CN101547936A - 癌性疾病调节抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用新型筛选模式制备患者癌性疾病调节抗体的方法。该方法利用癌细胞的细胞毒性作为指标来分离抗癌抗体，使制备用于治疗和诊断目的的抗癌抗体成为可能。所述抗体可以用于辅助癌症分期和诊断，还可以用于治疗原发性肿瘤和肿瘤转移。所述抗癌抗体能够与毒素、酶、放射性化合物和造血细胞偶联。

Description

癌性疾病调节抗体
发明领域
本发明涉及癌性疾病调节抗体(CDMAB)的分离和制备，以及CDMAB在诊断和治疗过程中的应用，任选地与一种或多种化学治疗剂联合使用。本发明还涉及利用本发明的CDMAB的结合分析。
发明背景
癌症中的CD63:CD63属于四次跨膜蛋白(tetraspanin)家族中的III型膜蛋白，该家族目前30个成员的特征是均具有四个跨膜片段。几个工作组通过使用针对活化的血小板的、中性粒细胞的和黑色素瘤细胞的全细胞制备物的抗体，独立地确定了CD63的表达。对它们的相关糖蛋白抗原的各自的cDNA进行克隆后确认了这些不同细胞上的抗原为同一种分子。随后，第六次国际白细胞分型研讨会(1996)将这些抗体归类为CD63抗体。在1996年该研讨会之前，CD63曾以多个名称被命名(黑色素瘤1抗原、眼黑色素瘤相关抗原、黑色素瘤相关抗原ME491、溶酶体相关膜糖蛋白3、致密体膜蛋白(granulophysin)、黑色素相关抗原MLA1)，这些名称往往与导致发现CD63的部分特性以及确认的抗体有关。因此，CD63也曾被称为ME491抗原(MAb ME491)、神经腺(neuroglandular)抗原(MAbsLS59，LS62，LS76，LS113，LS140，LS152)、Pltgp40(MAbs H5C6，H4F8和H5D2)、人类骨髓基质细胞抗原(MAb 12F12)、骨祖细胞特异性标志物(MAb HOP-26)和整合素相关蛋白(MAb 6H1)。被发现与人类CD63发生交叉反应的其他抗体有8-1H、8-2A(与ME491发生交叉反应)、NKI/C-3和NKI/black-13(Vennegoor et al.Int J Cancer 35(3)：287-95(1985)；Vennegoor and Rumke，Cancer Immunol Immunother.23(2)：93-100(1986)；Demetrick et al.，J Natl Cancer Inst 84(6)：422-9(1992)；Wang et al.，ArchOphthalmol.110(3)：399-404(1992))。有关针对免疫亲和纯化的NKI/C3抗原制备的兔多克隆抗体RaC3的工作显示，靶蛋白作为核心多肽具有约20kDa的表观分子量，并被N连接的糖类高度翻译后修饰(Gruters et al.，Cancer Res 49(2)：459-65(1989))。
利用MAb ME491，针对制备物SK Me1 23人皮肤黑素瘤细胞系制备的众多抗体的一种，从黑素瘤cDNA文库最先克隆出CD63，并基于其对黑素瘤细胞的结合进行了筛选。来自125I-乳过氧化物酶标记的黑素瘤细胞的免疫沉淀反应显示在细胞表面存在30-60kDa蛋白。由该抗体识别的抗原显示为是高度翻译后修饰的蛋白。通过免疫组织化学，所述抗体被发现识别肿瘤组织中的黑素瘤细胞，但不识别周围正常的观望细胞(lookingcells)，因此表明该抗体识别潜在的肿瘤特异性抗原决定簇(Atkinson et al.，Hybridoma 4，243-255(1984))。该抗体还使87％的葡萄膜黑素瘤病例中的黑素瘤细胞和86％的存在气球样细胞的病例中的气球样细胞染色。在该研究中，正常眼组织的染色是不定的，在仅少数正常病例中是阳性的，且在形态学上正常的黑色素细胞中极少(Folberg et al.，Arch Ophthalmol103(2)：275-9(1985))。在单独的实验中，针对SK Me1 23细胞系还制备的单克隆抗体MAb6-F1、MAb8-1H和MAb8-2A显示识别相同的抗原，并显示与由MAb ME491所获得的免疫组织化学染色模式非常类似的免疫组织化学染色模式。此外，这些抗体在患原发性脉络膜黑素瘤的患者中使肝转移瘤组织染色，但不染色正常的肝细胞。在人黑素瘤活检的另外研究中表明MAb ME491的反应性与黑素瘤的进展呈负相关。在正常黑色素细胞中，MAb ME491抗体的反应性低，在黑素瘤进展早期阶段(发育异常痣和放射生长期(radial growth phase，RGP)肿瘤)抗体反应性升高，在更晚期的黑素瘤例如垂直生长期(vertialgrowth phase，VGP)和转移性肿瘤中，MAb ME491抗体的反应性则下降甚至丧失。另外针对原发性人葡萄膜黑素瘤细胞制备的单克隆抗体(MAb 4A3)被发现特异性识别这些细胞中存在的抗原，并与健康个体中淋巴细胞的结合只显示本底水平。通过黑素瘤组织的Western免疫印迹，由该抗体识别的抗原包含具有约55kDa的表观分子量的双联体，表明由该抗体识别的抗原与成簇的抗体如抗-CD63所识别的抗原不同(Damato et al.，Invest Ophthalmol Vis Sci 27(9)：1362-7(1986))。
使用针对凝血酶活化的血小板制备的单克隆抗体(MAbs 2.28，2.19，5.15和5d10)，在人血小板中也发现了CD63，并将其部分地表征。这些抗体识别活化依赖的血小板膜53kDa糖蛋白，这由在凝血酶活化时增加的结合位点数(多于10倍)所证实。在竞争分析中，这些抗体阻断彼此的结合，表明它们识别相同的或空间上接近的抗原决定簇。血小板聚集实验的结果显示这些抗体本身不引起血小板聚集，它们也不干扰由腺苷二磷酸(ADP)、凝血酶、胶原、利托菌素和肾上腺素诱发的聚集。电子显微镜学数据表明在静止性血小板中这些抗体识别定位于溶酶体膜中的抗原。免疫组织化学数据显示这些抗体识别在脾、淋巴结、胸腺的有限区域和在内皮细胞中存在的抗原。在另一项研究中，MAb 2.28也标记静止性血小板和巨核细胞以及内皮细胞中的内部颗粒，在后两者中，它与抗体共定位到组织蛋白酶D，所述组织蛋白酶D是已知的溶酶体区室标志物。关于抗体成簇和表达克隆的后续研究，证明该抗体识别的抗原就是CD63，还证实其存在于溶酶体区室，在那里它与该区室-特异性标志物LAMP1和LAMP2共定位。该分子的克隆将其确定为CD63，并且属于四次跨膜蛋白家族。
在许多不同的组织和细胞类型中都能够检测到CD63的表达。在细胞水平，人们发现它与质膜结合，也与细胞内晚期内体(late endosomal)的囊状结构结合。某些情况下，细胞活化通过动员细胞内储备的CD63来增加表面表达。在B淋巴细胞，尤其在内体(endosomes)、在参与将MHC II类分子复合物输出到表面的外体(exosomes)和在分泌囊泡中，还发现CD63与MHC II类分子共定位并发生物理结合。在包括B淋巴细胞和T淋巴细胞、中性粒细胞、乳腺癌和黑素瘤细胞的许多细胞类型中，发现CD63与诸如CD9、CD81、CD11(整合素链αM，L，X)、CD18(整合素链β2)、CD49c(VLA-3或者整合素链α3)、CD49d(整合素链α4)、CD49f(VLA-6或者整合素链α6)和CD29(整合素链β1)的其他四次跨膜蛋白家族的成员相互作用。
CD63在癌症中的作用还不清楚。尽管最初几个相互独立的工作组发现CD63参与诸如血小板和粒细胞活化、MHC II类分子依赖的抗原提呈、整合素依赖性细胞粘附和运动以及某些类型癌症的肿瘤进展的多种事件，但其功能还有待进一步充分阐述。虽然目前有证据支持CD63在多种细胞生理事件中的发挥作用，但是还不清楚这些作用是彼此独立的还是具有CD63参与的潜在的共同细胞机制。
几个工作组已经研究了CD63和某些类型肿瘤进展之间的关系，特别是与黑色素瘤进展之间的关系。除Mab ME491之外，还研发了多种其它的抗CD63单克隆抗体以用于对从携带不同进展阶段肿瘤的患者获得的癌症标本进行免疫组化(immunohistochemical，IHC)染色。观察到着色变浅被作者解释为极可能反映CD63的表达降低，并与肿瘤的晚期进展和转移性特征相关。更近的一项研究还描述了包括CD63在内的几个四次跨膜蛋白家族成员表达水平的明显下调(mRNA定量后)与几种乳腺癌来源的细胞系体外侵袭性的显著相关性。另外一项研究通过差异显示法确定了在去除雌激素的培养乳腺癌细胞中具有CD63。这说明CD63的表达受到类固醇-激素的调节，并且改变的CD63丰度和/或功能也可能与乳腺肿瘤进展有关。
与之相比，利用抗CD63单克隆抗体MAb FC-5.01的研究揭示了其活性表位在不同正常组织中表达不同。尽管该抗体被发现能识别CD63，但它并不能区分早期黑色素瘤和包括转移性黑素瘤在内的更晚期的黑色素瘤(与MAb ME491不同)，这表明CD63抗原存在于这些更晚期的肿瘤细胞上，但是在来自不同阶段的肿瘤的细胞中，它的某些表位被掩盖。这可能由于核心CD63多肽的翻译后修饰发生改变，或是由于CD63和其他分子的相互作用，影响了用于抗体识别和结合的特定表位的提供。这些研究结果支持Si和Hersey，Int J Cancer 54(1)：37-43(1993)所描述的观察结果，即用抗CD63 MAb NKI-C3的染色不能区分来自诸如早期、放射生长期、垂直生长期以及转移性黑素瘤的不同进展阶段的黑素瘤的组织切片。尽管在对来自乳腺癌和非小细胞性肺癌细胞的mRNA的其他研究分析(Adachi et al.，J Clin Oncol 16(4)：1397-406(1998)；Huang et al.，Am JPathol 153(3)：973-83(1998))中，通过定量PCR，发现四次跨膜蛋白分子家族中的两个成员(CD9和CD82)的表达水平与肿瘤进展和患者预后存在明显的相关性，但没有发现CD63存在这种相关性，因为CD63在所有的样本中表达都是相似的。由于这些结果存在明显冲突，因此缺乏能明确证明CD63和肿瘤之间的关系的有力和一致的数据。
到目前为止，很少有体内研究试图建立CD63与该分子的晚期肿瘤抑制功能之间的联系。在这些研究中的一项中，经皮下和腹腔注射入无胸腺小鼠的人CD63过度表达的H-RAS转化的NIH-3T3细胞，与亲代无CD63过度表达的小鼠细胞的行为比较，显示出恶性/致瘤性降低的表型，所述表型由减小的肿瘤体积和降低的转移可能性以及增加的生存时间所表明。这表明转化细胞中人CD63的存在会抑制它们的恶性行为。更近期，利用表达人CD63的转基因小鼠模型并诱导对CD63产生耐受的研究工作表明用与牛痘病毒融合的人CD63免疫时，可以抑制注射的人CD63-MHC I型(H-2Kb)共转染鼠黑素瘤细胞的肿瘤生长，并增加生存期。该研究作者指出：由于肿瘤生长的抑制作用仅存在于注射了CD63-MHC-I型共转染细胞，而不是注射了CD63单独转染细胞系的动物中，所以这种治疗作用是T淋巴细胞依赖性的，看起来内源性抗CD63抗体并未参与该保护作用。该解释得到以下事实的支持：经纯化的人CD63预免疫并且显示已产生抗人CD63抗体的野生型动物中，没有抗肿瘤细胞生长的保护作用。Radford et al.，Int J Cancer 62(5)：631-5(1995)利用人CD63转染KM3细胞系(最初认为是人源，后来定性为鼠源)的研究工作表明当将所述细胞皮内注射入无胸腺小鼠时，与使用未转染的KM3亲代细胞观察到的结果比较，该蛋白的表达减慢了这些细胞的生长并降低了其转移潜能，尽管各种转染和未转染细胞系的体外生长率并无显著性差异。这些观察将CD63的潜在作用与其他已知的在体内和体外影响肿瘤细胞生长率的肿瘤抑制基因区分开来。此外，在体外试验中(Radford et al.，JImmunol 158(7)：3353-8(1997))，抗CD63单克隆抗体ME491的添加不影响相同细胞的体外生长率，所述ME491被发现通过减少细胞的随机运动影响它们的功能。
这项研究还描述了如下观测结果：在诸如层粘连蛋白、纤维连接蛋白、胶原和玻璃粘连蛋白的细胞外基质(ECM)衍生的趋化因子作用下，CD63能促进迁移，并且这种作用可以由β1-型整合素的功能性参与介导，尽管针对整合素的抗体并不能够阻断这些作用。然而，看起来在CD63转染细胞上，玻璃粘连蛋白介导的信号(已知为整合素αvβ5的配体)的作用与由诸如纤维连接蛋白、层粘连蛋白和胶原的其他ECM成分介导的信号的作用之间存在拮抗效应。这提示在在特定条件下，ECM组分存在时，CD63的表达能导致迁移减少，这可能取决于粘附和运动之间的细微平衡。另一项研究中，抗CD63单克隆抗体(MAb 710F)增强了PMA处理的HL-60细胞的粘附性和伸展性，而另一种抗CD63单克隆抗体(MAb 2.28)促进类似的效应，但只针对更小部分的细胞群，并且只在加入更大的抗体量时发挥所述作用。这些结果表明，尽管已经开发了多种抗CD63抗体，但是它们的功能性作用可能存在很大区别。
四次跨膜蛋白家族可能也参与了细胞增殖。Oren et al.Mol Cell Biol10(8)：4007-15(1990)描述了识别CD81(TAPA-1)的小鼠MAb 5A6对淋巴瘤细胞系的抗增殖作用。在另一项研究中，人T淋巴细胞的CD37与抗体的结合阻断了CD37诱导的增殖。更近期，用CD37表达缺失(CD37敲除)的小鼠动物模型的研究显示，与来自野生型动物的T淋巴细胞对刀豆蛋白A活化和CD3/T细胞受体结合的响应相比，来自CD37敲除小鼠的T淋巴细胞过度增殖。因此提出：在细胞生长和增殖中的功能性作用可能是四次跨膜蛋白家族的共同特征。最近关于肝母细胞瘤和肝细胞癌细胞的研究显示，这些细胞与抗CD81单克隆抗体的结合导致Erk/MAP激酶通路的活化。已经表明该信号转导通路参与细胞生长和增殖事件。平行研究也表明，过表达人CD81的转染细胞系与模拟转染对照组相比显示增殖增加。因此现有证据已经表明四次跨膜蛋白分子总体，尤其是CD63在细胞生长增殖和细胞粘附/运动相关事件中的作用。因为这两类细胞事件在肿瘤进展和转移过程中起着重要作用，所以这两者是目前热点研究的靶点。
氨基酸序列测定和分析没有揭示四次跨膜蛋白家族与其它蛋白质家族之间的同源性，或具有任何目前已表征的功能模块，也没有表明其具有任何目前已知的酶活性。因此，人们很难研究该蛋白质家族在信号转导通路中的调节作用。但是，利用四次跨膜蛋白特异性试剂产生的证据表明四次跨膜蛋白具有信号转导特性，所述试剂能改变细胞的生理机能，而这密切依赖于信号转导通路的调节。CD63在物理和/或功能上均显示出与大量分子有联系，所述分子本身是参与第二信使信号的产生的酶，或者在物理和/或功能上与这类酶相关。
设计的仔细分析调控人中性粒细胞与内皮细胞的相互作用的机制的实验表明，预先用几种抗CD63单克隆抗体(AHN-16、AHN-16.1、AHN-16.2、AHN-16.3和AHN-16.5)处理中性粒细胞促进它们与培养内皮细胞层的粘附，所述相互作用是炎症反应的起始步骤之一。此外这种作用强烈地依赖于钙离子(Ca2+)的存在，所述钙离子是公知的多种胞内信号通路的调节因子，它作用于细胞接触刺激性抗体的特定时段。在接触抗体更长时间后，中性粒细胞对内皮细胞的粘附作用开始变得对后来加入的钙离子不敏感，因此提示这是动态和短暂的调节(暂时的)事件。此外，发现CD63在物理上和CD11/CD18蛋白复合物相互作用，特异性靶向作用于此复合物的试剂介导调节信号。在这项研究中还发现，CD63在物理上与包括酪氨酸激酶Lck和Hck的酶的复合物结合，或者其本身就是该复合物的一部分。这些酶是一类蛋白质的成员，这类蛋白质在特定表面受体活化后，在介导细胞内调节信号中发挥重要作用，是导致细胞特异性生理变化的信号转导通路级联反应的一部分。另一项研究表明，四次跨膜蛋白(包括CD63)与单克隆抗体的共连接(co-ligation)，能够增强黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)的磷酸化或活性，所述FAK由MDA-MB-231乳腺癌细胞对胶原底物的粘附来诱导。这表明CD63(和其它四次跨膜蛋白家族成员)直接参与整合素介导的酪氨酸激酶信号转导通路的调节。其它可以在功能上通过抗CD63单克隆抗体MAb 710F与表面CD63的存在和连接(ligation)交叉的信号通路是那些依赖于通过蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)磷酸化调节的通路，所述PKC是另外一种公知的细胞内信号转导通路的调节剂。在本文中，骨髓细胞系HL-60的粘附和形态改变经由MAb 710F的增强依赖于豆蔻酰佛波醇乙酯(phorbolmyristate acetate，PMA)对所述细胞的预处理，尽管PKC的短暂参与并没有得到最终证实。然而，一独立工作组的后期研究证实PMA诱导的HL-60分化是PKC活性依赖的，因为Ro31-8220分子(该酶的特异性抑制剂)阻断了PMA的作用。
支持CD63和其他四次跨膜蛋白家族成员与信号转导通路关联的进一步证据来自下述研究。该研究描述了CD63(以及CD53)分子与酪氨酸磷酸酶活性之间的物理关联(直接结合的或作为超分子复合物的一部分)在该研究中，利用抗CD63抗体分离的免疫沉淀复合物显示与酪氨酸磷酸酶活性有关，尽管与显示与酪氨酸磷酸酶CD45有关的CD53不同，但不可能鉴定CD63相关的磷酸酶。更近期还发现几个四次跨膜蛋白家族的成员与II型磷脂酰肌醇4-激酶(II型PI4-K)有关(Berditchevski et al.，JBiol Chem 272(5)：2595-8(1997))。这种相互作用看起来非常特异，因为其仅在CD9、CD63、CD81、CD151和A15/TALLA中被确定，并没有观察到发生于CD37、CD52、CD82或NAG-2。此外，由于每个含有PI-4激酶的复合物限于单个四次跨膜蛋白家族成员，所以四次跨膜蛋白家族成员和PI-4K之间的关联是唯一的。特别发现CD63-PI-4激酶复合物与其它他四次跨膜蛋白成员形成的复合物不同，几乎完全位于脂筏样结构域的细胞内小室中。这一发现表明，与PI-4激酶相互作用的CD63部分会参与涉及或者依赖于磷酸肌醇生物合成途径的特定的细胞内事件(Claaset al，J Biol Chem 276(11)：7974-84(2001))，已知所述磷酸肌醇生物合成途径除了作为第二信使分子外，还参与了膜运输(胞吞和胞吐作用)以及细胞骨架重组的调节(Martin Annu.Rev.Cell.Dev Biol 14：231-64(1998))。
到目前为止发现的与CD63直接相关的所有酶在信号通路调节中的直接和重要参与提供了支持CD63与信号转导通路调节相关联的进一步的证据，所述CD63作为这些酶活性的调节因子或者下游的效应分子。
阐明导致肿瘤进展的机制是非常困难和复杂的工作，经常被很多明显的相互矛盾的发现所掩盖，因此很少能够将那些发现成功转化为有效的疗法。从目前已知的关于CD63与肿瘤进展和转移以及信号转导机制之间的关联来看，在肿瘤细胞内改变CD63的功能是可能的。
开发对肿瘤细胞具有细胞毒作用的抗原特异性试剂作为潜在的治疗或者诊断工具将是极其有益的，所述试剂结合表达识别抗原的细胞，并且通过自身或者与其他分子结合而具有细胞的或者体内的生理活性，以使这些试剂抑制肿瘤细胞生长、进展和转移，且对正常细胞群无显著的损伤作用。
最近，新的数据表明CD63在调节正常细胞生理学中的重要的作用模式，当其被改变时，对病理状态下包括肿瘤中的细胞行为有重要影响。
已知引起CD63在乳腺癌细胞中内在化的MAb抗体Fc-5.01被用于测定CD63在人树突细胞(DC)中的表面表达和内在化水平(Mantezazza etal.，Blood 104(4)：1183-90(2004))。CD63被发现定位在细胞表面和细胞内，与内体和溶酶体标志物共定位。完整抗体和其Fab片断能诱导CD63的内在化。由Fc-5.01促进的CD63内在化同时导致一些整合素分子、CD11b、CD18、CD29和α5而不是β3或HLA-II分子的表面表达降低。趋化性分析的结果显示了该抗体和识别四次跨膜蛋白家族的蛋白的其他成员的其他抗体，引起跨过膜屏障向化学引诱剂迁移的细胞数目增加。在这些细胞(未成熟DC)中，由β1，3-聚糖受体介导的酵母吞噬作用伴随着细胞表面CD63的水平降低，而不是四次跨膜蛋白CD9、CD81和CD82也不是HLA-II分子的水平降低。另一方面，由葡聚糖-FITC诱导的内在化是由巨噬细胞甘露糖受体(MMR)介导的，其不引起CD63表面表达降低，或CD9、CD81、CD82、HLA-I和HLA-II分子表面表达降低。因此，看起来CD63与特异性受体相关(有时是物理上的相关，如与β1，3-聚糖受体dectin-1的情形)并参与内在化事件。一些整合素分子的表面表达在抗体诱导的CD63内在化时降低的事实也表明，这样的CD63依赖性事件对细胞表面受体组合物有显著影响，并因此影响这些细胞群的生理学，如通过对DC迁移试验的影响所证实的。
在另一项研究中，发现膜1型金属蛋白酶(MT1-MMP)的内在化受CD63的影响。在该研究中，FLAG标记的MT1-MMP内在化并获得弥漫性胞浆分布，这伴随在其细胞表面水平的降低。加入氯喹(已知的溶酶体蛋白酶抑制剂)部分抑制所述细胞表面MT1-MMP的内在化依赖性消失，并同时以MT1-MMP保持与CD63阳性内部颗粒型结构结合的方式改变内在化依赖性的胞浆分布。细胞与MT1-MMP和CD63的共转染导致该金属蛋白酶在细胞表面水平降低，这不依赖于MMP活性的总体水平，因为这些分子的抑制剂BB94对所述降低没有任何影响，而氯喹会对所述降低有影响。该观察表明增加的CD63表达促进MT1-MMP的更新/内在化/降解。增加的MT1-MMP的内在化/降解依赖于MT1-MMP和CD63之间的直接相互作用。该类型的功能也得到了前述观察的支持，即CD63分别与适配子蛋白AP-2和AP-3的亚单位μ2和μ3直接相互作用，这涉及蛋白分型到内体和溶酶体。先前已表明MT1-MMP的胞浆尾部对该分子的内在化是重要的，该事件在调节其促进侵袭的活性中起重要作用。MT1-MMP还被认为在恶性肿瘤细胞侵袭中起重要作用。因此，MT1-MMP总体水平的调节依赖于其与CD63的相互作用及通过与CD63结合的内在化是可能的。
在最近另一项公开(Xu et al.，Embo J 23(4)：811-22(2004))中，对可能涉及视网膜变性的果蝇眼部富集的基因进行了基因筛选，鉴定了大量基因，其中四次跨膜蛋白样分子的基因称为“太阳镜”(“sunglasses”，“sun”)。最接近的相关哺乳动物蛋白是四次跨膜蛋白CD63。与CD63类似，“sun”被发现在溶酶体中富集，如免疫电子显微镜术所表明的。该项研究的结果表明“sun”参与了Rh1信号传导的正常的下调，独立于视紫红质抑制蛋白(arrestin)介导的机制，该机制对其他G蛋白偶联受体是典型的。此外，“sun”不仅在调节活化的Rh1更新中是重要的，而且可能依赖于该事件在维持视轴的结构中具有显著影响，这导致在突变的苍蝇中显著的sun依赖性视网膜变性。总之，所述数据暗示了哺乳动物CD63的该同源物在正常运输依赖性蛋白更新中的作用，且其表达/功能的异常导致了生理学异常。
有关CD63在受体内在化中作用的另一项公开描述了用胃离子泵H，K-ATP酶的β亚基和该四次跨膜蛋白在该两分子共转染的COS细胞中的共定位。在该项研究中，还发现H，K-ATP酶的β亚基经历了CD63表达依赖性的内在化和到胞浆溶酶体样颗粒结构定位的增强。
所有来自上述研究的数据表明CD63还通过参与细胞表面分子的内在化和溶酶体依赖性降解参与细胞表面分子的正常更新，并由此参与正常细胞生理学的调控。因此，可能的是对CD63的该功能的操纵可能是调控依赖于特异性分子或分子基团活性的事件的重要工具，所述分子的表面表达或功能被改变或有助于在病理状态如癌症中的异常细胞行为。
直到最近，还没有报道抗CD63抗体或者特异性靶向CD63表达细胞的其它试剂能够同时影响肿瘤细胞的体外和体内生长特性，以及影响肿瘤生长的动物模型的生存期。公布的美国专利申请10/810,751公开了两种显示针对人癌细胞有体外和体内功效的抗CD63抗体。
用作癌症治疗的单克隆抗体：每个患有癌症的个体都是独特的，正如人的身份有所差异一样，其患有的癌症也不同于其他癌症。尽管这样，现有疗法用相同方式治疗患有同期同类型癌症的所有患者。这种患者中的至少30％的一线治疗是失败的，从而导致更多轮次的治疗并且增加了治疗失败、转移和最终死亡的可能性。优良的治疗方法应该是针对特定个体的个体化疗法。现有唯一的个体化疗法是手术。化疗和放疗无法针对患者量身定做，而手术本身在大部分情况下不足以治愈癌症。
随着单克隆抗体的出现，开发个体化疗法的可能性变得更加现实，因为每种抗体可以针对单一表位。此外，有可能制备抗体的组合，所述组合针对表位的集群(constellation)，所述集群唯一地限定了特定个体的肿瘤。
在认识到癌性细胞和正常细胞之间的显著差异是癌性细胞包含对转化细胞特异的抗原后，科学界长期以来认为可以将单克隆抗体设计为通过特异结合这些癌症抗原特异地靶向转化细胞；这样就产生了单克隆抗体可以作为“魔术子弹(Magic Bullets)”消除癌细胞的观点。但是，现在已经广泛意识到没有单一的单克隆抗体可以用于癌症的所有情形，并且单克隆抗体可以按类来开发，用来治疗目标癌症。依照本发明公开的方法分离的单克隆抗体已经显示以有益于患者的方式改善癌性疾病过程，例如通过减轻肿瘤负荷，所述分离的单克隆抗体在本文中将分别被称为癌性疾病调节抗体(CDMAB)或者“抗癌”抗体。
目前，癌症患者通常可选择的治疗方法很少。癌症治疗的组合方法已经改善了总体存活率和发病率。但是，对于特定个体，这些改善的统计数据和他们个人状况的改善不一定必然相关。
因此，如果提出一种方法学，使医师能够独立于相同群组中的其他患者来治疗每例肿瘤，这就会使根据个体进行量身定做的独特治疗成为可能。理论上这种治疗过程将提高治愈率，产生更好的结果，从而满足盼望已久的需要。
从历史上来看，多克隆抗体已经被用于人类癌症的治疗，但只取得了有限的成功。已经用人血浆来治疗淋巴瘤和白血病，但很少有延长的症状缓解或者反应。此外，与化疗相比，缺乏重现性，也没有额外的益处。诸如乳腺癌、黑素瘤和肾细胞癌的实体瘤也用人血液、黑猩猩血清、人血浆和马血清治疗过，但是相应的结果是不可预见和无效的。
有很多用单克隆抗体治疗实体肿瘤的临床试验。在20世纪80年代，就有至少四项针对人类乳腺癌的临床试验，所述试验在使用了针对特定抗原或基于组织特异性的抗体的至少47名患者中，只产生了一名应答者。直到1998年，才有了成功的临床试验，该试验联合使用人源化的抗Her2/neu抗体(赫赛汀
Figure A200780030641D00181
)与顺铂。在这项试验中，对37个患者的反应进行了评估，大约有四分之一的患者有部分反应率，另外四分之一有轻微的或稳定的病情发展。在反应者中，中位进展时间(median time toprogression)是8.4个月，其中中位反应持续时间(median response duration)是5.3个月。
赫赛汀在1998年被批准作为与泰素联合使用的一线用药。临床试验结果表明，与单独接受泰素治疗的人群的中位疾病进展时间(3.0月)相比，接受抗体治疗与泰素联合应用的患者的中位疾病进展时间(6.9月)增加。赫赛汀与泰素联合治疗组的中位存活时间也轻微增加，与泰素单独治疗组相比是22个月：18个月。除此之外，所述抗体和泰素联合应用组与单独使用泰素组相比，在完全应答者(8％:2％)和部分应答者(34％:15％)的数量方面都有增加。然而赫赛汀和泰素联合治疗相比泰素单独治疗，导致了较高的心血管毒性发病率(分别是13％和1％)。此外，赫赛汀治疗也只对那些过表达人类表皮生长因子受体2(Her2/neu)(通过免疫组化(IHC)分析来确定)的患者有效。Her2/neu是目前还不知其功能或生物学重要配体的受体；大约25％的转移性乳腺癌患者过表达Her2/neu。因此远远不能满足患乳腺癌的患者的治疗需求。即便那些从赫赛汀治疗中受益的患者仍然需要化疗，并且随后还必须至少在一定程度上处理这类治疗的副作用。
研究结肠直肠癌的临床试验涉及同时抗糖蛋白和糖脂靶的抗体。对腺癌具有一定特异性诸如17-1A的抗体，已经进行了超过60例患者的2期临床试验，其中仅有1例患者有部分应答。在其他试验中，在采用另外的环磷酰胺的实验方案的52例患者中，使用17-1A仅产生1例完全应答和2例轻微应答。迄今为止，17-1A作为III期结肠癌辅助治疗的III期临床试验还没有显示出改善的疗效。使用最初被批准用于成像的人源化鼠单克隆抗体也没有使肿瘤消退。
只有到了最近，使用单克隆抗体进行的结肠直肠癌的临床试验才有一些阳性结果。在2004年，爱必妥
Figure A200780030641D00191
被批准作为表达EGFR的转移结肠直肠癌患者的二线治疗用药，这些患者对于基于依立替康(irinotecan)的化疗是耐受的。双臂II期临床研究和单臂研究的结果表明，爱必妥与依立替康联合应用分别有23％和15％的反应率，中位疾病进展时间分别是4.1和6.5月。来自同一项双臂II期临床试验和另一项单臂研究的结果表明，爱必妥单独治疗的反应率分别是11％和9％，中位疾病进展时间分别是1.5和4.2个月。
因而在瑞士和美国，爱必妥与依立替康的联合应用，以及在美国，爱必妥的单独治疗都已经被批准作为依立替康一线治疗失败的结肠癌患者的二线治疗。因此，与赫赛汀一样，爱必妥治疗在瑞士只被批准作为单克隆抗体和化疗联合应用。此外，在瑞士和美国，爱必妥治疗只被批准作为患者的二线治疗。同样，在2004年，阿伐他汀
Figure A200780030641D00192
被批准与基于静脉注射5-氟尿嘧啶的化疗联合应用，作为转移性结肠直肠癌的一线治疗。III期临床研究结果表明，联合应用阿伐他汀和5-氟尿嘧啶，与单独使用5-氟尿嘧啶相比，延长了患者的中位存活时间(分别是20个月和16个月)。然而，还是与赫赛汀和爱必妥一样，阿伐他汀只被批准作为单克隆抗体与化疗联合应用。
对于肺癌、脑癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌的治疗，疗效仍然很差。对于非小细胞肺癌最有希望的近期结果来自II期临床试验，其中治疗涉及偶联到细胞杀伤药物阿霉素的单克隆抗体(SGN-15；dox-BR96，抗-Sialyl-LeX)与化疗剂泰素帝
Figure A200780030641D00193
联用。泰素帝是唯一经FDA批准用于肺癌二线治疗的化疗剂。原始数据显示相对于单用泰素帝，总体存活率提高。该研究招募的62例患者中，2/3接受SGN-15与泰素帝联合治疗，而剩余的1/3接受单独的泰素帝治疗。对于接受SGN-15与泰素帝联合治疗的患者，中位总体存活时间为7.3个月，与之相对，接受泰素帝单独治疗的患者为5.9个月。接受SNG-15加泰素帝治疗的患者在1年和18个月时的总体存活率分别为29％和18％，与之相比，接受泰素帝单独治疗的患者分别为24％和8％。进一步的临床试验在计划中。
临床前试验中，使用单克隆抗体治疗黑色素瘤取得了有限的成功。这些抗体中，极少有达到临床试验期的，且至今还没有一种得到批准，或在III期临床试验中显示出良好效果。
由于对能够明确促进疾病发生的30,000种已知基因产物中的相关靶点缺乏鉴定，使治疗疾病的新药的发现受阻。在肿瘤学研究中，潜在的药物靶点仅因为其在肿瘤细胞中过表达这一事实而经常被选择。随后，这样鉴定的靶点通过与大量化合物的相互作用被筛选。就潜在抗体的治疗而言，这些候选化合物通常由依据Kohler和Milstein提出的基本原理(1975，Nature，256，495-497，Kohler and Milstein)的制备单克隆抗体的传统方法所产生。从抗原(例如，全细胞、细胞成分、纯化的抗原)免疫过的小鼠收集脾细胞，并与永生的杂交瘤细胞伴侣融合。基于与靶抗原密切结合的抗体的分泌来筛选所产生的杂交瘤。包括赫赛汀和利妥昔单抗(RITUXIMAB)在内的许多针对癌细胞的治疗和诊断的抗体已经被用这些方法制备并已基于它们的亲和性被选择。这项策略的缺陷是双重的。首先，由于对组织特异性的癌症过程认识的贫乏及由此产生的鉴定这些靶标的过分简单的方法(诸如通过过表达来筛选)，与用于治疗或诊断的抗体结合的合适靶标的选择是有限的。其次，与受体有最大结合亲和性的药物分子通常具有启动或抑制信号的最大可能性这一假说并不总是成立。
尽管乳癌和结肠癌的治疗取得了一些进展，但是有效的抗体治疗的鉴定与开发对所有类型癌症而言都是不够的，不管是作为单一试剂还是联合治疗。
现有专利
美国专利5,750,102公开了一种方法，其中用可以从患者的细胞或组织中克隆的MHC基因转染来自患者肿瘤的细胞。然后用这些转染的细胞给患者接种。
美国专利4，861,581公开了一种方法，它包括的步骤有：获取对哺乳动物肿瘤细胞和正常细胞的细胞内成分特异、对外部成分没有特异性的单克隆抗体；标记单克隆抗体；将该标记的抗体与已接受杀灭肿瘤细胞疗法的哺乳动物的组织接触；以及通过测量该标记抗体与退化的肿瘤细胞的细胞内成分的结合来确定治疗的效果。在制备针对人类细胞内抗原的抗体时，专利权所有人认识到肿瘤细胞是这类抗原的便利来源。
美国专利5,171,665提供了一种新型抗体及其制备方法。具体地，该专利叙述了一种单克隆抗体的制备，该抗体有与人类肿瘤(例如肠癌和肺癌)相关的蛋白抗原牢固结合的特性，而与正常细胞的结合程度弱得多。
美国专利5,484,596提供了一种癌症治疗的方法，所述方法包括：手术去除人类癌症患者的肿瘤；处理肿瘤组织以获得肿瘤细胞；照射肿瘤细胞，使其能成活但不致瘤；用这些细胞来制备抑制原发性肿瘤复发、同时抑制肿瘤转移的患者疫苗。该专利讲述了能够与肿瘤细胞表面抗原反应的单克隆抗体的开发。如在第4栏，第45行等处提到的，专利权所有人在开发单克隆抗体中应用了自体肿瘤细胞，该单克隆抗体对人类肿瘤表现出活性特异的免疫治疗。
美国专利5,693,763讲述了人类癌细胞的糖蛋白抗原特性，其不依赖于起源的上皮组织。
美国专利5,783,186涉及能诱导表达Her2的细胞发生凋亡的抗-Her2抗体、产生该抗体的杂交瘤细胞系、用该抗体和包括所述抗体在内的药物组合物治疗癌症的方法。
美国专利5,849,876描述了产生单克隆抗体的新的杂交瘤细胞系，该抗体针对从肿瘤和非肿瘤组织来源中纯化的粘液素抗原。
美国专利5,869,268涉及一种制备产生特异针对目标抗原的抗体的人类淋巴细胞的方法，制备单克隆抗体的方法及该方法制备的单克隆抗体。该专利特别涉及用于癌症诊断和治疗的抗-HD人类单克隆抗体的制备。
美国专利5,869,045涉及与人类癌细胞反应的抗体、抗体片段、抗体偶联物和单链免疫毒素。这些抗体发挥功能的机制是双重的，其中该分子可以与人类癌细胞表面的细胞膜抗原反应，而且该抗体能够进一步内在化入癌细胞内，随后结合，这使它们对形成抗体-药物，抗体-毒素的偶联物尤其有用。未经修饰的抗体在特定浓度下，也表现出细胞毒特性。
美国专利5,780,033公开了用于肿瘤治疗和预防的自身抗体的用途。不过，这种抗体是来自老年哺乳动物的抗核自身抗体。这里，自身抗体是指一种存在于免疫系统的天然抗体。因为自身抗体来自“老年哺乳动物”，所以就不要求自身抗体真正来自受治患者。此外，该专利公开了来自老年哺乳动物的天然单克隆抗核自身抗体及产生单克隆抗核自身抗体的杂交瘤细胞系。
美国专利申请10/810,751公开了两种抗CD63单克隆抗体的应用以及它们针对人乳腺、前列腺、胰腺和黑色素瘤癌细胞的体外和体内功效。
美国专利5,296,348讲述了用于选择特异性针对内在化的癌细胞表面抗原的单克隆抗体的方法以及用于鉴定对细胞代谢具有抗转录和/或抗复制作用的单克隆抗体的方法。通过实施例，显示ME491抗体在W9、WM35、WM983黑素瘤细胞和SW948结肠直肠癌细胞中内在化。此外，显示了ME491抗体降低了SW948细胞中的转录和细胞增殖。专利申请US20030211498A1(及其相关申请：WO0175177A3，WO0175177A2，AU0153140A5)公开了一种使用与卵巢肿瘤标志多肽结合的抗体来抑制卵巢肿瘤生长或者转移的方法，所述多肽由选自包括CD63抗原的一组的卵巢肿瘤标志基因编码。利用卵巢癌进行了基因表达系列分析，以鉴定卵巢肿瘤标志基因，该分析使CD63被鉴定为候选基因。专利申请WO02055551A1(及其相关申请CN1364803A)公开了一种新的多肽-人CD63抗原56.87。专利申请CN1326962A公开了一种新的多肽-人CD63抗原14.63。专利申请CN1326951A公开了一种新的多肽-人CD63抗原15.07。专利申请CN1351054A公开了一种新的多肽-人CD63抗原11.11。这些专利和专利申请均鉴定了CD63抗原和抗体，但未公开本发明分离的单克隆抗体，或者本发明分离的单克隆抗体的应用。
编码ME491多肽抗原的基因被克隆，其序列于1988年2月24日被接受公布(Can Res 48：2955，1988年6月1日)；编码CD63的基因被克隆并于1991年2月公开了其序列(JBC 266(5)：3239-3245，1991)，并且所述公开清楚表明了ME491与CD63的同一性。
WO2004041170.89(序列识别号：89，优先权申请日：2004年6月29日)，WO2003068268-A2(序列识别号：1，优先权申请日：2003年2月13日(2003WO-EP001461)；其他优先权日：2002年2月14日(2002GB-00003480))，WO2003057160-A29(序列识别号：40，优先权申请日：2002年12月30日(2002WO-US041798)；其他优先权日：2002年1月2日(2002US-0345444P))都公开了与CD63具有100％序列同源性的多肽。
WO2003016475-A2(序列识别号：9787&12101，优先权申请日：2002年8月14日(2002WO-US025765)其他优先权日：2001年8月14日(2001US-0312147P)公开了与包含CD63的238个氨基酸中的237个氨基酸具有100％序列同源性的多肽。
WO2003070902-A2(序列识别号：27，优先权申请日：2003年2月18日(2003WO-US004902)；其他优先权日：2002年2月20日(2002US-0358279P))公开了与包含CD63的238个氨基酸中的224个氨基酸具有94％序列同源性的多肽。
EP1033401-A2(序列识别号：4168&4913，优先权申请日：2000年2月21日(2000EP-00200610)；其他优先权日：1999年2月26日(99US-0122487P))公开了分别与包含CD63的238个氨基酸中的205个氨基酸和94个氨基酸具有100％序列同源性的多肽。
WO200257303-A2(志贺菌属(Shigella)ospG捕获的人猎物蛋白#26，优先权申请日：2002年1月11日(2002WO-EP000777)；其他优先权日：2001年1月12日(2001US-0261130P))公开了与包含CD63的238个氨基酸中的130个氨基酸具有100％序列同源性的多肽。
WO200055180-A2(序列识别号：756，优先权申请日：2000年3月8日(2000WO-US005918)；其他优先权日：1999年3月12日(99US-0124270P))公开了与包含CD63的238个氨基酸中的127个氨基酸具有99％序列同源性的多肽。
WO200200677-A1(序列识别号：3203，优先权申请日：2001年6月7日(2001WO-US018569)；其他优先权日：2000年6月7日(2000US-0209467P))公开了与包含CD63的238个氨基酸中的132个氨基酸具有97％序列同源性的多肽。
WO9966027-A1(来自人CD63蛋白的大胞外环(Large extracellularloop)序列，优先权申请日：1999年6月15日(99WO-US013480)；其他优先权日：1998年6月15日(98US-0089226P))公开了与包含CD63的238个氨基酸中的99个氨基酸具有100％序列同源性的多肽。
WO200270539-A2(序列识别号：1207，优先权申请日：2002年3月5日(2002WO-US005095)；其他优先权日：2001年3月5日(2001US-00799451))公开了与包含CD63的238个氨基酸中的102个氨基酸具有86％序列同源性的多肽。
EP1033401-A2(序列识别号：4169，优先权申请日：2000年2月21日(2000EP-00200610)；其他优先权日：1999年2月26日(99US-0122487P)公开了与包含CD63的238个氨基酸中的74个氨基酸具有100％序列同源性的多肽。
这些专利申请鉴定了与CD63抗原具有不同序列同源性的多肽。在大多数情况下，这些申请还公开了相应多肽及其同系物的抗体和抗体衍生物，但没有公开本发明分离的单克隆抗体，或本发明分离的单克隆抗体治疗人肺、前列腺和结肠癌或其它人癌的应用。重要的是，所有上述申请都是在编码CD63的多核苷酸序列公开后提交的。
发明概述
本申请采用6,180,357专利中讲述的制备患者特异性抗癌抗体的方法，以分离杂交瘤细胞系，所述细胞系编码癌性疾病调节单克隆抗体。这些抗体可以被制备为特异性地针对一种肿瘤，由此使得癌症治疗的个体化成为可能。在本申请公开的内容中，具有细胞杀灭(细胞毒素的)或细胞生长抑制(细胞生长抑制的)特性的抗癌抗体将在下文中被称为细胞毒的。这些抗体可以用于帮助癌症的分期和诊断，也可以用于治疗肿瘤转移。这些抗体也可以通过预防性治疗的方式用于癌症预防。与传统的药物发现模式下制备的抗体不同，用本方法制备的抗体可以靶向以前没有表明对恶性组织生长和/或存活必需的分子和途径。而且，这些抗体的结合亲和性满足启动细胞毒性作用事件的要求，所述事件可不顺从于更强的亲和性相互作用。此外，本发明还涉及将标准的化疗模式，例如放射性核素，与本发明的CDMAB偶联，从而使所述化疗剂的作用集中。CDMAB还可以与毒素、细胞毒性部分、酶(例如生物素偶联酶)或者造血细胞偶联，从而形成抗体偶联物。
个体化抗癌治疗的前景将给患者的治疗方式带来改变。可能出现的临床情景是在肿瘤出现时获取肿瘤样本并入库。通过该样本，从预存在的癌性疾病调节抗体组中对肿瘤进行分型。对该患者进行常规分期，而所提供的抗体可用于该患者的进一步分期。用现有的抗体可以直接对该患者进行治疗，且所述肿瘤特异性的抗体组可以通过使用本文中列出的方法来制备或通过噬菌体显示库与本文公开的筛选方法合用来制备。既然其他肿瘤可能携带一些与被治疗肿瘤相同的抗原决定簇，所有制备的抗体都将被加入到抗癌抗体库中。按照本方法制备的抗体可以用于治疗许多患有与这些抗体结合的肿瘤的患者的癌性疾病。
除抗癌抗体之外，患者可以选择接受目前推荐的疗法作为多模式治疗方案的一部分。通过本方法分离的抗体对非癌性细胞是相对无毒的事实允许大剂量抗体组合单独应用，或与传统的治疗联合应用。高治疗指数也允许短时程重复治疗，这将降低治疗抗性细胞出现的可能性。
如果患者的初期治疗产生耐药性或发生了转移，可以重复肿瘤特异性抗体的制备过程进行再次治疗。此外，所述抗癌抗体可以与从该患者体内获得的红细胞偶联，重新输注到患者体内用于治疗转移肿瘤。目前几乎没有有效的治疗转移癌的方法，而转移通常预示着导致死亡的不良结果。然而，转移癌通常血管丰富，并且通过红细胞来递送抗癌抗体可以具有将抗体富集在肿瘤部位的效应。即便在转移之前，大多数癌细胞也要依赖于宿主的血供来存活，因而与红细胞偶联的抗癌抗体对原位肿瘤同样有效。可选择地，所述抗体可以与例如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞等其他血细胞偶联。
抗体有五类，每类都与其重链所赋予的功能相关。通常认为通过抗体依赖性细胞的细胞毒性作用或补体依赖性细胞毒性作用来介导裸抗体的癌细胞杀伤功能。例如，鼠IgM和IgG2a抗体能够通过结合补体系统的C1组分来活化人类补体，从而活化导致肿瘤裂解的补体活化的经典途径。对于人类抗体，最有效的补体激活抗体通常是IgM和IgG1。鼠IgG2a和IgG3同种型抗体可以有效地募集具有Fc受体的细胞毒细胞，所述Fc受体会导致单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和某些淋巴细胞的细胞杀伤作用。人IgG1和IgG3同种型抗体介导ADCC。
抗体介导的癌症杀伤的另一个可能机制可能通过抗体的使用，所述抗体能够催化细胞膜及其结合的糖蛋白或糖脂中的多种化学键的水解，即所谓的催化抗体。
抗体介导的癌细胞杀伤还有三种机制。第一种是用抗体作为疫苗以诱导机体产生针对存在于癌细胞的推定抗原的免疫反应。第二种是用抗体靶向生长受体，并干扰它们的功能或下调所述受体，以使受体功能有效丧失。第三种是这类受体对细胞表面部分的直接连接(ligation)作用，这可导致直接的细胞死亡，比如诸如TRAIL R1或TRAIL R2的死亡受体，或是诸如αVβ3及其类似物的整合素分子的连接。
癌症药物的临床应用是基于该药物在可接受的风险范围下对患者的益处。在癌症治疗中，存活率通常是追求的最主要的益处。但是，除了延长寿命之外，还有许多其他公认的益处。在治疗对存活率没有负面影响的情况下，这些其他益处包括症状减轻、防止副作用、延长复发或无疾病存活时间以及延长病情进展时间。这些标准是被普遍接受的，且诸如美国食品药品管理局(F.D.A.)等管理机构批准产生这些益处的药物(Hirschfeld et al.Critical Reviews in Oncology/Hematolgy(肿瘤学/血液学的临床综述)42：137-143 2002)。除了这些标准之外，人们充分认识到还有一些其他的指标可以预测这些类型的益处。在某种程度上，美国FDA准许的快速审批程序肯定了可能预测患者受益的替代品的存在。到2003年末，有16种药物在这种程序下得到批准，在这些药物中，有四种进入了完全审批，即后续的研究已经显示了直接的患者受益，正如替代指标预测的那样。确定药物对实体肿瘤疗效的一个重要的指标是通过测定对治疗的反应来评价肿瘤负荷(Therasse et al.Journal of the National CancerInstitute 92(3)：205-216 2000)。这类评价的临床标准(RECIST criteria(RECIST标准))已经由实体肿瘤反应评价标准工作组(Response EvaluationCriteria in Solid Tumors Working Group)公布，该工作组由国际癌症专家组成。正如依据RECIST标准的客观反应显示的，与适当的对照组相比，对肿瘤负荷有确切作用的药物易于最终对患者产生直接的益处。在临床前设置中，肿瘤负荷通常能更直接地被评价和记录。因为临床前研究可以转化成临床设置，所以在临床前模型中延长存活率的药物有最好的预期临床效用。与临床治疗产生的积极作用相似，在临床前设置中减轻肿瘤负荷的药物也对疾病有明显的直接影响。尽管延长生存时间是癌症药物治疗中追求的最主要的临床结果，但仍有其他有临床作用的益处，并且显然，降低肿瘤负荷(其与疾病进展的延迟、生存时间的延长或两者都有关系)也能导致直接的益处，并具有临床作用(Eckhardt et al.Developmental Therapeutics：Successes and Failures of Clinical Trial Designsof Targeted Compounds(发展的治疗学：靶化合物的临床试验设计的成功与失败)；ASCO Educational Book，39th Annual Meeting，2003，pages209-219)。
本发明描述了通过其在细胞毒性分析和人癌症的动物模型中的作用鉴定的AR75A105.8的开发和应用。本发明描述了特异性与存在于CD63分子上的一个或多个抗原决定簇结合的试剂，其作为裸抗体还对恶性肿瘤细胞而非正常细胞具有体外细胞毒特性，并且也可作为裸抗体直接介导肿瘤生长的抑制。另外的进步是关于诸如该抗体的抗癌抗体的应用以靶向肿瘤表达的相关抗原来实现肿瘤生长抑制以及其它癌症治疗的阳性指标。
总之，本发明讲述了AR75A105.8抗原作为治疗试剂靶点的应用，给予所述治疗试剂时可以减轻哺乳动物中表达该抗原的癌症的肿瘤负荷。本发明也讲述了CDMAB(AR75A105.8)及其衍生物、其抗原结合片段和其细胞毒性诱导配体，靶向它们的抗原以减轻哺乳动物中表达该抗原的癌症的肿瘤负荷的用途。此外，本发明也讲述了在癌细胞内检测AR75A105.8抗原的用途，其可以用于携带表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的诊断、治疗预测及预后。
因此，本发明的目的是利用制备抗来源于特定个体的癌细胞、或者一种或多种特定癌细胞系的癌性疾病调节抗体(CDMAB)的方法，以分离杂交瘤细胞系和该杂交瘤细胞系编码的相应的分离的单克隆抗体及其抗原结合片段。所述CDMAB对癌细胞有细胞毒性作用，而同时对非癌细胞相对无毒。
本发明的另外目的是讲述癌性疾病调节抗体，其配体和其抗原结合分段。
本发明的另外目的是产生癌性疾病调节抗体，其细胞毒性通过抗体依赖的细胞毒性介导。
本发明的另外目的是产生癌性疾病调节抗体，其细胞毒性通过补体依赖的细胞毒性介导。
本发明的另外目的是产生癌性疾病调节抗体，其细胞毒性是它们催化细胞化学键水解的能力的功能。
本发明的另外目的是产生癌性疾病调节抗体和配体，其可用于癌症诊断、预测和监测的结合分析。
通过本发明下述的说明、举例和一些实施方案的描述，本发明其他的目的和优点将变得显而易见。
附图简述
本专利或申请文件包含至少一张彩色图片。依据请求并支付必要费用后，专利局会提供带彩色附图的本专利或申请文件公开文本的复印件。
图1比较了杂交瘤上清针对细胞系A549、NCI-H23、NCI-H460、MB231和Hs888.Lu的细胞毒性百分比和结合水平。
图2是细胞毒性分析中AR75A105.8与阳性对照和阴性对照的比较。
图3表示AR75A105.8和抗EGFR对照与癌细胞系和正常细胞系的结合。数据制成表格，以高于同种型对照的倍增来表示平均荧光强度。
图4包括针对数种癌细胞和非癌细胞系的AR75A105.8和抗EGFR抗体的代表性FACS直方图。
图5显示AR75A105.8在预防性Lovo结肠癌模型中对肿瘤生长的影响。垂直虚线表示给予抗体的时期。数据点表示平均值+/-SEM(均数的标准误)。
图6显示AR75A105.8在预防性Lovo结肠癌模型中对体重的影响。数据点表示平均值+/-SEM。
图7.获自MDA-MB-231(泳道1)和BxPC-3(泳道4)细胞系的全细胞膜部分的样本以及获自PC-3(泳道2)和CCD-27sk(泳道3)细胞系的全细胞裂解产物的样本的Western印迹。用AR75A105.8和1A245.6作为探针检测印迹。
图8.通过MDA-MB-231细胞系的全细胞膜部分与7BD-33-11A(泳道1)、AR75A105.8(泳道2)以及IgG1同种型对照(泳道3)的免疫沉淀制备的免疫复合物的Western印迹。重复的印迹用抗体7BD-33-11A(左泳道)、AR75A105.8(中间泳道)以及用IgG1同种型对照抗体(右泳道)作为探针来检测。
图9.人重组融合构建体GST-EC2(CD63)的Western印迹。印迹的各条泳道用7BD-33-11A(泳道2)、H460-22-1(泳道3)、1A245.6(泳道4)、7BDI-58(泳道5)、7BDI-60(泳道6)、AR51A994.1(泳道7)、AR75A105.8(泳道8)以及用阴性对照H460-16-2(抗CD44；泳道1)和同种型对照抗体(泳道9和10)作为探针来检测。
发明详述
下面用于概述、描述、实施例和权利要求书中的字词或短语通常都有其指定的含义。
术语“抗体”使用其最广泛的涵义，且特别包括，例如单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂和中和抗体，去免疫的、鼠科的、嵌合的或人源化的抗体)、携带有多表位特异性的抗体组合物、单链抗体、抗体的免疫偶联物和抗体片段(见下文)。
本文使用的术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，也就是说，包括这群抗体的单个抗体是相同的，除了可以少量存在的可能自然发生的变异。单克隆抗体针对单一抗原部位是高度特异性的。而且，与包含针对不同决定基(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每一种单克隆抗体针对抗原上的单一的决定基。除了特异性之外，单克隆抗体的优势还在于其合成可以不受其他抗体的污染。修饰语“单克隆的”指从基本同质的抗体群中获得的抗体的特征，而不能解释为需要通过任何特定方法来产生该抗体。例如，本文使用的单克隆抗体可以通过由Kohler et al.，Nature，256：495(1975)首次描述的杂交瘤(鼠或人)方法制备或由重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利第4,816,567号)。“单克隆抗体”也可以从噬菌体抗体文库中分离，使用的技术在例如Clacksonet al.，Nature，352：624-628(1991)和Marks et al.，J.MoI.Biol，222：581-597(1991)中描述过。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包括其抗原结合区域或其可变区。抗体片段的实例包括非全长的抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双体(diabodies)；线形抗体；单链抗体分子；单链抗体，单结构域抗体分子，融合蛋白，重组蛋白和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“完整”抗体指不但包含轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2、CH3，还包含结合抗原的可变区的抗体。恒定结构域可以是天然序列的恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列的变体。优选地，完整抗体有一个或多个效应器功能。
依据完整抗体的重链恒定结构域的氨基酸序列，完整抗体可以分为不同的“种类”。主要有五类完整的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可进一步分成“亚类”(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。与不同种类抗体对应的重链恒定区分别被称为α，δ，，γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚单位结构和三维空间结构是公知的。
抗体“效应器功能”指那些由抗体Fc区引起的(天然序列的Fc区或氨基酸序列变体的Fc区)的生物活性。抗体效应器功能的实例包括C1q结合；补体依赖的细胞毒性作用；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如B细胞受体；BCR)等。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用”和“ADCC”指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性的细胞毒细胞(例如天然杀伤(NK)细胞，中性粒细胞和巨噬细胞)识别结合在靶细胞上的抗体，随后导致该靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。关于造血细胞FcR表达的总结见Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)464页的表3。为了测定目标分子的ADCC活性，可以进行例如在美国专利5,500,362或5,821,337中描述的体外ADCC活性分析。用于这类分析的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可选择地或附加地，可以在体内评价目标分子的ADCC活性，例如在诸如Clynes et al.PNAS(USA)95：652-656(1998)中公开的动物模型中。
“效应细胞”指表达一种或多种FcRs、执行效应功能的白细胞。优选地，这些细胞至少表达FcγRIII，并执行ADCC效应器功能。介导ADCC的人类白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒T细胞和中性粒细胞；优选PBMCs和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源中分离，例如从本文中描述的血液或PBMC中分离。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合于抗体Fe区的受体。优选的FcR是天然序列的人类FcR。而且，优选的FcR是结合于IgG抗体(γ受体)的受体，并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，其包括这些受体的等位基因变体和选择性的剪切形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，两者的氨基酸序列相似，区别主要在于其胞浆区。激活性受体FcγRIIA在其胞浆区含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞浆区含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。(参见，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997)中的综述M)。在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel etal.，Immunomethods 4：25-34(1994)和de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中对FcR进行了综述。其他FcR，包括将来要被确认的FcR，都包括在本发明中的术语“FcR”中。该术语也包括负责将母体的IgG转运到胎儿体内的新生受体，FcRn(Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976)和Kim et al.，Eur.J.Immunol.24：2429(1994))。
“补体依赖性细胞毒性作用”或“CDC”指分子在补体存在下，裂解靶标的能力。补体激活途径通过补体系统的第一组分(Clq)和与相关抗原络合的分子(比如，抗体)的结合启动。为了评价补体激活，可以进行如在Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中描述的CDC分析。
术语“可变的”指可变区某些部分的序列在抗体间高度不同，并用于每一种特定抗体与其特定抗原的结合及其特异性。然而，变异并不是均匀分布在抗体的可变区域内。它集中在轻链和重链可变区的三个所谓的高度可变区的片段内。可变区内保守性较高的部分被称为骨架区(FRs)。每个天然的重链和轻链可变区，包含主要采用β-片层构型的四个FR，由三个高度可变区连接在一起，形成环状连接，在一些情况下形成部分>片层结构。每条链的高度可变区通过FRs以密切靠近的方式与另一条链的高度可变区结合在一起，促成抗体的抗原结合部位的形成(参见Kabat et al，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学目标蛋白的序列)，第5版.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.pp 15-17；48-53(1991))。恒定区并不直接参与抗体与抗原的结合，而是呈现各种效应器功能，例如在抗体依赖性的细胞毒效应(ADCC)中抗体的参与。
本发明中使用的术语“高度可变区”指抗体中负责与抗原结合的氨基酸残基。高度可变区通常包括“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变区的氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变区的氨基酸残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat et al，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学目标蛋白的序列)，第5版.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.pp 15-17；48-53(1991))和/或“高变环”区的氨基酸残基(例如轻链可变区的残基2632(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变区的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk J.MoI.Biol.196：901-917(1987))。“骨架区”或“FR”残基指除了本发明定义的高变区残基之外的那些可变区的残基。抗体经木瓜蛋白酶水解产生两个相同的被称为“Fab”片段的抗原结合片段和一个残余的“Fc”片段，每个“Fab”片段都有单一的抗原结合部位，“Fc”片段的名称反映了其易结晶的能力。胃蛋白酶处理抗体产生一个F(ab′)2片段，其有两个抗原结合部位，且仍能够与抗原交联。
“Fv”是含有完整的抗原识别和抗原结合部位的最小抗体片段。该区域由以紧密、非共价结合的一条重链和一条轻链可变区的二聚体构成。每个可变区的三个高变区正是以这种构型相互作用，来决定VH-VL二聚体表面的抗原结合位点。六个高变区域共同赋予了抗体的抗原结合特异性。然而，即便单一的可变区(或只含有三个抗原特异性高变区的Fv的一半)仍能够识别和结合抗原，尽管比完整结合位点的亲和性低。Fab片段也含有轻链恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab′片段不同于Fab片段之处在于其重链CH1区的羧基末端多了几个氨基酸残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH在本发明中指代Fab′，其中恒定区的半胱氨酸残基至少携带一个游离的巯基。最初的F(ab′)2抗体片段以Fab′片段对产生，之间有铰链的半胱氨酸。其他的抗体片段的化学偶联也是公知的。
来自任一脊椎动物的抗体的“轻链”基于其恒定区的氨基酸序列，都可以归于两种截然不同的所谓kappa(κ)和lambda(λ)链中的一种。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL区，其中这些区域存在于单一的多肽链上。优选地，Fv多肽还包含VH和VL区之间的多肽连接子，其使scFv形成适于抗原结合的结构。关于scFv的综述参见Plückthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体药理学)，vol.113，Rosenburg and Moore eds.，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。
术语“双体(Diabodies)”指带有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一多肽链上(VH-VL)包含与轻链可变区(VL)结合的重链可变区(VH)。通过使用因过短而不能使同一条链上的两个区域配对的连接子，使这些区域被迫与另一条链上的互补区域配对，由此产生了两个抗原结合位点。例如在EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger et al，Proc.Natl Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)中对双体作了更详细的描述。
“分离的”抗体是指从其天然环境的组分中鉴别、分离和/或回收的抗体。其天然环境下的污染成分是指干扰抗体诊断或治疗作用的物质，可以包括酶、激素和其它的蛋白质或非蛋白质溶解物。因为缺乏抗体的天然环境中的至少一种组分，分离抗体包括重组细胞内部的原位抗体。但是，通常分离抗体会经过至少一步的纯化步骤来制备。
“结合”目的抗原如CD63抗原部分的抗体是指对所述抗原有充分亲和力的抗体，以致该抗体在靶定表达该抗原的细胞时，可以作为治疗或诊断试剂。如果该抗体能结合CD63抗原部分，它通常会优先结合CD63抗原部分，而不是其它受体，这不包括诸如非特异性的Fc接触的偶然结合或与其他抗原共有的翻译后修饰成分结合，该抗体不会与其他蛋白有明显的交叉反应。检测与目的抗原结合的抗体的方法在本领域中是公知的，可以包括但并不局限于例如FACS、细胞ELISA和Western印迹等分析。
正如本发明中使用的，“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”的表述可以交替使用，所有这些用法都包括其子代。也可以理解为由于人为的或非人为的突变，所有的子代在DNA组成上不可能完全相同。在原始转化细胞内筛选的有相同功能或生物学活性的突变子代包括在内。根据有意使用的不同指代的上下文，指代是清楚的。
“治疗”既指治疗性处理，也指预防性或防止性的措施，其目的就是预防或减缓(减轻)目标病理状态或病症。需要治疗的个体包括那些已经存在所述病症的个体，还包括那些将发展为该病症的或欲对其病症进行预防的个体。因此，本文中欲被治疗的哺乳动物已经被诊断为患有该病症或倾向于或易患该病症。
术语“癌症”和“癌性(的)”是指或描述哺乳动物的生理状态，其典型特征是细胞生长或死亡不受调控。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这些癌症更多具体的实例包括鳞状细胞癌(例如鳞状上皮细胞癌)，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌在内的肺癌，腹膜癌，肝细胞癌，包括胃肠道癌在内的胃癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝脏癌症，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛癌，阴茎癌，还有头颈部癌。
“化疗剂”是用于癌症治疗的化合物。化疗剂的实例包括：诸如噻替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)的烷化剂；诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)、哌泊舒凡(piposulfan)的烷基磺酸酯类；诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)、乌瑞替派(uredopa)的氮丙啶类；包括六甲蜜胺、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基奥罗蜜胺(trimethylolomelamine)在内的乙烯亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamine)；诸如瘤可宁(chlorambucil)、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀(uracil mustard)等氮芥类药物；如卡氯芥、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司丁、雷莫司汀等硝脲类(nitrosureas)；如阿克拉霉素类、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加里刹霉素、洋红霉素、碳霉素(carnomycin)、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托咪定、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、依达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、灰霉素、紫菜霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星类抗生素；甲氨碟呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)类抗代谢类药；如二甲叶酸、氨甲喋呤、蝶罗呤、三甲曲沙等叶酸拟似物；如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫米嘌呤、硫鸟嘌呤类嘌呤类似物；如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU等嘧啶类似物；如卡鲁睾酮、屈他雄酮丙酸酯、表硫雄醇、美雄烷、睾内酯酮等男性激素类药物；如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦等抗肾上腺类药物；如亚叶酸等叶酸补充物；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；足叶草酸；2-乙肼；丙卡巴肼；
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；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2＂-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(＂Ara-C＂)；环磷酰胺；塞替派；如紫杉醇(
Figure A200780030641D0035142735QIETU
，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ.)和多西他赛(
Figure A200780030641D0035142751QIETU
，Aventis，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)等紫杉烷类；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；如顺铂和卡铂等铂类似物；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；去甲长春碱；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；柔红霉素；氨蝶呤钠；希罗达；伊班膦酸钠；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨；以及上述任一种药物在药学上可以接受的盐、酸或衍生物。调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素类药物也包括在本定义内，诸如抗雌激素药物，包括例如它莫西芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制剂4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷诺昔芬(keoxifene)、LY1 17018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通)；以及抗雄激素物质，诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任一种药物在药学上可以接受的盐、酸或衍生物。
用于治疗目的的“哺乳动物”指任何一种可以归于哺乳类的动物，包括人类、小鼠、免疫缺陷鼠(SCID)或裸鼠或品系小鼠、家畜和农场动物及动物园内的动物、体育动物或宠物，比如绵羊、狗、马、猫、母牛等。优选地，本发明中的哺乳动物指人类。
“寡核苷酸”指短长度、单链或双链多聚脱氧核苷酸，其通过已知的方法(例如磷酸三酯、亚磷酸盐、亚磷酰胺化学)，利用例如发表于1988年5月4日的EP 266,032中描述的固相技术，或利用Froehler et al，Nucl.Acids Res.，14：5399-5407，1986描述的脱氧核苷H-磷酸盐中间物化学合成。然后将其用聚丙烯酰胺凝胶纯化。
除非另外指出，术语“CD63抗原部分”用于本文时是指四次跨膜蛋白家族的III型膜蛋白，其还称为黑色素瘤1抗原、眼黑色素瘤相关抗原、黑色素瘤相关抗原ME491、溶酶体相关膜糖蛋白3、致密体膜蛋白(granulophysin)、黑色素相关抗原MLA1。
“嵌合”抗体指免疫球蛋白，其部分重链和/或轻链与来源于特定种属或属于特定抗体种类或亚类的抗体的对应序列相同或同源，同时链上余下序列与来源于另一种属或属于另一种类或亚类的抗体的对应序列相同或同源，此外还指这些抗体的片段，只要这些片段能够表现出所需的生物活性(美国专利4,816,567和Morrison et al，Proc.Natl.Acad.Sci USA，81：6851-6855(1984))。
非人类(例如鼠科)抗体的“人源化”形式指特殊的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv，Fab，Fab′，F(ab)2或抗体的其他抗原结合序列)，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。在绝大多数情况下，人源化抗体是人的免疫球蛋白(受者抗体)，其中，所述受者抗体的互补决定区(CDR)的残基被诸如具有所需的特异性、亲和力、能力的小鼠、大鼠或兔等的非人类抗体(供者抗体)的CDRs的残基所替代。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)残基被相应的非人类FR残基所替代。此外，人源化抗体可以包括既不在受者抗体也不在引入的CDR或FR序列的残基。这些修饰进一步改善和优化了抗体的性能。通常，人源化抗体包括至少一个，通常是两个可变区的基本上全部，其中全部或基本上全部的CDR区对应非人类免疫球蛋白的CDR区，且全部或基本上全部的FR残基是人类免疫球蛋白共有序列的FR残基。人源化抗体也最适宜包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人类免疫球蛋白的恒定区。
“去免疫化”抗体是对给定的物种没有免疫原性或免疫原性较差的免疫球蛋白。通过改造抗体的结构可以实现去免疫化。任何本领域技术人员公知的去免疫化技术都可以使用。例如，在发表于2000年6月15日的WO 00/34317中，描述了一项使抗体去免疫原性的适当的技术。
“同源性”被定义为比对序列和必要时引入空位(gaps)，以实现最大同源性百分比后，氨基酸序列变体中相同残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域公知的。
诱导“细胞凋亡”的抗体是通过任何方式诱导程序性细胞死亡的抗体，这些方式例如但不限于：结合膜联蛋白V(Annexin V)、半胱天冬酶(caspase)活性、DNA断裂、细胞皱缩、内质网扩张、细胞破碎和/或膜囊泡(所谓的凋亡小体)的形成。
在本说明书自始至终中，杂交瘤细胞系以及从其产生的分离的单克隆抗体可被选择用其内部名称AR75A105.8，或者用保藏号IDAC280306-03来表示。
本文中使用的“抗体-配体”包括对靶抗原显示结合特异性的部分，所述部分可以是完整的抗体分子、抗体片段和至少有一个抗原结合区或其部分(即抗体分子的可变部分)的任何分子，例如，Fv分子、Fab分子、Fab′分子、F(ab′)2分子、双特异性抗体、融合蛋白或任一基因工程分子，所述分子特异性识别和结合被以IDAC 280306-03命名的杂交瘤细胞系产生的分离的单克隆抗体结合的抗原(IDAC 280306-03抗原)。
本文中使用的“癌性疾病调节抗体”(CDMAB)指以有益于患者的方式，例如通过减轻肿瘤负荷或延长肿瘤患者的生存期的方式，调节癌性疾病过程的单克隆抗体，以及其抗体-配体。
本文使用的“抗原结合区”表示识别靶抗原的分子的部分。
本文使用的“竞争性抑制”指使用常规的抗体相互(reciprocal)竞争分析(Belanger L.，Sylvestre C.and Dufour D.(1973)，Enzyme linkedimmunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures(竞争和夹心法的甲胎蛋白的酶联免疫测定).Clinica Chimica Acta 48，15)能够识别并结合决定簇位点，其中命名为IDAC 280306-03的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体(IDAC 280306-03抗体)靶向所述决定簇位点。
本文使用的“靶抗原”是IDAC 280306-03抗原或其部分。
如本文所用，“免疫偶联物”指以化学或生物学方式与细胞毒素、放射性试剂、酶、毒素、抗肿瘤药或治疗剂结合的诸如抗体的任何分子或CDMAB。该抗体或CDMAB可以在所述分子的任何位置与细胞毒素、放射性试剂、抗肿瘤药或治疗剂连接，只要它能够与其靶标结合。免疫偶联物的实例包括抗体毒素化学偶联物和抗体-毒素融合蛋白。
如本文所用，“融合蛋白”指任何嵌合蛋白，其中，抗原结合区与例如毒素、酶或蛋白药物的生物活性分子连接。
为了更充分理解本文中描述的发明，进行下述说明。
本发明提供CDMAB(即，IDAC 280306-03CDMAB)，其特异识别并结合IDAC 280306-03抗原。
由以保藏号280306-03保藏于IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的CDMAB可以采用任何形式，只要它具有抗原结合区，所述抗原结合区竞争性抑制由杂交瘤IDAC 280306-03产生的单克隆抗体与其靶抗原的免疫特异结合。因此，与IDAC 280306-03抗体具有相同结合特异性的任何重组蛋白(例如，融合蛋白，其中所述抗体与诸如淋巴因子或者肿瘤抑制生长因子的另一蛋白结合)也属于本发明的范围。
在本发明的一个实施方案中，所述CDMAB是IDAC 280306-03抗体。
在其他实施方案中，所述CDMAB是抗原结合片段，其可以是具有IDAC 280306-03抗体的抗原-结合区的Fv分子(例如单链Fv分子)，Fab分子，Fab′分子，F(ab′)2分子，融合蛋白，双特异抗体，异种抗体或者任何重组分子。本发明的CDMAB针对IDAC 280306-03单克隆抗体针对的表位。
本发明的CDMAB可以被修饰，即，通过分子内的氨基酸修饰，从而产生衍生物分子。也可以是化学修饰。
衍生物分子将保留所述多肽的功能特性，即，具有这类取代的分子将仍然允许所述多肽与IDAC 280306-03抗原或者其部分结合。
这些氨基酸取代包括在本领域中公知的“保守”氨基酸取代，但并不局限于此。
例如，某些被称为“保守氨基酸取代”的氨基酸取代能够在蛋白中经常出现，但并不改变该蛋白的构象或功能，这是蛋白质化学中已建立的法则。
这些改变包括异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)的任何一种取代任何其他的疏水氨基酸；天门冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，反之亦然；以及丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)，反之亦然。其他的取代也可被认为是保守的，这取决于特定氨基酸的环境和其在蛋白质三维结构中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)可经常互换，丙氨酸和缬氨酸(V)也是。相对疏水的甲硫氨酸(M)可经常与亮氨酸和异亮氨酸互换，有时与缬氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)经常互换，其发生部位氨基酸残基的明显特征是其电荷，这两种氨基酸残基的不同pK的差别并不明显。在特定情境下，仍有其他的一些变化可以被认为是“保守的”。
给定一种抗体，本领域普通技术人员可以制备识别相同表位的竞争性抑制CDMAB，例如竞争性抗体(Belanger et al.，1973)。一种方法是用表达该抗体识别抗原的免疫原产生免疫。该样品可以包括组织、分离的蛋白或细胞系，但并不局限于这些。可以用诸如ELISA、FACS或免疫沉淀的竞争性分析筛选产生的杂交瘤，该分析能鉴定抑制所检测抗体结合的抗体。另一种方法可以利用噬菌体展示文库，淘选识别所述抗原的抗体(Rubinstein et al.，2003)。在任何一种情况下，杂交瘤的选择都是基于它们竞争过原抗体与其靶抗原的结合的能力。因此，这些杂交瘤的特征是识别与所述原抗体相同的抗原，并且这些杂交瘤将更为特异地识别同样的表位。
实施例1
杂交瘤制备-杂交瘤细胞系AR75A105.8
依据布达佩斯条约，杂交瘤细胞系AR75A105.8于2006年3月28日保藏于加拿大国际微生物保藏单位(IDAC)，加拿大卫生部微生物局，位于加拿大马尼托巴省温尼伯市阿林顿街道1015，R3E 3R2，保藏号为280306-03。依据37 CFR 1.808的规定，保藏者保证在专利授权时将不可撤销地取消对公众获取该保藏材料的所有限制。如果保藏中保藏样本不存活，应替换保藏物。
为了制备产生AR75A105.8抗癌抗体的杂交瘤，在PBS中制备冷冻的人肺透明细胞癌肿瘤组织(Genomics Collaborative，Cambridge，MA)的单细胞悬浮液。将IMMUNEASYTM(Qiagen，Venlo，Netherlands)佐剂轻轻混合后备用。通过皮下注射含2百万个细胞的50微升抗原-佐剂来免疫5到7周龄的BALB/c小鼠。初次免疫后2和5周，用新鲜制备的含2百万个细胞的50微升抗原-佐剂腹腔注射加强免疫小鼠。末次免疫后第3天，取出脾脏用于融合。将分离的脾细胞与NSO-1骨髓瘤细胞伴侣融合，制备杂交瘤。检测杂交瘤亚克隆融合的上清。
为了检测杂交瘤细胞分泌的抗体是IgG，还是IgM同种型，进行ELISA分析。将4℃包被缓冲液(0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH9.2-9.6)中的浓度为2.4μg/mL的山羊抗小鼠的IgG+IgM(H+L)，按100微升/孔加入ELISA板过夜。该板用洗涤缓冲液(PBS+0.05％吐温)洗3次。按100微升/孔加入封闭缓冲液(5％奶洗涤缓冲液)，室温1小时，随后用洗涤缓冲液洗3次。按100微升/孔加入杂交瘤上清，将该板室温孵育1小时。该板用洗涤缓冲液洗3次，按100微升/孔加入山羊抗小鼠的IgG或IgM辣根过氧化物酶偶联物的1/100,000稀释液(用含1％奶的PBS稀释)。室温孵育1小时后，该板用洗涤缓冲液洗3次。按100微升/孔加入TMB溶液，室温孵育1-3分钟。按50微升/孔加入2M H2SO4，终止颜色反应，用Perkin-Elmer HTS7000读板仪在450nm波长处读板。如图1所示，AR75A105.8杂交瘤主要分泌IgG同种型抗体。
为了确定杂交瘤细胞分泌的抗体的亚类，使用小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒(HyCult Biotechnology，Frontstraat，Netherlands)进行同种型分型(isotyping)实验。将500微升缓冲溶液加入到包含大鼠抗小鼠亚类特异性抗体的检测条(test strip)上。向试管中添加500微升杂交瘤上清，并通过温和搅拌浸没。利用偶联到胶体微粒的大鼠单克隆二抗来直接检测捕获的小鼠免疫球蛋白。这两种蛋白的组合产生了用于分析同种型的可视信号。抗癌抗体AR75A105.8为IgG1，κ同种型。
经过一轮有限稀释，在细胞ELISA分析中，检测杂交瘤上清中与靶细胞结合的抗体。检测了3种人肺癌细胞系，1种人乳腺癌细胞系和1种人正常肺细胞系：分别是A549、NCI-H23、NCI-H460-23、MDA-MB-231(MB-231)和Hs888.Lu。铺板的细胞在使用前先固定。室温下，该板用包含MgCl2和CaCl2的PBS洗涤3次。每孔加入100微升稀释于PBS中的2％多聚甲醛，室温10分钟，然后倒掉。室温下，该板用包含MgCl2和CaCl2的PBS再洗涤3次。每孔加100微升溶于洗涤缓冲液(PBS+0.05％吐温)的5％奶进行封闭，室温1小时。该板用洗涤缓冲液洗3次，按100微升/孔加入杂交瘤上清，室温孵育1小时。用洗涤缓冲液将该板洗3次，按100微升/孔加入与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠的IgG抗体的1/25,000稀释液(用含1％奶的PBS稀释)。室温孵育1小时后，该板用洗涤缓冲液洗3次，每孔加入100微升TMB底物，室温孵育1-3分钟。每孔加入50微升2M H2SO4终止反应，并用Perkin-ElmerHTS7000读板仪在450nm波长处读板。如图1列表所示，结果表示为与内部(in-house)的IgG同种型对照相比，高出背景的倍数，事先已经证明该对照不与所检测的细胞系结合。来源于杂交瘤AR75A105.8的抗体显示出与所有测试的细胞系的可检测的结合。
进行抗体结合试验的同时，在A549、NCI-H23、NCI-H460-23、MDA-MB-231(MB-231)和Hs888.Lu这些细胞系上检测了杂交瘤上清的细胞毒性作用。钙黄绿素(calcein)AM购自Molecular Probes(Eugene，OR)。根据厂商的说明及下述的改动进行分析。所述分析前将细胞以预定的合适密度进行铺板。2天后，将来自杂交瘤微量滴定板的100微升上清转移到细胞板，在5％ CO2培养箱中孵育5天。将阳性对照孔吸净，加入100微升叠氮钠(NaN3)或者放线菌酮。经过5天处理后，倒空反应板的液体并吸干。通过多通道挤瓶将室温下包含MgCl2和CaCl2的DPBS分入每个孔中，叩打3次，倒空液体并吸干。将用包含MgCl2和CaCl2的DPBS稀释的50微升荧光钙黄绿素染料添加到每个孔中，在5％ CO2培养箱中于37℃孵育30分钟。在Perkin-Elmer HTS7000荧光读板仪中读板，数据用Microsoft Excel进行分析。结果列表于图1。来自AR75A105.8杂交瘤的上清对A549细胞产生了19％的特异性细胞毒性。这分别是从阳性对照叠氮钠和放线菌酮得到的细胞毒性的63％和33％。在NCI-H23细胞上也观测到了11％的特异性细胞毒性，这分别是从阳性对照叠氮钠和放线菌酮得到的细胞毒性的27％和55％。此外，在NCI-H460-23细胞上观测到了17％的特异性细胞毒性，这分别是从阳性对照叠氮钠和放线菌酮得到的细胞毒性的26％和106％。图1的结果表明AR75A105.8的细胞毒性作用不与其对癌细胞类型的结合水平成正比。AR75A105.8在所有测试的细胞系上都有可检测的结合，AR75A105.8有与A549、NCI-H23和NCI-H460-23细胞相关的细胞毒性。如图1列表所示，AR75A105.8在Hs888.Lu正常人肺细胞系中不产生细胞毒性。已知的非特异性的细胞毒性试剂放线菌酮和NaN3普遍产生了预期的细胞毒性。
实施例2
体外细胞毒性和结合
通过在CL-1000瓶(BD Biosciences，Oakville，ON)中培养杂交瘤来制备AR75A105.8单克隆抗体，每周进行两次收集和再接种。接着进行利用蛋白G琼脂糖凝胶4快流(Protein G Sepharose 4 Fast Flow)(AmershamBiosciences，Baie d′Urfé，QC)的标准抗体纯化步骤。利用去免疫的、人源化的、嵌合的或者鼠科的单克隆抗体也在本发明的范围内。
在细胞毒性分析中，将AR75A105.8与两种阳性对照(抗-EGFR抗体(C225，IgG1，κ，5μg/mL，Cedarlane，Hornby，ON)和放线菌酮(CHX，0.5微摩尔，Sigma，Oakville，ON)和阴性同种型对照1B7.11(抗TNP)，内部纯化)进行了比较(图2)。检测了前列腺癌(PC-3)和乳腺癌(MB-231)，以及来自皮肤(CCD-27sk)和肺(Hs888.Lu)的非癌细胞系。所有这些细胞均来自ATCC，Manassas，VA。钙黄绿素AM购自Molecular Probes(Eugene，OR)。根据厂商的说明书及下面列出的改动进行分析。分析前将细胞以预定的合适密度进行铺板。2天后，将100微升纯化的抗体或者对照稀释于培养基中，然后转移到所述细胞板，在5％ CO2培养箱中孵育5天。然后将板倒空并吸干。通过多通道挤瓶将室温下包含MgCl2和CaCl2的DPBS分入每个孔中，叩打3次，倒空液体，然后吸干。将用包含MgCl2和CaCl2的DPBS稀释的50微升荧光钙黄绿素染料添加到每个孔中，在5％ CO2培养箱中于37℃孵育30分钟。在Perkin-Elmer HTS7000荧光读板仪内读板，数据用Microsoft Excel进行分析，结果列表于图2。每种抗体得到5至50的分数，其基于以一式三份检测的4次实验观测到的平均细胞毒性，以及得到25至100的分数，其基于分析间所观测到的变异。这两种分数(细胞毒性分数)的总和显示于图2。大于或者等于55的细胞毒性分数被认为对所测细胞系是阳性的。相对于同种型和缓冲液阴性对照，AR75A105.8抗体在PC-3前列腺癌细胞系中产生了特异的细胞毒性。AR75A105.8没有在MB-231乳腺癌细胞系中产生阳性的细胞毒性分数。这与来自AR75A105.8克隆的杂交瘤上清的数据一致，所述上清也没有显示出针对MB-231癌细胞系的特异的细胞毒性(参见实施例1)。重要的是，与阴性对照相比，AR75A105.8对诸如CCD-27sk或者Hs888.Lu的非癌细胞系没有产生显著的细胞毒性，表明该抗体具有针对癌细胞的特异的细胞毒性。对1B7.11的细胞毒性分数是多次实验的平均值。化学细胞毒性试剂诱导了针对多种细胞系的预期的细胞毒性。
通过流式细胞术(FACS)评估了AR75A105.8与前列腺癌(PC-3)和乳腺癌(MB-231)以及来自皮肤(CCD-27sk)和肺(Hs888.Lu)的非癌细胞系的结合。首先用DPBS(不含Ca++和Mg++)洗涤细胞单层来制备用于FACS的细胞。然后在37℃使用细胞离解缓冲液(Invitrogen，Burlington，ON)将细胞从它们的细胞培养板上分离出来。经离心和收集后，将细胞重悬于4℃的包含MgCl2、CaCl2和2％胎牛血清的DPBS(染色培养基)并计数，等分到合适的细胞密度，离心以沉淀所述细胞，并在测试抗体(AR75A105.8)或者对照抗体(同种型对照，抗EGFR)存在的条件下将其重悬于4℃的染色培养基中。同种型对照和测试抗体以20μg/mL被评估，而抗EGFR以5μg/mL被评估，冰上置30分钟。在添加Alexa Fluor 546偶联的二抗前，用染色培养基洗涤细胞一次。然后在4℃添加溶于染色培养基的Alexa Fluor 546偶联的抗体，孵育30分钟。然后最后一次洗涤细胞，将其重悬于固定培养基(包含1.5％多聚甲醛的染色培养基)。使用FACSarrayTM System Software(BD Biosciences，Oakville，ON)在FACSarrayTM上运行样本来评价细胞的流式细胞采集。通过调整前向角散射(FSC)和侧向角散射(SSC)探测器上的电压和振幅，设置细胞的FSC和SSC。通过运行未染色的细胞来调节荧光(Alexa-546)通道的检测器，以使细胞具有中位荧光强度约为1至5单位的统一的波峰。对于每种样本，获得大约10,000个门事件(染色的固定细胞)用于分析，结果显示于图3。
图3以高于同种型对照的倍增来表示平均荧光强度。图4汇集了AR75A105.8抗体的代表性直方图。AR75A105.8显示了与正常皮肤细胞系CCD-27sk的弱结合(2.2倍)。AR75A105.8显示了与前列腺癌细胞系PC-3(15.5)、乳腺癌细胞系MB-231(9.9)以及与正常肺细胞系Hs888.Lu(5.4倍)的较强结合。这些数据表明AR75A105.8显示出功能特异性，因为尽管AR75A105.8与被测的癌细胞型存在明显的结合，但只存在与前列腺癌细胞系PC-3相关的细胞毒性。这是结合并不必然地预示着抗体与其相关抗原连接的结果的进一步证据，并且是非显而易见的发现。这表明在不同细胞中细胞毒性作用取决于抗体连接的情形，而并不仅仅取决于抗体结合。
实施例3
Lovo细胞的体内肿瘤实验
参见图5和6，将颈背部皮下注射的100微升生理盐水中的1百万个人结肠癌细胞(Lovo)植入到4至6周的雌性SCID小鼠。将所述小鼠随机分成2个治疗组，每组6只。在植入后第1天，每组小鼠经腹腔给予稀释后体积为300微升的20mg/kg的AR75A105.8测试抗体或者缓冲液对照，所述稀释使用含有2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl和20mM Na2HPO4的稀释剂从储存液浓度稀释。然后在整个研究期间以同样方式每周注射一次所述抗体和对照样本。利用测径器大约每7天测量一次肿瘤生长。注射8次抗体后结束研究。在整个研究期间每周记录一次动物的体重。研究结束时，依据CCAC的指导方针，所有的动物都采取安乐死。
在高侵入性的Lovo人结肠癌体内预防模型中，AR75A105.8降低了肿瘤生长。移植后第56天，也是末次治疗给药后6天，AR75A105.8治疗组的平均肿瘤体积比缓冲液对照治疗组的肿瘤体积小45％(图5)。由于每组内的动物数目少，这种效应并没有统计学显著性。第48天，7次抗体给药后，此时动物仍处在治疗期，用AR75A105.8的治疗导致了62％的显著的肿瘤生长抑制(p＝0.0239)。
在整个研究期间没有临床毒性症状。每周测量一次的体重是动物健康和发育停止的指标。在整个研究期间，对照组的平均体重没有显著变化(图6)。然而，AR75A105.8治疗组的平均体重在研究结束时显著高于对照组的体重(第56天；p＝0.024)。该观测可能与在AR75A105.8治疗组观测到的肿瘤体积降低有关。
总之，AR75A105.8在该人结肠癌异种移植模型中被良好地耐受，并且降低了肿瘤的负荷。
实施例4
AR75A105.8和抗CD63抗体7BD-33-11A之间的交叉反应的测定
当利用单克隆抗体AR75A105.8作为探针时，全细胞膜部分和全细胞裂解产物的Western印迹结果显示与利用另一种抗CD63单克隆抗体1A245.6获得的结果高度相似(图7)。为了确定前面的抗体是否与CD63交叉反应，在免疫沉淀复合物的Western印迹中使用它作为探针，所述免疫沉淀复合物利用抗CD63抗体7BD-33-11A或者AR75A105.8从人乳腺癌细胞(MBD-MB-231)的全细胞膜部分获得。
简单来说，三份重复样本，每份含有300微克的MDA-MB-231全细胞膜部分(0.5mg/mL终蛋白浓度，溶于600微升1×RIPA缓冲液中)，与15微升偶联7BD-33-11A、AR75A105.8或IgG1同种型对照的蛋白G琼脂糖珠在4℃孵育2小时。洗涤后将所述珠在1×非还原性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)样本缓冲液中煮沸，通过在10％聚丙烯酰胺凝胶上的电泳分析样本。在电转到PVDF膜上后，根据标准Western印迹步骤，将所述印迹用抗体7BD-33-11A、AR75A105.8和1B7.11(IgG1同种型对照)作为探针检测。所有一抗在5μg/mL的工作浓度下使用。所获印迹的图像(图8)显示7BD-33-11A和AR75A105.8都与由它们中的任一个免疫沉淀的抗原交叉反应，因此抗体AR75A105.8与由已知的抗CD63抗体免疫沉淀的CD63交叉反应。
为了进一步证实AR75A105.8和人CD63之间的交叉反应性，在大肠杆菌表达的人CD63最大胞外环重组GST融合构建体(GST-EC2)的Western印迹中使用所述抗体作为探针。简单来说，通过在10％制备性SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的电泳分析5微克纯化的重组GST融合蛋白。转膜后，根据标准Western印迹步骤，用AR75A105.8以及用抗CD63抗体7BDI-58、7BDI-60、AR51A994.1、7BD-33-11A、1A245.6和H460-22-1以及用抗CD44抗体(克隆H460-16-2)和用IgG1和IgG2a同种型对照抗体作为探针检测印迹。所有一抗在5μg/mL的浓度下使用。该实验的结果(图9)显示，除了抗-CD44抗体和同种型对照外，所有抗体都与人CD63最大胞外环的重组GST融合构建体特异性交叉反应，因此证实了所有抗体(除了抗-CD44抗体和同种型对照)都与人CD63交叉反应。
此优势证据表明，AR75A105.8通过CD63上存在的表位的连接来介导抗癌作用。在实施例4中已经显示，AR75A105.8抗体可以用于免疫沉淀来自诸如MDA-MB-231细胞的表达细胞的相关抗原。此外还表明，利用例如但并不限于FACS或细胞ELISA等技术，AR75A105.8抗体可以用于检测表达与之特异性结合的CD63抗原部分的细胞和/或组织。
因此，其他抗CD63抗体可以用于免疫沉淀和分离其他形式的CD63抗原，并且利用相同类型的分析，所述抗原也可以用于抑制那些抗体与表达该抗原的细胞或者组织的结合。
本说明书中提及的所有专利和公开出版物代表了本发明所属领域的技术人员的水平。所有专利和公开出版物通过引用的方式并入本文，其引用程度如同每个出版物被特别单独地指明以引用的方式并入本文。
应该明白，尽管本发明以某种形式被说明，但这不是要将本发明限定在本文所描述和显示的特定形式或布局。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的范围的前提下还可做出各种变化，且不应当认为本发明限于本说明书中显示和描述的内容。
本领域的技术人员很容易看出使本发明较好地适合实现所描述的目的并获得提及的结果和益处，以及其中固有的部分。本文中描述的任一寡核苷酸、肽、多肽、生物相关化合物、方法、流程和技术都是优选实施方案中有代表性的，其目的在于示例，并不是限制本发明的范围。本领域的技术人员能够想到包括在本发明精神的范畴内的变化和其它用途，并由所附权利要求书的范围所限定。尽管借助特定的优选实施方案描述了本发明，但是应理解所要求保护的本发明并不仅仅局限于这些特定的实施方案。事实上，所描述的实施本发明的方式的各种变化，对本领域的技术人员来说是显而易见的，均在所附权利要求书的范围内。
Figure A200780030641D00481
Figure A200780030641D00491

Claims (28)

1.分离的单克隆抗体，所述抗体由以保藏号280306-03保藏在IDAC的杂交瘤产生。
2.由权利要求1所述的分离的单克隆抗体产生的人源化抗体。
3.由权利要求1所述的分离的单克隆抗体产生的嵌合抗体。
4.由以保藏号280306-03保藏在IDAC的分离的杂交瘤细胞系。
5.引发抗体诱导的选自人类肿瘤的组织样本中癌细胞的细胞的细胞毒性的方法，其包括：
提供来自所述人类肿瘤的组织样本；
提供由以保藏号280306-03保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMAB，该CDMAB的特征在于具有竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力；以及
将所述分离的单克隆抗体或者其CDMAB与所述组织样本接触；
其中所述分离的单克隆抗体或者其CDMAB与所述组织样本的结合诱导细胞的细胞毒性。
6.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体的CDMAB。
7.如权利要求2所述的人源化抗体的CDMAB。
8.如权利要求3所述的嵌合抗体的CDMAB。
9.如权利要求1、2、3、6、7或8中的任一项所述的分离的抗体或其CDMAB，所述抗体或其CDMAB与选自细胞毒性部分、酶、放射性化合物和造血细胞的成员偶联。
10.治疗哺乳动物中人类肿瘤的方法，其中所述人类肿瘤表达至少一种与分离的单克隆抗体或其CDMAB特异性结合的抗原表位，该分离的单克隆抗体由以保藏号280306-03保藏在IDAC的克隆编码，该CDMAB的特征在于具有竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述方法包括给予所述哺乳动物有效导致所述哺乳动物的肿瘤负荷降低的量的所述单克隆抗体或其CDMAB。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细胞毒性部分偶联。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB活化补体。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB介导抗体依赖的细胞的细胞毒性作用。
15.如权利要求10所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是人源化的。
16.如权利要求10所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是嵌合的。
17.治疗哺乳动物中对抗体诱导的细胞的细胞毒性作用敏感的人类肿瘤的方法，其中所述人类肿瘤表达至少一种与分离的单克隆抗体或者其CDMAB特异性结合的抗原表位，该分离的单克隆抗体由以保藏号280306-03保藏在IDAC的克隆编码，该CDMAB的特征在于具有竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述方法包括给予所述哺乳动物有效导致所述哺乳动物的肿瘤负荷降低的量的所述单克隆抗体或其CDMAB。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细胞毒性部分偶联。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB活化补体。
21.如权利要求17所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB介导抗体依赖的细胞的细胞毒性作用。
22.如权利要求17所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是人源化的。
23.如权利要求17所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是嵌合的。
24.能够特异性结合于人CD63的分离的单克隆抗体或其CDMAB，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB与人CD63的一个或者多个表位反应，所述表位与由IDAC保藏号为280306-03的杂交瘤细胞系AR75A105.8产生的分离的单克隆抗体与之反应的表位相同；所述分离的单克隆抗体或其CDMAB的特征在于具有竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其人CD63靶抗原结合的能力。
25.分离的单克隆抗体或者其CDMAB，所述单克隆抗体或其CDMAB与IDAC保藏号为280306-03的杂交瘤细胞系AR75A105.8产生的分离的单克隆抗体识别相同的一个或者多个表位；所述单克隆抗体或其CDMAB的特征在于具有竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其一个或多个靶表位结合的能力。
26.治疗表达人CD63抗原的至少一种表位的人癌性肿瘤的方法，所述表位被IDAC保藏号为280306-03的杂交瘤细胞系AR75A105.8产生的分离的单克隆抗体特异性结合，所述方法包括：
给予患有所述人类癌症的个体至少一种分离的单克隆抗体或其CDMAB，所述单克隆抗体或其CDMAB与IDAC保藏号为280306-03的杂交瘤细胞系AR75A105.8产生的分离的单克隆抗体识别相同的一个或多个表位；
其中所述一个或多个表位的结合导致肿瘤负荷的降低。
27.治疗表达人CD63抗原的至少一种表位的人癌性肿瘤的方法，所述表位被IDAC保藏号为280306-03的杂交瘤细胞系AR75A105.8产生的分离的单克隆抗体特异性结合，所述方法包括：
给予患有所述人类癌症的个体至少一种分离的单克隆抗体或其CDMAB，所述单克隆抗体或其CDMAB与IDAC保藏号为280306-03的杂交瘤细胞系AR75A105.8产生的分离的单克隆抗体识别相同的一个或多个表位；所述单克隆抗体或其CDMAB与至少一种化疗剂联用；
其中所述给药导致肿瘤负荷的降低。
28.确定在选自人类肿瘤的组织样本中表达CD63的一个或多个表位的癌性细胞存在的结合分析，所述表位被IDAC保藏号为280306-03的杂交瘤细胞系AR75A105.8产生的分离的单克隆抗体特异性结合，所述分析包括：
提供来自所述人类肿瘤的组织样本；
提供至少一种分离的单克隆抗体或其CDMAB，所述单克隆抗体或其CDMAB与IDAC保藏号为280306-03的杂交瘤细胞系AR75A105.8产生的分离的单克隆抗体识别相同的一个或多个表位；
将所述至少一种单克隆抗体或其CDMAB与所述组织样本接触；以及
确定所述至少一种分离的单克隆抗体或其CDMAB与所述组织样本的结合；
由此指示所述癌细胞在所述组织样本中的存在。
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