CN101784566A - 证明cd9表面表达的细胞的细胞毒性介导 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分期、诊断和治疗癌性疾病(原发性肿瘤和肿瘤转移二者)，具体涉及肿瘤细胞的细胞毒性作用的介导；且最具体涉及减轻癌性疾病的抗体(CDMAB)，任选地与一种或多种CDMAB/化疗剂组合，作为用于起始细胞毒性反应的手段的应用。本发明还涉及结合测定，其利用本发明的CDMAB。抗癌抗体可以与毒素、酶、放射性化合物、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分和造血细胞缀合。

Description

证明CD9表面表达的细胞的细胞毒性介导
发明领域
本发明涉及癌性疾病的诊断和治疗，具体涉及肿瘤细胞的细胞毒性介导；且最具体涉及减轻癌性疾病的抗体(CDMAB)的用途，其任选与一种或多种CDMAB/化疗剂联合，作为用于起始细胞毒性反应的手段。本发明还涉及使用本发明的CDMAB的结合测定方法。
发明背景
细胞膜含有许多不同的细胞表面蛋白，一些处于运动状态且一些锚定于细胞骨架。细胞表面蛋白的这种巨大体系能够执行不同的功能，诸如信号传导和粘附。还已知某些膜蛋白类型负责将这些细胞表面蛋白组织为复合物，所述复合物能够具有作为单独分子时不能执行的联合功能。该形成的蛋白家族，即整合膜蛋白的四穿膜蛋白(tetraspanin)或穿膜4(TM4)家族，起多分子复合物的分子促进物(facilitator)或组织者的作用。
四穿膜蛋白参与大量多种生理学过程，诸如免疫细胞活化，细胞迁移，细胞-细胞融合(包括受精)和细胞分化的多种方面。这些分子还表现出在传染病(例如，疟疾、丙型肝炎和人免疫缺陷病毒)中起作用并且若干遗传病与这些分子的突变有联系(例如，X-连锁的智力迟钝、视网膜恶化和人肾和皮肤中基膜的错误装配)(Boucheix和Rubinstein.Cell.Mol.Life Sci.(细胞分子生命科学)58(9)：1189-12052001)。四穿膜蛋白与许多其他信号传导分子的相互作用和参与活化、粘附和细胞分化的能力均与其作为“分子促进物”的作为有关，所述“分子促进物”集合大分子复合物并容许它们通过稳定化更有效地起作用。四穿膜蛋白与其他信号传导分子的相互作用有时称为四穿膜蛋白网络。
该超家族(TM4SF)最初在1990年公认，当时新克隆的CD37，CD81(TAPA-1)和sm23基因与肿瘤相关基因CD63(ME491)的序列的比较(Hotta等Cancer Res.(癌症研究)48(11)：2955-29621988)揭示序列同源性和保守的预测结构(Wright等J Immunol(免疫学杂志)144(8)：3195-3200 1990；Oren等Mol.Cell.Biol(分子细胞生物学)10(8)：4007-4015 1990)。该家族现在在人中发展到约32个成员(Le Naour等Proteomics(蛋白质组学).6(24)：6447-54 2006)。
CD9是该家族的24kDa成员，其在造血和非造血细胞上表达。特别地，在血小板和内皮细胞表面上表达高浓度CD9(Forsyth KD.Immunology(免疫学)72(2)：292-296 1991；Jennings等Blood(血液)88(10)：624a 1996)。近期还发现CD9是细胞表面分子复合物家族的成员，该家族包括整联蛋白、其他细胞表面受体和其他四穿膜蛋白。已经发现若干TM4家族成员，包括CD9，与β1整联蛋白以及β2，β3，和β7整联蛋白相关(Rubinstein等Eur.J.Immunol.(欧洲免疫学杂志)24(12)：3005-3013 1994；Nakamura等J.Cell Biol.(细胞分子学杂志)129(6)：1691-1705 1995；Berditchevski等Mol.Biol.Cell.(分子生物学细胞)7(2)：193-207 1996；Radford等Biochem.Biophys.Res.Commun.(生物化学和生物物理研究通信)222(1)：13-28 1996；Hadjiargyrou等J Neurochem(神经化学杂志)67(6)：2505-2513 1996；Slupsky等Eur J Biochem(欧洲生物化学杂志)244(1)：168-175 1997)。
基于cDNA序列分析，预测TM4SF成员是单多肽链，其具有4个高度疏水性推定穿膜(TM)区和2个胞外(EC)环，其氨基和羧基端均位于胞内。所有四穿膜蛋白氨基酸序列的比对揭示四穿膜蛋白之间的许多同源性被限制在穿膜结构域内，所述穿膜结构域包含少量高度保守的极性氨基酸(TM1中的天冬酰胺和TM3和TM4中的谷氨酸或谷氨酰胺)。膜中的这些带电残基可以彼此相互作用并可能对蛋白装配的稳定化很重要，如关于T细胞受体所证明地(Cosson等Nature(自然)351(6325)：414-4161991)。
在所有四个穿膜结构域中还存在保守的疏水性残基；发现TM2中的一些在17/18四穿膜蛋白序列中。TM2和TM3之间的短区域包含2-3个带电残基，包括保守的谷氨酸。这些同源性不与也具有4个穿膜结构域的其他蛋白家族，诸如配体门控离子通道、连接蛋白、或CD2O/FcERII3共享。
在推定穿膜结构域中观察到的残基和EC环中的某些残基之间的保守性提示这些蛋白执行密切相关的功能(Maecker等FASEBJ(FASEB杂志)11(6)：428-442 1997)。在四穿膜蛋白的胞外环中存在较大的序列分歧，尽管EC2中的3个半胱氨酸位于16/18家族成员中，与TM区相距确定的距离。这些半胱氨酸中的2个存在于位于TM3后约50个氨基酸处的保守CCG基序中。第三个半胱氨酸通常在甘氨酸之前并固定在TM4的11个氨基酸的上游处。第四个保守的半胱氨酸，经常存在于PXSC基序中，可变地处于EC2中。对于该家族的一些成员，使用还原剂影响抗体对它们识别，这说明出现二硫键。涉及哪个半胱氨酸是未知的，但是EC2中的至少2个保守残基包括在二硫键中(Tomlinson等Eur J Immunol(欧洲免疫学杂志)23(1)：136-140 1993)。
大多数四穿膜蛋白通过N-糖基化修饰；一些是可变糖基化或酰化的，诸如CD9(Seehafer等Biochim Biophys Acta 957(3)：399-410 1988)。不同四穿膜蛋白之间的糖基化模式广泛变化。CD9包含位于EC 1中的糖基化位点(Boucheix等J Biol Chem(生物化学杂志)266(1)：117-122 1991)，而大多数其他糖基化四穿膜蛋白包含位于EC2中的位点(Classon等J Exp Med(实验医学杂志)169(4)：1497-1502)。然而，在各个成员中，大多数糖基化位点在物种之间是保守的。例如，小鼠、大鼠、灵长类动物和牛CD9均具有相同的单糖基化位点，而猫科分子完全失去了该位点。
这些蛋白中的一些的表达模式具有近乎普遍的组织分布(CD9，CD63，CD81，CD82)而其他是高度局限于，例如，淋巴和骨髓细胞(CD53)或成熟B细胞(CD37)。一些成员似乎在免疫系统中高度表达；更近期，已经意识到它们在神经系统中的表达。CD9在发育中的脊髓运动神经元和其他胎儿中枢和外周神经系统位点中瞬间表达(Tole和Patterson.Dev Dyn(发育动力学)197(2)：94-106 1993)。其存在于胚胎和胎儿造血组织中(Abe等Nippon Ketsueki Gakkai Zasshi.1989 52(4)：712-20 1989；Abe J.ClinImmunol Immunopathol.(临床免疫学和免疫病理学)1989 51(1)：13-21 1989)并也在B细胞发育过程中表达(Boucheix等J Biol Chem(生物化学杂志)266(1)：117-122 1991)。
CD9与β1整联蛋白以及β2，β3，和β7整联蛋白之间的相互作用特别提示CD9表达可以影响许多与已经分配给整联蛋白相同的细胞功能。已经报告CD9和其他四穿膜蛋白参与活化、粘附和细胞的运动性以及参与正常和肿瘤细胞生长(Maecker等FASEB J(FASEB杂志)11(6)：428-4421997)。虽然提示TM4家族成员起分子促进物的作用(Maecker等FASEB J(FASEB杂志)11(6)：428-442 1997)，但是它们的影响模式可以在细胞之间变化。将CD9转染到弱游动CD9-阴性前B细胞(Raji)中上调这些细胞穿越纤连蛋白和层粘连蛋白的运动性(Shaw等270(41)：24092-240991995)，然而将CD9转染到非淋巴游动细胞系中下调它们到这些胞外基质成分的运动性(Ikeyama等J.Exp.Med.(实验医学杂志)177，1231-12371993)。
通过证明纤连蛋白与固定的血小板CD9和与重组CD9的直接结合，将纤连蛋白确定为CD9的潜在配体(Wilkinson等FASEB J(FASEB杂志)9：A1500.23 1995)。通过使用mock-和CD9-转染的CHO细胞，Cook等，比较了这些转染的细胞对固定的胞外基质成分，特别是纤连蛋白的粘附和扩散。它们显示：(i)CD9的表面表达改变纤连蛋白上的CHO细胞粘附和扩散形态学；(ii)CD9 CHO细胞-纤连蛋白相互作用主要涉及由包括HEP2/IIICS结合结构域的纤连蛋白区段和(iii)CD9表达下调细胞外周纤连蛋白基质的生成。这些数据清楚地提示异位CD9表达可以通过CD9结合纤连蛋白上的特异性区域和通过调节其他纤连蛋白-结合分子诸如α5b1来调节细胞-纤连蛋白相互作用(Cook等Exp Cell Res(实验细胞研究).251(2)：356-371)。
尽管现在根据物理和功能结合方面适当充分表征了四穿膜蛋白的许多结合，但是其他保持争议，具体地四穿膜蛋白和Fc受体(FcR)的结合。证明抗CD9抗体触发血小板聚集后，报告该抗体诱导CD9与血小板上的整联蛋白αIIb/βIII(GPIIb/IIIa；CD4I/CD61)的结合和触发血小板聚集由GPIIb/IIIa介导(Slupsky等J Biol Chem(生物化学杂志).264(21)：12289-12293 1989)。实际上，将抗CD9注射到猴中在注射5分钟内导致致命的血小板减少症，这通过使用抗αIIb/β抗体预处理该猴来预防(Kawakatsu等Thromb Res(血栓症研究).70(3)：245-254 1993)。CD9介导的血小板活化，如由抗αllb/βIII抗体诱导的活化，可以被针对FcγRII的抗体阻断，这提示该活化由FcyRlI介导。事实上，针对若干血小板蛋白的抗体，包括四穿膜蛋白PETA-3诱导受Fc受体阻断抑制的血小板聚集。
然而，该数据的大部分描述间接关系，因为细胞活化事件由四穿膜蛋白与FcR通过完整抗四穿膜蛋白抗体Fc区的共连接引起。该事件在正常生理学中未必具有任何显著性。四穿膜蛋白被如此频繁确定为共连接FcR的抗体的靶标的事实提示这些分子之间的空间关系。四穿膜蛋白-FcR共连接报告的多血症可能将注意力集中到支持这种关系的更多生理学上相关的报告，具体地，通过免疫荧光和共免疫沉淀显示四穿膜蛋白与FcR的近端共定位(Higginbottom等99(4)：546-552 2000；Kaji等J Immunol(免疫学杂志)166(5)：3256-3265 2001)。该相互作用应该促进四穿膜蛋白网络中FcR和粘附/信号传导分子之间的对话，所述四穿膜蛋白网络具有针对血小板和免疫细胞生物学的清楚的生理学显著性。FcR与四穿膜蛋白的那种关联具有重要的功能作用，所述功能作用通过证明以共连接复合物形式和与共连接事件无关形式的FcR信号传导的四穿膜蛋白依赖性调节而得到暗示。
在癌症中，临床研究报告了四穿膜蛋白表达水平和预后和/或转移之间的联系。CD9最初在B谱系急性淋巴母细胞白血病的细胞表面上描述(Kersey等J Exp Med(实验医学杂志).153(3)：726-31 1981)。其在90％的B谱系急性白血病上和50％的急性骨髓白血病和B谱系慢性淋巴白血病上表达(Boucheix等Leuk Res(白血病研究).9(5)：597-604 1985)。具体地，CD9是急性早幼粒细胞的恒定标记物。CD9的表面存在可以起一些癌症转移潜力的预后指示剂的作用(Ikeyama等J Exp Med(实验医学杂志).177(5)：1231-1237 1993；Miyake等Cancer Res(癌症研究).55(18)：4127-4131 1995)。事实上，肿瘤细胞上的高水平的四穿膜蛋白CD9和CD82/KAI-1与乳腺、肺、结肠、前列腺、和胰腺癌中的有利预后相关。另外，这些分子的降低的表达水平与这些癌症中的转移相关(Boucheix和Rubinstein.Cell Mol Life Sci.(细胞分子生命科学)58(9)：1189-1205 2001)。CD9水平在获自淋巴结转移的细胞中通常比在原发性乳腺癌肿瘤细胞中更低(Miyake等Cancer Res.(癌症研究)55(18)：4127-4131 1995)。此外，使用体外和体内实验模型，CD9和CD82表现出起“转移抑制剂”的作用，而CD151显示出增加转移潜力(Boucheix和Rubinstein.Cell Mol Life Sci.(细胞分子生命科学).58(9)：1189-1205 2001)。
报告了2项关于肿瘤和转移中四穿膜蛋白网络组合物的近期蛋白质组学研究(Andre等Proteomics(蛋白质组学)6(5)：1437-1449 2006；Le Naour等Mol Cell Proteomics(分子细胞蛋白质组学)5(5)：845-857 2006)。这2项报告均集中在使用两种不同分子模型的结肠癌中。该模型由源自来自相同患者的原发性结肠肿瘤和转移的细胞系构成。第一模型由细胞系SW480(原发性肿瘤)和SW620(淋巴结转移)构成(Leibovitz等Cancer Res(癌症研究)36(12)：4562-4569 1976)，其可获自美国典型性培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC))。四穿膜蛋白复合物在免疫亲和纯化后分离，并且该蛋白通过使用LC-ESI-MS/MS和MALDI-FTICR的MS来鉴定。
第二模型由三种细胞系Isreco1(IS1，原发性肿瘤)，Isreco2(IS2，肝转移)，和Isreco3(IS3，腹膜转移)(Cajot等J Biol Chem(生物化学杂志).274(45)：31903-31908 1997)构成，在ISREC(Institut Suisse d’EtudesExpérimentales sur le Cancer，Swiss)确立。在该研究中，细胞用温和的去污剂Brij97裂解，随后进行包含CD9的复合物的免疫沉淀实验。结合的蛋白进一步使用更严格的去污剂Triton X-100来洗脱，Triton X-100解离四穿膜蛋白-四穿膜蛋白结合。为了排除非特异性结合，免疫沉淀实验还利用与对CD9mAb相同处理的无关IgG1进行。蛋白质鉴定通过质谱法执行。
两种细胞模型中的原发性肿瘤细胞和转移的比较分析显示区别性检测一些蛋白。对于这些蛋白中的大部分，区别性表达通过量化方案诸如流式细胞计数法验证。观察到若干粘附分子表达水平的重要变化，具体地，胞外基质的受体诸如层粘连蛋白受体。有趣地，整联蛋白α6b4仅在来自转移的包含CD9的复合物中通过MS检测到。免疫沉淀和Western印迹实验验证更高量的整联蛋白α6b4在来自这两种模型的转移中与CD9一起共免疫沉淀，尽管在细胞表面处具有类似或更低的表达水平。因此，这提示在肿瘤进展过程中整联蛋白α6b4特异性募集到富集四穿膜蛋白的微域中。相反，在来自所用的两种细胞模型的转移细胞系中以及在多种其他转移细胞系上观察到其他层粘连蛋白受体，诸如整联蛋白α3b1和Ig蛋白Lu/B-CAM(卢氏/B-细胞粘附分子)的显著减少(Andre等Proteomics(蛋白质组学)6(5)：1437-1449 2006)。
由MS鉴定的另一种粘附分子是上皮细胞粘附分子(EpCAM)。该蛋白在许多人上皮组织中表达且在大部分上皮癌中过表达(Armstrong和Eck.Cancer Biol Ther.(癌症生物学疗法)2(4)：320-3262003)。有趣地，已经证明EpCAM可以与四穿膜蛋白CD9直接结合。因此，已经观察到这两种分子在正常结肠中的充分共定位，而共定位水平在原发性肿瘤和转移中较低(Le Naour等Mol Cell Proteomics(分子细胞蛋白质组学)5(5)：845-8572006)。蛋白质组学还揭示了不同的膜蛋白酶(即仅在一些转移细胞上表达的CD26/二肽基肽酶4(DPPIV))以及若干信号传导分子在富集四穿膜蛋白的微域中的存在。这些发现可以产生关于四穿膜蛋白功能的新的关注，这提示所述微域可以起酶促活性和信号转导平台的作用。
在另一项蛋白质组学研究中，
Figure GPA00001027374200071
等证明关于氨基酸的稳定同位素标记在细胞培养(SILAC)方法中的应用，从而比较来自胰腺癌来源的细胞的分泌性蛋白(分泌蛋白(secretome))和来自非致瘤性胰腺管细胞的分泌性蛋白。他们鉴定了若干以前未曾与胰腺癌相关联的蛋白质，包括串珠蛋白聚糖(HSPG2)，CD9抗原，纤连蛋白受体(整联蛋白β1)，和命名为预测的成骨细胞蛋白(FAM3C)的新型细胞因子。具体地，鉴定CD9在癌症中，与正常对比，升高8倍。因为以前没有描述CD9在胰腺癌中升高，所以他们利用胰腺癌组织微阵列(TMAs)，通过免疫组化法(IHC)进行确认研究。CD9在TMA上7/18(39％)胰腺癌中以粗膜分布表达，在相邻正常胰腺实质中未观察到表达(
Figure GPA00001027374200072
等Mol Cell Proteomics(分子细胞蛋白质组学).5(1)：157-171)。CD9标记证明顶腔加强的模式与他们以前关于胰腺癌中其他分泌性蛋白诸如前列腺干细胞抗原和mesothelin所报告的模式相似(Argani等Clin Cancer Res(临床癌症严会计)7(12)：3862-38682001；Argani等Cancer Res(癌症研究).61(11)：4320-43242001)。另外，腔内内容物的标记经常在致瘤性腺体结构中观察到，这与CD9的分泌相一致。
通过SILAC法获得的蛋白水平量化数据与通过DNA微阵列实验获得的mRNA数据进行比较。SILAC证明在胰腺癌分泌蛋白中区别性过表达且被证实在蛋白水平过表达的CD9抗原在Panc1中，与HPDE细胞对比下调2倍，这基于DNA微阵列数据。该数据加强评估人癌症转录组和蛋白质组的重要性(
Figure GPA00001027374200073
等Mol Cell Proteomics(分子细胞蛋白质组学).5(1)：157-171)。
在另一种研究中，在原发性和转移性胃癌组织中检查CD9的表达。总共，来自78名患者的样本用于免疫组织学染色和来自57名患者的样本经历Northern印迹。在原发性胃癌组织、淋巴结转移性组织、和腹膜弥散性组织中，在信使水平和蛋白水平观察CD9表达。CD9表达在胃癌的癌性区域内与在相同患者的非癌性区域内相比加强。当通过基于临床病理学诊断的恶性状态分析时，存在这样的趋势，即在严重管入侵、活性淋巴结转移、和晚期中观察到CD9表达。这些作者推定CD9表达在胃癌组织中，与正常组织相比，更强化。CD9表达在晚期胃癌中更显著(Haruko et al.JSurg Res.117(2)：208-2152004)。
还研究了CD9在前列腺癌性进展中的作用(Wang等Clin Cancer Res.(临床癌症研究)13(8)：2354-2361 2007)。在107个临床局部化原发性腺癌的24％，60个临床晚期原发性腺癌的85％，65个淋巴结转移的85％和23个骨转移的65％中观察到前列腺致瘤性细胞内CD9表达的减少或失去。该CD9表达的减少与在正常组织中没有观察到的CD9cDNA变化相关。他们发现全部PC-3来源的细胞系，一种PIN和四种前列腺腺癌在其CD9cDNA中具有缺失。这些缺失除去684bp CD9编码序列的核苷酸115-487，190-585或120-619。因此，由228个氨基酸CD9蛋白，通过这些缺失消除氨基酸39-163，64-195或40-207。这些缺失影响蛋白的大量胞外和胞内结构域。根据直接测序mRNA扩增产物(在不克隆的条件下)，验证PC-3M-LN4缺失(缺失64-195)的存在。在源自这些样品中的一些的基因组DNA中没有检测到这些缺失，这论证了转录CD9mRNA修饰的存在。在DU145细胞系中检测到另一种缺失，而在源自PC-3M-Pro4的mRNA中存在符合读框的插入。
最后，普遍的错义点突变在一种前列腺癌性细胞系(PC-3M-LN4)，一份PIN样本，和7份前列腺腺癌样本中观察到。一些样本具有多于一个错义突变。有趣地，在这些情形中的大多数中没有检测到CD9蛋白表达(除在一份前列腺腺癌样本中以外)。位于第二胞质结构域(氨基酸83)中导致新终止密码子的碱基对置换也存在于一个PIN中和2名前列腺癌患者中，他们没有在其中检测到CD9蛋白。尽管减少的CD9蛋白表达已经与不同肿瘤类型的癌症进展联系在一起，但是这是第一份涉及CD9蛋白失活中的CD9mRNA变化的报告。
还通过使用抗CD9单克隆抗体研究了CD9在若干细胞系中的作用。这些实验证明粘附和增殖作用取决于所用的细胞类型和抗体。抗CD9抗体在人血小板中刺激由成纤维细胞引起的血纤蛋白凝块收缩(Azzarone等J Cell Physiol(细胞生理学杂志).125(3)：420-426 1985)，诱导前B淋巴细胞的同型性粘附(Masellis-Smith等J Immunol(免疫学杂志).144(5)：1607-1613 1990)，抑制肺腺癌细胞的运动性(Miyake等J Exp Med(实验医学杂志).174(6)：1347-1354 1991)，增加嗜中性粒细胞对内皮细胞的粘附(Forsyth KD.Immunology(免疫学)72(2)：292-296 1991)并激发磷脂酰肌醇转换，磷脂酰肌醇生物合成和蛋白-酪氨酸磷酸化(Yatomi等FEBS Lett.(FEBS书信)322(3)：285-290 1993)。一种抗CD9单克隆抗体，B2C11，促进许多施旺细胞系，PC12细胞和原发性大鼠施旺细胞的粘附(Hadjiargyrou和Patterson.J Neurosci(神经科学杂志).15(1 Pt 2)：574-5831995)。另外，该抗体还刺激施旺细胞系之一的增殖。在另一篇文章中，相同的小组进一步证明另一种抗CD9单克隆抗体，SMRA1，在原发性施旺细胞中提高运动性和迁移，这与胞质钙和磷蛋白中的增加相关(Anton等JNeurosci(神经科学杂志).15(1 Pt 2)：584-95 1994)。然而，这些抗体中没有一个被报告已在人癌症的体内模型中检验过。
最后，近期的报告显示CD9在结肠癌性细胞中的异位表达导致提高的整联蛋白依赖性粘附和细胞生长的抑制。与这些作用相一致，用抗CD9特异性抗体处理这些细胞导致(i)增加β1整联蛋白介导的细胞粘附，其通过涉及整联蛋白分子群集而非改变的亲和性的机制；(ii)诱导通过获得伸长的细胞表型表征的形态学变化；(iii)抑制细胞增殖，而对细胞存活无显著影响；(iv)增加膜TNF-α的表达和最后(v)抑制裸鼠中体内致瘤能力。另外，通过使用TNF-α的选择性阻断剂，他们证明了该细胞因子部分介导CD9的抗增殖作用(Ovalle等Int J Cancer(国际癌症杂志).[在印刷前E公开]2007)。体内测试的两种抗CD9抗体，即VJ1/20和PAINS-13，在预防型异种移植模型中测试，而本文中公开的抗CD9抗体已经证明了在预防性，和更临床相关地，确定的人癌症异种移植模型中的功效。另外，与VJ1/20或PAINS-13不同，本文中公开的抗CD9抗体已经证明了在多于一种癌症异种移植模型中的体内功效。
作为癌症治疗的单克隆抗体：患有癌症的每个个体都是独特的，并且患有与其它癌症不同的癌症，正如个人的身份一样。尽管如此，目前的治疗法以相同的方法治疗患有同种类型的癌症、处于相同的阶段的所有患者。这些患者中至少有30％将在一线治疗中失败，由此导致以后几轮的治疗和增加治疗失败、转移、以及最终死亡的可能性。较好的治疗方法应该是对于特定的个体量身定制的治疗法。目前本身适于量身定制的唯一的治疗法是手术。化疗和放射治疗不能对患者进行量身定做，并且手术本身在大部分情形中不足以产生治愈。
随着单克隆抗体的出现，由于每种抗体可以针对单个表位，则开发量身定制的治疗法的方法的可能性变得更加现实。此外，产生针对独特限定特定个体的肿瘤的表位群的抗体组合也是可能的。
已经认识到在癌症细胞和正常细胞之间的显著不同是在于癌症细胞包含对转化的细胞特异的抗原，科学团体长期认为单克隆抗体可以设计成通过特异性与这些癌症抗原结合而特异性靶向转化的细胞；因此产生这样的信心：单克隆抗体可以作为“魔力子弹(Magic Bullets)”来消除癌细胞。然而，现在广泛认识到，没有任何一种单个的单克隆抗体可以在所有癌症情形中起作用，并且单克隆抗体可以被配置为一类作为靶向癌症治疗。已经表明按照本文公开的发明的教导分离的单克隆抗体以有益于患者的方式减轻癌性疾病过程，例如通过减少肿瘤负荷的方式，并且在本文中应该不同地称为减轻癌性疾病的抗体(CDMAB)或“抗癌”抗体。
目前，癌症患者通常具有很少的治疗选择。对癌症治疗法的管理方法已经在全球生存和发病率中产生了改善。然而，对于特定的个体，这些改善的统计学没有与他们个人情况的改善必然相关。
因此，如果采用能够使执业者独立于处于同一团体中的其他患者而治疗每种肿瘤的方法，这将允许产生仅使治疗适合该名个体的独特方法。这样的治疗疗程理想地将增加治愈率，并且产生更好的结果，由此满足长期渴望的需要。
历史上，多克隆抗体已经进行了应用，在治疗人类癌症中具有有限的成功。已经使用人血浆治疗淋巴瘤和白血病，但是存在很少延长的好转或反应。此外，与化疗相比，缺少再现性，并且没有任何其它的益处。实体瘤诸如乳腺癌、黑素瘤和肾细胞癌也已经使用人血液、黑猩猩血清、人血浆和马血清进行治疗，具有相对不可预知的和无效的结果。
对于实体瘤，已经存在单克隆抗体的许多临床试验。在20世纪80年代，对于人乳腺癌存在至少4种临床试验，其使用针对特异抗原的抗体或基于组织选择性，在至少47名患者中仅产生一名响应者。直到1998年才出现使用人源化的抗Her2/neu抗体
Figure GPA00001027374200111
与顺铂组合的成功的临床试验。在该试验中，评估37名患者的响应，其中约四分之一具有部分响应率，另外四分之一具有较小或稳定的疾病发展。在所述响应者中对发展的中值时间是8.4个月，中值响应持续5.3个月。
Figure GPA00001027374200112
在1998年核准与
Figure GPA00001027374200113
组合用于一线应用。临床研究结果显示，与仅接受
Figure GPA00001027374200114
的组(3.0个月)相比，对于接受抗体治疗加
Figure GPA00001027374200115
的那些的疾病发展的中值时间(6.9个月)增加。在中值存活中也存在稍微的增加；对于加
Figure GPA00001027374200117
治疗组相对于单独的
Figure GPA00001027374200118
治疗组为22个月相对于18个月。另外，与单独的相比较，在抗体加
Figure GPA000010273742001110
组合组中，在完全(8％相对于2％)和部分响应者(34％相对于15％)的数量中存在增加。然而，与单独的
Figure GPA000010273742001111
治疗相比较，用
Figure GPA000010273742001112
和
Figure GPA000010273742001113
治疗导致更高的心脏中毒的发生(分别为13％相对于1％)。此外，
Figure GPA000010273742001114
治疗法只对过量表达(通过免疫组化(IHC)分析确定)人表皮生长因子受体2(Her2/neu)的患者，患有转移乳腺癌的患者的大约25％中有效；所述人表皮生长因子受体2是一种受体，其目前具有未知的功能或生物学重要的配体。因此，对于患有乳腺癌的患者仍然存在大量未满足的需求。即使可以受益于
Figure GPA000010273742001115
治疗的那些仍然需要化疗，并且因此仍然必须处理，至少在某种程度上，处理这种治疗的副作用。
研究结肠直肠癌的临床试验包括针对糖蛋白和糖脂靶点的抗体。抗体如17-1A，其对于腺癌具有某种特异性，已经在六十多名患者中进行了2期临床试验，仅有1名患者具有部分响应。在其它试验中，在使用额外的环磷酰胺的方案中，使用17-1A在52名患者中仅产生1例完全响应和2例较小的响应。迄今为止，17-1A的III期临床试验尚未表现出作为III期结肠癌的辅助治疗的提高的功效。最初核准用于成像的人源化鼠单克隆抗体的应用也没有产生肿瘤衰减。
仅在最近，使用单克隆抗体的结肠直肠癌临床研究产生了一些积极的结果。在2004年，
Figure GPA00001027374200121
核准用于患有表达EGFR的转移结肠直肠癌的患者的二线治疗，所述患者对基于伊立替康的化疗不起反应(refractory)。来自两组(two-arm)II期临床研究和单组研究的结果表明，与伊立替康组合分别具有23％和15％的响应率，疾病发展的中值时间分别为4.1个月和6.5个月。来自同一两组II期临床研究和另一单组研究的结果表明，仅用
Figure GPA00001027374200123
治疗分别导致11％和9％的响应率，疾病发展的中值时间分别为1.5个月和4.2个月。
因此，在瑞士和美国，
Figure GPA00001027374200124
与伊立替康组合治疗，并且在美国，单独的
Figure GPA00001027374200125
治疗，已经被核准作为在一线伊立替康治疗中失败的结肠癌患者的二线治疗。因此，如同
Figure GPA00001027374200126
在瑞士只核准治疗作为单克隆抗体和化疗的组合。另外，在瑞士和美国只核准治疗作为二线治疗用于患者。此外，在2004年，
Figure GPA00001027374200127
被核准与静脉内基于5-氟尿嘧啶的化疗组合用作转移性结肠直肠癌的一线治疗。III期临床研究结果表现出与仅用5-氟尿嘧啶治疗的患者相比，用
Figure GPA00001027374200128
加5-氟尿嘧啶治疗的患者的中值存活延长(分别为20个月相对于16个月)。然而，同样如同
Figure GPA00001027374200129
和
Figure GPA000010273742001210
治疗仅被核准作为单克隆抗体和化疗的组合。
对于肺癌、脑癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌还继续存在极差的结果。对于非小细胞肺癌的最有希望的最近的结果来自II期临床试验，其中治疗包括与杀细胞药多柔比星缀合的单克隆抗体(SGN-15；dox-BR96，抗-唾液酸(sialyl)-LeX)，其与化疗药
Figure GPA000010273742001211
组合。
Figure GPA000010273742001212
是唯一一种FDA核准的化疗药，用于肺癌的二线治疗。原始数据显示与单独的相比提高的整体存活时间。在本研究征募的62名患者中，三分之二接受SGN-15与
Figure GPA000010273742001214
组合，而其余三分之一接受单独的
Figure GPA000010273742001215
对于接受SGN-15与
Figure GPA000010273742001216
组合的患者，中值整体存活时间是7.3个月，而与之比较的接受单独的
Figure GPA000010273742001217
的患者是5.9个月。对于接受SNG-15加
Figure GPA000010273742001218
的患者的整体存活时间为1年和18个月的分别为29％和18％，而与之比较的对于接受单独的
Figure GPA000010273742001219
的患者分别为24％和8％。计划了进一步的临床试验。
临床前，对于黑素瘤使用单克隆抗体已经存在一些有限的成功。这些抗体中很少已经达到临床试验阶段，并且迄今为止没有一种已经被核准或在III期临床试验中表现出有利的结果。
治疗疾病的新药的发现受到在30,000种已知的基因产物中缺少相关靶点的鉴定的阻碍，所述30,000种已知的基因可能有助于疾病的发病机理。在肿瘤学研究中，潜在的药物靶点通常由于它们在肿瘤细胞中过量表达的事实来简单地选择。然后筛选这样鉴定的靶点与多种化合物的相互作用。在潜在的抗体治疗的情形中，这些候选化合物通常衍生于根据Kohler和Milstein所述的基本原理(1975，自然(Nature)，256，495-497，Kohler和Milstein)的单克隆抗体产生的常规方法。从用抗原(例如，全细胞，细胞级分，纯化的抗原)免疫的小鼠收集脾细胞，并且与无限增殖的杂交瘤配偶体融合。筛选所得到的杂交瘤，并且针对最亲和性地与所述靶点结合的抗体的分泌进行选择。针对癌细胞的许多治疗和诊断抗体，包括
Figure GPA00001027374200131
和RITUXIMAB，已经使用这些方法产生，并且基于它们的亲和性进行选择。这种方法中的缺点是双重的。首先，对治疗或诊断抗体结合选择适当的靶点受到关于组织特异性致癌过程的极少的知识以及用于鉴定这些靶点的所得到的过于单纯化的方法的限制，所述过于单纯化的方法如通过过量表达进行选择。第二，与受体以最大的亲和力结合的药物分子通常具有起始或抑制信号的最大可能性的假设可能不总是这种情形。
尽管一些关于乳腺癌和结肠癌的治疗的进展，但是作为单一药剂或共同治疗的有效抗体治疗的鉴定和开发对于所有类型的癌症尚是不充足的。
现有专利：
美国专利号5,858,358和美国申请号09/183,055均公开单克隆抗体ES5.2D8和其识别CD9。
美国申请号10/619,323公开CD9在粘附和增殖中的作用和由单克隆抗体mAb7识别的CD9区域。该申请人还公开mAb7对冠状平滑肌细胞的处理减少体外细胞增殖。
美国专利号5,750,102公开这样一种方法，其中来自患者肿瘤的细胞用MHC基因转染，所述MHC基因可克隆自来自该患者的细胞或组织。然后，使用这些转染的细胞免疫该患者。
美国专利号4,861,581公开这样一种方法，所述方法包括下列步骤：获得单克隆抗体，所述单克隆抗体对哺乳动物的肿瘤细胞和正常细胞的内部细胞成分是特异性的，但是对外部成分不是特异性的；标记所述单克隆抗体，使所标记的抗体与已经接受治疗的哺乳动物组织接触以杀死肿瘤细胞；并且通过测量所标记的抗体与退化的肿瘤细胞的内部细胞成分的结合而确定治疗的功效。在制备针对人细胞内抗原的抗体时，专利权所有人认为恶性细胞代表这样的抗原的便利的来源。
美国专利号5,171,665提供一种新型抗体以及其生产方法。具体地，该专利教导形成这样的单克隆抗体，所述单克隆抗体具有与人肿瘤相关的蛋白质抗原例如结肠和肺的那些强结合而与正常细胞以弱得多的程度结合的能力。
美国专利号5,484,596提供一种癌症治疗方法，所述方法包括从人癌症患者手术取出肿瘤组织，处理所述肿瘤组织以获得肿瘤细胞，辐射所述肿瘤细胞以成为存活的但非肿瘤发生性的，并且使用这些细胞制备用于患者的疫苗，所述疫苗能够抑制原发瘤的复发而且同时抑制转移。该专利教导开发与肿瘤细胞的表面抗原反应的单克隆抗体。如在第4栏45行等描述的，专利权所有人在开发用于人肿瘤形成的表达单克隆抗体的活性特异性免疫治疗中使用自生的肿瘤细胞。
美国专利号5,693,763教导一种糖蛋白抗原，其是人癌症特有的，并且不依赖于起源的上皮组织。
美国专利号5,783,186涉及在表达Her2的细胞中诱导程序性细胞死亡的抗-Her2抗体，产生所述抗体的杂交瘤细胞系，使用所述抗体治疗癌症的方法和包括所述抗体的药物组合物。
美国专利号5,849,876描述了用于产生针对黏蛋白抗原的单克隆抗体的新杂交瘤细胞系，所述黏蛋白抗原由肿瘤和非肿瘤组织来源纯化。
美国专利号5,869,268涉及产生人淋巴细胞的方法，所述人淋巴细胞产生对目的抗原特异性的抗体，产生单克隆抗体的方法，以及由所述方法产生的单克隆抗体。该专利特别涉及有效用于癌症诊断和治疗的抗-HD人单克隆抗体的生产。
美国专利号5,869,045涉及与人癌症细胞反应的抗体、抗体片段、抗体缀合物和单链免疫毒素。这些抗体作用的机制是两面性的，原因在于分子与在人癌症表面上存在的细胞膜抗原反应，并且此外，原因在于所述抗体具有在癌症细胞内部内在化的能力，随后结合，使它们特别有效用于形成抗体-药物和抗体-毒素缀合物。在它们的未修饰形式中，所述抗体还在特定的浓度表现出细胞毒性特征。
美国专利号5,780,033公开自体抗体用于肿瘤治疗和预防的应用。然而，这种抗体是来自年老的哺乳动物的抗核自体抗体。在这种情形中，认为该自体抗体是在免疫系统中发现的一种自然抗体类型。因为该自体抗体来自“年老的哺乳动物”，不存在所述自体抗体实际来自被治疗的患者的要求。另外，该专利公开了来自年老的哺乳动物的天然和单克隆抗核自体抗体，和产生单克隆抗核自体抗体的杂交瘤细胞系。
发明概述
本申请利用在U.S.6,180,357专利中教导的生产患者特异的抗癌抗体的方法分离杂交瘤细胞系，所述杂交瘤细胞系编码减轻癌性疾病的单克隆抗体。这些抗体可以针对一种肿瘤特异性制备，并且因此使得癌症治疗的量身定制成为可能。在本申请的情形中，具有杀伤细胞(细胞毒性)或抑制细胞生长(抑制细胞)特性的抗癌抗体在下文中称为细胞毒性的。这些抗体可以用于辅助癌症的分阶段和诊断，并且可以用于治疗肿瘤转移。这些抗体还可以用于通过预防治疗的方式用于预防癌症。与根据传统药物发现样本(paradigm)产生的抗体不同，以这种方式产生的抗体可以靶向这样的分子和途径，所述分子和途径先前没有显示出对于恶性组织的生长和/或存活是必需的。此外，这些抗体的结合亲和力适合起始可能不易受更强的亲和性相互作用影响的细胞毒性事件的需要。此外，将标准化疗形式如放射性核素与本发明的CDMAB缀合也在本发明的范围内，由此集中在所述化疗剂的应用。所述CDMAB也可以与毒素、细胞毒性部分、酶例如生物素缀合的酶、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分或造血细胞缀合，由此形成抗体缀合物。所述CDMAB可以单独或与一种或多种CDMAB/化疗剂组合使用。
个体化的抗癌治疗的前景将在患者的管理方式中引起改变。可能的临床方案(scenario)是在出现时获得肿瘤样品，并且储存。从该样品，肿瘤可以用一组预先存在的减轻癌性疾病的抗体而确定类型。将患者进行常规分阶段，但是可用的抗体可以用于将患者进一步分阶段。患者可以立即用现有的抗体进行治疗，并且使用本发明描述的方法或通过利用噬菌体展示文库与本发明公开的筛选方法联合，可以产生一组对肿瘤特异性的抗体。由于其它肿瘤可能携带一些与被治疗的肿瘤相同的表位，故将产生的所有抗体加入到抗癌抗体文库中。按照该方法产生的抗体可以有效用于治疗许多患有与这些抗体结合的癌症的患者中的癌性疾病。
除了抗癌抗体之外，患者可以选择接受目前推荐的治疗作为多形式治疗方案的一部分。通过本方法分离的抗体对非癌症细胞是相对无毒的事实允许以高剂量使用抗体组合，单独的，或与常规治疗组合。高治疗指数还允许在短时间范围内再次治疗，这应该降低耐受治疗的细胞出现的可能性。
如果患者对初始的治疗疗程没有反应或发展了转移，则可以重复产生针对肿瘤的特异性抗体的方法，进行再次治疗。此外，所述抗癌抗体可以与从该患者获得的红血细胞缀合，并且重新输注用于治疗转移。对于转移癌存在很少有效的治疗，并且转移通常预示着导致死亡的最坏结果。然而，转移癌通常充分地血管化，通过红血细胞递送抗癌抗体可以具有将所述抗体集中在肿瘤部位的作用。甚至在转移之前，大部分癌症细胞依赖于宿主的血液供应它们的生存，并且与红细胞缀合的抗癌抗体还可以有效针对原位肿瘤。备选地，所述抗体可以与其它造血细胞缀合，如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、天然杀伤细胞等。
存在5类抗体，并且每类与由其重链赋予的功能相关。通常认为由裸抗体杀伤癌症细胞通过抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)进行介导。例如，鼠IgM和IgG2a抗体可以通过结合补体系统的C-1成分而激活人补体，由此激活可以导致肿瘤消退的补体激活经典途径。对于人抗体，最有效的补体激活抗体通常是IgM和IgG1。IgG2a和IgG3同种型的鼠抗体有效募集具有Fc受体的细胞毒性细胞，其将导致由单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和某些淋巴细胞进行的细胞杀伤。IgG1和IgG3同种型的人抗体介导ADCC。
通过Fc区域介导的细胞毒性需要存在效应细胞、其相应受体、或蛋白质，例如NK细胞、T-细胞和补体。在缺乏这些效应子机制的条件下，抗体的Fc部分是无活性的。抗体的Fc部分可以赋予这样的特性，即影响抗体体内药物代谢动力学，但在体外其是无效的。
我们测试抗体的细胞毒性测定不存在任何效应子机制，且在体外进行。这些测定不存在效应子细胞(NK，巨噬细胞，或T细胞)或补体。因为这些测定完全通过将什么加在一起来定义，所以可以表征每种成分。本文中所有的测定仅含有靶细胞、培养基和血清。靶细胞不具有效应子功能，因为它们是癌症细胞或成纤维细胞。在无具有效应子功能特性的异源细胞的条件下，不存在具有该功能的细胞元件。培养基不含有补体或任何细胞。用于支持靶细胞生长的血清不具有补体活性，如由销售商公开地。此外，在我们自己的实验室中，我们证实所用的血清中缺乏补体活性。因此，我们的工作证明这样的事实，即抗体的作用完全归因于通过Fab介导的抗原结合的作用。有效地，靶细胞仅鉴别和与Fab相互作用，因为它们不具有关于Fc的受体。尽管，杂交瘤是使用靶细胞测试的分泌性完全免疫球蛋白，但是只有该免疫球蛋白与细胞相互作用的部分是Fab，其起抗原结合片段的作用。
关于目前要求保护的抗体和抗原结合片段，本申请，在提交时，已经证明了细胞的细胞毒性，如图1中的数据证明地。如以上指出地，和如本文中通过客观证据证实地，该作用完全归因于Fab与肿瘤细胞的结合。
在抗体介导细胞毒性归因于抗体与靶抗原的直接结合与Fc募集的效应子机制无关的领域中存在充足的证据。关于此的最佳证据是不具有补充细胞(supplemental cells)，或补体(从而正式排除那些机制)的体外实验。这些类型的实验已经关于完整的免疫球蛋白，或关于抗原结合片段诸如F(ab’)2片段进行了。在这些类型的实验中，抗体或抗原结合片段可以直接诱导靶细胞的凋亡，诸如在抗Her2和抗EGFR抗体的情形中，这二者均具有由US FDA批准在癌症治疗中销售的抗体。
抗体介导的癌症杀伤的另一种可能的机制可以通过使用催化细胞膜中的不同化学键的水解的抗体以及其相关的糖蛋白或糖脂，即所谓的催化抗体进行。
存在3种抗体-介导的癌症细胞杀伤的其它机制。第一种是使用抗体作为疫苗来诱导机体产生针对存在于癌症细胞上的推定的抗原的免疫反应。第二种是使用这样的抗体，所述抗体靶向生长受体，并且干扰它们的功能，或下调所述受体，以致有效地丧失其功能。第三种是所述抗体对细胞表面部分的直接连接的作用，所述细胞表面部分的直接连接可能导致直接的细胞死亡，诸如死亡受体如TRAIL R1或TRAIL R2的连接，或整联蛋白分子如αVβ3的连接等。
癌症药物的临床应用基于所述药物在对患者的可接受的危险模式下的益处。在癌症治疗中，通常是在益处之后最追求生存，然而，除了延长生命之外，还存在许多其它公认的益处。这些其它的益处，其中治疗没有不利地影响生存，包括症状减轻，针对不利事件的保护，复发时间的延长或没有疾病的生存，并且延长发展的时间。这些标准通常被接受，并且管理团体如美国食品及药品管理局(F.D.A.)核准产生这些益处的药物(Hirschfeld等.肿瘤学/血液学的重要综述(Critical Reviews inOncology/Hematolgy)42：137-143 2002)。除了这些标准之外，公认还存在其它的可以预示这些类型的益处的终点(endpoint)。部分地，由美国F.D.A.授予的加速的核准流程承认存在可能预测患者益处的替代品。到2003年年末，在这种流程下已经核准了16种药物，并且这些中有4种已经继续获得了完全的核准，即，随后的研究已经表明由替代品终点预测的直接的患者益处。确定药物在实体瘤中的作用的一个重要的终点是通过测量针对治疗的响应而评估肿瘤负荷(Therasse等.国家癌症研究所杂志(Journal ofthe National Cancer Institute)92(3)：205-216 2000)。关于所述评估的临床标准(RECIST标准)已由癌症国际专家组实体瘤工作组的响应评估标准公布。与适当的对照组相比较，对肿瘤负荷具有证明的作用的药物，如由RECIST标准所述的目标响应所示，最终倾向于产生直接的患者益处。在临床前设定中，肿瘤负荷通常更直接进行评估和记录。因为临床前研究可以转换成临床设定，在临床前模型中产生延长的生存的药物具有最大的预测临床用途。与产生针对临床治疗的积极响应类似，在临床前设定中减少肿瘤负荷的药物还可能对疾病具有显著的直接影响。尽管延长生存是在癌症药物治疗的临床结果后最追求的，但是存在其它的益处，其具有临床应用，并且清楚地，可能与疾病发展的延迟、延长的生存或二者相关的肿瘤负荷减少还可以导致直接的益处和具有临床影响(Eckhardt等.发展的治疗学：目标化合物的临床试验设计的成功与失败(Developmental Therapeutics：Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds)；ASCO教育书，第39次年会，2003，第209-219页)。
本发明描述了AR40A746.2.3的开发和应用，AR40A746.2.3通过其在细胞毒性测定中和在人癌症的动物模型中的作用而鉴定。本发明描述了这样的试剂，所述试剂与靶分子上存在的一个或多个表位特异性结合，且作为裸抗体还具有针对恶性肿瘤细胞而不针对正常细胞的体外细胞毒性特性，并且其作为裸抗体还直接介导肿瘤生长的抑制。另一个进步是使用抗癌抗体诸如靶向表达同源抗原标记的肿瘤的抗体来获得肿瘤生长抑制，以及其它积极的癌症治疗终点。
总之，本发明教导AR40A746.2.3抗原作为治疗剂靶标的应用，在施用时，其可以在哺乳动物中减少表达所述抗原的癌症的肿瘤负荷。本发明还教导CDMAB(AR40A746.2.3)、和它的衍生物、及其抗原结合片段、和其诱导细胞毒性的配体的应用，其靶向它们的抗原，以减少在哺乳动物中表达所述抗原的癌症的肿瘤负荷。此外，本发明还教导在癌性细胞中检测AR40A746.2.3抗原的应用，所述应用可以有效用于携带表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的诊断、治疗预测、和预后。
因此，本发明的一个目的是利用产生针对来源于特定个体的癌性细胞或一种或多种特定的癌症细胞系的减轻癌性疾病的抗体(CDMAB)的方法，以分离杂交瘤细胞系，和所述杂交瘤细胞系编码的相对应的分离的单克隆抗体及其抗原结合片段，所述CDMAB对于癌症细胞是细胞毒性的，但是同时对于非癌性细胞相对是无毒的。
本发明的另一个目的是教导减轻癌性疾病的抗体，其配体和抗原结合片段。
本发明的另一个目的是产生减轻癌性疾病的抗体，其细胞毒性通过抗体依赖性细胞毒作用介导。
本发明的另一个目的是产生减轻癌性疾病的抗体，其细胞毒性通过补体依赖性细胞毒作用介导。
本发明的另一个目的是产生减轻癌性疾病的抗体，其细胞毒性是它们催化细胞的化学键水解的能力的功能。
本发明的另一个目的是产生减轻癌性疾病的抗体，所述抗体有效用于癌症诊断、预后和监测的结合测定。
本发明的其它目的和优点将通过下述描述变得清楚，其中通过举例说明和实施例的方式描述本发明的某些实施方案。
附图简述
本专利或申请文件包含至少一幅彩色制图。该具有彩色制图的专利或专利申请出版物的副本将由专利局依据请求和缴纳必要的费用来提供。
图1比较杂交瘤上清针对细胞系PC-3，LnCap和CCD-27sk的细胞毒性百分数和结合水平。
图2描述AR40A746.2.3与癌症和正常细胞系的结合。将数据列表以将平均荧光强度表示为高于同种型对照增加的倍数。
图3包括针对若干癌症和非-癌细胞系的AR40A746.2.3和抗-EGFR抗体的代表性FACS柱状图。
图4显示在预防性BxPC-3胰腺癌模型中AR40A746.2.3对肿瘤生长的作用。垂直的虚线表示施用抗体的时间期间。数据点表示平均值+/-SEM。
图5显示在预防性BxPC-3胰腺癌模型中AR40A746.2.3对体重的影响。数据点表示平均值+/-SEM。
图6显示在确立的BxPC-3胰腺癌模型中AR40A746.2.3对肿瘤生长的影响。垂直虚线表示施用抗体的期间。数据点表示平均值+/-SEM。
图7显示在确立的BxPC-3胰腺癌模型中AR40A746.2.3对体重的影响。数据点表示平均值+/-SEM。
图8显示在确立的MDA-MB-231乳腺癌模型中AR40A746.2.3对肿瘤生长的影响。垂直虚线表示施用抗体的期间。数据点表示平均值+/-SEM。
图9显示在确立的MDA-MB-231乳腺癌模型中AR40A746.2.3对体重的影响。数据点表示平均值+/-SEM。
图10显示在BxPC-3胰腺癌模型中AR40A746.2.3以剂量依赖性方式对肿瘤生长的影响。垂直虚线表示施用抗体的期间。数据点表示平均值+/-SEM。
图11显示在BxPC-3胰腺癌模型中不同剂量的AR40A746.2.3对体重的影响。数据点表示平均值+/-SEM。
图12显示在确立的人BxPC-3胰腺癌模型中AR40A746.2.3和AR40A746.2.3F(ab’)2对肿瘤生长的影响。垂直虚线表示腹膜内施用抗体的期间。数据点表示平均值+/-SEM。
图13显示在确立的BxPC-3胰腺癌模型中AR40A746.2.3和AR40A746.2.3F(ab’)2对小鼠体重的影响。数据点表示平均值+/-SEM。
图14在确立的人胰腺(BxPC-3)癌模型中AR40A746.2.3和80mg/kg吉西他滨独自地和组合地对中值肿瘤生长的影响。
图15在确立的人胰腺(BxPC-3)癌模型中AR40A746.2.3和160mg/kg吉西他滨独自地和组合地对中值肿瘤生长的影响。
图16在确立的人胰腺(BxPC-3)癌模型中AR40A746.2.3和80mg/kg吉西他滨独自地和组合地对小鼠存活的影响。
图17在确立的人胰腺(BxPC-3)癌模型中AR40A746.2.3和160mg/kg吉西他滨独自地和组合地对小鼠存活的影响。
图18在确立的BxPC-3胰腺癌模型中AR40A746.2.3和80mg/kg吉西他滨独自地和组合地对小鼠体重的影响。
图19在确立的BxPC-3胰腺癌模型中AR40A746.2.3和160mg/kg吉西他滨独自地和组合地对小鼠体重的影响。
图20在预防性人MDA-MB-231乳腺癌模型中AR40A746.2对肿瘤生长的影响。垂直虚线表示腹膜内施用抗体的期间。数据点表示平均值+/-SEM。
图21在预防性人MDA-MB-231乳腺癌模型中AR40A746.2对小鼠体重的影响。数据点表示平均值+/-SEM。
图22A-22B对来自组织微阵列的多种人正常组织切片上的AR40A746.2.3的IHC比较进行列表。
图23A-23C对来自两种人组织微阵列的多种人正常和肿瘤组织切片上的AR40A746.2.3的IHC比较进行列表。
图24表示来自人肿瘤和正常组织微阵列的显微照片，其显示在人肾过渡(transitional)细胞癌性肿瘤组织(A)或正常人肾组织(B)上和在人食道鳞状细胞癌性肿瘤组织(C)或正常人食道组织(D)上使用AR40A746.2.3获得的结合模式。放大倍数是200X。
图25对来自组织微阵列的多种人胰腺肿瘤组织切片上AR40A746.2.3的IHC比较进行列表。
图26表示来自人胰腺肿瘤和正常组织微阵列的显微照片，其显示在胰腺腺癌(A)或正常人胰腺组织(B)上使用AR40A746.2.3获得的结合模式。放大倍数是200X。
图27对来自多组织微阵列的多种物种正常组织切片上AR40A746.2.3的IHC比较进行列表。
图28表示来自多种物种微阵列的显微照片，其显示在来自人(A)，食蟹猴(B)，猕猴(C)或兔(D)的正常脾组织上使用AR40A746.2.3获得的结合模式。AR40A746.2.3结合于人、食蟹猴、猕猴和兔脾血窦的淋巴细胞和内皮。放大倍数是200X。
图29.免疫沉淀产物的SDS-PAGE。泳道1包含AR40A746.2.3免疫沉淀的物质，泳道2包含IgG1同种型对照(克隆1B7.11)免疫沉淀的物质和泳道3包含分子量标准。由AR40A746.2.3免疫沉淀的25kDa条带由箭头指示。
图30.AR40A746.2.3免疫沉淀和IgG1(克隆1B7.11)胰蛋白酶消化的校准光谱。特异于AR40A746.2.3免疫沉淀消化的峰用分子量标记。
图31.使用AR40A746.2.3(图A)、抗CD9(克隆MEM-61；图B)和IgG1同种型对照(克隆1B7.11；图C)探测的蛋白Western印迹。泳道1：AR40A746.2.3免疫沉淀，泳道3：抗CD9(克隆MEM-61)免疫沉淀，泳道4：IgG1同种型对照(克隆1B7.11)免疫沉淀，泳道5：BxPC-3溶胞产物(20微克)和泳道6：分子量标记(以kDa为单位的分子量列在每条条带旁边)。
图32.用于PCR扩增AR40A746.2.3重链和轻链的引物列表。
图33.AR40A746.2.3的重链和轻链的蛋白序列。在CDR区下划线并以蓝色突出。
图34.其磷酸化受到被AR40A746.2.3处理的BxPC-3细胞的处理以及随后血清和增补剂刺激影响的激酶列表。
图35.其磷酸化受到被AR40A746.2.3处理的BxPC-3细胞的处理以及随后血清和增补剂刺激影响的RTK列表。
图36表示由膜联蛋白-V染色实验获得的鼠科AR40A746.2.3抗体对BxPC-3胰腺细胞系在24和40小时时的总凋亡影响。
发明详述
一般地，当用于概述、描述、实施例和权利要求中时，下述词语或短语具有所示的定义。
术语“抗体”以最宽泛的意义使用，并且特别涵盖，例如，单一的单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、和中和抗体、去免疫的(de-immunized)、鼠、嵌合的或人源化的抗体)，具有多表位特异性的抗体组合物，单链抗体，双抗体，三链抗体，免疫缀合物和抗体片段(见下文)。
当用于本发明时，术语“单克隆抗体”是指从一群基本上均一的抗体获得的抗体，即，除了可能以较少量存在的可能天然存在的突变之外，构成(comprising)所述群体的个体抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一的抗原性位点。此外，多克隆抗体制剂包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体，与所述多克隆抗体制剂相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性，因为单克隆抗体可以不被其它抗体污染地合成，所以单克隆抗体是有利的。修饰词“单克隆”表示该抗体的特征是从基本上均一的抗体群体获得，并且不被解释为抗体的生产需要通过任何特定的方法。例如，按照本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohler等自然(Nature)，256：495(1975)首先描述的杂交瘤(鼠或人)方法制备，或可以通过重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)制备。“单克隆抗体”还可以从噬菌体抗体文库分离，例如，使用Clackson等，自然(Nature)，352：624-628(1991)和Marks等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，222：581-597(1991)中所述的技术。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选地包括其抗原-结合或可变区。抗体片段的实例包括小于全长的抗体，Fab，Fab’，F(ab’)2，和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；单链抗体，单结构域抗体分子，融合蛋白，重组蛋白和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“完整的”抗体是一种包括抗原-结合可变区以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整的抗体具有一种或多种效应子功能。
取决于它们的重链恒定结构域的氨基酸序列，完整抗体可以指定为不同的“种类”。存在5种主要类别的完整抗体：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，并且它们中的一些可以进一步分成“亚类”(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，和IgA2。与不同种类的抗体相对应的重链恒定结构域分别叫作α，δ，ε，γ，和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。
抗体“效应子功能”是指归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调，等。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcRs)的非特异性细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞，嗜中性粒细胞，和巨噬细胞)识别在靶细胞上的结合的抗体，并且随后引起该靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞，即NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达总结在Ravetch和Kinet，免疫学年度综述(Annu.Rev.Immunol)9：457-92(1991)的第464页表3中。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，诸如在美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的测定。对于所述测定有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或另外地，目的分子的ADCC活性可以在体内进行评估，例如，在动物模型中，诸如在Clynes等.PNAS(USA)95：652-656(1998)中公开的动物模型中。
“效应细胞”是表达一种或多种FcRs并且执行效应子功能的白细胞。优选地，该细胞至少表达FcγRIII并且执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)，天然杀伤(NK)细胞，单核细胞，细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中PBMCs和NK细胞是优选的。效应细胞可以从其天然来源分离，例如，从血液或PBMCs分离，如本发明所述。
术语“Fc受体”或“FcR”用来描述结合抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然人FcR序列。此外，优选的FcR是一种结合IgG抗体的FcR(γ受体)，并且包括FcγRI，FcγRII，和FcγRIII亚类的受体，包括等位基因变体和这些受体的可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有主要在它们的细胞质结构域不同的相似的氨基酸序列。激活受体FcγRIIA在其细胞质结构域包含免疫受体基于酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见在M.
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免疫学年度综述(Annu.Rev.Immunol.)15：203-234(1997)中的综述)。FcRs在Ravetch和Kinet，免疫学年度综述(Annu.Rev.Immunol)9：457-92(1991)；Capel等，免疫学方法(Immunomethods)4：25-34(1994)；和de Haas等，实验室临床医学杂志(J.Lab.Clin.Med.)126：330-41(1995)中综述。其它FcRs，包括将在将来鉴定的那些，包含在本发明的术语“FcR”中。该术语还包括新生儿受体，FcRn，其负责将母亲的IgGs转运到胎儿(Guyer等，免疫学杂志(J.Immunol.)117：587(1976)和Kim等，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)24：2429(1994))。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在存在补体的条件下分子裂解靶点的能力。补体激活途径通过补体系统的第一成分(C1q)同与同源抗原复合的分子(例如，抗体)的结合而起始。为了评估补体激活，可以进行CDC测定，例如，如在Gazzano-Santoro等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)202：163(1996)中所述。
术语“可变”是指这样的事实，即，在抗体之间，某些可变结构域的部分在序列上大量不同，并且其用于每种特定的抗体对于其特定的抗原的结合和特异性。然而，在抗体的整个可变结构域中可变性不是均匀分布的。它集中在轻链和重链可变结构域内称为高变区的三个片段中。可变结构域的更高度保守的部分称为构架区(FRs)。天然重链和轻链的可变结构域分别包括4个FRs，其主要采取β-折叠构型，通过三个高变区连接，其形成环连接，并且在某些情形中形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FRs紧密相邻保持在一起，并且与另一条链的高变区一起有助于形成抗体的抗原-结合位点(见Kabat等，免疫学兴趣的蛋白的序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest)，第5版.公共卫生服务(Public HealthService)，全国卫生研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出多种效应子功能，诸如在抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)中的抗体参与。
当用于本发明时，术语“高变区”是指抗体负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包括来自“互补性决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，在轻链可变结构域中的残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)和在重链可变结构域中的31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，免疫学兴趣的蛋白的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版.公共卫生服务(Public Health Service)，全国卫生研究所(National Institutesof Health)，Bethesda，Md.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如，在轻链可变结构域中的残基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)和在重链可变结构域中的26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196：901-917(1987))。“构架区”或“FR”残基是除了如本文所定义的所述高变区残基之外的那些可变结构域残基。木瓜蛋白酶消化抗体产生两种相同的抗原-结合片段，其称为“Fab”片段，每个具有单个抗原-结合位点，和剩余的“Fc”片段，它的名称反应了它容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab’)2片段，其具有两个抗原-结合位点，并且仍然能够交联抗原。
“Fv”是包含完整的抗原-识别和抗原-结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价缔合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。正是在这种构型中每个可变结构域的三个高变区相互作用，以限定在VH-VL二聚体表面上的抗原-结合位点。笼统地，6个高变区赋予抗体的抗原-结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包括对抗原特异的3个高变区的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管是以比完整的结合位点低的亲和力结合。Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH I)。Fab’片段不同于Fab片段，其通过在重链CH1结构域的羧基端添加几个残基而不同，所述添加的残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH在本发明中是Fab’的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带至少一个游离的巯基(thiol)基团。F(ab’)2抗体片段最初作为一对Fab’片段产生，其在它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
基于它们的恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”可以被指定为两种明显不同的类型中的一种，所述两种明显不同的类型称为κappa(κ)和lambda(λ)。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一的多肽链中。优选地，Fv多肽还包括在VH和VL结构域之间的多肽连接体，其使得scFv能够形成用于抗原结合的理想结构。对于scFv的综述，参见Plückthun，在单克隆抗体的药理学(ThePharmacology of Monoclonal抗体)中，卷113，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994)。
术语“双抗体”是指具有两个抗原-结合位点的小抗体片段，所述片段包括与在同一多肽链(VH-VL)中的可变轻链结构域(VL)连接的可变重链结构域(VH)。通过使用太短而不允许在同一条链中的两个结构域之间成对的连接体，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域成对，并且产生两个抗原-结合位点。例如，在EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，90：6444-6448(1993)中更充分地描述了双抗体。
术语“三链抗体”或“三价三聚体”指三个单链抗体的组合。用VL或VH结构域的氨基酸末端，即不具有任何连接体序列，构建三链抗体。三链抗体具有三个Fv头部，所述Fv头部具有以头-尾的方式环形排列的多肽。所述三链抗体可能的构象是具有三个结合位点的平面，所述结合位点位于彼此相差120度角的平面上。三链抗体可以是单特异性、双特异性或三特异性的。
“分离的”抗体是一种已经被鉴定并且与其天然环境的成分分离和/或从中回收的抗体。它的天然环境的污染成分是干扰抗体的诊断或治疗应用的物质，并且可以包括酶、激素、和其它蛋白或非蛋白溶质。因为将不存在抗体天然环境的至少一种成分，分离的抗体包括在重组细胞内原位的抗体。然而，一般地，分离的抗体应该通过至少一个纯化步骤制备。
与目的抗原，例如CD44抗原“结合”的抗体是一种能够以充足的亲和力结合所述抗原的抗体，以便所述抗体通过靶向表达所述抗原的细胞而有效用作治疗或诊断剂。在所述抗体是一种结合CD44的抗体的情形中，与其它受体相反，它通常优先结合CD44，并且不包括偶然发生的结合，如非特异性Fc接触，或不包括与其它抗原所常见的翻译后修饰结合，并且可以是一种不与其它蛋白显著交叉反应的抗体。用于检测与目的抗原结合的抗体的方法在本领域中是公知的，并且可以包括，但不限于，如FACS、细胞ELISA和蛋白质印迹的测定。
当用于本发明时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换地使用，并且所有这样的名称包括后代。还应该理解，由于故意的或偶然的突变，所有的后代在DNA内容物上可能不是精确相同的。包括在初始转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的突变的后代。这将通过使用不同名称的上下文变得清楚。
“治疗或处理”是指治疗性治疗和预防或预防性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)目的病理症状或病症。需要治疗的那些包括已经患有病症的那些，以及倾向于患有病症的那些，或要预防病症的那些。因此，在本发明中待治疗的哺乳动物可以已经诊断患有病症或可以是倾向于或易受病症影响的。
术语“癌症”和“癌性的”是指或描述哺乳动物中的生理状况，所述生理状况的典型特征在于失控的细胞生长或死亡。癌症的实例包括，但不限于，癌，淋巴瘤，胚细胞瘤，肉瘤，和白血病或淋巴恶性病。所述癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)，肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌(gastric or stomach cancer)，包括胃肠癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾脏或肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝的癌症，肛门癌，阴茎癌，以及头颈癌。
“化疗剂”是有效用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷基化试剂，如塞替哌和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯如白消安，英丙舒凡，和哌泊舒凡；吖丙啶类如苯佐替派(benzodopa)，卡波醌，美妥替哌(meturedopa)，和乌瑞替哌(uredopa)；ethylenimines和methylamelamines，包括六甲蜜胺，曲他胺，三亚乙基磷酰胺，塞替哌(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥(chlornaphazine)，cholophosphamide，雌莫司汀，异环磷酰胺，氮芥(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥，美法仑，新氮芥，苯芥胆甾醇，泼尼莫司汀，曲磷胺，乌拉莫司汀；亚硝基脲(nitrosureas)如卡莫司汀，氯脲菌素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀，雷莫司汀；抗生素如阿克拉霉素(aclacinomysins)，放线菌素，authramycin，偶氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C，calicheamicin，carabicin，carnomycin，嗜癌霉素，色霉素，放线菌素D，柔红霉素，地托比星，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，多柔比星，表柔比星，依索比星，伊达比星，马塞罗霉素，丝裂霉素，麦考酚酸，诺拉霉素，橄榄霉素，培洛霉素，potfiromycin，嘌罗霉素，三铁阿霉素，罗多比星，链黑霉素，链佐星，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁，佐柔比星；抗代谢物如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如denopterin，甲氨喋呤，喋罗呤，三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨，6-巯嘌呤，thiamiprine，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨，阿扎胞苷，6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，二脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨，氟尿苷，5-FU；雄激素诸如卡普睾酮，屈他雄酮丙酸盐，环硫雄醇，美雄烷，睾内酯；抗肾上腺药(anti-adrenals)如氨鲁米特，米托坦，曲洛司坦；叶酸补偿物如frolinic acid；醋葡醛内酯；羟醛磷酰胺配糖(aldophosphamideglycoside)；5-氨基酮戊酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；异丙嗪(phenamet)；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2，2’，2”-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替哌；紫杉烷类，例如，紫杉醇(
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Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，新泽西)和多西他赛(
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Aventis，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；道诺霉素；氨喋呤；适罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；esperamicins；卡培他滨；以及任何上述物质的药用盐、酸或衍生物。下列物质也包含在本定义中，它们是：作用调控或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素药剂，诸如抗雌激素药，包括例如他莫昔芬，雷洛昔芬，抑制芳香酶的4(5)-咪唑的芳香酶，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬，keoxifene，LY117018，奥那司酮，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素药诸如氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺，亮丙立德，和戈舍瑞林；以及任何上述物质的药用盐、酸或者衍生物。
用于治疗目的的“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人，小鼠，SCID，或裸鼠或小鼠品系，家畜和农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，诸如绵羊、狗、马、猫、牛、等等。在本发明中优选地，所述哺乳动物是人。
“寡核苷酸”是长度短的、单链或双链的多聚脱氧核苷酸，其通过已知方法化学合成(如磷酸三酯、亚磷酸酯、或亚磷酰胺化学，使用固相技术，如在1988年5月4日公布的EP 266,032中所述的，或通过脱氧核苷H-磷酸酯中间物，如Froehler等，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，14：5399-5407，1986所述)。然后在聚丙烯酰胺凝胶上纯化它们。
按照本发明，非人(例如鼠)免疫球蛋白的“人源化的”和/或“嵌合的”形式是指这样的抗体，所述抗体包含特异的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv，Fab，Fab’，F(ab’)2或抗体的其它抗原-结合亚序列)，与原始抗体相比较，其导致人抗-小鼠抗体(HAMA)、人抗-嵌合抗体(HACA)或人抗-人抗体(HAHA)反应的减少，并且所述抗体包含来源于所述非人免疫球蛋白的、对再现所需要的作用是必需的必需部分(例如，一个或多个CDR(s)、抗原结合区、可变结构域等)，同时保留与所述非人免疫球蛋白相当的结合特征。对于大部分，人源化的抗体是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自该受体抗体互补性决定区(CDRs)的残基被来自非人物种(供体抗体)CDRs的、具有需要的特异性、亲和性和能力的残基取代，所述非人物种如小鼠、大鼠或兔。在一些情形中，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相对应的非人FR残基取代。此外，所述人源化的抗体可以包括在受体抗体和在所引入的CDR或FR序列中都找不到的残基。进行这些修饰以进一步限定和最优化抗体性能。通常，所述人源化的抗体应该包括基本上不少于至少一个、和典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区与非人免疫球蛋白的那些相对应，并且所有或基本上所有的FR残基是人免疫球蛋白共有序列的那些。所述人源化抗体优化地还应该包括至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地是人免疫球蛋白的恒定区。
“去免疫的(De-immunized)”抗体是对于给定的物种是无免疫原性的或较少免疫原性的免疫球蛋白。去免疫可以通过抗体的结构改变实现。可以使用本领域技术人员已知的任何去免疫技术。例如，用于使抗体去免疫性的一种适宜的技术记述在于2000年6月15日公布的WO 00/34317中。
诱导“程序性细胞死亡”的抗体是一种通过任何方式诱导程序性细胞死亡的抗体，所述方式示例而不限于，膜联蛋白V的结合，胱天蛋白酶活性，DNA的片段化，细胞收缩，内质网膨胀，细胞片段化和/或膜囊泡的形成(称为凋亡小体)。
当用于本文时，“抗体诱导的细胞毒性”应该理解为意指来源于由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的杂交瘤上清或抗体，由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体，由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体，其抗原结合片段或抗体配体的细胞毒性作用，所述作用不必与结合程度相关。
在整个说明书中，备选地，杂交瘤细胞系以及由其产生的分离的单克隆抗体由它们的内部命名AR40A746.2.3或保藏命名IDAC 141204-01指示。
当用于本文时，“抗体-配体”包括这样的部分，所述部分表现出针对靶抗原的至少一个表位的结合特异性，并且其可以是完整的抗体分子、抗体片段、以及至少具有它的抗原-结合区或部分(即，抗体分子的可变部分)的任何分子，例如，Fv分子，Fab分子，Fab’分子，F(ab’)2分子，双特异性抗体，融合蛋白，或特异性识别和结合抗原的至少一个表位的任何遗传工程分子，所述抗原与由命名为IDAC 141204-01(IDAC 141204-01抗原)的杂交瘤细胞系产生的分离的单克隆抗体、由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体、由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体和抗原结合部分结合。
当用于本文时，“减轻癌性疾病的抗体”(CDMAB)是指这样的单克隆抗体及其抗体-配体，所述单克隆抗体以有益于患者的方式减轻癌性疾病过程，例如，通过减少肿瘤负荷或延长肿瘤携带个体的生存的方式。
“CDMAB相关结合剂”，以其广义，理解为包括，但不仅限于，竞争结合于至少一个CDMAB靶表位的任何形式的人或非-人抗体、抗体片段、抗体-配体等。
“竞争性结合剂”理解为包括对至少一个CDMAB靶表位具有结合亲和力的任何形式的人或非-人抗体、抗体片段、抗体-配体等。
待治疗的肿瘤包括原发肿瘤和转移瘤，以及顽固性肿瘤。顽固性肿瘤包括对使用单独化疗剂、单独抗体、单独辐射或其组合的治疗未能应答或对其具有抗性的肿瘤。顽固性肿瘤还包括表现出受使用所述试剂治疗抑制但停止治疗后至多5年、有时至多10年或更长复发的肿瘤。
可以治疗的肿瘤包括未血管化、或尚未充分血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。可以因此治疗的实体肿瘤实例包括乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤和淋巴瘤。所述肿瘤的一些实例包括表皮样肿瘤，鳞状细胞肿瘤，诸如头颈肿瘤，结肠直肠肿瘤，前列腺肿瘤，乳腺肿瘤，肺肿瘤，包括小细胞和非-小细胞肺肿瘤，胰腺肿瘤，甲状腺肿瘤，卵巢肿瘤，和肝肿瘤。其他实例包括卡波西肉瘤、CNS瘤、成神经细胞瘤、毛细血管成血管细胞瘤、脑膜瘤和脑转移瘤、黑素瘤、胃肠癌和肾癌和肉瘤、横纹肌肉瘤、成胶质细胞瘤优选多形性成胶质细胞瘤、和平滑肌肉瘤。
当用于本文时，“抗原-结合区”意指分子识别靶抗原的部分。
当用于本文时，“竞争性抑制”意指使用常规的交互(reciprocal)抗体竞争测定(Belanger L.，Sylvestre C.和Dufour D.(1973)，通过竞争性和夹心方法对α胎蛋白的酶联免疫测定(Enzyme linked immunoassay for alphafetoprotein by competitive and sandwich procedures).Clinica Chimica Acta 48，15)能够识别和结合这样的决定簇位点，所述决定簇位点是由命名为IDAC141204-01的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体(IDAC 141204-01抗体)、由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体、由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体、其抗原结合片段或抗体配体所针对的。
当用于本文时，“靶抗原”是IDAC 141204-01抗原或其部分。
当用于本文时，“免疫缀合物”意指与细胞毒素、放射性试剂、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分、酶、毒素、抗肿瘤药或治疗药剂化学或生物学连接的任何分子或CDMAB，如抗体。所述抗体或CDMAB可以在分子的任何位置处与所述细胞毒素、放射性试剂、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分、酶、毒素、抗肿瘤药或治疗药物连接，只要它能够结合其靶点。免疫缀合物的实例包括抗体毒素化学缀合物和抗体-毒素融合蛋白。
适合于用作抗-肿瘤试剂的放射性试剂是本领域中那些技术人员已知的。例如，使用131I或211At。利用常规技术使这些同位素附着于抗体(例如Pedley等，英国癌症杂志(Br.J.Cancer)68，69-73(1993))。备选地，附着于抗体的抗-肿瘤试剂是活化前体药物的酶。可以施用这样的前体药物，所述前体药物保持其失活形式直到其到达肿瘤位点，一旦施用抗体复合物所述前体药物在该位点处转化为其细胞毒素形式。实际上，将抗体-酶缀合物施用于患者并容许定位在待治疗的组织区域。然后将前体药物施用于患者，从而使向细胞毒性药物的转化发生在待治疗组织区域中。备选地，与抗体缀合的抗-肿瘤试剂是细胞因子，诸如白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)或肿瘤坏死因子α(TNF-α)。所述抗体靶向针对肿瘤的细胞因子，以使得细胞因子在不影响其他组织的条件下介导针对肿瘤的损伤或破坏。利用常规重组DNA技术使细胞因子在DNA水平上与抗体融合。还可以使用干扰素。
当用于本文时，“融合蛋白”意指任何嵌合蛋白，其中抗原结合区与生物活性分子如毒素、酶、荧光蛋白、发光标记、多肽标记物、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分或蛋白药物连接。
本发明还预期本发明的CDMAB，靶标或报告部分与所述CDMAB相连接。靶标部分是结合对的第一个成员。抗-肿瘤试剂，例如，与所述对的第二个成员缀合，且由此针对抗原-结合蛋白结合的位点。所述结合对的常见实例是抗生物素蛋白和生物素。在优选的实施方案中，生物素与本发明CDMAB的靶抗原缀合，并由此为抗-肿瘤试剂或与抗生物素蛋白或链亲和素缀合的其他部分提供靶标。备选地，生物素或另一种所述部分与本发明CDMAB的靶抗原相连接，并用作，例如诊断系统中的报告分子，在所述诊断系统中可检测的信号-生成试剂与抗生物素蛋白或链亲和素缀合。
可检测的信号-生成试剂有效用于体内和体外诊断目的。信号生成试剂产生可测量的信号，所述信号是可以通过外部方法，通常电磁辐射测量法检测的。通常，所述信号生成试剂是酶或发色团，或由荧光、磷光或化学发光引起的发光。发色团包括在紫外或可见区吸收光的染料，且可以是酶催化反应的底物或降解产物。
而且，在本发明范围内包括本发明CDMAB体内和体外用于研究或诊断方法的用途，这在本领域中是公知的。为了执行如本文中所预期的诊断方法，本发明还可以包括试剂盒，所述试剂盒包括本发明的CDMAB。所述试剂盒应该有效用于通过检测CDMAB的靶抗原在该个体细胞中的过量表达而确定处于某种类型癌症风险中的个体。
诊断测定试剂盒
预期利用处于诊断测定试剂盒形式的本发明CDMAB确定肿瘤的存在。通常基于一种或多种肿瘤-特异性抗原，例如在生物学样品，诸如血液、血清、尿液和/或肿瘤活组织检查中的蛋白质和/或编码所述蛋白的多核苷酸的存在，检测患者中的肿瘤，所述样品应该是获自所述患者的。
所述蛋白起指示具体肿瘤，例如结肠、乳腺、肺或前列腺肿瘤存在或缺乏的标记的作用。还预期所述抗原应该具有检测其他癌性肿瘤的效用。在诊断试剂盒中包括包含本发明CDMAB的结合试剂或CDMAB相关结合试剂，允许检测与生物学样品中的试剂相结合的抗原水平。多核苷酸引物和探针可以用于检测编码肿瘤蛋白的mRNA水平，其也指示是否存在癌症。为了使该结合测定具有诊断性，产生这样的数据，即所述数据与和正常组织中存在的抗原相比具有统计学显著性的抗原水平相关，从而能够实施识别确定地诊断癌肿瘤存在的结合。预期许多形式应该有效用于本发明的诊断测定，如本领域中普通技术人员已知地，从而使用结合试剂检测样品中的多肽标记。例如，如Harlow和Lane，抗体：实验室手册(抗体：ALaboratory Manual)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，1988中举例说明的。还预期前述诊断测定形式的任意和全部组合、改变或修饰。
患者中是否存在癌症应该典型地通过以下确定：(a)使获自患者的生物学样品与结合试剂接触；(b)检测样品中与结合试剂结合的多肽水平；和(c)比较多肽水平和预定截断值。
在举例说明的实施方案中，预期该测定应该包括使用固定在固体支持物上的基于CDMAB的结合试剂结合以及去除样品的残余中的多肽。结合的多肽然后可以利用检测试剂检测，所述检测试剂包含报告基团并特异性结合于结合试剂/多肽复合物。例证性检测试剂可以包括基于CDMAB的结合试剂，所述结合试剂特异性结合于多肽或抗体或特异性结合于所述结合试剂的其他试剂，诸如抗-免疫球蛋白、蛋白质G、蛋白质A或凝集素。在备选的实施方案中，预期可以使用竞争测定，其中用报告基团标记多肽，并容许其在结合试剂与样品一起温育后结合于固定的结合试剂。样品与固定的结合试剂的反应性指示是所述样品成分抑制标记的多肽与结合试剂结合的程度。对于在所述测定中使用合适的多肽包括结合试剂对其具有结合亲和力的全长肿瘤-特异性蛋白和/或其部分。
所述诊断试剂盒应该具有固体支持物，其可以处于蛋白质可以附着的本领域中普通技术人员已知的蛋白质可以附着的任何材料形式。合适的实例可以包括微量滴定板中的检测孔或硝化纤维或其他合适的膜。备选地，所述支持物可以是珠或盘，诸如玻璃、玻璃纤维、胶乳胶或塑料材料诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯。所述支持物还可以是磁性粒子或光纤传感器，诸如例如美国专利号5,359,681中公开的那些。
预期利用多种本领域中那些技术人员已知的技术将结合试剂固定在固体支持物上，这详细地记述在专利和科学文献中。术语“固定”指非共价缔合诸如吸附和共价附着，其在本发明的情形中，可以是所述试剂和所述支持物官能团之间的直接连接，或可以是通过交联剂的连接。在优选但非限制性实施方案中，通过吸附固定于微量滴定板的孔或膜是优选的。吸附可以通过使结合试剂，在合适的缓冲液中，与固体支持物接触一段合适的时间获得。接触时间可以随温度变化，且应该通常在约1小时-约1天的范围内。
结合试剂与固体支持物的共价附着一般通过首先使该支持物与双功能试剂反应实现，所述双功能试剂应该与支持物和结合试剂上的官能团，诸如羟基或氨基基团二者反应。例如，结合试剂可以通过使用苯醌或通过使支持物上的醛基与结合配偶体上的胺和活性氢缩合共价附着于具有合适聚合物涂层的支持物(参见，例如，Pierce Immunotechnology Catalog andHandbook(皮尔斯免疫技术目录和手册)，1991，在A12A13)。
还预期所述诊断测定试剂盒应该采用双-抗体夹心式测定的形式。该测定可以通过首先使抗体，例如本发明公开的固定在固体支持物，通常是微量滴定板的孔上的CDMAB，与样品接触进行，从而容许该样品中的多肽结合于固定的抗体。然后从固定的多肽-抗体复合物中去除未结合的样品，并加入包含报告基团的检测试剂(优选地，能够结合于多肽上不同位点的二级抗体)。然后使用适合于特异性报告基团的方法确定保持与固体支持物结合的检测试剂的量。
在具体实施方案中，预期抗体一旦固定在如上所述的支持物上，应该通过使用本领域中普通技术人员已知的任何合适封闭剂，诸如牛血清清蛋白或吐温20TM(西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.)，St.Louis，Mo.)封闭支持物上剩余的蛋白质结合位点。然后使固定的抗体与样品一起温育，且容许多肽结合于所述抗体。温育前，可以用合适的稀释剂，诸如磷酸盐缓冲液(PBS)稀释样品。通常，合适的接触时间(即温育时间)应该进行选择以对应于这样的时间期，所述时间期足以检测获自患有特定选择的肿瘤的个体的样品中多肽的存在。优选地，接触时间足以获得在结合和未结合多肽之间平衡时获得的结合水平的至少约95％的结合水平。本领域中那些普通技术人员应该承认获得平衡所需的时间可以容易地通过测定经过一段时间发生的结合水平来确定。
还预期未结合的样品应该然后通过用合适的缓冲液清洗固体支持物而去除。然后应该将包含报告基团的二级抗体加入固体支持物。然后进行检测试剂与固定的抗体-多肽复合物在一起温育一段足以检测结合的多肽的时间量。随后，然后去除未结合的检测试剂，并利用报告基团检测结合的检测试剂。用于检测报告基团的方法必须特异于所选报告基团的类型，例如，针对放射性基团，闪烁计数或放射自显影法通常是适合的。光谱法可以用于检测染料、发光基团和荧光基团。生物素可以利用与不同报告基团(通常，放射性或荧光基团或酶)偶联的抗生物素蛋白检测。酶报告基团可以通常通过添加底物(通常进行一段特定时期)，随后进行反应产物的光谱或其他分析来检测。
为了使用本发明的诊断测定试剂盒确定是否存在癌症，诸如前列腺癌，通常将从保持与固体支持物结合的报告基团检测到的信号与对应于预确定截断值的信号相比较。例如，用于检测癌症的例证性截断值可以是当使固定的抗体与来自无癌症患者的样品一起温育时获得的平均信号。通常，认为产生高于预确定截断值约3个标准偏差的信号的样品是癌症阳性的。在备选的实施方案中，按照Sackett等，临床流行病学(ClinicalEpidemiology).临床医学基本科学(A Basic Science for Clinical Medicine)，利特尔布朗公司(Little Brown and Co.)，1985，106-7页的方法，截断值可以利用接受者操作曲线(Receiver Operator Curve)确定。在该实施方案中，截断值可以从对应于关于诊断检测结果的每种可能的截断值的正阳性率(即灵敏性)和假阳性率(100％-特异性)对的图表确定。在最接近左上角的图表中的截断值(即包含最大面积的值)是最准确的截断值，且可以认为产生高于由该方法确定的截断值的信号的样品是阳性的。备选地，截断值可以沿着图表向左移动，从而最小化假阳性率，或向右移动，从而最小化假阴性率。一般，认为产生高于由该方法确定的截断值的信号的样品对癌症是阳性的。
预期可通过所述试剂盒进行的诊断测定以流通式或试验纸检验(striptest)形式进行，其中结合试剂固定在膜，诸如硝化纤维膜上。在流通式检测中，当样品流经膜时，样品中的多肽结合于固定的结合试剂。第二种标记的结合试剂在包含该第二种结合试剂的溶液流经该膜时，再结合于结合试剂-多肽复合物。结合的第二种结合试剂的检测可以然后如上所述进行。在试验纸检验形式中，将结合试剂结合的膜的一端浸没在包含样品的溶液中。该样品沿该膜移动经过包含第二种结合试剂的区域，并到达固定的结合试剂的区域。所述第二结合试剂在固定的抗体区域处的浓度指示癌症的存在。在结合位点形成可以视觉读取的图案，诸如线，指示阳性检测。缺乏所述图案指示阴性结果。一般，选择固定在膜上的结合试剂的量，从而在生物学样品包含足以在处于上述形式的双-抗体夹心式测定中产生阳性信号的多肽水平时，产生视觉可辨别的图案。对于在本诊断测定中使用的优选结合试剂是目前公开的抗体，其抗原-结合片段、和如本文中所述的任何CDMAB相关结合试剂。固定在膜上的抗体的量应该是有效引起诊断测定的任意量，且可以在约25毫微克-约1微克的范围内。典型地，所述检测可以利用非常小量的生物学样品进行。
另外，本发明的CDMAB由于其识别其靶抗原的能力，可以用在进行研究的实验室中。
为了更充分地理解本文所述的本发明，进行了下述描述。
本发明提供特异性识别和结合IDAC 141204-01抗原的CDMAB(即，IDAC 141204-01CDMAB，由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体、由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体、其抗原结合片段或抗体配体)。
通过以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的CDMAB可以以任何形式存在，只要它具有这样的抗原-结合区，所述抗原-结合区竞争性抑制由杂交瘤IDAC 141204-01产生的分离的单克隆抗体与其靶抗原的免疫特异性结合。因此，具有与IDAC 141204-01抗体相同的结合特异性的任何重组蛋白(例如，融合蛋白，其中所述抗体与第二蛋白如淋巴因子或肿瘤抑制性生长因子结合)均落入本发明的范围内。
在本发明的一个实施方案中，所述CDMAB是IDAC 141204-01抗体。
在其它实施方案中，所述CDMAB是抗原结合片段，其可以是Fv分子(如单链Fv分子)、Fab分子、Fab’分子、F(ab’)2分子、融合蛋白、双特异性抗体、异种抗体或具有IDAC 141204-01抗体的抗原-结合区的任何重组分子。本发明的CDMAB针对所述IDAC 141204-01单克隆抗体针对的表位。
本发明的CDMAB可以在分子内进行修饰，即，通过氨基酸修饰，以产生衍生物分子。化学修饰也可以是可能的。通过直接突变、亲和力成熟方法、噬菌体展示或链改组的修饰也可以是可能的。
亲和力和特异性可以通过突变CDR和/或苯丙氨酸色氨酸(FW)残基和筛选具有所需特征的抗原结合位点进行改进或改良。(例如，Yang等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，(1995)254：392-403)。一种方法是随机化各个残基或残基的组合，从而在其它方面相同的抗原结合位点群中，2-20个氨基酸的子集存在于特定位置处。备选地，突变可以通过易错PCR方法在一定范围的残基中诱导(例如，Hawkins等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，(1992)226：889-96)。在另一个实例中，包含重链和轻链可变区基因的噬菌体展示载体可以在大肠杆菌(E.coli)突变菌株中增殖(例如，Low等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，(1996)250：359-68)。这些诱变方法是许多本领域中技术人员已知方法的例证。
增加本发明抗体亲和力的另一种方式是进行链改组，其中重链或轻链与其他重链或轻链随机配对，从而制备具有较高亲和力的抗体。抗体中的多种CDR也可以利用其他抗体中相对应的CDR改组。
衍生物分子将保留所述多肽的功能特性，即，具有这样的取代的分子仍然允许所述多肽与所述IDAC 141204-01抗原或其部分结合。
这些氨基酸取代包括，但不必要限于，本领域内已知为“保守的”氨基酸取代。
例如，充分确定的蛋白质化学原理认为，通常可以在蛋白质内频繁进行称为“保守氨基酸取代”的特定的(certain)氨基酸取代，而不改变该蛋白质的构象或功能。
这样的变化包括用异亮氨酸(I)，缬氨酸(V)，和亮氨酸(L)中的任一种取代这些疏水性氨基酸中的任意其它一种；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，并且反之亦然；用谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，并且反之亦然；和用丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)，并且反之亦然。其它取代也可以被认为是保守的，这取决于特定氨基酸的环境及其在蛋白质的三维结构中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)常常可以互换，同样丙氨酸和缬氨酸(V)也可以互换。相对疏水性的甲硫氨酸(M)常常可以与亮氨酸和异亮氨酸互换，并且有时可以与缬氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)常常在这样的情形中互换，在所述情形中，氨基酸残基的重要特征是其电荷，并且这两种氨基酸残基的不同的pK’s并不显著。在特定的情形中，还有其它的变化可以被认为是“保守的”。
实施例1
杂交瘤生产----杂交瘤细胞系AR40A746.2.3
Figure GPA00001027374200401
构不能发放存活的样品，替换保藏品。
为了产生生产抗癌抗体AR40A746.2.3的杂交瘤，在PBS中制备与由冷冻的前列腺癌肿瘤组织(Genomics Collaborative(基因组合作)，Cambridge，MA)的单细胞混悬液。通过轻轻混合制备IMMUNEASYTM(Qiagen，Venlo，荷兰)佐剂用于使用。通过皮下注射在50微升的抗原佐剂中的200万个细胞而免疫5-7周龄的BALB/c小鼠。在初次免疫后2和3周，用新鲜制备的抗原佐剂对免疫的小鼠进行腹膜内加强，浓度为200万个细胞/50微升。在最后一次免疫后3天，使用脾脏进行融合。通过将分离的脾细胞与NSO-1骨髓瘤配偶体融合而制备杂交瘤。对杂交瘤亚克隆，检测来自融合物的上清。
为了确定该杂交瘤细胞分泌的抗体是IgG还是IgM同种型，使用ELISA测定。在4℃在ELISA平板中加入100微升/孔的山羊抗-小鼠IgG+IgM(H+L)过夜，所述山羊抗-小鼠IgG+IgM(H+L)在包被缓冲液(0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH 9.2-9.6)中，浓度2.4微克/mL。将平板用洗涤缓冲液(PBS+0.05％吐温)洗涤3次。向平板加入100微升/孔的封闭缓冲液(在洗涤缓冲液中5％牛奶)，在室温下1小时，然后在洗涤缓冲液中洗涤3次。加入100微升/孔的杂交瘤上清，并且将平板在室温下温育1小时。平板用洗涤缓冲液洗涤3次，并且加入山羊抗-小鼠IgG或IgM辣根过氧化物酶缀合物的1/100,000稀释液(稀释在含有1％牛奶的PBS中)，100微升/孔。在将平板在室温下温育1小时后，将平板用洗涤缓冲液洗涤3次。将100微升/孔的TMB溶液在室温下温育1-3分钟。加入50微升/孔2M H2SO4终止颜色反应，并且用Perkin-Elmer HTS7000平板读数仪在450nm下对平板读数。如在图1中所示，AR40A746.2.3杂交瘤主要分泌IgG同种型的抗体。
为了确定由所述杂交瘤细胞分泌的抗体的亚类，使用小鼠单克隆抗体同种型试剂盒(HyCult生物技术(HyCult Biotechnology)，Frontstraat，荷兰)进行同种型分型实验。将500微升缓冲液加入到包含大鼠抗-小鼠亚类特异性抗体的检测试验条(test strip)。将500微升杂交瘤上清液加入到检测管，并通过轻轻搅动浸没。通过与胶体粒子偶联的第二大鼠单克隆抗体直接检测捕获的小鼠免疫球蛋白。这两种蛋白质的组合产生用于分析同种型的视觉信号。抗-癌抗体AR40A746.2.3是IgG1、κ同种型的。
在一轮限制性稀释后，在细胞ELISA测定中检测杂交瘤上清的与靶细胞结合的抗体。检测了2种人前列腺细胞系和一种人非-癌皮肤细胞系：分别为PC-3，LnCap和CCD-27sk。所有细胞系均从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)获得。在使用前将接种的细胞固定。在室温下，用含有MgCl2和CaCl2的PBS洗涤平板三次。向每个孔中加入100微升稀释在PBS中的2％低聚甲醛，在室温下10分钟，然后倒掉。将平板再在室温下用含有MgCl2和CaCl2的PBS洗涤三次。在室温下用100微升/孔在洗涤缓冲液(PBS+0.05％吐温)中的5％牛奶封闭1小时。将平板用洗涤缓冲液洗涤三次，并且以100微升/孔加入杂交瘤上清，在室温下1小时。将平板用洗涤缓冲液洗涤3次，并且加入100微升/孔与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗-小鼠IgG抗体的1/25,000稀释液(稀释在含有1％牛奶的PBS中)。在室温下温育1小时后，将平板用洗涤缓冲液洗涤3次，并且将100微升/孔的TMB底物在室温下温育1-3分钟。用50微升/孔2M H28O4终止反应，并且用Perkin-Elmer HTS7000平板读数仪在450nm下对平板读数。列在图1中的结果表示为与内部(in-house)IgG同种型对照相比高出背景的倍数，所述内部IgG同种型对照先前已经表明不与所检测的细胞系结合。来自杂交瘤AR40A746.2.3的抗体显示出与PC-3和LnCap前列腺癌细胞系结合。
与检测抗体结合联合，在下述细胞系中检测杂交瘤上清的细胞毒性作用(抗体诱导的细胞毒性)：PC-3，LnCap和CCD-27sk。钙荧光素AM从分子探针(Molecular Probes)(Eugene，OR)获得，并且按照下文所述进行测定。在测定前将细胞以预先确定的适当的密度接种。2天后，将来自杂交瘤微量滴定板的100微升上清转移到细胞平板中，并且在5％CO2培养箱中温育5天。抽空作为阳性对照的孔，加入100微升溶解在培养基中的叠氮钠(NaN3，.01％，西格玛(Sigma)，Oakville，ON)，或放线菌酮(CHX，0.5微摩尔，西格玛(Sigma)，Oakville，ON)。在处理5天后，然后通过倒置将平板倒空，并且吸干。从多通道挤压瓶向每个孔中分配含有MgCl2和CaCl2的室温DPBS(Dulbecco’s磷酸盐缓冲液)，轻敲3次，通过倒置倒空然后吸干。向每个孔中加入50微升稀释在含有MgCl2和CaCl2的DPBS中的荧光钙荧光素染料，并且在37℃在5％CO2培养箱中温育30分钟。在Perkin-Elmer HTS7000荧光平板读数仪中对平板读数，并且在MicrosoftExcel中分析数据。结果列在图1中。来自AR40A746.2.3杂交瘤的上清对LnCap前列腺癌细胞产生8％的特异性细胞毒性。这是用阳性对照叠氮化钠和放线菌酮分别对LnCap前列腺癌细胞获得的细胞毒性的12％和14％。对非-癌皮肤细胞系CCD-27sk不存在可检测的细胞毒性。
来自图1的结果显示AR40A746.2.3的细胞毒性作用与癌细胞类型上的结合水平相关。最强可检测的结合针对LnCap前列腺癌细胞并且类似地，最强可检测的细胞毒性也在LnCap前列腺癌细胞上。如图1中列表，AR40A746.2.3在CCD-27sk非癌人皮肤细胞系中不产生细胞毒性。已知的非-特异性细胞毒素试剂放线菌酮和NaN3如所料通常产生细胞毒性。
实施例2
体外结合
通过在CL-1000烧瓶(BD生物科学(BD Biosciences)，Oakville，ON)中培养杂交瘤而生产AR40A746.2.3单克隆抗体，收集和再接种以两次/周进行。接着使用蛋白质G琼脂糖4Fast Flow(Protein G Sepharose 4 FastFlow)(安玛西亚生物科学(Amersham Biosciences)，Baie d’Urfé，QC)进行标准的抗体纯化步骤。使用去免疫的、人源化的、嵌合的或鼠单克隆抗体在本发明范围之内。
通过流式细胞计数(FACS)评估AR40A746.2.3与结肠(DLD-1，HT-29，Lovo和SW1116)，胰腺(BxPC-3)，乳腺(MDA-MB-231和MCF-7)，前列腺(PC-3和DU-145)，卵巢(OVCAR-3)和黑素瘤(A2058，A375，WM9，WM35，WM164，WM451，WM537，WM852，WM983，WM1205和WM1232)癌，和来自皮肤(CCD-27sk)和肺(Hs888.Lu)的非癌细胞系的结合。除黑素瘤细胞系WM9，WM35，WM164，WM451，WM537，WM852，WM983，WM1205和WM1232获自David Hogg博士(多伦多大学，多伦多，加拿大)外，全部细胞系获自美国典型培养物保藏中心(American Type Tissue Collection)(ATCC，Manassas，VA)。
通过最初用DPBS(无Ca++和Mg++)清洗细胞单层，为FACS准备细胞。然后使用细胞解离缓冲液(Invitrogen，Burlington，ON)在37℃将细胞从它们的细胞培养板中移出。离心和收集后，将细胞在4℃重新混悬在包含MgCl2，CaCl2和2％胎牛血清的DPBS中(染色培养基)并计数，等分为适当的细胞密度，离心沉淀细胞并在存在检测抗体(AR40A746.2.3)或对照抗体(同种型对照，抗-EGFR)的条件下，在4℃，重新混悬在染色培养基中。在冰上，以20微克/mL评估同种型对照和检测抗体，而以5微克/mL评估抗-EGFR 30分钟。加入Alexa Fluor 546-缀合的二次抗体前，用染色培养基清洗细胞一次。然后，在4℃，添加染色培养基中的Alexa Fluor 546-缀合抗体30分钟。再最后清洗细胞一次并重新混悬在固定培养基(包含1.5％低聚甲醛的染色培养基)中。通过利用FACSarrayTM系统软件(BD生物科学(BD Biosciences)，Oakville，ON)在FACSarrayTM上运行样品评估细胞的流式细胞计数采样。通过调节FSC和SSC检测器上的电压和振幅增加设置细胞正向(FSC)和侧向扩散(SSC)。通过运行未染色的细胞调节用于荧光(Alexa-546)通道的检测器，从而使细胞具有约1-5单位中等荧光强度的一致的峰。对于每份样品，获得约10,000门控事件(染色的固定细胞)以进行分析，并将结果显示在图2中。
图2显示超过同种型对照的平均荧光强度倍数增加。图3编辑AR40A746.2.3抗体的代表性柱状图。AR40A746.2.3证明了与结肠DLD-1(50.5-倍)，HT-29(80.5-倍)和Lovo(31.6-倍)，乳腺MCF-7(107.4-倍)，前列腺PC-3(37.8-倍)和DU-145(30.4-倍)和卵巢OVCAR-3(64.9-倍)人癌细胞系的强结合。还存在与结肠SW1116(13.3-倍)，胰腺BxPC-3(18.4-倍)，乳腺MDA-MB-231(19.8-倍)和黑素瘤A2058(2.7-倍)，A375(4.7-倍)，WM9(4.8-倍)，WM35(13.8-倍)，WM164(3.3-倍)，WM451(7.0-倍)，WM537(2.6-倍)，WM852(4.2-倍)，WM983(3.9-倍)和WM1232(3.4-倍)人癌细胞系的结合。存在与人非癌皮肤CCD-27sk(8.7-倍)和肺Hs888.Lu(20.5-倍)的可检测的结合。不存在与黑色素瘤癌细胞系WM1205的可检测结合。这些数据证明AR40A746.2.3结合于具有不同抗原表达水平的若干不同细胞系。
实施例3
使用人BxPC-3胰腺癌细胞进行体内肿瘤实验
在实施例1中，AR40A746.2.3证明了在体外针对人癌细胞的细胞毒性。为了将该发现扩展到体内模型中，在人BxPC-3胰腺癌异种移植模型中测试AR40A746.2.3。参考图4和5，对8-10周龄雌性SCID小鼠通过在颈后皮下注射而植入在100微升PBS溶液中的500万人胰腺癌细胞(BxPC-3)。将小鼠随机分成2个处理组，每组5只。在植入后那天，在用含有2.7mM KCl，1mM KH2PO4，137mM NaCl和20mM Na2HPO4的稀释剂从储备的浓缩液稀释后，对每组腹膜内施用300微升体积的20mg/kg的AR40A746.2.3检测抗体或缓冲液对照。然后，在研究持续时间内，每周一次施用所述抗体和对照样品。约每隔7天用测径器测量肿瘤生长。在8剂量抗体注射后，结束本研究。在研究持续时间内，每周一次记录动物的体重。在研究结束时，按照CCAC指导将所有动物处死。
AR40A746.2.3在人胰腺癌BxPC-3体内预防模型中减少肿瘤生长。如在第55天，即最后给药抗体后5天时确定地，与缓冲液-处理的组相比，用Arius抗体AR40A746.2.3处理以99.56％(p＜0.0001，t-检验)显著减少BxPC-3肿瘤生长(图4)。
在整个研究过程中，不存在临床毒性迹象。以每周时间间隔测量的体重是健康和不能健壮生长(thrive)的替代品(surrogate)。所有组中的平均体重均在研究期间内增加(图5)。第0天和第55天之间的平均体重增加在对照组中是2.0g(9.9％)和在AR40A746.2.3处理组中是3.0g(15.3％)。在处理期结束时各组间不存在显著差异。
总之，在这种人胰腺癌异种移植模型中，AR40A746.2.3是很好耐受的，并且减少肿瘤负荷。
实施例4
使用人BxPC-3胰腺癌细胞的体内肿瘤实验
在实施例3中，AR40A746.2.3证明了针对人预防性胰腺异种移植癌症模型的功效。为了将该发现扩展到确立的模型中，在确立的人BxPC-3胰腺癌异种移植模型中测试AR40A746.2.3。参考图6和7，对8-10周龄雌性SCID小鼠通过在每只小鼠颈后皮下注射而植入在100微升PBS溶液中的500万人胰腺癌细胞(BxPC-3)。当平均小鼠肿瘤体积达到约83mm3时，将小鼠随机分成2个处理组，每组8只。在植入后第31天，在用含有2.7mM KCl，1mM KH2PO4，137mM NaCl和20mM Na2HPO4的稀释剂从储备的浓缩液稀释后，对每组腹膜内施用300微升体积的20mg/kg的AR40A746.2.3检测抗体或缓冲液对照。然后，每周施用所述抗体和对照样品3次，持续约3周。每周用测径器测量肿瘤生长一次。在10剂量抗体注射后，结束治疗。在肿瘤测量的同时记录动物的体重。一旦它们达到终点，在研究结束时，按照CCAC指导将所有动物处死。
AR40A746.2.3在BxPC-3体内确立的人胰腺癌模型中证明了显著的肿瘤生长抑制。如在第58天，即最后给药抗体后6天时确定地，与缓冲液-处理的组相比，用Arius抗体AR40A746.2.3处理以70.14％(p＝0.00001，t-检验)减少BxPC-3肿瘤生长(图6)。
在整个研究过程中，不存在明显临床毒性迹象。以每周时间间隔测量的体重是健康和不能健壮生长的替代品。所有组中的平均体重均在研究期间内保持大致相同(图7)。在处理期内各组间不存在显著差异。
总之，在这种确立的人胰腺癌异种移植模型中，AR40A746.2.3是很好耐受的，并且显著抑制肿瘤生长。
实施例5
使用人MDA-MB-231乳腺癌细胞的体内肿瘤实验
在实施例3和4中，AR40A746.2.3证明了针对人胰腺异种移植癌症模型的功效。为了将该发现扩展到乳腺癌模型中，在确立的人MDA-MB-231乳腺癌异种移植模型中测试AR40A746.2.3。参考图8和9，对8-10周龄雌性SCID小鼠通过在每只小鼠颈后皮下注射而植入在100微升PBS溶液中的500万人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)。当平均小鼠肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠随机分成2个处理组，每组10只。在植入后第59天，在用含有2.7mM KCl，1mM KH2PO4，137mM NaCl和20mMNa2HPO4的稀释剂从储备的浓缩液稀释后，对每组腹膜内施用300微升体积的20mg/kg的AR40A746.2.3检测抗体或缓冲液对照。然后，每周施用所述抗体和对照样品3次，持续约3周。每周用测径器测量肿瘤生长一次。在10剂量抗体注射后，结束治疗。在肿瘤测量的同时记录动物的体重。一旦它们达到终点，在研究结束时，按照加拿大动物护理委员会(CCAC)指导将所有动物处死。
AR40A746.2.3在人乳腺癌的MDA-MB-231体内确立模型中证明了肿瘤生长的抑制。如在第90天，即最后给药抗体后10天时确定地，与缓冲液-处理的组相比，用Arius抗体AR40A746.2.3处理以42.67％(p＝0.08，t-检验)减少MDA-MB-231肿瘤生长(图8)。
在整个研究过程中，不存在明显临床毒性迹象。以每周时间间隔测量的体重是健康和不能健壮生长的替代品。所有组中的平均体重均在研究期间内增加(图9)。第59天和第90天之间的平均体重增加在对照组中是1.64g(7.0％)且在AR40A746.2.3处理组中是0.17g(0.8％)。在处理期内各组间不存在显著差异。
总之，在这种人乳腺癌异种移植模型中，AR40A746.2.3是很好耐受的，并且抑制肿瘤生长。AR40A746.2.3证明了针对3种不同人癌症指征的功效：前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌。在若干公认的人癌症疾病模型中观察到治疗益处，这提示该抗体对于其他哺乳动物，包括人的治疗的药理学和药物益处。总之，该数据证明AR40A746.2.3抗原是癌性相关抗原且在人癌细胞上表达，并且是病理学相关癌症靶标。
实施例6
使用人BxPC-3胰腺癌细胞的体内肿瘤实验
在实施例3和4中，AR40A746.2.3证明了在预防性和确立的BxPC-3人胰腺异种移植癌症模型中的功效。为了确定有效剂量水平，在确立的BxPC-3模型中以不同剂量测试AR40A746.2.3。参考图10和11，对8-10周龄雌性SCID小鼠通过在每只小鼠颈后皮下注射而植入在100微升PBS溶液中的500万人胰腺癌细胞(BxPC-3)。当平均小鼠肿瘤体积达到约83mm3时，将小鼠随机分成5个处理组，每组9只。在植入后第30天，在用含有2.7mM KCl，1mM KH2PO4，137mM NaCl和20mM Na2HPO4的稀释剂从储备的浓缩液稀释后，对每组腹膜内施用300微升体积的20，10，5或2mg/kg的AR40A746.2.3检测抗体或缓冲液对照。然后，每周施用所述抗体和对照样品3次，持续约3周。每周用测径器测量肿瘤生长一次。在10剂量抗体注射后，结束治疗。在肿瘤测量的同时记录动物的体重。一旦它们达到终点，在研究结束时，按照CCAC指导将所有动物处死。
AR40A746.2.3在人胰腺癌的体内确立模型中证明了肿瘤生长的剂量依赖性抑制。如在第61天，即最后给药抗体后10天时确定地，与缓冲液-处理的组相比，用处于20，10，5或2mg/kg剂量的Arius抗体AR40A746.2.3处理以64.7％(p＜0.0003，t-检验)，69.9％(p＜0.0001，t-检验)，63.7％(p＜0.0003，t-检验)或42.0％(p＜0.0074，t-检验)减少BxPC-3肿瘤生长(图10)。最大抑制以20，10和5mg/kg剂量获得。
在整个研究过程中，不存在明显临床毒性迹象。以每周时间间隔测量的体重是健康和不能健壮生长的替代品。所有组中的平均体重均在研究期间内保持大致相同(图11)。在处理期内各组间不存在显著差异。
总之，在这种确立的人胰腺癌异种移植模型中，在所有测试剂量下，AR40A746.2.3是很好耐受的，并且以剂量依赖性方式显著抑制肿瘤生长。总之，该数据证明AR40A746.2.3在以剂量依赖性方式治疗人癌症中是有效的。
实施例7
使用人BxPC-3胰腺癌细胞的体内肿瘤实验
在实施例3、4、5和6中，AR40A746.2.3证明了作为完整抗体的功效。为了确定作为抗体片段是否能保持该功效，在确立的BxPC-3胰腺异种移植模型中测试AR40A746.2.3和AR40A746.2.3F(ab’)2。AR40A746.2.3如实施例2中概述地产生和纯化。纯化的AR40A746.2.3随后通过胃蛋白酶和/或无花果蛋白酶消化裂解，从而生成F(ab’)2分子。利用大小排阻Amicon离心单元(50,000kDa分子量截取)和/或蛋白A层析法进行片段的分离。
参考图12和13，对8-10周龄雌性SCID小鼠通过在每只小鼠颈后皮下注射而植入在100微升PBS溶液中的500万人胰腺癌细胞(BxPC-3)。当平均小鼠肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠随机分成3个处理组，每组9只。在植入后第43天，在用含有2.7mM KCl，1mM KH2PO4，137mMNaCl和20mM Na2HPO4的稀释剂从储备的浓缩液稀释后，对每组腹膜内施用300微升体积的10mg/kg的AR40A746.2.3检测抗体或缓冲液对照，每周3次，总共施用10剂量。每日腹膜内施用13.3mg/kg的AR40A746.2.3F(ab’)2，总共施用19剂量。约每7天用测径器测量肿瘤生长一次。在肿瘤测量的同时记录动物的体重。一旦它们达到终点，在研究结束时，按照CCAC指导将所有动物处死。
AR40A746.2.3和AR40A746.2.3F(ab’)2均在人胰腺癌的BxPC-3体内确立模型中证明了抑制肿瘤生长。如在第69天，即最后给药抗体后5天时确定地，与缓冲液-处理的组相比，用Arius抗体AR40A746.2.3和AR40A746.2.3F(ab’)2处理分别以67.6％(p＜0.0011，t-检验)和51.7％(p＜0.0098，t-检验)显著减少BxPC-3肿瘤生长(图12)。
在整个研究过程中，不存在临床毒性迹象。以每周时间间隔测量的体重是健康和不能健壮生长的替代品。所有组中的平均体重均在研究期间内保持大致相同(图13)。在处理期结束时各组间不存在显著差异。
总之，在这种人胰腺癌异种移植模型中，AR40A746.2.3和AR40A746.2.3F(ab’)2是很好耐受的，并且显著减少肿瘤负荷。
实施例8
使用人BxPC-3胰腺癌细胞的体内肿瘤实验
在实施例3、4、6和7中，AR40A746.2.3证明了在体内针对人胰腺癌异种移植模型的活性。为了对该活性和临床相关化疗剂，吉西他滨进行比较，和为了确定抗体活性是否能够在化疗剂-抗体组合中增强，在确立的人BxPC-3胰腺异种移植模型中单独地和组合地使用AR40A746.2.3和吉西他滨。参考图14，15，16，17，18和19，对7-8周龄雌性无胸腺裸鼠在右腰处皮下植入BxPC-3肿瘤片段(1mm3；胰腺BxPC-3癌细胞系通过连续传代保持在无胸腺裸鼠中)。每周2次监测肿瘤，并且当它们的体积达到80-120mm3时每日进行监测。在研究的第1天，将小鼠分类为6个处理组，每组9-10只，所述处理组具有肿瘤尺寸62.5-126.0mm3和组平均肿瘤尺寸86-87.3mm3。所有试剂通过腹膜内施用。20mg/kg的AR40A746.2.3测试抗体或缓冲液对照给药每周3次，持续3周，并且在用含有2.7mM KCl，1mM KH2PO4，137mM NaCl和20mM Na2HPO4的稀释剂从储备的浓缩液稀释后，以200微升的体积施用于每组。吉西他滨在第1，4，7和10天时每日给药1次。对照组小鼠接受PBS缓冲液，3x/周，持续3周。组2和3分别接受160和80mg/kg的吉西他滨单治疗。组4接受AR40A746.2.3单治疗。组5和6分别接受160和80mg/kg的吉西他滨和AR40A746.2.3的组合。约每3-4天用测径器测量肿瘤生长一次。在9剂量抗体和4剂量吉西他滨后，结束治疗。肿瘤生长的终点体积是1000mm3。将关于抗体处理对比载体处理组的治疗结果表示为(i)百分比肿瘤生长延迟(TGD)，其定义为在中间时间到终点中的百分比增加(TTE)，和(ii)百分比肿瘤生长抑制(TGI)，其定义为中值肿瘤体积的减小。在肿瘤测量的同时记录动物的体重。一旦它们达到终点，在研究结束时，按照CCAC指导将所有动物处死。
AR40A746.2.3单治疗证明了0％的TGD，但产生一只具有850-mm3肿瘤的72天存活者。吉西他滨在160和80mg/kg分别产生9％和0％的TGD，并不产生72天存活者。AR40A746.2.3与160和80mg/kg吉西他滨的组合分别产生9％和22％的TGD。然而，高剂量组合产生2只具有中值肿瘤体积612mm3的72天存活者，以及2只具有多于58天的TTE值的动物。低剂量组合产生一只具有中值肿瘤体积550-mm3的存活者，以及一只具有69.5天TTE的动物。组合治疗均不获得统计学显著活性，这部分归因于载体处理肿瘤对照中的可变肿瘤生长率(图14和15)。
这2种组合从第1天到第13天均抑制中值肿瘤生长。在第13天进行的肿瘤体积分析说明160和80mg/kg吉西他滨单治疗产生显著的27％和56％的TGI(p＜0.05，Mann-Whitney U-检验)，而AR40A746.2.3单治疗证明了不显著的16％的TGI。20mg/kg的AR40A746.2.3和160或80mg/kg吉西他滨的组合产生高度显著的53％和56％的TGI(p＜0.001，Mann-WhitneyU-检验)(图14和15)。
在整个研究过程中，不存在明显临床毒性迹象。以每周时间间隔测量的体重是健康和不能健壮生长的替代品。可以忽略(＜1％)的最大组平均体重减少发生在组2(160mg/kg吉西他滨单治疗)和组5(AR40A746.2.3与160mg/kg吉西他滨组合)中。在处理期内各组间不存在显著差异(图18和19)。
总之，TTE值的对数级分析说明AR40A746.2.3或吉西他滨单治疗或它们的组合产生针对BxPC-3胰腺癌异种移植物的活性。在第13天，除AR40A746.2.3单治疗外，每种抗体或化学疗法或它们的组合产生统计学显著的TGI。结果证明对于治疗活性的剂量依赖性倾向：用160和80mg/kg吉西他滨/AR40A746.2.3组合处理的动物的40％和20％分别经历充分延长的存活，然而，经历充分延长存活的单治疗处理的小鼠的百分比是11-12.5％(图17和18)。
实施例9
使用人MDA-MB-231癌细胞的体内肿瘤实验
参考图20和21，对8-10周龄雌性SCID小鼠通过在每只小鼠右腰处皮下注射而植入在100微升PBS溶液中的500万人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)。将小鼠随机分成2个处理组，每组10只。在植入后那天，在用PBS缓冲溶液从储备的浓缩液稀释后，对每组腹膜内施用300微升体积的20mg/kg的AR40A746.2.3检测抗体或缓冲液对照。然后，每周施用所述抗体和对照样品1次，持续7周。每周用测径器测量肿瘤生长一次。在8剂量抗体注射后，结束治疗。在研究的期间内，当测量肿瘤时记录动物的体重。达到终点时，在研究结束时，按照加拿大动物护理委员会(CCAC)指导将所有动物处死。
AR40A746.2.3在人乳腺癌的MDA-MB-231体内预防性模型中显著抑制肿瘤生长。如在第56天，即最后给药抗体后6天时确定地，与缓冲液-处理的组相比，用Arius抗体AR40A746.2.3处理以80.6％(p＜0.00001，t-检验)减少MDA-MB-231肿瘤生长(图20)。
在整个研究过程中，不存在明显临床毒性迹象。以每周时间间隔测量的体重是健康和不能健壮生长的替代品。所有组中的平均体重均在研究期间内增加(图21)。第0天和第56天之间的平均体重增加在对照组中是+2.76g(+13.6％)且在AR40A746.2.3处理组中是+2.59(+12.6％)。在处理期内各组间不存在显著差异。
总之，在这种人乳腺癌异种移植模型中，AR40A746.2.3在第56天时是很好耐受的，并且显著抑制肿瘤生长。
实施例10
人正常组织
进行IHC研究表征人正常组织中AR40A746.2.3抗原分布。测试了组织阵列(Imgenex，圣地亚哥，CA)上表示的59种人正常组织。进行以前的研究以最优化抗体的IHC结合条件。组织切片通过在58℃烤箱中干燥1小时去石蜡并通过浸没在科普林缸(Coplin jar)的二甲苯5次，4分钟/次脱蜡。在通过一系列分级乙醇清洗(100％至75％)处理后，使切片在水中重新水合。将载玻片浸没在10mM柠檬酸盐缓冲液pH 6(Dako，多伦多，安大略)中，然后以高、中和低能量设置各微波处理5分钟，并最后浸没在冷PBS中。然后将载玻片浸没在3％过氧化氢溶液中6分钟，用PBS清洗3次，每次5分钟，干燥并用通用封闭溶液(Dako，多伦多，安大略)在室温下温育5分钟。AR40A746.2.3或同种型对照抗体(针对黑曲霉(Aspergillusniger)葡糖氧化酶，即在哺乳动物组织中既不存在也不可诱导的酶；Dako，多伦多，安大略)在抗体稀释缓冲液(Dako，多伦多，安大略)中稀释到其工作浓度(对于每种抗体5微克/mL)并在室温下，在湿润室中温育1小时。将单克隆小鼠抗肌动蛋白(Dako，多伦多，安大略)稀释到其工作浓度2微克/mL。用PBS清洗载玻片3次，每次5分钟。用如供应(Dako EnvisionSystem(Dako预见系统)，多伦多，安大略)的HRP缀合的二级抗体在室温下检测/显现初级抗体的免疫反应性30分钟。在该步骤后，载玻片用PBS清洗3次，5分钟/次，并且通过添加DAB(3，3’-diaminobenzidinetetrahydrachloride，Dako，多伦多，安大略)发色团底物溶液以在室温下进行免疫过氧化物酶染色10分钟形成颜色反应。在自来水中洗涤载玻片终止发色反应。在用梅尔苏木精(Sigma Diagnostics(西格玛诊断)，Oakville，ON)复染色后，载玻片用分级乙醇(75-100％)脱水并用二甲苯透明化。利用封固剂(mounting media)(Dako Faramount，多伦多，安大略)封盖载玻片。利用Axiovert 200(Ziess加拿大，多伦多，ON)显微镜法检验载玻片，并用Northern Eclipse Imaging Software(北方日食图像软件)(Mississauga，ON)获得和保存数字图像。由组织病理学家对结果进行阅读、评分和解释。
AR40A746.2.3与59种人正常组织样品的结合利用人正常组织阵列(Imgenex，圣地亚哥，CA)进行。图22A-22B总结多种人正常组织的AR40A746.2.3染色的结果。AR40A746.2.3抗体显示出主要结合上皮组织(图24的图B和D)。另外，观察到与结缔组织、肌肉组织和外展神经组织的结合。细胞定位主要在膜上。在一些组织的细胞中观察到胞质染色。抗肌动蛋白阳性对照抗体显示出与肌肉组织的特异性结合。IgG同种型阴性对照不显示出与任何测试组织的结合。
实施例11
人肿瘤组织
进行IHC研究表征人癌症中AR40A746.2.3抗原的普遍性。测试了来自一种阵列(Imgenex，圣地亚哥，CA)的59种人肿瘤组织和另外12种肿瘤组织和来自另一种阵列(Tri Star，Rockville，MD)的代表性正常组织。进行以前的研究以最优化抗体的IHC结合条件。组织切片通过在58℃烤箱中干燥1小时去石蜡并通过浸没在科普林缸的二甲苯5次，4分钟/次脱蜡。在通过一系列分级乙醇清洗(100％至75％)处理后，使切片在水中重新水合。将载玻片浸没在10mM柠檬酸盐缓冲液pH 6(Dako，多伦多，安大略)中，然后以高、中和低能量设置各微波处理5分钟，并最后浸没在冷PBS中。然后将载玻片浸没在3％过氧化氢溶液中6分钟，用PBS清洗3次，每次5分钟，干燥并用通用封闭溶液(Dako，多伦多，安大略)在室温下温育5分钟。AR40A746.2.3或同种型对照抗体(针对黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖氧化酶，即在哺乳动物组织中既不存在也不可诱导的酶；Dako，多伦多，安大略)在抗体稀释缓冲液(Dako，多伦多，安大略)中稀释到其工作浓度(对于每种抗体5微克/mL)并在室温下，在湿润室中温育1小时。将抗肌动蛋白稀释到其工作浓度2微克/mL。用PBS清洗载玻片3次，每次5分钟。用如供应(Dako Envision System(Dako预见系统)，多伦多，安大略)的HRP缀合的二级抗体在室温下检测/显现初级抗体的免疫反应性30分钟。在该步骤后，载玻片用PBS清洗3次，5分钟/次，并且通过添加DAB(3，3’diaminobenzidine tetrahydrachloride，Dako，多伦多，安大略)发色团底物溶液以在室温下进行免疫过氧化物酶染色10分钟形成颜色反应。在自来水中洗涤载玻片终止发色反应。在用梅尔苏木精(Sigma Diagnostics(西格玛诊断)，Oakville，ON)复染色后，载玻片用分级乙醇(75-100％)脱水并用二甲苯透明化。利用封固剂(mounting media)(Dako Faramount，多伦多，安大略)封盖载玻片。利用Axiovert 200(Ziess加拿大，多伦多，ON)显微镜法检验载玻片，并用Northern Eclipse Imaging Software(北方日食图像软件)(Mississauga，ON)获得和保存数字图像。由组织病理学家对结果进行阅读、评分和解释。
图23A-23C总结抗体与来自2种不同组织阵列的多种人肿瘤组织结合的结果。66种肿瘤样品是能解释的。在25/66(38％)测试的肿瘤中存在肿瘤细胞的中等到强染色，所述测试的肿瘤包括恶性黑素瘤，多种器官(包括食道)的鳞状细胞癌，肾和膀胱的过渡细胞癌，肾的肾细胞癌，前列腺的腺癌，脑的成胶质细胞瘤多态型，甲状腺小囊癌，子宫内膜癌和转移肺癌到肝(图24的A和C)。在23/66(35％)测试的肿瘤组织样品中观察到弱且不确定的染色。细胞定位主要在膜上，在一些组织的肿瘤细胞中还观察到胞质染色。在正常组织中，抗体显示出主要结合于上皮组织，这与实施例9中概述的数据相一致。没有观察到与骨骼肌或脑的结合。在肿瘤中，与正常组织包括肺和脑对比，存在AR40A746.2.3表位的过表达。抗肌动蛋白阳性对照抗体显示出与肌肉组织的特异性结合。IgG同种型阴性对照不显示出与任何测试组织的结合。这些结果证明AR40A746.2.3表位存在于癌细胞上并在一些肿瘤组织中过表达。
实施例12
胰腺人肿瘤组织
进行IHC研究进一步表征人胰腺癌中AR40A746.2.3抗原的普遍性。由人组织微阵列(Petagen，ISU ABXIS Co，首尔，韩国)测试33种胰腺癌组织和4种代表性非致瘤性胰腺组织。癌组织样品对于每种情形一式二份。最后的评分表示来自样品和肿瘤的最高主要染色强度。进行以前的研究以最优化抗体的IHC结合条件。组织切片通过在58℃烤箱中干燥1小时去石蜡并通过浸没在科普林缸的二甲苯5次，4分钟/次脱蜡。在通过一系列分级乙醇清洗(100％至75％)处理后，使切片在水中重新水合。将载玻片浸没在10mM柠檬酸盐缓冲液pH 6(Dako，多伦多，安大略)中，然后以高、中和低能量设置各微波处理5分钟，并最后浸没在冷PBS中。然后将载玻片浸没在3％过氧化氢溶液中6分钟，用PBS清洗3次，每次5分钟，干燥并用通用封闭溶液(Dako，多伦多，安大略)在室温下温育5分钟。AR40A746.2.3或同种型对照抗体(针对黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖氧化酶，即在哺乳动物组织中既不存在也不可诱导的酶；Dako，多伦多，安大略)在抗体稀释缓冲液(Dako，多伦多，安大略)中稀释到其工作浓度(对于每种抗体5微克/mL)并在室温下，在湿润室中温育1小时。将抗肌动蛋白稀释到其工作浓度2微克/mL。用PBS清洗载玻片3次，每次5分钟。用如供应(Dako Envision System(Dako预见系统)，多伦多，安大略)的HRP缀合的二级抗体在室温下检测/显现初级抗体的免疫反应性30分钟。在该步骤后，载玻片用PBS清洗3次，5分钟/次，并且通过添加DAB(3，3’diaminobenzidine tetrahydrachloride，Dako，多伦多，安大略)发色团底物溶液以在室温下进行免疫过氧化物酶染色10分钟形成颜色反应。在自来水中洗涤载玻片终止发色反应。在用梅尔苏木精(Sigma Diagnostics(西格玛诊断)，Oakville，ON)复染色后，载玻片用分级乙醇(75-100％)脱水并用二甲苯透明化。利用封固剂(mounting media)(Dako Faramount，多伦多，安大略)封盖载玻片。利用Axiovert 200(Ziess加拿大，多伦多，ON)显微镜法检验载玻片，并用Northern Eclipse Imaging Software(北方日食图像软件)(Mississauga，ON)获得和保存数字图像。由组织病理学家对结果进行阅读、评分和解释。
图25总结在组织阵列中抗体与胰腺癌结合的结果。31种胰腺肿瘤组织样品(包括29种腺癌和2种内分泌癌)和4种正常组织样品是能解释的。总之，在11/31(36％)测试肿瘤组织中存在肿瘤细胞的中等到强染色且在12/31(39％)测试肿瘤组织中存在肿瘤细胞的不确定到弱染色。对于腺癌，在9/29(31％)测试肿瘤组织中存在肿瘤细胞的中等到强染色且在12/29(41％)测试肿瘤组织中存在肿瘤细胞的不确定到弱染色。对于内分泌肿瘤，在两种测试样品(2/2)中均存在中等到强染色。存在对于更高组织学等级(G2-3，G3和G4)更高结合的倾向。不存在抗体结合和TNM肿瘤阶段的明显相关性。细胞定位主要在膜上，在一些测试组织的肿瘤细胞中还观察到胞质染色。
在4种测试的非致瘤性胰腺组织中，在1/4(25％)测试的肿瘤组织中存在中等到强染色且在3/4(75％)测试肿瘤组织中存在不确定到弱染色。结合主要针对上皮组织。抗肌动蛋白阳性对照抗体显示出与肌肉组织的特异性结合。IgG同种型阴性对照不显示出与任何测试组织的结合。在比较AR40A746.2.3与胰腺癌和非致瘤性胰腺组织结合的强度中，在致瘤性(图26A)中，与非致瘤性人胰腺组织(图26B)对比，存在由AR40A746.2.3靶向的表位的过表达。这些结果证明由AR40A746.2.3识别的表位在胰腺癌上表达并在肿瘤中，与正常胰腺组织对比，过表达。
实施例13
正常然和其他物种组织的交叉反应性
进行IHC研究，以评估AR40A746.2.3与非人物种组织的交叉反应性，从而发现合适的潜伏期(preclinical)毒理学模型。使用的所有组织都是福尔马林固定的石蜡包埋的。AR40A746.2.3与食蟹猴和猕猴的8种正常组织(Biochain(生物链)，CA，美国)和兔、大鼠、小鼠和绵羊的10种正常组织(Zymed laboratories Inc(Zymed实验室公司)，CA，美国)的结合利用组织微阵列进行。进行以前的实验以最优化抗体的IHC结合条件。组织切片通过在58℃烤箱中干燥1小时去石蜡并通过浸没在科普林缸的二甲苯5次，4分钟/次脱蜡。在通过一系列分级乙醇清洗(100％至75％)处理后，使切片在水中重新水合。将载玻片浸没在10mM柠檬酸盐缓冲液pH 6(Dako，多伦多，安大略)中，然后以高、中和低能量设置各微波处理5分钟，并最后浸没在冷PBS中。然后将载玻片浸没在3％过氧化氢溶液中6分钟，用PBS清洗3次，每次5分钟，干燥并用通用封闭溶液(Dako，多伦多，安大略)在室温下温育5分钟。AR40A746.2.3，单克隆小鼠抗肌动蛋白(Dako，多伦多，安大略)或同种型对照抗体(针对黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖氧化酶，即在哺乳动物组织中既不存在也不可诱导的酶；Dako，多伦多，安大略)在抗体稀释缓冲液(Dako，多伦多，安大略)中稀释到其工作浓度(5微克/mL)，例外是将抗肌动蛋白稀释到2微克/mL，并在室温下，在湿润室中温育1小时。用PBS清洗载玻片3次，每次5分钟。用如供应(DakoEnvision System(Dako预见系统)，多伦多，安大略)的HRP缀合的二级抗体在室温下检测/显现初级抗体的免疫反应性30分钟。在该步骤后，载玻片用PBS清洗3次，5分钟/次，并且通过添加DAB(3，3’-diaminobenzidinetetrahydrachloride，Dako，多伦多，安大略)发色团底物溶液以在室温下进行免疫过氧化物酶染色10分钟形成颜色反应。在自来水中洗涤载玻片终止发色反应。在用梅尔苏木精(Sigma Diagnostics(西格玛诊断)，Oakville，ON)复染色后，载玻片用分级乙醇(75-100％)脱水并用二甲苯透明化。利用封固剂(mounting media)(Dako Faramount，多伦多，安大略)封盖载玻片。利用Axiovert 200(Ziess加拿大，多伦多，ON)显微镜法检验载玻片，并用Northern Eclipse Imaging Software(北方日食图像软件)(Mississauga，ON)获得和保存数字图像。由组织病理学家对结果进行阅读、评分和解释。
一些组织不具代表性并且因此不包括在最终的解释中。图27表示与抗体与以前测试的正常人组织的结合相比，AR40A746.2.3结合食蟹猴、猕猴、兔、小鼠、大鼠和山羊正常组织的结果总结(实施例9)。AR40A746.2.3抗体显示主要与人(图28A)、食蟹猴(26B)、猕猴(26C)和兔(26D)的上皮组织、炎性细胞和神经组织的结合。对小鼠、大鼠或绵羊组织没有观察到结合。抗肌动蛋白阳性对照抗体显示与肌肉组织的特异性结合。IgG同种型阴性对照没显示出与任何解释的组织的结合。AR40A746.2.3因此以跟与人正常组织类似的方式与食蟹猴、猕猴和兔正常组织交叉反应。
实施例14
识别由AR40A746.2.3结合的抗原
1.免疫沉淀
识别关于AR40A746.2.3的抗原通过免疫沉淀来自BxPC-3细胞的溶解的溶胞产物分离关联配体进行。100微升蛋白G Dynabeads(Invitrogen，Burlington，安大略)用1mL 0.1M磷酸钠缓冲液pH 6.0清洗3次。将处于总体积100微升0.1M磷酸钠缓冲液pH 6.0中的100微克AR40A746.2.3加入到清洗的珠中。该混合物用立式滚筒混合温育1小时。除去未结合的抗体并用0.5mL含有0.1％吐温-20的0.1M磷酸钠pH 7.4清洗AR40A746.2.3包被的珠3次。AR40A746.2.3包被的珠用0.2M三乙醇胺pH 8.2清洗2次。通过在0.2M三乙醇胺pH 8.2中添加1mL新鲜制备的0.02M庚二亚氨酸二甲酯(dimethylpimelimidate)和使用立式滚筒混合温育30分钟，使AR40A746.2.3与珠化学交联。该反应通过用1mL 0.05M TrispH 7.5，旋转混合温育15分钟来终止。AR40A746.2.3交联的珠通过0.1M柠檬酸盐pH 3.0温育3分钟随后在含有0.1％吐温-20的0.1M PBS中清洗3次来预洗脱。以所述相同方式，使用针对苦酸的小鼠IgG1抗体(克隆1B7.11，内部纯化的)制备第二组抗体交联珠，其用作阴性IgG1同种型对照。
AR40A746.2.3交联珠通过在处于0.1M磷酸钠pH 7.4中的0.1％BSA在室温旋转混合温育30分钟来封闭。该珠用0.1M磷酸钠pH 7.4清洗3次。5毫克来自BxPC-3细胞的溶胞产物制剂使用AR40A746.2.3交联珠，在室温下旋转混合温育2小时。免疫复合物结合珠用含有0.1％Triton X-100的1mL 1mM KH2PO4，10mM Na2HPO4，137mM NaCl和2.7mM KCl清洗1次，随后用含有0.1％Triton X-100的1mL 1mM KH2PO4，10mM Na2HPO4，637mM NaCl和2.7mM KCl在立式滚筒混合条件下进行第二次清洗，随后用含有0.1％Triton X-100的1mM KH2PO4，10mM Na2HPO4，137mMNaCl和2.7mM KCl进行最后的清洗。将14微升非还原SDS-PAGE样品缓冲液加入到清洗的免疫复合物结合珠中并且将样品煮沸5分钟。除去含有解离的免疫复合物的上清并置于装有1微升2-巯基乙醇的微离心管中。IgG1同种型对照(克隆1B7.11)交联的珠用BxPC-3溶胞产物制剂温育并以与AR40A746.2.3珠相同的方式处理。
将AR40A746.2.3免疫沉淀的蛋白加载到由IgG1同种型对照(克隆1B7.11)产生的免疫沉淀物旁边的12％聚丙烯酰胺凝胶的单孔中。将MagicMark分子量标记(Invitrogen，Burlington，安大略)样品加载到参考泳道中。在150V下电泳含有免疫沉淀样品的聚丙烯酰胺凝胶约70分钟。按照制造商的说明，用胶状蓝蛋白染色(Invitrogen，Burlington，安大略)来染色该凝胶约17小时。图29中所示的是染色的凝胶的照片。在AR40A746.2.3免疫沉淀物中的约25kDa处存在条带，该条带在IgG1同种型对照免疫沉淀物中不存在。因此，利用玻璃巴斯德吸移管切下含有来自AR40A746.2.3免疫沉淀物的25kDa条带的凝胶区域，以及含有IgG1同种型对照(克隆1B7.11)免疫沉淀物的泳道中的相应区域。
2.质谱法
对切下的凝胶碎片进行胰蛋白酶消化。简言之，通过使用50％甲醇、10％乙酸进行2次搅拌清洗各30分钟，随后用50％乙腈，0.1M碳酸氢铵搅拌温育1小时，在微离心管中对该凝胶碎片进行退色和脱水。将100％乙腈加入到样品中并搅拌温育15分钟。除去所有的液体，并通过在保持微离心管盖开启的条件下在75℃温育10分钟对凝胶进行完全脱水。胰蛋白酶消化通过用10微升新鲜制备的0.01mg/mL活化的胰蛋白酶(Pierce，Rockford，IL)温育脱水的凝胶碎片15分钟，随后添加25mM碳酸氢铵来进行。样品在37℃温育约13小时。1微升各种样品(含有由胰蛋白酶消化产生的肽)应用到H4芯片(Ciphergen Biosystems，Fremont，CA)上的点上并容许干燥。将0.5微升处于0.5％三氟乙酸50％乙腈中的20％饱和α-氰基-4-羟基-肉桂酸应用到各点上2次。在PBS-IIc质谱仪(CiphergenBiosystems，Fremont，CA)上获得各样品的光谱。关于各样品获得的光谱的总结显示在图30中。视觉扫描光谱并且标记与IgG1同种型对照(克隆1B7.11)消化物相比，特异于AR40A746.2.3消化物的峰。在AR40A746.2.3免疫沉淀消化物中识别在IgG1同种型对照消化物中不存在的10个不同的峰。为了精确识别由AR40A746.2.3免疫沉淀的蛋白，对AR40A746.2.3胰蛋白酶消化物中存在的肽之一进行串联质谱法。以上述相同方式制备第二H4芯片，并利用Q-ToF串联质谱仪，通过碰撞-诱导的解离分析AR40A746.2.3消化物中存在的1570Da肽，从而产生该肽的氨基酸序列。针对Mascot肽定位数据库(Matrix Science Ltd(矩阵科学公司)，伦敦，英国)搜索关于1570Da肽确定的氨基酸序列。由该数据库重现与人CD9的高信度匹配。
3.验证抗原身份
验证CD9作为AR40A746.2.3的抗原靶标通过进行交叉免疫沉淀以确定已知的抗CD9抗体是否与由AR40A746.2.3免疫沉淀的蛋白反应来进行，反之亦然。以如上所述相同的方法，利用抗体AR40A746.2.3，IgG1同种型对照(克隆1B7.11)和抗CD9(克隆MEM-61；Abcam，Cambridge，MA)制备抗体-交联珠和免疫沉淀物。AR40A746.2.3免疫沉淀物、抗CD9(克隆MEM-61)免疫沉淀物、IgG1同种型对照(克隆1B7.11)免疫沉淀物和BxPC-3溶胞产物通过在三个复制的12％聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE分离。电泳如上所述进行。蛋白通过在40V电印迹16小时，由凝胶转移到PVDF膜(Millipore，Billerica，MA)。转移后，用处于TBST中的5％脱脂奶粉封闭2小时。用以5微克/mL的浓度稀释在处于TBST中的3％脱脂奶粉中的AR40A746.2.3，IgG1同种型对照(克隆1B7.11)或抗CD9(克隆MEM-61)探测2小时。用TBST清洗3次，每次10分钟后，用山羊抗小鼠IgG(Fc)缀合的HRT温育该膜1小时。该温育后用TBST清洗3次，每次10分钟，随后用ECL溶液温育5分钟。使该膜对底片进行曝光，并显影底片。来自交叉免疫沉淀Western印迹的结果显示在图31中。当AR40A746.2.3用作Western印迹上的初级抗体时(图A)，其与其自体免疫沉淀物，以及抗CD9(克隆MEM-61)免疫沉淀物和BxPC-3溶胞产物强烈反应。IgG1同种型对照(克隆1B7.11)免疫沉淀物中也似乎存在约25kDa的条带。然而，最可能非特异性假设其在所有泳道中均可见，包括分子量标记。当抗CD9(克隆MEM-61)用作Western印迹上的初级抗体时(图B)，其与AR40A746.2.3强烈反应，并且在其自体免疫沉淀物和BxPC-3溶胞产物中检测到约25kDa的条带。用IgG1同种型对照探测的Western印迹(克隆1B7.11；图C)在与免疫沉淀物中污染抗体片段尺寸相对应的较高分子量区域内具有反应性，而在任何样品中的25kDa区域处不存在反应性。来自交叉免疫沉淀Western印迹的结果证明AR40A746.2.3免疫沉淀的蛋白由被抗CD9抗体(克隆MEM-61)识别，且抗CD9抗体(克隆MEM-61)免疫沉淀物被AR40A746.2.3识别。
质谱识别与利用已知商购抗体的验证的组合证明AR40A746.2.3的抗原是CD9。
实施例15
AR40A746.2.3的鼠序列
1.0将可变区基因克隆到测序载体中
将编码重链和轻链可变区的基因分别克隆到商购测序载体pCR2.1(Invitrogen，Burlington，安大略)中。
1.1分离mRNA
利用绝对
Figure GPA00001027374200601
微型制备试剂盒(Absolutely
Figure GPA00001027374200602
Miniprep kit)(Stratagene，La Jolla，CA)，由一管冷冻的主细胞库(Master Cell Bank)AR40A746.2.3杂交瘤细胞分离总核糖核酸(RNA)。将RNA保存在-80℃直到需要进一步使用。
1.2RT-PCR和扩增可变区基因
进行分开的反应，以扩增轻链和重链可变区。反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)由总RNA模板合成互补脱氧核酸(cDNA)，并然后特异性扩增靶基因。
对于轻链和重链，1微克总RNA与1微升10毫摩尔脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，和0.2微升10微摩尔引物组合。轻链RT引物(Arius编号：olg-06-118；图32)用于轻链反应，且nMuIgGVh3’-2引物(Arius编号：olg-06-98，图32)用于重链反应。该混合物在65℃温育5分钟，并然后在冰上冷却1分钟。第一链cDNA反应利用SuperScript IIITM RT-PCR系统(Invitrogen，Burlington，安大略)制备。
为了扩增轻链或重链的可变区，每个PCR反应包含2微升由RT-PCR反应制备的第一链cDNA，5微升10X HI-FI PCR缓冲液(Invitrogen，Burlington，安大略)，1.0微升25微摩尔dNTPs(Bio Basic Inc.(生物基础公司)，Markham，安大略)，1微升10微摩尔正向引物，1微升10微摩反向引物，0.2微升HI-FI Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen，Burlington，安大略)和39.6微升水。
对于轻链PCR，反向引物是轻链RT引物是(Arius编号：olg-06-118；图32)或nMuIgKVL3’-1(Arius编号：olg-06-115；图32)且正向引物是nMuIgKVL5’-F3(Arius编号：olg-06-109，图32)，40A746Vk-15F(Arius编号：olg-06-219；图32)或40A746Vk-26F(Arius编号：olg-06-220；图32)引物之一。
为了扩增重链可变区，反向引物是nMuIgGVh3’-2引物(Arius编号：olg-06-98，图32)，且正向引物是nMuIgVh5’-F3(Arius编号：olg-06-95，图32)，40A746Vh-26F(Arius编号：olg-06-217；图32)或40A746Vh-8F(Arius编号：olg-06-218；图32)引物之一。
所有PCR反应在热循环器中进行这样的温育，即95℃2分钟，随后30个周期的95℃30秒，55℃2分钟和68℃1分钟，和最后68℃温育7分钟。将反应物保存在4℃直到需要。将10微升各种反应物在1.2％琼脂糖凝胶上跑电泳，并在紫外光下使用溴化乙锭显现。
来自扩增的轻链和重链反应的PCR产物利用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，Mississauga，安大略)纯化。
1.3克隆到测序载体中
利用TOPO TA
Figure GPA00001027374200621
试剂盒(Invitrogen，Burlington，安大略)，将轻链和重链纯化的PCR产物分别克隆到pCR2.1载体中。该反应包含4微升纯化的PCR产物。连接后，将3微升转化到OneMACH-1TM-T1R大肠杆菌(E.coli)(Invitrogen，Burlington，安大略)中。将50微升转化的细胞置于预暖的Lennox L培养液(LB)琼脂(Sigma，Oakville，安大略)板上，其中含有50微克/mL氨苄青霉素(Sigma，Oakville，安大略)和40微升处于N，N-二甲基甲酰胺(Caledon Laboratories(Caledon实验室)，Georgetown，安大略)中的40mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-半乳糖，Caledon Laboratories(Caledon实验室)，Georgetown，安大略)。将该板倒置并在37℃温育过夜。
来自每个转化板的四个或更多具有重组DNA的单一白色菌落用于在37℃，摇动接种4毫升含有50微克/毫升氨苄青霉素的LB培养液的培养物过夜。利用QIApre旋转微型制备试剂盒(QIAprep Spin Microprep kit)(QIAGEN，Mississauga，安大略)由这些过夜培养物中分离质粒。具有轻链(MBPP 953，954，956，960，961，963，965-973)或重链(MBPP 991-1002)插入物的质粒在Quintara(Berkeley，CA，美国)测序。测序数据利用载体NTI软件(Invitrogen，Burlington，安大略)分析，以获得DNA和蛋白序列。轻链和重链蛋白序列分别以SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：7给出(图31)。CDR区和序列编号按照Kabat给出。
实施例16
分离竞争性结合剂
给定抗体，本领域普通技术人员可以产生竞争性抑制CDMAB，例如竞争性抗体，其是一种识别相同表位的抗体(Belanger L等.Clinica ChimicaActa 48：15-18(1973))。一种方法需要(entails)用这样的免疫原进行免疫，所述免疫原表达被所述抗体识别的抗原。样品可以包括，但不限于，组织、分离的蛋白或细胞系。得到的杂交瘤可以使用竞争测定进行筛选，所述竞争测定是一种鉴定抑制测试抗体结合的抗体的测定，诸如ELISA，FACS或蛋白质印迹。另一种方法可以使用噬菌体展示抗体文库，和淘选(panning)识别所述抗原的至少一个表位的抗体(Rubinstein JL等年度生物化学(Anal Biochem)314：294-300(2003))。在每种情形中，基于抗体置换初始标记抗体与其靶抗原的至少一个表位的结合的能力，选择抗体。因此，这样的抗体将如初始抗体一样具有识别抗原的至少一个表位的特征。
实施例17
克隆AR40A746.2.3单克隆抗体的可变区
确定了来自由AR40A746.2.3杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)的可变区序列(如实施例14中所公开)。为了生成嵌合和人源化IgG，可以将可变轻链和可变重链结构域亚克隆到合适的载体中表达。
在另一个实施方案中，AR40A746.2.3或其去免疫的、嵌合的或人源化的形式通过在转基因动物中表达编码所述抗体的核酸产生，从而表达并可以回收抗体。例如，抗体可以以促进回收和纯化的组织特异性方式表达。在一个该实施方案中，本发明的抗体表达在乳腺中，从而在哺乳期过程中分泌。转基因动物包括但不仅限于小鼠、山羊和兔。
(i)单克隆抗体
使用常规方法容易地分离并测序编码单克隆抗体的DNA(例如，通过使用能够特异性结合编码所述单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞作为这样的DNA的优选来源。一旦分离，所述DNA可以置于表达载体内，然后将其转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞中，如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞中，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。也可以修饰所述DNA，例如，通过人重链和轻链恒定结构域编码序列取代替换同源鼠序列。也可以使用合成蛋白质化学中的已知方法，包括涉及交联剂的那些方法，体外制备嵌合抗体或杂交抗体。例如，可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键构建免疫毒素。用于这一目的的适当试剂的实例包括亚氨基硫羟酸盐(iminothiolate)和甲基-4-巯基butyrimidate。
(ii)人源化抗体
人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“引入”的残基，其典型地来自“引入的”可变结构域。可以通过利用Winter及合作者的方法用啮齿类CDRs或CDR序列取代相对应的人抗体序列进行人源化(Jones等，自然(Nature)321：522-525(1986)；Riechmann等，自然(Nature)332：323-327(1988)；Verhoeyen等，科学(Science)239：1534-1536(1988)；在Clark，今日免疫学(Immunol.Today)21：397-402(2000)中的综述)。
可以通过使用母体和人源化序列的三维模型分析母体序列和多种概念人源化产物的方法而制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是本领域技术人员可获得的和熟悉的。图解和展示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。这些展示的观察允许分析残基在所述候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以这种方式，可以从共有和引入序列中选择FR残基且组合FR残基，以便获得需要的抗体特征，如对靶抗原增加的亲和性。通常，CDR残基直接且最显著地(most substantially)参与影响抗原结合。
(iii)抗体片段
已经开发了生产抗体片段的各种技术。这些片段可以通过重组宿主细胞产生(参考综述于Hudson，现代免疫学观点(Curr.Opin.Immunol.)11：548-557(1999)；Little等，今日免疫学(Immunol.Today)21：364-370(2000))。例如，Fab’-SH片段可以直接从大肠杆菌回收，并且化学偶联以形成F(ab’)2片段(Carter等，生物技术(Biotechnology)10：163-167(1992))。在另一个实施方案中，使用亮氨酸拉链GCN4促进F(ab’)2分子的组装而形成F(ab’)2。根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物分离Fv，Fab或F(ab’)2片段。
实施例18
胞内激酶蛋白质组Profiler印迹
为了确定受AR40A746.2.3处理影响的胞内信号传导分子，利用蛋白质组profiler人磷酸-MAPK抗体阵列(ARY002，R&D Systems Inc.(R&D系统公司)，Minneapolis，MN)对来自用AR40A746.2.3处理的细胞的溶胞产物进行筛选。
处理和制备细胞
以前的工作利用在重度联合(severe combined)免疫缺损小鼠(SCID)中生长的BxPC-3细胞，证明了AR40A746.2.3在胰腺癌异种移植模型中的体内功效。因此，对胞内信号传导分子活性的筛选利用BxPC-3细胞系进行。BxPC-3细胞生长至接近汇合，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，并然后在血清和增补剂-缺乏的培养基中37℃饥饿过夜。此后，将AR40A746.2.3(20微克/ml)或1B7.11(IgG1)(20微克/ml)加入到细胞中并容许在4℃结合20分钟。然后通过向细胞中加入胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠以提供10％FBS，1％L-谷氨酰胺，和1％丙酮酸钠的最终浓度来刺激细胞。将细胞置于37℃温育器中并在刺激后1小时收集细胞溶胞产物。通过用PBS清洗细胞2次和在溶胞缓冲液6(Part no.895561：R&D系统抗体阵列ARY002)中收获来收集溶胞产物。通过吸移管吹吸重新混悬细胞，将其转移到1.5ml微量离心管中并通过涡旋在4℃混合30分钟。然后以14000xg离心溶胞产物5分钟，并将上清液转移到干净的管中。蛋白质浓度通过二辛可宁酸(BCA)蛋白测定(Pierce，Rockford，IL)确定。
人磷酸-MAPK抗体阵列
人磷酸-MAPK抗体阵列按照制造商所述的流程，针对BxPC-3细胞溶胞产物筛选(第4修订版，2006年5月，R&D系统抗体阵列ARY002)。简言之，每种人磷酸-MAPK profiler膜通过在1.5ml阵列缓冲液1(Part no.895477：R&D系统抗体阵列ARY002)中，在摇动平台摇动器中温育1小时制备。对于每种处理，200微克总蛋白用溶胞缓冲液6稀释以提供250微升的总体积并与1.25ml阵列缓冲液1混合。将该混合物加入到制备的profiler膜中，并在摇动平台摇动器中4℃温育过夜。然后在1X清洗缓冲液(由25X储液(Part no.895003：R&D系统抗体阵列ARY002)在纯化蒸馏水中稀释)中清洗每个膜三次并与在1X阵列缓冲液2/3(5X阵列缓冲液2，Part no.895478：R&D系统抗体阵列ARY002；阵列缓冲液3，Part no.895008：R&D系统抗体阵列ARY002)中制备的1.5mL抗磷酸-MAPK检测抗体混合物(含有生物素化的磷酸特异性抗体)(Part no.893051：R&D系统抗体阵列ARY002)一起温育2小时。该膜在1X清洗缓冲液中清洗3次，并用以1∶2000稀释在1X阵列缓冲液2/3中的1.5ml链霉抗生物素蛋白-HRP(Part no.890803：R&D系统抗体阵列ARY002)温育30分钟。在1X清洗缓冲液中清洗膜三次，并使其暴露于ECL+Western检测试剂(GEHealthcare(GE卫生保健)，Life Sciences(生命科学)，Piscataway，NJ)，以显影。膜暴露于化学发光胶片(Kodak(柯达)，Cedex，France)并利用X-射线医学处理器显影。显影的X-射线胶片上的磷酸-MAPK阵列数据通过在发送模式扫描仪上扫描胶片和利用图像J分析软件(Image J 1.37v，NIH)分析阵列图像文件而量化。对于每种激酶，利用膜上透明区域的像素密度计算关于相应复制点的平均像素密度，并从背景信号中减去。对于各相应磷酸-蛋白靶标，AR40A746.2.3处理样品的平均标准化像素密度除以1B7.11处理样品的平均标准化像素密度，以获得相对变化比。磷酸-蛋白信号的减少百分比通过由1减去相对变化比并乘以100确定。
来自磷酸-MAPK阵列膜的显示使用AR40A746.2.3点强度％减少变化的结果显示在图34中。与1B7.11相比，AR40A746.2.3抑制受到血清和增补剂刺激的BxPC-3细胞中的90kDa核糖体S6激酶(Rsk)(46.2％)，糖原合酶激酶3α/β(Gsk3α/β(20.6％)；Gsk3β(51.0％))，Akt/蛋白激酶B(PKB)(总Akt(pan Akt(21.6％)，Akt1/PKBα(17.1％)，Akt2/PKBβ(43.9％)和Akt3/PKBγ(49.0％))和热激蛋白(HSP)27(49.4％)的磷酸化。这些激酶参与可以影响细胞增殖、生长和存活的胞内信号传导途径。AR40A746.2.3在受到血清和增补剂刺激时，可以减少这些激酶的磷酸化，这提示AR40A746.2.3可以通过这些激酶及其相关胞内信号传导途径阻断细胞生长和存活。因此，该数据提供针对理解AR40A746.2.3通过胞内信号传导作用的机制和识别用于测量AR40A746.2.3活性和用于患者选择的新标记物或指示剂的潜在指导。
实施例19
受体酪氨酸激酶蛋白质组Profiler印迹
为了确定受AR40A746.2.3处理影响的胞内信号传导分子，利用蛋白质组profiler人磷酸-RTK抗体阵列(ARY001，R&D Systems Inc.(R&D系统公司)，Minneapolis，MN)对来自用AR40A746.2.3处理的细胞的溶胞产物进行筛选。
处理和制备细胞
以前的工作利用在重度联合免疫缺损小鼠(SCID)中生长的BxPC-3细胞，证明了AR40A746.2.3在胰腺癌异种移植模型中的体内功效。因此，对胞内信号传导分子活性的筛选利用BxPC-3细胞系进行。BxPC-3细胞生长至接近汇合，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，并然后在血清和增补剂-缺乏的培养基中37℃饥饿过夜。此后，将AR40A746.2.3(20微克/mL)或1B7.11(IgG1)(20微克/mL)加入到细胞中并容许在4℃结合20分钟。然后通过向细胞中加入胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠以提供10％FBS，1％L-谷氨酰胺，和1％丙酮酸钠的最终浓度来刺激细胞。将细胞置于37℃温育器中并在刺激后15分钟收集细胞溶胞产物。通过用PBS清洗细胞2次和在NP-40溶胞缓冲液(1％NP-40，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，137mM NaCl，10％甘油，2mM EDTA，1mM原钒酸钠，10微克/mL牛胰蛋白酶抑制剂，10微克/mL抑酶醛肽)中收获来收集溶胞产物。通过吸移管吹吸重新混悬细胞，将其转移到1.5mL微量离心管中并通过涡旋在4℃混合30分钟。然后以14000xg离心溶胞产物5分钟，并将上清液转移到干净的管中。蛋白质浓度通过二辛可宁酸(BCA)蛋白测定(Pierce，Rockford，IL)确定。
人磷酸-RTK抗体阵列
人磷酸-RTK抗体阵列按照制造商所述的流程(R&D系统抗体阵列ARY001)，针对BxPC-3细胞溶胞产物筛选。简言之，每种人磷酸-RTKprofiler膜通过在1.5mL阵列缓冲液1(Part no.895477：R&D系统抗体阵列ARY001)中，在摇动平台摇动器中温育1小时制备。对于每种处理，含有200微克总蛋白的体积用阵列缓冲液1稀释到1.5ml。将该混合物加入到制备的profiler膜中，并在摇动平台摇动器中4℃温育过夜。然后在1X清洗缓冲液(由25X储液(Part no.895003：R&D系统抗体阵列ARY001)在纯化蒸馏水中稀释)中清洗每个膜三次并与在1X阵列缓冲液2(5X阵列缓冲液2，Part no.895478：R&D系统抗体阵列ARY001)中制备的1.5mL抗磷酸酪氨酸-HRP检测抗体(Part no.841403：R&D系统抗体阵列ARY001)一起温育2小时。在1X清洗缓冲液中清洗膜三次，并使其暴露于ECL+Western检测试剂(GE Healthcare(GE卫生保健)，Life Sciences(生命科学)，Piscataway，NJ)，以显影。膜暴露于化学发光胶片(Kodak(柯达)，Cedex，France)并利用X-射线医学处理器显影。显影的X-射线胶片上的磷酸-RTK阵列数据通过在发送模式扫描仪上扫描胶片和利用图像J分析软件(ImageJ 1.37v，NIH)分析阵列图像文件而量化。对于每种RTK，利用膜上透明区域的像素密度计算关于相应复制点的平均像素密度，并从背景信号中减去。对于各相应磷酸-蛋白靶标，AR40A746.2.3处理样品的平均标准化像素密度除以1B7.11处理样品的平均标准化像素密度，以获得相对变化比。磷酸-蛋白信号的减少百分比通过由1减去相对变化比并乘以100确定。
来自磷酸-RTK阵列膜的显示使用AR40A746.2.3点强度％减少变化的结果显示在图35中。与1B7.11相比，AR40A746.2.3抑制受到血清和增补剂刺激的BxPC-3细胞之间中的ErbB3(HER3)(28.3％)，ErbB4(HER4)(77.0％)，成纤维细胞生长因子(FGF)受体1和3(FGF R1(59.5％)，FGF R3(84.7％))，肝细胞生长因子(HGF)受体(MSP R)(39.5％)，血小板来源的生长因子(PDGF)受体(Flt 3)(94.4％)，c-RET(54.8％)，Tie2/Tek(71.6％)和血管内皮生长因子(VEGF)受体3(VEGF R3)(53.7％)的磷酸化。而且，使用AR40A746.2.3处理相对于单独使用同种型处理增加TrkA(31.6％)的磷酸化。这些激酶参与可以影响细胞增殖、生长和存活的胞内信号传导途径。AR40A746.2.3在受到血清和增补剂刺激时，可以影响这些RTK的磷酸化，这提示AR40A746.2.3可以通过这些RTK及其相关胞内信号传导途径影响细胞的生长和存活。因此，该数据提供针对理解AR40A746.2.3通过胞内信号传导作用的机制和识别用于测量AR40A746.2.3活性和用于患者选择的新标记物或指示剂的潜在指导。
实施例20
膜联蛋白-V染色用mAR40A746.2.3处理过的BxPC-3细胞
进行膜联蛋白-V染色，以确定鼠抗体AR40A746.2.3是否能够在BxPC-3人胰腺癌细胞系上诱导凋亡。用0.2，2和20微克/mL的AR40A746.2.3处理BxPC-3细胞24和40小时。各种抗体浓度连同以相同浓度测试的合适同种型对照(1B7.11，抗TNP，鼠IgG1，κ，内部生产)一起重复测试三次。包括未处理的样品作为阴性对照和包括喜树碱(Biovision；Exton，PA)作为阳性对照。利用荧光珠补偿FACS仪以获得荧光缀合物的视觉溢出(BD Bioscience(BD生物科学)，Oakville，ON)。然后用膜联蛋白-V和7AAD染色细胞并在1小时内在FACS阵列上捕获。发现用同种型对照处理的细胞的自发凋亡作用与仅用载体处理的细胞相似。发现鼠AR40A746.2.3抗体在每个实验中，在胰腺癌细胞系中以剂量依赖性方式诱导凋亡，在浓度20μg/mL时观察到较大的凋亡作用，其中获得61.3％总凋亡细胞对比在用同种型对照处理的细胞中获得的36.1％(图36)。
实施例21
包括本发明的抗体的组合物
本发明抗体可以用作预防/治疗癌症的组合物。所述包括本发明抗体的用于预防/治疗癌症的组合物可以作为它们采用液体制剂的形式施用，或作为适用于人或哺乳动物(例如，大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、犬、猿猴、等等)的制剂的药物组合物口服或肠胃外(例如，静脉内、腹膜内、皮下、等等)施用。本发明抗体可以以本身施用，或可以作为适当的组合物施用。用于所述施用的组合物可以包含药用载体，和本发明抗体或其盐，稀释剂或赋形剂。这样的组合物以适于口服或肠胃外施用的药物制剂的形式提供。
用于肠胃外施用的组合物的实例是可注射制剂、栓剂等。可注射制剂可以包括这样的剂型，诸如静脉内、皮下、皮内和肌内注射，滴注，关节内注射等等。这些可注射制剂可以通过公知方法制备。例如，可注射制剂可以通过将本发明抗体或其盐溶解、混悬或乳化在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中而制备。对于水性注射介质，存在如生理盐水，含有葡萄糖和其他辅助试剂的等渗溶液等，其可以与适当的增溶剂如醇(例如乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂(例如，聚山梨酸酯80，HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mols)加合物))等组合使用。对于油性介质，使用例如芝麻油、大豆油等，其可以与增溶剂如苯甲酸苄酯、苯甲醇等组合使用。这样制备的注射剂通常装在适当的安瓿中。用于直肠施用的栓剂可以通过将本发明抗体或其盐与常规用于栓剂的基质混合而制备。用于口服施用的组合物包括固体或液体制剂，具体为片剂(包括糖衣和薄膜包被的片剂)，丸剂、粒剂、粉末制剂、胶囊(包括软胶囊)、糖浆、乳液、混悬液等。这样的组合物通过公知方法制备，并且可以包含常规用在药物制剂领域中的媒介物赋形剂(vehicle)、稀释剂或赋形剂(excipient)。用于片剂的赋形剂媒介物(vehicle)或赋形剂(excipient)的实例包括乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁等。
有利地，将上述用于口服或肠胃外应用的组合物制备成适于符合活性成分剂量的单位剂量的药物制剂。所述单位剂量制剂包括，例如，片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂、等等。所包含的前述化合物的量通常为5-500mg/剂量单位形式；优选地特别是在注射液形式中含有约5-约100mg的上述抗体，并且对于其他形式含有10-250mg的上述抗体。
前述包括本发明抗体的预防性/治疗性药剂或调节剂的剂量可以取决于下列各项而不同：被施用的受试者，目的疾病，病症，施用途径等等。例如，当用于治疗/预防目的时，例如，治疗/预防成年人中的乳腺癌时，有利地以约0.01-约20mg/kg体重、优选地约0.1-约10mg/kg体重且更优选地约0.1-约5mg/kg体重的剂量静脉内施用本发明的抗体，约1-5次/天，优选约1-3次/天。在其他肠胃外和口服施用中，所述药剂可以以与上述剂量相对应的剂量施用。当病症特别严重时，可以依据病症增加剂量。
本发明抗体可以以其自身或以适当组合物的形式施用。用于施用的组合物可以包含药用载体与前述抗体或其盐，稀释剂或赋形剂。这样的组合物以适于口服或肠胃外施用(例如，血管内注射、皮下注射等)的药物制剂的形式提供。上述每种组合物还可以包含其他活性成分。此外，本发明抗体可以与其他药剂联合使用，所述其他药剂例如烷基化试剂(例如，环磷酰胺，异环磷酰胺(ifosfamide)，等)，代谢拮抗剂(例如，甲氨喋呤，5-氟尿嘧啶，等)，抗肿瘤抗生素(例如，丝裂霉素，阿霉素，等)，植物来源的抗肿瘤药(例如，长春新碱，长春地辛，泰素，等)，顺铂，卡铂，依托泊苷，伊立替康，等。本发明抗体和上述药物可以同时或以交错的次数施用给患者。
本文中所述的治疗方法，特别是对于癌症的，也可以利用同施用其他抗体或化疗剂进行。例如，也可以施用针对EGFR的抗体，诸如
Figure GPA00001027374200711
(西妥昔单抗(cetuximab))，特别是当治疗结肠癌时。
Figure GPA00001027374200712
还显示出有效治疗银屑病。其他组合使用的抗体包括
Figure GPA00001027374200713
(曲妥单抗)(特别是当治疗乳腺癌时)，
Figure GPA00001027374200714
(特别是当治疗结肠癌时)，和SGN-15(特别是当治疗非-小细胞肺癌时)。施用本发明的抗体和其他抗体/化疗剂可以同时，或者分别，通过相同或不同的途径进行。
使用的化疗剂/其他抗体方案包括认为最佳适合于治疗患者病症的任何方案。不同的恶性肿瘤可以需要使用特异性抗-肿瘤抗体和特异性化疗剂，所述特异性抗-肿瘤抗体和特异性化疗剂应该基于具体患者确定。在本发明的优选实施方案中，化学治疗与抗体治疗同时，或更优选地，化学治疗在抗体治疗后施用。然而，应该强调的是，本发明不局限于任何具体的施药方法或途径。
证据的优势表明AR40A746.2.3通过与CD9上存在的表位连接而介导抗癌作用和延长存活。已经显示(如实施例13中公开地)AR40A746.2.3抗体可以用于从表达细胞诸如BxPC-3细胞免疫沉淀关联抗原。此外，可以表明，AR40A746.2.3、嵌合AR40A746.2.3或人源化变体可以用于检测表达与其特异性结合的CD9抗原部分的细胞和/或组织；这使用所举例说明的但不限于FACS、细胞ELISA或IHC的技术。
如用AR40A746.2.3抗体，其他抗CD9抗体可以用于免疫沉淀和分离CD9抗原的其他形式，且抗原也可以用于利用相同类型的测定抑制那些抗体与表达该抗原的细胞或组织的结合。
本说明书中提及的所有专利和出版物象征本发明所属领域技术人员的水平。所有的专利和出版物通过引用结合于此，以如同每篇单独的出版物通过引用特别且独立地指明结合的相同程度结合。
应该理解，尽管示例了本发明的某些形式，但是不限于本文所述和所示的部分的特定形式或安排。对于本领域技术人员来说，在不背离本发明的范围的条件下可以进行各种变化，并且本发明不应该被视为限于在本说明书中所示和所述的内容，这是显而易见的。
本领域技术人员应该容易地理解本发明充分适合实施所述目标并且获得所提及的目的和益处以及其中固有的那些。本发明所述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物相关的化合物、方法、步骤和技术代表目前的优选实施方案，意欲是示例性的，并且不意欲作为对范围的限制。本领域技术人员可以实施其中的变化和其他应用，所述变化和其他应用包括在本发明的精神内，并且由后附的权利要求的范围限定。尽管已经联合特定优选实施方案对本发明进行了描述，但是应该理解所要求的本发明不应该不适当地限于所述特定实施方案。实际上，对于本领域技术人员是明显的实施本发明的所述模式的各种改进意欲被包括在后附权利要求的范围内。
Figure GPA00001027374200741

Claims (63)

1.由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤生产的分离的单克隆抗体。
2.由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤生产的分离的单克隆抗体的人源化抗体，或由所述人源化抗体产生的抗原结合片段。
3.由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤生产的分离的单克隆抗体的嵌合抗体，或由所述嵌合抗体产生的抗原结合片段。
4.以保藏号141204-01保藏在IDAC的分离的杂交瘤细胞系。
5.在选自人前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤的组织样品中起始抗体诱导的癌细胞细胞毒性的方法，所述方法包括：
提供来自所述人前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤的组织样品；
提供由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤生产的分离的单克隆抗体，由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤生产的分离的单克隆抗体的人源化抗体，由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤生产的分离的单克隆抗体的嵌合抗体，或其CDMAB，所述CDMAB特征在于竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力；和
使所述分离的单克隆抗体、所述人源化抗体、所述嵌合抗体或其CDMAB与所述组织样品接触；
其中所述分离的单克隆抗体、所述人源化抗体、所述嵌合抗体或其CDMAB与所述组织样品的结合诱导细胞毒性。
6.权利要求1的分离的单克隆抗体的CDMAB。
7.权利要求2的人源化抗体的CDMAB。
8.权利要求3的嵌合抗体的CDMAB。
9.权利要求1、2、3、6、7或8中任一项的分离的抗体或其CDMAB，所述分离的抗体或其CDMAB与选自由下列各项组成的组中的成员缀合：细胞毒性部分、酶、放射性化合物、和造血细胞。
体内乳腺和胰腺(体外前列腺)
10.在哺乳动物中减少人前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤的方法，其中所述人前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤表达抗原的至少一个表位，所述抗原特异性结合由以保藏号141204-01保藏在IDAC的克隆编码的分离的单克隆抗体或其CDMAB，所述CDMAB特征在于竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述方法包括对所述哺乳动物以有效导致所述哺乳动物前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤负荷减小的量施用所述单克隆抗体或其CDMAB。
11.权利要求10的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细胞毒性部分缀合。
12.权利要求11的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
13.权利要求10的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB激活补体。
14.权利要求10的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB介导抗体依赖性细胞毒作用。
15.权利要求10的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体或由所述人源化抗体产生的抗原结合片段。
16.权利要求10的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体或由所述嵌合抗体产生的抗原结合片段。
17.在哺乳动物中减少易受抗体诱导的细胞毒性影响的人前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤的方法，其中所述人前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤表达特异性结合由以保藏号141204-01保藏在IDAC的克隆编码的分离的单克隆抗体或其CDMAB的抗原的至少一个表位，所述CDMAB特征在于竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述方法包括对所述哺乳动物以有效导致所述哺乳动物前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤负荷减小的量施用所述单克隆抗体或其所述CDMAB。
18.权利要求17的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细胞毒性部分缀合。
19.权利要求18的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
20.权利要求17的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB激活补体。
21.权利要求17的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB介导抗体依赖性细胞毒作用。
22.权利要求17的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体或由所述人源化抗体产生的抗原结合片段。
23.权利要求17的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体或由所述嵌合抗体产生的抗原结合片段。
24.在哺乳动物中减少人前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤的方法，其中所述人前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤表达特异性结合由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤生产的分离的单克隆抗体或其CDMAB的抗原的至少一个表位，所述CDMAB特征在于竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述方法包括对所述哺乳动物以有效导致所述哺乳动物前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤负荷减小的量施用与至少一种化疗剂联合的所述单克隆抗体或其CDMAB。
25.权利要求24的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细胞毒性部分缀合。
26.权利要求25的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
27.权利要求24的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB激活补体。
28.权利要求24的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB介导抗体依赖性细胞毒作用。
29.权利要求24的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体或由所述人源化抗体产生的抗原结合片段。
30.权利要求24的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体或由所述嵌合抗体产生的抗原结合片段。
31.单克隆抗体用于减小人前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤负荷的应用，其中所述人前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤表达特异性结合由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生分离的单克隆抗体或其CDMAB的抗原的至少一个表位，所述CDMAB的特征在于竞争抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述应用包括向所述哺乳动物以有效导致所述哺乳动物的人前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤负荷减小的量施用所述单克隆抗体或其CDMAB。
32.权利要求31的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细胞毒性部分缀合。
33.权利要求32的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
34.权利要求31的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB激活补体。
35.权利要求31的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB介导抗体依赖性细胞毒作用。
36.权利要求31的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体。
37.权利要求31的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体。
38.单克隆抗体用于减小人前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤负荷的应用，其中所述人前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤表达特异性结合由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生分离的单克隆抗体或其CDMAB的抗原的至少一个表位，所述CDMAB的特征在于竞争抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述应用包括向所述哺乳动物以有效导致所述哺乳动物的人前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤负荷减小的量施用与所述单克隆抗体或其CDMAB以及至少一种化疗剂。
39.权利要求38的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细胞毒性部分缀合。
40.权利要求39的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
41.权利要求38的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB激活补体。
42.权利要求38的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB介导抗体依赖性细胞毒作用。
43.权利要求38的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体。
44.权利要求38的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体。
45.减轻人前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤的方法，所述肿瘤表达与由具有IDAC保藏号141204-01的杂交瘤细胞系AR40A746.2.3产生的分离的单克隆抗体特异性结合的人CD9抗原的至少一个表位，所述方法包括：
向患有所述人肿瘤的个体施用至少一种分离的单克隆抗体或其CDMAB，所述分离的单克隆抗体或其CDMAB结合与由具有IDAC保藏号141204-01的杂交瘤细胞系AR40A746.2.3产生的分离的单克隆抗体结合的表位相同的一种或多种表位；
其中所述一种或多种表位的结合导致前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤负荷的减小。
46.减轻人前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤的方法，所述肿瘤表达与由具有IDAC保藏号141204-01的杂交瘤细胞系AR40A746.2.3产生的分离的单克隆抗体特异性结合的人CD9抗原的至少一个表位，所述方法包括：
向患有所述人肿瘤的个体施用至少一种分离的单克隆抗体或其CDMAB，以及至少一种化疗剂，所述分离的单克隆抗体或其CDMAB结合与由具有IDAC保藏号141204-01的杂交瘤细胞系AR40A746.2.3产生的分离的单克隆抗体结合的表位相同的一种或多种表位；
其中所述施用导致前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤负荷的减小。
FACS和IHC
47.确定选自人肿瘤的组织样品中癌细胞的存在的结合测定，所述人组织样品被由具有IDAC保藏号141204-01的杂交瘤细胞系AR40A746.2.3产生的分离的单克隆抗体、由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体或由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体特异性结合，所述结合测定包括：
提供来自所述人肿瘤的组织样品；
提供所述分离的单克隆抗体、所述人源化抗体、所述嵌合抗体或其CDMAB中的至少一种，其识别与由具有IDAC保藏号141204-01的杂交瘤细胞系AR40A746.2.3产生的分离的单克隆抗体识别的表位相同的一种或多种表位；
使至少一种所述提供的抗体或其CDMAB与所述组织样品相接触；并确定所述至少一种提供的抗体或其CDMAB与所述组织样品的结合；
由此指示所述癌细胞在所述组织样品中的存在。
48.确定表达CD9的细胞的存在的结合测定，所述CD9被由具有IDAC保藏号141204-01的杂交瘤细胞系AR40A746.2.3产生的分离的单克隆抗体、由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体或由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体特异性识别，所述结合测定包括：
提供细胞样品；
提供由具有IDAC保藏号141204-01的杂交瘤细胞系AR40A746.2.3产生的分离的单克隆抗体，所述人源化抗体，所述嵌合抗体或其CDMAB
使所述分离的单克隆抗体或所述抗原结合片段与所述细胞样品相接触；和
确定所述分离的单克隆抗体或其CDMAB与所述细胞样品的结合；
由此确定表达CD9的抗原的细胞的存在，所述CD9被所述分离的单克隆抗体或所述其CDMAB特异性结合。
49.确定表达CD9的灵长类动物细胞的存在的结合测定，所述CD9被由具有IDAC保藏号141204-01的杂交瘤细胞系AR40A746.2.3产生的分离的单克隆抗体、由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体或由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体特异性识别，所述结合测定包括：
提供灵长类动物细胞样品；
提供由具有IDAC保藏号141204-01的杂交瘤细胞系AR40A746.2.3产生的分离的单克隆抗体，所述人源化抗体，所述嵌合抗体或其CDMAB；
使所述分离的单克隆抗体或所述抗原结合片段与所述灵长类动物细胞样品相接触；和
确定所述分离的单克隆抗体或其CDMAB与所述灵长类动物细胞样品的结合；
由此确定表达CD9的抗原的灵长类动物细胞的存在，所述CD9被所述分离的单克隆抗体或所述其CDMAB特异性结合。
50.确定表达CD9的兔细胞的存在的结合测定，所述CD9被由具有IDAC保藏号141204-01的杂交瘤细胞系AR40A746.2.3产生的分离的单克隆抗体、由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体或由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体特异性识别，所述结合测定包括：
提供兔细胞样品；
提供由具有IDAC保藏号141204-01的杂交瘤细胞系AR40A746.2.3产生的分离的单克隆抗体，所述人源化抗体，所述嵌合抗体或其CDMAB；
使所述分离的单克隆抗体或所述抗原结合片段与所述兔细胞样品相接触；和
确定所述分离的单克隆抗体或其CDMAB与所述兔细胞样品的结合；
由此确定表达CD9的抗原的兔细胞的存在，所述CD9被所述分离的单克隆抗体或所述其CDMBA特异性结合。
表位序列-尚未确定
51.一种单克隆抗体，其特异性结合与由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体相同的一种或多种表位。
52.一种分离的单克隆抗体或其CDMAB，其特异性结合人CD9，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB与人CD9的一种或多种表位反应，所述表位与由具有IDAC保藏号141204-01的杂交瘤细胞系AR40A746.2.3产生的分离的单克隆抗体的表位相同；所述分离的单克隆抗体或其CDMAB的特征在于竞争抑制所述分离的单克隆抗体与其靶人CD9抗原结合的能力。
53.一种分离的单克隆抗体或其CDMAB，其识别与由具有IDAC保藏号141204-01的杂交瘤细胞系AR40A746.2.3产生的分离的单克隆抗体识别的表位相同的一种或多种表位；所述单克隆抗体或其CDMAB的特征在于竞争抑制所述分离的单克隆抗体与其一种或多种靶表位结合的能力。
CDR序列
54.一种单克隆抗体，其特异性结合人CD9的一种或多种表位，所述表位与由具有IDAC保藏号141204-01的杂交瘤细胞系AR40A746.2.3产生的分离的单克隆抗体的表位相同，所述单克隆抗体包括：
包括互补决定区氨基酸序列SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，和SEQ IDNO：3的重链可变区；和包含互补决定区氨基酸序列SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：5，或SEQ ID NO：6的轻链可变区；
或其人CD9结合片段。
55.一种单克隆抗体，其特异性结合人CD9的一种或多种表位，所述表位与由具有IDAC保藏号141204-01的杂交瘤细胞系AR40A746.2.3产生的分离的单克隆抗体的表位相同，所述单克隆抗体包括：
包括互补决定区氨基酸序列SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，和SEQ IDNO：3的重链可变区；和包含互补决定区氨基酸序列SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：5，或SEQ ID NO：6的轻链可变区；和来自人抗体或人抗体共有构架的重链和轻链的可变结构域构架区；
或其人CD9结合片段。
56.特异性结合人CD9的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括SEQID NO：7的重链可变区氨基酸序列；和选自SEQ ID NO：8的轻链可变区氨基酸序列；
或其人CD9结合片段。
57.一种人源化抗体，其特异性结合人CD9的一种或多种表位，所述表位与由具有IDAC保藏号141204-01的杂交瘤细胞系AR40A746.2.3产生的分离的单克隆抗体的表位相同，所述人源化抗体包括：
包括互补决定区氨基酸序列SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，和SEQ IDNO：3的重链可变区；和包含互补决定区氨基酸序列SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：5，或SEQ ID NO：6的轻链可变区；
或其人CD9结合片段。
58.一种人源化抗体，其特异性结合人CD9的一种或多种表位，所述表位与由具有IDAC保藏号141204-01的杂交瘤细胞系AR40A746.2.3产生的分离的单克隆抗体的表位相同，所述人源化抗体包括：
包括互补决定区氨基酸序列SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，和SEQ IDNO：3的重链可变区；和包含互补决定区氨基酸序列SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：5，或SEQ ID NO：6的轻链可变区；和来自人抗体或人抗体共有构架的重链和轻链的可变结构域构架区；
或其人CD9结合片段。
59.特异性结合人CD9的人源化抗体，其中所述单克隆抗体包括SEQ
ID NO：7的重链可变区氨基酸序列；和选自SEQ ID NO：8的轻链可变区氨基酸序列；
或其人CD9结合片段。
组合物
60.有效治疗人胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、卵巢肿瘤、乳腺肿瘤或结肠肿瘤的组合物，包括处于组合形式的：
权利要求1，2，3，6，7，8，17，49，50，54，55，或56中任一项的抗体或CDMAB；
所述抗体或其抗原结合片段与选自由细胞毒性部分、酶、放射性化合物、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分和造血细胞组成的组中的成员的缀合物；和
需要量的药用载体；
其中所述组合物有效治疗所述人前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤。
61.有效治疗人前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤的组合物，包括处于组合形式的：
权利要求1，2，3，6，7，8，17，49，50，54，55，或56中任一项的抗体或CDMAB；和需要量的药用载体；
其中所述组合物有效治疗所述人前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤。
62.有效治疗人前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤的组合物，包括处于组合形式的：
权利要求1，2，3，6，7，8，17，49，50，54，55或56中任一项的抗体、抗原结合片段、或CDMAB与选自由细胞毒性部分、酶、放射性化合物、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分和造血细胞组成的组中的成员的缀合物；和
需要量的药用载体；
其中所述组合物有效治疗所述人前列腺肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤。
测试试剂盒
63.用于检测人癌性肿瘤存在的测试试剂盒，其中所述人癌性肿瘤表达特异性结合分离的单克隆抗体或其CDMAB的抗原的至少一种表位，所述分离的单克隆抗体由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生，所述CDMAB的特征在于竞争抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述试剂盒包括所述由以保藏号141204-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMAB，和用于检测所述单克隆抗体或其CDMAB是否结合多肽的工具，所述多肽以特定截断水平的存在诊断所述人癌性肿瘤的存在。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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