden, zoals homologe polypeptiden die afkomstig zijn van 41 verschillende soorten van organismen, of tussen een wildtype-eiwit en een analogon daarvan. Zie bv. GCG Version 6.1 (University of Wisconsin, WI) . Polypeptidesequen-ties kunnen ook worden vergeleken met gebruikmaking van 5 FASTA met gebruikmaking van default- of aanbevolen parameters, zie GCG Version 6.1. FASTA (bv. FASTA2 en FASTA3) verschaft op één lijn brengingen en percentage sequentie-identiek-zijn van de gebieden van de beste overlapping tussen de vraag- en zoeksequenties (Pearson, Methods Enzy-10 mol., 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol., 132:185-219 (2000)). Een ander voorkeursalgoritme, wanneer een sequentie van de uitvinding wordt vergeleken met een database die een groot aantal sequenties bevat die afkomstig zijn van verschillende organismen, is het computer-15 programma BLAST, in het bijzonder blastp of tblastn, met gebruikmaking van defaultparameters zoals geleverd met de programma's. Zie bv. Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-402 (1997).

De lengte van polypeptidesequenties die worden verge leken voor homologie, zal gewoonlijk ten minste ongeveer 16 aminozuurresiduen, gewoonlijk ten minste ongeveer 20 residuen, gewoonlijker ten minste ongeveer 24 residuen, kenmerkend ten minste ongeveer 28 residuen en bij voorkeur 25 meer dan ongeveer 35 residuen zijn. Wanneer een database wordt doorzocht die sequenties bevat die afkomstig zijn van een groot aantal verschillende organismen, heeft het de voorkeur om aminozuursequenties te vergelijken.

Zoals hierin gebruikt, verwijzen de termen "merkstof" 3 0 of "gemerkt" naar de incorporatie van een ander molecuul in het antilichaam. In één uitvoeringsvorm is de merkstof een detecteerbare merker, bv. de incorporatie van een radioactief gemerkt aminozuur of de aanhechting aan een polypeptide van biotinylresten die kunnen worden gedetec-35 teerd door middel van gemerkt avidine (bv. streptavidine dat een fluorescerende merker of enzymatische activiteit bevat die kunnen worden gedetecteerd met behulp van opti- 42 «r-he of r.nlnTimetrische werkwijzen) . In een andere uitvoeringsvorm kan de merkstof of merker therapeutisch zijn, bv. een geneesmiddelconjugaat of toxine. Verschillende werkwijzen voor het merken van polypeptiden en gly-5 coproteïnen zijn in de techniek bekend en kunnen worden gebruikt. Voorbeelden van merkstoffen voor polypeptiden omvatten, maar zijn niet beperkt tot, de volgende: radio-isotopen of radionucliden (bv. 3H, 14C, 1SN, 35S, 90Y, 99Tc, 113In, 125I, 131I) , fluorescerende merkstoffen (bv. FITC, rho-10 damine, lanthanidefosfors), enzymatische merkstoffen (bv. mierikswortelperoxidase, β-galactosidase, luciferase, alkalische fosfatase), chemiluminescente merkers, biotinyl-groepen, vooraf bepaalde polypeptide-epitopen die worden herkend door een secundaire reporter (bv. leucineritspaar-15 sequenties, bindingsplaatsen voor secundaire antilichamen, metaalbindende domeinen, epitooplabels), magnetische agentia, zoals gadoliniumchelaten, toxinen zoals kinkhoest-toxine, taxol, cytochalasine B, gramicidine D, ethidium-bromide, emetine, mitomycine, etoposide, tenoposide, vin-20 cristine, vinblastine, colchicine, doxorubicine, daunoru-bicine, dihydroxyanthracinedion, mitoxantron, mithramyci-ne, actinomycine D, 1-dehydrotestosteron, glucocorticoï-den, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, en puromycine en analogons of homologous daarvan. In sommige 25 uitvoeringsvormen worden merkstoffen vastgehecht door middel van uitelkaarplaatserarmen van verschillende lengten, waardoor mogelijke sterische verhindering wordt verminderd .

"Therapeutisch effectieve hoeveelheid" verwijst naar 3 0 die hoeveelheid van het therapeutische agens dat wordt toegediend, die enigszins één of meer van de symptomen van de stoornis die wordt behandeld, zal verlichten. Met betrekking tot de behandeling van kanker verwijst een therapeutisch effectieve hoeveelheid naar die hoeveelheid die 35 ten minste één van de volgende effecten heeft: het verminderen van de grootte van de tumor; het remmen (dat wil zeggen, het enigszins vertragen, bij voorkeur stopzetten) 43 van tumormetastase; het enigszins remmen (dat wil zeggen, het enigszins vertragen, bij voorkeur stopzetten) van tumorgroei, en het enigszins verlichten (of bij voorkeur verdrijven) van één of meer symptomen die zijn geas-5 socieerd met de kanker.

"Behandelen", "het behandelen" en "behandeling" verwijzen naar een werkwijze voor het verlichten of tenietdoen van een biologische stoornis en/of haar begeleidende symptomen. Met betrekking tot kanker betekenen deze termen 10 eenvoudig dat de levensverwachting van een individu dat is getroffen door een kanker, zal worden verhoogd, of dat één of meer van de symptomen van de ziekte zullen worden verminderd.

"Het in contact brengen" verwijst naar het op zo'n 15 manier samenbrengen van een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan van de onderhavige uitvinding en een doelwit-P-cadherine, of epitoop daarvan, dat het. antilichaam de biologische activiteit van het P-cadherine kan beïnvloeden. Dergelijk "in contact brengen" kan "in vitro" 20 worden bewerkstelligd, i.e. in een reageerbuis, een petrischaal of iets dergelijks. In een reageerbuis kan het in contact brengen alleen een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan en P-cadherine of epitoop daarvan met zich meebrengen, of het kan gehele cellen met zich 25 meebrengen. Cellen kunnen ook worden gehandhaafd of gekweekt in celkweekschalen en in contact worden gebracht met antilichamen of antigeenbindende gedeelten daarvan in die omgeving. In deze context kan het vermogen van een specifiek antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan 30 om een aan P-cadherine gerelateerde stoornis te beïnvloeden, i.e. de IC50 van het antilichaam, worden bepaald alvorens het gebruik van het antilichaam in vivo met complexere levende organismen wordt geprobeerd. Voor cellen buiten het organisme bestaan er veelvoudige werkwijzen, en deze 35 zijn bij de gemiddelde vakman algemeen bekend, voor het in contact brengen van P-cadherine met de antilichamen of an-tigeenbindende gedeelten daarvan.

"Abnormale celgroei", zoals hierin gebruikt, verwijst, tenzij anders aangegeven, naar celgroei die onafhankelijk van normale regulerende mechanismen geschiedt (bv. verlies van contactinhibitie), waaronder de abnormale 5 groei van normale cellen en de groei van abnormale cellen. Dit omvat, maar is niet beperkt tot, de abnormale groei van: tumorcellen (tumoren) die zich snel vermenigvuldigen door middel van het tot expressie brengen van een gemuteerd tyrosinekinase of de overexpressie van een receptor-10 tyrosinekinase; goedaardige en kwaadaardige cellen van andere proliferatieve ziekten waarbij afwijkende tyrosineki-naseactivering plaatsvindt; welke tumoren ook die zich snel vermenigvuldigen door middel van receptortyrosineki-nases; welke tumoren ook die zich snel vermenigvuldigen 15 door middel van afwijkende serine/threoninekinase-activering; goedaardige en kwaadaardige cellen van andere proliferatieve ziekten waarbij afwijkende seri- ne/threoninekinaseactivering plaatsvindt; tumoren, zowel goedaardige als kwaadaardige, die een geactiveerd Ras-20 oncogen tot expressie brengen; tumorcellen, zowel goedaardige als kwaadaardige, waarbij het Ras-eiwit is geactiveerd tengevolge van oncogene mutatie in een ander gen; goedaardige en kwaadaardige cellen van andere proliferatieve ziekten waarbij afwijkende Ras-activering plaats-25 vindt. Voorbeelden van dergelijke goedaardige proliferatieve ziekten zijn psoriasis, goedaardige prostaathyper-trofie, humaan papillomavirus (HPV) en restinosis. "Abnormale celgroei" verwijst ook naar, en omvat, de abnormale groei van cellen, zowel goedaardige als kwaadaardige, die 30 voortkomt uit de activiteit van het enzym farnesyleiwit-transferase.

De termen "abnormale celgroei" en "hyperproliteratieve stoornis" worden in deze aanvrage verwisselbaar gebruikt .

"In vitro" verwijst naar procedures die worden uitge voerd in een kunstmatige omgeving, zoals bv., zonder beperking, in een reageerbuis of kweekmedium.

"In vivo" verwijst naar procedures die worden uitgevoerd binnen in een levend organisme, zoals, zonder beperking, een muis, rat of konijn.

Korte beschrijving van de tekeningen 5 Figuur 1 vertoont de aminozuur- en nucleïnezuurse- quenties van SEQ ID NO's: 1-347.

Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding Humane P-cadherineantilichamen

Deze uitvinding heeft betrekking op geïsoleerde huma-10 ne antilichamen, of antigeenbindende gedeelten daarvan, die binden aan humaan P-cadherine. Bij voorkeur zijn de humane antilichamen recombinante humane P-cadherine-antilichamen die een grotere affiniteit voor P-cadherine dan voor E-cadherine hebben. Verschillende aspecten van de 15 uitvinding hebben betrekking op zowel dergelijke antilichamen en antigeenbindende gedeelten, en farmaceutische preparaten daarvan, als op nucleïnezuren, recombinante ex-pressievectoren en gastheercellen voor het maken van dergelijke antilichamen en antigeenbindende gedeelten. Werk-20 wijzen voor het gebruiken van de antilichamen en antigeenbindende gedeelten van de onderhavige uitvinding voor het detecteren van humaan P-cadherine of voor het remmen van humaan P-cadherine-activiteit, hetzij in vitro, hetzij in vivo, worden ook door de uitvinding bevat.

25 De P-cadherineaminozuur- en -nucleotidesequenties die afkomstig zijn van verscheidene soorten, waaronder de mens, zijn bekend (zie bv. inschrijvingsnr. NM_001793.3). Humaan P-cadherine, of antigene gedeelten daarvan, kan/kunnen worden bereid volgens werkwijzen die bij de ge-30 middelde vakman algemeen bekend zijn, of kan/kunnen worden gekocht bij commerciële verkopers (bv. R&D Systems 861-PC-100) .

In bepaalde uitvoeringsvormen zijn antilichamen van de onderhavige uitvinding IgG's, aangeduid als: 194-e06; 35 194-a02; 194-b09; 195-ell; 194-g09; 196-h02; 194-eOl; 196- dlO; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194- b0 9; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-

AC

e06; 129-lc4 en g-129-lc4. Zoals in Voorbeeld 1 in meer detail besproken, werd screening met hoge doorvoercapaci-teit van een scFv-faagdisplaybibliotheek gebruikt voor het identificeren van het 129-lc4-scFv, dat vervolgens werd 5 omgezet tot een IgG. 129-lc4 vertegenwoordigt het leidraad [lead]-antilichaam dat werd geïdentificeerd gedurende de eerste faagdisplayscreening, en is het moederantilichaam van een afkomst vanwaaruit verscheidene andere antilicha-men van de onderhavige uitvinding werden afgeleid. Ver-10 scheidene van dergelijke afgeleide antilichamen worden aangeduid als 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-ell; 194-g09; 196-h02; 194-eOl; 196-dlO; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198- a09 en 200-h06, en vertegenwoordigen geoptimaliseerde antilichamen binnen de 129-lc4-moederafkomst. Het g-129-lc4-15 antilichaam is de kiemli jnversie van het 129-lc4-moederantilichaam, waarbij bepaalde aminozuren in de ge-raamtegebieden van de VH- en VL-domeinen werden gemuteerd, waardoor ze pasten bij die in de kiemlijngeraamtegebieden. Welke van de boven vermelde antilichamen ook, kan ook wor-20 den gekiemlijnd zodat de geraamtegebiedsequenties identiek zijn aan de kiemlijngeraamtesequenties zoals bij g-129-lc4. In één uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding zijn de antilichamen g-194-b09, g-194-g09, g-196-g03, g- 196-h02, g-194-e01, g-195-ell, g-200-h06 en g-194-e06 bij-25 voorbeeld de gekiemlijnde versies van respectievelijk 194-b09, 194-g09, 196-g03, 196-h02, 194-eOl, 195-ell, 200-h06 en 194-e06. De specifieke aminozuren die werden gemuteerd om te komen tot de gekiemlijnde versies, zijn voor de gemiddelde vakman duidelijk aan de hand van het vergelijken 30 van de sequenties van een gekiemlijnd vs. een niet-gekiemlijnd antilichaam. Zoals beneden besproken, worden specifieke aminozuursequenties van de antilichamen van de onderhavige uitvinding beschreven in Tabellen 1-3 en Figuur 1.

35 Antilichamen van de onderhavige uitvinding werden ge genereerd met een sterke voorkeur voor het gebruik van de VH3-genfamilie van variabele gebieden van de zware keten.

47

In het bijzonder het 129- lc4-moederantilichaam dat is afgeleid van het variabele VH3-23-gensegment. In humane B-cellen zijn er meer dan 30 onderscheiden, functionele, variabele zware keten-genen waarmee er antilichamen worden 5 gegenereerd. Voorkeur is daarom kenmerkend voor een voor-keursbindingsmotief van de antilichaam-antigeeninteractie met betrekking tot de gecombineerde eigenschappen van binding aan het antigeen en functionele activiteit.

Zoals zal worden erkend, verschaft gengebruikanalyse 10 slechts een beperkt overzicht van antilichaamstructuur. Aangezien humane B-cellen stochastisch V-D-J-zware of V-J-kappa-lichte keten-transcripten genereren, is er een aantal secundaire processen dat plaatsvindt, waaronder, zonder beperking, somatische hypermutatie, n-toevoegingen en 15 CDR3-uitbreidingen. Zie bijvoorbeeld Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997) en Amerikaanse gepubliceerde octrooiaanvrage 2003-0070185, ingediend op 19 februari 2002. Dienovereenkomstig werden, om verder antilichaamstructuur van de onderhavige uitvinding te onderzoeken, 20 voorspelde aminozuursequenties van de antilichamen gegenereerd op basis van de cDNA1 s die waren verkregen op basis van de klonen. Bovendien werden N-terminale aminozuursequent ies verkregen door middel van eiwitsequencing. Figuur 1 verschaft nucleotide- en aminozuursequenties van de va-25 riabele gebieden van de zware en lichte keten van verscheidene van de antilichamen van de onderhavige uitvinding.

Ieder van de boven vermelde specifieke antilichamen kan worden beschreven aan de hand van zijn variabel do-30 mein-sequenties van de zware [heavy] (VH) en lichte (VL) ketens, zoals aangegeven in Tabellen 1 en 2. De specifieke sequenties waarnaar wordt verwezen aan de hand van deze SEQ ID NO1s, worden vertoond in Figuur 1. Zoals aangegeven in Tabellen 1 en 2 worden de corresponderende VH- en VL-35 aminozuur- en -DNA-sequent ies van de antilichamen die boven zijn vermeld, beschreven door SEQ ID NO1s: 1-23, 68-90 en 320-343.

48

Tabel 1 _Humane P-cadherineantilichamen_

Anti- Seguentie-ldentificator (SEQ ID NO:) lichaam VB Vh

Aminozuur DNA__Aminozuur__DNA

194 -e06__1__68__14__81 194- a02__2__69__14__81 194 -b09__2__69__15__82 195- ell__3__70__16__83 194-g09__4__71__17__84 196 -h02__4__71__23__90 194- eOl__5__72__18__85 196- dlO__6__73__23__90 196-g03__7__74__23__90 196-e06__8__75__23__90 195- a09__9__76__23__90 198-a09__10__77__19__86 200-h06__11__78__20__87 129-1C4__12__79__21 88 5 Tabel 2 _Gekiemlijnde humane P-cadherineantilichamen_

Anti- Sequentie-identificator (SEQ ID NO:) lichaam V„ __

Aminozuur DNA Aminozuur__DNA

g-194 -b09 320__332__326__338 g-194 -g09 321__333__327__339 g-196 -g03 322__334__328__340 g-196 -h02 323__335__329__341 g-194 -eQl 324__336__330__342 g-194 -e06 325__337__321__343 g-129-lc4__13__80__22__89 49

Bijkomende antilichamen en antigeenbindende gedeelten van de onderhavige uitvinding kunnen ook worden beschreven als omvattende de verschillende CDR- en FR-sequenties die de variabele gebieden van de zware en lich-5 te keten van de antilichamen vormen die zijn aangegeven in Tabellen 1 en 2. Dienovereenkomstig worden SEQ ID NO's die corresponderen met verschillende CDR- en FR-sequenties van antilichamen van de onderhavige uitvinding aangegeven in Tabel 3. Verder werden ook talrijke willekeurig gemaakte 10 mutaties in de CDR3-gebieden van de zware en lichte keten van het moederantilichaam 129-lc4 ten uitvoer gebracht, wat verbeterde P-cadherineaffiniteit opbracht die varieerde van een 10- tot een 417-voudige verbetering, zoals gemeten met behulp van een epitoopcompetitiebepaling (zie 15 Voorbeeld 8) . De SEQ ID NO's van deze gemuteerde VH- en VL-CDR3-sequenties (SEQ ID NO's: 91-256, en 257-319) worden ook inbegrepen in Tabel 3 beneden.

20 Tabel 3 _SEQ ID NO's:__Beschrijving_ _24__VH-CDR1_ _25__VH - CDR2_ _26-37, 91-256__VH-CDR3_ _38__V^-CDRl_ _39__VL - CDR2_ _40-47, 257-319__VL-CDR3_ _48__Vh-FR1_ _49__VH - FR2_ _ 50-55__VH-FR3_ _56, 57__VH-FR4_ _58, 59__VL-FR1_ _ 60-62__VL-FR2_ __63-66__VL-FR3_ ___67_|__VL - FR4_ 50

Wsrkwij zen_\rnnr_het produceren van antilichamen

Faagdisplaybibliotheken

De antilichamen of antigeenbindende gedeelten van de onderhavige uitvinding kunnen worden bereid volgens ver-5 scheidene werkwijzen die in de techniek bekend zijn. Faagdi splaytechnieken kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt voor het verschaffen van bibliotheken die een repertoire van antilichamen bevatten met variërende affiniteiten voor P-cadherine. Deze bibliotheken kunnen vervolgens worden ge-10 screend voor het identificeren en isoleren van antilichamen met de gewenste affiniteit voor P-cadherine.

Recombinante humane P-cadherineantilichamen van de onderhavige uitvinding kunnen bijvoorbeeld worden geïsoleerd door middel van het screenen van een recombinante 15 combinatorische antilichaambibliotheek. Bij voorkeur is de bibliotheek een scFv-faagdisplaybibliotheek, gegenereerd met gebruikmaking van humane VL- en VH-cDNA's die zijn bereid op basis van mRNA dat is geïsoleerd uit humane B-cellen. Werkwijzen voor het bereiden en screenen van der-20 gelijke bibliotheken zijn in de techniek bekend. Kits voor het genereren van faagdisplaybibliotheken zijn commercieel verkrijgbaar (bv. het Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catalogusnr. 27-9400-01; en de SurfZAP™-faagdisplaykit van Stratagene, catalogusnr. 240612). Er 25 zijn ook andere werkwijzen en reagentia die kunnen worden gebruikt bij het genereren en screenen van antilichaamdis-playbibliotheken (zie bv. Amerikaans octrooi 5,223,409; PCT-publicaties WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047 en WO 92/09690; Fuchs 30 et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay et al.,

Hum. Antibod. Hybridomas, 3:81-85 (1992); Huse et al.,

Science, 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J. , 12:725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992); 35 Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Gram et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3576-3580 (1992); Garrad et al., Bio/Technology, 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom et 53.

al., Nuc. Acid Res., 19:4133-4137 (1991); Barbas et al., Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 88:7978-7982 (1991); en Griffiths et al., EMBO J., 13:3245-3260 (1994), die al le hier bij referentie worden opgenomen).

5 Een andere werkwijze voor het bereiden van een bibli otheek van antilichamen voor gebruik bij faagdisplaytech-nieken, omvat de stappen van het immuniseren van een niet-humaan dier dat loei voor humaan immunoglobuline omvat, met P-cadherine of een antigeen gedeelte daarvan, waardoor 10 een immuunrespons wordt gecreëerd, het extraheren van an-tilichaamproducerende cellen uit het geïmmuniseerde dier; het uit de geëxtraheerde cellen isoleren van RNA dat codeert voor zware en lichte ketens van antilichamen van de uitvinding, het omgekeerd transcriberen van het RNA, waar-15 door cDNA wordt geproduceerd, het amplificeren van het cDNA met gebruikmaking van primers, en het zodanig inzetten van het cDNA in een faagdisplayvector dat antilichamen tot expressie worden gebracht in de faag. Voor de productie van dergelijke repertoires is het niet noodzakelijk om 20 de B-cellen uit het geïmmuniseerde dier onsterfelijk te maken. Integendeel kunnen de primaire B-cellen direct worden gebruikt als een bron van DNA. Het mengsel van cDNA's dat is verkregen op basis van de B-cellen, bv. afgeleid van milten, wordt gebruikt voor het bereiden van een ex-25 pressiebibliotheek, bijvoorbeeld een faagdisplaybiblio-theek die wordt getransfecteerd naar E. coli. Uiteindelijk worden klonen uit de bibliotheek geïdentificeerd die bin-dingsaffiniteiten van een gewenste omvang voor het antigeen produceren, en het DNA dat codeert voor het product 30 dat verantwoordelijk is voor dergelijke binding, wordt gewonnen en gemanipuleerd voor standaardrecombinantexpressie. Paagdisplaybibliotheken kunnen ook worden geconstrueerd met gebruikmaking van eerder gemanipuleerde nucleoti-desequenties en op een vergelijkbare manier worden ge-35 screend. Gewoonlijk worden de cDNA's die coderen voor zware en lichte ketens onafhankelijk geleverd of verbonden waardoor Pv-analogons worden gevormd voor productie in de 52 faagbibliotheek. De faagbibliotheek wordt vervolgens gescreend op de antilichamen met de hoogste affiniteiten voor P-cadherine, en het genetische materiaal wordt uit de gepaste kloon gewonnen. Verdere ronden van 5 screening kunnen de affiniteit van het geïsoleerde oorspronkelijke antilichaam verhogen.

In één uitvoeringsvorm wordt, om humane P-cadherine-antilichamen met de gewenste kenmerken te isoleren en produceren, een humaan P-cadherineantilichaam, zoals hierin 10 beschreven, eerst gebruikt om humane zware en lichte ke-ten-sequenties te selecteren met vergelijkbare bindingsac-tiviteit jegens P-cadherine, met gebruikmaking van de epi-toopinprentingswerkwijzen die worden beschreven in PCT-publicatie WO 93/06213, hier bij referentie opgenomen. De 15 antilichaambibliotheken die worden gebruikt bij deze werkwijze, zijn bij voorkeur scFv-bibliotheken die zijn bereid en gescreend zoals beschreven in PCT-publicatie WO 92/01047, McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990); en Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993), alle hier 20 bij referentie opgenomen. De scFv-antilichaambibliotheken kunnen worden gescreend met gebruikmaking van humaan P-cadherine als het antigeen. De faagbibliotheek wordt gescreend op de antilichamen met de hoogste affiniteiten voor P-cadherine, en het genetische materiaal wordt uit de 25 gepaste kloon gewonnen. Verdere ronden van screening kunnen de affiniteit van het geïsoleerde oorspronkelijke antilichaam verhogen.

Zodra de eerste humane VL- en VH-domeinen zijn geselecteerd, kunnen vervolgens experimenten van "mengen en 30 met elkaar in overeenstemming brengen" worden uitgevoerd, waarbij verschillende paren van de aanvankelijk geselecteerde Vh- en VH-segmenten worden gescreend op P-cadherinebinding om voorkeurs-VL/VH-paarcombinaties te selecteren. Deze experimenten van mengen en met elkaar in 35 overeenstemming brengen kunnen ook worden uitgevoerd nadat de VH- en VL-segmenten willekeurig zijn gemuteerd voor geoptimaliseerde binding, zoals beneden beschreven. Verder 53 kunnen, om de kwaliteit van het antilichaam verder te verbeteren, de VL- en VH-segmenten van het/de voorkeurs-VL/VH-pa(a)r(en) willekeurig worden gemuteerd, bij voorkeur binnen in het CDR3-gebied van VH en/of VL, in een proces 5 dat analoog is met het in vivo somatische mutatie-proces dat verantwoordelijk is voor affiniteitsrijping van anti-lichamen tijdens een natuurlijke immuunrespons. Deze in vitro affiniteitsrijping kan bijvoorbeeld worden bewerkstelligd door middel van het amplificeren van VH- en VL-10 domeinen met gebruikmaking van PCR-primers die complementair zijn met respectievelijk het VH-CDR3 of VL-CDR3, aan welke primers zodanig op bepaalde posities "een kleine hoeveelheid is toegevoegd" van een willekeurig mengsel van de vier nucleotidebasen, dat de resulterende PCR-producten 15 coderen voor VH- en VL-segmenten waarin willekeurige mutaties zijn ingebracht in de VH- en/of VL-CDR3-gebieden. Deze willekeurig gemuteerde VH- en VL-segmenten kunnen opnieuw worden gescreend op binding aan P-cadherine, en sequenties die een hoge affiniteit en een lage af-snelheid voor P-20 cadherine vertonen, kunnen worden geselecteerd. Zoals eerder besproken, worden verscheidene VH- en VL-CDR3-sequenties van de onderhavige uitvinding die willekeurig werden gemuteerd en verbeterde affiniteit vertoonden, aangegeven door SEQ ID NO's: 91-256 en 257-319.

25 Na screening en isolatie van een P-cadherine- antilichaam van de uitvinding op basis van een recombinant immunoglobuline-displaybibliotheek, kunnen nucleinezuren die coderen voor het geselecteerde antilichaam worden gewonnen uit de displayverpakking (bv. uit het faaggenoom) 30 en worden gesubkloneerd in andere expressievectoren met behulp van standaard-recombinant DNA-technieken. Indien gewenst, kan het nucleïnezuur verder worden gemanipuleerd voor het creëren van andere antilichaamvormen van de uitvinding, zoals beneden beschreven. Om een recombinant hu-35 maan antilichaam tot expressie te brengen dat is geïsoleerd door middel van screening van een combinatorische bibliotheek, wordt het DNA dat codeert voor het antili- 54 chaam in een recombinante expressievector gekloneerd en ingebracht in een gastheercel, zoals beneden beschreven .

Irmunisatie 5 In een andere uitvoeringsvorm kunnen humane P- cadherineantilichamen worden geproduceerd door middel van het immuniseren van een niet-humaan, transgeen dier dat binnen in zijn genoom iets, of alles van de loei voor de zware keten en lichte keten van humaan immunoglobuline om-10 vat, met een P-cadherineantigeen. Het niet-humane dier kan bijvoorbeeld een XEN0M0USE™-dier zijn. (Abgenix, Ine., Fremont, CA).

XENOMOUSE™-muizen zijn gemanipuleerde muizenstammen die grote fragmenten van de loei voor de zware keten en 15 lichte keten van humaan immunoglobuline omvatten en die deficiënt zijn wat betreft muizenantilichaamproductie. Zie bv. Green et al., Nature Genetica, 7:13-21 (1994) en Amerikaanse octrooien 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598, 6,130,364, 20 6,162,963 en 6,150,584. Zie ook WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560 en WO 00/037504.

De in deze documenten beschreven werkwijzen kunnen 25 worden gemodificeerd zoals beschreven in Amerikaans octrooi 5,994,619, dat hier bij referentie wordt opgenomen. Amerikaans octrooi 5,994,619 beschrijft werkwijzen voor het produceren van nieuwe gekweekte binnenste celmassa [cultured inner cell mass] (CICM) -cellen en -cellijnen, 30 afgeleid van varkens en koeien, en transgene CICM-cellen waarin heteroloog DNA is ingezet. Transgene CICM-cellen kunnen worden gebruikt voor het produceren van gekloneerde transgene embryo's, foetussen en nakomelingen. Het '619-octrooi beschrijft ook werkwijzen voor het produceren van 3 5 transgene dieren die in staat zijn om het heterologe DNA naar hun nageslacht over te brengen. Voorbeelden van niet-humane dieren die kunnen worden gebruikt met deze werkwij- 55 zen, omvatten ratten, schapen, varkens, geiten, rundvee, kip en paarden.

XENOMOUSErM-muizen produceren een adultachtig humaan repertoire van volledig humane antilichamen en genereren 5 antigeenspecifieke humane antilichamen. In sommige uitvoeringsvormen bevatten de XENOMOUSE™-muizen ongeveer 80% van het humaan antilichaam-V-gen-repertoire door middel van de inbrenging van fragmenten van megabasegrootte en met kiem-lijnconfiguratie van de loei voor de humane zware keten en 10 loei voor de kappa-lichte keten in het kunstmatige gist-chromosoom [yeast artificial chromosome] (YAC). In andere uitvoeringsvormen bevatten XENOMOUSETM-muizen verder ongeveer alles van de locus voor de humane lambda-lichte keten. Zie Mendez et al., Nature Genetics, 15:146-156 15 (1997), Green en Jakobovits, J. Exp. Med., 188:483-495 (1998) en WO 98/24893, waarvan de beschrijvingen hier bij referentie worden opgenomen.

In sommige uitvoeringsvormen zijn de niet-humane dieren die humane immunoglobulinegenen omvatten, dieren die 20 een "minilocus" voor een humaan immunoglobuline hebben. Bij de minilocusbenadering wordt een exogene Ig-locus nagebootst door middel van de insluiting van individuele genen die afkomstig zijn van de Ig-locus. Aldus worden één of meer VH-genen, één of meer DH-genen, één of meer JH-25 genen, een mu-constant domein, en een tweede constant domein (bij voorkeur een gamma-constant domein) tot een construct gevormd voor insertie in een dier. Deze benadering wordt beschreven in Amerikaanse octrooien 5,545,807, 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 30 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,591,669, 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215 en 5,643,763, hier bij referentie op genomen .

Niet-humane dieren, zoals boven beschreven, kunnen vervolgens worden geïmmuniseerd met een P-cadherine-35 antigeen, zoals beneden beschreven, onder omstandigheden die antilichaamproductie mogelijk maken. Antilichaamprodu-cerende cellen worden uit de dieren geïsoleerd, en nuclei- 56 nezuren die coderen voor de zware en lichte ketens van het P-cadherineantilichaam van belang worden geïsoleerd uit de geïsoleerde antilichaamproducerende cellen of uit een onsterfelijk gemaakte cellijn die is geproduceerd uit 5 dergelijke cellen. Deze nucleïnezuren worden vervolgens gemanipuleerd met gebruikmaking van technieken die bij de gemiddelde vakman bekend zijn en zoals beneden verder beschreven, waardoor de hoeveelheid niet-humane sequentie wordt verminderd, i.e. waardoor het antilichaam wordt ge-10 humaniseerd waardoor de immuunrespons bij mensen wordt verminderd.

In sommige uitvoeringsvormen kan het P-cadherine-antigeen geïsoleerd en/of gezuiverd P-cadherine zijn. In sommige uitvoeringsvormen is het P-cadherineantigeen hu-15 maan P-cadherine. In andere uitvoeringsvormen kan het P-cadherineantigeen een cel zijn die P-cadherine tot expressie brengt of tot overexpressie brengt. In andere uitvoeringsvormen is het P-cadherineantigeen een recombinant eiwit dat tot expressie wordt gebracht op basis van gist, 20 insectencellen, bacteriën zoals E. coli, of andere hulpbronnen door middel van recombinante technologie. De immu-nisatie van dieren kan geschieden met behulp van een willekeurige werkwijze die in de techniek bekend is. Zie bv. Harlow en Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: 25 Cold Spring Harbor Press (1990). Werkwijzen voor het immuniseren van niet-humane dieren zoals muizen, ratten, schapen, geiten, varkens, rundvee en paarden, zijn in de techniek algemeen bekend. Zie bv. Harlow en Lane, supra, en Amerikaans octrooi 5,994,619. Het P-cadherineantigeen kan 30 bijvoorbeeld worden toegediend met een adjuvant, waardoor de immuunrespons wordt gestimuleerd. Kenschetsende adju-vanten omvatten compleet of incompleet Freund's adjuvant, RIBI (muramyldipeptiden) of ISCOM (immunostimulerende complexen) . Dergelijke adjuvanten kunnen het polypeptide be-35 schermen tegen snelle dispersie door middel van het se-kwestreren van dit in een lokale afzetting, of ze kunnen stoffen bevatten die de gastheer stimuleren om factoren af 57 te scheiden die chemotactisch zijn voor macrofagen en andere componenten van het immuunsysteem. Bij voorkeur zal, indien een polypeptide wordt toegediend, het immunisatieschema twee of meer toedieningen van het 5 polypeptide met zich meebrengen, uitgespreid over enkele weken.

Na bijvoorbeeld immunisatie van een transgeen dier zoals boven beschreven met P-cadherine, kunnen primaire cellen (bv. miltcellen of B-cellen van perifeer bloed) 10 worden geïsoleerd uit het geïmmuniseerde transgene dier, en individuele cellen die antilichamen produceren die specifiek zijn voor het gewenste antigeen, kunnen worden geïdentificeerd. Gepolyadenyleerd mRNA uit iedere individuele cel wordt vervolgens geïsoleerd, en omgekeerde transcrip-15 tie-polymerasekettingreactie (RT-PCR) wordt uitgevoerd met gebruikmaking van sense-primers die versmelten met sequenties voor het variabele gebied (bv. gedegenereerde primers die het grootste gedeelte, of alles van de FRl-gebieden van de genen voor het variabele gebied van de humane zware 20 en lichte keten herkennen en antisense-primers die versmelten met sequenties voor het constante of verbindende gebied). cDNA's van de variabele domeinen van de zware en lichte keten worden vervolgens gekloneerd en tot expressie gebracht in een willekeurige geschikte gastheercel, bv. 25 een myeloomcel, als chimere antilichamen met respectieve constante gebieden van het immunoglobuline, zoals het constante domein van de zware keten en k- of λ-constante domeinen. Zie Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7843-48, (1996), hier bij referentie opgenomen. P- 30 cadherineantilichamen kunnen vervolgens worden geïdentificeerd en geïsoleerd zoals hierin beschreven.

Recombinante werkwijzen voor het produceren van antilichamen

Een antilichaam, of antilichaamgedeelte, van de uit-35 vinding kan worden bereid met behulp van recombinante expressie van genen voor de lichte en zware keten van een immunoglobuline in een gastheercel. Om een antilichaam op 58 recombinante wijze tot expressie te brengen, wordt een gastheercel bijvoorbeeld zodanig getransfecteerd met één of meer recombinante expressievectoren die DNA-fragmenten dragen die coderen voor de lichte en zware ke-5 tens van het immunoglobuline van het antilichaam, dat de lichte en zware ketens tot expressie worden gebracht in de gastheercel en bij voorkeur worden afgescheiden naar het medium waarin de gastheercellen worden gekweekt, uit welk medium de antilichamen kunnen worden gewonnen. Standaard-10 recombinant DNA-methodologieën worden gebruikt voor het verkrijgen van genen voor de zware en lichte keten van het antilichaam, voor het incorporeren van deze genen in re-combinante expressievectoren en voor het inbrengen van de vectoren in gastheercellen, zoals die welke worden be-15 schreven in Sambrook, Fritsch en Maniatis (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold

Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. et al. (eds.),

Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) en in Amerikaans octrooi 4,816,397, 20 waarvan de beschrijvingen hier bij referentie worden opgenomen .

Mutaties en modificaties

Om de P-cadherineantilichamen van de onderhavige uitvinding tot expressie te brengen, kunnen DNA-fragmenten 25 die coderen voor VH- en VL-gebieden eerst worden verkregen met gebruikmaking van een van de boven beschreven werkwijzen. Verschillende mutaties, deleties en/of toevoegingen kunnen ook worden ingebracht in de DNA-sequenties met gebruikmaking van standaardwerkwijzen die bij de gemiddelde 30 vakman bekend zijn. Mutagenese kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd met gebruikmaking van standaardwerkwijzen, zoals PCR-gemedieerde mutagenese, waarbij de gemuteerde nu-cleotiden zodanig worden geïncorporeerd in de PCR-primers dat het PCR-product de gewenste mutaties bevat, of plaats-35 gerichte mutagenese. Eén type substitutie dat bijvoorbeeld kan worden voortgebracht, is het veranderen van één of meer cysteïnen in het antilichaam, dat/die chemisch reac- 59 tief kan/kunnen zijn, in een ander residu, zoals, zonder beperking, alanine of serine. Er kan bijvoorbeeld een substitutie van een niet-canonisch cysteïne zijn. De substitutie kan worden voortgebracht in een CDR- of geraamtege-5 bied van een variabel domein of in het constante domein van een antilichaam. In sommige uitvoeringsvormen is het cysteine canonisch.

De antilichamen kunnen ook worden gemuteerd in de variabele domeinen van de zware en/of lichte ketens, bv. 10 voor het wijzigen van een bindingseigenschap van het antilichaam. Er kan bijvoorbeeld een mutatie worden voortgebracht in één of meer van de CDR-gebieden voor het verhogen of verlagen van de Kj, van het antilichaam voor P-cadherine, voor het verhogen of verlagen van Ka£ of voor 15 het wijzigen van de bindingsspecificiteit van het antilichaam. Technieken in de plaatsgerichte mutagenese zijn in de techniek algemeen bekend. Zie bv. Sambrook et al. en Ausubel et al., supra, die hier bij referentie wordt opgenomen. Er werden bijvoorbeeld, zoals in meer detail in 20 Voorbeeld 8 besproken, talrijke alternatieve VH- en VL-CDR3-sequenties van de 129-lc4-moeder gemaakt volgens de boven besproken procedures, en ze worden in Figuur 1 aangegeven als SEQ ID NO's: 91 tot 256 (VH-CDR3-varianten) en SEQ ID NO's: 257 tot 319 (VL-CDR3-varianten).

2 5 Een mutatie kan ook worden voortgebracht in een ge- raamtegebied of constant domein, voor het verhogen van de halfwaardetijd van een P-cadherineantilichaam. Zie bv. PCT-publicatie WO 00/09560, hier bij referentie opgenomen. Een mutatie in een geraamtegebied of constant domein kan 3 0 ook worden voortgebracht voor het wijzigen van de immu- nogeniteit van het antilichaam, voor het verschaffen van een plaats voor covalente of niet-covalente binding aan een ander molecuul, of voor het wijzigen van dergelijke eigenschappen als complementfixatie, FcR-binding en anti-35 lichaamafhankelijke, celgemedieerde cytotoxiciteit [antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity] (ADCC). Volgens de uitvinding kan een enkelvoudig antilichaam mutaties 60 hebben in één of meer van de CDR's of geraamtegebieden van het variabele domein of in het constante domein.

In een proces dat bekend is als "het kiemlijnen", kunnen bepaalde aminozuren in de VH- en VL-sequenties worden 5 gemuteerd zodat ze passen bij die welke van nature worden aangetroffen in kiemlijn-VH- en -VL-sequenties. In het bijzonder kunnen de aminozuursequenties van de geraamtegebieden in de VH- en VL-sequenties worden gemuteerd zodat ze passen bij de kiemlijnsequenties, waardoor het risico op 10 immunogeniteit wordt verminderd wanneer het antilichaam wordt toegediend. Kiemlijn-DNA-sequenties voor humane VH-en VL-genen zijn in de techniek bekend (zie bv. de humanè kiemlijn-sequentie-database "Vbase"; zie ook Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Inte-15 rest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH-publicatie 91-3242; Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798 en Cox et al., Ëur. J. Immunol. 24:827-836 (1994); waarvan de inhoud van ieder hier expliciet bij referentie wordt opgenomen).

20 Een ander type aminozuursubstitutie dat kan worden voortgebracht, is het verwijderen van mogelijke proteoly-tische plaatsen in het antilichaam. Dergelijke plaatsen kunnen vóórkomen in een CDR of geraamtegebied van een variabel domein of in het constante domein van een antili-25 chaam. Substitutie van cysteineresiduen en verwijdering van proteolytische plaatsen kan het risico op heterogeniteit in het antilichaamproduct verlagen en aldus zijn homogeniteit verhogen. Een ander type aminozuursubstitutie is het verwijderen van asparagine-glycineparen, die moge-30 lijke deamidatieplaatsen vormen, door middel van het wijzigen van één van de, of beide residuen. In een ander voorbeeld kan het C-terminale lysine van de zware keten van een P-cadherineantilichaam van de uitvinding worden gesplitst. In verschillende uitvoeringsvormen van de uit-35 vinding kunnen de zware en lichte ketens van de P-cadherineantilichamen eventueel een N-terminale signaalse- 61 quentie omvatten, zoals die welke worden aangegeven door SEQ ID NO'S: 346 en 347.

Zodra DNA-fragmenten die coderen voor de VH- en VL-segmenten van de onderhavige uitvinding zijn verkregen, 5 kunnen deze DNA-fragmenten verder worden gemanipuleerd met behulp van standaard-recombinant DNA-technieken, bijvoorbeeld voor het omzetten van de genen voor het variabele gebied tot genen voor de antilichaamketen van volledige lengte, tot Fab-fragmentgenen of tot een scFv-gen. Bij de-10 ze manipulaties wordt een voor VL of VH coderend DNA-fragment functioneel verbonden met een ander DNA-fragment dat codeert voor een ander eiwit, zoals een constant gebied van een antilichaam of een flexibel koppelstuk. Het wordt bedoeld dat de term "functioneel verbonden", zoals 15 gebruikt in deze context, betekent dat de twee DNA-fragment en zodanig zijn verbonden, dat de aminozuursequen-ties die worden gecodeerd door de twee DNA-fragmenten, in-fase blijven.

Het geïsoleerde DNA dat codeert voor het VH-gebied, 2 0 kan worden omgezet tot een gen voor de zware keten van volledige lengte door middel van het functioneel verbinden van het voor VH coderende DNA met een ander DNA-molecuul dat codeert voor constante gebieden van de zware keten (CHI, CH2 en CH3) . De sequenties van genen voor het con-2 5 stante gebied van de humane zware keten zijn in de techniek bekend (zie bv. Rabat, E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH-publicatie 91-3242), en DNA-fragmenten die deze gebieden omvatten, kun-30 nen worden verkregen met behulp van standaard-PCR-amplificatie. Het constante gebied van de zware keten kan een constant gebied van IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM of IgD zijn, maar is met de meeste voorkeur een constant gebied van IgGl of IgG2. De sequentie voor het con-35 stante gebied van IgGl kan een van de verschillende alle-len of allotypen zijn waarvan bekend is dat ze vóórkomen onder verschillende individuen, zoals Gm(l), Gm(2), Gm(3) 62 en Gm(17). Deze allotypen vertegenwoordigen van nature vóórkomende aminozuursubstituties in de constante gebieden van IgGl. Het constante gebied van de zware keten van IgGl kan bijvoorbeeld SEQ ID NO: 344 zijn. Voor een gen voor de 5 zware keten van een Fab-fragment kan het voor V„ coderende DNA functioneel zijn verbonden met een ander DNA-molecuul dat alleen codeert voor het CHl-constante gebied van de zware keten. Het constante gebied van de zware keten CH1 kan zijn afgeleid van een van de genen voor de zware ke-10 ten.

Het geïsoleerde DNA dat codeert voor het VL-gebied, kan worden omgezet tot een gen voor de lichte keten van volledige lengte (evenals een gen voor de lichte keten van Fab) door middel van het functioneel verbinden van het 15 voor VL coderende DNA met een ander DNA-molecuul dat co deert voor het constante gebied van de lichte keten, CL. De sequenties van genen voor het constante gebied van de humane lichte keten zijn in de techniek bekend (zie bv. Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immu-20 nological Interest, Fifth Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH-publicatie 91-3242), en DNA-fragmenten die deze gebieden omvatten, kunnen worden verkregen met behulp van standaard-PCR-amplificatie. Het constante gebied van de lichte keten kan een kappa- of lamb-25 da-constant gebied zijn. Het kappa-constante gebied kan een van de verschillende allelen zijn waarvan bekend is dat ze vóórkomen onder verschillende individuen, zoals

Inv(l), Inv(2) en Inv(3). Het lambda-constante gebied kan zijn afgeleid van een van de drie lambda-genen. Het con-30 stante gebied van de lichte keten van IgGl kan bijvoorbeeld SEQ ID NO: 347 zijn.

Om een scFv-gen te creëren, worden de voor VH en VL coderende DNA-fragmenten zodanig functioneel verbonden met een ander fragment dat codeert voor een flexibel koppel-35 stuk, bv. dat codeert voor de aminozuur sequent ie (Gly4-Ser) 3, dat de VH- en Vb-sequenties tot expressie kunnen worden gebracht als een eiwit van aansluitende enkelvoudi- 63 ge keten, met de VL- en VH- gebieden verbonden door middel van het flexibele koppelstuk (zie bv. Bird et al., Science 242:423-426 (1988) ; Huston et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); McCafferty et al., Na- 5 ture, 348:552-554 (1990)). Het antilichaam van enkelvoudi ge keten kan monovalent, indien alleen een enkelvoudig VH en VL worden gebruikt, bivalent, indien twee VH en VL worden gebruikt, of polyvalent zijn, indien meer dan twee VH en VL worden gebruikt. Er kunnen bispecifieke of polyva-10 lente antilichamen worden gegenereerd die specifiek binden aan P-cadherine en aan een ander molecuul.

In een andere uitvoeringsvorm kan een fusieantilichaam of immunoadhesine worden gemaakt dat alles of een gedeelte van een P-cadherineantilichaam van de uitvinding omvat, 15 verbonden met een ander polypeptide. In een andere uitvoeringsvorm worden alleen de variabele domeinen van het P-cadherineantilichaam met het polypeptide verbonden. In een andere uitvoeringsvorm wordt het VH-domein van een P-cadherineantilichaam verbonden met een eerste polypeptide, 20 terwijl het VL-domein van een P-cadherineantilichaam wordt verbonden met een tweede polypeptide dat zich op een zodanige manier associeert met het eerste polypeptide dat de VH- en VL-domeinen een interactie kunnen aangaan met elkaar, waardoor een antigeenbindingsplaats wordt gevormd. 25 In een andere voorkeursuitvoeringsvorm wordt het VH-domein zodanig door middel van een koppelstuk gescheiden van het VL-domein dat de VH- en VL-domeinen een interactie kunnen aangaan met elkaar. Het VH-koppelstuk-VL-antilichaam wordt vervolgens verbonden met het polypeptide van belang. Bo-30 vendien kunnen fusieantilichamen worden gecreëerd waarbij twee (of meer) antilichamen van enkelvoudige keten met elkaar worden verbonden. Dit is bruikbaar indien men een divalent of polyvalent antilichaam in een enkelvoudige poly-peptideketen wil creëren, of indien men een bispecifiek 35 antilichaam wil creëren.

In andere uitvoeringsvormen kunnen andere gemodificeerde antilichamen worden bereid met gebruikmaking van 64 voor P-cadherineantilichaam coderende nucleinezuurmolecu-len. "Kappa-lichamen" ["Kappa bodies"] (111 et al., Protein Eng. 10: 949-57 (1997)), "Minilichamen" ["Minibodies"] (Martin et al., EMBO J. , 13: 5303-9 (1994)), "Dialichamen" 5 ["Diabodies"] (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 90: 6444-6448 (1993)) of "Janusinen" ["Janusins"] (Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) en Trau- necker et al., Int. J. Cancer, (Suppl.) 7:51-52 (1992)) kunnen bijvoorbeeld worden bereid met gebruikmaking van 10 standaardtechnieken van de moleculaire biologie terwijl er wordt gehandeld naar de leren van de beschrijving.

Bispecifieke antilichamen of antigeenbindende fragmenten kunnen worden geproduceerd met behulp van een verscheidenheid aan werkwijzen, waaronder fusie van hybrido-15 men of het verbinden van Fab'-fragmenten. Zie bv. Songsi-vilai & Lachmann, Clin. Exp. Iimunol. , 79:315-321 (1990),

Kostelny et al., J. Iimunol., 148:1547-1553 (1992). Boven dien kunnen bispecifieke antilichamen worden gevormd als "dialichamen" of "Janusinen". In sommige uitvoeringsvormen 20 bindt het bispecifieke antilichaam aan twee verschillende epitopen van P-cadherine. In sommige uitvoeringsvormen worden de boven beschreven gemodificeerde antilichamen bereid met gebruikmaking van één of meer van de variabele domeinen of CDR-gebieden die afkomstig zijn van een humaan 25 P-cadherineantilichaam dat hierin wordt verschaft.

Vectoren en gastheercellen

Om de antilichamen en antigeenbindende gedeelten van de uitvinding tot expressie te brengen, worden DNA's die coderen voor gedeeltelijke lichte en zware ketens of lich-30 te en zware ketens van volledige lengte, verkregen zoals boven beschreven, zodanig ingezet in expressievectoren dat de genen functioneel worden verbonden met transcriptionele en translationele regulatiesequenties. In deze context wordt het bedoeld dat de term "functioneel verbonden" be-35 tekent dat een antilichaamgen zodanig wordt geligeerd in een vector, dat transcriptionele en translationele regulatiesequenties binnen in de vector hun bedoelde functie 65 vervullen van het reguleren van de transcriptie en translatie van het antilichaamgen. De expressievector en ex-pressieregulatiesequenties worden gekozen opdat ze compatibel zijn met de gebruikte expressiegastheercel. Expres-5 sievectoren omvatten plasmiden, retrovirussen, adenovirus-sen, adeno-geassocieerde virussen (AAV), plantenvirussen zoals bloemkoolmozaïekvirus, tabaksmozaïekvirus, cosmiden, YAC's, van EBV afgeleide episomen en dergelijke. Het antilichaamgen wordt zodanig geligeerd in een vector dat 10 transcriptionele en translationele regulatiesequenties binnen in de vector hun bedoelde functie vervullen van het reguleren van de transcriptie en translatie van het antilichaamgen. De expressievector en expressieregulatiese-quenties worden gekozen opdat ze compatibel zijn met de 15 gebruikte expressiegastheercel. Het gen voor de lichte keten van het antilichaam en het gen voor de zware keten van het antilichaam kunnen worden ingezet in afzonderlijke vectoren. In een voorkeursuitvoeringsvorm worden beide genen in dezelfde expressievector ingezet. De antilichaamge-2 0 nen worden in de expressievector ingezet met behulp van standaardwerkwijzen (bv. ligatie van complementaire re-strictieplaatsen in het antilichaamgenfragment en de vector, of ligatie van stomp uiteinde indien geen restrictie-plaatsen aanwezig zijn).

2 5 Een geschikte vector is er één die codeert voor een functioneel complete sequentie voor humaan immunoglobuli-ne-CH of -CL, met gepaste restrictieplaatsen gemanipuleerd zodat welke VH- of VL-sequentie ook, gemakkelijk kan worden ingezet en tot expressie gebracht, zoals boven beschreven. 30 Bij dergelijke vectoren vindt splicing gewoonlijk plaats tussen de splice-donorplaats in het ingezette J-gebied en de splice-acceptorplaats die voorafgaat aan het humane C-domein, en ook bij de splice-gebieden die vóórkomen binnen in de humane CH-exons. Polyadenylering en transcriptieter-35 minatie vinden plaats bij natieve chromosomale plaatsen, stroomafwaarts van de coderende gebieden. De recombinante expressievector kan ook coderen voor een signaalpeptide r r u u dat afscheiding van de antilichaamketen vanuit een gastheercel vergemakkelijkt. Het antilichaamketengen kan zodanig in de vector worden gekloneerd dat het signaalpep-tide in-fase wordt verbonden met het amino-uiteinde van de 5 immunoglobulineketen. Het signaalpeptide kan een immu-noglobulinesignaalpeptide of een heteroloog signaalpeptide zijn (i.e. een signaalpeptide dat afkomstig is van een niet -immunoglobuline-eiwit) .

Naast de antilichaamketengenen dragen de recombinante 10 expressievectoren van de uitvinding regulerende sequenties die de expressie van de antilichaamketengenen in een gastheercel reguleren. Het zal door de gemiddelde vakman worden erkend dat het ontwerp van de expressieveetor, waaronder de selectie van regulerende sequenties, kan afhangen 15 van dergelijke factoren als de keuze van de te transformeren gastheercel, het gewenste niveau van expressie van eiwit, enzovoorts. Regulerende sequenties voor zoogdiergast-heercelexpressie die de voorkeur hebben, omvatten virale elementen die hoge niveaus van eiwitexpressie in zoogdier-20 cellen leiden, zoals promotoren en/of versterkers die zijn afgeleid van retrovirale LTR's, cytomegalovirus (CMV) (zoals de CMV-promotor/versterker), Simian Virus 40 (SV40) (zoals de SV40-promotor/versterker), adenovirus, (bv. de voornaamste late promotor van adenovirus [adenovirus major 25 late promoter] (AdMLP)), polyoma- en sterke zoogdierpromo-toren zoals natieve immunoglobuline- en actinepromotoren. Voor een verdere beschrijving van virale regulerende elementen, en sequenties daarvan, zie bv. Amerikaans octrooi 5,168,062, Amerikaans octrooi 4,510,245 en Amerikaans oc-30 trooi 4,968,615. Werkwijzen voor zowel het tot expressie brengen van antilichamen in planten, inclusief een beschrijving van promotoren en vectoren, als de transformatie van planten, zijn in de techniek bekend. Zie bv. Amerikaans octrooi 6,517,529, hier bij referentie opgenomen. 35 Werkwijzen voor het tot expressie brengen van polypeptiden in bacteriële cellen of schimmelcellen, bv. gistcellen, zijn ook algemeen bekend in de techniek.

67

Naast de antilichaamketengenen en regulerende sequenties, kunnen de recombinante expres-sievectoren van de uitvinding bijkomende sequenties dragen, zoals sequenties die de replicatie van de vector in 5 gastheercellen reguleren (bv. oorsprongen van replicatie) , en selecteerbare merker-genen. Het selecteerbare merker-gen vergemakkelijkt de selectie van gastheercellen waarin de vector is ingebracht (zie bv. Amerikaanse octrooien 4.399.216, 4,634,665 en 5,179,017, hier bij referentie op-10 genomen). Het selecteerbare merker-gen verleent bijvoorbeeld kenmerkend resistentie tegen geneesmiddelen, zoals G418, hygromycine of methotrexaat, bij een gastheercel waarin de vector is ingebracht. Selecteerbare merker-genen die de voorkeur hebben, omvatten het dihydrofolaatreducta- 15 se (DHFR)-gen (voor gebruik in dhfr-gastheercellen met me-thotrexaatselectie/amplificatie), het neomycinefosfotrans -ferasegen (voor G418-selectie) en het glutamaatsynthetase-gen.

Nucleïnezuurmoleculen die coderen voor P-cadherine-20 antilichamen en vectoren die deze nucleïnezuurmoleculen omvatten, kunnen worden gebruikt voor de transfectie van een geschikte zoogdier-, planten-, bacteriële of gistgast-heercel. De transformatie kan geschieden met behulp van een willekeurige bekende werkwijze voor het inbrengen van 25 polynucleotiden in een gastheercel. Werkwijzen voor in-brenging van heterologe polynucleotiden in zoogdiercellen zijn in de techniek algemeen bekend en omvatten dextrange-medieerde transfectie, calciumfosfaatprecipitatie , poly-breengemedieerde transfectie, protoplastfusie, elektropo-30 ratie, inkapseling van het/de polynucleotide(n) in liposo-men en directe micro-injectie van het DNA in kernen. Bovendien kunnen nucleïnezuurmoleculen in zoogdiercellen worden ingebracht door middel van virale vectoren. Werkwijzen voor het transformeren van cellen zijn in de tech-35 niek algemeen bekend. Zie bv. Amerikaanse octrooien 4.399.216, 4,912,040, 4,740,461 en 4,959,455, hier bij referentie opgenomen) . Werkwijzen voor het transformeren van 68 plantencellen zijn in de techniek algemeen bekend, waaronder bv. Agrobacterium-gemedieerde transformatie, bi-olistische transformatie, directe injectie, elektroporatie en virale transformatie. Werkwijzen voor het transformeren 5 van bacteriële en gistcellen zijn ook algemeen bekend in de techniek.

Zoogdiercellijnen die beschikbaar zijn als gastheren voor expressie, zijn in de techniek algemeen bekend en omvatten vele onsterfelijk gemaakte cellijnen die verkrijg-10 baar zijn bij de American Type Culture Collection (ATCC) . Deze omvatten bijvoorbeeld Chinese hamster-ovarium (CHO)-cellen, NSO-cellen, SP2-cellen, HEK-293T-cellen, NIH-3T3-cellen, HeLa-cellen, hamsterjongnier [baby hamster kidney] (BHK)-cellen, niercellen van de Afrikaanse groene meerkat 15 (COS), humaan hepatocellulair carcinoom-cellen (bv. Hep G2) , A549-cellen, en een aantal andere cellijnen. Cellijnen die in het bijzonder de voorkeur hebben, worden geselecteerd door middel van het bepalen welke cellijnen hoge expressieniveaus hebben. Andere cellijnen die kunnen wor-20 den gebruikt, zijn insectencellijnen, zoals Sf9- of Sf21-cellen. Wanneer recombinante expressievectoren die coderen voor antilichaamgenen worden ingebracht in zoogdiergast-heercellen, dan worden de antilichamen geproduceerd door middel van het kweken van de gastheercellen gedurende een 25 tijdsperiode die toereikend is voor het laten van ruimte voor de expressie van het antilichaam in de gastheercellen of, met meer voorkeur, afscheiding van het antilichaam naar het kweekmedium waarin de gastheercellen worden gekweekt. Antilichamen kunnen uit het kweekmedium worden ge-30 wonnen met gebruikmaking van standaardeiwitzuiveringswerk-wijzen. Plantengastheercellen omvatten bv. Nicotiana, Ara-bidopsis, eendenkroos, maïs, tarwe, aardappel enzovoorts. Bacteriële gastheercellen omvatten E. coli- en Streptomy-ces-soorten. Gistgastheercellen omvatten Schizosaccharomy-35 ces pombe, Saccharomyces cerevisiae en Pichia pastoris.

Verder kan de expressie van antilichamen van de uitvinding op basis van productiecellijnen worden versterkt 69 met gebruikmaking van een aantal bekende technieken. De glutaminesynthetase- (het GS-systeem) en DHFR-genexpressiesystemen zijn bijvoorbeeld gebruikelijke benaderingen voor het versterken van expressie onder bepaalde 5 omstandigheden. Celklonen die in hoge mate tot expressie brengen, kunnen worden geïdentificeerd met gebruikmaking van conventionele technieken, zoals beperkte verdunning-klonering en Microdrop-technologie. Het GS-systeem wordt besproken in Europese octrooien 0 216 846, 0 256 055, 0 10 323 997 en 0 338 841.

Het is waarschijnlijk dat antilichamen die tot expressie worden gebracht door verschillende cellijnen of in transgene dieren, een van elkaar verschillende glycosyle-ring zullen hebben. Alle antilichamen die worden gecodeerd 15 door de hierin verschafte nucleinezuurmoleculen, of die de aminozuursequenties omvatten die hierin worden verschaft, zijn echter een deel van de onderhavige uitvinding, ongeacht de glycosylering van de antilichamen.

Transgene dieren en planten 20 P-cadherineantilichamen van de uitvinding kunnen ook op transgene wijze worden geproduceerd door middel van de generatie van een zoogdier of plant dat/die transgeen is voor de sequenties van belang voor de zware en lichte keten van een immunoglobuline, en de productie van het anti-25 lichaam in een daaruit winbare vorm. In verband met de transgene productie in zoogdieren kunnen P-cadherineantilichamen worden geproduceerd in, en gewonnen uit, de melk van geiten, koeien of andere zoogdieren. Zie bv. Amerikaanse octrooien 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 en 30 5,741,957, hier bij referentie opgenomen. In sommige uit voeringsvormen worden niet-humane transgene dieren die loei voor humaan immunoglobuline omvatten, geïmmuniseerd met P-cadherine of een immunogeen gedeelte daarvan, zoals boven beschreven. Werkwijzen voor het maken van antilichamen 35 in planten worden bv. beschreven in Amerikaanse octrooien 6,046,037 en 5,959,177, hier bij referentie opgenomen.

7 0

In sommige uitvoeringsvormen worden niet-humane transgene dieren of planten geproduceerd door middel van het inbrengen van één of meer nucle-inezuurmoleculen die coderen voor een P- 5 cadherineantilichaam, of antigeenbindend gedeelte daarvan, van de uitvinding, in het dier of de plant met behulp van gebruikelijke transgene technieken. Zie Hogan en Amerikaans octrooi 6,417,429, supra. De transgene cellen die worden gebruikt voor het maken van het transgene dier, 10 kunnen embryonale stamcellen of somatische cellen, of een bevruchte eicel zijn. De transgene niet-humane organismen kunnen chimere, niet-chimere heterozygoten, en niet-chimere homozygoten zijn. Zie bv. Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 2* ed. , Cold 15 Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (20 00) ; en Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999), alle hier bij referentie opgenomen. In sommige uitvoeringsvormen hebben 20 de transgene niet-humane dieren een getargetete ontwrichting en vervanging door een targeting-construct dat codeert voor een zware keten en/of een lichte keten van belang. De P-cadherineantilichamen kunnen worden gemaakt in ieder transgeen dier. In een voorkeursuitvoeringsvorm zijn 25 de niet-humane dieren muizen, ratten, schapen, varkens, geiten, rundvee of paarden. Het niet-humane transgene dier brengt die gecodeerde polypeptiden tot expressie in bloed, melk, urine, speeksel, tranen, mucus en andere lichamelijke vloeistoffen.

30 Klasseomschakeling

De klasse (bv. IgG, IgM, IgE, IgA of IgD) en subklasse (bv. IgGl, IgG2, IgG3 of IgG4) van P-cadherineantilichamen kan worden bepaald met behulp van een willekeurige, in de techniek bekende werkwijze. Ge-35 woonlijk kan de klasse en subklasse van een antilichaam worden bepaald met gebruikmaking van antilichamen die specifiek zijn voor een specifieke klasse en subklasse van 71 antilichaam. Dergelijke antilichamen zijn commercieel verkrijgbaar. De klasse en subklasse kunnen worden bepaald met behulp van zowel ELISA, of Western Blot, als andere technieken. Alternatief kunnen de klasse 5 en subklasse worden bepaald door middel van het sequencen van alles of een gedeelte van de constante domeinen van de zware en/of lichte ketens van de antilichamen, het vergelijken van hun aminozuursequenties met de bekende amino-zuursequenties van verschillende klassen en subklassen van 10 immunoglobulinen, en het bepalen van de klasse en subklasse van de antilichamen. De P-cadherineantilichamen van de onderhavige uitvinding kunnen een IgG-, een IgM-, een IgE-, een IgA- of een IgD-molecuul zijn. De P-cadherineantilichamen kunnen bijvoorbeeld een IgG zijn dat 15 een IgGl-, IgG2-, IgG3- of een IgG4-subklasse is. In één uitvoeringsvorm kunnen de P-cadherineantilichamen een constant gebied van de zware keten dat wordt aangegeven door SEQ ID NO: 344, en een constant gebied van de lichte keten dat wordt aangegeven door SEQ ID NO: 345, hebben.

20 Eén aspect van de uitvinding verschaft een werkwijze voor het omzetten van de klasse of subklasse van een P-cadherineantilichaam tot een andere klasse of subklasse. In sommige uitvoeringsvormen wordt een nucleïnezuurmole-cuul dat codeert voor een VL of VH dat geen sequenties om-25 vat die coderen voor CL of CH, geïsoleerd met gebruikmaking van werkwijzen die in de techniek algemeen bekend zijn. Het nucleïnezuurmolecuul wordt vervolgens functioneel verbonden met een nucleïnezuursequentie die codeert voor een CL of CH dat afkomstig is van een gewenste immunoglobuline-30 klasse of -subklasse. Dit kan tot stand worden gebracht met gebruikmaking van een vector of nucleïnezuurmolecuul die/dat een CL- of CH-keten omvat, zoals boven beschreven. Een P-cadherineantilichaam dat oorspronkelijk bijvoorbeeld IgM was, kan wat betreft klasse worden omgeschakeld naar 35 een IgG. Verder kan de klasseomschakeling worden gebruikt voor het omzetten van één IgG-subklasse tot een andere, bv. van IgGl tot IgG2. Een andere werkwijze voor het pro- 72 duceren van een antilichaam van de uitvinding dat een gewenst isotype omvat, omvat de stappen van het isoleren van een nucleinezuur dat codeert voor een zware keten van een P-cadherineantilichaam en een nucleinezuur dat codeert 5 voor een lichte keten van een P-cadherineantilichaam, het isoleren van de sequentie die codeert voor het VH-gebied, het ligeren van de VH-sequentie met een sequentie die codeert voor een constant domein van de zware keten van het gewenste isotype, het tot expressie brengen van het gen 10 voor de lichte keten en het construct voor de zware keten in een cel, en het verzamelen van het P-cadherineantilichaam met het gewenste isotype.

Gedeïmmuniseerde anti lichamen

In een ander aspect van de uitvinding kunnen de anti-15 lichamen of antigeenbindende gedeelten daarvan worden ge-deimmuniseerd om hun immunogeniteit te verminderen, met gebruikmaking van de technieken die worden beschreven in bv. PCT-publicaties W098/52976 en WOOO/34317 (hier bij referentie opgenomen).

20 Gederivatiseerde en gemerkte antilichamen

Een P-cadherineantilichaam of antigeenbindend gedeelte van de uitvinding kan worden gederivatiseerd of verbonden met een ander molecuul (bv. een ander peptide of eiwit) . Gewoonlijk worden de antilichamen of het gedeelte 25 daarvan zodanig gederivatiseerd dat de P-cadherinebinding niet nadelig wordt beïnvloed door de derivatisering of merking. Dienovereenkomstig wordt het bedoeld dat de antilichamen en antilichaamgedeelten van de uitvinding zowel intacte als gemodificeerde vormen van de hierin beschreven 30 humane P-cadherineantilichamen omvatten. Een antilichaam of antilichaamgedeelte van de uitvinding kan bijvoorbeeld functioneel zijn verbonden (door middel van chemische koppeling, genetische fusie, niet-covalente associatie of op een andere manier) met één of meer andere moleculaire en-35 titeiten, zoals een ander antilichaam (bv. een bispecifiek antilichaam of een dialichaam), een detectieagens, een merkstof, een cytotoxisch agens, een farmaceutisch agens, 73 en/of een eiwit of peptide dat de associatie van het antilichaam of antilichaamgedeelte met een ander molecuul (zoals een streptavidinekerngebied of een polyhistidinela-bel) kan mediëren.

5 Eén type gederivatiseerd antilichaam wordt geprodu ceerd door middel van het verknopen van twee of meer anti-lichamen (van hetzelfde type of van verschillende typen, bv. voor het creëren van bispecifieke antilichamen). Geschikte verknopers omvatten die welke heterobifunctioneel, 10 met twee verschillend reactieve groepen die worden gescheiden door een gepaste uitelkaarplaatser (bv. m-maleïmidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide-ester), of homobi-functioneel (bv. disuccinimidylsuberaat) zijn. Dergelijke koppelstukken zijn verkrijgbaar bij Pierce Chemical Compa-15 ny, Rockford, IL.

Een ander type gederivatiseerd antilichaam is een gemerkt antilichaam. Bruikbare detectieagentia waarmee een antilichaam of antigeenbindend gedeelte van de uitvinding kan worden gederivatiseerd, omvatten fluorescerende ver-20 bindingen, waaronder fluoresceine, fluoresceïne- isothiocyanaat, rhodamine, 5-dimethylamine-l-naftaleen-sulfonylchloride, fyco-erythrine, lanthanidefosfors en dergelijke. Een antilichaam kan ook worden gemerkt met enzymen die bruikbaar zijn voor detectie, zoals mierikswor-25 telperoxidase, β-galactosidase, luciferase, alkalische fosfatase, glucoseoxidase en dergelijke. Wanneer een antilichaam wordt gemerkt met een detecteerbaar enzym, dan wordt het gedetecteerd door middel van het toevoegen van bijkomende reagentia die het enzym gebruikt om een reac-30 tieproduct te produceren dat kan worden waargenomen. Wanneer het agens mierikswortelperoxidase bijvoorbeeld aanwezig is, dan leidt de toevoeging van waterstofperoxide en diaminobenzidine tot een gekleurd reactieproduct, dat detecteerbaar is. Een antilichaam kan ook worden gemerkt met 35 biotine, en gedetecteerd door middel van de indirecte meting van avidine- of streptavidinebinding. Een antilichaam kan ook worden gemerkt met een vooraf bepaald polypeptide- 74 epitoop dat wordt herkend door een secundaire reporter (bv. leucineritspaarsequenties, bindingsplaatsen voor secundaire antilichamen, metaalbindende domeinen, epitoopla-bels). In sommige uitvoeringsvormen worden merkstoffen 5 vastgehecht door middel van uitelkaarplaatserarmen van verschillende lengten, waardoor mogelijke sterische verhindering wordt verminderd. Een P-cadherineantilichaam kan ook worden gederivatiseerd met een chemische groep zoals polyethyleenglycol (PEG), een methyl- of ethylgroep, of 10 een koolhydraatgroep. Deze groepen zijn bruikbaar voor het verbeteren van de biologische kenmerken van het antili-chaam, bv. voor het verhogen van de halfwaardetijd in serum.

Bindingsaffiniteit van P-cadherineantilichamen voor P-15 cadherine

De bindingsaffiniteit (KD) en de dissociatiesnelheid (Kaf) van een P-cadherineantilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan voor P-cadherine kunnen worden bepaald met behulp van in de techniek bekende werkwijzen. De bindings-20 affiniteit kan worden gemeten met behulp van ELISA's, RIA's, flowcytometrie of oppervlakteplasmonresonantie, zoals BIACORE™. De dissociatiesnelheid kan worden gemeten met behulp van oppervlakteplasmonresonantie. Bij voorkeur worden de bindingsaffiniteit en de dissociatiesnelheid ge-25 meten met behulp van oppervlakteplasmonresonantie. Met meer voorkeur worden de bindingsaffiniteit en de dissociatiesnelheid gemeten met gebruikmaking van BIACORE™. Men kan bepalen of een antilichaam in aanzienlijke mate dezelfde KD heeft als een P-cadherineantilichaam met behulp 30 van in de techniek bekende werkwijzen. Dergelijke werkwijzen voor het bepalen van Κρ en Kaf kunnen worden gebruikt tijdens zowel het eerste screeningsstadium, als tijdens eropvolgende optimaliseringsstadia.

Identificatie van P-cadherine-epitopen die worden herkend 35 door P-cadherineantilichamen

De uitvinding verschaft humane P-cadherineantilichamen die binden aan P-cadherine en concurreren of 75 kruisconcurreren met, en/of hetzelfde epitoop binden als, een van de antilichamen zoals beschreven in Tabellen 1 of 2. Men kan bepalen of een antilichaam bindt aan hetzelfde epitoop of kruisconcurreert met een P-5 cadherineantilichaam van de onderhavige uitvinding om binding met behulp van werkwijzen die in de techniek bekend zijn. In één uitvoeringsvorm laat men het P-cadherineantilichaam van de uitvinding binden aan P-cadherine onder verzadigende omstandigheden, en meet men 10 vervolgens het vermogen van het testantilichaam om te binden aan P-cadherine. Indien het testantilichaam in staat is om op hetzelfde moment als het P-cadherineantilichaam aan P-cadherine te binden, dan bindt het testantilichaam aan een verschillend epitoop dan 15 het P-cadherineantilichaam. Indien het testantilichaam echter niet in staat is om op hetzelfde moment aan P-cadherine te binden, dan bindt het testantilichaam aan hetzelfde epitoop, een overlappend epitoop of een epitoop dat zich in directe nabijheid van het epitoop bevindt dat 20 wordt gebonden door het humane P-cadherineantilichaam. Dit experiment kan worden uitgevoerd met gebruikmaking van ELISA, RIA, BIACORE™ of flowcytometrie. In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt het experiment uitgevoerd met gebruikmaking van ELISA.

25 Inhibitie van P-cadherineactiviteit door een P-cadherine-antilichaam P-cadherineantilichamen die P-cadherineactiviteit remmen, kunnen worden geïdentificeerd met gebruikmaking van een aantal bepalingen. Een celaggregatiebepaling ver-30 schaft bijvoorbeeld een werkwijze voor het meten van P-cadherineafhankelijke cellulaire aggregatie. Dit type bepaling gebruikt een cellijn die P-cadherine tot overex-pressie brengt, waarbij de cellen in suspensie worden geplaatst en men ze P-cadherineafhankelijke aggregaten laat 35 vormen. De aggregatiebepaling wordt vervolgens gebruikt voor het kwantificeren van het vermogen van een P-cadherineantilichaam om deze aggregatie te voorkomen door 76 middel van het meten van de grootte van cellulaire aggregaten die het gevolg zijn, met en zonder het antilichaam. Celaggregaatgrootte als een functie van P-cadherine-antilichaamconcentratie kan vervolgens worden gebruikt 5 voor het bepalen van een IC50-waarde. Voorbeeld 4 verschaft verdere details van een P-cadherineafhankelijke aggregatie -bepaling die werd gebruikt voor het meten van leswaarden voor verscheidene P-cadherineantilichamen.

Celadhesiebepalingen kunnen ook worden gebruikt om 10 het vermogen van een P-cadherineantilichaam te meten om de adhesie van cellen aan een receptor-P-cadherine te verhinderen dat is geïmmobiliseerd op een vaste drager. Dit type bepaling kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd door middel van het immobiliseren van P-cadherine op een vaste drager, 15 zoals plastic. Men laat cellen die P-cadherine tot overex-pressie brengen vervolgens hechten aan de vaste drager via P-cadherine-P-cadherine-interacties. Het niveau van adhesie kan vervolgens worden gekwantificeerd met en zonder een P-cadherineantilichaam. Adhesie als een functie van 20 antilichaamconcentratie wordt vervolgens gebruikt voor het bepalen van een IC50-waarde. Voorbeeld 3 verschaft verdere details van een P-cadherineafhankelijke celadhesie-bepaling die werd gebruikt voor het meten van IC50-waarden voor P-cadherineantilichamen.

25 Inhibitie van P-cadherineactiviteit kan ook worden gemeten met gebruikmaking van een P-cadherineafhankelijke sferoïdeontwrichting-bepaling. Dit type bepaling meet het vermogen van een P-cadherineantilichaam om vooraf gevormde P-cadherineafhankelijke cellulaire aggregaties te ont-30 wrichten. Door middel van het meten van de groottevermin-dering van aggregaten als een functie van antilichaamconcentratie kan een IC50-waarde worden bepaald. Voorbeeld 5 verschaft verdere details van een P-cadherineafhankelijke sferoïdeontwrichting-bepaling die werd gebruikt voor het 35 meten van IC50-waarden voor P-cadherineantilichamen. De boven beschreven werkwijzen en bepalingen voor het bepalen van de inhibitie van P-cadherineactiviteit door verschil- 77 lende antilichamen of antigeenbindende gedeelten daarvan, kunnen worden gebruikt tijdens zowel het eerste screeningsstadium, als tijdens eropvolgende optimalise-ringsstadia.

5 Moleculaire selectiviteit

De selectiviteit van de P-cadherineantilichamen van de onderhavige uitvinding boven andere cadherinen, zoals E-cadherine, kan worden bepaald met gebruikmaking van werkwijzen die in de techniek algemeen bekend zijn. Men 10 kan de selectiviteit bepalen met gebruikmaking van bijvoorbeeld Western blot, flowcytometrie, ELISA, immunopre-cipitatie of RIA. Voorbeeld 7 verschaft verdere details van een ELISA-bepaling die werd gebruikt voor het meten van de selectiviteit van specifieke antilichamen voor P-15 cadherine boven E-cadherine. De boven beschreven werkwijzen en bepalingen voor het bepalen van de selectiviteit voor P-cadherine van verschillende antilichamen of anti-geenbindende gedeelten daarvan, kunnen worden gebruikt tijdens zowel het eerste screeningsstadium, als tijdens 20 eropvolgende optimaliseringsstadia.

Farmaceutische preparaten en toediening

Deze uitvinding heeft ook betrekking op een farmaceutisch preparaat voor de behandeling van abnormale celgroei bij een zoogdier, waaronder een mens, omvattende een hoe-25 veelheid van een P-cadherineantilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan, zoals hierin beschreven, die effectief is bij het behandelen van abnormale celgroei, en een farmaceutisch aanvaardbare drager.

De antilichamen en antigeenbindende gedeelten van de 30 onderhavige uitvinding kunnen in farmaceutische preparaten worden geïncorporeerd die geschikt zijn voor toediening aan een patiënt. Het farmaceutische preparaat omvat kenmerkend een antilichaam of antigeenbindend gedeelte van de uitvinding en een farmaceutisch aanvaardbare drager. Zoals 35 hierin gebruikt, betekent "farmaceutisch aanvaardbare drager" ieder(e) en alle oplosmiddel(en), dispersiemedi-um/dispersiemedia, coating(s), antibacterieel agens/anti- 78 bacteriële agentia en antischimmelagens/antischimmelagentia, isoto(o)n(e) en ab-sorptievertragend(e) agens/agentia en dergelijke dat/die fysiologisch compatibel is/zijn. Enkele voorbeelden van 5 farmaceutisch aanvaardbare dragers zijn zowel water, fysiologische zoutoplossing, met fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing, dextrose, glycerol, ethanol en dergelijke, als combinaties daarvan. In vele gevallen zal het de voorkeur hebben om isotone agentia, bijvoorbeeld sui-10 kers, polyalcoholen zoals mannitol, sorbitol of natrium-chloride in het preparaat in te begrijpen. Bijkomende voorbeelden van farmaceutisch aanvaardbare stoffen zijn bevochtigingsmiddelen of vrij kleine hoeveelheden hulpstoffen zoals bevochtigingsmiddelen of emulgatoren, con-15 serveringsmiddelen of buffers, die de houdbaarheidsperiode of de effectiviteit van het antilichaam verhogen.

De preparaten van deze uitvinding kunnen een verscheidenheid aan vormen hebben, bijvoorbeeld vloeibare, halfvaste en vaste doseringsvormen, zoals vloeibare oplos-20 singen (bv. injecteerbare en infundeerbare oplossingen), dispersies of suspensies, tabletten, pillen, poeders, li-posomen en zetpillen. De voorkeursvorm hangt af van de bedoelde wijze van toediening en therapeutische toepassing. Kenmerkende voorkeurspreparaten hebben de vorm van injec-25 teerbare of infundeerbare oplossingen, zoals preparaten die vergelijkbaar zijn met die welke worden gebruikt voor passieve immunisatie van mensen. De wijze van toediening die de voorkeur heeft, is parenteraal (bv. intraveneus, subcutaan, intraperitoneaal, intramusculair). In een voor-30 keursuitvoeringsvorm wordt het antilichaam toegediend door middel van intraveneuze infusie of injectie. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm wordt het antilichaam toegediend door middel van intramusculaire of subcutane injectie. Preparaten voor injectie kunnen worden aangeboden in een-35 heidsdoseringsvorm, bv. in ampullen of in multidosishou-ders, met of zonder een toegevoegd conserveringsmiddel. De preparaten kunnen dergelijke vormen aannemen als suspen- 79 sies, oplossingen of emulsies in olieachtige of waterige vehiculi, en kunnen formuleringsagentia bevatten, zoals suspendeer-, stabiliseer- en/of dispergeermiddelen. Alternatief kan het actieve ingrediënt in poedervorm zijn 5 voor constitutie met een geschikt vehiculum, bv. steriel pyrogeenvrij water, vóór gebruik.

Therapeutische preparaten moeten kenmerkend steriel en stabiel zijn onder de omstandigheden van vervaardiging en bewaring. Het preparaat kan worden geformuleerd als een 10 oplossing, micro-emulsie, dispersie, liposoom of andere geordende structuur die geschikt is voor een hoge genees-middelconcentratie. Steriele injecteerbare oplossingen kunnen worden bereid door middel van het incorporeren van het P-cadherineantilichaam in de vereiste hoeveelheid in 15 een gepast oplosmiddel met één of een combinatie van de ingrediënten die boven zijn opgesomd, zoals vereist, gevolgd door gefiltreerde sterilisatie. Gewoonlijk worden dispersies bereid door middel van het incorporeren van de actieve verbinding in een steriel vehiculum dat een basis-20 dispersiemedium en de vereiste andere ingrediënten, afkomstig van die welke boven zijn opgesomd, bevat. In het geval van steriele poeders voor de bereiding van steriele injecteerbare oplossingen, zijn de voorkeurswerkwijzen voor bereiding vacuümdrogen en vriesdrogen, dat een poeder 25 opbrengt van het actieve ingrediënt plus welk bijkomend gewenst ingrediënt ook dat afkomstig is van een eerder steriel-gefiltreerde oplossing daarvan. De juiste vloeibaarheid van een oplossing kan bijvoorbeeld worden gehandhaafd door middel van het gebruik van een coating zoals 3 0 lecithine, door middel van de handhaving van de vereiste partikelgroot te in het geval van een dispersie en door middel van het gebruik van oppervlakteactieve stoffen. Verlengde absorptie van injecteerbare preparaten kan worden bewerkstelligd door middel van het in het preparaat 35 inbegrijpen van een agens dat absorptie vertraagt, bijvoorbeeld monostearaatzouten en gelatine.

80

De antilichamen of antilichaamgedeelten van de onderhavige uitvinding kunnen met behulp van een verscheidenheid aan werkwijzen die in de techniek bekend zijn, worden toegediend, alhoewel voor vele therapeutische 5 toepassingen de route/wijze van toediening die de voorkeur heeft, subcutaan, intramusculair of intraveneuze infusie is. Zoals door de gemiddelde vakman zal worden erkend, zal de route en/of wijze van toediening afhankelijk van de gewenste resultaten variëren.

10 In bepaalde uitvoeringsvormen kunnen de antilichaam- preparaten van de onderhavige uitvinding worden bereid met een drager die het antilichaam zal beschermen tegen snelle vrijgeving, zoals een preparaat van gereguleerde vrijge-ving, waaronder implantaten, transdermale patches en mi-15 cro-ingekapselde leveringssystemen. Biologisch afbreekbare, biologisch compatibele polymeren kunnen worden gebruikt, zoals ethyleenvinylacetaat, polyanhydriden, poly-glycolzuur, collageen, polyortho-esters en polymelkzuur. Vele werkwijzen voor de bereiding van dergelijke prepara-20 ten zijn bij de gemiddelde vakman gewoonlijk bekend. Zie bv. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems , J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978, die hier bij referentie wordt opgenomen.

Bijkomende actieve verbindingen kunnen ook in de pre-25 paraten worden geïncorporeerd. In bepaalde uitvoeringsvormen wordt een remmend P-cadherineantilichaam van de uitvinding mede-geformuleerd met, en/of mede-toegediend met, één of meer bijkomende therapeutische agentia. Deze agentia omvatten, zonder beperking, antilichamen die andere 30 doelwitten binden, antitumoragentia, antiangiogeneseagen-tia, signaaltransductieremmers, antiproliferatieve agentia, chemotherapeutische agentia of peptideanalogons die P-cadherine remmen. Dergelijke combinatietherapieën kunnen lagere doseringen van zowel het remmende P-35 cadherineantilichaam als van de mede-toegediende agentia vereisen, aldus mogelijke toxiciteiten of complicaties 81 vermijdend die zijn geassocieerd met de verschillende monotherapieén.

De preparaten van de uitvinding kunnen een "therapeutisch effectieve hoeveelheid" of een "profylactisch effec-5 tieve hoeveelheid" van een antilichaam of antigeenbindend gedeelte van de uitvinding omvatten. Een "therapeutisch effectieve hoeveelheid" verwijst naar een hoeveelheid die, bij doseringen en gedurende tijdsperioden die noodzakelijk zijn, effectief is voor het bereiken van het gewenste the-10 rapeutische resultaat. Een therapeutisch effectieve hoeveelheid van het antilichaam of antigeenbindende gedeelte kan variëren volgens factoren zoals de ziektetoestand, de leeftijd, het geslacht en het gewicht van het individu, en het vermogen van het antilichaam of antilichaamgedeelte om 15 een gewenste respons in het individu op te wekken. Een therapeutisch effectieve hoeveelheid is er ook één waarbij welke toxische of schadelijke effecten van het antilichaam of antigeenbindende gedeelte ook, worden tenietgedaan door de therapeutisch heilzame effecten. Een "profylactisch ef-20 fectieve hoeveelheid" verwijst naar een hoeveelheid die, bij doseringen en gedurende tijdsperioden die noodzakelijk zijn, effectief is voor het bereiken van het gewenste profylactische resultaat. Aangezien bij patiënten een profylactische dosis voorafgaand aan, of op een vroeger stadium 25 van de ziekte wordt gebruikt, kan de profylactisch effectieve hoeveelheid kenmerkend minder zijn dan de therapeutisch effectieve hoeveelheid.

Doseringsregimes kunnen worden bijgesteld voor het verschaffen van de optimale gewenste respons (bv. een the-30 rapeutische of profylactische respons). Er kan bijvoorbeeld een enkelvoudige bolus worden toegediend, verscheidene verdeelde doses kunnen in de tijd worden toegediend of de dosis kan evenredig worden verminderd of verhoogd, zoals aangegeven door de dringendheden van de therapeuti-35 sche situatie. Het is in het bijzonder gunstig om parente-rale preparaten in doseringseenheidsvorm te formuleren voor het gemak van toediening en de uniformiteit van dose- ft?.

ring. Doseringseenheidsvorm, zoals hierin gebruikt, verwijst naar fysiek afzonderlijke eenheden die geschikt zijn als eenheidsdoseringen voor de te behandelen zoogdierpati-enten; waarbij iedere eenheid een vooraf bepaalde hoeveel-5 heid actieve verbinding bevat waarvan is berekend dat deze, samen met de vereiste farmaceutische drager, het gewenste therapeutische effect produceert. De specificatie voor de doseringseenheidsvormen van de uitvinding wordt gedicteerd door, en is direct afhankelijk van (a) de unie-10 ke kenmerken van het P-cadherineantilichaam of gedeelte daarvan en het specifieke te bereiken therapeutische of profylactische effect, en (b) de beperkingen die inherent zijn aan de techniek van het bereiden van zo'n antilichaam voor de behandeling van gevoeligheid in individuen.

15 Een kenschetsend, niet-beperkend traject voor een

therapeutisch of profylactisch effectieve hoeveelheid van een antilichaam of antilichaamgedeelte van de uitvinding is 0,025 tot 50 mg/kg, met meer voorkeur 0,1 tot 50 mg/kg, met meer voorkeur 0,1-25, 0,1 tot 10 of 0,1 tot 3 mg/kg. 20 In sommige uitvoeringsvormen bevat een preparaat 5 mg/ml antilichaam in een buffer van 20 mM natriumcitraat, pH

5,5, 140 mM NaCl en 0,2 mg/ml polysorbaat 80. Het dient te worden opgemerkt dat doseringswaarden kunnen variëren met het type en de hevigheid van de te verlichten aandoening. 25 Het dient verder te worden begrepen dat voor welke specifieke patiënt ook, specifieke doseringsregimes in de tijd dienen te worden bijgesteld in overeenstemming met de individuele behoefte en het professionele oordeel van de persoon die de preparaten toedient of die toezicht houdt 3 0 op de toediening van de preparaten, en dat doseringstra-jecten die hierin zijn uiteengezet, slechts kenschetsend zijn en niet zijn bedoeld om de omvang of de praktijk van het preparaat waarvoor bescherming wordt gevraagd, te beperken.

35 Een ander aspect van de onderhavige uitvinding ver schaft kits die een P-cadherineantilichaam of antigeenbin-dend gedeelte van de uitvinding, of een preparaat dat zo'n 83 antilichaam of gedeelte omvat, omvatten. Een kit kan, naast het antilichaam of preparaat, diagnostische of therapeutische agentia omvatten. Een kit kan ook instructies voor gebruik in een diagnostische of therapeutische 5 werkwijze omvatten. In een voorkeursuitvoeringsvorm omvat de kit het antilichaam of een preparaat dat het omvat, en een diagnostisch agens dat kan worden gebruikt in een werkwijze die beneden wordt beschreven. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm omvat de kit het antilichaam of 10 een preparaat dat het omvat, en één of meer therapeutische agentia die kunnen worden gebruikt in een werkwijze die beneden wordt beschreven.

Diagnostische werkwijzen voor gebruik

De P-cadherineantilichamen of antigeenbindende ge-15 deelten daarvan kunnen worden gebruikt in diagnostische werkwijzen voor het in vitro of in vivo detecteren van P-cadherine in een biologisch monster. De P-cadherine-antilichamen kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt in een conventionele immunobepaling, waaronder, zonder beperking, 20 een ELISA, een RIA, flowcytometrie, weefselimmunohistoche-mie, Western blot of immunoprecipitatie. De P- cadherineantilichamen van de uitvinding kunnen worden gebruikt voor het detecteren van P-cadherine dat afkomstig is van mensen. De P-cadherineantilichamen kunnen ook wor-25 den gebruikt voor het detecteren van P-cadherine dat afkomstig is van muizen, ratten en cynomolgusapen.

De uitvinding verschaft een werkwijze voor het detecteren van P-cadherine in een biologisch monster, omvattende het in contact brengen van het biologische monster met 30 een P-cadherineantilichaam van de uitvinding en het detecteren van het gebonden antilichaam. In één uitvoeringsvorm is het P-cadherineantilichaam direct gemerkt met een detecteerbare merkstof. In een andere uitvoeringsvorm is het P-cadherineantilichaam (het eerste antilichaam) niet-35 gemerkt en is een tweede antilichaam of ander molecuul dat het P-cadherineantilichaam kan binden, gemerkt. Zoals bij de gemiddelde vakman algemeen bekend is, wordt een tweede 84 antilichaam gekozen dat in ' staat is om specifiek de specifieke soort en klasse van het eerste antilichaam te binden. Indien het P-cadherineantilichaam bijvoorbeeld een humaan IgG is, dan zou het secundaire antilichaam een an-5 ti-humaan IgG kunnen zijn. Andere moleculen die kunnen binden aan antilichamen omvatten, zonder beperking, Protein A en Protein G, waarvan beide commercieel verkrijgbaar zijn, bv. bij Pierce Chemical Co.

Geschikte merkstoffen voor het antilichaam of secun-10 daire antilichaam zijn eerder besproken en omvatten verschillende enzymen, prosthetische groepen, fluorescerende materialen, luminescente materialen en radioactieve materialen. Voorbeelden van geschikte enzymen omvatten mie-rikswortelperoxidase, alkalische fosfatase, β-galactosi- 15 dase of acetylcholine-esterase; voorbeelden van geschikte prosthetische groep-complexen omvatten streptavidi-ne/biotine en avidine/biotine; voorbeelden van geschikte fluorescerende materialen omvatten umbelliferon, fluores-celne, fluoresceïne-isothiocyanaat, rhodamine, dichloor-20 triazinylaminefluoresceïne, dansylchloride of fyco- erythrine; een voorbeeld van een luminescent materiaal om vat luminol; en voorbeelden van geschikt radioactief materiaal omvatten 125I, 131I, 35S of 3H.

In andere uitvoeringsvormen kan P-cadherine worden 25 getest in een biologisch monster aan de hand van een competitie -immunobepaling onder gebruik van P-cadherine- standaarden die zijn gemerkt met een detecteerbare stof, en een niet-gemerkt P-cadherineantilichaam. Bij deze bepaling worden het biologische monster, de gemerkte P- 30 cadherinestandaarden en het P-cadherineantilichaam gecombineerd, en de hoeveelheid gemerkte P-cadherinestandaard die is gebonden aan het niet-gemerkte antilichaam, wordt bepaald. De hoeveelheid P-cadherine in het biologische monster is omgekeerd evenredig met de hoeveelheid gemerkte 35 P-cadherinestandaard die is gebonden aan het P-cadherineantilichaam.

85

Men kan de boven beschreven immunobepalingen gebruiken voor een aantal doeleinden. De P-cadherineantilichamen kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt voor het detecteren van P-cadherine in gekweekte 5 cellen. In een voorkeursuitvoeringsvorm worden de P-cadherineantilichamen gebruikt voor het bepalen van de hoeveelheid P-cadherine die wordt geproduceerd door cellen die zijn behandeld met verschillende verbindingen. Deze werkwijze kan worden gebruikt voor het identificeren van 10 verbindingen die P-cadherine-eiwitniveaus moduleren. Volgens deze werkwijze wordt één monster van cellen gedurende een tijdsperiode behandeld met een testverbinding, terwijl een ander monster onbehandeld wordt gelaten. Indien het totale niveau van P-cadherine moet worden gemeten, dan 15 worden de cellen gelyseerd en het totale P-cadherineniveau wordt gemeten met gebruikmaking van één van de boven beschreven immunobepalingen. Het totale niveau van P-cadherine in de behandelde versus de onbehandelde cellen wordt vergeleken, om het effect van de testverbinding te 20 bepalen.

Een voorkeursimmunobepaling voor het meten van totale P-cadherineniveaus is flowcytometrie of immunohistochemie. Werkwijzen zoals ELISA, RIA, flowcytometrie, Western blot, immunohistochemie, celoppervlaktemerking van integrale 25 membraaneiwitten en immunoprecipitatie zijn in de techniek algemeen bekend. Zie bv. Harlow en Lane, supra. Bovendien kunnen de immunobepalingen worden vergroot voor screening met hoge doorvoercapaciteit, om een groot aantal verbindingen te testen op hetzij activering, hetzij inhibitie 30 van P-cadherine-expressie.

De P-cadherineantilichamen van de uitvinding kunnen ook worden gebruikt voor het bepalen van de niveaus van P-cadherine in een weefsel of in cellen die zijn afgeleid van het weefsel. In sommige uitvoeringsvormen is het weef-35 sel een ziek weefsel. In sommige uitvoeringsvormen van de werkwijze wordt een weefsel of een biopt daarvan uit een patiënt weggesneden. Het weefsel of biopt wordt vervolgens o c o v gebruikt in een immunobepaling voor het bepalen van bv. totale P-cadherineniveaus of de lokalisatie van P-cadherine met behulp van de werkwijzen die boven zijn besproken.

5 De antilichamen van de onderhavige uitvinding kunnen ook in vivo worden gebruikt voor het identificeren van weefsels en organen die P-cadherine tot expressie brengen. Eén voordeel van het gebruiken van de humane P-cadherineantilichamen van de onderhavige uitvinding is dat 10 ze veilig in vivo kunnen worden gebruikt, zonder het opwekken van een aanmerkelijke immuunrespons tegen het anti-lichaam bij toediening, anders dan antilichamen van niet-humane oorsprong of met gehumaniseerde of chimere antilichamen .

15 De werkwijze omvat de stappen van het toedienen van een P-cadherineantilichaam dat detecteerbaar is gemerkt of een preparaat dat dit omvat, aan een patiënt die zo'n diagnostische test nodig heeft, en het onderwerpen van de patiënt aan beeldvormingsanalyse voor het bepalen van de 20 plaats van de P-cadherine tot expressie brengende weefsels. Beeldvormingsanalyse is in de medische techniek algemeen bekend, en omvat, zonder beperking, róntgenanalyse, beeldvorming met magnetische resonantie (MRI) of computertomografie (CT). Het antilichaam kan zijn gemerkt met ie-25 der agens dat geschikt is voor in vivo beeldvorming, bijvoorbeeld een contrastagens, zoals barium, dat kan worden gebruikt voor róntgenanalyse, of een magnetisch contrastagens, zoals een gadoliniumchelaat, dat kan worden gebruikt voor MRI of CT. Andere merkingsagentia omvatten, zonder 30 beperking, radio-isotopen, zoals "Tc. In een andere uitvoeringsvorm zal het P-cadherineantilichaam niet-gemerkt zijn en zal dit worden af geheeld door middel van het toedienen van een tweede antilichaam of ander molecuul dat detecteerbaar is en dat het P-cadherineantilichaam kan 35 binden. In één uitvoeringsvorm wordt uit de patiënt een biopt verkregen om te bepalen of het weefsel van belang P-cadherine tot expressie brengt.

87

Therapeutische_werkwi j zen voor gebruik

In een andere uitvoeringsvorm verschaft de uitvinding een werkwijze voor het remmen van P-cadherineactiviteit door middel van het toedienen van een P-cadherine-5 antilichaam aan een patiënt die dat nodig heeft. Welke van de hierin beschreven antilichamen of antigeenbindende gedeelten daarvan ook, kan therapeutisch worden gebruikt. In een voorkeursuitvoeringsvorm is het P-cadherineantilichaam een humaan, chimeer of gehumaniseerd antilichaam. In een 10 andere voorkeursuitvoeringsvorm is het P-cadherine humaan en is de patiënt een humane patiënt. Alternatief kan de patiënt een zoogdier zijn dat een P-cadhèrine tot expressie brengt waarmee het P-cadherineantilichaam kruisrea-geert. Het antilichaam kan worden toegediend aan een niet-15 humaan zoogdier dat P-cadherine tot expressie brengt waarmee het antilichaam kruisreageert (bv. een rat, een muis of een cynomolgusaap) , voor veterinaire doeleinden of als een diermodel voor humane ziekte. Dergelijke diermodellen kunnen bruikbaar zijn voor het evalueren van de therapeu-20 tische werkzaamheid van antilichamen van deze uitvinding.

In een andere uitvoeringsvorm kan een P-cadherineantilichaam of antilichaamgedeelte daarvan aan een patiënt worden toegediend die ongepast hoge niveaus van P-cadherine tot expressie brengt. Het antilichaam kan 2 5 één keer worden toegediend, maar wordt met meer voorkeur veelvoudige keren toegediend. Het antilichaam kan van drie keer per dag tot één keer per zes maanden of langer worden toegediend. Het toedienen kan in een schema geschieden zoals drie keer per dag, tweemaal per dag, één keer per dag, 30 één keer per twee dagen, één keer per drie dagen, één keer per week, één keer per twee weken, één keer per maand, één keer per twee maanden, één keer per drie maanden en één keer per zes maanden. Het antilichaam kan ook continu worden toegediend via een minipomp. Het antilichaam kan wor-35 den toegediend via een mucosa-, buccale, intranasale, in-haleerbare, intraveneuze, subcutane, intramusculaire, pa-renterale of intratumorroute. Het antilichaam kan één 88 keer, ten minste tweemaal of gedurende ten minste de tijdsperiode worden toegediend totdat de aandoening is behandeld, verlicht of genezen. Het antilichaam zal gewoonlijk worden toegediend zo lang als de aandoening aanwezig 5 is. Het antilichaam zal gewoonlijk worden toegediend als een deel van een farmaceutisch preparaat, zoals aupra beschreven. De dosering van het antilichaam zal zich gewoonlijk in het traject van 0,1 tot 100 mg/kg, met meer voorkeur 0,5 tot 50 mg/kg, met meer voorkeur 1 tot 20 mg/kg en 10 zelfs met meer voorkeur 1 tot 10 mg/kg bevinden. De serum-concentratie van het antilichaam kan worden gemeten met behulp van een willekeurige, in de techniek bekende werk-wij ze.

Deze uitvinding heeft ook betrekking op een werkwijze 15 voor de behandeling van abnormale celgroei bij een zoogdier, waaronder een mens, omvattende het aan dat zoogdier toedienen van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van een P-cadherineantilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan, zoals hierin beschreven, die effectief is bij het 20 behandelen van abnormale celgroei.

In één uitvoeringsvorm van deze werkwijze is de abnormale celgroei kanker, waaronder, maar niet beperkt tot, mesothelioom, hepatobiliaire (lever- en galkanaal) tumor, een primaire of secundaire CNS-tumor, een primaire of se-25 cundaire hersentumor, longkanker (NSCLC en SCLC), botkan-ker, pancreaskanker, huidkanker, kanker van het hoofd of de hals, huid- of intraoculair melanoom, ovariale kanker, colonkanker, rectale kanker, kanker van het anale gebied, maagkanker, gastro-intestinale (maag-, colorectaal en duo-30 denaal) kanker, borstkanker, uteruskanker, carcinoom van de eileiders, carcinoom van het endometrium, carcinoom van de cervix, carcinoom van de vagina, carcinoom van de vulva, ziekte van Hodgkin, kanker van de slokdarm, kanker van de dunne darm, kanker van het endocriene systeem, kanker 35 van de schildklier, kanker van de bijschildklier, kanker van de bijnier, sarcoom van weke delen, kanker van de urethra, kanker van de penis, prostaatkanker, testeskanker, 89 chronische of acute leukemie, chronische myeloïde leukemie, lymfocytische lymfomen, kanker van de blaas, kanker van de nier of ureter, niercelcarcinoom, carcinoom van het nierbekken, neoplasma's van het centraal 5 zenuwstelsel (CNS), primair CNS-lymfoom, non-Hodgkin-lymfoom, ruggengraatsastumoren, hersenstamglioom, hypofy-seadenoom, adrenocorticale kanker, galblaaskanker, multipel myeloom, cholangiocarcinoom, fibrosarcoom, neuro-blastoom, retinoblastoom of een combinatie van één of meer 10 van de voorafgaande kankers.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding wordt de kanker gekozen uit longkanker (NSCLC en SCLC) , kanker van het hoofd of de hals, ovariale kanker, colonkanker, rectale kanker, kanker van het anale ge-15 bied, maagkanker, borstkanker, kanker van de nier of ureter, niercelcarcinoom, carcinoom van het nierbekken, neo-plasma's van het centraal zenuwstelsel (CNS), primair CNS-lymfoom, non-Hodgkin-lymfoom, ruggengraatsastumoren, of een combinatie van één of meer van de voorafgaande kan-2 0 kers.

In een andere voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding wordt de kanker gekozen uit longkanker (NSCLC en SCLC), ovariale kanker, colonkanker, rectale kanker, kanker van het anale gebied, of een combinatie van 25 één of meer van de voorafgaande kankers.

In een andere uitvoeringsvorm van die werkwijze is die abnormale celgroei een goedaardige proliferatieve ziekte, waaronder, maar niet beperkt tot, psoriasis, goedaardige prostaathypertrofie of restinosis.

30 Deze uitvinding heeft ook betrekking op een werkwijze voor de behandeling van abnormale celgroei bij een zoogdier, die het aan dat zoogdier toedienen van een hoeveelheid van een P-cadherineantilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan, zoals hierin beschreven, die effectief is 35 bij het behandelen van abnormale celgroei in combinatie met een antitumoragens dat is gekozen uit de groep bestaande uit mitotische remmers, alkylerende agentia, anti- 90 metabolieten, intercalerende antibiotica, groeifactorrem-mers, celcyclusremmers, enzymen, topo-isomeraseremmers, biologische respons-modificatoren, antilichamen, cytotoxi-sche stoffen, antihormonen en anti-androgene hormonen, om-5 vat.

De uitvinding heeft ook betrekking op een farmaceutisch preparaat voor de behandeling van abnormale celgroei bij een zoogdier, waaronder een mens, dat een hoeveelheid van een P-cadherineantilichaam of antigeenbindend gedeelte 10 daarvan, zoals hierin beschreven, die effectief is bij het behandelen van abnormale celgroei in combinatie met een farmaceutisch aanvaardbare drager en een antitumoragens dat is gekozen uit de groep bestaande uit mitotische remmers, alkylerende agentia, antimetabolieten, intercaleren-15 de antibiotica, groeifactorremmers, celcyclusremmers, enzymen, topo-isomeraseremmers, biologische respons-modif icatoren, antihormonen en anti-androgene hormonen, omvat.

De uitvinding heeft ook betrekking op een werkwijze 20 voor de behandeling van een hyperproliferatieve stoornis bij een zoogdier, die het aan dat zoogdier toedienen van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van een P-cadherineantilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan, zoals hierin beschreven, in combinatie met een antitumora-25 gens dat is gekozen uit de groep bestaande uit antiproli-feratieve agentia, kinaseremmers, angiogeneseremmers, groeifactorremmers, cox-I-remmers, cox-II-remmers, mitotische remmers, alkylerende agentia, antimetabolieten, intercalerende antibiotica, groeifactorremmers, bestraling, 30 celcyclusremmers, enzymen, topo-isomeraseremmers, biologische respons-modificatoren, antilichamen, cytotoxische stoffen, antihormonen, statinen en anti-androgene hormonen , omvat.

In één uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding 35 is het antitumoragens dat wordt gebruikt in combinatie met een P-cadherineantilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan, en farmaceutische preparaten die hierin zijn be- 91 schreven, een antiangiogene- seagens, kinaseremmer, pan-kinaseremmer of groeifactorremmer. Voorkeurs-pan-kinaseremmers omvatten SU-11248, beschreven in Amerikaans octrooi 6,573,293 (Pfizer, Inc., NY, V.S.).

5 Antiangiogeneseagentia omvatten, maar zijn niet be perkt tot de volgende agentia, zoals EGF-remmer, EGFR-remmers, VEGF-remmers, VEGFR-remmers, TIE2-remmers, IGF1R-remmers, COX-II (cyclo-oxygenase II)-remmers, MMP-2 (ma-trix-metalloproteïnase 2) -remmers en MMP-9 (matrix-10 metalloproteinase 9)-remmers. Voorkeurs-VEGF-remmers omvatten bijvoorbeeld Avastin (bevacizumab), een anti-VEGF-monoklonaal antilichaam van Genentech, Inc. van South San Francisco, Californië.

Bijkomende VEGF-remmers omvatten CP-547,632 (Pfizer 15 Inc., NY, V.S.), AG13736 (Pfizer Inc.), ZD-6474 (AstraZeneca) , AEE788 (Novartis), AZD-2171), VEGF Trap (Regene- ron,/Aventis) , Vatalanib (ook bekend als PTK-787, ZK-222584: Novartis & Schering AG), Macugen (pegaptanib-octa-natrium, NX-1838, EYE-001, Pfizer Ine./Gilead/Eyetech) , 20 IM862 (Cytran Inc. van Kirkland, Washington, V.S.) en angiozym, een synthetisch ribozym van Ribozyme (Boulder, Colorado) en Chiron (Emeryville, Californië) en combinaties daarvan. VEGF-remmers die bruikbaar zijn in de praktijk van de onderhavige uitvinding worden beschreven 25 in Amerikaans octrooi 6,534,524 en 6,235,764, waarvan beide in hun geheel voor alle doeleinden worden opgenomen. VEGF-remmers die in het bijzonder de voorkeur hebben, omvatten CP-547,632, AG13736, Vatalanib, Macugen en combinaties daarvan.

30 Bijkomende VEGF-remmers worden beschreven in bijvoor beeld WO 99/24440 (gepubliceerd op 20 mei 1999), internationale PCT-aanvrage PCT/IB99/00797 (ingediend op 3 mei 1999) , in WO 95/21613 (gepubliceerd op 17 augustus 1995) , WO 99/61422 (gepubliceerd op 2 december 1999), Amerikaans 35 octrooi 6,534,524 (beschrijft AG13736), Amerikaans octrooi 5,834,504 (uitgebracht op 10 november 1998), WO 98/50356 (gepubliceerd op 12 november 1998), Amerikaans octrooi r\ r\

Zf £*

5,883,113 (uitgebracht op 16 maart 1999), Amerikaans octrooi 5,886,020 (uitgebracht op 23 maart 1999), Amerikaans octrooi 5,792,783 (uitgebracht op 11 augustus 1998), Amerikaans octrooi US 6,653,308 (uitgebracht op 25 november 5 2003), WO 99/10349 (gepubliceerd op 4 maart 1999), WO

97/32856 (gepubliceerd op 12 september 1997), WO 97/22596 (gepubliceerd op 26 juni 1997), WO 98/54093 (gepubliceerd op 3 december 1998) , WO 98/02438 (gepubliceerd op 22 januari 1998), WO 99/16755 (gepubliceerd op 8 april 1999) en 10 WO 98/02437 (gepubliceerd op 22 januari 1998), waarvan alle hier bij referentie in hun geheel worden opgenomen.

Andere antiproliferatieve agentia die kunnen worden gebruikt met de antilichamen, of antigeenbindende gedeelten daarvan, van de onderhavige uitvinding, omvatten rem-15 mers van het enzym farnesyleiwittransferase en remmers van het receptortyrosinekinase PDGFr, waaronder de verbindingen die worden beschreven, en waarvoor bescherming wordt gevraagd, in de volgende Amerikaanse octrooiaanvragen: 09/221946 (ingediend op 28 december 1998) ; 09/454058 (in-20 gediend op 2 december 1999); 09/501163 (ingediend op 9 februari 2000) ; 09/539930 (ingediend op 31 maart 2000); 09/202796 (ingediend op 22 mei 1997); 09/384339 (ingediend op 26 augustus 1999) en 09/383755 (ingediend op 26 augustus 1999); en de verbindingen die worden beschreven, en 25 waarvoor bescherming wordt gevraagd, in de volgende Amerikaanse voorlopige octrooiaanvragen: 60/168207 (ingediend op 30 november 1999); 60/170119 (ingediend op 10 december 1999); 60/177718 (ingediend op 21 januari 2000) ; 60/168217 (ingediend op 30 november 1999) en 60/200834 (ingediend op 30 1 mei 2000). Ieder van de voorafgaande octrooiaanvragen en voorlopige octrooiaanvragen wordt hier in haar geheel bij referentie opgenomen.

PDGFr-remmers omvatten, maar zijn niet beperkt tot die welke worden beschreven in W001/40217, gepubliceerd op 35 7 juli 2001 en W02004/020431, gepubliceerd op 11 maart 2004, waarvan de inhouden in hun geheel voor alle doeleinden worden opgenomen. Voorkeurs-PDGFr-remmers omvatten 93

Pfizer's CP-673,451 en CP- 868,596, en zijn farmaceutisch aanvaardbare zouten.

Voorkeurs-GARF-remmers omvatten Pfizer's AG-2037 (pe-litrexol en zijn farmaceutisch aanvaardbare zouten) . GARF-5 remmers die bruikbaar zijn in de praktijk van de onderhavige uitvinding worden beschreven in Amerikaans octrooi 5,608,082, dat in zijn geheel voor alle doeleinden wordt opgenomen.

Voorbeelden van bruikbare COX-II-remmers die kunnen 10 worden gebruikt in combinatie met een P-cadherine-antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan, zoals hierin beschreven, en farmaceutische preparaten die hierin worden beschreven, omvatten CELEBREX™ (celecoxib), pare-coxib, deracoxib, ABT-963, MK-663 (etoricoxib), COX-189 15 (Lumiracoxib), BMS 347070, RS 57067, NS-398, Bextra (val-decoxib), paracoxib, Vioxx (rofecoxib), SD-8381, 4-methyl-2- (3,4-dimethylfenyl) -1- (4-sulfamoylfenyl) -1H-pyrrol, 2- (4-ethoxyfenyl) -4-methyl-l- (4-sulfamoylfenyl) -IH-pyrrol, T-614, JTE-522, S-2474, SVT-2016, CT-3, SC-58125 en Ar- 20 coxia (etoricoxib). Verder worden COX-II-remmers beschreven in Amerikaanse octrooiaanvragen 10/801,446 en 10/801,429, waarvan de inhouden in hun geheel voor alle doeleinden worden opgenomen.

In één voorkeursuitvoeringsvorm is het anti tumor agens 2 5 celecoxib, zoals beschreven in Amerikaans octrooi 5,466,823, waarvan de inhoud in zijn geheel bij referentie voor alle doeleinden wordt opgenomen. De structuur voor Celecoxib wordt beneden vertoond: %>ibsCv-> \—=J celecoxib / CAS No. 169590-42-5 5,466,623 \ J C-2779 SC-5B635 h3c 35 In één voorkeursuitvoeringsvorm is het antitumoragens valdecoxib, zoals beschreven in Amerikaans octrooi 5,633,272, waarvan de inhoud in zijn geheel bij referentie 94 voor alle doeleinden wordt opgenomen. De structuur voor valdecoxib wordt beneden vertoond: « /"*N valdecoxib /\ CAS No. 161695*72-7 f \ 5,633,272 W/ C-2665 SC-65672

In één voorkeursuitvoeringsvorm is het antitumoragens 10 parecoxib, zoals beschreven in Amerikaans octrooi 5,932,598, waarvan de inhoud in zijn geheel bij referentie voor alle doeleinden wordt opgenomen. De structuur voor parecoxib wordt beneden vertoond: r /Γ \ parecoxib \ 9 CAS No. 198470-84-7

We/ 5,932,598 02931 20 In één voorkeursuitvoeringsvorm is het antitumoragens deracoxib, zoals beschreven in Amerikaans octrooi 5,521,207, waarvan de inhoud in zijn geheel bij referentie voor alle doeleinden wordt opgenomen. De structuur voor deracoxib wordt beneden vertoond: 25 deracoxib F—/ \ CAS No. 169590-41-4 ^ ✓ 5,521,207

/—f C-2779 H3C-O

30

In één voorkeursuitvoeringsvorm is het antitumoragens SD-8381, zoals beschreven in Amerikaans octrooi 6,034,256, waarvan de inhoud in zijn geheel bij referentie voor alle doeleinden wordt opgenomen. De structuur voor SD-8381 I u ΈΓ3 SD-8381 Cl 6,034,256

Ex. 175 95

In één voorkeursuitvoeringsvorm is het antitumoragens 5 ABT-963, zoals beschreven in internationale publicatie WO 2002/24719, waarvan de inhoud in zijn geheel bij referentie voor alle doeleinden wordt opgenomen. De structuur voor ABT-963 wordt beneden vertoond: ABT-963 I J WO 00/24719

In één voorkeursuitvoeringsvorm is het antitumoragens 15 rofecoxib, zoals beneden vertoond: \ \ rofecoxib 'W CAS No. 162011-90-7 20

In één voorkeursuitvoeringsvorm is het antitumoragens MK-663 (etoricoxib), zoals beschreven in internationale publicatie WO 1998/03484, waarvan de inhoud in zijn geheel bij referentie voor alle doeleinden wordt opgenomen. De 25 structuur voor etoricoxib wordt beneden vertoond: °V°

rrS

MK-663 L II etoricoxib CAS No. 202409-33-4 1 WO 98/03484 n*tch3 ^86218 30

In één voorkeursuitvoeringsvorm is het antitumoragens COX-189 (Lumiracoxib) , zoals beschreven in internationale publicatie WO 1999/11605, waarvan de inhoud in zijn geheel bij referentie voor alle doeleinden wordt opgenomen. De 35 structuur voor Lumiracoxib wordt beneden vertoond: co2h “ ό: C* I <*»1 - COX-189 ^

Lumiracoxlb CAS No. 220991-20-8 Novartis NO 99/11605 5 In één voorkeursuitvoeringsvorm is het anti tumor agens BMS-347070, zoals beschreven in Amerikaans octrooi 6,180,651, waarvan de inhoud in zijn geheel bij referentie voor alle doeleinden wordt opgenomen. De structuur voor BMS-347070 wordt beneden vertoond: SOjCH, 10 BMS 347070 IC CAS No. 197438-48-5 -13 6,180,651

In één voorkeursuitvoeringsvorm is het antitumoragens NS-398 (CAS 123653-11-2). De structuur voor NS-398 (CAS 123653-11-2) wordt beneden vertoond: HN-sC NS-398 .

CAS No. 123653-11-2 25 In één voorkeursuitvoeringsvorm is het antitumoragens RS 57067 (CAS 17932-91-3). De structuur voor RS-57067 (CAS 17932-91-3) wordt beneden vertoond: RS 57067 CAS No. 17932-91-3

In één voorkeursuitvoeringsvorm is het antitumoragens 4-methyl-2- (3,4-dimethylfenyl) -1- (4-sulfamoylfenyl) -1H-pyrrol. De structuur voor 4-methyl-2-(3,4-dimethylfenyl) - 35 1-(4-sulfamoylfenyl)-ΙΗ-pyr-rol wordt beneden vertoond: ch3 SOaNH,

In één voorkeursuitvoeringsvorm is het antitumoragens 5 2- (4-ethoxyfenyl) -4-methyl-1- (4-sulfamoylfenyl) -1H-pyrrol.

De structuur voor 2 -(4-ethoxyfenyl)-4-methyl-l-(4-sulfamoylfenyl)-lH-pyrrol wordt beneden vertoond: ch3 10 c^o-N^ Λ, S02ÜH2

In één voorkeursuitvoeringsvorm is het antitumoragens meloxicam. De structuur voor meloxicam wordt beneden ver-15 toond: rrSV^

Meloxicam Λ 20 Andere bruikbare remmers als antitumoragentia, ge bruikt in combinatie met antilichamen van de onderhavige uitvinding en farmaceutische preparaten die hierin worden beschreven, omvatten aspirine, en niet-steroïdale antiont-stekingsgeneesmiddelen [non-steroidal anti-inflammatory 25 drugs] (NSAID's) die het enzym remmen dat prostaglandinen maakt (cyclo-oxygenase I en II) , leidend tot lagere niveaus van prostaglandinen, omvatten, maar zijn niet beperkt tot, de volgende, Salsalate (Amigesic) , Diflunisal (Dolobid), Ibuprofen (Motrin) , Ketoprofen (Orudis), Nabu-30 metone (Relafen) , Piroxicam (Feldene) , Naproxen (Aleve, Naprosyn) , Diclofenac (Voltaren) , Indomethacin (Indocin) , Sulindac (Clinoril), Tolmetin (Tolectin), Etodolac (Lodi-ne) , Ketorolac (Toradol), Oxaprozin (Daypro) en combinaties daarvan. Voorkeurs-COX-I-remmers omvatten ibuprofen 35 (Motrin), nuprin, naproxen (Aleve), indomethacine (Indocin) , nabumeton (Relafen) en combinaties daarvan.

98

Getargetete agentia die worden gebruikt in combinatie met een P-cadherineantilichaam of antigeenbin-dend gedeelte daarvan, zoals hierin beschreven, en farmaceutische preparaten daarvan, zoals hierin beschreven, om-5 vatten EGFr-remmers zoals Iressa (gefitinib, AstraZeneca) , Tarceva (erlotinib of OSI-774, OSI Pharmaceuticals Inc.)/ Erbitux (cetuximab, Imclone Pharmaceuticals, Inc.), EMD-7200 (Merck AG), ABX-EGF (Amgen Inc. en Abgenix Inc.), HR3 (Cu-10 baanse regering), IgA-antilichamen (universiteit van Er-langen-Neurenberg), TP-38 (IVAX), EGFR-fusie-eiwit, EGF- vaccin, anti-EGFr-immunoliposomen (Hermes Biosciences Inc.) en combinaties daarvan.

Voorkeurs-EGFr-remmers omvatten Iressa, Erbitux, Tar-15 ceva en combinaties daarvan.

De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op anti tumoragent ia die zijn gekozen uit pan-erb-receptor-remmers of ErbB2-receptorremmers, zoals CP-724,714 (Pfizer, Inc.), CI-1033 (canertinib, Pfizer, Ine.), Herceptin 20 (trastuzumab, Genentech Inc.), Omitarg (2C4, pertuzumab, Genentech Inc.), TAK-165 (Takeda), GW-572016 (lonafarnib,

GlaxoSmithKline) , GW-282974 (GlaxoSmithKline), EKB-569 (Wyeth), PKI-166 (Novartis), dHER2 (HER2 Vaccine, Corixa en GlaxoSmithKline), APC8024 (HER2 Vaccine, Dendreon), an-25 ti-HER2/neu-bispecifiek antilichaam (Decof Cancer Center), B7.her2.IgG3 (Agensys), AS HER2 (Research Institute for Rad Biology & Medicine), trifunctionele bispecifieke anti-lichamen (universiteit van München) en mAB AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) en mAB 2B-1 (Chiron) en combinaties 30 daarvan. Erb-selectieve antitumoragentia die de voorkeur hebben, omvatten Herceptin, TAK-165, CP-724,714, ABX-EGF, HER3 en combinaties daarvan. Voorkeurs-pan-erb-receptorremmers omvatten GW572016, CI-1033, EKB-569, en

Omitarg en combinaties daarvan.

35 Bijkomende erbB2-remmers omvatten die welke worden

beschreven in WO 98/02434 (gepubliceerd op 22 januari 1998), WO 99/35146 (gepubliceerd op 15 juli 1999), WO

99 99/35132 (gepubliceerd op 15 juli 1999), WO 98/02437 (gepubliceerd op 22 januari 1998), WO 97/13760 (gepubliceerd op 17 april 1997), WO 95/19970 (gepubliceerd op 27 juli 1995), Amerikaans octrooi 5,587,458 (uitgebracht op 24 de-5 cember 1996) en Amerikaans octrooi 5,877,305 (uitgebracht op 2 maart 1999), waarvan ieder hier bij referentie in haar/zijn geheel wordt opgenomen. ErbB2-receptorremmers die bruikbaar zijn in de onderhavige uitvinding, worden ook beschreven in Amerikaanse octrooien 6,465,449 en 10 6,284,764, en internationale aanvrage WO 2001/98277, waar van ieder hier bij referentie in zijn/haar geheel wordt opgenomen.

Verder kunnen andere antitumoragentia worden gekozen uit de volgende agentia, BAY-43-9006 (Onyx Pharmaceuticals 15 Inc.), Genasense (augmerosen, Genta), Panitumumab (Abge-nix/Amgen), Zevalin (Schering), Bexxar (Co- rixa/GlaxoSmithKline), Abarelix, Alimta, EPO 906 (Novartis) , discodermolide (XAA-296), ABT-510 (Abbott), Neo- vastat (Aeterna), enzastaurine (Eli Lilly), Combrestatin 20 A4P (Oxigene), ZD-6126 (AstraZeneca), flavopiridol (Aven- tis) , CYC-202 (Cyclacel) , AVE-8062 (Aventis) , DMXAA (Ro- che/Antisoma), Thymitaq (Eximias), Temodar (temozolomide, Schering Plough) en Revilimd (Celegene) en combinaties daarvan.

25 Andere antitumoragentia kunnen worden gekozen uit de volgende agentia, CyPat (cyproteronacetaat), Histerelin (histrelineacetaat), Plenaixis (abarelixdepot), Atrasentan (ABT-627), Satraplatin (JM-216), thalomide (Thalidomide), Theratope, Temilifene (DPPE), ABI-007 (paclitaxel), Evista 30 (raloxifen) , Atamestane (Biomed-777) , Xyotax (polygluta-maatpaclitaxel), Targetin (bexarotine) en combinaties daarvan.

Verder kunnen andere antitumoragentia worden gekozen uit de volgende agentia, Trizaone (tirapazamine), Aposyn 35 (exisulind), Nevastat (AE-941), Ceplene (histaminediwater-stofchloride), Orathecin (rubitecan), Virulizin, Gastrim-mune (G17DT), DX-8951f (exatecanmethaansulfonaat), Oncona- 100 se (ranpirnase), BEC2 (mitumoab), Xcytrin (motexafingadolinium) en combinaties daarvan.

Verdere antitumoragentia kunnen worden gekozen uit de volgende agentia, CeaVac (CEA), NeuTrexin (trimetresaat-5 glucuronaat) en combinaties daarvan. Bijkomende antitumor-agentia kunnen worden gekozen uit de volgende agentia, OvaRex (oregovomab), Osidem (IDM-1) en combinaties daarvan. Bijkomende antitumoragentia kunnen worden gekozen uit de volgende agentia, Advexin (ING 201), Tirazone (tirapa-10 zamine) en combinaties daarvan. Bijkomende antitumoragen-tia kunnen worden gekozen uit de volgende agentia, RSR13 (efaproxiral), Cotara (1311 chTNT l/b), NBI-3001 (IL-4) en combinaties daarvan. Bijkomende antitumoragentia kunnen worden gekozen uit de volgende agentia, Canvaxin, GMK-15 vaccin, PEG Interon A, Taxoprexin (DHA/paclitaxel) en combinaties daarvan. Andere voorkeursantitumoragentia omvatten Pfizer's MEKl/2-remmer PD325901, Array Biopharm's MEK-remmer ARRY-142886, Bristol Myers' CDK2-remmer BMS-387,032, Pfizer's CDK-remmer PD0332991 en AstraZeneca's 20 AXD-5438 en combinaties daarvan. Verder kan er ook gebruik worden gemaakt van mTOR-remmers zoals CCI-779 (Wyeth) en rapamycinederivaten RAD001 (Novartis) en AP-23573 (Ariad) , HDAC-remmers SAHA (Merck Inc./Aton Pharmaceuticals) en combinaties daarvan. Bijkomende antitumoragentia omvatten 25 de aurora 2-remmer VX-680 (Vertex), Chkl/2-remmer XL844 (Exilixis).

De volgende cytotoxische agentia, bv. één of meer die zijn gekozen uit de groep bestaande uit epirubicine (El-lence), docetaxel (Taxotere), paclitaxel, Zinecard (dexra-30 zoxan), rituximab (Rituxan), imatinibmethaansulfonaat (Gleevec) en combinaties daarvan, kunnen worden gebruikt in combinatie met een P-cadherineantilichaam of antigeen-bindend gedeelte daarvan, zoals hierin beschreven, en farmaceutische preparaten daarvan, zoals hierin beschreven.

3 5 De uitvinding beoogt ook het gebruik van de antili- chamen en antigeenbindende gedeelten daarvan van de onderhavige uitvinding, samen met hormonale therapie, waaron- 101 der, maar niet beperkt tot, exemestan (Aromasin, Pfizer Ine.), leuproreline (Lupron of Leuplin, TAP/Abbott/Takeda) , anastrozol (Arimidex, Astrazeneca) , gosreline (Zoladex, AstraZeneca), doxercalciferol, fadro-5 zol, formestan, tamoxifencitraat (tamoxifen, Nolvadex,

AstraZeneca) , Casodex (AstraZeneca) , Abarelix (Praecis) , Trelstar, en combinaties daarvan.

De uitvinding heeft ook betrekking op agentia van hormonale therapie zoals antioestrogenen, waaronder, maar 10 niet beperkt tot, fulvestrant, toremifen, raloxifen, laso-foxifen, letrozol (Femara, Novartis), anti-androgene hormonen, zoals bicalutamide, flutamide, mifepriston, niluta-mide , Casodex® (4 ' - cyaan-3 - (4- f luorfenylsulfonyl) - 2 - hydroxy-2-methyl-31-(trifluormethyl) propionanilide, bica-15 lutamide) en combinaties daarvan.

Verder verschaft de uitvinding antilichamen van de onderhavige uitvinding alléén of in combinatie met één of meer producten van steunende zorg, bv. een product dat is gekozen uit de groep bestaande uit Filgrastim (Neupogen), 20 ondansetron (Zofran), Fragmin, Procrit, Aloxi, Emend, of combinaties daarvan.

Cytotoxische agentia die in het bijzonder de voorkeur hebben, omvatten Camptosar, Erbitux, Iressa, Gleevec, Taxotere en combinaties daarvan.

2 5 Er kan gebruik worden gemaakt van de volgende topo- isomerase I-remmers als antitumoragentia, camptothecine, irinotecan-HCl (Camptosar), edotecarine, orathecine (Su-pergen), exatecan (Daiichi), BN-80915 (Roche) en combinaties daarvan. Topo-isomerase II-remmers die in het bijzon-30 der de voorkeur hebben, omvatten epirubicine (Ellence).

De antilichamen van de uitvinding kunnen worden gebruikt met antitumoragentia, alkylerende agentia, antime-tabolieten, antibiotica, van planten afgeleide antitumor-agentia, camptothecinederivaten, tyrosinekinaseremmers, 35 andere antilichamen, interferonen en/of biologische respons -modi f icatoren.

102

Alkylerende agentia omvatten, maar zijn niet beperkt tot, stikstofmosterd-N-oxide, cyclofosfamide, ifosfamide, melfalan, busulfan, mitobronitol, carboquon, thiotepa, ranimustine, nimustine, temozolomide, AMD-473, 5 altretamine, AP-5280, apaziquon, brostallicine, bendamus-tine, carmustine, estramustine, fotemustine, glufosfamide, ifosfamide, KW-2170, mafosfamide, en mitolactol; platina-gecoördineerde alkylerende verbindingen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, cisplatine, Paraplatin (carboplati-10 ne), eptaplatine, lobaplatine, nedaplatine, Eloxatin (oxa- liplatine, Sanofi) of satrplatine, en combinaties daarvan. Alkylerende agentia die in het bijzonder de voorkeur hebben, omvatten Eloxatin (oxaliplatine).

Antimetabolieten omvatten, maar zijn niet beperkt 15 tot, methotrexaat, 6-mercaptopurine riboside, mercaptopu- rine, 5-fluoruracil (5-FU), alléén of in combinatie met leucovorine, tegafur, UFT, doxifluridine, carmofur, cyta-rabine, cytarabineocfosfaat, enocitabine, S-l, Alimta (premetrexed-dinatrium, LY231514, MTA), Gemzar (gemcitabi-20 ne, Eli Lilly), fludarabine, 5-azacitidine, capecitabine, cladribine, clofarabine, decitabine, eflornithine, ethy-nylcytidine, cytosinearabinoside, hydroxyureum, TS-1, melfalan, nelarabine, nolatrexed, ocfosfaat, dinatrium-premetrexed, pentostatine, pelitrexol, raltitrexed, tria-25 pine, trimetrexaat, vidarabine, vincristine, vinorelbine; of bijvoorbeeld één van de voorkeursantimetabolieten die worden beschreven in Europese octrooiaanvrage 239362, zoals N-(5-[N-(3,4-dihydro-2-methyl-4-oxochinazoline-6- ylmethyl)-N-methylamino]-2-thenoyl)-L-glutaminezuur en 30 combinaties daarvan.

Antibiotica omvatten intercalerende antibiotica, maar zijn niet beperkt tot: aclarubicine, actinomycine D, amru-bicine, annamycine, adriamycine, bleomycine, daunorubici-ne, doxorubicine, elsamitrucine, epirubicine, galarubici-35 ne, idarubicine, mitomycine C, nemorubicine, neocarzino- statine, peplomycine, pirarubicine, rebeccamycine, stima- 103 lamer, streptozocine, valrubicine, zinostatine en combinaties daarvan.

Van planten afgeleide antitumorstoffen omvatten bijvoorbeeld die welke zijn gekozen uit mitotische remmers, 5 bijvoorbeeld vinblastine, docetaxel (Taxotere), paclitaxel en combinaties daarvan.

Cytotoxische topo-isomeraseremmende agentia omvatten één of meer agentia die zijn gekozen uit de groep bestaande uit aclarubicine, amonafide, belotecan, camptothecine, 10 10-hydroxycamptothecine, 9-aminocamptothecine, diflomo-tecan, irinotecan-HCl (Camptosar), edotecarine, epirubici-ne (Ellence), etoposide, exatecan, gimatecan, lurtotecan, mitoxantron, pirarubicine, pixantron, rubitecan, sobu-zoxan, SN-38, tafluposide, topotecan, en combinaties daar-15 van.

Cytotoxische topo-isomeraseremmende agentia die de voorkeur hebben, omvatten één of meer agentia die zijn gekozen uit de groep bestaande uit camptothecine, 10-hydroxycamptothecine, 9-aminocamptothecine, irinotecan-HCl 20 (Camptosar), edotecarine, epirubicine (Ellence), etoposide, SN-38, topotecan, en combinaties daarvan.

Immunologische stoffen omvatten interferonen en talrijke andere immuunversterkende agentia. Interferonen omvatten interferon alfa, interferon alfa-2a, interferon al-25 fa-2b, interferon beta, interferon gamma-la, interferon gamma-lb (Actimmune) of interferon gamma-nl en combinaties daarvan. Andere agentia omvatten filgrastim, lentinan, si-zofilan, TheraCys, ubenimex, WF-10, aldesleukine, alemtu-zumab, BAM-002, dacarbazine, daclizumab, denileukine, gem-30 tuzumab, ozogamicine, ibritumomab, imiquimod, lenograstim, lentinan, melanoomvaccin (Corixa), molgramostim, OncoVAX-CL, sargramostim, tasonermin, tecleukine, thymalasine, to-situmomab, Virulizin, Z-100, epratuzumab, mitumomab, ore-govomab, pemtumomab (Y-muHMFGl), Provenge (Dendreon) en 35 combinaties daarvan.

Biologische respons-modificatoren zijn agentia die afweermechanismen van levende organismen of biologische 104 responsen modificeren, zoals overleving, groei, of differentiatie van weefselcellen, waardoor ze ertoe worden geleid om antitumoractiviteit te hebben. Dergelijke agentia omvatten krestine, lentinan, sizofiran, picibanil, 5 ubenimex en combinaties daarvan.

Andere antikankeragentia omvatten alitretinoïne, ampligen, atrasentan, bexaroteen, bortezomib, bosentan, calcitriol, exisulind, finasteride, fotemustine, ibandro-ninezuur, miltefosine, mitoxantron, 1-asparaginase, pro-10 carbazine, dacarbazine, hydroxycarbamide, pegaspargase, pentostatine, tazarotne, Telcyta (TLK-286, Telik Ine.), Velcade (bortemazib, Millenium) , tretinoïne en combinaties daarvan.

Andere antiangiogene verbindingen omvatten acitreti-15 ne, fenretinide, thalidomide, zoledroninezuur, angiostati- ne, aplidine, cilengtide, combretastatine A-4, endostati-ne, halofuginon, rebimastat, removab, Revlimid, squalami-ne, ukrain, Vitaxin en combinaties daarvan.

Platina-gecoördineerde verbindingen omvatten, maar 20 zijn niet beperkt tot, cisplatine, carboplatine, nedapla- tine, oxaliplatine, en combinaties daarvan.

Camptothecinederivaten omvatten, maar zijn niet beperkt tot, camptothecine, 10-hydroxycamptothecine, 9-aminocamptothecine, irinotecan, SN-38, edotecarine, topo-25 tecan en combinaties daarvan.

Andere antitumoragentia omvatten mitoxantron, 1-asparaginase, procarbazine, dacarbazine, hydroxycarbamide, pentostatine, tretinoïne en combinaties daarvan.

Er kan ook gebruik worden gemaakt van antitumoragen-3 0 tia die in staat zijn om antitumorimmuunresponsen te versterken, zoals CTLA4 (cytotoxische lymfocyt-antigeen 4)-antilichamen, en andere agentia die in staat zijn om CTLA4 te blokkeren, zoals MDX-010 (Medarex) en CTLA4-verbindingen die worden beschreven in Amerikaans octrooi 35 6,682,736; en antiproliferatieve agentia zoals andere far- nesyleiwittransferaseremmers, bijvoorbeeld de farnesylei-wittransferaseremmers. Bijkomende, specifieke CTLA4- 105 antilichamen die kunnen worden gebruikt in de onderhavige uitvinding, omvatten die welke worden beschreven in Amerikaanse voorlopige aanvrage 60/113,647 (ingediend op 23 december 1998) , Amerikaans octrooi 6,682,736, 5 waarvan beide hier bij referentie in hun geheel worden opgenomen .

Specifieke IGFIR-antilichamen die kunnen worden gebruikt in de onderhavige uitvinding, omvatten die welke worden beschreven in internationale octrooiaanvrage WO 10 2002/053596, die hier bij referentie in haar geheel wordt opgenomen.

Specifieke CD40-antilichamen die kunnen worden gebruikt in de onderhavige uitvinding omvatten die welke worden beschreven in internationale octrooiaanvrage WO 15 2003/040170, die hier bij referentie in haar geheel wordt opgenomen.

Gentherapieagentia kunnen ook worden gebruikt als anti tumoragent ia, zoals TNFerade (GeneVec), die TNF-alfa tot expressie brengen in reactie op radiotherapie.

20 In één uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding kunnen statinen worden gebruikt in combinatie met een P-cadherineantilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan, zoals hierin beschreven, en farmaceutische preparaten daarvan. Statinen (HMG-CoA-reductaseremmers) kunnen worden 25 gekozen uit de groep bestaande uit Atorvastatin (Lipitor, Pfizer Ine.), Provastatin (Pravachol, Bristol-Myers Squibb), Lovastatin (Mevacor, Merck Inc.), Simvastatin (Zocor, Merck Ine.), Fluvastatin (Lescol, Novartis), Ceri-vastatin (Baycol, Bayer), Rosuvastatin (Crestor, AstraZe-30 neca), Lovostatin en Niacin (Advicor, Kos Pharmaceuticals) , derivaten en combinaties daarvan.

In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt het statine gekozen uit de groep bestaande uit Atovorstatin en Lovastatin, derivaten en combinaties daarvan.

35 Andere agentia die bruikbaar zijn als antitumoragen- tia omvatten Caduet.

106

Voor welke van de werkwijzen ook voor het behandelen van een hyperproliferatieve stoornis of abnormale celgroei zoals hierin beschreven, met gebruikmaking van een combinatie van een P-cadherineantilichaam of 5 antigeenbindend gedeelte met ten minste één bijkomend therapeutisch agens, kan het P-cadherineantilichaam zijn geconjugeerd, of gederivatiseerd, met het bijkomende therapeutische agens. Het ten minste één bijkomende therapeutische agens kan ook afzonderlijk, of op een niet-10 gederivatiseerde of niet-geconjugeerde manier worden toegediend. Wanneer het ten minste één bijkomende therapeutische agens niet is gederivatiseerd of geconjugeerd met het antilichaam, kan het worden toegediend binnen in hetzelfde farmaceutische preparaat als het antilichaam, of kan het 15 in een afzonderlijk preparaat worden toegediend. Gentherapie

De nucleïnezuurmoleculen die coderen voor de antili-chamen en antilichaamgedeelten van de onderhavige uitvinding kunnen via gentherapie worden toegediend aan een pa-20 tiënt die ze nodig heeft. De therapie kan hetzij in vivo, hetzij ex vivo geschieden. In een voorkeursuitvoeringsvorm worden nucleïnezuurmoleculen die coderen voor zowel een zware keten als een lichte keten, aan een patiënt toegediend. In een uitvoeringsvorm die meer voorkeur heeft, 25 worden de nucleïnezuurmoleculen zodanig toegediend dat ze stabiel in chromosomen van B-cellen worden geïntegreerd, omdat deze cellen zijn gespecialiseerd voor het produceren van antilichamen. In een voorkeursuitvoeringsvorm worden voorloper-B-cellen ex vivo getransfecteerd of geïnfecteerd 3 0 en opnieuw in een patiënt getransplanteerd die ze nodig heeft. In een andere uitvoeringsvorm worden voorloper-B-cellen of andere cellen in vivo geïnfecteerd met gebruikmaking van een virus waarvan het bekend is dat het het celtype van belang infecteert. Kenmerkende vectoren die 35 worden gebruikt voor gentherapie omvatten liposomen, plas-miden en virale vectoren. Kenschetsende virale vectoren zijn retrovirussen, adenovirussen en adeno-geassocieerde 107 virussen. Na hetzij in vivo, hetzij ex vivo infectie kunnen niveaus van antilichaamexpressie worden gecontroleerd door middel van het nemen van een monster uit de behandelde patiënt en met gebruikmaking van een 5 willekeurige immunobepaling die in de techniek bekend is of die hierin wordt besproken.

In een voorkeursuitvoeringsvorm omvat de gentherapie-werkwijze de stappen van het toedienen van een geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul dat codeert voor de zware keten of 10 een antigeenbindend gedeelte daarvan van een P-cadherineantilichaam, en het tot expressie brengen van het nucleïnezuurmolecuul. In een andere uitvoeringsvorm omvat de gentherapiewerkwijze de stappen van het toedienen van een geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul dat codeert voor de 15 lichte keten of een antigeenbindend gedeelte daarvan van een P-cadherineantilichaam, en het tot expressie brengen van het nucleïnezuurmolecuul. In een werkwijze die meer voorkeur heeft, omvat de gentherapiewerkwijze de stappen van het toedienen van een geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul 20 dat codeert voor de zware keten of een antigeenbindend gedeelte daarvan en een geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul dat codeert voor de lichte keten of het antigeenbindende gedeelte daarvan van een P-cadherineantilichaam van de uitvinding, en het tot expressie brengen van de nucleïnezuur-25 moleculen. De gentherapiewerkwij ze kan ook de stap omvatten van het toedienen van een ander therapeutisch agens, zoals een van de agentia die eerder zijn besproken in verband met combinatietherapie.

Opdat deze uitvinding beter kan worden begrepen, wor-30 den de volgende voorbeelden uiteengezet. Deze voorbeelden zijn alleen voor doeleinden van illustratie en dienen niet te worden opgevat als de omvang van de uitvinding op welke manier ook beperkend.

Voorbeelden 35 In de volgende voorbeelden en preparaten betekent "BSA" bovien serumalbumine; betekent "EDTA" ethyleendiami-netetra-azijnzuur; betekent "DMSO" dimethylsulfoxide; be- 108 tekent "MOPS" 3-(N- morfolino)propaansulfonzuur; betekent "MES" 2-(N-morfolino)ethaansulfonzuur; betekent "PBS" met fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing; betekent "dPBS" Dul-5 becco's met fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing; betekent "HEMA" 2-hydroxyethylmethacrylaat; betekent "DMEM" Dulbecco's gemodificeerd eagle's medium; betekent "FBS" foetaal bovien serum; betekent "NEAA" niet-essentiële aminozuren; betekent "HEPES" N-2-hydroxy-10 ethylpiperazine-N'-2-ethaansulfonzuur; en betekent " DMF" dimethylformamide.

Voorbeeld 1: Het screenen van een scFv-faagdisplay- bibliotheek

Recombinant humaan P-cadherine (R&D Systems 861-PC-15 100) werd gebruikt als het antigeen voor het screenen van een scFv-faagdisplaybibliotheek. Grote bibliotheken van scFv van humane anti lichamen, gekloneerd in een faagmide-vector, werden gebruikt voor de selecties (Vaughan, T.J. et al., Nat. Biotech. 14:309-314 (1996)). ScFv die P-20 cadherine herkenden, werden uit de faagdisplaybibliotheken geïsoleerd in een reeks van herhaalde selectiecycli bij recombinant humaan P-cadherine en confluente monolagen van HCTll6-cellen die P-cadherine tot expressie brengen. In het kort werd gebonden faag, na incubatie met de biblio-25 theek, vanuit P-cadherine gewonnen en werd niet-gebonden faag weggewassen. Gebonden faag werd vervolgens gered zoals beschreven in Vaughan, T.J. et al., Nat. Biotech. 14:309-314 (1996), en het selectieproces werd herhaald.

Een representatief gedeelte van de klonen die afkomstig 30 waren van de opbrengst van de selectieronden, werd onderworpen aan een met enzym verbonden immunoabsorptie-bepaling [enzyme-linked immunosorbent assay] (ELISA) bij de faag om te testen op binding aan P-cadherine, in wezen zoals beschreven in Vaughan, T.J. et al., Nat. Biotech. 35 14:309-314 (1996). Er werden twee verschillende antigenen gebruikt in de ELISA: recombinant humaan P-cadherine (R&D Systems) en confluente monolagen van A43l-cellen die P- 109 cadherlne tot expressie brengen. ELISA-positieve klonen werden onderworpen aan DNA-sequencing, zoals beschreven in Vaughan, T.J. et al., Nat. Biotech. 14:309-314 (1996) en in Osbourn, J.K. et al., Immunotechnology 3:293-5 302 (1998). Unieke ELISA-positieve klonen werden omgezet tot gehele IgG-moleculen en getest op hun vermogen om P-cadherine te neutraliseren in de P-cadherineafhankelijke adhesie-bepaling die wordt beschreven in Voorbeeld 4. Gebaseerd op de resultaten van deze screening werd het anti-, 10 lichaam 129-lc4 (IC50 van 1-3 μΜ in de A431- adhesiebepaling) gekozen als de leidraadmoederafkomst voor verdere optimalisering.

Voorbeeld 2: Leidraadoptimalisering

Faagdisplaybibliotheken die zijn afgeleid van 129-lc4 15 werden gecreëerd door middel van oligonucleotidegerichte mutagenese van CDR3-gebieden van de variabele zware (VH) en variabele lichte (VL) keten van het antilichaam. De bibliotheken werden geconstrueerd met gebruikmaking van standaardtechnieken van de moleculaire biologie zoals be-20 schreven in Clackson en Lowman, Phage Display - A Practical Approach (Oxford University Press, 2004). Er werden op affiniteit gebaseerde selecties uitgevoerd waardoor, na incubatie met de bibliotheek, het recombinante humane P-cadherine (R&D Systems) werd gevangen door met eiwit G ge-25 coate paramagnetische kralen (Dynal 100.03), en gebonden faag werd gewonnen door middel van magnetische scheiding terwijl niet-gebonden complexen werden weggewassen. Het selectieproces werd herhaald met afnemende concentraties recombinant humaan P-cadherine (25 nM tot 10 pM in 4 ron-30 den) dat aanwezig was tijdens de selectie. Bovendien werden selectieopbrengsten uit de VH-CDR3- en VL-CDR3-bibliotheken gerecombineerd tot verdere faagdisplaybibliotheken en geselecteerd in nog twee ronden van op affiniteit gebaseerde selectie. Representatieve gedeelten van de 35 klonen die afkomstig waren van de opbrengsten van de selectieronden werden onderworpen aan screening als scFv in 110 de 129-1π4- epitoopcompetitiebepaling, zoals beschreven in Voorbeeld 8.

Voorbeeld 3: P-cadherineafhankelijke adhesie-bepaling

Het volgende protocol werd gebruikt voor het bepalen 5 van ICB0-waarden in een P-cadherineafhankelijke adhesie-bepaling met gebruikmaking van verscheidene geoptimaliseerde scFv's die werden omgezet tot IgG tijdens de opti-maliseringsfase van antilichaamontdekking, zoals boven beschreven in Voorbeeld 2. De gemiddelde gemeten IC50-waarden 10 voor deze antilichamen worden beneden in Tabel 4 vertoond.

Recombinant humaan P-cadherine-Fc (R&D-cat. 861-PC) werd 24 uur voorafgaand aan gebruik met 2 mM CaCl2 in Mil-liQ-water weer in zijn normale staat gebracht tot een concentratie van 1 mg/ml, en bij 4°C bewaard. A431-cellen 15 werden gekweekt en als volgt bereid. A431-cellen (ECACC-nr. 85090402) werden routineus gekweekt in Nunc-drievoudige kweekflessen (oppervlakte van 3 x 175 cm2) in minimaal essentieel medium (MEM) (Invitrogen-cat. 31095), bevattende 10% foetaal bovien serum (Invitrogen-cat. 20 10100-147) en 1% niet-essentiële aminozuren (Invitrogen- cat. 11140-035). De gekweekte cellen waren ongeveer 80% confluent op het moment van de oogst voor gebruik in de bepaling. Om te beschermen tegen mogelijke aan passage gerelateerde effecten, werden de cellen routineus gebruikt 25 tussen passage 4 en 8, en geoogst na hetzij 48, hetzij 72 uur kweek. A431-cellen werden geoogst met 0,25% trypsine/l mM EDTA (Gibco-cat. 25200-056) gedurende een tijd die voor de cellen precies genoeg was om te scheiden (7-10 min), en vervolgens onmiddellijk verdund in weefselkweekmedia tot 30 een dichtheid van ongeveer 2 x 106 cellen/ml. De A431-cellen werden vervolgens gecentrifugeerd (1200 rpm), gere-suspendeerd in bepalingsbuffer (Hanks' uitgebalanceerde zoutoplossing (zonder Mg2+ en Ca2+, zonder fenolrood) (Invitrogen-cat. 14175-053), aangevuld tot een eind-CaCl2-35 concentratie van 1 mM), gerecentrifugeerd en geresuspen-deerd in bepalingsbuffer, opnieuw bij een einddichtheid van 2 x 106 cellen/ml.

Ill

De bereiding van serieverdunningen van

IgG en de preincubatie met A431-cellen werd als volgt uitgevoerd. 180 μΐ van ieder test-IgG, of gedeelte daarvan, werd aangevuld met 20 μΐ bepalingsbuffer dat 10% BSA (Sig-5 ma-cat. A-9576) bevatte, waardoor de BSA-concentratie werd genormaliseerd naar 1%. Een anti-muizen-/humaan P-cadherine-referentie-polyklonaal antilichaam (R&D-cat. AF-761) werd aanvankelijk geresuspendeerd in MilliQ-water, waardoor een voorraad van 1 mg/ml werd opgeleverd. 40 μΐ 10 van deze voorraadoplossing werd vervolgens verder verdund in 140 μΐ bepalingsbuf f er. 20 μΐ bepalingsbuf f er dat 10% BSA bevatte, werd vervolgens toegevoegd, waardoor 200 μΐ bij 0,2 mg/ml antilichaam en 0,1% BSA werd opgeleverd. Er werden serieverdunningen in duplo bereid door middel van 15 het eerst toevoegen van 2 x 90 μΐ AF-761-polyklonaal antilichaam of test-IgG aan kolom 1 van een Greiner--verdunningsplaat van polypropyleen met 96 putjes (Greiner-cat. 780271) . 60 μΐ bepalingsbuffer werd vervolgens toegevoegd aan kolommen 2-11. Een verdunning van 30 μΐ in 60 μΐ 20 (1:3) werd vervolgens over de plaat bereid van links naar rechts van kolommen 1-11. 60 μΐ bepalingsbuffer alléén werd vervolgens toegevoegd aan putjes 12 A-D voor het definiëren van de maximale adhesie. Minimale adhesie werd gedefinieerd aan de hand van de toevoeging van 60 μΐ 25 mM 25 EDTA (in bepalingsbuf f er) aan putjes 12 E-H. 60 μΐ A431-celsuspensie (2 x 106 cellen/ml in bepalingsbuf f er - bereid zoals boven geschetst) werd vervolgens toegevoegd aan alle putjes, en na beweging werden de platen gedurende 1 h bij 37°C gepreïncubeerd.

30 Parallel met de bereiding van serieverdunningen van test-IgG en preincubatie met A431-cellen, werden met P-cadherine gecoate bepalingsplaten als volgt bereid. Recombinant humaan P-cadherine-Fc werd in coatingsbuffer (PBS zonder Mg2+ en Ca2+ - Invitrogen-cat. 14190-094) verdund tot 35 een concentratie van 10 pg/ml, en verspreid op Fluoronunc-bepalingsplaten met 96 putjes (Nunc-cat. 437958) (100 μΐ/putje). De platen werden vervolgens gedurende 1 h en 30 j.iz min bij kamertemperatuur geïncubeerd. De platen werden vervolgens 3 keer gewassen met PBS met gebruikmaking van een Tecan 96-plaatwasser. 200 μΐ/putje bepalings-buffer werd vervolgens toegevoegd voor het blokkeren en de 5 platen werden gedurende een bijkomend 1 h bij kamertemperatuur geincubeerd. De platen werden vervolgens 3 keer gewassen met PBS, zoals eerder beschreven.

100 μΐ/putje van het gepreïncubeerde IgG/A431-materiaal werd vervolgens van de Greiner-verdunningsplaten 10 met 96 putjes overgebracht naar de met P-cadherine gecoate bepalingsplaten. Op het moment van de overbrenging werd het IgG/A431-materiaal gemengd door middel van pipetteren, om te garanderen dat de cellen homogeen waren. Men liet het adhesieproces vervolgens plaatsvinden door middel van 15 het gedurende 30-45 minuten bij 37°C incuberen van de bepalingsplaten. Aan het einde van de incubatie werden niet-hechtende cellen verwijderd door middel van het voorzichtig van de platen opzuigen van de media en het opnieuw vullen van de putjes met celwasbuffer (Hanks' uitgebalan-2 0 ceerde zoutoplossing (zonder Mg2+ en Ca2+ en zonder fenol-rood - Invitrogen-cat. 14175-053), aangevuld tot een eind- concentratie van 1 mM CaCl2) . De platen werden vervolgens gedurende 15 min in een bad van celwasbuffer omgekeerd om overgebleven niet-hechtende cellen te verwijderen. Aan het 25 einde van deze incubatie werd de inhoud van de putjes voorzichtig opgezogen.

De kwantificering van hechtende cellen werd als volgt uitgevoerd. Hechtende cellen werden gedetecteerd door middel van de toevoeging van 100 μΐ/putje van gecombineerd 30 lysis-/alkalische fosfatase-detectiereagens (diethanolami-nesubstraatbuffer, 5X-concentraat (Pierce-cat. 34064), 1:5 verdund met water, waarna één PNPP-tablet van 15 mg (Sig-ma-cat. N-2640) werd opgelost per 25 ml lX-oplossing), gevolgd door incubatie gedurende 30-60 min bij 37°C. De re-35 actie werd vervolgens stopgezet door middel van de toevoeging van 1 M NaOH (50 μΐ/putje), daarbij trachtend om een maximale OD-waarde van ongeveer 0,8 in de afwezigheid van 113 inhibitie voort te brengen. De absorptie bij 405 nm werd vervolgens gemeten met gebruikmaking van een standaardplaat lezer .

De resultaten werden vervolgens als volgt geanaly-5 seerd. Terwijl kolom 12, putjes A-D als 100% adhesie en kolom 12, putjes E-H als 0% adhesie werden genomen, werden de ruwe data als volgt eerst omgezet tot % adhesie-waarden: % adhesie = {(waarde-min adhesie)/(max-min adhesie)}*100 10 Het % adhesie versus de concentratie IgG-remmer werd vervolgens uitgezet en de ICS0-waarden werden bepaald met gebruikmaking van Prism-software. Daar waar gedeeltelijke inhibitie werd waargenomen, wordt de IC50 aangehaald als de concentratie IgG die een ware 50% inhibitie geeft, onder-15 scheiden van het midden van de kromme. IC50-waarden worden gerapporteerd in Tabel 4.

Tabel 4 2 0 __

IgG A431-adhesiebepaling, __gemiddelde ICS0 (nM) (n=3) 194- e06__0,162_ 194 -a02__0,217_ 194 -b09__0,229_ 195- ell__0,114_ 194-g09__0,158_ 196- h02___0,148_ 194- eQl__0,147_ _196-dlO__0,080_ 196-g03__0,149_ 196-e06__0,117 _ 195- a09__0,114_ 198-a09__0,097_ 200-h06 _0,168_ 1X4

Twee afzonderlijke A431-adhesiebepalingen werden uitgevoerd om verscheidene gekiemlijnde, geoptimaliseerde

IgG's, afkomstig van de l29-lc4-afkomst, te onderzoeken, 5 in vergelijking met hun niet-gekiemlijnde equivalenten. Voor deze experimenten was het noodzakelijk om over te stappen op een nieuwe batch P-cadherine (CFR-134041) , die geassocieerd blijkt te zijn met enigszins verhoogde leswaarden, vergeleken met andere data. Gemiddelde data voor 10 verscheidene gekiemlijnde IgG's uit de twee experimenten worden vertoond in Tabel 5. Zoals eerder opgemerkt, verwijst g-194-b09 naar de gekiemlijnde versie van 194-b09, enzovoorts.

15

Tabel 5

IgO A431-adhesiebepaling, __gemiddelde IC50 (nM) (n=2) g-194 -b09__0,77_ 194-b09__2,10_ g-194 -g09__1,00_ 194-g09__0,73_ g-196 -g03__1,05_ 196 -g03 0,39_ g-194-e06__0,77_ 194- e06__0,46_ g-195-ell__ 0,87_ 195- ell__0,97 _ g-200-h06__ 1,31_ 200 -h06 0,63_ 20 Voorbeeld 4 ;_P-cadherineafhankelijke celaggregatie- bepaling

Het volgende protocol werd gebruikt voor het bepalen van IC50-waarden in een P-cadherineafhankelijke aggregatie- 115 bepaling met gebruikmaking van verscheidene geoptimaliseerde scFv's die werden omgezet tot IgG tijdens de opti-maliseringsfase van antilichaamontdekking, zoals boven beschreven in Voorbeeld 2. Omdat P-cadherine tot overexpres-5 sie brengende cellijnen hechte muiticellulaire aggregaten vormen, wanneer in suspensiekweek geplaatst, kan celaggre-gatie worden gemeten in de aanwezigheid van P-cadherine-antilichamen die cellulaire aggregatie verstoren. De gemiddelde gemeten IC50-waarden voor verscheidene antilicha-10 men worden beneden in Tabel 6 vertoond.

De plaatbereiding werd als volgt uitgevoerd. Iedere bepalingsplaat met 96 putjes werd gecoat met 50 μΐ polyHEMA (12 mg/ml in 90% ethanol, 10% methanol) en vervolgens gedurende 6 h tot overnacht uitgedampt, gevolgd 15 door wassen met 3 x 100 μΐ steriel H20 vóór gebruik. Cellen werden vervolgens als volgt gekweekt. Cellen die afkomstig zijn van de humane cellijn SW480 (stabiel P-cadherine G418r tot expressie brengend) werden doorgezet in volledig groeimedium (qs DMEM (inVitrogen 11995-065), 20 10% FBS (Omega Scientific FB-02), 1:100 NEAA (InVitrogen 11140-050), 1:100 natriumpyruvaat (InVitrogen 11360-070), 1:100 glutamine (InVitrogen 25030-051), 1:100 penicilli-ne/streptolysine (InVitrogen 15070-063), 1:100, geneticine 50 mg/ml (Invitrogen 10131-035)) + G418 (500 μg/ml) , ver- 25 volgens tweemaal per week 1:3-4 gescheiden. Kweken werden vervolgens ingevroren in groeimedium + 10% DMSO.

Op Dag 1 werden de SW480:pCAD-cellen en de controle SW4 8 0:pCLNX (controlevector stabiel) geënt bij 5 x 106 cellen/schaal van 100 mm, bij een verdunning van niet meer 30 dan 1:3. Men liet de cellen vervolgens gedurende 48 uur in kweek groeien. Iedere schaal van 100 mm verschafte ongeveer 10 x 106 cellen, of genoeg voor 2 x platen met 96 putjes.

Op Dag 3 werd het medium verwijderd, gevolgd door 35 wassen met dPBS (Dulbecco's PBS (InVitrogen 14040-133)), waarna de cellen werden getrypsiniseerd in 3 ml/schaal van 100 mm. Neutralisatie werd vervolgens uitgevoerd na vrij- 116 geving met twee volumes (6 ml) volledig groeimedium. De plaat werd vervolgens drie keer gewassen met gebruikmaking van een pipet met 10 ml, waardoor de clusters werden ontwricht. Cellen werden vervolgens geteld en een pellet 5 werd verkregen met gebruikmaking van een Beckman-centrifuge bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. Het medium werd vervolgens opgezogen, de pellet eerst geresuspendeerd in < 1 ml volledig groeimedium door middel van wervelen met de vingers, vervolgens met een plOOO-pipet, vervolgens 10 werd de celconcentratie genormaliseerd naar 1,3 M/ml. Dispersie van enkelvoudige cel werd verzekerd aan de hand van microscopie.

Er werd vervolgens een reagensplaat bereid door middel van het gedurende 3 0 min blokkeren van een plaat met 15 96 putjes met dPBS en 5% FBS. De plaat werd vervolgens ge wassen met gebruikmaking van 1 x 100 μΐ dPBS, gevolgd door opzuiging en aantikken om te drogen. Een verdunningsreeks van test-IgG werd bereid met dPBS, met gebruikmaking van 4x [IgG]-concentratie, genoeg voor 3 putjes van de behan-20 delingsplaat in één putje van het 96-putje. 40.000 cellen in 30 μΐ/putje werden overgebracht naar een gewassen, met poly-HEMA gecoate Costar3590-niet-weefselkweekplaat met 96 putjes (Corning 3590). 10 μΐ reagens werd vervolgens over-gebracht naar ieder putje van de plaat met 96 putjes. Er 25 werden per behandeling monsters in triplo ten uitvoer gebracht met gebruikmaking van een pipet met 8 kanalen. Incubatie vond vervolgens plaats bij 250 rpm, geschud, overnacht (16-18 h) in een bevochtigde incubator van 37°C, 5% C02.

3 0 Op dag 4 werd 4 0 μΐ van de geschudde cellen overge

bracht naar een met polylysine gecoate plaat met 96 putjes (BioCoat-met polylysine gecoate plaat met 96 putjes: BD

356516). De putjes werden vervolgens gespoeld met 60 μΐ volledig groeimedium, de plaat werd geschud door middel 35 van tikken, en overgebracht naar de met polylysine gecoate plaat. Indien noodzakelijk werd een bijkomende was van 50 μΐ uitgevoerd. Incubatie volgde gedurende 60 minuten in 117 een bevochtigde incubator van 37°C, 5% C02. Er werd bij deze stap opgelet dat al de cellen kwantitatief werden overgebracht, zo voorzichtig mogelijk, zonder bovenmatig pipetteren. Cellen werden vervolgens gefixeerd door middel 5 van het toevoegen van 100 μΐ fixeeroplossing (7,4% formaldehyde (37% wt/vol. - Sigma F15587) ) in een zuurkast, gevolgd door incubatie gedurende > 30 minuten bij kamertemperatuur .

Om de cellen te wassen, werd de vloeistof vervolgens 10 overgegoten in een verzamelbekerglas of schaal en aangetikt om overblijvende vloeistof te verwijderen, en voorzichtig op een tissue getikt. 100 μΐ dPBS per putje werd vervolgens aangebracht om te wassen, gevolgd door incubatie gedurende 15 min. De cellen werden vervolgens gekleurd 15 door middel van overgieten zoals bovengenoemd en het aanbrengen van 100 μΐ Hoechst (1 μg/ml Hoechst in dPBS - Hoechst 10 mg/ml, Molecular Probes 33342), gevolgd door incubatie gedurende 30 min. De cellen werden vervolgens tweemaal gewassen, daarbij de overblijvende 100 μΐ dPBS in 20 het putje achterlatend voor microscopie.

Het aantal geaggregeerde objecten per putje werd vervolgens gemeten (Cellomics) en een gemiddelde objecttelling (met test-IgG) werd vergeleken met die van IgG (bv. Gt-anti-P-cadherin, R&D Systems AF761) of medium alléén-25 controle. De objecttelling versus de concentratie IgG-remmer werd vervolgens uitgezet en de IC50-waarden werden bepaald. De IC50-waarden voor verscheidene antilichamen van de onderhavige uitvinding worden gerapporteerd in Tabel 6.

30

Tabel 6

IgG SW48 0-aggregatiebepaling, __gemiddelde IC5B (nM)_ 194-eOg__0/7_ 194-a02__ 1^1_ g-194 -b09 0_^9_ iiö g-195-ell__2,2 g-194 -g09__2/S_ 196-h02__3/2_ 194- eOl__1/5_ 196-dlO__1^5_ g-196-g03__0_j_9_ 196-e06__1^9_ 195- a09__1/7_ 198 -a09__2_j_9__ g-200 -h06__4/7_ 129-1C4 35_

Voorbeeld 5; P-cadherineafhankelijke sferoldeontwrichting-bepalinq 5 De volgende sferoïdeontwrichtingbepaling is een vari atie van de aggregatiebepaling (beschreven in Voorbeeld 4) waarbij de celaggregaten overnacht worden gevormd, voorafgaand aan de toevoeging van P-cadherine- en controleanti-lichamen. Testreagentia worden vervolgens toegevoegd gedu-10 rende een bijkomende 24 uur vóór de analyse.

De plaatbereiding werd op de volgende manier uitgevoerd. Iedere bepalingsplaat met 96 putjes werd gecoat met 50 μΐ polyHEMA (12 mg/ml in 90% ethanol, 10% methanol) en vervolgens gedurende 6 h tot overnacht uitgedampt, gevolgd 15 door wassen met 3 x 100 μΐ steriel H20 vóór gebruik. Cellen werden vervolgens als volgt gekweekt. Cellen die afkomstig zijn van de humane cellijn SW480 (stabiel P-cadherine G418r tot expressie brengend) werden doorgezet in volledig groeimedium (qs DMEM (InVitrogen 11995-065), 20 10% FBS (Omega Scientific FB-02), 1:100 NEAA (InVitrogen 11140-050), 1:100 natriumpyruvaat (InVitrogen 11360-070), 1:100 glutamine (InVitrogen 25030-051), 1:100 penicilli-ne/streptolysine (InVitrogen 15070-063), 1:100, geneticine 50 mg/ml (Invitrogen 10131-035)) + G418 (500 μg/ml), ver- 25 volgens tweemaal per week 1:3-4 gescheiden. Kweken werden vervolgens ingevroren in groeimedium + 10% DMSO.

119

Op Dag 1 werden de SW480 :pCAD-cellen en de controle SW480:pCLNX (controlevector stabiel) geënt bij 5 x 106 cellen/schaal van 100 mm, bij een verdunning van niet meer dan 1:3. Men liet de cellen vervolgens gedurende 5 48 uur in kweek groeien. Iedere schaal van 100 mm ver schafte ongeveer 10 x 106 cellen, of genoeg voor 2 x platen met 96 putjes.

Op Dag 3 werd het medium verwijderd, gevolgd door wassen met dPBS (Dulbecco's PBS (InVitrogen 14040-133)), 10 waarna de cellen werden getrypsiniseerd in 3 ml/schaal van 100 mm. Neutralisatie werd vervolgens uitgevoerd na vrij-geving met twee volumes (6 ml) volledig groeimedium. De plaat werd vervolgens drie keer gewassen met gebruikmaking van een pipet met 10 ml, waardoor de clusters werden ont-15 wricht. Cellen werden vervolgens geteld en een pellet werd verkregen met gebruikmaking van een Beckman-centrifuge bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. Het medium werd vervolgens opgezogen, de pellet eerst geresuspendeerd in < 1 ml volledig groeimedium door middel van wervelen met de vingers, 20 vervolgens met een plOOO-pipet, vervolgens werd de celcon-centratie genormaliseerd naar 1,0 x 106/ml. Dispersie van enkelvoudige cel werd verzekerd aan de hand van micrösco-pie.

40.000 cellen in 40 μΐ/putje werden overgebracht naar 25 een gewassen, met poly-HEMA gecoate Costar3590-niet-weefselkweekplaat met 96 putjes (Corning 3590). Incubatie vond vervolgens plaats bij 250 rpm, geschud, overnacht (16-18 h) in een bevochtigde incubator van 37°C, 5% COz.

Op dag 4 werd vervolgens een reagensplaat bereid door 30 middel van het gedurende 3 0 min blokkeren van een plaat met 96 putjes met dPBS en 5% FBS. De plaat werd vervolgens gewassen met gebruikmaking van 1 x 100 μΐ dPBS, gevolgd door opzuiging en aantikken om te drogen. Een verdunnings-reeks van test-IgG werd bereid met dPBS, met gebruikmaking 35 van 5x [IgG]-concentratie, genoeg voor 3 putjes van de behandel ingsplaat in één putje van de plaat met 96 putjes. 10 μΐ reagens werd vervolgens overgebracht naar ieder'put- 120 je van de plaat met 96 putjes. Er werden per behandeling monsters in triplo ten uitvoer gebracht met gebruikmaking van een pipet met 8 kanalen. Incubatie vond vervolgens plaats bij 250 rpm, geschud, in een bevochtigde 5 incubator van 37°C, 5% C02 (20-24 h) .

Op dag 5 werd 50 μΐ van de geschudde cellen overgebracht naar een met polylysine gecoate plaat met 96 putjes (BioCoat-met polylysine gecoate plaat met 96 putjes: BD

356516). De putjes werden vervolgens gespoeld met 50 μΐ 10 volledig groeimedium, de plaat werd geschud door middel van tikken, en overgebracht naar de met polylysine gecoate plaat. Indien noodzakelijk werd een bijkomende was van 50 μΐ uitgevoerd. Incubatie volgde gedurende 60 minuten in een bevochtigde incubator van 37°C, 5% C02. Er werd bij de-15 ze stap opgelet dat al de cellen kwantitatief werden overgebracht, zo voorzichtig mogelijk, zonder bovenmatig pi-petteren. Cellen werden vervolgens gefixeerd door middel van het toevoegen van 100 μΐ fixeeroplossing (7,4% formaldehyde (37% wt/vol. - Sigma F15587) ) in een zuurkast, ge-20 volgd door incubatie gedurende > 30 minuten bij kamertemperatuur.

Om de cellen te wassen, werd de vloeistof vervolgens overgegoten in een verzamelbekerglas of schaal en aangetikt om overblijvende vloeistof te verwijderen, en voor-25 zichtig op een tissue getikt. 100 μΐ dPBS per putje werd vervolgens aangebracht om te wassen, gevolgd door incubatie gedurende 15 min. De cellen werden vervolgens gekleurd door middel van overgieten zoals bovengenoemd en het'aanbrengen van 100 μΐ Hoechst (1 μg/ml Hoechst in dPBS 30 - Hoechst 10 mg/ml, Molecular Probes 33342), gevolgd door incubatie gedurende 30 min. De cellen werden vervolgens tweemaal gewassen, daarbij de overblijvende 100 μΐ dPBS in het putje achterlatend voor microscopie. Het aantal geaggregeerde objecten per putje werd vervolgens gemeten (Cel-35 lomics) en een gemiddelde objecttelling (met test-igG) werd vergeleken met die van IgG (bv. Gt-anti-P-cadherin, RScD Systems AF761) of medium alléén-controle. De object- 121 telling versus de concentratie IgG-remmer kan worden uitgezet voor het bepalen van de ICS0-waarden. Alternatief werd de objecttelling uitgedrukt als -voudige ontwrichting vs. controle bij één gedefinieerde concentra-5 tie, zoals vertoond in Tabel 7.

122

Tabel 7

IgG SW480-sferoïdeontwrichtingbepaling, -voudig toegenomen ontwrichting vs.

__controle bij 5 nM_ 194 -e06__10_ 194 -a02__10_ g-194 -b09__ 10_ g-195-ell___7_, g-194 -g09__14_ 196-h02__10_ 194- eQl__16_ 196-dlO__ 10_ g-196 -g03__ 13_ 196-e06__ 10_ 195- a09__10_ 198-a09__13_ g-200 -h06__7_ 129-lc4 _4_ 5 Voorbeeld 6: Meting van Kn en Kaf van P-cadherine- antilichamen

Af f initeitsmaten (Κβ en Kaf) van P-cadherine- antilichamen van scFv-enkelvoudige keten aan de hand van oppervlakteplasmonresonantie met gebruikmaking van het 10 BIACORE™ 3000-instrument, werden als volgt ten uitvoer gebracht met gebruikmaking van de protocollen van de fabrikant .

Om kinetische analyses uit te voeren, werden recombinant humaan P-cadherine/Fc-fusie-eiwit (hCad/Fc) en mui-15 zen-P-cadherine/Fc-fusie-eiwit (mCad/Fc) geïmmobiliseerd in afzonderlijke stromingscellen van een CM5 BIACORE™-sensorchip met gebruikmaking van routineuze aminekoppe-ling. Oppervlakken werden bereid met gebruikmaking van 10 mM acetaatbuffer, pH 4,5 met 2,0 mM CaCl2 als de immobili-20 satiebuffer, en eiwitdichtheden van 5800 en 1600 RU werden 123 bereikt voor respec- tievelijk de hCad/Fc- en mCad/Fc-fusie-eiwitten. Deactivering van N- hydroxysuccinimide-esters die niet hadden gereageerd, werd uitgevoerd met gebruikmaking van 1 M ethanolaminewater-5 stofchloride, pH 8,5. Een geactiveerd/gedeactiveerd blanco oppervlak werd gebruikt als een controleoppervlak. ScFv-antilichaammonsters in loopbuffer werden bereid bij concentraties die varieerden van 200 tot 0,78 nM (een oplossing van 0 nM die alléén loopbuffer omvatte, werd inbegre-10 pen als een nul-referentie) . De monsters werden willekeu-rig gemaakt en in triplo gedurende 1 minuut ieder door de stromingscellen heen geïnjecteerd met gebruikmaking van HBS-P (10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,005% Surfactant P20) met 2,0 mM CaCl2 als loopbuffer. Een stromingssnel-15 heid van 25 μΐ/min werd gebruikt voor het bepalen van af-finiteitsconstanten. De dissociatie van het antilichaam werd gedurende 5 minuten gecontroleerd, het oppervlak werd geregenereerd door middel van een injectie van 12 seconden van 10 mM glycine-HCl, pH 1,5 (25 μΐ/min) . De ruwe data 20 werden bewerkt met gebruikmaking van het Scrubber (©BioLo-gic Software)-softwarepakket en geanalyseerd met gebruikmaking van het CLAMP (©BioLogic Software)-softwarepakket. De data werden globaal passend gemaakt voor een eenvoudig 1:1-Langmuir-bindingsmodel.

25 Tabel 8 vermeldt affiniteitsconstanten voor de anti- P-cadherineantilichamen van enkelvoudige keten van de onderhavige uitvinding: 30 Tabel 8 scFv hCad/Fc, KB tiCad./Fc, Kaf mCad/Fc, Κ„ mCad/Fc, Kat __(nM)__(1/s)__(nM)__(1/s) 194 -b0 9__4JD__1,9 x 10~°3__11__3,6 X 10 3 194-g09__2^6__1,6 x 10 03__1_J3__8,1 x 10'4 196-g03 1,1__7,0 x IQ 04__0,76__4,7 X 10 * 124

Voorbeeld 7: Het bepalen van de selectiviteit van P- cadherineantilichamen

Het volgende protocol werd gebruikt voor het bepalen 5 van de selectiviteit van verschillende antilichamen , voor P-cadherine boven E-cadherine.

Recombinant humaan P-cadherine (R&D Systems 861-PC-100) en recombinant humaan E-cadherine (R&D Systems 648-EC-100) werden bij 1 μg/ml in PBS + 0,5 mM CaCl2 gecoat op 10 putjes van Exiqon-eiwitimmobilisatorplaten (VWR International) . Monster-IgG1s werden gedurende 1 uur geblokkeerd in 3% Marvel/PBS + 0,5 mM CaCl2 alvorens te worden getitreerd van 5 0 nM (7,5 μg/ml) tot 0,64 nM (0,09.6 μg/ml) , en in duplo toegevoegd aan putjes die waren gecoat met de twee 15 verschillende antigenen. Na overnacht equilibreren bij 4°C, werden de platen drie keer gewassen met lx PBS/0,1% Tween + 0,5 mM CaCl2, vervolgens drie keer met 1 x PBS + 0,5 mM CaCl2. 50 μΐ anti-humaan-Fab-peroxidaseconjugaat, 1:5000 verdund in 3% Marvel/PBS + 0,5 mM CaCl2, werd ver- 2 0 volgens aan ieder putje toegevoegd en men liet het gedu rende 1 uur bij kamertemperatuur equilibreren. De platen werden drie keer gewassen met 1 x PBS/0,1% Tween + 0,5 mM CaCl2 en drie keer met 1 x PBS + 0,5 mM CaCl2. 50 μΐ 3,3 1 , 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB; Sigma) werd aan ieder 25 putje toegevoegd en men liet reacties zich gedurende 20 minuten ontwikkelen, alvorens ze werden stopgezet door middel van de toevoeging van 25 μΐ/putje 0,5 M H2S04. Na het lezen van de absorptiewaarden bij 450 nm, werden de data geanalyseerd met gebruikmaking van Graphpad Prism- 3 0 software voor het berekenen van relatieve I^-waarden voor ieder antilichaam wat betreft binding aan P-cadherine en E-cadherine. De resulterende data worden in Tabel 9 samengevat .

35 125

Tabel 9

IgG P-cadherine, E-cadherine, KD (E)/KD/(P) __K„ (pM)__K„ (pM)___ 194 -a02__116__682__6_ g-194 -b09__788__2156__3_ g-194 -g09__2602__Geen binding__> 100_ 194-eOl__112__20511__183_ g-194-e06__191__794_ 4_ 195 -a09__120__11516____96_ 194 -e06__56__264__5_ 196-dlO___45_ 63__1^4_ 196 -e06__62__187__3_ g-196-g03__449__7513__17_ 196-h02__102__33212__326_ 198 -a09__78__19396__249_ 5 Voorbeeld 8: Epitoopcompetitiebepaling

Het volgende protocol werd gebruikt voor het meten van IC50-waarden in een epitoopcompet itiebepaling voor het meten van het vermogen van alternatieve scFv's binnen in een moederafkomst om het moeder-IgG te verdringen van na-10 tief P-cadherine op het oppervlak van A431-cellen. De hoeveelheid gebonden gebiotinyleerd moeder-IgG in de aanwezigheid van remmend scFv wordt gedetecteerd met europium-streptavidine en DELFIA-kwantificering. De gemeten leswaarden voor verscheidene scFv's worden vertoond in Tabel 15 10 .

A431-cellen (ECACC-nr. 85090402), gekweekt volgens standaardwerkwijzen, vervolgens geoogst bij ongeveer 80% confluentie, werden bij 2,5 x 104 cellen per putje op de dag voorafgaand aan gebruik geënt in met collageen gecoate 20 Beckton Dickenson (BD-cat. 6407)-platen met 96 putjes. De platen werden vervolgens 3 keer gewassen door middel van onderdompeling in een PBS-buffer (Gibco-cat. 14190-094, zonder calcium, magnesium en natriumbicarbonaat)- 126 reservoir, vóór toevoeging van 200 μΐ per putje blokbuffer (PBS, Gibco-cat. 14190-094, plus 3% Marvel (Premier International Foods Ltd.)), en gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. De platen werden vervol-5 gens 3 keer gewassen met PBS zoals bovengenoemd.

Voor zowel screening met hoge doorvoercapaciteit als het geven van een karakterschets van de IC50, werden scFv/IgG-materialen eerst bereid in Greiner-verdunningsplaten (Greiner-polypropyleen platen met 96 10 putjes (Greiner-cat. 780271)) in een totaal volume van 60 μΐ bepalingsbuffer. Vervolgens werd 50 μΐ direct overgebracht van de neven-Greiner-plaat op de bepalingsplaat, en men liet de bindingsreactie gedurende 2 h en 30 min bij kamertemperatuur plaatsvinden. Aan het einde van de bin-15 dingsreactie werden de platen 3 keer gewassen in PBS, vóór de toevoeging van met europium gemerkt streptavidine (Perkin Elmer-cat. 1244-360, verdunning van 1:1000 in DELFIA-bepalingsbuffer (Perkin Elmer-cat. 4002-0010)), en gedurende een verdere 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd.

20 De platen werden vervolgens 7 keer gewassen met DELFIA-wasbuffer (Perkin Elmer-cat. 4010-0010) door middel van het herhaaldelijk onderdompelen van de platen in een bufferreservoir. Ten slotte werden, na toevoeging van DELFIA-versterker (Perkin Elmer-cat. 4001-0010 - 100 25 μΐ/putje), de platen met gebruikmaking van een standaard-DELFIA-protocol in een compatibele lezer (bv. Wallac of Envision) gelezen.

Greiner-verdunningsplaatopzet - HTS

Omstandigheden voor screening met hoge doorvoercapa-30 citeit [high throughput screening] (HTS) werden verschillend geconfigureerd, afhankelijk van het stadium van de optimalisering. Voor HTS van opbrengsten uit de individuele VH- en VL-keten-optimalisering, werd de eind-[peri-prep] vastgelegd bij 12,5%, zodat het moeder-scFv gedeeltelijke 35 inhibitie opleverde. Voor de latere HTS van opbrengsten uit de VH:VL-recombinatiebibliotheken, werd de eind-peri-prep-concentratie verlaagd tot 1,7%, en onder deze omstan- 127 digheden leverde het VH- geoptimaliseerde maatstaf-scFv (TOP-108-C01) gedeeltelijke inhibitie op. De zodanige optimalisering van peri-prep-concentratie dat het relevante maatstaf-scFv gedeeltelijke inhibitie opleverde, liet 5 een venster bestaan waarin verbeterde klonen kunnen worden geïdentificeerd.

Om deze eind-scFv-peri-prep-concentraties te bereiken, werd de volgende procedure toegepast: i) Met gebruikmaking van een Cybiwell-instrument 10 werd het vereiste volume (zie beneden) peri- prep-monstermateriaal overgebracht van een mon-sterplaat met diepe putjes naar een Greiner-verdunningsplaat in kolommen 1-11.

[Eind-peri-prep] Overbrengingsvolume 15 [12,5%] = 7,5 μΐ [1,7%] = 10,0 μΐ (van 1:10 verdund peri-prep) (1:10 voorverdund peri-prep werd bereid door middel van het overbrengen van 10 μΐ onverdund 20 peri-prep van de monsterplaat in een Greiner- verdunningsplaat die 90 μΐ bepalingsbuffer bevatte (met gebruikmaking van Cybiwell).

ii) Het volume in kolommen 1-11 werd vervolgens aangevuld tot 3 0 μΐ door middel van de toevoeging 25 van een gepast volume bepalingsbuffer.

iii) 30 μΐ bepalingsbuffer werd vervolgens toegevoegd aan kolom 12 (A-D) (totale binding-putjes).

iv) 3 0 μΐ van een overmaat niet-gemerkt moeder-IgG (129-lc4) in bepalingsbuffer werd toegevoegd aan 30 kolom 12 (E-H) voor het definiëren van piet- specifieke binding. Dit werd toegevoegd bij een concentratie van 1000 nM, waardoor een eindcon-centratie van 500 nM werd opgeleverd.

v) Het 129-lc4-IgG werd gebiotinyleerd met gebruik- 35 making van het in water onoplosbare reagens EZ- 1ink-NHS-LC-Biotin (Perbio/Pierce-productnr.

21336). De IgG-oplossing werd aangevuld door 129 middel van het toevoegen van een 1/10* volume 1 M NaHC03 en een 1/10* volume dimethyl-formamide. Het EZ-link-NHS-LC-Biotin-reagens werd opgelost in DMF en vervolgens toegevoegd 5 bij een vijfvoudige molaire overmaat boven IgG, en men liet de reactie gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur plaatsvinden. Het gebiotiny-leerde IgG werd vervolgens gestabiliseerd door middel van de toevoeging van BSA (0,1%) . 30 μΐ 10 gebiotinyleerd moeder-129-lc4-IgG in bepalings- buffer werd vervolgens toegevoegd aan alle putjes, waardoor een eindconcentratie van 1,5 nM in het eindvolume van 60 μΐ werd opgeleverd (i.e. met europium gemerkt IgG toegevoegd bij 2x eind-15 concentratie).

vi) Na het mengen van de Greiner-plaatinhoud door middel van beweging, werd 50 μΐ direct overgebracht naar de bepalingsplaat, en men liet de bindingsreactie gedurende 2 h en 3 0 min bij ka-20 mertemperatuur plaatsvinden (zoals eerder be schreven) .

Greiner-verdunningsplaatopzet - het geven van een karakterschets van de ICS0 i) 30 μΐ/putje bepalingsbuffer werd toegevoegd aan 2 5 kolommen 2-11 en putjes 12A tot 12D in stan daard -Greiner-verdunningsplaten.

ii) 30 μΐ van een overmaat niet-gemerkt 129-lc4- moeder-IgG in bepalingsbuffer werd toegevoegd aan kolom 12 (E-H) voor het definiëren van niet- 30 specifieke binding. Dit dient te worden toege voegd bij een concentratie van 1000 nM, waardoor een eindconcentratie van 500 nM wordt opgeleverd .

iii) Aan kolom 1 werd 2 x 45 μΐ van ieder onverdund 35 scFv-His-prep zodanig toegevoegd dat 4 tweevou dige ll-punts-IC50-titraties konden worden opgezet per bepalingsplaat met 96 putjes. Tweevoudi- 129 ge serieverdunningen van 1:3 werden vervolgens ten uitvoer gebracht door middel van het nemen van 15 μΐ uit kolom 1 en het mengen in kolom 2, gevolgd door het nemen van 15 5 μΐ uit kolom 2 en het mengen in kolom 3, etc. Na het mengen in kolom 11 werd 15 μΐ verwijderd (i.e. waardoor een eindvolume van 30 μΐ overbleef) .

iv) 30 μΐ gebiotinyleerd 129-lc4-moeder-IgG in bepa-10 lingsbuffer werd vervolgens toegevoegd aan alle putjes, waardoor een eindconcentratie van 1,5 nM in het eindvolume van 60 μΐ werd opgeleverd (i.e. met europium gemerkt IgG toegevoegd bij 2x eindconcentratie) .

15 v) Na het mengen van de Greiner-plaatinhoud door middel van beweging, werd 5 0 μΐ vervolgens direct overgebracht naar de bepalingsplaat, en men liet de bindingsreactie gedurende 2 h en 30 min bij kamertemperatuur plaatsvinden, zoals eerder 20 besproken.

Voor HTS werden scPv in een opmaak van 96 putjes als een ruw extract uit het bacteriële periplasma (scFv-peri-prep) in een basisbuffer die MOPS/EDTA/Sorbitol, pH 7,4 (MES, pH 7,4) bevatte, tot expressie gebracht. Voor het 2 5 geven van een karakterschets van de ICS0 werden scFv tot expressie gebracht in een gezuiverde vorm van lagere door-voercapaciteit, met gebruikmaking van het scFv-His-label voor affiniteitzuivering (scFv-His-prep) in een basisbuffer van PBS.

30 Voor zowel HTS- als IC50-analyse werden de ruwe data eerst omgezet tot % binding-data, volgens de volgende vergelijking : % binding = {(waarde-niet-specifieke binding)/(totale binding-niet-specifieke binding)}*100 35 HTS-data werden vervolgens verder geanalyseerd met gebruikmaking van standaard-Excel-sjablonen voor het identificeren van treffers die een grotere inhibitie opleveren 130 (lager % binding) dan het relevante maatstaf-scFv. Voor IC50-analyse werden % binding-data geanalyseerd met gebruikmaking van Prism-versie 4.0-software voor het passend maken van de kromme. De scFv's zijn varianten van het 5 129-lc4-moeder-IgG, waarbij de VH- en V^-CDRS-gebieden willekeurig werden gemuteerd, zoals beschreven in Voorbeeld 2. VH-CDR3-variantsequenties worden in Figuur 1 vertoond als SEQ ID NO's: 91 tot 256. VL-CDR3-variantsequenties worden in Figuur 1 vertoond als SEQ ID NO's: 257 tot 319. 10 De IC50-waarden voor verscheidene scFv's die verbeterde binding boven het moeder-129-lc4-IgG vertoonden, worden vertoond in Tabel 10. Ieder van de scFv-varianten van de 129-lc4-moeder wordt geïdentificeerd aan de hand van twee SEQ ID NO's: een VH-CDR3 en een VL-CDR3. Voor referentie 15 was de ICS0 van het moeder-l29-lc4-IgG 108,3 nM.

Tabel 10 131 SEQ ID NOs Va-CDR3 SEQ ID NO: VL-CDR3 ICS0 (nM) 37 40 ÏF~49 37 261 1778 3 7 43 §767 37 274 8773 37 277 2720 37 287 10,50 37 288 6,67 37 295 0,80 37 297 2,49 37 ~ 299 1,97 37 303 1,47 37 — 3Ö4 1,10 37 305 ΤΓΪ9 95 47 2,36 97 47 1,33 113 47 2,06 125 47 0726 131 47 0,35 31 47 2,05 147 47 1,16 165 47 5,11 167 47 0,60 Ï8Ö 47 0,43 Ï8Ï 47 2,46 27 47 0,54 195 47 1,29 Ï87 43 1,58 27 296 1,16 Ï63 43 2,45 26 4Ö 0,76 26 43 0,93 27 309 1 1,36 199 310 2,54 2ÖÏ 3ÏÖ 2,26 2Ö7 291 2,73 240 3Ï3 2,98 5 Alle publicaties, octrooien en octrooiaanvragen die in deze beschrijving zijn geciteerd, worden hier bij referentie opgenomen alsof het met name en individueel werd aangegeven dat iedere individuele publicatie of octrooiaanvrage bij referentie moet worden opgenomen. Alhoewel de 132 voorafgaande uicvinding bij wijze van illustratie en voorbeeld in wat detail is beschreven voor doeleinden van duidelijkheid van begrip, zal het voor de gemiddelde vakman in het licht van de leren van deze uitvinding vlug 5 duidelijk zijn dat bepaalde veranderingen en modificaties daaraan kunnen worden aangebracht, zonder af te wijken van de geest of omvang van de bijgevoegde conclusies.

1031818

Claims

1. Antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan dat ten minste één eigenschap heeft die is gekozen uit de groep bestaande uit: a) heeft een KD(E)/KD(P) die groter dan, of gelijk aan 5 1,5 is; b) bindt aan P-cadherine met een KD van 50 nM of minder, zoals gemeten met behulp van oppervlakteplasmonreso-nantie; c) een Ka£ voor P-cadherine van minder dan, of gelijk 10 aan 0,01s'1, zoals gemeten met behulp van oppervlakteplas- monresonantie; d) een ICS0 van 50 nM of minder, zoals gemeten met behulp van een P-cadherineafhankelijke celadhesie-bepaling; e) een IC50 van 50 nM of minder, zoals gemeten met be- 15 hulp van een P-cadherineafhankelijke celaggregatie- bepaling; f) verhoogt sferoïdeontwrichting in een P-cadherine-afhankelijke sferoïdeontwrichting-bepaling met een factor van 2 of meer, vergeleken met een controlemonster zonder

20 IgG; g) concurreert met een antilichaam dat is gekozen uit de groep bestaande uit 194-e06; 194-a02; l94-b09; 195-ell; 194- g09; 196-h02; 194-e01; 196-dlO; 196-g03; 196-e06; 195- a09; 198-aO9; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g- 25 196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-lc4 en g-129-lc4, om binding aan P-cadherine; h) kruisconcurreert met een antilichaam dat is gekozen uit de groep bestaande uit 194-e06; 194-aO2; 194-b09; 195- ell; 194-g09; 196-h02; 194-eOl; 196-dl0; 196-g03; 196- 3. e06; 195-aO9; 198-aO9; 2 00-h06; g-194-bO9; g-194-g09; g- 1031818 196-g03; g-196-h02; g-194- eOl; g-194-e06; g-129-lc4 en g-129-lc4, om binding aan P-cadherine; i) bindt aan hetzelfde epitoop van P-cadherine als een antilichaam dat is gekozen uit de groep bestaande uit 5 194-e06; 194-a02; l94-b09; 195-ell; 194-g09; 196-h02; 194- eOl; 196-dlO; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g- 194-e06; 129-lc4 en g-129-lc4; j) bindt aan P-cadherine met nagenoeg dezelfde KD als 10 een antilichaam dat is gekozen uit de groep bestaande uit 194-e06; 194-a02; 194-b09; 195-ell; 194-g09; 196-h02; 194- eOl; 196-dlO; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g- 194-e06; 129-lc4 en g-129-lc4; en 15 k) bindt aan P-cadherine met nagenoeg dezelfde Kaf als een antilichaam dat is gekozen uit de groep bestaande uit 19 4 -e 0 6; 194-a02; 194-b09; 195-ell; 194-g09; 196-h02; 194- eOl; 196-dlO; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g- 20 194-e06; 129-lc4 en g-129-lc4.

2. Antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan volgens conclusie 1, omvattende een VH-domein dat wat betreft aminozuursequentie ten minste 90% identiek is aan 25 één van SEQ ID NO's: 13, 320, 321 en 322.

3. Antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan volgens conclusie 1, omvattende een VL-domein dat wat betreft aminozuursequentie ten minste 90% identiek is aan 30 één van SEQ ID NO's: 22, 326, 327 en 328.

4. Antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan volgens conclusie 1, gekozen uit de groep bestaande uit: a) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daar-35 van dat een VH-domein zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 13, of dat verschilt van SEQ ID NO: 13 met 1 tot 10 conservatieve aminozuursubstituties, en een VL-domein zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 22, of dat verschilt van SEQ ID NO: 22 met 1 tot 10 conservatieve aminozuursubstituties, omvat; b) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daar- 5 van dat een VH-domein zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 320, of dat verschilt van SEQ ID NO: 320 met 1 tot 10 conservatieve aminozuursubstituties, en een VL-domein zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 326, of dat verschilt van SEQ ID NO: 3 26 met 1 tot 10 conservatieve amino- 10 zuursubstituties, omvat; c) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan dat een VH-domein zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 321, of dat verschilt van SEQ ID NO: 321 met 1 tot 10 conservatieve aminozuursubstituties, en een VL-domein 15 zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 327, of dat verschilt van SEQ ID NO: 327 met 1 tot 10 conservatieve amino zuursubstituties, omvat; en d) een antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan dat een VH-domein zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 20 322, of dat verschilt van SEQ ID NO: 322 met 1 tot 10 conservatieve aminozuursubstituties, en een VL-domein zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 328, of dat verschilt van SEQ ID NO: 328 met 1 tot 10 conservatieve amino zuursubstituties, omvat. 25

5. Antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan volgens conclusie 1, omvattende een VH-domein dat onafhankelijk is gekozen uit één van SEQ ID NO's: 1 tot 13 en 320 tot 325, of een sequentie die verschilt van één van SEQ ID 30 NO1 s: 1 tot 13 en 320 tot 325 met 1 tot 10 conservatieve aminozuursubstituties; en verder omvattende een VL-domein dat onafhankelijk is gekozen uit één van SEQ ID NO' s: 14 tot 23 en 326 tot 331, of een sequentie die verschilt van één van SEQ ID NO's: 14 tot 23 en 326 tot 331 met 1 tot 10 35 conservatieve aminozuursubstituties.

6. Antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan volgens conclusie 1, waarbij dat antilichaam of antigeenbindende gedeelte een VH-CDR3, gekozen uit één van SEQ ID NO’s: 26 tot 37 en 91 tot 256, of een sequentie die 5 verschilt van één van SEQ ID NO's: 26 tot 37 en 91 tot 256 met 1 of 2 conservatieve aminozuursubstituties, omvat.

7. Antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan volgens conclusie 1, waarbij dat antilichaam of antigeen- 10 bindende gedeelte een VL-CDR3, gekozen uit één van SEQ ID NO's: 40 tot 47 en 257 tot 319, of een sequentie die verschilt van één van SEQ ID NO's: 40 tot 47 en 257 tot 319 met 1 of 2 conservatieve aminozuursubstituties, omvat.

8. Antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan volgens conclusie 1, waarbij dat antilichaam of antigeenbindende gedeelte: a) een VH-CDR1 zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 24, of een sequentie die verschilt van SEQ ID NO: 24 met 1 20 of 2 conservatieve aminozuursubstituties; b) een V„-CDR2 zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 25, of een sequentie die verschilt van SEQ ID NO: 25 met 1 of 2 conservatieve aminozuursubstituties; en c) een V„-CDR3 dat is gekozen uit één van SEQ ID NO- 25 s: 26 tot 37 en 91 tot 256, of een sequentie die ver schilt van één van SEQ ID NO's: 26 tot 37 en 91 tot 256 met 1 of 2 conservatieve aminozuursubstituties, omvat.

9. Antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan volgens conclusie 1, waarbij dat antilichaam of antigeenbindende gedeelte: a) een VL-CDR1 zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 38, of een sequentie die verschilt van SEQ ID NO: 3 8 met 1 35 of 2 conservatieve aminozuursubstituties; b) een VL-CDR2 zoals uiteengezet in SEQ ID NO: 39, of een sequentie die verschilt van SEQ ID NO: 39 met 1 of 2 conservatieve aminozuursubstituties; en c) een VL-CDR3 dat is gekozen uit één van SEQ ID NO- 5 s: 40 tot 47 en 257 tot 319, of een sequentie die verschilt van één van SEQ ID NO1 s: 40 tot 47 en 257 tot 319 met 1 of 2 conservatieve amino zuursubs t i t u -ties, omvat. 10

10. Antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan, waarbij het VH-domein één van SEQ ID NO' s: 13, 320, 321 en 322, of een sequentie die verschilt van één van SEQ ID NO's: 13, 320, 321 en 322 met 1 tot 10 conservatieve ami- 15 nozuursubstituties, omvat; en het VL-domein één van SEQ ID NO's: 22, 326, 327 en 328 omvat, of verschilt van één van SEQ ID NO's: 22, 326, 327 en 328 met 1 tot 10 conservatie ve aminozuursubstituties.

11. Antilichaam volgens een van conclusie 1 tot 10 dat een IgG-, een IgM-, een IgE-, een IgA- of een IgD- molecuul is, of dat daarvan is afgeleid.

12. Antilichaam volgens conclusie 11 waarbij het IgG 2. een IgGj is waarbij het constante gebied van de zware keten SEQ ID NO: 344 omvat en waarbij het constante gebied van de lichte keten SEQ ID NO: 345 omvat, met dien ver stande dat het C-terminale lysineresidu van SEQ ID NO: 344 eventueel is gesplitst. 30

13. Farmaceutisch preparaat dat het antilichaam of antigeenbindende gedeelte volgens een van conclusie 1 tot 12 en een farmaceutisch aanvaardbare drager omvat.

14. Geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul dat een nucleoti- desequentie zoals uiteengezet in één van SEQ ID NO's: 80, 89, 332, 333, 334, 338, 339 en 340 omvat.

15. Antilichaam of antigeenbindend gedeelte daarvan volgens conclusie 1, omvattende een aminozuursequentie van een variabel gebied van een zware keten die gebruik maakt 5 van een humane VH-3-familie-gen.

16. Antilichaam of antigeen-bïndend gedeelte daarvan volgens conclusie 1 dat een eerste variabel domein omvattende SEQ ID NO: 321 en een tweede variabel domein omvattende SEQ ID NO: 327 omvat.