KR102627688B1 - 죽단화 꽃 에센셜오일을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 주름 개선용 화장료 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 죽단화(Kerria japonica f. pleniflora (Witte) Rehder) 꽃으로부터 추출한 에센셜오일의 성분을 규명하고, 이는 표피 각질형성세포의 증식과 type I 및 IV 콜라겐 합성을 유도할 뿐만 아니라, 각질형성세포 기반 in vitro 인공피부모델의 sprout out growth을 농도 의존적으로 유도하여, 피부 조직 재생을 유도하고, 피부 탄력 증진을 통해 주름개선 활성을 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 따라서 이는 화장료 조성물 또는 피부 외용제 조성물로 사용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 죽단화 꽃(Kerria japonica f. pleniflora (Witte) Rehder Flower) 에센셜오일을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 주름 개선용 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 죽단화의 꽃에서 유기용매 추출법(solvent extraction)으로 추출한 에센셜오일을 유효성분으로 함유하는 피부 재생 및 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부(skin)는 인체의 최외각 조직으로, 표피(epidermis), 진피(dermis) 및 피하조직(hypodermis)으로 구성된다. 그 중 표피층의 95%는 각질형성세포(keratinocyte)로 구성되어있으며, 각질형성세포의 분화정도에 따라 기저층(basal layer), 유극층(prickle layer, spinous layer), 과립층(granular layer), 각질층(horny layer, cornified layer, stratum corneum)으로 구분된다. 각질형성세포는 피부에 침투하는 세균, 화학 물질 등에 효율적으로 방어역할을 하고, 다양한 사이토카인을 분비하여 피부의 염증반응과 면역반응에 관여한다. 또한, 각질형성세포의 이동과 증식은 상처치유와 피부 재생, 그리고 콜라겐 합성을 유도하여 피부의 탄력 증진과 기저막(basement membrane) 형성에 중요한 역할을 한다. 콜라겐은 알파체인에 따라 20종 이상의 콜라겐이 있으며, 사람의 피부에는 type I, III, IV, V, VI 및 VII 콜라겐이 분포하고 있다. 주로 type I 콜라겐은 피부 진피층의 85% 이상을 구성하고, type IV 콜라겐은 기저막의 주요 구조 단백질이다. type I 및 IV 콜라겐의 합성은 피부의 탄력을 증진시키고, 기저막 형성을 향상시켜 피부 세포들의 부착과 증식이 조절되는 것으로 알려져 있다. 또한 각질형성세포는 콜라겐, 사이토카인 등을 분비하면서 기저막 성분을 생성하며, 피부 손상 부위로 이동(migration)하는 동시에 세포의 증식(proliferation)이 진행된다. 따라서 각질형성세포의 증식, 이동 및 콜라겐 생합성 유도는 피부조직의 재상피화(re-epithelialization)을 통해 피부 조직 재생 뿐만 아니라 피부 탄력을 증진시켜 주름을 개선시키고 건강한 피부가 유지되도록 도와준다.
천연물 유래 "정유"란 방향유(식물의 잎, 줄기, 열매, 꽃, 뿌리 따위에서 채취한 향기로운 휘발성의 물질)을 통칭하는 용어로서, 추출물, 추출법, 용도 및 목적에 따라 다양하게 분류된다. 천연물 유래 정유는 추출법에 따라 에센셜오일(essential oil), 앱솔루트(absolute), 콘크리트(concrete) 등으로 분류된다. 이러한 천연물 유래 정유의 방향성 성분이 피부, 순환계, 후각계를 통해 진정, 긴장완화 등의 효과를 나타내고 항균작용, 면역 증진, 항알러지 작용 등의 치료효과를 나타내어 오래전부터 질병의 치료와 예방에 활용되어왔을 뿐만 아니라, 식품 향료와 향장품 원료로 사용되고 있다.
한편, 죽단화(Kerria japonica f. pleniflora (Witte) Rehder)는 황매화속(Kerria)에 속하는 황매화의 한 품종으로, 겹꽃인 것이 특징이다. 죽단화는 내음력이 강해 양지·음지 구별 없이 잘 자라고 내한력, 내공해력이 강하지만 내염력이 약해 해풍이 잦은 곳에서는 생육이 어렵다. 죽단화는 덤불형 관목으로 양지·음지 구별없이 잘 자라며, 개화기간이 길고 진노랑 꽃이 덤불 전체를 덮은 모습이 아름다워 오래전부터 조경수로 널리 활용되고 있다. 죽단화의 가지와 줄기는 항상 녹색이며, 꽃은 겹꽃으로 4~5월에 노랗게 피며, 곁가지 끝마다 한 개씩 핀다. 원산지는 중국과 일본으로, 우리나라에서는 중부 이남에 주로 자생한다. 한방에서는 죽단화 꽃, 줄기, 잎 모두를 ‘체당화’라는 한약으로 사용하는데 거풍, 지해, 거담의 효능이 있고, 구해·소화불량·수종·류마티즘·창독·소아의 마진 등을 치료할 때 쓰이는 식물이다.
이에 본 발명자들은 유기용매 추출법을 이용하여 추출한 죽단화 꽃 유래의 에센셜오일이 각질형성세포의 증식과 type I 및 IV 콜라겐의 합성을 유도하며, 각질형성세포 기반 in vitro 인공피부모델의 sprout out growth를 촉진하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기와 같은 문제를 해소하기 위해, 본 발명은 죽단화(Kerria japonica f. pleniflora (Witte) Rehder) 꽃에서 에센셜오일을 추출하여 이의 구성 성분을 규명하고, 피부 탄력증진, 피부 재생 및 상처 치유 효능을 확인하여, 피부 재생 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 죽단화(Kerria japonica f. pleniflora (Witte) Rehder)로부터 추출된 에센셜오일을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 에센셜오일은 죽단화 꽃으로부터 추출된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 죽단화(Kerria japonica f. pleniflora (Witte) Rehder) 꽃은 건조되지 않은 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 에센셜오일은 죽단화 꽃을 헥산(n-hexane)으로 추출한 후 감압농축하여 고형의 콘크리트(concrete)를 얻은 단계와, 상기 고형의 콘크리트를 에틸 알코올(ethyl alcohol)에 용해시켜 불용성 왁스를 제거하는 단계 및 이를 감압농축하여 용매를 제거한 에센셜오일을 수득하는 단계를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 에센셜오일은 휘발성 유기 화합물을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 휘발성 유기 화합물은 팔미트산(Palmitic acid), 에틸 팔미테이트(Ethyl palmitate), 아이코산(Eicosane), 헤네이코산(Heneicosane), 리놀레산(Linoleic acid), 리놀렌산(Linolenic acid), 에틸 리놀레이트(Ethyl linoleate), 에틸 리놀렌에이트(Ethyl linolenate), 도코세인(Docosane), 트리코세인(Tricosane), 테트라코세인(Tetracosane), 펜타코세인(Pentacosane), 테트라데케인(Tetradecane), 스쿠알렌(Squalene), 1-노나데켄(1-Nonadecene), δ-토코페롤(δ-Tocopherol), 22,23-디하이드로브라시카스테롤(22,23-Dihydrobrassicasterol), 클리오나스테롤(Clionasterol), β-아미린(β-Amyrin) 및 α-아미린(α-Amyrin)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 에센셜오일은 1 내지 250 μg/mL의 범위로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 10 내지 150 μg/mL일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 50 내지 100 μg/mL일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 표피 각질형성세포의 증식 및 이동을 촉진시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서,상기 조성물은 표피 각질형성세포의 콜라겐 type I 또는 콜라겐 type Ⅳ의 합성을 촉진시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 표피 각질형성세포 맹아(sprouting)의 성장 촉진 효과를 유도하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 죽단화(Kerria japonica f. pleniflora (Witte) Rehder) 꽃으로부터 추출된 에센셜오일을 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 피부외용제 조성물을 제공한다.
본 발명은 죽단화(Kerria japonica f. pleniflora (Witte) Rehder) 꽃으로부터 추출한 에센셜오일의 성분을 규명하고, 이는 표피 각질형성세포의 증식과 type I 및 IV 콜라겐 합성을 유도할 뿐만 아니라, 각질형성세포 기반 in vitro 인공피부모델의 sprout out growth을 농도 의존적으로 유도하여, 피부 조직 재생을 유도하고, 피부 탄력 증진을 통해 주름개선 효과를 갖는다. 따라서 이는 화장료 조성물 또는 피부 외용제 등으로서 다양하게 적용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 죽단화 꽃으로부터 추출한 에센셜오일(essential oil), 정유 또는 앱솔루트(absolute)를 추출하는 과정을 나타내는 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 죽단화 꽃으로부터 추출한 에센셜오일의 표피 각질형성세포에 대한 독성을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 죽단화 꽃으로부터 추출한 에센셜오일의 표피 각질형성세포 증식에 미치는 효과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 죽단화 꽃으로부터 추출한 에센셜오일의 표피 각질형성세포 기반 in vitro 인공피부 모델의 sprout out growth에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 죽단화 꽃으로부터 추출한 에센셜오일의 type I 콜라겐 합성에 미치는 효과를 나타낸 도이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 죽단화 꽃으로부터 추출한 에센셜오일의 type IV 콜라겐 합성에 미치는 효과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 죽단화 꽃으로부터 추출한 에센셜오일의 표피 각질형성세포에 대한 독성을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 죽단화 꽃으로부터 추출한 에센셜오일의 표피 각질형성세포 증식에 미치는 효과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 죽단화 꽃으로부터 추출한 에센셜오일의 표피 각질형성세포 기반 in vitro 인공피부 모델의 sprout out growth에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 죽단화 꽃으로부터 추출한 에센셜오일의 type I 콜라겐 합성에 미치는 효과를 나타낸 도이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 죽단화 꽃으로부터 추출한 에센셜오일의 type IV 콜라겐 합성에 미치는 효과를 나타낸 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.
일 측면에서, 죽단화(Kerria japonica f. pleniflora (Witte) Rehder) 꽃으로부터 추출된 에센셜오일을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 또는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 죽단화(Kerria japonica f. pleniflora (Witte) Rehder) 꽃으로부터 추출된 에센셜오일은 죽단화 꽃을 헥산(n-hexane)으로 추출한 후 감압농축하여 고형의 콘크리트(concrete)를 얻은 단계와, 상기 고형의 콘크리트를 에틸 알코올(ethyl alcohol)에 용해시켜 불용성 왁스를 제거하는 단계 및 이를 감압농축하여 용매를 제거한 에센셜오일을 수득하는 단계를 포함하여 제조할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 콘크리트(concrete)를 얻는법과 에센셜오일을 수득하는 방법은 이 기술 분야에서 보통의 지식을 가진 자가 변형할 수 있는 모든 방법을 포함하는 것이 가능하다.
일 구현예에서, 본 발명의 죽단화(Kerria japonica f. pleniflora (Witte) Rehder) 꽃으로부터 추출된 에센셜오일은 팔미트산(Palmitic acid), 에틸 팔미테이트(Ethyl palmitate), 아이코산(Eicosane), 헤네이코산(Heneicosane), 리놀레산(Linoleic acid), 리놀렌산(Linolenic acid), 에틸 리놀레이트(Ethyl linoleate), 에틸 리놀렌에이트(Ethyl linolenate), 도코세인(Docosane), 트리코세인(Tricosane), 테트라코세인(Tetracosane), 펜타코세인(Pentacosane), 테트라데케인(Tetradecane), 스쿠알렌(Squalene), 1-노나데켄(1-Nonadecene), δ-토코페롤(δ-Tocopherol), 22,23-디하이드로브라시카스테롤(22,23-Dihydrobrassicasterol), 클리오나스테롤(Clionasterol), β-아미린(β-Amyrin) 및 α-아미린(α-Amyrin)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 휘발성 유기 화합물 성분을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 죽단화(Kerria japonica f. pleniflora (Witte) Rehder) 꽃은 꽃이 피기 직전의 꽃봉오리일 수 있으며, 건조되지 않은 꽃일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “정유(精油, 에센셜오일, essential oil)"란 식물(식물의 잎, 줄기, 열매, 꽃, 뿌리 등)로부터 추출 분리한 방향유(휘발성 물질)을 통칭하는 용어로서, 추출물, 추출법, 용도 및 목적에 따라 다양하게 분류된다. 천연물 유래 정유는 추출법에 따라 에센셜오일(essential oil), 앱솔루트(absolute) 또는 콘크리트(concrete) 등으로 분류된다.
본 발명에서 사용된 용어 "추출물(extract)"이란 천연물로부터 분리된 활성성분 즉, 목적하는 활성을 보이는 물질을 의미한다. 상기 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할수 있으며, 추출물 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다. 또한, 상기 추출물에는 상기 추출과정을 거친 추출물을 분획한 것도 포함된다. 추출물의 추출 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 교반 추출, 진탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법으로 추출될 수 있다. 추출 용매로는 물, C1-C4의 저급 알코올과 같은 극성 용매나 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트와 같은 비극성 용매, 또는 이들 중 2 이상의 혼합물을 사용할 수도 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 상술한 본 발명의 죽단화(Kerria japonica f. pleniflora (Witte) Rehder) 꽃에서 추출한 정유의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount) 및 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하여 제조할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "화장품학적 유효량"은 상술한 본 발명의 조성물의 표피 각질형성세포의 증식을 통한 피부 재생 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
화장료 조성물의 외형은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스 등의 화장품으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 스킨, 로션, 크림, 에센스, 팩, 파운데이션, 색조화장품, 선크림, 투웨이케이크, 페이스파우더, 콤팩트, 메이크업베이스, 스킨커버, 아이쉐도우, 립스틱, 립글로스, 립픽스, 아이브로우 펜슬, 화장수 등의 화장품 및 샴푸, 비누 등의 세정제에 적용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물에는 상기 죽단화(Kerria japonica f. pleniflora (Witte) Rehder) 꽃에서 추출한 정유 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에는 또한, 상기 기능성 첨가물과 더불어 필요에 따라 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분을 배합해도 된다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 죽단화(Kerria japonica f. pleniflora (Witte) Rehder) 꽃으로부터 추출된 에센셜오일을 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 피부외용제 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 표피 각질형성세포 증식, 재생 및 콜라겐 형성용일 수 있으며, 이는 노화와 주름, 상처 및 피부 병변으로 인하여 생리활성이 저하된 피부의 탄력, 재생, 및/또는 상처치유 등에 유용할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 죽단화(Kerria japonica f. pleniflora (Witte) Rehder) 꽃에서 추출한 에센셜오일을 1 내지 250 μg/mL의 농도로 사용할 수 있으며, 50 내지 100 μg/mL의 농도로 포함하는 것이 가장 우수한 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가지기 때문에 더욱 바람직하다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예 또는 실험예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예 또는 실험예들에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예 또는 실험예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 죽단화 꽃 에센셜오일의 제조
도 1에 도시된 공정을 참조하여 죽단화 꽃으로부터 에센셜오일(정유)을 제조하였다. 죽단화 꽃은 전라남도 해남(하나로 농장)에서 채취하였고, 이를 건조하지 않은 상태에서 유기용매 추출법을 이용하여 추출하였다. 구체적으로는, 죽단화 꽃을 헥산(n-hexane)으로 추출하였고, 이렇게 얻은 침전물을 회전식 증발기(rotary evaporation)로 증발시켜서 농축시킴으로서 고형의 콘크리트(concrete)를 획득하였다. 그 다음, 상기 콘크리트를 에틸알코올(ethyl alcohol)을 넣어서 용해시킨 후, 진공 냉각 필터(vacuum cooling filtration)를 거쳐서 불용성 왁스를 제거하였으며, 다시 회전식 증발기(rotary evaporation)를 이용하여 용매를 제거하여 최종적으로 죽단화 꽃 에센셜오일을 제조하였다. 그런 다음 상기 제조한 죽단화 꽃 에센셜오일은 실험에 사용되기 전까지 -80 ℃의 저온고에서 보관하였다.
<실시예 2> 죽단화 꽃 에센셜오일의 성분 분석
상기 실시예 1에서 제조된 죽단화 꽃 에센셜오일의 성분 분석은 KBSI(Korea Basic Science Institute, Seoul Center)에 의뢰하였다. 분석은 가스크로마토그래피/질량분석계(6890N GC/5975i MS, Agilent, USA)를 사용하였고, GC/MS(Gas chromatography-mass spectrometry)의 컬럼(column)은 DB5-MS(30 m×50 μm, 0.25 μm)를 사용하였으며, 캐리어 가스(carrier gas)는 헬륨을 사용하여 1 mL/분으로 흐르게 하여 분석하였다. 오븐의 온도는 40℃-2℃/분-230℃-5℃/분-300℃(5분)으로 유지하였으며, 주입구(injection port)의 온도는 280℃에서 분석하였다. 또한 인터페이스(interface)의 온도는 300℃, 이온소스(ion source)의 온도는 230℃, 분석관(analyzer)의 온도는 150℃ 에서 분석하였으며, 질량비정(Mass range)는 40 내지 800 m/z에서 분석하였다. 죽단화 꽃 에센셜오일 성분의 확인은 휘발성분의 지체시간(retention indices, RI)과 표준물질의 지체시간과 일치하거나 휘발물질의 질량 스펙트럼과 Wiley 7Nist 05 library의 질량 스펙트럼을 비교하여 물질을 확인하였다. RI는 C6 내지 C24 (n-alkane)를 이용하여 시료와 동일 조건에서 결정하였다.
그 결과, 하기 표 1에서 나타낸 것과 같이 총 20개의 성분으로 구성되어 있음을 확인할 수 있었으며, 주요 성분으로는 Tricosane 34.21%, α-Amyrin 14.97%, Pentacosane 9.45%, Squalene 6.30%, 1-Nonadecene 4.25%, Palmitic acid 3.63%, β-Amyrin 3.31%, Clionasterol 3.26%, Tetracosane 3.24%, Heneicosane 3.13%, Docosane 2.95%, Ethyl linolenate 2.07%, δ-Tocopherol 1.86%, Linolenic acid 1.75%, Linoleic acid 1.72%, Ethyl linoleate 1.12%, Tetradecane 0.96%, Eicosane 0.67%, Ethyl palmitate 0.59%, 22,23-Dihydrobrassicasterol 0.56%순으로 높은 함량을 나타냄을 확인하였다(표 1).
<실시예 3> 죽단화 꽃 에센셜오일이 각질형성세포 생존율에 미치는 영향 측정
사람 피부 유래의 표피 각질형성세포(HaCat)를 10%의 우태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 DMEM(Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium) 배지를 이용하여 배양하고, 본 발명에 활용하였다. 표피 각질형성세포를 96 well microtiter plate에 각 well 당 5×103 cells/100 μL/well이 되도록 주입하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 부착시켰다. 상기 실시예 1에서 제조된 죽단화 꽃 에센셜오일을 1 내지 250 μg/mL 농도로 각 well에 100 μL씩 처리하여 배양하고, 음성대조군으로는 죽단화 꽃 에센셜오일을 미처리하여 배양하였다. 24시간 후, Ez-cytox를 각 well에 처리한 후 배양기에서 30분간 반응시켰다. ELISA plate reader(Synerge2, BioTek, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도 측정 후, 백분율로 환산하여, 죽단화 꽃 에센셜오일의 표피 각질형성세포에 대한 생존률 결과를 확보하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 것처럼, 죽단화 꽃 에센셜오일의 1 내지 150 μg/mL의 농도에서는 유의한 세포독성이 관찰되지 않았다. 다만, 250 μg/mL의 농도에서 세포 독성을 가지는 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명에 따른 죽단화 꽃 에센셜오일 농도는 150 μg/mL 이하의 농도가 바람직함을 확인하고 이후의 실험에 적용하였다.
<실시예 4> 죽단화 꽃 에센셜오일이 표피 각질형성세포의 증식에 미치는 효과
사람 피부 유래 표피 각질형성세포(HaCaT)를 10%의 우태아 혈청이 포함된 DMEM배지를 이용하여 배양하고, 본 발명에 활용하였다. 표피 각질형성세포를 96 well microtiter plate에 각 well 당 3×103 cells/100 μL/well 이 되도록 주입하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 부착시켰다. 죽단화 꽃 에센셜오일 0.1 내지 100 μg/mL 농도로 각 well에 100 μL씩 처리하여 배양하고, 음성대조군으로는 죽단화 꽃 에센셜오일를 미처리하였으며, 양성대조군은 종래에 상처치유 또는 피부 재생에 활용되고 있는 표피성장인자(epidermal growth factor; EGF, 50 ng/mL)를 처리하고, 48시간 동안 배양하였다. Ez-cytox를 각 well에 처리한 후 배양기에서 30분간 반응시켰다. ELISA plate reader(Synerge2, BioTek, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도 측정 후, 백분율로 환산하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 죽단화 꽃 에센셜오일은 표피 각질형성세포의 증식을 농도 의존적으로 유도하는 것으로 나타났다. 양성대조군에 의한 표피 각질형성세포의 증식은 159.85±4.79% 유도가 되었으며, 죽단화 꽃 에센셜오일 10 μg/mL 농도에서 122.44±5.00%의 증식 유도율을 나타내었고, 50 μg/mL의 농도에서 223.37±3.74%의 최대 증식 유도율을 나타내었다.
<실시예 5> 죽단화 꽃 에센셜오일이 표피 각질형성세포 기반 in vitro 인공피부 모델의 sprout out growth에 미치는 영향
Type I 콜라겐과 표피 각질형성세포를 2.5×107 cells/mL이 되도록 섞은 후, 24 well plate에 스포팅(spotting)하고, 건조하여 인공피부조직을 형성하였다. 죽단화 꽃 에센셜오일을 농도별로 처리하였으며, 음성대조군은 죽단화 꽃 에센셜오일을 이용하지 않은 것이고, 양성 대조군은 종래의 상처치유 또는 피부 재생에 활용되는 있는 표피성장인자(epidermal growth factor; EGF, 50 ng/mL)를 이용한 것이다. 음성 또는 양성대조군을 처리하고, 48시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양액을 제거하고, Diff-Quik solution을 이용하여 세포와 조직을 고정 및 염색하였으며, 염색된 세포와 조직을 촬영하여 결과를 확보하였다.
그 결과, 도 4는 본 발명의 실시예 1에 의해 추출된 죽단화 꽃 에센셜오일은 표피 각질형성세포 기반 in vitro 인공피부 모델의 sprout out growth을 농도 의존적으로 유도하는 것으로 나타났다. 양성대조군은 705.92±42.71% out growth를 유도하였으며, 죽단화 꽃 에센셜오일은 50 μg/mL의 농도에서 609.27±31.26%의 최대 out growth 유도율을 나타내었다.
<실시예 6> 죽단화 꽃 에센셜오일이 표피 각질형성세포의 type I 또는 IV 콜라겐 합성과 분비에 미치는 영향
96 well microtiter plate에 단클론 항-콜라겐(monoclonal anti-collagen) I 또는 IV를 주입 후 12시간 동안 코팅하였다. Blocking 후, 각각의 샘플을 well당 100 μL씩 처리하여 반응시켰다. 샘플은 죽단화 꽃 에센셜오일 처리군 또는 미처리군의 세포 배양액(conditioned medium)을 처리하였다. 그 후, 다클론 항-콜라겐(polyclonal anti-collagen) I 또는 IV를 각 well에 처리하여 90분 동안 반응시킨 다음, streptavidin-POD를 각 well에 처리하여 60분 동안 반응시켰다. ELISA pico chemiluminescent substrate를 각 well에 주입한 후, ELISA plate reader를 이용하여 luminescence를 측정하였고, 죽단화 꽃 에센셜오일의 표피 각질형성세포의 type I 또는 IV 콜라겐 합성과 분비에 대한 결과를 확보하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 죽단화 꽃 에센셜오일은 50 μg/mL 및 100 μg/mL 농도에서 표피 각질형성세포의 type I 과 Ⅳ의 콜라겐 합성과 분비를 유의하게 촉진시켰다. 특히, 죽단화 꽃 에센셜오일 100 μg/mL 농도에서 type I (160.24±12.45%)과 Ⅳ(225.07±18.35%)의 합성을 최대로 유도함을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구 범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (10)
- 죽단화(Kerria japonica f. pleniflora (Witte) Rehder) 꽃으로부터 추출된 에센셜오일을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 또는 주름 개선용 화장료 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 에센셜오일은 죽단화 꽃을 헥산(n-hexane)으로 추출한 후 감압농축하여 고형의 콘크리트(concrete)를 얻은 단계와, 상기 고형의 콘크리트를 에틸 알코올(ethyl alcohol)에 용해시켜 불용성 왁스를 제거하는 단계 및 이를 감압농축하여 용매를 제거한 에센셜오일을 수득하는 단계를 포함하여 제조되는 것인, 피부 재생 또는 주름 개선용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 에센셜오일은 휘발성 유기 화합물을 포함하는 것인, 피부 재생 또는 주름 개선용 화장료 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 휘발성 유기 화합물은 팔미트산(Palmitic acid), 에틸 팔미테이트(Ethyl palmitate), 아이코산(Eicosane), 헤네이코산(Heneicosane), 리놀레산(Linoleic acid), 리놀렌산(Linolenic acid), 에틸 리놀레이트(Ethyl linoleate), 에틸 리놀렌에이트(Ethyl linolenate), 도코세인(Docosane), 트리코세인(Tricosane), 테트라코세인(Tetracosane), 펜타코세인(Pentacosane), 테트라데케인(Tetradecane), 스쿠알렌(Squalene), 1-노나데켄(1-Nonadecene), δ-토코페롤(δ-Tocopherol), 22,23-디하이드로브라시카스테롤(22,23-Dihydrobrassicasterol), 클리오나스테롤(Clionasterol), β-아미린(β-Amyrin) 및 α-아미린(α-Amyrin)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 피부 재생 또는 주름 개선용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 에센셜오일은 1 내지 250 μg/mL의 범위로 포함되는 것인, 피부 재생 또는 주름 개선용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 표피 각질형성세포의 증식 및 이동을 촉진시키는 것인, 피부 재생 또는 주름 개선용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 표피 각질형성세포의 콜라겐 type I 또는 콜라겐 type Ⅳ의 합성을 촉진시키는 것인, 피부 재생 또는 주름 개선용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 표피 각질형성세포 맹아(sprouting)의 성장 촉진 효과를 유도하는 것인, 피부 재생 또는 주름 개선용 화장료 조성물. - 죽단화(Kerria japonica f. pleniflora (Witte) Rehder) 꽃으로부터 추출된 에센셜오일을 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 피부외용제 조성물.
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