CN117285631A - 用于放射性免疫治疗的Lu-177标记MUC1抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及放射性免疫治疗技术领域，尤其涉及用于放射性免疫治疗的Lu‑177标记MUC1抗体。本发明制备了177Lu‑DOTA‑MUC1标记化合物，并发现其具有治疗肺癌的效果。
Description
技术领域
本发明涉及放射性免疫治疗技术领域，尤其涉及用于放射性免疫治疗的Lu-177标记MUC1抗体。
背景技术
177Lu的物理半衰期为6.7天，发射能量为176（12.2%）、384（9.1%），和497（78.6%）KeV的β粒子，对肿瘤细胞杀伤力强，但穿透力较弱，较不会伤及周边正常细胞，是一种很有潜力的放射性治疗用核素。另外，177Lu还可发射能量为113（6.4%），208（11.0%）KeV的β射线并用于显像。而且177Lu较长的半衰期与抗体体内半衰期接近，能够很好的实现治疗作用。
Mucin1（简称MUC1）是重要的肿瘤标志物之一，它是粘蛋白家族中最容易识别的跨膜蛋白，由人MUC1基因编码，具有高度糖基化的胞外结构域。
目前，针对基于MUC1抗体的放射诊断与治疗药物也已进行了大量研究。比如，64Cu标记PR81用于乳腺癌的PET显像的研究结果表明，64Cu-DOTA-PR81具有良好的肿瘤靶向性，在肿瘤中具有长时间的高吸收和保留（24小时为7.63%ID/g，48小时后为6.09%ID/g），表明这种放射免疫偶联物在表达MUC1的肿瘤PET成像方面具有潜力；111In标记PR81用于检测表达MUC1的乳腺癌，其在肿瘤部位的积累具有高灵敏度和特异性，可以用于该肿瘤抗原的预后成像；111In-MX-DTPA-BrE-3（BrE-3，一种鼠源IgG1 MUC1 mAb）的临床试验证明该抗体能够靶向过度表达MUC1的乳腺肿瘤，可以检测晚期乳腺癌患者86%的已知病灶。单次高剂量使用90Y-MX-DTPA-BrE-3的I期临床试验已经启动用于检测晚期乳腺癌。99mTc-mAb-170H.82（170H.82，MUC-1鼠类抗体）原发性乳腺癌和局部复发灶显示出高灵敏度和阳性预测价值；89Zr-Df'-GGSK-1/30（Df'= desferrioxamine），用于检测表达hu(TA)MUC1的乳腺肿瘤，在表达hu(TA)MUC1的肿瘤小鼠中观察到肿瘤的高特异性摄取（72小时后>55%ID/g）和非靶组织的低非特异性摄取值，得到高对比度PET成像。
但是，目前还没有一种能够针对肺癌的放射诊断与治疗药物。
发明内容
本发明提供用于放射性免疫治疗的Lu-177标记MUC1抗体，用于治疗肺癌。
本发明提供一种放射免疫偶联物，包括：MUC1抗体、一个螯合性连接子和一种放射性核素；
所述放射性核素为177Lu。
根据所述的放射免疫偶联物，所述MUC1抗体为IgG4型抗MUC1抗体。本发明所选用的MUC1抗体为人源化单克隆免疫球蛋白IgG4型抗MUC1抗体，此抗体相较于之前报道的鼠源化MUC1抗体能够克服人抗鼠抗体反应，避免单抗分子被免疫系统当作异源蛋白而被快速清除，提高单抗药物的药效。尤其是全人源化单抗的可变区和恒定区都是人源的，能够去除免疫原性和毒副作用。
根据所述的放射免疫偶联物，所述螯合性连接子为DOTA衍生物。
根据所述的放射免疫偶联物，所述螯合性连接子为DOTA-NHS。
本发明还提供一种药物或诊断试剂盒，包括所述的放射免疫偶联物。
本发明还提供所述的放射免疫偶联物在制备药物或诊断产品中的应用。
本发明还提供所述的放射免疫偶联物在以下任一项中的应用：
1）制备肺癌治疗药物；
2）制备肺癌诊断产品。
优选的，所述肺癌包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌；进一步优选为非小细胞肺癌。
本发明还提供所述的放射免疫偶联物的制备方法，所述MUC1抗体与所述螯合性连接子进行偶联反应时的pH值为6.9~8.1。现有技术中，DOTA-NHS与MUC1抗体偶联时的pH值一般为pH8.6~9.2，但是发明人发现，在本发明中利用以上条件不能完成反应，而利用pH值为6.9~8.1可以达到较好的效果。
优选的，pH值为7.5~8.0。
根据所述的放射免疫偶联物的制备方法，所述螯合性连接子为DOTA-NHS；
在磷酸氢盐缓冲溶液中，将抗体与DOTA-NHS混合后进行偶联反应，偶联反应后纯化得到偶联纯化物，将磷酸氢盐缓冲溶液替换为pH4~6（优选4.5~5.5）的乙酸铵缓冲液，在偶联纯化物中加入177LuCl3溶液，标记反应后进行纯化，得到177Lu-DOTA-MUC1。针对177Lu的标记步骤，研究乙酸铵缓冲液体系pH，确定在该pH值下，标记反应较好。
根据所述的放射免疫偶联物的制备方法，所述177LuCl3溶液中177Lu活度为1mCi~20mCi。
优选的，所述制备方法包括，在2~3mL Na2HPO4- NaH2PO4缓冲溶液pH=7.5~8.0中，抗体（2mg~5mg/mL）与DOTA-NHS摩尔比1:40~1:100，在3.5~4.5℃下孵育24~48h。偶联反应后，用CH3COOH-CH3COONH4缓冲液（0.18~0.22 M，pH=4.5~5.0）处理PD-10柱，随后使用处理过的PD-10柱进行偶联产物纯化，除去未结合的DOTA-NHS，并可同时将Na2HPO4-NaH2PO4缓冲体系置换为CH3COOH-CH3COONH4缓冲液（0.18~0.22 M，pH=4.5~5.0）。在偶联纯化物中加入177LuCl3溶液（1mCi~20mCi）在36.5~37.5℃下反应1.8~2.2h。标记反应后通过PD-10柱纯化，177Lu-DOTA-MUC1的放射化学纯度可达90%以上。
本发明的有益效果：
1）针对本发明MUC1抗体,通过研究DOTA-NHS与MUC1抗体的偶联反应条件，确定了所用MUC1抗体与DOTA-MHS偶联反应的pH值是影响制备177Lu-DOTA-MUC1制备效果的重要因素，并筛选出了最优pH值范围，可以保证偶联效果。
2）针对DOTA-NHS与MUC1抗体的偶联反应条件，确定了研究所用MUC1抗体与DOTA-MHS的偶联反应pH条件（pH7.5~8.0）优于采用同类其他抗体偶联DOTA-NHS的反应条件（pH8.6~9.5）。
3）确定了177Lu-DOTA-MUC1标记化合物在肺癌肿瘤中应用的可能性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。
图1是本发明实施例1缓冲溶液pH7.0时偶联后标记产物HPLC结果。
图2是本发明实施例1缓冲溶液pH7.5时偶联后标记产物HPLC结果。
图3是本发明实施例1缓冲溶液pH8.0时偶联后标记产物HPLC结果。
图4是本发明实施例1缓冲溶液pH8.2时偶联后标记产物HPLC结果。
图5是本发明实施例1缓冲溶液pH8.5时偶联后标记产物HPLC结果。
图6是本发明实施例1缓冲溶液pH9.0时偶联后标记产物HPLC结果。
图7是本发明实施例1缓冲溶液pH9.5时偶联后标记产物HPLC结果。
图8是本发明实施例1制备177Lu-DOTA-MUC1的技术路线图。
图9是本发明实施例2中24h、48h177Lu-DOTA-MUC1（NHS）在KM正常鼠的SPECT/CT显像结果图；
此图为CT与SPECT融合图像，其中：白色区域主要为骨骼及放射性药物聚集区域，白色区域越亮表明骨骼密度越大或放射性药物聚集越多，图像中部分噪点除外。
图10是本发明实施例2中24h、48h时177Lu-DOTA-MUC1（NHS）在A549肺癌荷瘤鼠的SPECT/CT显像结果图；
此图为CT与SPECT融合图像，其中：白色区域主要为骨骼及放射性药物聚集区域，白色区域越亮表明骨骼密度越大或放射性药物聚集越多，图像中部分噪点除外。
图11是本发明实施例2中72h、96h时177Lu-DOTA-MUC1（NHS）在A549肺癌荷瘤鼠的SPECT/CT显像结果图；
此图为CT与SPECT融合图像，其中：白色区域主要为骨骼及放射性药物聚集区域，白色区域越亮表明骨骼密度越大或放射性药物聚集越多，图像中部分噪点除外。
图12是本发明实施例2中177Lu-DOTA-MUC1在KM正常鼠体内分布图。
图13是本发明实施例2中177Lu-DOTA-MUC1在A549肺癌荷瘤鼠体内分布图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明具体实施方式中，使用的MUC1抗体为IgG4型抗MUC1抗体，购自本康生物制药（深圳）有限公司的重组人MUC1单克隆抗体。
实施例1
本实施例提供177Lu-DOTA-MUC1的制备方法：
所述制备方法包括，在2.5mL pH值分别为7.0、7.5、8.0、8.2、8.5、9.0、9.5的Na2HPO4- NaH2PO4缓冲溶液中，抗体（2.5mg/mL）与DOTA-NHS摩尔比1:40，在4℃下孵育40h。偶联反应后，用CH3COOH-CH3COONH4缓冲液（0.2 M，pH=4.5）处理PD-10柱，随后使用处理过的PD-10柱进行偶联产物纯化，除去未结合的螯合剂，并可同时将Na2HPO4-NaH2PO4缓冲体系置换为CH3COOH-CH3COONH4缓冲液（0.2 M，pH=4.5）。在偶联纯化物中加入177LuCl3溶液（活度10mCi）在37℃下反应2h。标记产物的HPLC图详见图1-图7。
其中，图1-3为Na2HPO4- NaH2PO4缓冲溶液的pH值分别为7.0、7.5、8.0时，制备得到放射免疫偶联物的HPLC结果（未纯化）。纯化后，177Lu-DOTA-MUC1的放射化学纯度可达90%以上。
图1-3中，左侧保留时间8.7min的峰为目标产物峰，右侧保留时间11.4min的为未标记的放射性峰。图4~图7的HPLC结果未出现保留时间8.7min左右的目标产物峰。
图8是本实施例制备177Lu-DOTA-MUC1的技术路线图。抗体与DOTA-NHS在4℃下孵育40h。偶联反应后，用CH3COOH-CH3COONH4缓冲液处理PD-10柱进行偶联产物纯化，除去未结合的螯合剂，并将Na2HPO4-NaH2PO4缓冲体系置换为CH3COOH-CH3COONH4缓冲液。在偶联纯化物中加入177LuCl3溶液在37℃下反应2h即可得到未纯化的标记产物。
实施例2
本实施例研究177Lu-DOTA-MUC1在KM正常鼠和A549肺癌模型动物中的分布数据。
用1ml注射器吸取纯化后的177Lu-DOTA-MUC1（实施例1中为Na2HPO4- NaH2PO4缓冲溶液pH值8.0时制备）适量，分别通过尾静脉给药正常KM鼠和A549肺癌肿瘤模型鼠，其中显像小鼠注射活度300μCi，生物分布小鼠注射100μCi177Lu-DOTA-MUC。在24h、48h、72h、96h等时项进行SPECT/CT显像，同时解剖生物分布给药组进行脏器计数测量，计算肿瘤和正常脏器的放射性摄取（ID%/g）。
图9是本实施例中KM正常鼠在给药177Lu-DOTA-MUC1后24h和48h时的SPECT/CT显像结果图。图10是本实施例中A549肺癌荷瘤鼠在给药177Lu-DOTA-MUC1后24h和48h时的SPECT/CT显像结果图。图11是本实施例中A549肺癌荷瘤鼠在给药177Lu-DOTA-MUC1后72h和96h时的SPECT/CT显像结果图。177Lu-DOTA-MUC1在KM和A549肺癌肿瘤鼠的显像结果表明，给药短时间内，药物主要分布在血液、心脏、肺部和肝脏。在24h后，肿瘤大量特异性摄取，肿瘤部位累积增多且具有长时间滞留。相对其他正常器官，肝脏的摄取较高。
图12是本实施例中KM正常鼠在给药177Lu-DOTA-MUC1后24h、48h、72h和96h时小鼠各脏器的分布数据。图13是本实施例中A549肺癌荷瘤鼠在给药177Lu-DOTA-MUC1后24h、48h、72h和96h时小鼠各脏器的分布数据。结果显示：从体内分布数据可以看到，药物在血液中的浓度较高，同时清除较慢、滞留时间较长，这与抗体较慢的分布速度有关，也可能是由于血液中游离的抗原与药物结合的原因。肝和脾的摄取较高，可能与抗体药物复杂的代谢途径有关。药物在肿瘤部位大量摄取，累积越来越多且具有很长的滞留时间，可以达到较好的治疗效果。
实施例3
使用氯化钠注射液冲洗PD-10柱后纯化177Lu-DOTA-MUC1溶液（实施例1中Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液pH值为8.0时制备），取0.5mL在37℃温度下保存，分别测定24小时、48小时、72小时和96小时的放射化学纯度。
177Lu-DOTA-MUC1在未添加其他组分条件下，在生理盐水中72h内较为稳定，96小时放化纯相对72h时有较明显降低。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种放射免疫偶联物，其特征在于，包括：MUC1抗体、一个螯合性连接子和一种放射性核素；
所述放射性核素为177Lu。
2.根据权利要求1所述的放射免疫偶联物，其特征在于，所述MUC1抗体为IgG4型抗MUC1抗体。
3.根据权利要求2所述的放射免疫偶联物，其特征在于，所述螯合性连接子为DOTA衍生物。
4.根据权利要求3所述的放射免疫偶联物，其特征在于，所述螯合性连接子为DOTA-NHS。
5.一种药物或诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的放射免疫偶联物。
6.权利要求1-4任一项所述的放射免疫偶联物在制备药物或诊断产品中的应用。
7.权利要求1-4任一项所述的放射免疫偶联物在以下任一项中的应用：
1）制备肺癌治疗药物；
2）制备肺癌诊断产品。
8.权利要求1-4任一项所述的放射免疫偶联物的制备方法，其特征在于，所述MUC1抗体与所述螯合性连接子进行偶联反应时的pH值为6.9~8.1。
9.根据权利要求8所述的放射免疫偶联物的制备方法，其特征在于，在磷酸氢盐缓冲溶液中，将抗体与DOTA-NHS混合后进行偶联反应，偶联反应后纯化得到偶联纯化物，将磷酸氢盐缓冲溶液替换为pH4~6的乙酸铵缓冲液，在偶联纯化物中加入177LuCl3溶液，标记反应后进行纯化，得到177Lu-DOTA-MUC1。
10.根据权利要求9所述的放射免疫偶联物的制备方法，其特征在于，所述177LuCl3溶液中177Lu活度为1mCi~20mCi。
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