CN101490247A - 癌性疾病调节抗体141205-02 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用新型筛选模式制备癌性疾病调节抗体的方法。所述方法利用癌细胞细胞毒性作用作为指标来分离抗癌抗体，使制备用于治疗和诊断目的的抗癌抗体成为可能。所述抗体可以用于辅助肿瘤分期和诊断，并且可以用于治疗原发性肿瘤和肿瘤转移。所述抗癌抗体能够与毒素、酶、放射性化合物、细胞因子、干扰素、靶标部分或报告分子部分以及造血细胞偶联。

Description

癌性疾病调节抗体141205-02
发明领域
本发明涉及癌性疾病调节抗体(CDMAB)的分离和生产，以及单独的或与一种或多种CDMAB/化疗剂结合的这些CDMAB在治疗和诊断方法中的应用。本发明还涉及利用本发明的CDMAB的结合分析。
发明背景
用于癌症治疗的单克隆抗体：每个患有癌症的个体都是独特的，并且由于个体的差异，其患有的癌症也不同于其他癌症。尽管如此，目前的治疗以相同的方式治疗患有同期同类型肿瘤的所有患者。至少30％的这些患者的一线治疗是失败的，因而导致了更多轮次的治疗并且增加了治疗失败、肿瘤转移及最终死亡的可能性。优良的治疗方式应该是针对特定个体的个体化治疗。目前唯一采用个体化的疗法是外科手术。化疗和放疗不能针对患者量身定做，而在大多数情况下，手术本身并不足以治愈癌症。
随着单克隆抗体的问世，发展个体化治疗的方法的可能性变得更为现实，因为每种抗体可以针对单一的抗原决定簇。而且，制备针对多个抗原决定簇的集群(constellation)的抗体组合成为可能，该抗原决定簇集群唯一确定了某一特定个体的肿瘤。
认识到癌细胞和正常细胞的显著差异在于癌细胞含有转化细胞特异的抗原，科学界长期认为可以通过与这些癌抗原特异结合设计出特异靶向转化细胞的单克隆抗体；这样就产生了单克隆抗体可以作为“魔术子弹(Magic Bullets)”消除癌细胞的观点。然而，现在已经广泛地认识到单一的单克隆抗体不能用于癌症的所有情形，单克隆抗体可以按类来开发，用来治疗目标癌症。依照本发明公开的方法分离出的单克隆抗体已经显示出能够以有利于患者的方式调节癌性疾病进程，如通过降低肿瘤负荷，并且在本文中这些单克隆抗体将分别被称为癌性疾病调节抗体(CDMAB)或“抗癌”抗体。
目前，癌症患者通常可选择的治疗方式很少。目前的癌症治疗方法已经改善了总体存活率和发病率。然而，对特定的个体来说，这些改善的统计数据与他们个人情况的改善并无必然关系。
因此，如果提出一种方法学，使医生能够在同组患者中，独立于其他患者治疗每例肿瘤，这就会使根据个体进行量身定做的独特治疗成为可能。理论上，这样一种治疗过程可以增加治愈率，产生更好的效果，从而满足长期的需要。
从历史上来看，多克隆抗体的应用在治疗人类癌症的方面取得的成功有限。一直用人类的血浆来治疗淋巴瘤和白血病，但极少有延长的好转或反应。而且，这种治疗方法重复性差，与化疗相比，没有更多的益处。像乳癌、黑色素瘤和肾细胞癌等实体肿瘤也用人类血液、黑猩猩的血清、人类血浆和马血清来治疗过，但相应的结果是不可预测和无效的。
有很多用单克隆抗体治疗实体肿瘤的临床试验。在20世纪80年代，就有至少四项针对人类乳腺癌的临床试验，所述试验在使用了针对特定抗原或基于组织特异性的抗体的至少47个患者中，只产生了一名应答者。直到1998年，才有了成功的临床试验，该试验联合使用人源化的抗Her2/neu抗体
Figure A200780012709D00111
与顺铂。在这项试验中，对37个患者的反应进行了评估，大约有四分之一的患者有部分反应率，另外四分之一有轻微的或稳定的病情发展。在反应者中，中位进展时间(median time toprogression)是8.4个月，其中中位反应持续时间(median response duration)是5.3个月。
Figure A200780012709D00112
在1998年被批准作为与
Figure A200780012709D00113
联合使用的一线用药。临床试验结果表明，与单独接受
Figure A200780012709D00114
治疗的人群的中位疾病进展时间(3.0月)相比，接受抗体治疗与
Figure A200780012709D00115
联合应用的患者的中位疾病进展时间(6.9月)增加。
Figure A200780012709D00116
与
Figure A200780012709D00117
联合治疗组的中位存活时间也轻微增加，与
Figure A200780012709D00118
单独治疗组相比是22个月：18个月。除此之外，所述抗体和
Figure A200780012709D00119
联合应用组与单独使用组相比，在完全应答者(8％:2％)和部分应答者(34％:15％)的数量方面都有增加。然而
Figure A200780012709D001111
和
Figure A200780012709D001112
联合治疗相比
Figure A200780012709D001113
单独治疗，导致了较高的心血管毒性发病率(分别是13％和1％)。此外，
Figure A200780012709D00121
治疗也只对那些过表达人类表皮生长因子受体2(Her2/neu)(通过免疫组化(IHC)分析来确定)的患者有效。Her2/neu是目前还不知其功能或生物学重要配体的受体；大约25％的转移性乳腺癌患者过表达Her2/neu。因此远远不能满足患乳腺癌的患者的治疗需求。即便那些从治疗中受益的患者仍然需要化疗，并且随后还必须至少在一定程度上处理这类治疗的副作用。
研究结肠直肠癌的临床试验涉及到同时针对糖蛋白和糖脂靶标的抗体。对腺癌有某些特异性的诸如17-1A等抗体，已经在超过60例的患者中进行了2期临床实验，其中仅有1例患者有部分反应。在其他试验中，17-1A的使用在采用额外使用环磷酰胺实验方案的52例患者中，只产生了1例完全反应，2例轻微反应。到目前为止，17-1A作为III期结肠癌辅助治疗的III期临床试验还没有显示出改善的疗效。最初被批准用于显像的人源化鼠单克隆抗体也没能使肿瘤消退。
只有到了最近，使用单克隆抗体进行的结肠直肠癌的临床试验才有一些阳性结果。在2004年，
Figure A200780012709D00123
被批准作为表达EGFR的转移结肠直肠癌患者的二线治疗用药，这些患者对于基于依立替康(irinotecan)的化疗是耐受的。双臂II期临床研究和单臂研究的结果表明，
Figure A200780012709D00124
与依立替康联合应用分别有23％和15％的反应率，中位疾病进展时间分别是4.1和6.5月。来自同一项双臂II期临床试验和另一项单臂研究的结果表明，
Figure A200780012709D00125
单独治疗的反应率分别是11％和9％，中位疾病进展时间分别是1.5和4.2个月。
因而在瑞士和美国，
Figure A200780012709D00126
与依立替康的联合应用，以及在美国，
Figure A200780012709D00127
的单独治疗都已经被批准作为依立替康一线治疗失败的结肠癌患者的二线治疗。因此，与
Figure A200780012709D00128
一样，
Figure A200780012709D00129
治疗在瑞士只被批准作为单克隆抗体和化疗联合应用。此外，在瑞士和美国，
Figure A200780012709D001210
治疗只被批准作为患者的二线治疗。同样，在2004年，
Figure A200780012709D001211
被批准与基于静脉注射5-氟尿嘧啶的化疗联合应用，作为转移性结肠直肠癌的一线治疗。III期临床研究结果表明，联合应用
Figure A200780012709D001212
和5-氟尿嘧啶，与单独使用5-氟尿嘧啶相比，延长了患者的中位存活时间(分别是20个月和16个月)。然而，还是与
Figure A200780012709D001213
和
Figure A200780012709D001214
一样，
Figure A200780012709D001215
只被批准作为单克隆抗体与化疗联合应用。
对于肺脏、脑、卵巢、胰腺、前列腺和胃癌的治疗，疗效仍然很差。在II期临床试验中，得到了对于非小细胞肺癌最有希望的近期结果，其治疗涉及与化疗试剂联合应用的偶联细胞杀伤药物阿霉素的单克隆抗体(SGN-15；dox-BR96，抗-唾液酸化的Lex)。
Figure A200780012709D00132
是唯一经FDA批准的用于肺癌二线治疗的化疗药物。初始数据表明，与单独使用
Figure A200780012709D00133
相比，总体存活率提高。参与该研究的62个患者中，三分之二接受了SGN-15与
Figure A200780012709D00134
的联合治疗，剩下的三分之一接受了
Figure A200780012709D00135
的单独治疗。接受SGN-15与联合治疗的患者的中位总体存活时间是7.3个月，相比之下，接受
Figure A200780012709D00137
单独治疗的患者的中位存活时间是5.9个月。与接受
Figure A200780012709D00138
单独治疗的患者的1年和18个月的总体存活率为分别24％和8％相比，接受SGN-15与联合治疗的患者分别是29％和18％。进一步的临床试验在计划中。
临床前试验中，使用单克隆抗体治疗黑色素瘤取得了有限的成功。这些抗体中，极少有达到临床试验期的，且至今还没有一种得到批准，或在III期临床试验中显示出良好效果。
由于对能够促进疾病发生的30,000种已知基因产物中的相关靶点缺乏鉴定，使治疗疾病的新药的发现受阻。在肿瘤学研究中，潜在的药物靶点仅因为其在肿瘤细胞中过表达这一事实而经常被选择。随后，这样鉴定的靶点通过与大量化合物的相互作用被筛选。就潜在抗体的治疗而言，这些候选化合物通常由依据Kohler和Milstein提出的基本原理(1975，Nature，256，495-497，Kohler and Milstein)的制备单克隆抗体的传统方法所产生。从抗原(例如，全细胞、细胞成分、纯化的抗原)免疫过的小鼠收集脾细胞，并与永生的杂交瘤细胞伴侣融合。基于与靶抗原密切结合的抗体的分泌来筛选所产生的杂交瘤。包括
Figure A200780012709D001310
和RITUXIMAB在内的许多针对癌细胞的治疗和诊断的抗体已经被用这些方法制备并已基于它们的亲和性被选择。这项策略的缺陷是双重的。首先，由于对组织特异性的癌症过程认识的贫乏及由此产生的鉴定这些靶标的过分简单的方法(诸如通过过表达来筛选)，与用于诊断或治疗的抗体结合的合适靶标的选择是有限的。其次，与受体有最大结合亲和性的药物分子通常具有启动或抑制信号的最大可能性这一假说并不总是成立。
尽管乳癌和结肠癌的治疗取得了一些进展，但是有效的抗体治疗的鉴定与开发对所有类型癌症而言都是不够的，不管是作为单一试剂还是联合治疗。
现有专利
美国第5,750,102号专利公开了一种方法，其中用可从患者的组织或细胞中克隆的MHC基因转染来自患者肿瘤的细胞。然后用这些转染的细胞给患者接种。
美国第4,861,581号专利公开了一种方法，所述方法包括的步骤有：获取对哺乳动物肿瘤细胞和正常细胞的细胞内成分特异而对外部成分没有特异性的单克隆抗体；；标记单克隆抗体；将该标记的抗体与已接受杀灭肿瘤细胞的治疗的哺乳动物的组织接触；；以及通过测量该标记抗体与退化的肿瘤细胞的细胞内成分的结合来确定治疗的效果。在制备针对人类细胞内抗原的抗体时，专利权所有人认识到肿瘤细胞是这类抗原的一个方便来源。
美国第5,171,665号专利提供了一种新型抗体及其制备方法。具体地，该专利叙述了一种单克隆抗体的制备，所述抗体有与人类肿瘤(例如肠癌和肺癌)相关的蛋白抗原牢固结合的特性，而与正常细胞的结合程度弱得多。
美国第5,484,596号专利提供了癌症治疗的方法，所述方法包括：手术去除来自人类癌症患者的肿瘤组织；处理所述肿瘤组织以获得肿瘤细胞；照射所述肿瘤细胞，使其能成活但不致瘤；以及使用这些细胞来制备能够抑制原发性肿瘤复发，同时抑制肿瘤转移的用于患者的疫苗。该专利讲述了能够与肿瘤细胞表面抗原反应的单克隆抗体的开发。如在第4栏，第45行等处提到的，专利权所有人在开发单克隆抗体中应用了自体肿瘤细胞，所述单克隆抗体对人类肿瘤表现出活性特异的免疫治疗。
美国第5,693,763号专利讲述了人类癌细胞的糖蛋白抗原特性，且所述抗原不依赖于起源的上皮组织。
美国第5,783,186号专利涉及诱导表达Her2的细胞凋亡的抗-Her2抗体、产生该抗体的杂交瘤细胞系、使用所述抗体和包含所述抗体在内的药物组合物治疗癌症的方法。
美国第5,849,876号专利描述了产生单克隆抗体的新杂交瘤细胞系，所述抗体针对从肿瘤和非肿瘤组织来源中纯化的粘液素抗原。
美国第5,869,268号专利涉及制备产生特异针对目标抗原的抗体的人类淋巴细胞的方法，制备单克隆抗体的方法以及由所述方法制备的单克隆抗体。该专利特别涉及用于癌症诊断和治疗的抗-HD人类单克隆抗体的制备。
美国第5,869,045号专利涉及与人类癌细胞反应的抗体、抗体片段、抗体偶联物和单链免疫毒素。这些抗体的作用机制是双重的，其中该分子可与人类癌细胞表面的细胞膜抗原反应，而且该抗体能够进一步内化入癌细胞内，随后结合，使它们对形成抗体-药物和抗体-毒素的偶联物特别有用。未经修饰的抗体在特定浓度下，也表现出细胞毒特性。
美国第5,780,033号专利公开了用于肿瘤治疗和预防的自身抗体的使用。不过，这种抗体是来自老年哺乳动物的抗核自身抗体。这里，所述自身抗体是指一种存在于免疫系统的天然抗体。因为所述自身抗体来自“老年哺乳动物”，所以就不要求自身抗体真正来自受治患者。此外，该专利公开了来自老年哺乳动物的天然单克隆抗核自身抗体以及产生单克隆抗核自身抗体的杂交瘤细胞系。
发明概述
本发明采用了美国专利6,180,357中讲述的生产患者特异性抗癌抗体的方法，用以分离编码癌症调节单克隆抗体的杂交瘤细胞系。这些抗体可以针对一种肿瘤被专门制备，从而使癌症治疗的个性化成为可能。在本申请公开的内容中，具有细胞杀灭(细胞毒素的)或细胞生长抑制(细胞生长抑制的)特性的抗癌抗体将在下文中被称为细胞毒的。这些抗体可以用于帮助癌症的分期和诊断，也可以用于治疗肿瘤转移。这些抗体也可以通过预防性治疗的方式用于癌症预防。与传统的药物发现模式下制备的抗体不同，用本方法制备的抗体可以靶向以前没有表明对恶性组织生长和/或存活必需的分子和途径。而且，这些抗体的结合亲和性满足启动细胞毒性作用事件的要求，所述事件可不顺从于更强的亲和性相互作用。本发明的范围还包括将传统的化疗调节物质，比如放射核素，与本发明中的CDMAB偶联，从而使所述的化疗作用集中。所述CDMAB也可与毒素、细胞毒性部分、例如生物素偶联酶的酶、细胞因子、干扰素、靶标部分或报告分子部分或造血细胞偶联，从而形成抗体偶联物。所述CDMAB可以单独使用或与一种或多种CDMAB/化疗治疗试剂联合使用。
个体化抗癌治疗前景将会带来患者治疗方式的变化。一个可能的临床情境就是在肿瘤出现时，就获取肿瘤样本并入库。通过该样本，从预存在的癌性疾病调节抗体组中对肿瘤进行分型。对该患者进行常规分期，而所提供的抗体可用于该患者的进一步分期。用现有的抗体可以直接对该患者进行治疗，且所述肿瘤特异性的抗体组可以通过使用本文中列出的方法来制备或通过噬菌体显示库与本文公开的筛选方法合用来制备。既然其他肿瘤可能携带一些与被治疗肿瘤相同的抗原决定簇，所有制备的抗体都将被加入到抗癌抗体库中。按照本方法制备的抗体可以用于治疗许多患有与这些抗体结合的肿瘤的患者的癌性疾病。
除抗癌抗体之外，患者可以选择接受目前推荐的治疗作为多模式治疗方案的一部分。通过本方法分离的抗体对于非癌细胞相对无毒性这一事实允许大剂量抗体组合的使用，要么单独使用，要么与传统的治疗联合使用。高治疗指数也允许短期内的重复治疗，这种治疗会降低治疗抗性细胞出现的可能性。
如果患者的初期治疗产生耐药性或发生了转移，可以重复肿瘤特异性抗体的制备过程进行再次治疗。此外，所述抗癌抗体可以与从该患者体内获得的红细胞偶联，重新输注到患者体内用于治疗转移肿瘤。目前几乎没有有效的治疗转移癌的方法，而转移通常预示着导致死亡的不良结果。然而，转移癌通常血管丰富，并且通过红细胞来递送抗癌抗体可以具有将抗体富集在肿瘤部位的作用。即便在转移之前，大多数癌细胞也要依赖于宿主的血供来存活，因而与红细胞偶联的抗癌抗体对原位肿瘤同样有效。可选择地，所述抗体可以与例如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞等其他血细胞偶联。
抗体有五类，每类都与其重链所赋予的功能相关。通常认为通过抗体依赖性细胞的细胞毒性作用或补体依赖性细胞毒性作用来介导裸抗体的癌细胞杀伤功能。例如，鼠IgM和IgG2a抗体能够通过结合补体系统的C-1组分来活化人类补体，从而活化导致肿瘤裂解的补体活化的经典途径。对于人类抗体，最有效的补体激活抗体通常是IgM和IgG1。鼠IgG2a和IgG3同种型抗体可以有效地募集具有Fc受体的细胞毒细胞，所述Fc受体会导致单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和某些淋巴细胞的细胞杀伤作用。人IgG1和IgG3同种型抗体介导ADCC。
通过Fc区介导的细胞毒性作用需要例如NK细胞、T细胞和补体的效应细胞、它们对应的受体或蛋白的存在。这些效应器机制缺乏的情况下，抗体的Fc部分是无活性的。所述抗体的Fc部分在体内可以提供影响抗体的药物动力学的特性，但在体外这是无效的。
我们测试抗体的细胞毒性作用分析没有任何效应器机制的存在，并且在体外操作。这些分析没有效应细胞(NK细胞、巨噬细胞或T-细胞)或补体的存在。既然这些分析完全由加在一起的成分确定，所以每一成分都可以被表征。本文中使用的分析只包含靶细胞、介质和血清。因为所述靶细胞是癌细胞或成纤维细胞，所以它们没有效应器功能。在没有具有效应器功能特性的外源细胞情况下，就没有具有该功能的细胞组分。所述介质不包含补体或任何细胞。用于支持所述靶细胞生长的血清没有厂商公开的补体活性。此外，在我们自己的实验室中，我们已经验证了在使用的血清中没有补体活性。因此，我们的工作证明了抗体的效应是完全来自通过Fab介导的抗原结合的效应这一事实。有效地，既然所述靶细胞没有对应Fc的受体，它们被观察到只与Fab相互作用。尽管杂交瘤分泌被用靶细胞测试的完整免疫球蛋白，但所述免疫球蛋白与所述细胞相互作用的唯一部分是作为抗原结合片段的Fab。
关于本发明要求保护的抗体和抗原结合片段，提交的本申请已经证实了细胞的细胞毒性作用，如由图1中的数据所证明的那样。如上述所指出以及如本发明通过客观证据所证实的，该效应完全来自所述Fab对肿瘤细胞的结合。
本领域存在许多关于抗体介导的细胞毒性作用来自抗体与靶抗原的直接结合而不依赖于由Fc募集的效应器机制的证据。对此最好的证据是没有补充的细胞或补体(以形式上排除那些机制)的体外实验。已经用完整的免疫球蛋白或用诸如F(ab)′2片段的抗原结合片段实施了这些类型的实验。在这些类型的实验中，抗体或抗原结合片段能够直接诱导靶细胞的凋亡，诸如抗-Her2和抗-EGFR抗体的情况，所述两种抗体已经被美国FDA批准上市用于癌症治疗。
抗体介导的癌症杀伤功能的另一个可能机制可能是通过使用能够催化细胞膜及其相关糖蛋白或糖脂中各种化学键水解的抗体，即所谓的催化抗体。
抗体介导的癌细胞杀伤还有三种机制。第一种是用抗体作为疫苗以诱导机体产生针对存在于癌细胞的推定抗原的免疫反应。第二种是用抗体靶向生长受体，并干扰它们的功能或下调所述受体，以使受体功能有效丧失。第三种是这类受体对细胞表面部分的直接连接(ligation)作用，这可导致直接的细胞死亡，比如诸如TRAIL R1或TRAIL R2的死亡受体，或是诸如αVβ3及其类似物的整合素分子的连接。
癌症药物的临床应用是基于该药物在可接受的风险范围下对患者的益处。在癌症治疗中，存活率通常是追求的最主要的益处。但是，除了延长寿命之外，还有许多其他公认的益处。在治疗对存活率没有负面影响的情况下，这些其他益处包括症状减轻、防止副作用、延长复发或无疾病存活时间以及延长病情进展时间。这些标准是被普遍接受的，且诸如美国食品药品管理局(F.D.A.)等管理机构批准产生这些益处的药物(Hirschfeld et al.Critical Reviews in Oncology/Hematolgy(肿瘤学/血液学的临床综述)42：137-1432002)。除了这些标准之外，人们充分认识到还有一些其他的指标可以预测这些类型的益处。在某种程度上，美国FDA准许的快速审批程序肯定了可能预测患者受益的替代品的存在。到2003年末，有16种药物在这种程序下得到批准，在这些药物中，有四种进入了完全审批，即后续的研究已经显示了直接的患者受益，正如替代指标预测的那样。确定药物对实体肿瘤疗效的一个重要的指标是通过测定对治疗的反应来评价肿瘤负荷(Therasse et al.Journal of the National CancerInstitute 92(3)：205-2162000)。这类评价的临床标准(RECIST criteria(RECIST标准))已经由实体肿瘤反应评价标准工作组(Response EvaluationCriteria in Solid Tumors Working Group)公布，该工作组由国际癌症专家组成。正如依据RECIST标准的客观反应显示的，与适当的对照组相比，对肿瘤负荷有确切作用的药物易于最终对患者产生直接的益处。在临床前设置中，肿瘤负荷通常能更直接地被评价和记录。因为临床前研究可以转化成临床设置，所以在临床前模型中延长存活率的药物有最好的预期临床效用。与临床治疗产生的积极作用相似，在临床前设置中减轻肿瘤负荷的药物也对疾病有明显的直接影响。尽管延长生存时间是癌症药物治疗中追求的最主要的临床结果，但仍有其他有临床作用的益处，并且显然，降低肿瘤负荷(其与疾病进展的延迟、生存时间的延长或两者都有关系)也能导致直接的益处，并具有临床作用(Eckhardt et al.Developmental Therapeutics：Successes and Failures of Clinical Trial Designsof Targeted Compounds(发展的治疗学：靶化合物的临床试验设计的成功与失败)；ASCO Educational Book，39th Annual Meeting，2003，pages209-219)。
本发明描述了通过在细胞毒性作用分析和未确定的动物模型中的作用鉴定的AR58A314.1的开发和应用。本发明描述了特异性与存在于靶分子上的一个或多个抗原决定簇结合的试剂，其作为裸抗体还对恶性肿瘤细胞而非正常细胞具有体外细胞毒性作用，并且也可作为裸抗体直接介导肿瘤生长的抑制。另外的进步是将该抗体包括在抗癌抗体库中，通过确定不同的抗癌抗体的合适组合会提高靶向表达不同抗原标志物的肿瘤的可能性，以实现最有效的靶向和抑制所述肿瘤的生长和进展。既然它能够在人类患者中显示相似的抗癌特性，因此它也代表癌症治疗方面的进步。另外的进步是将这些抗体包含在抗癌抗体库中，通过确定不同抗癌抗体的合适组合会提高靶向表达不同抗原标志物的肿瘤的可能性，以实现最有效的靶向和抑制所述肿瘤的生长和进展。
总之，本发明讲述了AR58A314.1抗原作为治疗试剂靶点的应用，给予所述治疗试剂时可以减轻哺乳动物中表达该抗原的癌症的肿瘤负荷。本发明也讲述了CDMAB(AR58A314.1)及其衍生物、其抗原结合片段和其细胞毒性作用诱导配体，靶向它们的抗原以减轻哺乳动物中表达该抗原的癌症的肿瘤负荷的用途。此外，本发明也讲述了在癌细胞内检测AR58A314.1抗原的用途，其可以用于携带表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的诊断、治疗预测及预后。
因此，本发明的目的是利用制备抗来源于特定个体的癌细胞、或者一种或多种特定癌细胞系的癌性疾病调节抗体(CDMAB)的方法，以分离杂交瘤细胞系和该杂交瘤细胞系编码的相应的分离的单克隆抗体及其抗原结合片段。所述CDMAB对癌细胞有细胞毒性作用，而同时对非癌细胞相对无毒。
本发明的另外目的是讲述癌性疾病调节抗体、配体及其抗原结合片段。
本发明的另外目的是制备癌性疾病调节抗体，所述抗体的细胞毒性作用由抗体依赖的细胞毒性作用介导。
本发明的另外目的是制备癌性疾病调节抗体，所述抗体的细胞毒性作用由补体依赖的细胞毒性作用介导。
本发明的另外目的是制备癌性疾病调节抗体，所述抗体的细胞毒性作用是其催化细胞化学键水解的能力的作用。
本发明的另外目的是制备癌性疾病调节抗体，所述抗体用于癌症诊断、预后和监测的结合分析。
通过本发明下述的说明、举例和一些实施方案的描述，本发明其他的目的和优点将变得显而易见。
附图简要说明
图1比较了杂交瘤上清对细胞系MDA-MB-231(MB-231)、OVCAR-3、SW1116、Lovo和CCD-27sk的细胞毒性百分比和结合水平。
图2显示了AR58A314.1和抗-EGFR对照对癌细胞系和正常细胞系的结合。数据制成表格，以高出同种型对照的倍增显示平均荧光强度。
图3包括了针对几种癌细胞和非癌细胞系的AR58A314.1和抗-EGFR抗体的代表性FACS直方图。
图4表明了AR58A314.1在预防性A549肺癌模型中对肿瘤生长的影响。垂直虚线(vertical dashed line)表示给予抗体的时间段。数据点表示平均值+/-标准误。
图5表明了AR58A314.1在预防性A549肺癌模型中对体重的影响。数据点表示平均值+/-标准误。
图6表明了AR58A314.1在预防性BxPC-3胰腺癌模型中对肿瘤生长的影响。垂直虚线表示给予抗体的时间段。数据点表示平均值+/-标准误。
图7表明了AR58A314.1在预防性BxPC-3胰腺癌模型中对体重的影响。数据点表示平均值+/-标准误。
图8是人肿瘤和正常组织微阵列中AR58A314.1与阳性和阴性对照的比较。
图9.代表性显微图，显示了人组织微阵列中用AR58A314.1(A)或同种型对照抗体(B)在肺肿瘤组织上获得的结合模式，以及用AR58A314.1(C)或抗-肌动蛋白(D)在肺正常组织上获得的的结合模式。AR58A314.1对肿瘤细胞显示了强阳性染色，在正常组织上显示了阴性染色。放大倍数是200×。
图10人正常组织微阵列中AR58A314.1与阳性和阴性对照的比较。
图11.代表性显微图，显示了正常人组织微阵列中用AR58A314.1(A)或阳性对照抗体(B)在正常心脏组织上获得的结合模式，以及用AR58A314.1(C)或阳性对照抗体(D)在正常胰腺组织上获得的结合模式。AR58A314.1对正常组织显示了阴性染色。放大倍数是200×。
发明的详细说明
下面用于概述、描述、实施例和权利要求书中的字词或短语通常都有其指定的含义。
术语“抗体”使用其最广泛的含义，并特别包括例如单种单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂和中和抗体、去免疫的、鼠源的、嵌合的或人源化的抗体)、具有多抗原表位特异性的抗体组合物、单链抗体、双体(diabodies)、三体(tribodies)、免疫偶联物和抗体片段(见下文)。
本文中使用的术语“单克隆抗体”指从基本同质的抗体群中获得的抗体，即包含该群抗体的单个抗体是相同的，除了可以少量存在的可能自然发生的变异。单克隆抗体高度特异性的针对单一抗原位点。此外，与包含针对不同决定基(抗原决定簇)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每一种单克隆抗体针对抗原上的单一决定基。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优势还在于它们的合成可以不受其他抗体的污染。修饰语“单克隆的”指从基本同质的抗体群中获得的抗体的特征，而不能解释为需要通过任何特定的方法来生产该抗体。例如，本发明中使用的单克隆抗体可以通过由Kohler et al.，Nature，256：495(1975)首次描述的杂交瘤(鼠或人)方法制备或由重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利第4,816,567号)。还可以使用例如在Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)和Marks et al，J.MoI.Biol，222：581-597(1991)中描述的技术，从噬菌体抗体库中分离“单克隆抗体”。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选包括其抗原结合区或其可变区。抗体片段的实例包括非全长的抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子；单链抗体，单结构域抗体分子，融合蛋白，重组蛋白和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“完整”抗体指包括抗原结合可变区，以及轻链恒定区(CL)和重链恒定区CH1，CH2和CH3的抗体。恒定区可以是天然序列的恒定区(例如，人天然序列恒定区)或其氨基酸序列的变体。优选地，所述完整抗体有一个或多个效应器功能。
依据其重链恒定区的氨基酸序列，完整抗体可以分为不同的“种类”。有五主类完整的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中几种可以进一步分为“亚类”(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同种类抗体的重链恒定区分别被称为α，δ，
Figure A200780012709D0022163642QIETU
，γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚单位结构和三维空间构型是公知的。
抗体“效应器功能”指那些由抗体Fc区引起的(天然序列的Fc区或氨基酸序列变异的Fc区)的生物活性。抗体效应器功能的实例包括Clq结合；补体依赖的细胞毒性作用；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如B细胞受体；BCR)等。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用”和“ADCC”指细胞介导的反应，在该反应中表达Fc受体(FcRs)的非特异性的细胞毒细胞(例如自然杀伤(NK)细胞，噬中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，并随后导致所述靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)的第464页的表3总结了造血细胞的FcR表达。为了测定目标分子的ADCC活性，可以进行诸如在美国第5,500,362或5,821,337号专利中描述的体外ADCC分析。对于这类分析有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选择地或附加地，可以在体内评价目标分子的ADCC活性，例如在诸如Clynes et al.PNAS(USA)95：652-656(1998)中公开的动物模型中。
“效应细胞”指表达一种或多种FcRs并执行效应器功能的白细胞。优选地，这些细胞至少表达FcγRIII，并执行ADCC效应器功能。介导ADCC的人类白细胞的实例包括外周血单个核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒T细胞和中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源中分离，例如从本文中描述的血液或PBMC中分离。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合于抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列的人类FcR。而且，优选的FcR是结合于IgG抗体(γ受体)的受体，并包括FcγRI，FcγRII和FcγRIII亚类的受体，其包括这些受体的等位基因变体和选择性的剪切形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，两者的氨基酸序列相似，区别主要在于其胞浆区。激活性受体FcγRIIA在其胞浆区含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞浆区含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。(参见
Figure A200780012709D0023095013QIETU
，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997)中的综述M)。在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capelet al.，Immunomethods 4：25-34(1994)和de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中对FcR进行了综述。其他FcRs，包括将来要被确认的那些，都包括在本文中的术语“FcR”中。所述术语也包括负责将母体的IgGs转移到胎儿体内的新生受体，FcRn(Guyer et al.，J.Immunol.1 17：587(1976)和Kim et al.，Eur.J.Immunol.24：2429(1994))。
“补体依赖性细胞毒性作用”或“CDC”指分子在补体存在下，裂解靶细胞的能力。补体激活途径通过补体系统的第一组分(Clq)与交联了同类抗原的分子(比如，抗体)的结合被启动。为了评价补体激活，可以进行例如在Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所描述的CDC分析。
术语“可变的”指可变区某些部分的序列在抗体间高度不同，并用于每一种特定抗体与其特定抗原的结合及其特异性。然而，变异并不是均匀分布在抗体的可变区内。它集中在轻链和重链可变区的三个所谓的高度可变区的片段内。可变区内更加高度保守的部分被称为骨架区(FRs)。每个天然的重链和轻链可变区包含由三个高度可变区连接的主要采用β-片层构型的四个FRs，其形成环状连接，且在某些情况下形成部分β-片层结构。每条链的高度可变区通过FRs以密切靠近的方式结合在一起，并与另一条链的高度可变区一起，促成抗体的抗原结合部位的形成(参见Kabat et al，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学目标蛋白的序列)，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.pp 15-17；48-53(1991))。恒定区并不直接参与抗体与抗原的结合，而是呈现各种效应器功能，例如在抗体依赖性的细胞毒效应(ADCC)中抗体的参与。
本文中使用的术语“高度可变区”指抗体中负责与抗原结合的氨基酸残基。高度可变区通常包含“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变区的氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变区的氨基酸残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat et al，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学目标蛋白的序列)，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.pp15-17；48-53(1991))和/或“高变环”区的那些氨基酸残基(例如轻链可变区的残基2632(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变区的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk J.MoI.Biol.196：901-917(1987))。“骨架区”或“FR”残基指除了本文定义的高变区残基之外的那些可变区的残基。木瓜蛋白酶水解抗体产生了两个相同的被称为“Fab”片段的抗原结合片段和一个残余的“Fc”片段，每个“Fab”片段都有单一的抗原结合部位，“Fc”片段的名称反映了其易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生了有两个抗原结合部位且仍能够与抗原交联的F(ab′)2片段。
“Fv”是含有完整的抗原识别和抗原结合部位的最小抗体片段。该区域由以紧密、非共价结合的一条重链和一条轻链可变区的二聚体组成。以每个可变区的三个高变区相互作用的这种构型决定VH-VL二聚体表面的抗原结合部位。六个高变区区共同赋予了抗体抗原结合特异性。然而，即便单一的可变区(或只含有三个抗原特异性高变区的Fv的一半)仍能够识别和结合抗原，尽管比完整结合位点的亲和性低。Fab片段也含有轻链恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab′片段不同于Fab片段之处在于其重链CH1区的羧基末端多了包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的几个氨基酸残基。Fab′-SH在本文中指代Fab′，其中所述恒定区的半胱氨酸残基至少携带一个游离的硫基。最初的F(ab′)2抗体片段以Fab′片段对产生，之间有铰链的半胱氨酸。其他的抗体片段的化学偶联也是已知的。
来自任一脊椎动物的抗体的“轻链”基于其恒定区的氨基酸序列，都可以归于两种截然不同的所谓kappa(κ)和lambda(λ)链中的一种。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH区和VL区，其中这些区域存在于单一的多肽链上。优选地，所述Fv多肽还包含VH和VL区之间的多肽连接子，所述连接子使scFv形成用于抗原结合的理想结构。关于scFv的综述参见Plückthun in The Pharmacology of MonoclonalAntibodies(单克隆抗体药理学)，vol.1 13，Rosenburg and Moore eds.，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。
术语“双体(Diabodies)”指带有两个抗原结合位点的小型抗体片段，所述片段在同一多肽链上(VH-VL)包含与轻链可变区(VL)结合的重链可变区(VH)。通过使用因过短而不能使同一条链上的两个区域配对的连接子，使这些区域被迫与另一条链上的互补区域配对，由此产生了两个抗原结合位点。例如在EP 404，097；WO 93/11161；和Hollinger et al.，Proc.NatlAcad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)中对双体作了更详细的描述。
术语“三体”或“三价三聚物”指三个单链抗体的结合。三体用VL或VH区的氨基酸末端构成，即没有任何连接子序列。三体具有三个其多肽以环状、头尾相接模式排列的Fv头。所述三体的可能构象是平面的，位于平面内的三个结合部位彼此成120度的角度。三体可以是单特异性的、双特异性的或三特异性的。
“分离”抗体是指从其天然环境的组分中鉴别、分离和/或回收的抗体。其天然环境下的污染成分是指会干扰抗体诊断或治疗作用的物质，可以包括酶、激素和其它的蛋白质的或非蛋白质的溶解物。因为抗体的天然环境中的至少一种组分不会存在，所以分离的抗体包括重组细胞内部的原位抗体。但是，通常分离的抗体会经过至少一步的纯化步骤来制备。
“结合”目的抗原的抗体是指能够以足够的亲和力结合所述抗原的抗体，以致所述抗体在靶向表达所述抗原的细胞时，可以用作治疗或诊断试剂。如果所述抗体是结合目标抗原的抗体，它通常会优先结合目标抗原，而不是其它蛋白，这不包括诸如非特异性的Fc接触的偶然结合或与其他抗原共有的翻译后修饰成分结合，而且所述抗体可以是不会与其他蛋白有明显的相互作用的抗体。检测与目的抗原结合的抗体的方法在本领域中是公知的，可以包括但并不限于例如FACS、细胞ELISA和Western印迹等分析。
如本文所使用的，“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”的表述可以交替使用，所有这些指代都包括其子代。也可以理解为由于人为的或非人为的突变，所有的子代在DNA组成上不可能完全相同。在原始转化细胞内筛选的有相同功能或生物学活性的突变子代包括在内。从有意使用的不同指代的上下文中，指代是清楚的。
“治疗”既指治疗性处理，也指预防性或防止性的措施，其目的就是预防或减缓(减轻)目标病理状态或病症。需要治疗的个体包括那些已经存在所述病症的个体，还包括那些将发展为所述病症的或欲对所述病症进行预防的个体。因此，本文中欲被治疗的哺乳动物可已经被诊断为患有所述病症或倾向于或易感于所述病症。
术语“癌症”和“癌性(的)”是指或描述哺乳动物的生理状态，其典型特征是细胞生长或死亡不受调控。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这些癌症更多具体的实例包括鳞状细胞癌(例如鳞状上皮细胞癌)，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌在内的肺癌，腹膜癌，肝细胞癌，包括胃肠道癌在内的胃癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝脏癌症，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴肿瘤，甲状腺癌，肝癌，肛癌，阴茎癌，以及头颈部癌。
“化疗剂”是用于癌症治疗的化合物。化疗剂的实例包括：诸如噻替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)的烷化剂；诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)、哌泊舒凡(piposulfan)的烷基磺酸酯类；如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)的氮丙啶类；包括六甲蜜胺、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基奥罗蜜胺(trimethylolomelamine)在内的乙烯亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamine)；诸如瘤可宁(chlorambucil)、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、胆甾醇对苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀(uracil mustard)的氮芥类药物；诸如卡氯芥、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司丁、雷莫司汀的硝脲类(nitrosureas)；诸如阿克拉霉素类、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加里刹霉素、洋红霉素(carabicin)、碳霉素(carnomycin)、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托咪定、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表阿霉素、依索比星、依达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星的抗生素；诸如甲氨碟呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)的抗代谢类药；诸如二甲叶酸、氨甲喋呤、蝶罗呤、三甲曲沙的叶酸类似物；诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫米嘌呤、硫鸟嘌呤的嘌呤类似物；诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU的嘧啶类似物；诸如卡鲁睾酮、屈他雄酮丙酸酯、表硫雄醇、美雄烷、睾内酯酮的男性激素类药物；诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦的抗肾上腺类药物；诸如亚叶酸的叶酸补充物；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；足叶草酸；2-乙肼；丙卡巴肼；
Figure A200780012709D0028162646QIETU
；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2＂-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(＂Ara-C＂)；环磷酰胺；塞替派；例如紫杉醇(
Figure A200780012709D0028162658QIETU
，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ.)和多西他赛(
Figure A200780012709D0028162711QIETU
，Aventis，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)等紫杉烷类；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；诸如顺铂和卡铂的铂类似物；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；去甲长春碱；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；柔红霉素；氨蝶呤钠；希罗达；伊班膦酸钠；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他滨；以及上述任一种药物在药学上可接受的盐、酸或衍生物。调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素类药物也包括在本定义内，诸如包括例如它莫西芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制剂4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷诺昔芬(keoxifene)、LY 1 17018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通)的抗雌激素药物；以及诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林的抗雄激素物质；以及上述任一种药物在药学上可接受的盐、酸或衍生物。
用于治疗目的的“哺乳动物”指任何一种可归于哺乳类的动物，包括人类、小鼠、免疫缺陷鼠(SCID)或裸鼠或品系小鼠、家畜和农场动物及动物园内的动物、体育动物或宠物，比如绵羊、狗、马、猫、母牛等。优选地，本文中的哺乳动物指人类。
“寡核苷酸”指短长度、单链或双链多聚脱氧核苷酸，其通过已知的方法(例如磷酸三酯、亚磷酸盐、亚磷酰胺化学，利用诸如发表于1988年5月4日的EP 266,032中描述的固相技术，或经由Froehler et al，Nucl.Acids Res.，14：5399-5407，1986描述的脱氧核苷H-磷酸盐中间物化学合成。然后将其用聚丙烯酰胺凝胶纯化。
依照本发明，非人类(例如鼠科)免疫球蛋白的“人源化”和/或“嵌合”形式指抗体，所述抗体包含导致人抗小鼠抗体(HAMA)、人抗嵌合抗体(HACA)或人抗人抗体(HAHA)应答与原抗体相比减弱的特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab)2或抗体的其他抗原结合序列)，并且包含再现所需效应必需的来自所述非人免疫球蛋白的必需部分(诸如CDR(s)、抗原结合区(s)、可变区等等)，同时保留可与所述非人免疫球蛋白相比的结合特性。在绝大多数情况下，人源化抗体是人的免疫球蛋白(受者抗体)，其中，来自受者抗体的互补决定区(CDRs)的残基被诸如具有所需的特异性、亲和力、能力的小鼠、大鼠或兔等非人类抗体(供者抗体)的CDRs的残基所替代。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)残基被相应的非人类FR残基所替代。此外，人源化抗体可以包含既不在受者抗体也不在引入的CDR或FR序列的残基。这些修饰被产生以进一步改善和优化抗体的性能。通常，人源化抗体包含至少一个，通常是两个可变区的基本上所有的部分，其中所有或基本上所有的CDR区对应非人类免疫球蛋白的CDR区，且所有或基本上所有的FR残基是人类免疫球蛋白共有序列的FR残基。最优地，人源化抗体也包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人类免疫球蛋白的恒定区。
“去免疫化”抗体是对特定的物种没有免疫原性或免疫原性较差的免疫球蛋白。通过对抗体结构的改造可以实现去免疫化。可以使用任何本领域技术人员公知的去免疫化技术。例如，在发表于2000年6月15日的WO 00/34317中，描述了一项使抗体去免疫原性的适当的技术。
诱导“细胞凋亡”的抗体是通过任何方式诱导程序性细胞死亡的抗体，这些方式例如但不限于：膜联蛋白V(Annexin V)的结合、半胱天冬酶活性、DNA断裂、细胞皱缩、内质网扩张、细胞破碎和/或膜囊泡(所谓的凋亡小体)的形成。
本文中使用的“抗体诱导的细胞毒性作用”被理解为指来自杂交瘤上清的或由杂交瘤产生的抗体的细胞毒效应，所述杂交瘤以保藏号141205-02保藏于IDAC，所述毒性效应并不必然与结合程度相关。
在本说明书中，杂交瘤细胞系及其产生的分离的单克隆抗体可选择用它们的内部分类号AR58A314.1或保藏号IDAC 141205-02来表示。
本文中使用的“抗体-配体”包括至少对靶抗原的一个抗原决定簇有结合特异性的部分，所述部分可以是完整的抗体分子、抗体片段和至少有一个抗原结合区或其部分(即抗体分子的可变部分)的任何分子，例如，Fv分子、Fab分子、Fab′分子、F(ab′).sub.2分子、双特异性抗体、融合蛋白或任一基因工程分子，所述分子特异性识别和结合抗原的至少一个抗原决定簇，所述抗原可被命名为IDAC 141205-02(IDAC 141205-02抗原)杂交瘤细胞系产生的分离的单克隆抗体结合。
本文中使用的“癌性疾病调节抗体”(CDMAB)指以有益于患者的方式，例如通过减轻肿瘤负荷或延长肿瘤患者的生存期的方式，调节癌性疾病过程的单克隆抗体，以及其抗体-配体。
使用其最广泛意义的“CDMAB相关结合剂”被理解为包括但不限于任何形式的竞争性结合至少一个CDMAB靶抗原决定簇的人或非人抗体、抗体片段、抗体配体或其类似物。
“竞争性结合剂”被理解为包括任何形式的具有针对至少一个CDMAB靶抗原决定簇的结合亲和性的人或非人抗体、抗体片段、抗体配体或其类似物。
欲被治疗的肿瘤包括原发性肿瘤和转移性肿瘤以及耐受性肿瘤(refractory tumors)。耐受性肿瘤包括对用单独的化疗剂、单独的抗体、单独的放射或其组合的治疗不发生反应或产生抵抗的肿瘤。耐受性肿瘤也包括其显示被用这些试剂的治疗抑制，但在治疗中断后5年、有时一直到10年或更长的时间复发的肿瘤。
可以被治疗的肿瘤包括没有形成血管的、基本上没有形成血管的以及形成血管的肿瘤。因此可以被治疗的实体肿瘤的实例包括乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤和淋巴瘤。这些肿瘤的一些实例包括表皮样瘤，鳞状肿瘤，诸如头颈肿瘤、结肠直肠肿瘤、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、包括小细胞和非小细胞肺肿瘤的肺肿瘤、胰腺肿瘤、甲状腺肿瘤、卵巢肿瘤和肝脏肿瘤。其它的实例包括Kaposi′s肉瘤、中枢神经系统肿瘤、神经母细胞瘤、毛细血管性血管母细胞瘤、脑膜瘤和脑转移瘤、黑色素瘤、胃肠道的和肾的癌及肉瘤、横纹肌肉瘤、优选多形性胶质母细胞瘤的胶质母细胞瘤以及平滑肌肉瘤。
本文中使用的“抗原结合区”指识别靶抗原的分子部分。
本文中使用的“竞争性抑制”是指通过常规的抗体相互竞争分析(Belanger L.，Sylvestre C.和Dufour D.(1973)，Enzyme linked immunoassayfor alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures(竞争和夹心法的甲胎蛋白的酶联免疫测定).Clinica Chimica Acta 48，15)，能够识别和结合由命名为IDAC 141205-02的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体(IDAC141205-02抗体)针对的抗原决定表位。
本文中使用的“靶抗原”指IDAC 141205-02抗原或其部分。
本文中使用的“免疫偶联剂”指以化学或生物学方式连接到细胞毒素、放射物质、细胞因子、干扰素、靶标部分或报告分子部分、酶、毒素、抗肿瘤药或治疗剂的诸如抗体的任何分子或CDMAB。只要能够与其靶标结合，该抗体或CDMAB可以在其分子的任何位置与细胞毒素、放射物质、细胞因子、干扰素、靶标部分或报告分子部分、酶、毒素、抗肿瘤药或治疗剂连接。免疫偶联剂的实例包括抗体毒素化学偶联剂和抗体-毒素融合蛋白。
适于用作抗肿瘤试剂的放射性试剂对本领域的技术人员而言是已知的。例如，使用131I或211At。使用常规的技术(例如Pedley et al，Br.J.Cancer 68，69-73(1993))将这些同位素结合于抗体。可选择地，所述结合到抗体的抗肿瘤试剂是激活前体药物的酶。可以给予前体药物，所述前体药物保持它的完整的形式直至到达肿瘤部位。一旦给予抗体复合物，所述前体药物在肿瘤部位转化为它的细胞毒性形式。在实践中，将抗体-酶偶联物给予患者并且允许其定位于欲被治疗的组织区。然后将所述前体药物给予患者以使向细胞毒性药物的转化发生在欲被治疗的组织区。可选择地，偶联到抗体的抗肿瘤试剂是诸如白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的细胞因子。所述抗体将所述细胞因子靶向肿瘤以使所述细胞因子在不影响其它组织的情况下，介导对肿瘤的损伤或破坏。使用常规的重组DNA技术，将细胞因子在DNA水平融合到抗体。也可以使用干扰素。
本文中使用的“融合蛋白”指任何嵌合蛋白，其中抗原结合区与例如毒素、酶、荧光蛋白、发光标志物、多肽标签、细胞因子、干扰素、靶标部分或报告分子部分或蛋白药物的生物活性分子连接。
本发明还涉及与靶标部分或报告分子部分连接的本发明的CDMAB。靶标部分是结合对的第一成员。例如抗肿瘤试剂偶联到这种对的第二成员并由此指向抗原结合蛋白结合的部位。这样一种结合对的共有实例是抗生物素蛋白和抗生素。在优选的实施方案中，抗生物素蛋白偶联到本发明所述的CDMAB的靶抗原，并由此为偶联到抗生物素蛋白或链霉亲和素的抗肿瘤试剂或其它部分提供靶标。可选择地，生物素或其它这样的部分连接到本发明所述的CDMAB的靶抗原并用作报告分子，例如在诊断系统中，其中可检测的信号产生剂偶联到抗生物素蛋白和链霉亲和素。
可检测的信号产生剂用于体内和体外的诊断目的。所述信号产生剂产生可测量的信号，所述信号可以通过体外的装置检测，通常是电磁辐射的测量。通常，所述信号产生剂是酶或生色团，或通过荧光、磷光或化学发光发光。生色团包括吸收紫外线或可见区的光的染料，也可以是酶催化反应的底物或降解产物。
此外，所述CDMAB在体内和体外用于本领域公知的研究的或诊断的方法包括在本发明范围内。为了实施本文所涉及的诊断方法，本发明还可以包括包含本发明的CDMAB的试剂盒。所述试剂盒可以通过检测个体细胞上的所述CDMAB的靶抗原用于鉴定有患某些类型肿瘤风险的个体。
诊断分析试剂盒
以诊断分析试剂盒的形式利用本发明所述的CDMAB来确定肿瘤的存在是被考虑的。患者体内的肿瘤通常基于一个或多个肿瘤特异性抗原的存在被检测，例如在从所述患者获得的诸如血液、血清、尿液和/或肿瘤活组织的生物样本中的蛋白和/或编码这些蛋白的多核苷酸。
所述蛋白作为指示例如结肠、乳腺、肺或前列腺肿瘤的特定肿瘤存在与否的标志物起作用。还涉及所述抗原具有用于检测其它癌性肿瘤的效用。将包含本发明的CDMABs的结合剂或CDMAB相关的结合剂包括在诊断分析试剂盒中使与生物样本中的试剂结合的抗原的水平能够被检测。多核甘酸引物和探针可以用于检测编码肿瘤蛋白的mRNA水平，所述mRNA水平也指示肿瘤的存在与否。为了使所述结合分析有诊断价值，产生与抗原的显著水平在统计学上相关的数据以使结合的识别对癌性肿瘤的存在有决定性的诊断价值，所述显著水平相对于在正常组织内存在的抗原水平。涉及如本领域的技术人员熟知的多种形式可以用于本发明的诊断分析，用于使用结合剂检测样本中的多肽标志物。例如，如在Harlow and Lane Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，ColdSpring Harbor Laboratory，1988.中示例的。还涉及前述诊断分析形式的任何和所有的组合物、变换或修饰。
癌症在患者的存在与否通常会由(a)将从患者获得的生物样本与结合剂接触；(b)检测样本中与结合剂结合的多肽水平；以及(c)比较有预定临界值的多肽水平确定。
在示例性实施方案中，涉及所述分析会包括使用固定于固体载体的基于CDMAB的结合剂以结合和移除来自剩余样本的多肽。然后可以使用包含报告分子基团并且特异性与结合剂/多肽复合物结合的检测试剂检测所述结合的多肽。示例性检测试剂可以包括特异性与多肽结合的基于CDMAB的结合剂，或特异性与结合剂结合的抗体或其它试剂，诸如抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A或植物凝集素。在一个可选择的实施方案中，涉及使用竞争性分析，其中多肽用报告分子基团标记并在将固定的结合剂与样本孵育后能够与所述结合剂结合。所述样本组分抑制标记的多肽与结合剂结合的程度指示样本与固定的结合剂的反应。用于所述分析的合适多肽包括结合剂对其有结合亲和力的全长的肿瘤特异性蛋白和/或其部分。
所述诊断试剂盒带有以本领域技术人员已知的任何材料形式的固体载体，蛋白可以结合到所述载体。合适的实例可以包括微孔板中的测试孔或硝酸纤维素或其它合适的膜。可选择地，所述载体可以是诸如玻璃、纤维玻璃、乳胶的小珠或圆盘，或诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯的塑料。所述载体也可以是磁性颗粒或光纤传感器，诸如例如在美国第5,359,681号专利中公开的那些。
本发明涉及使用在专利和科学文献中详细描述的多种本领域技术人员已知的方法将所述结合剂固定于所述固体载体。术语“固定”既指诸如吸附的非共价结合，又指共价结合。在本发明的上下文中，所述共价结合可以是载体上的试剂和功能团的直接连接，或者可以是通过交联剂的连接。在优选的但非限定性实施方案中，通过吸附固定到微孔板内的孔或固定到膜上是优选的。可以通过将所述结合剂在合适的缓冲液中与固体载体接触合适的时间来实现吸附。接触时间可以随着温度变化，并通常会在约1小时到约1天的范围内。
结合剂与固体载体的共价结合通常通过首先将载体与双功能试剂起反应而完成，所述双功能试剂与载体以及结合剂上诸如羟基或氨基的功能基团起作用。例如，使用苯醌或通过载体上的醛基与结合伴侣上的胺和活性氢的缩合，可以将所述结合试剂共价结合到具有适当的多聚体包被的载体(参见，例如，Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook(Pierce免疫技术目录和手册)，1991，在A12 A13)。
本发明还涉及所述诊断分析试剂盒会采用双抗体的夹心分析的形式。可以通过首先将例如本发明公开的CDMAB的抗体与所述样本接触来进行该分析，以致样本中的多肽能够结合到固定的抗体，所述CDMAB已经被固定于固体载体，通常是微孔板的孔。然后将未结合的样本从固定的多肽-抗体复合物中去除，并加入包含报告分子基团的检测试剂(优选能结合到多肽的不同部位的第二抗体)。然后使用适于特定报告分子基团的方法确定保持与固体载体结合的检测试剂的量。
在具体的实施方案中，涉及一旦抗体被固定于如上所述的载体上，载体上剩余的蛋白结合位点会通过使用本领域技术人员已知的诸如牛血清白蛋白或吐温20TM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)的任何适当的封闭试剂被封闭。然后将固定的抗体与样本孵育，使多肽结合到所述抗体。所述样本可以在孵育前，用诸如磷酸缓冲盐(PBS)的合适稀释剂被稀释。通常，会选择适当的接触时间(即，孵育时间)以对应足以检测多肽在从带有特定选择的肿瘤的个体获得的样本内存在的时间。优选地，所述接触时间足以完成在结合和非结合多肽平衡时达到的结合水平的至少95％的结合水平。本领域的技术人员会认识到可以通过分析一段时间发生的结合水平容易地确定达到平衡所必需的时间。
本发明还涉及然后将未结合的样本通过用合适的缓冲液冲洗固体载体去除。接着包含报告分子基团的第二抗体会被加入到固体载体。然后将检测试剂与固定的抗体多肽复合物孵育一段足以检测结合的多肽的时间。随后，未结合的检测试剂会被去除，而结合的检测试剂会被用报告基团检测。用于检测报告分子基团的方法必定是对所选择的报告分子基团的类型特异的，例如对放射活性基团而言，闪烁计数或放射自显影的方法通常是合适的。可以使用光谱法检测染料、发光基团和荧光基团。可以使用偶联到不同报告分子基团(通常是放射活性或荧光基团或酶)的抗生物素蛋白来检测生物素。酶报告基团通常可以通过添加底物(通常用于特定的时间段)及随后的反应产物的光谱分析或其它分析来检测。
为了利用本发明的诊断分析试剂盒以确定诸如前列腺癌的癌症的存在与否，从保持结合在固定载体的报告分子基团中检测的信号通常会被与对应预定临界值的信号比较。例如，用于检测肿瘤的示例性临界值可以是当固定的抗体被用来自无所述肿瘤的患者的样本孵育时获得的平均信号的平均值。通常，产生高于预定的临界值约三个标准差的信号的样本会被认为是所述肿瘤阳性的。在可选择的实施方案中，依照Sackett et al.，Clinical Epidemiology.A Basic Science for Clinical Medicine(临床流行病学.临床医学的基础科学)，Little Brown and Co.，1985，p.106-7的方法，所述临界值可以通过使用受试者工作特性曲线(Receiver Operator Curve)来确定。在这种实施方案中，所述临界值可以由对应于诊断测试结果的每个可能临界值的成对的真阳性率(即，敏感性)和假阳性率(100％-特异性)的曲线来确定。最接近于左侧转弯上方的曲线上的临界值(即，包括最大面积的值)是最准确的临界值，产生高于由该方法确定的临界值的信号的样本可以被认为是阳性的。可选择地，所述临界值可以沿曲线转移到左侧以使假阳性率最小，或转移到右侧以使假阴性率最小。通常，产生高于由该方法确定的临界值的信号的样本被认为是肿瘤阳性的。
本发明涉及通过所述试剂盒实现的诊断分析会以流动(flow-through)或检验条的形式进行，其中所述结合剂固定于诸如硝酸纤维素的膜上。在流动测试中，样本内的多肽在所述样本通过膜时结合到固定的结合剂。然后第二标记的结合剂在包含所述第二结合剂的溶液流经膜时结合到所述结合剂-多肽复合物。然后可以如上所述进行结合的第二结合剂的检测。在检验条的形式中，结合剂结合的膜的一端会被浸于包含样本的溶液中。所述样本沿着所述膜迁移，经过包含第二结合剂的区域，到达固定的结合剂的部位。第二结合剂在固定的抗体区的浓缩提示肿瘤的存在。可以通过视觉辨认的诸如线的样式在结合部位的产生提示阳性检测。缺乏这样一种样式提示阴性结果。通常，当生物样本包含足以在以如上所述的形式的双抗夹心分析中产生阳性信号的多肽水平时，选择固定于膜上的结合剂的量以产生视觉上可以辨认的样式。用于所述诊断分析的优选结合剂是本发明公开的抗体、其抗原结合片段以及本文描述的任何CDMAB相关结合剂。固定于膜上的抗体量可以是有效产生诊断分析的任何量，并且可以从约25纳克至约1微克变动。通常这样的测试可以用极少量的生物样本来完成。
此外，本发明的CDMAB由于它能识别其靶抗原，可以用于实验室研究。
为了更充分理解本文中描述的发明，进行下述说明。
本发明提供CDMAB(即IDAC 141205-02CDMAB)，其特异性识别和结合IDAC 141205-02抗原。
以保藏号141205-02保藏于IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的CDMAB可以是任何形式，只要其具有竞争性抑制IDAC 141205-02杂交瘤产生的分离的单克隆抗体与其靶抗原的免疫特异性结合的抗原结合区。因此，具有与IDAC 141205-02抗体相同的结合特异性的任何重组蛋白(例如融合蛋白，其中抗体与诸如淋巴因子或肿瘤生长抑制因子的另一种蛋白结合)都在本发明的范围内。
在本发明的一个实施方案中，所述CDMAB是IDAC 141205-02抗体。
在其他实施方案中，所述CDMAB是抗原结合片段，其可以是具有IDAC 141205-02抗体的抗原结合区的Fv分子(例如单链Fv分子)、Fab分子、Fab′分子、F(ab′)2分子、融合蛋白、双特异性抗体、异种抗体或任何重组分子。本发明中的CDMAB针对的抗原决定簇是IDAC 141205-02单克隆抗体针对的抗原决定簇。
本发明中的CDMAB可以被修饰，即通过分子内的氨基酸修饰，以产生衍生分子。也可能是化学修饰。也可能是通过直接的突变、亲和力成熟方法、噬菌体展示或链替换的修饰。
亲和力和特异性可以通过突变CDR和/或苯丙氨酸色氨酸(FW)残基以及筛选具有所需特性的抗原结合位点来修饰或改善(例如，Yang et al.，J.MoI.Biol.，(1995)254：392-403)。一种方式就是使个别残基或残基组合随机排列以使在否则完全相同的抗原结合部位群中，在特定的位置找到两个到二十个氨基酸的亚群。可选择地，可以通过易错聚合酶链反应的方法(例如，Hawkins et al.，J.MoI.Biol.，(1992)226：889-96)诱导整个残基范围的突变。在另一个实施例中，包含重链和轻链可变区基因的噬菌体展示载体可以在大肠杆菌的增变株内繁殖(例如，Low et al.，J.MoI.Biol.，(1996)250：359-68)。这些突变的方法用以说明本领域技术人员已知的许多方法。
增加本发明的抗体的亲和力另一种方式是进行链替换，其中将重链或轻链与另一重链或轻链随机配对以制备具有较高亲和力的抗体。抗体的多种CDRs也可以被用其它抗体中对应的CDRs替换。
衍生分子要保留多肽的功能特性，也就是说，具有这类取代的分子仍能够使所述多肽与IDAC 141205-02抗原或其部分结合。
这些氨基酸取代包括但不必然限于在本领域中已知的“保守”氨基酸取代。
举例来说，被称为“保守氨基酸取代”的某些氨基酸取代能够在蛋白中频繁出现，但并不改变所述蛋白的构象或功能，这是蛋白质化学中已建立的法则。
这些改变包括用异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)的任一种取代任何其他的疏水氨基酸；天门冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，反之亦然；以及丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)，反之亦然。依据特定氨基酸的环境和其在蛋白质三维结构中的作用，其他的取代也可以被认为是保守的。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)可经常互换，丙氨酸和缬氨酸(V)也是。相对疏水的蛋氨酸(M)可以经常与亮氨酸和异亮氨酸互换，有时与缬氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)经常互换，其发生部位氨基酸残基的重要特征是其带电特性，而这两种氨基酸残基的不同的pK并不重要。在特定环境中，仍有其他的变化可以被认为是“保守的”。
实施例1
杂交瘤生产—杂交瘤细胞系AR58A314.1
依据布达佩斯条约，杂交瘤细胞系AR58A314.1于2005年12月14日保藏于加拿大国际微生物保藏单位(IDAC)，位于加拿大马尼托巴省温尼伯市阿林顿街道1015的加拿大卫生部微生物局，R3E 3R2，保藏号为141205-02。依据37 CFR 1.808的规定，保藏者保证在专利授权时将不可撤销地取消对公众获取该保藏材料的所有限制。
为了制备产生AR58A314.1抗癌抗体的杂交瘤，在PBS中制备冷冻的结肠肿瘤组织(Genomics Collaborative，Cambridge，MA)的单细胞悬浮液。将IMMUNEASYTM(Qiagen，Venlo，Netherlands)佐剂轻轻混合后备用。通过皮下注射含2百万个细胞的50微升抗原-佐剂来免疫5到7周龄的BALB/c小鼠。初次免疫后2到5周，用新鲜制备的含2百万个细胞的50微升抗原-佐剂腹腔注射加强免疫鼠。末次免疫后第3天，取出脾脏用于融合。将分离的脾细胞与NSO-1骨髓瘤细胞伴侣融合，制备杂交瘤。检测所述杂交瘤亚克隆融合的上清。
为了确定杂交瘤细胞分泌的抗体是IgG，还是IgM同种型，进行ELISA分析。将4℃包被缓冲液(0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH9.2至9.6)中的浓度为2.4微克/mL的山羊抗小鼠的IgG+IgM(H+L)，按100微升/孔加入ELISA板过夜。该ELISA板用洗涤缓冲液(PBS+0.05％吐温-20)洗三次。按100微升/孔将封闭缓冲液(5％奶洗涤缓冲液)加入到板中，室温1小时，随后在洗涤缓冲液中洗三次。按100微升/孔加入杂交瘤上清，并将该板室温孵育1小时。所述板用洗涤缓冲液洗三次，按100微升/孔加入山羊抗小鼠的IgG或IgM辣根过氧化物酶偶联物的1/100,000稀释液(用含1％奶的PBS稀释)。将所述板在室温孵育1小时后，该板用洗涤缓冲液洗三次。按100微升/孔加入TMB溶液，室温孵育1-3分钟。通过加入50微升/孔的2M H2SO4终止颜色反应，并用Perkin-ElmerHTS7000酶标仪在450nm波长处读板。如图1所示，AR58A314.1杂交瘤主要分泌IgG同种型抗体。
为了确定杂交瘤细胞分泌抗体的亚类，使用小鼠单克隆抗体同种型分析试剂盒(Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit)(GE Healthcare，Baie d’Urfé，Quebec)进行同种型分型(isotyping)实验。将含抗体的杂交瘤上清(在用TBS-T稀释的1:10稀释液中)加到带有同种型条(isotyping strip)的试管中，所述同种型条携带特异性识别不同类型肽链的山羊抗体。搅动试管15分钟。然后在搅拌下用TBS-T将该同种型条洗两次，每次5分钟。将过氧化物酶标记的、种属特异性的抗小鼠抗体(在用TBS-T稀释的1:500稀释液中)加入到试管中反应15分钟，以检测结合于该条上的山羊抗体的单克隆抗体。在搅拌下用TBS-T将该条再洗涤两次，每次5分钟。然后用过氧化物酶底物系统检测结合于该条的过氧化物酶标记的抗体。将一片30mg的4-氯-1-萘酚溶于10mL冷乙醇中，并将一滴过氧化氢溶液(30％的体积比)稀释于50mL的TBS中。该两种液体在使用前直接混合，取3mL加入到同种型条，搅拌15分钟。然后弃除该底物溶液，并在搅拌下用5mL蒸馏水洗涤该条3次。从试管中取出该分型条，分析结果。抗癌抗体AR58A314.1为IgG1，κ同种型。
经过一轮限制稀释，在细胞ELISA分析中，检测杂交瘤上清中与靶细胞结合的抗体。检测了1种人乳腺癌细胞系、1种人卵巢癌细胞系、2种人结肠癌细胞系和1种人正常皮肤细胞系：分别是MDA-MB-231(MB-231)，OVCAR-3，SW1116，Lovo和CCD-27sk。所述细胞系均获自美国典型培养物保存中心(ATCC；Manassas，VA)。板内的细胞在使用前先固定。室温下，该板用含MgCl2和CaCl2的PBS洗三次。每孔加入PBS稀释的2％的多聚甲醛100微升，室温10分钟，然后弃掉多聚甲醛。再用含MgCl2和CaCl2的PBS在室温下洗涤该板三次。每孔加入100微升5％奶洗涤液(PBS+0.05％吐温-20)进行封闭，室温1小时。该板用洗涤液洗三次，按75微升/孔加入杂交瘤上清，室温孵育1小时。用洗涤缓冲液将该板洗三次，按100微升/孔加入与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠的IgG抗体的1/25,000稀释液(用含1％奶的PBS稀释)。室温孵育1小时后，该板用洗涤缓冲液洗三次，每孔加入100微升TMB底物，室温孵育1-3分钟。每孔加入50微升的2M硫酸终止反应，并用Perkin-ElmerHTS7000酶标仪在450nm波长处读板。如图2列表所示，结果表示为与内部(in-house)的IgG同种型对照相比，高出背景的倍数，事先已经证明所述对照不与所检测的细胞系结合。来自AR58A314.1杂交瘤的抗体显示与所测试的任何细胞系没有可检测的结合。
进行抗体结合试验的同时，在MDA-MB-231(MB-231)、OVCAR-3、SW1116、Lovo和CCD-27sk这些细胞系上，检测了杂交瘤上清的细胞毒性作用。钙黄绿素(calcein)AM购自Molecular Probes(Eugene，OR)公司。根据厂商的说明并作下述的改动后进行所述分析。在分析前，将细胞根据预先确定的适当密度进行铺板。两天后，将75微升来自杂交瘤微孔板的上清转移到细胞培养板中，在5％ CO2孵箱中孵育5天。将阳性对照孔吸净，加入100微升叠氮钠(NaN3)或放线菌酮或抗-EGFR抗体(c225；5微克/mL)。经过5天的处理后，倒空反应板的液体并吸干。将来自多通道挤瓶的含MgCl2和CaCl2的室温DPBS(Dulbecco′s磷酸盐缓冲液)分到每孔中，叩打三次，倒出液体并吸干。每孔加入50微升稀释于含有MgCl2和CaCl2的DPBS中的荧光染料钙黄绿素，并在37℃含5％ CO2的孵箱内孵育30分钟。该板置于Perkin-Elmer HTS7000荧光读板仪内读数，数据用Microsoft Excel进行分析。结果在图1的表格中列出。AR58A314.1杂交瘤上清对OVCAR-3细胞产生了13％、对SW1116细胞产生了13％、以及对Lovo细胞产生了12％的特异的细胞毒性作用。对OVCAR-3细胞的细胞毒性作用分别是用阳性对照叠氮钠和放线菌酮获得的细胞毒性作用的24％和43％。对SW1116细胞产生的13％的细胞毒性作用分别是用c225和放线菌酮获得的细胞毒性作用的41％和65％。最后，对Lovo细胞产生的12％的细胞毒性作用是用放线菌酮获得的细胞毒性作用的26％。图1的结果表明AR58A314.1的细胞毒效应并不与其对这些癌细胞型的结合水平成正比。如图1列表所示，AR58A314.1对CCD-27sk正常细胞系没有产生细胞毒性作用。已知的非特异性的细胞毒物质放线菌酮和叠氮钠以及抗-EGFR抗体c225普遍产生了预期的细胞毒性作用。
实施例2
体外结合
通过在CL-1000瓶(BD Biosciences，Oakville，ON)中培养所述杂交瘤来制备AR58A314.1单克隆抗体，每星期进行两次收集和再接种。然后用蛋白G琼脂糖4快流(Protein G Sepharose 4 Fast Flow)(AmershamBiosciences，Baie d′Urfé，QC)进行标准的抗体纯化操作。利用去免疫化的、人源化的、嵌合的或鼠源化的单克隆抗体均属于本发明的范围。
用流式细胞仪(FACS)评价了AR58A314.1与乳腺(MB-231)、结肠(DLD-1，Lovo，SW1116和SW620)、肺脏(A549)、前列腺(PC-3)、卵巢(OVCAR-3)和胰腺(AsPC-1和BxPC-3)的癌细胞系，以及来自皮肤(CCD-27sk)和肺脏(Hs888.Lu)的非癌细胞系的结合。所有细胞系均获自美国典型培养物保存中心(ATCC，Manassas，VA)。
通过首先用DPBS(不含钙离子和镁离子)洗涤单层细胞来制备用于流式细胞术(FACS)的细胞。然后在37℃条件下，用细胞解离缓冲液(INVITROGEN，Burlington，ON)将细胞从它们的细胞培养板上分离出来。离心收集细胞后，在4℃下，将细胞重悬在含MgCl2、CaCl2和2％胎牛血清的DPBS(标记培养液)中并计数，等分到合适的细胞密度，离心沉淀细胞并在测试抗体(AR58A314.1)或对照抗体(同种型对照，抗-EGFR)存在下，将细胞重悬在4℃的标记液中。同种型对照和测试抗体在20μg/ml浓度下置于冰上30分钟被评估，而抗-EGFR在5μg/ml浓度下置于冰上30分钟被评估。在加Alexa Fluor 546偶联的二抗前，将所述细胞用标记液洗一次。然后加入溶于标记培养液中的Alexa Fluor 546偶联的抗体，4℃置30分钟。最后洗涤一次细胞，并将其重悬在固定培养基(含1.5％多聚甲醛的标记培养液)中。通过在使用FACSarrayTM系统软件(BD Biosciences，Oakville，ON)的FACSarrayTM上运行样本来评估流式细胞计数的细胞获取结果。通过调整前向角散射(FSC)和侧向角散射(SSC)探测器上的电压和振幅，设置细胞的FSC和SSC。运行未标记的细胞来调整荧光(Alexa-546)通道的探测器，使这些细胞有一个统一的约为1至5单位的中等荧光强度的波峰。对于每一个样本，约需要获取10,000个门事件(标记的固定细胞)，用于分析，结果见图3。
图2以高出同种型对照的倍增表示平均荧光强度。图3汇集了AR58A314.1抗体代表性的直方图。AR58A314.1对结肠癌细胞系DLD-1、Lovo、SW1116和SW620(1.8倍、2.0倍、2.1倍和8.5倍)以及对卵巢癌细胞系(OVCAR-3)显示出结合。在这些条件下，未检测到对CCD-27sk正常皮肤细胞系和Hs888.Lu细胞系的结合。显然从实施例1中，使用细胞ELISA不能检测到AR58A310.1对OVCAR-3卵巢癌细胞系以及对SW1116和Lovo结肠癌细胞系的结合。然而，使用FACS显示了可检测的结合，说明在这些条件下，FACS是更为敏感的结合分析。
实施例3
在体A549细胞的肿瘤实验
实施例1和2表明AR58A314.1有针对人癌细胞系的抗癌特性，对几种不同的癌症有可检测的结合。参见图4和5，颈背皮下注射的100微升生理盐水中的1百万个人肺癌细胞(A549)植入到4至6周的雌性SCID小鼠。这些小鼠被随机分成两个治疗组，每组5只。移植癌细胞后第一天，每组小鼠腹腔给予300微升的AR58A314.1测试抗体(20mg/kg)或缓冲液对照，所述液体由含2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl和20mMNa2HPO4的稀释液将储存液稀后得到。随后抗体组和对照组在整个研究期间以相同的方式每周给药一次。大约每7天用测径器测量肿瘤生长。研究在7次注射(48天)后结束，因为动物由于大溃疡性损伤达到CCAC的终点。在整个研究期间，一周记录一次动物的体重。研究结束时，依据CCAC的指导方针，所有的动物都采取安乐死。
在人肺癌的高侵入性(aggressive)A549预防性体内模型中，AR58A314.1抑制肿瘤生长。在植入后的第48天，也是最后一次给药后第5天，AR58A314.1治疗组肿瘤的平均体积比缓冲液对照治疗组肿瘤体积小48.6％(图4)。因为最终时间点的测量受到研究结束前由于溃疡损害所致的小鼠缺失的影响，该结果没有达到显著性。
在整个研究中，没有出现临床毒性症状。每周测得的体重用做动物健康和发育停止的指标。如图5所示，整个研究期间，对照组或AR58A314.1治疗组的体重没有显著差异。在治疗期结束时，两组间的体重也没有差异(p＝0.829，t-检验)。
因此，AR58A314.1在该人类肺癌异种移植模型中被良好地耐受，并降低了肿瘤的负荷。
实施例4
在体BxPC-3细胞的肿瘤实验
实施例3表明AR58A314.1有抗人类肺癌细胞系的抗癌特性。为了确定AR58A314.1对人类胰腺细胞系的功效，在BxPC-3人类胰腺癌异种移植模型上检测了所述抗体。参见图6和7，颈背皮下注射的100微升生理盐水中的5百万个人胰腺癌细胞(BxPC-3)植入到4至6周雌性SCID小鼠。这些小鼠被随机分成两个治疗组，每组5只。植入癌细胞后第一天，每组小鼠腹腔给予300微升的AR58A314.1测试抗体(20mg/kg)或缓冲液对照，所述液体由含2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl和20mMNa2HPO4的稀释液将储存液稀释后得到。随后在整个研究过程中，抗体组和对照组以相同的方式每周给药一次，总共8次剂量。大约每7天用测径器测量肿瘤生长。在研究过程中，一周记录一次动物的体重。研究结束时，依据CCAC的指导方针，所有的动物都采取安乐死。
在人胰腺癌BxPC-3预防性体内模型中，AR58A314.1导致了肿瘤生长的抑制。在植入后的第56天，也是最后一次给药后第6天，AR58A314.1治疗组肿瘤的平均体积比缓冲液对照治疗组肿瘤体积小29％(图6)。在治疗后随访期(第63天)，AR58A314.1治疗组诱导的肿瘤抑制增加到45.8％。由于观测到的每组内小鼠间的变异性，这些结果没有达到显著性。
在整个实验过程中，没有出现临床毒性症状。每周一次测的体重作为动物健康和发育停止的指标。如图7所示，在整个实验过程中，对照组或AR58A314.1治疗组的体重没有降低。在治疗期结束时(第48天；p＝0.059，t-检验)或在治疗后随访期结束时(第63天；p＝0.1479，t-检验)，两组间的体重也没有差异。
因此，AR58A314.1在该人类胰腺癌异种移植模型中被良好地耐受，并降低了肿瘤的负荷。AR58A314.1对两种不同的人类癌症(胰腺癌和肺癌)表现出功效。在几种公认的人癌症疾病模型中观察到了治疗益处，这表明了该抗体用于治疗包括人的其它哺乳动物的药理和药学益处。
实施例5
人正常组织和多种肿瘤组织染色
进行免疫组化(IHC)研究以表现AR58A314.1抗原在人的分布特征。切片用冷(-20℃)丙酮后固定10分钟，然后回到室温。使用人正常器官组织和肿瘤器官组织筛选阵列(Tri Star，Rockville，MD)进行抗体与4种人正常(结肠、肺脏、前列腺和乳腺)和16种人肿瘤组织(结肠、肺脏、前列腺和乳腺各4种)的结合。
切片在4℃冷磷酸缓冲盐(PBS)中洗三次，每次2分钟，随后在3％过氧化氢中洗涤10分钟封闭内源性过氧化物酶活性。然后将切片在PBS中洗3次，每次5分钟，随后在通用的封闭液(Dako，Toronto，Ontario)中于室温孵育5分钟。将AR58A314.1、抗-人肌肉肌动蛋白(克隆HHF35，Dako，Toronto，Ontario)或同种型对照抗体(靶向黑曲霉(Aspergillus niger)葡萄糖氧化酶，一种在哺乳动物组织中不存在也不可诱导的酶；Dako，Toronto，Ontario)在抗体稀释缓冲液中稀释到其工作浓度(每种抗体都是5μg/mL，除了抗-肌动蛋白是0.5μg/mL外)，并孵育过夜，在室温1小时。用PBS洗涤切片3次，每次2分钟。用提供的HRP偶联的二抗(Dako Envision System，Toronto，Ontario)来检测/显现一抗的免疫活性，室温孵育30分钟。这步之后，将切片用PBS洗3次，每次5分钟，然后通过加入DAB(3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐，Dako，Toronto，Ontario)显色底物液在室温下进行免疫过氧化物酶染色10分钟，发生颜色反应。自来水冲洗切片，终止显色反应。切片用Meyer′s苏木精(Sigma Diagnostics，Oakville，ON)复染后，用梯度酒精(75至100％)脱水并用二甲苯透明。使用封固剂(Dako Faramount，Toronto，Ontario)封片。使用Axiovert 200(Zeiss Canada，Toronto，ON)显微观察切片，并用Northern Eclipse成像软件(Mississauga，ON)获取和储存数字图像。结果由组织病理学家读取、评分和解释。
图8显示了人正常组织和肿瘤组织阵列的AR58A314.1染色的结果汇总。所述AR58A314.1抗体显示了对1/4的结肠癌和2/4的肺癌的结合(图9)，对任何一种所测试的正常组织都没有结合。这些结果与FACS结合数据(图1和2)一致，这也证明了与正常细胞相比，该抗体特异性结合于癌细胞。AR58A314.1的结合限于组织切片内的肿瘤细胞，并且细胞的定位是细胞质的和膜的。这些结果表明AR58A314.1表达于几种不同的肿瘤类型。此外，AR58A314.1针对的抗原并不在正常组织广泛表达，这表明所述抗体特异性与人类有限数目的组织结合。
实施例6
人正常组织染色
扩大对人正常组织的IHC研究以评估AR58A314.1抗原在人的分布。使用人正常组织微阵列(Biochain，CA，USA)进行抗体与20种人正常组织(肾上腺、卵巢、胰腺、甲状腺、脑(大脑)、脑(小脑)、肺、脾、子宫、宫颈、乳腺、胎盘、心脏、皮肤、骨骼肌、肾、胃、小肠、肝脏和唾液腺)的结合。
使用的IHC方法、抗体浓度和同种型对照与实施例5中提及的相同，除了抗-肌动蛋白(使用的是2微克/mL)。使用Axiovert 200(Zeiss Canada，Toronto，ON)显微观察切片，并用Northern Eclipse成像软件(Mississauga，ON)获取和储存数字图像。结果由组织病理学家读取、评分和解释。
图10显示了人正常组织阵列中AR58A314.1染色结果的总结。AR58A314.1抗体没有显示对任何一种所测试的组织的结合(图11)。20种组织样本中有8种由于在阴性同种型对照中观察到背景染色而没有被评分。阳性抗体对照，抗-肌动蛋白，对肌肉组织显示出预期的结合。
AR58A314.1没有显示对所测试的人正常组织的结合，这与在上述实施例中的观察是一致的，并进一步表明由所述抗体靶向的抗原决定簇在肿瘤组织与正常组织内的差异表达。
实施例7
竞争性结合剂的分离
给定一种抗体，本领域的技术人员能够制备例如竞争性抗体的竞争性抑制CDMAB，其是与给定抗体识别相同抗原决定簇的抗体(Belanger Let al.Clinica Chimica Acta 48：15-18(1973))。一种方法是用表达该抗体识别抗原的免疫原产生免疫。该样本可以包括但不限于组织、分离的蛋白或细胞系。可以用诸如ELISA、FACS或Western印迹的竞争分析来筛选产生的杂交瘤，所述竞争分析能鉴别抑制所测试抗体结合的抗体。另一种方法可以利用噬菌体展示抗体库，淘选识别所述抗原至少一个抗原决定簇的抗体(Rubinstein JL et al.Anal Biochem 314：294-300(2003))。在任何一种情况下，抗体的选择都是基于它们能够取代原始标记的抗体与其靶抗原的至少一个决定簇的结合。因此这种抗体具有识别原始抗体识别的至少一个抗原决定簇的特性。
实施例8
AR58A314.1单克隆抗体的可变区的克隆
由AR58A314.1杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的序列可以被确定。可以使用包括用异硫氰酸胍的细胞增溶作用的标准方法从所述杂交瘤中提取编码免疫球蛋白的重链和轻链的RNA(Chirgwin et al.Biochem.18：5294-5299(1979))。通过本领域已知的PCR方法学(Sambrook et al.，eds.，Molecular Cloning(分子克隆)，第14章，冷泉港实验室出版社，N.Y.(1989))，可以使用mRNA制备用于随后VH和VL基因分离的cDNA。重链和轻链的N-末端氨基酸序列可以分别由自动化的Edman测序来确定。CDRs和侧翼FRs的进一步伸展也可以由VH和VL片段的氨基酸序列确定。然后可以设计合成引物用于分离AR58A314.1单克隆抗体的VH和VL基因，并可以将所分离的基因连接到用于序列测定的适当载体。为了产生嵌合的和人源化的IgG，可以将可变的轻链区和可变的重链区亚克隆入用于表达的适当载体。
在另一个实施方案中，AR58A314.1或其去免疫化的、嵌合的或人源化的抗体通过在转基因动物内表达编码所述抗体的核酸被产生，这样所述抗体被表达且可以被回收。例如，可以以促进回收和纯化的组织特异性方式表达所述抗体。在一个这样的实施方案中，本发明的抗体表达于乳腺用于哺乳期的分泌。转基因动物包括但不限于小鼠、山羊和兔。
(i)单克隆抗体
使用常规的操作(例如，通过使用能够特异性结合于编码所述单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)很容易分离编码单克隆抗体的DNA(如实施例1中所述)并对DNA进行测序。杂交瘤细胞是这种DNA的优选来源。所述DNA一旦被分离，就可以被置于表达载体内，然后将所述载体转染入诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞的宿主细胞以在重组的宿主细胞内以实现单克隆抗体的合成，否则这些细胞不产生免疫球蛋白。所述DNA也可以被修饰，例如，通过用人重链和轻链恒定区的编码序列替代同源的鼠序列。使用合成蛋白质化学中已知的方法，包括涉及交联剂的那些方法，也可以在体外制备嵌合的或杂交的抗体。例如，利用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键可以构建免疫毒素。用于该目的的合适试剂的实例包括亚胺基硫醇盐和4-甲基-巯基丁基酰胺化物。
(ii)人源化抗体
人源化抗体具有从非人类来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人类的氨基酸残基经常被称为“输入”残基，其通常来自“输入”可变区。依照Winter和合作者的方法，可以通过用啮齿类CDRs或CDR序列替代人抗体的相应序列进行人源化操作(Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen et al，Science 239：1534-1536(1988)；在Clark，Immunol.Today 21：397-402(2000)中被综述)。
可以通过亲代序列和多种概念上的人源化产物的分析方法，利用亲代序列和人源化序列的三维模型来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可得到的并为本领域的技术人员所熟悉。可利用计算机程序示例和显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。检验这些显示能够分析残基在候选的免疫球蛋白序列中可能的作用，即分析影响所述候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，FR残基可以从共有序列和输入序列中被选择和结合，以实现所需的抗体特性，诸如增加对靶抗原的亲和力。通常，CDR残基直接和最大程度上参与影响抗原结合。
(iii)抗体片段
已开发了多种制备抗体片段的技术。这些片段可以通过重组的宿主细胞来制备(在Hudson，Curr.Opin.Immunol.11：548-557(1999)；Little etal.，Immunol.Today 21：364-370(2000)中被综述)。例如，可以从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段并将其以化学方法偶联以形成F(ab′)2片段(Carteret al.，Biotechnology 10：163-167(1992))。在另一个实施方案中，使用亮氨酸拉链GCN4促进F(ab′)2分子的装配以形成F(ab′)2。根据另一种方法，Fv、Fab或F(ab′)2片段可以从重组的宿主细胞培养物中直接被分离。
实施例9
包含本发明所述的抗体的组合物
本发明所述的抗体可以用作预防/治疗癌症的组合物。包含本发明所述抗体的用于预防/治疗癌症的组合物是低毒性的，并且能够在它们是液体制剂的形式时或作为合适制剂的药物组合物经口或经胃肠外(例如，血管内、腹腔、皮下等)给予人或哺乳动物(例如，大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、犬、猿猴等)。可以给予本发明所述的抗体本身，或可以将其作为适当的组合物给予。用于给药的组合物可以包含携带本发明所述的抗体或其盐的药物上可以接受的载体、稀释剂或赋形剂。这样一种组合物具有适合口服给药或胃肠外给药的药物制剂的形式。
用于胃肠外给药的组合物的实例是可注射的制剂、栓剂等。所述可注射的制剂可以包括诸如静脉内的、皮下的、皮内的和肌肉内的注射、点滴、关节腔内注射等剂型。可以通过公知的方法制备这些可注射的制剂。例如，可以通过将本发明的抗体或其盐在常规用于注射的无菌水介质或油介质中溶解、悬浮或乳化来制备所述的可注射制剂。例如生理盐水，一种含有葡萄糖和其它辅助剂等的等渗液作为用于注射的水介质，其可以与诸如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂(例如，聚山梨酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50摩尔)加合物)等适当的增溶剂组合使用。使用例如芝麻油、大豆油等作为油介质，其可以与诸如苯甲酸苄酯、苯甲醇等增溶性组合使用。这样制备的注射剂通常装入合适的安瓶。用于直肠给药的栓剂可以通过将本发明的抗体或其盐与常规的栓剂基质混合来制备。用于口服给药的组合物包括固体或液体制剂，特别是片剂(包括糖锭剂和薄膜衣片)、丸剂、颗粒剂、粉状制剂、胶囊(包括软胶囊)、糖浆剂、乳状剂、悬浮剂等。这样一种组合物可以通过公知的方法制备，并可以包含常规用于药物制剂领域的载体、稀释剂或赋形剂。用于片剂的载体或赋形剂的实例是乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁等。
优选地，上述用于口服或胃肠外使用的组合物被制备成药物制剂，所述药物制剂的单位剂量被调适到适合活性成分的一次剂量。这种单位剂量制剂包括，例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓶)、栓剂等。所包含的前述化合物的量通常是每剂量单位形式5至500mg；包含的上述抗体优选为约5mg至约100mg，特别是在注射形式时，对于其它形式，优选包含上述抗体10至250mg。
取决于欲给药的个体、目标疾病、症状、给药途径等，前述包含本发明的抗体的预防/治疗性试剂或调节剂的剂量可以变动。例如，当用于治疗/预防例如成年个体的乳腺癌目的时，以约0.01至约20mg/kg体重的剂量通过静脉注射给予本发明的抗体是有利的，优选约0.1至约10mg/kg体重且更优选地约0.1至约5mg/kg，每天约1至5次，优选每天约1至3次。在其它胃肠外和口服给药中，以与上面给出的剂量相应的剂量给予所述试剂。当症状特别严重时，可以根据症状增加剂量。
本发明的抗体可以单独给予或以适当组合物的形式给予。用于给药的组合物可以包含携带前述抗体或其盐的药物上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这样一种组合物具有适合口服或胃肠外(例如，静脉内注射、皮下注射等)给药的药物制剂的形式。上述每一种组合物还可以包含其它的活性成分。此外，本发明的抗体可以用于与其它药物的组合，例如，烷化剂(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺等)、代谢拮抗剂(例如，甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶等)、抗肿瘤抗生素类(例如，丝裂霉素、阿霉素等)、植物来源的抗肿瘤剂(例如，长春新碱、长春地辛、紫杉醇注射液等)、顺铂、卡铂、依托泊甙、伊立替康等。可以将本发明所述的抗体和上述药物同时给予患者或在不同的时间给予患者。
本文所述的治疗方法，特别是针对癌症的治疗方法，也可以用给予其它抗体或化疗剂来实施。例如，也可以给予诸如
Figure A200780012709D00491
的针对EGFR的抗体，特别是当治疗结肠癌时。已经表明
Figure A200780012709D00501
用于银屑病的治疗是有效的。用于联合使用的其它抗体包括
Figure A200780012709D00502
特别当治疗乳腺癌时；包括特别当治疗结肠癌时；以及包括SGN-15，特别当治疗非小细胞肺癌时。可以将本发明所述的抗体与其它抗体/化疗剂通过相同的或不同的途径同时或分别给予。
使用的化疗剂/其它抗体的方案包括任何被认为最适于患者症状治疗的方案。不同的恶性肿瘤需要使用特定的抗肿瘤抗体和特定的化疗剂，这将根据患者确定。在本发明优选的实施方案中，化疗与抗体治疗同时给予，或更优选地，化疗在抗体治疗后给予。然而，需要强调的是，本发明并不限于任何特定的给药方法或途径。
此优势证据表明AR58A314.1通过癌细胞系和人肿瘤组织上的抗原决定簇的连接(ligation)介导了抗癌作用。进一步表明，利用例如但并不限于FACS、细胞ELISA或IHC等技术，AR58A314.1抗体可以用于检测表达与之特异性结合的抗原决定簇的细胞和/或组织。
本说明书中提及的所有专利和公开出版物代表了本发明所属领域的技术人员的水平。所有专利和公开出版物通过引用的方式并入本文，其引用程度如同每个出版物被特别单独地指明以引用的方式并入本文。
应该明白，尽管本发明以某种形式被说明，但这不是要将本发明限定在本文所描述和显示的特定形式或布局。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的范围的前提下还可做出各种变化，且不应当认为本发明限于本说明书中显示和描述的内容。本领域的技术人员很容易看出使本发明较好地适合实现所描述的目的并获得提及的结果和益处，以及其中固有的部分。本文中描述的任一寡核苷酸、肽、多肽、生物相关化合物、方法、流程和技术都是优选实施方案中有代表性的，其目的在于示例，并不是限制本发明的范围。本领域的技术人员能够想到包括在本发明精神的范畴内的变化和其它用途，并由所附权利要求书的范围所限定。尽管借助特定的优选实施方案描述了本发明，但是应理解所要求保护的本发明并不仅仅局限于这些特定的实施方案。事实上，所描述的实施本发明的方式的各种变化，对本领域的技术人员来说是显而易见的，均在所附权利要求书的范围内。
Figure A200780012709D00511
Figure A200780012709D00521

Claims (50)

1.由杂交瘤产生的分离的单克隆抗体，该杂交瘤保藏于IDAC，保藏号为141205-02。
2.权利要求1所述的分离的单克隆抗体的CDMAB。
3.由以保藏号141205-02保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体或者从所述人源化抗体产生的抗原结合片段。
4.权利要求3所述的人源化抗体的CDMAB。
5.由以保藏号141205-02保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体或者从所述嵌合抗体产生的抗原结合片段。
6.权利要求5所述的嵌合抗体的CDMAB。
7.权利要求1、2、3、4、5或6中的任一项所述的分离的抗体或其CDMAB，其与选自细胞毒部分、酶、放射活性化合物、细胞因子、干扰素、靶标部分或报告分子部分和造血细胞的成员偶联。
8.分离的杂交瘤细胞系，以保藏号141205-02保藏在IDAC。
9.引发抗体诱导的选自人类肺、胰腺、卵巢或结肠肿瘤组织样本中癌细胞的细胞毒性作用的方法，其包括：
提供来自所述人类肺、胰腺、卵巢或结肠肿瘤的组织样本；
提供由以保藏号141205-02保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体、由以保藏号141205-02保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体、由以保藏号141205-02保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体或其CDMAB，该CDMAB的特征在于具有竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力；以及
将所述的分离的单克隆抗体、所述人源化抗体、所述嵌合抗体或其CDMAB与所述组织样本接触；
其中所述分离的单克隆抗体、所述人源化抗体、所述嵌合抗体或其CDMAB与所述组织样本的结合诱导细胞毒性作用。
10.减小哺乳动物内对抗体诱导的细胞毒作用敏感的人类肺、胰腺、卵巢或结肠肿瘤的方法，其中所述人类肿瘤至少表达一种特异性结合于由保藏于IDAC、保藏号为141205-02的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMA的抗原决定簇，该CDMAB的特征在于具有竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述方法包括给予所述哺乳动物有效导致所述哺乳动物的肺、胰腺、卵巢或结肠肿瘤负荷降低的量的所述单克隆抗体或所述其CDMAB。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体偶联到细胞毒性部分。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB激活补体。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB介导抗体依赖性细胞的细胞毒性作用。
15.如权利要求10所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141205-02保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体或者从所述人源化抗体产生的抗原结合片段。
16.如权利要求10所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141205-02保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体或者从所述嵌合抗体产生的抗原结合片段。
17.特异性结合于一个或多个抗原决定簇的单克隆抗体，所述抗原决定簇与由以保藏号141205-02保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体结合的抗原决定簇相同。
18.减小哺乳动物内人类肺、胰腺、卵巢或结肠肿瘤的方法，其中所述人类肺、胰腺、卵巢或结肠肿瘤至少表达一种特异性结合于由保藏于IDAC、保藏号为141205-02的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMA的抗原决定簇，该CDMAB的特征在于具有竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述方法包括给予所述哺乳动物导致所述哺乳动物的肺、胰腺、卵巢或结肠肿瘤负荷降低的有效量的所述单克隆抗体或所述其CDMAB。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细胞毒性部分偶联。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述的细胞毒性部分是放射性同位素。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB激活补体。
22.如权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB介导抗体依赖性细胞的细胞毒性作用。
23.如权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141205-02保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体或者从所述人源化抗体产生的抗原结合片段。
24.如权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141205-02保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体或者从所述嵌合抗体产生的抗原结合片段。
25.减小哺乳动物内人类肺、胰腺、卵巢或结肠肿瘤的方法，其中所述人类肺、胰腺、卵巢或结肠肿瘤至少表达一种特异性结合于由保藏于IDAC、保藏号为141205-02的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMA的抗原决定簇，该CDMAB的特征在于具有竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述方法包括给予所述哺乳动物有效导致所述哺乳动物的肺、胰腺、卵巢或结肠肿瘤负荷降低的量的、与至少一种化疗剂联用的所述单克隆抗体或其CDMAB。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细胞毒性部分偶联。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
28.如权利要求25所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB激活补体。
29.如权利要求25所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB介导抗体依赖性细胞的细胞毒性作用。
30.如权利要求25所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141205-02保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体或者从所述人源化抗体产生的抗原结合片段。
31.如权利要求25所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141205-02保藏在IDAC的杂交瘤产生的所述分离的单克隆抗体的嵌合抗体或者从所述嵌合抗体产生的抗原结合片段。
32.确定选自人类肿瘤的组织样本中癌细胞存在的结合分析，所述癌细胞被IDAC保藏号为141205-02的AR58A314.1杂交瘤细胞系产生的分离的单克隆抗体、由以保藏号141205-02保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体或由以保藏号141205-02保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体特异性结合，所述分析包括：
提供来自所述人类肿瘤的组织样本；
提供至少一种所述分离的单克隆抗体、所述人源化抗体、所述嵌合抗体或其CDMAB，其识别的一种或多种抗原决定簇与AR58A314.1杂交瘤细胞系产生的分离的单克隆抗体识别的抗原决定簇相同，该杂交瘤细胞系在IDAC的保藏号为141205-02；
将至少一种所述提供的抗体或其CDMAB与所述组织样本接触；以及
确定所述至少一种提供的抗体或其CDMAB与所述组织样本的结合；
由此指示在所述组织样本中所述癌细胞的存在。
33.单克隆抗体降低人类肺、胰腺、卵巢或结肠肿瘤负荷的用途，其中所述人类肺、胰腺、卵巢或结肠肿瘤至少表达一种特异性结合于由保藏于IDAC、保藏号为141205-02的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMA的抗原决定簇，该CDMAB的特征在于具有竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述用途包括给予所述哺乳动物有效导致所述哺乳动物的人类肺、胰腺、卵巢或结肠肿瘤负荷降低的量的所述单克隆抗体或其CDMAB。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细胞毒性部分偶联。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
36.如权利要求33所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB激活补体。
37.如权利要求33所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB介导抗体依赖性细胞的细胞毒性作用。
38.如权利要求33所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141205-02保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体或者从所述人源化抗体产生的抗原结合片段。
39.如权利要求33所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141205-02保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体或者从所述嵌合抗体产生的抗原结合片段。
40.单克隆抗体降低人类肺、胰腺、卵巢或结肠肿瘤负荷的用途，其中所述人类肺、胰腺、卵巢或结肠肿瘤至少表达一种特异性结合于由保藏于IDAC、保藏号为141205-02的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMAB的抗原决定簇，该CDMAB的特征在于具有竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述用途包括给予所述哺乳动物有效导致所述哺乳动物的人类肺、胰腺、卵巢或结肠肿瘤负荷降低的量的、与至少一种化疗剂联用的所述单克隆抗体或其CDMAB。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细胞毒性部分偶联。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
43.如权利要求40所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB激活补体。
44.如权利要求40所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB介导抗体依赖性细胞的细胞毒性作用。
45.如权利要求40所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141205-02保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体或者从所述人源化抗体产生的抗原结合片段。
46.如权利要求40所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141205-02保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体或者从所述嵌合抗体产生的抗原结合片段。
47.对治疗人类癌性肿瘤有效的组合物，所述组合物包括下列组合：
权利要求1、2、3、6、7、8或17中的任一项所述的抗体或CDMAB；
所述抗体或其抗原结合片段与选自细胞毒性部分、酶、放射性化合物、细胞因子、干扰素、靶标部分或报告分子部分以及造血细胞的成员的偶联物；以及
必需量的药学上可接受的载体；
其中所述组合物对治疗所述人类癌性肿瘤是有效的。
48.对治疗人类癌性肿瘤有效的组合物，所述组合物包括下列组合：
权利要求1、2、3、6、7、8或17中的任一项所述的抗体或CDMAB；以及
必需量的药学上可接受的载体；
其中所述的组合物对治疗所述人类癌性肿瘤是有效的。
49.对治疗人类癌性肿瘤有效的组合物，所述组合物包括下列组合：
权利要求1、2、3、6、7、8或17中的任一项所述的抗体、抗原结合片段或CDMAB与选自细胞毒性部分、酶、放射性化合物、细胞因子、干扰素、靶标部分或报告分子部分以及造血细胞的成员的偶联物；以及
必需量的药学上可接受的载体；
其中所述的组合物对治疗所述人类癌性肿瘤是有效的。
50.检测人类癌性肿瘤存在的分析试剂盒，其中所述人类癌性肿瘤至少表达一种特异性结合于由保藏于IDAC、保藏号为141205-02的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMA的抗原决定簇，该CDMAB的特征在于具有竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力。所述试剂盒包括由保藏于IDAC、保藏号为141205-02的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMA，以及检测所述的单克隆抗体或其CDMAB是否结合于多肽的装置，所述多肽在特定临界水平的存在对于所述人类癌性肿瘤的所述存在具有诊断价值。
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