JP5294271B2 - Ｃｄｈ３ペプチド及びこれを含む薬剤 - Google Patents

Description

本発明は、膵癌、胆管細胞癌、胃癌、大腸癌、肺癌など、P-cadherin (CDH3)を高発現する癌に対するワクチンとして有効な新規ペプチド、及び当該ペプチドを含む癌の治療および予防のための薬剤に関する。

膵癌は全悪性腫瘍の約2-3%を占めており、世界で毎年約20万人が膵癌で死亡し、その死亡者数は悪性腫瘍の中で第5位である。日本では年間約2万人が死亡している。膵癌発生の危険因子としては、糖尿病、慢性膵炎、喫煙などが挙げられ、また家族歴も危険因子の一つとして報告されている。早期診断について、画像診断の進歩をはじめ、種々の試みがなされているにもかかわらず、ほとんどの患者は診断時に進行した状態で発見され、化学療法に対しても抵抗性を示すため、その5年生存率は約9.7%、切除例であっても約13%にすぎず、消化器癌の中では最も予後不良な癌である。この診断の困難さによって特に先進国では、次第に癌死亡の原因疾患としての頻度が増加しつつある。現在、外科的切除を中心として、放射線治療、化学療法などによる集学的治療が行われているが、劇的な治療効果の改善はなく、新たな治療戦略が緊急に必要とされている。

胆管細胞癌は原発性肝癌の約10%を占め、肝細胞癌についで2番目に多い。特徴的な臨床所見に乏しく、発見時にはすでにリンパ節転移や肝内転移などを伴う進行例も少なくない。5年生存率は約20%であり、切除例の5年生存率は35%であるが、非切除例は7.4%と非常に不良である。外科的切除のみが唯一長期生存を期待できる治療法であるが、発見時には既に手術不能であることが多い（手術施行率66%、非治癒切除率20%）。抗癌剤感受性、放射線感受性共に低く、非治癒切除症例をはじめ非手術例に対する治療法の確立が望まれている。

胃癌は、欧米と比較して、日本や中国などのアジア諸国で罹患率が高い。胃癌は、健康診断の普及や消化器内視鏡器具、検査技術の進歩により、早期発見が可能となり、患者数は減少しつつある。しかしながら、依然として日本人の悪性新生物の死亡原因の第２位を占めており、未だ死亡原因に占める割合は高い。大腸癌は、欧米諸国では2番目に多い癌であり、日本でも悪性新生物の死亡原因の第3位を占めている。胃癌、大腸癌は外科的切除を中心に化学療法、放射線療法等が行われるが、これらの治療法の適応外の転移癌や難治性癌に対する新しい治療法として、癌患者の癌に対する免疫力を強めることにより癌の増殖を抑制する、免疫療法が注目されている。

肺癌は近年、世界各国で増加し続けており、現在では世界で年間約100万人の肺癌死がみられている。わが国においても肺癌死は増え続けており2015年には、12万3000人に達すると考えられている。日本の悪性新生物の死亡原因の第1位を占めている。今後、高齢化社会が進むことによって、ますます患者数は増加すると考えられる。肺癌治療において重要なことは、早期発見、早期治療であるが、検診で行われている単純胸部X線撮影と喀痰検査は、肺癌の早期発見に関する効果は乏しく、癌死を減らす結果には繋がらないことが近年、指摘されており、今後とも肺癌による死亡者数は増加すると考えられるため、新たな治療戦略の開発は緊急な課題である。

一方、近年の分子生物学および腫瘍免疫学の発展により、細胞傷害性（キラー）T細胞およびヘルパーT細胞が、癌細胞あるいは抗原提示細胞の表面にHLA分子を介して提示される、癌細胞に特異的に高発現する蛋白質が分解されてできたペプチドを認識して、癌細胞を破壊する免疫反応を示すことが明らかとなった。さらに、このような癌を攻撃する免疫反応を刺激する、腫瘍抗原蛋白質および、それらに由来するペプチドが多数同定されてきており、抗原特異的な腫瘍免疫療法の臨床応用が進められている。

HLAクラスI分子は、身体のすべての有核細胞の表面に発現しており、細胞質や核で産生される蛋白質が、細胞内で分解されて出来たペプチドを結合して、細胞表面に発現する。正常な細胞の表面には、正常な自己の蛋白質に由来するペプチドがHLAクラスI分子に結合しており、これを免疫系のT細胞が識別して破壊することはない。一方、癌細胞は癌になる過程で、正常細胞には、ほとんど発現していないか、あるいは、ごく僅かしか発現していない蛋白質を大量に発現することがある。このような癌細胞に特異的に高発現する蛋白質が細胞質内で分解されて出来たペプチドが、HLAクラスI分子に結合して癌細胞の表面に発現すると、キラーT細胞がこれを認識して癌細胞のみを破壊する。また、このような癌特異抗原やペプチドを個体に投与することにより、正常細胞には危害を加えることなく、癌細胞を破壊して癌の増殖を抑制する免疫応答を誘導することができる。これを、癌特異抗原を用いた癌免疫療法と呼ぶ。またHLAクラスII分子は、主に抗原提示細胞の表面に発現しており、抗原提示細胞が細胞外から取り込んで、細胞内で分解されて出来た癌特異抗原由来のペプチドを結合して細胞表面に発現する。これを認識したヘルパーT細胞は、活性化され他の免疫担当細胞を活性化する種々のサイトカインを産生することにより、腫瘍に対する免疫反応を誘導あるいは増強する。

そこで、これらの癌に特異的に高発現している抗原を標的にした免疫療法を開発できれば、自己の正常臓器に有害事象を及ぼすことなく、癌だけを有効に排除する治療法になる可能性がある。また、他の治療が行えない、どんな末期の癌患者にでも使用できる治療法になりうると期待される。また、あらかじめ、このような癌を発生するリスクが高いヒトに対して、癌特異抗原およびペプチドをワクチンとして投与することにより、癌の発生を予防できる可能性がある。

膵癌の治療法には様々なものがあるが、ほかの癌に比べて非常に予後不良である。その理由として、早期発見が困難であり、また進行も早く、発見されたときはかなり進行した状態であることが多い。現時点で最も根治が期待できるものは外科的切除であるが、切除可能な症例は全体の約20%にすぎない。しかし、膵臓の手術は侵襲が大きく、進行例においては外科的切除においても予後は不良である。非切除症例に対してはゲムシタビンを中心とした化学療法や放射線療法が行われるが、多くが抵抗性を示し、腫瘍縮小効果は認めにくく、難治性癌である理由の一つとなっている。以上より膵癌に特異的に高発現している抗原を標的にした免疫療法を開発できれば、自己の正常臓器に障害を及ぼすことなく、癌だけを有効に排除する治療法になる可能性がある。また、どんな末期の癌患者でも使用できる治療法になると期待される。この他、膵癌は、切除術後早期に再発することが多く、術後補助療法としても有用な治療法となることが期待される。

本発明者等は先に、cDNAマイクロアレイ解析を利用した、27,648種のヒト遺伝子を含むゲノムワイドの遺伝子発現解析によって、16症例の膵癌および胎生期臓器ならびに様々な成人の正常臓器における、これらの遺伝子の発現プロフィールを検討した。その結果、P-cadherin (CDH3)が、成人の正常臓器ではほとんど発現しないのに対し、多くの膵癌で高発現することを見いだした。さらにCDH3は、胆管細胞癌、胃癌、大腸癌、非小細胞肺癌、精巣癌、子宮頸癌、骨肉腫、軟部肉腫等でも大部分の症例で高発現を認めた。この事実はCDH3が多くの癌腫において、癌特異抗原となりうることを示唆するものである。

HLA-A2は人種を問わず人類集団中に高頻度で観察され、日本人でもその約30％が所有している。このため、HLA-A2によりキラーT細胞に提示されるペプチドを同定することが出来れば、日本人のみならず広く欧米白人などにも応用できることになる。したがって、HLA-A2によりキラーT細胞に提示される癌抗原ペプチドの同定は、重要な課題である。このような癌抗原ペプチドを、全世界において罹患率、死亡率の高い肺癌に対する免疫療法に応用することができれば、非常に有益であると考えられる。

尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
Nakamura, T., et al., Oncogene 23: 2385-2400 (2004) Obama, K., et al., Hepatology 41: 1339-1348 (2005) Taniuchi, K., et al., Cancer Res 65: 3092-3099 (2005) Soler, A. P., et al., Cancer 86: 1263-1272 (1999) Paredes, J., et al., Clin Cancer Res 11: 5869-5877 (2005) Ingunn, M., et al., J Clin Oncol 22: 1242-1252 (2004) Glenn, L., et al., J Cell Biol 139: 1025-1032 (1997) Bauer, R., et al., Exp Mol Pathol 81: 224-230, (2006) Muzon-Guerra, M.F., et al. Cancer 103: 960-969 (2005) Marck, V. V., et al., Cancer Res 65: 8774-8783 (2005)

本発明は、膵癌、胆管細胞癌、胃癌、大腸癌、非小細胞肺癌などの治療法として実行されている外科療法、化学療法、放射線療法では治療が難しい、転移性癌や難治性癌に対する新しい治療方法として、癌患者の癌に対する免疫力を強めることにより、癌の増殖を抑制する免疫療法を実現する手段を開発することを解決すべき課題とする。本発明は、癌特異的に高発現するタンパク質由来で、HLA-A2によりキラーT細胞に提示されるペプチドを同定することにより、日本人のCDH3を高発現する様々な癌患者の約30％を対象とすることができる、免疫療法を可能にする。

本発明者らは膵癌組織におけるcDNAマイクロアレイ解析により、膵癌に高発現する遺伝子CDH3（GenBank Accession No. NM_001793）を同定した。CDH3特異的なキラーT細胞による抗腫瘍免疫の誘導の有無を検討するために、日本人の約30%が所有するHLA-A2を発現するHLA-A2トランスジェニックマウスを利用した。つまり今回、HLA-A2結合モチーフを持つヒトCDH3ペプチドを負荷したマウス骨髄由来樹状細胞を、HLA-A2トランスジェニックマウスに免疫することにより、HLA-A2拘束性のペプチド特異的キラーT細胞が誘導されるか否かを検討した。HLA-A2により提示されたペプチドを認識して活性化されたキラーT細胞が産生するγ-インターフェロン（IFN-γ）を、ELISPOT 法を用いて検出することにより、免疫されたマウス脾細胞中のCDH3ペプチドに特異的なキラーT細胞の誘導の有無を検討した。その結果、HLA-A2陽性の癌患者を対象とした免疫療法に応用可能な、新規CDH3ペプチドを2種類同定した。また、前記ペプチドを用いて誘導したCDH3応答性CTLは内在性のCDH3及びHLA-A2分子を発現している癌細胞に対して特異的な細胞傷害性を有すること、及び該CTLはHLA-クラスI 拘束性に標的細胞を認識することが明らかとなった。さらに、前記ペプチドで誘導されたCD8陽性細胞を静脈注射により接種（CTL養子免疫法）することで、NOD/SCIDマウスに移植された腫瘍の成長が有意に抑制されることが明らかとなった。

即ち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載のペプチド。
（Ａ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を含むペプチドにおいて、１個、２個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されており、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を有するペプチド。
（２）Ｎ末端から2番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンである、（１）に記載のペプチド。
（３）Ｃ末端アミノ酸がバリンまたはロイシンである、（１）に記載のペプチド。
（４）（１）に記載のペプチドを有効成分として１種類以上含有する、癌に対する免疫誘導剤。
（５）（１）に記載のペプチドを有効成分として１種類以上含有する、癌の治療及び／または予防のための薬剤。
（６）（１）に記載のペプチドを有効成分として１種類以上含有する、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を示す抗原提示細胞を誘導するための薬剤。
（７）（１）に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効成分として１種類以上含有する、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を示す抗原提示細胞を誘導するための薬剤。
（８）（１）に記載のペプチドを有効成分として１種類以上含有する、細胞傷害性（キラー）T細胞を誘導するための薬剤。
（９）（１）に記載のペプチドに対する抗体。
（１０）（１）に記載のペプチドを用いて誘導される、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性（キラー）Ｔ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団。
（１１）（１）に記載のペプチドおよびＨＬＡ抗原を含む複合体を提示する抗原提示細胞。
（１２）（６）または（７）に記載の薬剤によって誘導される、（１１）に記載の抗原提示細胞。
（１３）（１）に記載のペプチドおよびＨＬＡ抗原を含む複合体を提示するエキソソーム。
（１４）ＨＬＡ抗原がHLA-A2 (HLA-A2*0201)である、（１３）のエキソソーム。
（１５）抗原提示細胞を（１）に記載のペプチドと接触させる工程を含む、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を示す抗原提示細胞を誘導する方法。
（１６）（１）に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを抗原提示細胞へ導入する工程を含む、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を示す抗原提示細胞を誘導する方法。
（１７）Ｔ細胞を（１）に記載のペプチドと接触させる工程を含む、細胞傷害性（キラー）T細胞を誘導する方法。
（１８）（１）に記載のペプチドを対象に投与する工程を含む、癌に対する免疫を誘導する方法。
（１９）（１）に記載のペプチドを対象に投与する工程を含む、癌を治療及び／または予防する方法。
（２０）癌に対する免疫誘導剤を製造するための、（１）に記載のペプチドの使用。
（２１）癌の治療及び／または予防のための薬剤を製造するための、（１）に記載のペプチドの使用。

HLA-A2拘束性キラーT細胞が認識する、CDH3ペプチドの同定までのプロトコールを示す図である。（免疫マウスからの脾細胞回収日をDay 0とする。） 18種類のCDH3ペプチドに関するELISPOT解析結果を示す図である。免疫したマウスから得られたキラーT細胞が、CDH3ペプチドを負荷した細胞に対して、特異的に反応してIFN-γを産生するかどうかをELISPOTアッセイで検討した。その結果、CDH3-4あるいはCDH3-7ペプチドで誘導したキラーT細胞は、CDH3ペプチドを添加したBM-DCを特異的に識別してIFN-γを産生したが、他のペプチドで誘導したキラーT細胞においては、CDH3特異的なキラーT細胞の免疫応答は観察されなかった。以上より、CDH3-4およびCDH3-7ペプチドは、CDH3特異的なHLA-A2拘束性キラーT細胞を誘導できるエピトープペプチドであると判定した。図２に記載したCDH3ペプチドの番号は、表２のペプチドのポジションの項目に記載されたペプチドの番号に対応し、本明細書に記載された配列番号とは異なる。 CDH3ペプチドを特異的に認識して活性化されたキラーT細胞が産生した、IFN-γをELISPOT解析により検出した結果を示す写真である。CDH3-4_655-663 ペプチド負荷BM-DCへの応答として、CD4陰性脾細胞は283.7 ± 40.0スポット数/ウェルを示し（Ａ左およびB上段）、負荷しなかったBM-DCへの応答として、48.7±11.9スポット数/ウェルを示した（A右およびB下段）(P < 0.05)。同様に、CDH3-7_757-765ペプチド負荷BM-DCへの応答として、CD4陰性脾細胞は79.3±3.2スポット数/ウェルを示し（C上段）、負荷しなかったBM-DCへの応答として、42.7±2.5スポット数/ウェルを示した（C下段）(P < 0.05)。これらの分析は２度行い同じ結果が得られた。 HLA-A2陽性健常人ドナーおよび癌患者のPBMCから得られたCDH3特異的ヒトCTLの誘導の結果を示す図である。A CDH3ペプチド応答性CTLはHLA-A2陽性健常人ドナーのPBMCから誘導した。CDH3-4_655-663(上図)またはCDH3-7_757-765(下図)ペプチドを負荷した自己単球由来DCを用いて３度刺激した後、各ペプチドを負荷もしくは負荷しないT2細胞(HLA-A2陽性, TAP欠損)に対する細胞傷害性を標準的な⁵¹Cr放出試験で評価した。これらのCTLは、CDH3-4_655-663(上図)またはCDH3-7_757-765(下図)ペプチドを負荷したT2細胞にその傷害性を示したが、ペプチドを負荷しないT2細胞には示さなかった。B これらのCTLは、CDH3陽性HLA-A2陽性ヒト大腸癌細胞株HCT116、口腔扁平上皮癌細胞株HSC3およびCDH3陰性HLA-A2陽性ヒト膵癌細胞株PANC1へCDH3遺伝子を形質転換したPANC1/CDH3へは細胞傷害性を示したが、CDH3陰性HLA-A2陽性ヒト肝癌細胞株SKHep1、PANC1およびCDH3陽性HLA-A2陰性ヒト膵癌細胞株PK8にはその細胞傷害性を示さなかった。C HLA-A2陽性膵癌（PC）および胃癌患者（GC）由来のPBMCより誘導したCDH3応答性CTLは、HCT116およびPANC1/CDH3に対して細胞傷害性を示したが、PANC1およびPK8には示さなかった。D 抗HLAクラスI mAbによる細胞傷害性の阻害の結果を示す。標的細胞であるSKHep1/CDH3およびHSC3を抗HLAクラスI mAb (W6/32、IgG_2a)もしくは抗HLA-DR mAb (H-DR-1、IgG_2a)1時間インキュベートとした後、CDH3-4_655-663(左および中央)またはCDH3-7_757-765ペプチド(右)で刺激した健常人ドナーのPBMCより誘導したCTLを加えた。IFN-γERISPOT法によるINF-γ産生（左および右）および⁵¹Cr放出試験による細胞傷害性（中央）はW6/32によって著しく阻害されたが、H-DR-1では阻害されなかった。 NOD/SCIDマウスへ移植したヒト癌細胞に対するin vivoでのCDH3誘導ヒトCTLの抗癌活性を示す図である。A CTL接種後、NOD/SCIDマウスへ移植したヒト結直腸癌細胞株HCT116(CDH3陽性、HLA-A2陽性)の成長の抑制を示す。腫瘍皮下移植７日後、25mm²のサイズに到達した時に、CDH3-4_655-663(□)ペプチドおよびCDH3-7_757-765(黒塗り□)ペプチド応答性ヒトCTLを静脈内投与した。１４日目に同じようにCTLを投与した。コントロールとしてHLA-A2拘束性HIVペプチドを用いて刺激したCD8陽性T細胞では細胞傷害性は示さなかった(◇)。CDH3応答性CTL(n=7)、コントロールCD8陽性T細胞(n=7)またはPBSのみ(○、n=7)を７日目と１４日目に２度投与されたNOD/SCIDマウスにおける腫瘍容積を示した。腫瘍サイズはmm²で表示した。B 各グループでの腫瘍サイズを± SD (n=7)で示した。

〔発明の実施の形態〕
本明細書において用いられる場合、「1つの」、および「その」という単語は、他に明確な指示がない限り「少なくとも1つ」を意味する。

他に定義がない限り、本明細書において用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味をもつ。

本発明のペプチドは、日本人および白人集団に一般的に見出されるHLA対立遺伝子であるHLA-A2により拘束されるエピトープである。具体的には、HLA-A2への結合親和性を指標として、CDH3由来のHLA-A2結合ペプチドの候補を選択した。選択したペプチドについて、選択したペプチドを負荷したHLA-A2トランスジェニックマウス骨髄細胞由来の樹状細胞(BM-DC)によりHLA-A2トランスジェニックマウス生体内でキラーT細胞が誘導されるか否かを評価した。CDH3-4（FILPVLGAV（配列番号：１））、CDH3-7（FIIENLKAA（配列番号：２））により、HLA-A2トランスジェニックマウス生体内でキラーT細胞が誘導された。これらのペプチドで誘導したキラーＴ細胞は、これらペプチドを添加したBM-DCに対して免疫応答反応を示した。しかしながら、これらのキラーＴ細胞は、ペプチドを添加しないBM-DCに対して免疫応答反応を示さなかった。これらの結果は、CDH3由来のペプチドが、CDH3提示細胞に対する免疫反応を誘導するペプチドとして有用であること、ならびにCDH3由来のペプチドがHLA-A2により拘束されるエピトープペプチドであることを実証している。CDH3は、膵癌、胆管細胞癌、胃癌、大腸癌、非小細胞肺癌、精巣癌、子宮頸癌、骨肉腫、軟部肉腫等の大部分の症例で高発現を認めた。この事実から、CDH3が多くの癌腫において、免疫療法の標的として有用であることが分かった。

（１）本発明のペプチド、及びそれを含む癌に対する免疫誘導剤
本発明のペプチドは以下の何れかのペプチドである。
（Ａ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を含むペプチドにおいて１個、２個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されており、キラーＴ細胞の誘導活性を有するペプチド。
（Ｃ）Ｎ末端から2番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンである、（Ｂ）に記載のペプチド。
（Ｄ）Ｃ末端アミノ酸がバリンまたはロイシンである、（Ｂ）に記載のペプチド。

本発明のペプチドは、キラーＴ細胞の誘導活性を有するペプチドであって、40アミノ酸未満、好ましくは20アミノ酸未満、より好ましくは15アミノ酸未満であり、かつ配列番号：１または２のアミノ酸配列を含むエピトープペプチドである。あるいは、エピトープペプチドは、キラーＴ細胞の誘導活性を保持する限り、1個、2個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されている、配列番号：１または２のアミノ酸配列を含むペプチドを含みうる。置換、欠失、挿入、及び／または付加される残基の数は、一般的に、5アミノ酸またはそれ未満、好ましくは4アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは3アミノ酸またはそれ未満、よりいっそう好ましくは1アミノ酸もしくは2アミノ酸である。

変異体ペプチド(すなわち、本来のアミノ酸配列に対して、1個、2個、または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／または付加を行うことにより改変されたアミノ酸配列を含むペプチド)は、本来の生物活性を保持することが知られている(Mark DF et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:5662-6; Zoller MJ and Smith M, (1982) Nucleic Acids Res 10:6487-500; Dalbadie-McFarland G et al., (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:6409-13)。アミノ酸改変は、本来のアミノ酸側鎖の性質を保存することが好ましい。アミノ酸側鎖の性質の例は、疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、および共通して、以下の官能基または特性を有する側鎖である：脂肪族側鎖(G、A、V、L、I、P)；ヒドロキシ基含有側鎖(S、T、Y)；イオウ原子含有側鎖(C、M)；カルボン酸およびアミド含有側鎖(D、N、E、Q)；塩基含有側鎖(R、K、H)；ならびに芳香族含有側鎖(H、F、Y、W)。ただし、括弧でくくられた文字は、アミノ酸の一文字記号を示す。

好ましい態様において、本発明のペプチド（免疫原性ペプチド）は、ノナペプチド(9-mer)またはデカペプチド(10-mer)である。

本明細書で言うキラーT細胞の誘導活性を有するペプチドとは、キラーT細胞（細胞傷害性T細胞/CTL）を刺激するT細胞誘導活性を有するペプチドを意味する。

さらに、高い結合親和性およびキラーT細胞誘導活性を示すペプチドを得るために、天然に存在するCDH3の部分ペプチドのアミノ酸配列に、1個、2個、もしくは数個のアミノ酸の置換、除去、または付加による改変を加えてもよい。本明細書において、「数個の」という用語は、5個またはそれ未満、好ましくは3個またはそれ未満、より好ましくは2個またはそれ未満を指す。さらに、HLA抗原へ高い親和性を示すペプチドの配列の規則性は既知であるため(Kubo RT, et al., (1994) J. Immunol., 152, 3913-24; Rammensee HG, et al., (1995) Immunogenetics. 41:178-228; Kondo A, et al., (1995) J. Immunol. 155:4307-12)、そのような規則性に基づきHLA抗原への親和性を高めることを目的として、本発明のペプチド（エピトープペプチド）を改変することができる。例えば、Ｎ末端から2番目のアミノ酸をロイシンまたはメチオニンに置換することで、高いHLA-2結合親和性を示すペプチドを得ることができる。同様に、Ｃ末端アミノ酸をバリンまたはロイシンに置換することでも、高いHLA-2結合親和性を示すペプチドを得ることができる。

エピトープペプチド配列が、異なる機能をもつ内因性または外因性のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、特定の物質に対する自己免疫異常またはアレルギー症状のような副作用が引き起こされうる。このような副作用を回避するため、エピトープペプチドの改変に当たっては、公知のタンパク質のアミノ酸配列に一致しないように、利用可能なデータベースを用いて相同性検索を行い、改変後のエピトープペプチドと100%の相同性を示す異なる機能をもつ内因性または外因性のタンパク質が存在しないことを確認する必要がある。このような手順を踏むことにより、HLA抗原との結合親和性を増加させる、および/またはキラーT細胞誘導活性を増加させる上記のアミノ酸配列の改変による危険性が避けられうる。

上記のようなHLA抗原に対する高い結合親和性をもつペプチドは、癌ワクチンとして大いに効果的であることが期待されるが、高い結合親和性の存在を指標とし、それに応じて選択される候補ペプチドは、実際のキラーT細胞誘導活性の存在について調べる必要がある。キラーT細胞誘導活性は、ヒトMHC抗原を有する抗原提示細胞(例えば、Bリンパ球、マクロファージ、および樹状細胞)、またはより具体的には、ヒト末梢血単核白血球由来の樹状細胞を誘導し、関心の対象のペプチドによる刺激後、CD8陽性細胞と混合し、標的細胞に対する細胞傷害活性を測定することにより確認されうる。反応系として、ヒトHLA抗原を発現させるように作製されたトランスジェニック動物(例えば、BenMohamed L, et al., (2000) Hum. Immunol. 61(8):764-79 Related Articles, Books, Linkoutに記載)が用いられうる。例えば、標的細胞は、⁵¹Crなどで放射標識することができ、細胞傷害活性は、標的細胞から放出された放射能から計算することができる。あるいは該標的細胞は、固定化ペプチドを有する抗原提示細胞の存在下でキラーT細胞により産生および放出されたIFN-γを測定し、抗IFN-γモノクローナル抗体を用いて培地上のIFN-γ産生ゾーンを可視化することにより調べることができる。

実施例に示すようにペプチドのキラーＴ細胞の誘導活性を調べた結果として、HLA抗原に対する高い結合親和性をもつペプチドは必ずしも高い誘導活性をもつとは限らないことが発見された。しかしながら、CDH3-4（FILPVLGAV（配列番号：１））、CDH3-7（FIIENLKAA（配列番号：２））により示されたアミノ酸配列を含むペプチドは、特に高いキラーT細胞誘導活性を示した。

上記のように、本発明は、キラーＴ細胞の誘導活性を有するペプチド、すなわち、配列番号：１または２のアミノ酸配列またはそれらの変異体(すなわち、1個、2個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されているアミノ酸配列)を含むペプチドを提供する。配列番号：１または２に示される9アミノ酸を含むペプチドまたはそれらの変異体は、他の内因性タンパク質とアミノ酸配列が一致しないことが好ましい。特に、Ｎ末端から2番目のアミノ酸をロイシンまたはメチオニンへ置換、または／および、Ｃ末端アミノ酸をバリンまたはロイシンへ置換することにより、高いHLA-2結合親和性を示すペプチドを得ることができる。

本発明のペプチドは、改変によりキラーＴ細胞の誘導活性を失わない限りにおいて、グリコシル化、側鎖酸化、またはリン酸化のような改変を含みうる。他の改変としては、例えば、ペプチドの血清半減期を増加させるために用いることができるD-アミノ酸または他のアミノ酸のアナログが含まれる。

本発明のペプチドの入手・製造方法は特に限定されず、化学合成したペプチドでも、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えペプチドの何れでもよい。

化学合成ペプチドを入手する場合には、例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のペプチドを合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のペプチドを合成することもできる。

本発明のペプチドを組み換え蛋白質として産生するには、当該ペプチドをコードする塩基配列を有するDNA、又はその変異体又は相同体を入手し、これを好適な発現系に導入することにより本発明のペプチドを製造することができる。

発現ベクターとしては、好ましくは宿主細胞において自立複製可能であるか、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものであればよく、ペプチドをコードする遺伝子を発現できる位置にプロモーターを含有しているものが使用される。また、本発明のペプチドをコードする遺伝子を有する形質転換体は、上記の発現ベクターを宿主に導入することにより作製することができる。宿主は、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞のいずれでもよく、また宿主への発現ベクターの導入は、各宿主に応じた公知の手法により行えばよい。

本発明においては、上記のようにして作製した形質転換体を培養し、培養物中に本発明のペプチドを生成蓄積させ、該培養物より本発明のペプチドを採取することにより組み換えペプチドを単離することができる。

形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。また培養条件も該微生物を培養するのに通常用いられる条件にて行えばよい。培養後、形質転換体の培養物から本発明のペプチドを単離精製するには、通常のペプチドの単離、精製法を用いればよい。

なお、配列番号1または２に記載のアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号1または２に記載のアミノ酸配列をコードするDNA配列の塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜製造又は入手することができる。即ち、配列番号1または２に記載のアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、キラーＴ細胞の誘導活性を有するペプチドをコードする遺伝子は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することもできる。例えば、遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は、特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載の方法に準じて行うことができる。

上記した本発明のペプチドは、後記実施例にも示す通り、癌に対する免疫を誘導することができる。従って、本発明によれば、本発明のペプチドを含む、癌に対する免疫誘導剤が提供される。本発明の免疫誘導剤は2つまたはそれ以上のエピトープペプチドを組み合わせた混合剤として調製することもできる。複数種類のペプチドを組み合わせた免疫誘導剤は、カクテルであってもよく、または標準的な技術を用いて互いに結合させてもよい。組み合わせるエピトープペプチドは、同一遺伝子由来の異なるアミノ酸配列を有するペプチドまたは異なる遺伝子由来のアミノ酸配列を有するペプチドでもよい。本発明のペプチドを投与すると、投与されたペプチドは抗原提示細胞のHLA抗原上において高密度で提示され、続いて、投与されたペプチドとHLA抗原の間で形成された複合体に対して特異的に反応するキラーT細胞が誘導される。あるいは、被検体から採取した樹状細胞と本発明のペプチドとを接触させることにより（あるいは被検体から摂取した樹状細胞に本発明のペプチドを負荷することにより）、本発明のペプチドを細胞表面上に提示している抗原提示細胞を得ることができる。それぞれの被検体へのこれら抗原提示細胞を再投与することにより被験者の体内でキラーＴ細胞を誘導し、その結果、本発明のペプチドを提示している標的細胞に対する免疫応答を増強させることができる。

本発明の癌に対する免疫誘導剤は、インビトロ又はインビボ、好ましくはインビトロで用いることにより、ヘルパーT細胞、キラーT細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を誘導することができ、これにより癌に対する免疫を付与することができる。

（２）本発明の癌の治療及び／または予防のための薬剤（癌ワクチン）
実施例では、本発明のペプチドは、生体内における癌細胞特異的キラーＴ細胞を誘導することができることが示された。さらに、先の発明では、CDH3は、膵癌、胆管細胞癌、胃癌、大腸癌、非小細胞肺癌、精巣癌、子宮頸癌、骨肉腫、軟部肉腫等の大部分の症例で高発現していることが示された。したがって本発明のペプチドを含む免疫誘導剤には、癌の治療、予防剤としての効果が期待できる。つまり、本発明のペプチドを適当なアジュバントと共に、あるいはペプチドを樹状細胞などの抗原提示細胞に負荷した後に体内に注入することにより、腫瘍攻撃性キラーＴ細胞を誘導ならびに活性化し、その結果として抗腫瘍効果が期待できる。また発明のペプチドをコードする遺伝子を適当なベクターに組み込み、この組換えＤＮＡで形質転換されたヒトの抗原提示細胞（樹状細胞など）、BCG結核菌などの細菌、または本発明のペプチドをコードするＤＮＡをゲノムに組み込まれたワクシニアウイルス等のウイルスは、ヒト癌の治療・予防用生ワクチンとして有効に利用できる。なお、癌ワクチンの投与量及び投与法は通常の種痘やＢＣＧワクチンと同様である。

本発明との関連において、「ワクチン」という用語(免疫原性組成物とも呼ばれる)は、動物への接種により、抗腫瘍免疫を誘導する、または各種癌を抑制する物質を指す。本発明により、配列番号：１または２のアミノ酸配列を含むペプチドが、CDH3を提示する細胞に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導しうるHLA-A2拘束性エピトープペプチドであると示唆された。従って、本発明はまた、配列番号１または２のアミノ酸配列またはそれらの変異体(すなわち、1個、2個、もしくは数個のアミノ酸の置換、除去、または付加を含む)を含むペプチドを用いて抗腫瘍免疫を誘導する方法を含む。一般的に、抗腫瘍免疫は、以下のような免疫応答を含む：
（１）CDH3を発現する細胞を含む腫瘍に対するキラーT細胞の誘導、
（２）CDH3を発現する細胞を含む腫瘍を認識する抗体の誘導、および
（３）抗腫瘍性サイトカイン産生の誘導。

特定のペプチドが動物への接種によりこれらの免疫応答のいずれか1つを誘導する場合、そのペプチドは、抗腫瘍免疫誘導効果をもつと決定される。ペプチドによる抗腫瘍免疫の誘導は、インビボまたはインビトロで、ペプチドに対する宿主における免疫系の応答を観察することにより、検出することができる。

例えば、キラーT細胞の誘導を検出するための方法は周知である。生体に侵入する異物は、抗原提示細胞(APC)の作用により、T細胞およびB細胞へ提示される。抗原特異的な様式で抗原提示細胞により提示された抗原に対して応答するT細胞は、抗原による刺激により、キラーT細胞(細胞傷害性Tリンパ球またはCTLとも呼ばれる)へ分化し、その後増殖する；この過程は、本明細書では、T細胞の「活性化」と呼ばれる。特定のペプチドによるキラーT細胞誘導は、ペプチドを負荷した抗原提示細胞により、ペプチドをT細胞へ提示させ、キラーT細胞の誘導を検出することにより評価することができる。さらに、抗原提示細胞は、CD4⁺ T細胞、CD8⁺ T細胞、マクロファージ、好酸球、およびNK細胞を活性化する効果を有する。CD4⁺ T細胞はまた抗腫瘍免疫において重要であるため、ペプチドの抗腫瘍免疫誘導作用は、これらの細胞の活性化効果を指標として用いて評価することができる。

樹状細胞(DC)を抗原提示細胞として用いて誘導されたキラーT細胞の誘導作用を評価するための方法は、当技術分野において周知である。DCは、抗原提示細胞中で最も強いキラーT細胞誘導作用をもつ。この方法では、試験ペプチドを最初にDCに接触させ、その後、該DCをT細胞と接触させる。DCと接触させたT細胞について、標的細胞に対する細胞傷害性効果をもつT細胞を検出する。該T細胞が標的細胞に対して細胞傷害活性を示すことは、すなわち、試験ペプチドが細胞傷害性T細胞を誘導する活性をもつことを示している。標的細胞、例えば腫瘍、に対するキラーT細胞の活性は、例えば、⁵¹Cr標識腫瘍細胞の溶解を指標として用いて検出することができる。あるいは、³H-チミジン取り込み活性またはLDH(ラクトースデヒドロゲナーゼ)放出を指標として用いて腫瘍細胞損傷の程度を評価することができる。

これらの方法によりキラーT細胞誘導活性を有することが確認された試験ペプチドは、DC活性効果およびその後のキラーT細胞誘導活性を有するペプチドである。それゆえに、腫瘍細胞に対してキラーT細胞を誘導するペプチドは、CDH3を提示する癌に対するワクチンとして有用である。さらに、ペプチドと接触させることにより癌に対してキラーT細胞を誘導する能力を獲得した抗原提示細胞は、癌に対するワクチンとして有用である。さらに、抗原提示細胞によるペプチドの提示によって細胞傷害性を獲得したキラーT細胞もまた、CDH3を提示する癌に対するワクチンとして利用できる。抗原提示細胞およびキラーT細胞による抗腫瘍免疫を利用する癌の治療方法は、細胞免疫療法と呼ばれる。

一般的に、細胞免疫療法のためにペプチドを用いる場合、異なる構造をもつ複数のペプチドを組み合わせることにより、キラーT細胞誘導の効率を増加させることができる。それゆえに、タンパク質断片でDCを刺激する場合、複数種のペプチド断片の混合物を用いることが有利である。

ペプチドによる抗腫瘍免疫の誘導はさらに、腫瘍に対する抗体産生の誘導を観察することにより評価することができる。例えば、ペプチドに対する抗体が、ペプチドで免疫された実験動物において誘導される場合、ならびに、腫瘍細胞の成長、増殖、および/または転移がそれらの抗体により抑制される場合、ペプチドは抗腫瘍免疫を誘導すると決定される。

抗腫瘍免疫は、本発明のワクチンを投与することにより誘導することができ、抗腫瘍免疫が誘導されることにより、癌の治療および予防を可能にする。癌に対する治療または癌の発症の予防の効果は、癌細胞の成長の阻害、癌細胞の退縮、および癌細胞の発生の抑制を含みうる。癌をもつ個体の死亡率の減少、血液中の癌マーカーの減少、癌に伴う検出可能な症状の軽減などもまた、癌の治療または予防による効果に含まれる。そのような治療的または予防的効果は、癌に対するワクチンの治療的または予防的効果がワクチン投与なしの対照と比較して、統計学的に有意であること、例えば5%またはそれ未満の有意レベルで観察されることが好ましい。統計学的な手法としては、例えば、スチューデントt検定、マン-ホイットニーU検定、またはANOVAが、統計学的有意性を決定するために用いられうる。

本発明において、被検体は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物は、限定されるわけではないが、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシを含む。

本発明のペプチドは、インビボまたはエクスビボで被検体に投与することができる。また、癌を治療または予防するための免疫原性組成物を製造するために、本発明の免疫原性ペプチド、すなわち配列番号：１または２に記載のアミノ酸配列またはそれらの変異体ペプチドから選択されるノナペプチドを使用することができる。

より具体的には、本発明は、本発明のペプチドを有効成分として1種類以上含有する、腫瘍を治療するための、または腫瘍の増殖、転移などを予防するための薬剤を提供する。本発明のペプチドは、膵癌、胆管細胞癌、胃癌、大腸癌、非小細胞肺癌、精巣癌、子宮頸癌、骨肉腫、軟部肉腫のような腫瘍の治療において特に有用である。

本発明のペプチドは、通常の製剤方法により製剤した薬剤として被検体へ直接投与することができる。そのような製剤は、本発明のペプチドに加えて、薬学的に許容される担体、賦形剤などを、必要に応じて含んでいてもよい。本発明の薬剤は、様々な腫瘍の処置および予防のために用いられうる。

さらに、細胞性免疫を効果的に確立するために、本発明のペプチドを有効成分として1種類以上含有する腫瘍の処置および/または予防のための薬剤にアジュバントを混合することができる。あるいは、該組成物は抗腫瘍剤のような他の活性成分と共に投与されうる。適切な製剤には顆粒も含まれる。適切なアジュバントは、文献(Johnson AG. (1994) Clin. Microbiol. Rev., 7:277-89)に記載されている。例示的なアジュバントは、フロイントの不完全アジュバント、BCG、トレハロースダイマイコレート（TDM）、リポ多糖（LPS）、ミョウバンアジュバント、シリカアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、およびミョウバンを含むが、これに限定されない。さらに、リポソーム製剤、薬物が直径数μmのビーズへ結合している顆粒製剤、および脂質が前記ペプチドに結合している製剤が、便利に用いられうる。投与の方法は、経口投与、皮内注射、皮下注射、静脈内注射などであってもよく、全身投与または標的腫瘍の付近への局所的投与を含みうる。

本発明のペプチドの用量は、処置すべき疾患、患者の年齢、体重、投与の方法などにより適切に調整することができる。用量は、普通、0.001mg〜1000mg、好ましくは0.01mg〜100mg、より好ましくは0.1mg〜10mgであり、好ましくは数日に1回から数ヶ月に1回投与されるが、当業者は適切な用量および投与の方法を容易に選択することができ、これらのパラメーターの選択および最適化は、十分に通常の技術の範囲内である。製剤の形態も特に限定されず、凍結乾燥したものや、糖などの賦形剤を加えて顆粒にしたものでもよい。

本発明の薬剤に添加することができる腫瘍反応性Ｔ細胞誘導活性を高めるための補助剤としては、ムラミルジペプチド(MDP) ほかのBCG菌などの菌体成分、Nature, vol. 344, p873 (1990)に記載されるISCOM、J.Immunol. vol. 148, p1438(1992)に記載されるサポニン系のQS-21、リポソーム、水酸化アルミニウムなどが挙げられる。また、レンチナン、シゾフィラン、ピシバーニールなどの免疫賦活剤を補助剤として用いることもできる。また、IL-2、IL-4、IL-12、IL-1、IL-6、TNFなどのT細胞の増殖、分化を増強するサイトカイン等、ならびにNKT細胞を活性化するαガラクトシルセラミドやToll様レセプターに結合して自然免疫系を活性化するCpG、リポ多糖（LPS）なども補助剤として用いることができる。

本発明のワクチン組成物は、キラーT細胞を初回抗原刺激する成分を含む。脂質は、生体内においてウイルス抗原に対して初回抗原刺激する物質として同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、リシン残基のε-アミノ基およびα-アミノ基に結合し、その後、本発明の免疫原性ペプチドに連結することができる。脂質化ペプチドは、ミセルまたは粒子に注入する、リポソームに封入する、またはアジュバント中に乳化するかのいずれかで、直接投与することができる。脂質初回抗原刺激のもう一つの例として、適切なペプチドに共有結合的に結合している場合、トリパルミトイル-S-グリセリルシステイニルセリル-セリン(P3CSS)のような大腸菌(E. coli)リポタンパク質により初回抗原刺激することができる(Deres K, et al., (1989) Nature 342:561-4)。

本発明の免疫原性ペプチドはまた、ウイルスベクターまたは細菌ベクターにより発現させることができる。適切な発現ベクターの例は、ワクシニアまたは鶏痘のような弱毒性ウイルス宿主を含む。例えば、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとして、ワクシニアウイルスを使用することができる。宿主細胞へ組換えワクシニアウイルスを導入することにより、免疫原性ペプチドを発現させ、それにより、免疫応答を誘発する。ワクシニアベクターを用いた免疫化方法は、例えば、米国特許第4,722,848号に記載されている。さらに、BCG(カルメット・ゲラン菌(Bacille Calmette Guerin))を用いることもできる。BCGベクターは、Stover CK, et al., (1991) Nature 31:456-60に記載されている。治療的投与または免疫化に有用な幅広い種類の他のベクター、例えば、アデノおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌(Salmonella typhi)ベクター、解毒化炭疽毒素ベクターなどが、当技術分野において公知である。例えば、Shata MT, et al., (2000) Mol. Med. Today 6:66-71; Shedlock DJ and Weiner DB., et al., (2000) J. Leukoc. Biol. 68:793-806;およびHipp JD, et al., (2000) In Vivo 14:571-85を参照。

また、患者から採取した細胞または、一部のHLA対立遺伝子を共有する他人の（アロ）細胞に試験管内で当該抗原ペプチドを加え、抗原提示させた後、患者の血管内や腫瘍局所などに投与し、患者体内で効果的にキラーＴ細胞を誘導することもできる。また、患者末梢血リンパ球に当該ペプチドを加えて試験管内で培養することにより、試験管内でキラーＴ細胞を誘導した後に、患者血管内や腫瘍局所などに投与することもできる。このような細胞移入による治療は、既に癌治療法として実施されており、当業者間では、よく知られた方法である。

本発明における癌の種類は特に限定されず、具体例としては、食道癌、乳癌、甲状腺癌、大腸癌、膵癌、悪性黒色腫（メラノーマ）、悪性リンパ腫、骨肉腫、褐色細胞腫、頭頸部癌、子宮癌、卵巣癌、脳腫瘍、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、腎臓癌、前立腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、精巣癌、甲状腺癌、膀胱癌又は肉腫などが挙げられる。本発明を応用する際に適した癌の例としては、好ましくは、膵癌、胆管細胞癌、胃癌、大腸癌、または肺癌などを挙げることができる。

(３)本発明の抗体
本発明は、上記した本発明のペプチドの一部もしくは全部をエピトープ（抗原）として認識する抗体、ならびに当該蛋白質又はペプチドを用いてインビトロ刺激により誘導されたキラーT細胞にも関する。一般的には、キラーT細胞のほうが抗体よりも強い抗腫瘍活性を示す。

また、本発明の抗体は、本発明のペプチドと同様に、癌抗原であるCDH3の活性を阻害することができる限り、CDH3を発現する癌の予防および／または治療剤として有用である。実際の使用法としては、本発明のペプチド又は抗体をそのまま、又は医薬的に許容される担体及び／又は希釈剤とともに、必要に応じて補助剤も加えて、注射剤として投与することもできるし、噴霧などの方法で粘膜からの経皮吸収などで投与してもよい。尚、ここで言う担体とは例えば、ヒト血清アルブミンであり、また希釈剤としては、例えばPBS、蒸留水等を挙げることができる。

本発明の抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、その作製は当業者に公知な方法により行なうことができる。

例えば、ポリクローナル抗体は、本発明のペプチドを抗原として哺乳動物又は鳥類を免疫感作し、該哺乳動物又は鳥類から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離・精製することにより得ることができる。例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等の哺乳動物又は鳥類を免疫することができる。免疫感作の方法は当業者に公知であり、例えば抗原を、７〜３０日間隔で２〜３回投与すればよい。投与量は１回につき、例えば抗原約０．０５〜２ｍｇ程度とすることができる。投与経路も特に限定されず、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を適宜選択することができる。また、抗原は適当な緩衝液、例えば完全フロイントアジュバント又は水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して用いることができる。

免疫感作した哺乳動物又は鳥類を一定期間飼育した後、抗体価が上昇してきたら、例えば100μｇ〜1000μｇの抗原を用いて追加免疫を行なうことができる。最後の投与から1〜2ケ月後に免疫感作した哺乳動物又は鳥類から血液を採取して、当該血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモニウム又はポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の常法によって分離・精製することにより、ポリクローナル抗血清として、本発明のペプチドを認識するポリクローナル抗体を得ることができる。

一方、モノクローナル抗体はハイブリドーマを調製して得ることができる。例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合によりハイブリドーマを得ることができる。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、以下のような細胞融合法によって得ることができる。

抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Bリンパ球等を使用する。抗原としては、本発明のペプチドを使用する。免疫動物としてはマウス、ラット等を使用でき、これらの動物への抗原の投与は常法により行う。例えば完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと抗原である本発明のペプチドとの懸濁液もしくは乳化液を動物の静脈、皮下、皮内、腹腔内等に数回投与することによって動物を免疫化する。免疫化した動物から抗体産生細胞として例えば脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞とを公知の方法（G.Kohler et al ., Nature,256 495(1975)）により融合してハイブリドーマを作製することができる。

細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスではＰ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３Ｕ１株、Ｓｐ２／０株などが挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチレングリコール、センダイウイルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイブリドーマの選択にはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（HAT）培地を常法に従って使用する。細胞融合により得られるハイブリドーマは限界希釈法等によりクローニングする。さらに必要に応じて、本発明のペプチドを用いた酵素免疫測定法によりスクリーニングを行うことにより、本発明のペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する細胞株を得ることができる。

上記の方法に加えて、ＥＢウイルス感染リンパ球等のヒトリンパ球を、本発明のペプチド、ペプチドを発現する細胞、またはそれらの溶解物を用いてインビトロで刺激することにより、免疫化細胞を調節することができる。この免疫化されたリンパ球をＵ２６６等のヒト由来の骨髄細胞と融合させることにより、本発明のペプチドに結合するヒト抗体を獲ることもできる（特開昭６３−１７６８８号）。

このようにして得られたハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造するには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培養し、培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればよい。培養上清もしくは腹水からのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。例えば、硫安分画、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用できる。

さらに、本発明のペプチド、ペプチドを発現する細胞、またはそれらの溶解物を用いて、ヒト抗体遺伝子群を有するトランスジェニック動物を免疫化することもできる。免疫化されたトランスジェニック動物から抗体産生細胞を採取し、上記のミエローマ細胞株と融合させハイブリドーマを得て、該ハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造することもできる（WO92-03918、WO94-02602、WO94-25585、WO94-33735、WO96-34096）。

または、免疫化リンパ球等の、抗体を産生する免疫細胞を癌遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体の調整に用いることもできる。

このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子操作技術を用いて調節することもできる（Borrbaeck and Larrick, (1990)Therapeutic Monoclonal Antibodies）。例えば、ハイブリドーマや免疫化リンパ球等の抗体産生細胞より抗体をコードするDNAをクローニングし、適切なベクターに挿入した上で、宿主細胞に導入することにより、組換え抗体を調整することができる。

また、本発明の抗体は、本発明のペプチドに結合する限り、抗体の断片または修飾抗体であっても良い。抗体断片としては、Faｂ、F(ab’)2、Fv、またはHおよびL鎖由来のFv断片が適切なリンカーによって連結されている一本鎖Fv（scFv）であっても良い（Huston et al., (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-83）。より具体的には、抗体をパパインやペプシン等の酵素で処理することにより、抗体断片を調整することができる（Co et al., (1994) J Immunol 152:2968-76、Better and Horwitz, (1989) Methods Enzymol 178: 476-96、Pluckthun and Skerra, (1989) Methods Emzymol 178:497-515、Lamoyi (1986) Methods Enzymol 121:652-63、Rousseaux et al., (1986 Methods Enzymol 121:663-9、Bird and Walker, (1991) Trends Biotech 9:132-7）。

本発明の抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）等の様々な分子を結合させることで得られる、修飾抗体を含む。抗体の修飾は、当技術分野で慣例的な化学修飾方法により行うことができる。

本発明の抗体は、非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域を有するキメラ抗体、または、非ヒト抗体由来の相補性決定領域（CDR）とヒト抗体由来のフレームワーク領域（FR）およびヒト抗体由来の定常領域を含むヒト化抗体も含む。このような抗体は、当技術分野で慣例的な方法により調整することができる。ヒト化抗体は、ヒト抗体のCDR配列領域を所望の結合活性を備えたげっ歯類のCDR領域と置換することにより得られる（Verhoeyen et al., (1988) Science 239:1534-6）。したがって、ヒト化抗体は、キメラ抗体と比較して、ヒト抗体のより狭い領域が非ヒト由来の対応する領域と置換された抗体である。

ヒトフレームワーク領域および定常領域に加えてヒト可変領域も有する完全ヒト抗体を作成することもできる。例えば、インビトロ法では、バクテリオファージ上にヒト抗体断片を提示させた組換えライブラリーを用いてスクリーニングを行うことができる（Hoogenboom and Winter, (1992) J Mol Biol 227:381-8）。同様に、内因性免疫グロブリン遺伝子を部分的または完全に不活性化されたトランスジェニック動物に、ヒト免疫グロブリン座位を導入することによりヒト抗体を作成することもできる（米国特許第6,150,584号、第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,661,016号）。

上記のようにして得られた抗体は、当技術分野で慣例的な方法により均一になるまで精製することができる。例えば、一般的なタンパク質の分離・精製方法を用いることができる。アフィニティークロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動等を組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができるが、これらの方法に限定されない（Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory）。アフィニティーカラムとして、プロテインAカラムおよびプロテインGカラムを使用することができる。プロテインAカラムとしては、例えば、ハイパーD、POROS、およびセファロースF.F（Pharmacia）が含まれる。

アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が含まれる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. et al.）。クロマトグラフィーは、HPLCおよびFPLCなどの液層クロマトグラフィーによって行うこともできる。

本発明の抗体の抗原結合性を測定するために、例えば、吸光度測定、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、酵素免疫アッセイ法（EIA）、放射免疫アッセイ法（RIA）、免疫蛍光検査法を用いても良いが、これらに限定されない。ELISAの場合、本発明の抗体をプレート上に固定化し、本発明のペプチドを添加し、次いで抗体産生細胞の培養上清または精製抗体を含む試料を添加する。続いて抗原結合性を測定される抗体を認識し、検出可能な標識を有する二次抗体を添加する。プレートを洗浄後、二次抗体の標識を検出するための試薬を添加し、吸光度等を測定する。例えば、二次抗体の標識としてはアルカリフォスファターゼ等の酵素を用いることができ、検出するための試薬としてはｐ−ニトロフェニルリン酸等の酵素基質を用いることができる。また、抗体の活性評価には、BIAcore（Pharmacia）を用いることもできる。

本発明の抗体は、サンプル中に含まれる本発明のペプチドを検出することができる。すなわち、本発明の抗体を、例えば、癌組織生検に曝露することにより、癌組織中に本発明のペプチドが存在することを確認することが可能となる。

本発明のペプチドを用いて癌の治療および／または予防のための処置を行うに先立ち、本発明の抗体を用いて治療対象の癌が本発明のペプチドを発現していることを確認することにより、治療開始以前にその効果が期待できる被験対象を予測することが可能となる。

さらに、本発明の抗体は、種々の癌細胞で発現亢進しているCDH3のペプチド断片を認識する抗体であるため、診断のみならず治療への応用も期待される。

（４）ヘルパーT細胞、キラーT細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団
本発明はまた、本発明のペプチドを用いてインビトロ刺激により誘導されたヘルパーT細胞、キラーT細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団に関する。例えば、末梢血リンパ球や腫瘍浸潤リンパ球を本発明のペプチドを用いて、インビトロで刺激すると腫瘍反応性活性化T細胞が誘導され、この活性化されたT細胞は養子免疫療法に有効に用いることができる。また本発明のペプチドを強力な抗原提示細胞である樹状細胞に負荷、あるいは遺伝子導入により発現させて、これらを用いてＴ細胞をインビボあるいはインビトロで刺激することにより、抗腫瘍免疫応答を誘導することができる。

好ましくは、本発明のペプチドと、免疫賦活剤とを用いてインビトロ刺激により、ヘルパーT細胞、キラーT細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を誘導することができる。ここで用いる免疫賦活剤としては、細胞増殖因子又はサイトカインなどが挙げられる。

上記のようにして得られたヘルパーT細胞、キラーT細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を体内に移入することにより、腫瘍を抑制することができ、癌を予防及び／又は治療することが可能である。

また、本発明のペプチドを用いることにより、上記した通り腫瘍を抑制することができるヘルパーT細胞、キラーT細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を作製することができる。従って、本発明によれば、本発明のペプチドを含む細胞培養液が提供される。この細胞培養液を用いることにより、腫瘍を抑制することができるヘルパーT細胞、キラーT細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を作製することができる。さらに、本発明によれば、上記の細胞培養液、及び細胞培養容器を含む、ヘルパーT細胞、キラーT細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を作製するための細胞培養キットも提供される。

（５）抗原を提示するエキソソーム
本発明はさらに、本発明のペプチドとHLA抗原の間で形成された複合体をその表面上に提示するエキソソームと呼ばれる細胞内小胞を提供する。エキソソームは、例えば、第平11-510507号および第2000-512161号の公開された日本語翻訳文に詳細に記載された方法を用いることにより調製することができ、好ましくは、治療および/または予防の標的である被検体から得られた抗原提示細胞を用いて調製される。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様に、癌ワクチンとして接種することができる。

本発明において用いられるHLA抗原の型は、処置および/または予防を必要とする被検体のHLA抗原の型と一致しなければならない。例えば、HLA-A2が挙げられ、好ましくはHLA-A2 (HLA-A*0201)が挙げられる。「HLA-A2」は蛋白質を意味し、「HLA-A*0201」は該蛋白質を細分化する遺伝子を指す（現時点では細分化された蛋白質を表現する記号が無いため上記のように記載している）。

（６）抗原提示細胞、キラーT細胞の誘導方法
本発明は、本発明の1つまたは複数のペプチドを用いて抗原提示細胞を誘導する方法を提供する。末梢血単球から誘導した樹状細胞に本発明の１つまたは複数のペプチドを負荷して、刺激することにより抗原提示細胞を誘導することができる。本発明のペプチドを被検体へ投与する場合、本発明のペプチドを細胞表面に提示している抗原提示細胞を、被検体の生体内において誘導することができる。あるいは、本発明のペプチドと抗原提示細胞とを接触させた後（あるいは本発明のペプチドを抗原提示細胞へ負荷した後）、該細胞をワクチンとして被検体に投与するエクスビボ法を用いることができる。例えば、エクスビボ投与は以下の工程を含みうる：
（１） 被検体から抗原提示細胞を収集する工程、および
（２） 工程（１）の抗原提示細胞と本発明のペプチドとを接触させる（あるいは工程（１）の抗原提示細胞に本発明のペプチドを負荷する）工程。

工程（２）により得られた抗原提示細胞は、被検体へワクチンとして投与することができる。

本発明はまた、高レベルのキラーT細胞誘導活性をもつ抗原提示細胞を誘導するための方法を提供する。該方法はインビトロで、本発明の1つまたは複数のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を抗原提示細胞へ導入する工程を含む。導入する遺伝子は、DNAまたはRNAでありうる。導入の方法は、例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム法のような、当分野において通常行われる様々な方法が適切に用いられうるが、これらに限定されない。より具体的には、トランスフェクションは、Reeves ME, et al., (1996) Cancer Res., 56:5672-7; Butterfield LH, et al., (1998) J. Immunol., 161:5607-13; Boczkowski D, et al., (1996) J Exp. Med., 184:465-72; 国際公開第2000-509281号の公開された日本語翻訳文に記載されているように行われうる。遺伝子を抗原提示細胞へ移入することにより、遺伝子は、細胞において転写、翻訳などを受け、その後、得られたタンパク質は、MHCクラスIまたはクラスII経路によりプロセシングされ、抗原提示経路を通って、部分的ペプチドとして抗原提示細胞表面に提示される。

本発明はさらに、本発明の1つまたは複数のペプチドを用いてキラーT細胞を誘導するための方法を提供する。本発明の1つまたは複数のペプチドを被検体に投与することにより、被検体の生体内においてキラーT細胞を誘導し、腫瘍組織におけるCDH3を提示する癌細胞を標的とする免疫系を増強することができる。あるいは、本発明の1つまたは複数のペプチドを被検体由来の抗原提示細胞およびCD8陽性細胞とインビトロで接触させ、さらに末梢血単核白血球と抗原提示細胞をインビトロで接触させ、刺激することにより、活性化したキラーT細胞を誘導することができる。エクスビボ治療法においては、この活性化したキラーT細胞を被検体へ戻すことで、被検体における腫瘍組織中のCDH3を提示する癌細胞を標的とする免疫系を増強することができる。例えば、方法は以下の工程を含みうる：
（１）被検体から抗原提示細胞を収集する工程、
（２）工程（１）の抗原提示細胞と本発明のペプチドとを接触させる工程（あるいは工程（１）の抗原提示細胞に本発明のペプチドを負荷する工程）、
（３）細胞傷害性T細胞を誘導するために、工程（２）の抗原提示細胞をCD8⁺ T細胞と混合し共培養する工程、および
（４）工程（３）の共培養物からCD8⁺ T細胞を収集する工程。

工程（４）により得られた細胞傷害活性をもつCD8⁺ T細胞は、ワクチンとして被検体に投与することができる。

本発明はさらに、本発明の1つまたは複数のペプチドを用いて誘導される単離されたキラーT細胞を提供する。本発明の方法により誘導されるキラーT細胞は、好ましくは、処置および/または予防の標的である被検体由来である。本発明の1つもしくは複数のペプチドを提示する抗原提示細胞またはエキソソームを含む他の薬物と組み合わせて投与することができる。得られたキラーT細胞は、誘導に用いられたものと同じペプチドを提示する標的細胞に対して特異的である。標的細胞は、CDH3を内因的に発現させる細胞、またはCDH3遺伝子がトランスフェクションされている細胞である。本発明のペプチドによる刺激により、本発明のペプチドを細胞表面上に提示する細胞、例えば、膵癌、胆管細胞癌、胃癌、大腸癌、非小細胞肺癌、精巣癌、子宮頸癌、骨肉腫、軟部肉腫等由来の癌細胞は攻撃の標的になりうる。

本発明はまた、HLA抗原と本発明の1つまたは複数のペプチドとの間で形成された複合体を提示する抗原提示細胞を提供する。本発明の1つまたは複数のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするヌクレオチドを発現させる抗原提示細胞は、好ましくは、処置および/または予防の対象である被検体より採取した抗原提示細胞である。本発明のペプチド、ペプチドを提示する抗原提示細胞、エキソソーム、もしくは活性型キラーT細胞は他の薬物と組み合わせて、ワクチンとして投与することができる。

以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

［実施例１］
悪性腫瘍におけるCDH3の発現
過去のcDNAマイクロアレイ解析によるとCDH3は隣接する正常組織と比較して胃癌や大腸癌など様々な悪性腫瘍において発現が亢進していた。(表１) (Nakamura T, et al., Oncogene 2004;23:2385-2400., Kitahara O, Cancer Res 2001;61:3544-3549., Obama K, et al. Hepatology 2005;41:1339-1348.)

^＊相対発現比（癌／正常組織）>５のとき、陽性とみなす。

［実施例２］
HLA-A2に結合性を示すCDH3ペプチドレパートリーの選択
ヒトCDH3のアミノ酸配列をBIMAS system により検索して、推定されたHLA-A2との結合親和性(binding affinity) が高いものから順に18種類を選択した（表２）。

本発明で同定されたHLA-A2拘束性キラーＴ細胞エピトープを下線で示す。

[実施例３]
先に報告した方法を用いて（Komori Hら、Clinical Cancer Research 12: 2689-2697, 2006）、まずHLA-A2トランスジェニックマウスの骨髄細胞から樹状細胞（DC）を誘導した。このようにして得られたBM-DCに、CDH3ペプチドを添加（10μM）し、HLA-A2トランスジェニックマウスの一匹あたり5×10⁵の個数を腹腔内に投与した。1週間の間隔をおいて2回同様に投与しマウスを免疫した後、マウスの脾細胞を回収してキラーT細胞の検出に用いた。CD8^＋T細胞由来のキラーT細胞の誘導を厳密に検討するために、脾臓の採取後に脾細胞からMACS ビーズを用いてCD4⁺ T細胞を取り除いたものを用いた。

図１は、HLA-A2トランスジェニックマウスにおいて、HLA-A2拘束性キラーT細胞が認識するCDH3ペプチドの決定までのプロトコールを示す。（免疫されたマウスからの脾細胞回収日をDay0とする）
Day-21 (1)HLA-A2トランスジェニックマウスの骨髄細胞にGM-CSFを加え、骨髄由来の樹状細胞（以下BM-DC）の誘導を開始する。
Day-14 (2) 誘導したBM-DCに3種類のCDH3ペプチドの混合物を添加し、2時間後に1匹あたり5×10⁵個を腹腔内に投与する。
(1)(2)を1週毎2回繰り返す。
Day 0 免疫したHLA-A2トランスジェニックマウスの脾細胞を回収し、再びBM-DCを CDH3ペプチドと2時間インキュベートしたものと共培養した後に、6日間培養した。
Day 6 CDH3ペプチドを特異的に認識するキラーT細胞を検出するために、抗原刺激後にガンマーインターフェロン（INF-γ）を産生するT細胞を、ELISPOT法により定量した。ターゲット細胞としてBM-DCに、それぞれのCDH3ペプチドを負荷したものと、負荷していないものを利用した。

ELISPOT法によるCDH3特異的キラーT細胞活性の検討
これらの誘導したキラーT細胞の中に、確かにCDH3に特異的に反応してIFN-γを産生するものが存在するかどうかをELISPOT法にて検出した。IFN-γの検出は、Mouse IFN-γ ELISPOT set (BD社)を用いて行った。刺激細胞（ターゲット）に対して、キラーT細胞（エフェクター）が反応してIFN-γを産生すると、それぞれが赤いスポットとして検出される。標的細胞として、BM-DCと、CDH3ペプチドを負荷したBM-DCを用いた。まず、抗マウス IFN-γ抗体を、ELISPOTプレート(BD Bioscience社)に18時間コーティングした。その後、10％FCS/RPMIにて2時間ブロッキングを行った。エフェクター細胞(100μL /well)と標的細胞(100μL /well)を混合し、37℃で22時間培養した。エフェクター／ターゲット比（E/T比）は、10：1で実験を行なった。その後、プレートを滅菌水で洗浄し、ビオチン化抗マウスIFN-γ抗体と2時間、さらにストレプトアビジン-HRPと1時間反応させ、基質溶液にてIFN-γ陽性のスポットを検出した。スポットのカウントは、MINERVA TECH社の自動解析ソフトを用いて行った。この結果、CDH3-4、CDH3-7ペプチドで誘導したキラーT細胞において、CDH3特異的キラーT細胞の免疫応答が観察されたが、その他のペプチドで誘導したキラーT細胞については、CDH3特異的な免疫応答は観察されなかった (図２および図３)。
CDH3-4（配列番号：１）およびCDH3-7（配列番号：２）ペプチドで誘導したキラーT細胞のELISPOT解析結果を図３に示す。

キラーT細胞はCDH3-4（配列番号：１）ペプチドをパルスしたBM-DCに反応し283.7±40.0スポット／ウェルを示したが、ペプチドを負荷されていないBM-DCでは48.7±11.9スポット／ウェルであった（P < 0.05）。同様に、キラーT細胞はCDH3-７（配列番号：２）ペプチドをパルスしたBM-DCに反応し79.3±3.2スポット／ウェルを示したが、ペプチドを負荷されていないBM-DCでは42.7スポット／ウェルであった（P < 0.05）。

統計解析
ELISPOTアッセイで得られたデータと治療群間の腫瘍サイズの統計学的有意差はtwo-tailed Student’s t testにより評価した。P値0.05未満を有意とした。統計解析には市販の統計ソフトを使用した(SPSS for Windows（登録商標）, version 11.0、シカゴ、イリノイ州、米国)。

[実施例４]
細胞株およびHLA発現
細胞傷害活性の評価に用いたヒト膵癌細胞株PANC1、口腔癌細胞株HSC3、TAP欠損およびHLA-A2 (A*0201)-陽性細胞株T2は理化学研究所cell bank（筑波、日本）より購入した。ヒト膵癌細胞株PK8は東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより提供を受けた。ヒト大腸癌細胞株HCT116はDr. B. Vogelstein, Johns Hopkins University (Baltimore, MD, USA) から提供を受けた。ヒト肝癌細胞株SKHep1は久留米大学伊藤恭悟教授より提供を受けた。HLA-A2陽性血液ドナーの選択及び細胞毒性試験のための細胞株の選別のために、抗HLA-A2モノクローナル抗体BB7.2(One Lambda社)を用いたフローサイトメトリーによりHLA-A2の発現を検査した。また、これらの細胞は10% FCS含有RPMI1640またはDMEM培地中で37^oC、5%CO₂の条件で培養した。

レンチウイルスによる遺伝子導入
レンチウイルスベクターを用いた遺伝子導入は従来の方法を用いた(Tahara-Hanaoka S, et al. Exp Hematol 2002;30:11-17.)。すなわち、CDH3のcDNAを組み込んだ17μgの自己不活性化ベクターCSII-CMV-RfAおよびCSIIEF-RfA (Miyoshi H, et al. J Virol 1998;72:8150-8157.)、10μgのpCMV-VSV-G-RSV-RevおよびpCAG-HIVgpを、リポフェクタミン2000（Invitrogen、CA、USA）を用いて10cm培養皿中で増殖させた293T細胞を形質転換した。60時間後に培養液を回収し、超遠心(50,000 × g, 2時間)によりウイルス粒子をペレット化した。ペレットを50μLのRPMI1640培地に懸濁し、10μLのウイルス懸濁液を平底96穴プレートに1ウェルあたり5×10⁴個となるように播種したPANC1細胞またはSKHep1細胞へ加えた。遺伝子導入したCDH3の発現はウエスタンブロットにより確認した。

CDH3応答性ヒトCTLの誘導
HLA-A2陽性の膵癌患者、胃癌患者、結腸直腸癌患者または健常人ドナーのヘパリン処理血液由来のPBMCはFicoll-Conray密度勾配遠心法により単離し、末梢単核球由来のDCは過去に報告された方法で調整した(Yoshitake Y, et al. Clin Cancer Res 2004;10:6437-6448., Komori H, et al. Clin Cancer Res 2006;12:2689-2697.)。熱不活性自己血漿2%含有AIM-V (Invitrogen) 中、37℃で２時間、4μg/mLのβ2-ミクログロブリン(Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国)の存在下で20μg/mL の候補ペプチドをDCへパルスした。このDCへ放射線照射し(40Gy)、CD8陽性細胞とともにインキュベートした。この培養は２４穴プレートで行い、各ウェルは2％の自己血漿含有AIM-V2mL中に、1×10⁵個のペプチドパルスDC、2×10⁶個のCD8陽性T細胞および5ng/mLのヒト組み換えIL-7(Wako、大阪、日本)となるよう調整した。２日後、ヒト組み換えIL-2(PeproTec Inc.)を最終濃度が20IU/mLになるよう加えた。さらに７日目と１４日目に、同じペプチド負荷自己DCを用いて同様の方法で１週毎2回刺激した。最後の刺激から６日後、誘導されたCTLの抗原特異的反応を⁵¹Cr放出試験およびINF-γ ELISPOT法により評価した。各種癌細胞またはペプチド負荷T2細胞(5×10³個/ ウェル)を標的細胞として、適切なエフェクター/標的比でCTLと共培養し、既存の方法により⁵¹Cr放出試験を行った(Komori H, et al. Clin Cancer Res 2006;12:2689-2697.)。

CDH3-4_655-663およびCDH3-7_757-765ペプチドの刺激によりHLA-A2陽性の健常人ドナーおよび種々の癌患者由来のPBMCよりCDH3特異的CTLの誘導を試みた。PBMCより分画されたCD8T細胞をそれぞれのペプチドをパルスした自己単核細胞由来DCとインキュベートした。3回刺激の後、ペプチドパルスされたT2細胞に対する殺細胞効果を⁵¹Cr放出試験（図４Ａ）およびINF-γ ELISPOT法により評価した。健常人ドナーのPBMCにより誘導されたCTLは、CDH3-4_655-663またはCDH3-7_757-765ペプチドをパルスされたT2細胞に対して殺細胞効果を示したが、ペプチドを負荷していないT2細胞に対してはその効果を示さなかった。同様の応答が他のドナーにおいても確認された。これらの結果より、本CTLはペプチド特異的な細胞傷害性を有することが示された。

次に、これらのCTLのCDH3およびHLA-A2発現ヒト癌細胞株への細胞傷害活性を確認した。図４Ｂに示すように、健常人ドナーにおいては、CDH3-4_655-663ペプチドで刺激したCDH3応答性CTLは、HCT116(CDH3+, HLA-A2+)、HSC3(CDH3+, HLA-A2+)およびCDH3遺伝子形質転換PANC1細胞であるPANC1/CDH3(CDH3+, HLA-A2+)に対して細胞傷害性を示したが、PANC1(CDH3-, HLA-A2+)、SKHep1(CDH3-, HLA-A2+)およびPK8(CDH3+, HLA-A2-)にはその効果を示さなかった。同様に、CDH3-7_757-765ペプチドで刺激したCTLはHSC3に細胞傷害性を示したが、PANC1、PK8およびSKHep1にはその効果を示さなかった。これらの細胞傷害活性は種々の癌患者由来のCTLにおいても確認された（図４C）。

これらのペプチドが自然の条件下でCDH3タンパク質からプロセシングされるかどうか確認するため、標的としてPANC1/CDH3およびCDH3遺伝子形質転換SKHep1細胞であるSKHep1/CDH3(CDH3+, HLA-A2+)を用いた。図４Ｃに示すように、CDH3-4_655-663 or with CDH3-7_757-765ペプチドで刺激して誘導したCTLは、HCT116、 PANC1/CDH3およびSKHep1/CDH3へは細胞傷害性を示したが、PANC1、SKHep1およびPK8には示さなかった。以上より、これらのペプチドは自然条件下でプロセシングされ癌細胞の表面にHLA-A2分子と共に提示されることが示唆された。これらの結果より、CDH3応答性CTLは内在性のCDH3およびHLA-A2分子を発現している癌細胞に対して特異的な細胞傷害性を有する。

HLA-クラスI拘束性の確認
誘導したCTLがHLA-クラスI拘束性に標的細胞を認識するか否かについて確認するため、⁵¹Cr放出試験およびELISPOT法のためのCTLと癌細胞株の共培養前に、標的癌細胞は10 μg/mLの抗クラスI mAb（W6/32）または10 μg/mLの抗HLA-DR mAb（H-DR-1）と１時間インキュベートし、CTLによる細胞傷害活性またはIFN-γの産生に与えるmAbの効果を従来の方法で評価した(Gomi S, et al. J Immunol 1999;163:4994-5004.)。この結果、抗HLA-クラスI抗体は、CDH3-4_655-663ペプチドで刺激して産生したCTLによるSKHep1/CDH3に対するELISPOT 法ではINF-γの産生を統計学的有意差を持って抑制した（図４Ｄ左、P < 0.01）。また、⁵¹Cr放出試験においてもHCT116に対して細胞傷害活性を抑制した（図４Ｄ中央）。同様に、抗クラスI抗体もまたCDH3-7_757-765ペプチドによる刺激で産生したCTLによるHSC3細胞に対するELISPOT 法でINF-γの産生を統計学的有意差を持って抑制した（図４Ｄ右、P < 0.01）。以上より、HLA-クラスI拘束性にCDH3発現標的細胞を認識するCTLが誘導されていることが示唆された。

[実施例５]
養子免疫療法
NOD/SCIDマウスに対する養子免疫したCDH3誘導ヒトCTLのin vivoでの抗癌活性
CDH3陽性ヒト癌細胞移植マウスへのCDH3応答性CTL接種の治療効果を評価するため、実験的養子免疫治療が従来の方法で行われた(Komori H, et al. Clin Cancer Res 2006;12:2689-2697.)。簡潔には、NOD/SCIDマウスの右側腹部へHLA-A2および内生のCDH3陽性細胞であるHCT116細胞(4×10⁶個)を皮下注射で接種した。マウスへ腫瘍接種した後７日目で腫瘍サイズが25mm²になったときに、100μLのPBSに懸濁 させた５人の健常人ドナー由来のCDH3 peptide-4_655-663、-7_757-765-特異的CTL株または陰性コントロールとしてHLA-A2拘束性HIVペプチド (SLYNTYATL、配列番号：１９)で刺激されたCD8陽性T細胞株(4×10⁶個)を静脈注射した。さらに、このT細胞を１４日目に静脈注射した。腫瘍サイズは１週間に２度測定され、ノギスで垂直な２つの直径を測定することで評価した。腫瘍サイズの統計学的有意差はtwo-tailed Student’s t testにより評価した。P値0.05未満を有意とした。統計解析には市販の統計ソフトを使用した(SPSS for Windows（登録商標）, version 11.0)。

in vitroにおいても、コントロールHIVペプチド刺激CD8陽性T細胞はHCT116細胞に対して細胞傷害性を示さなかった。各グループでの各7匹のマウスの腫瘍サイズ（図５Ａ）と各グループの腫瘍サイズの平均±標準偏差（図５Ｂ）を評価した。コントロールＴ細胞株やPBSでは腫瘍成長に抑制的な効果を示さなかったが、CDH3刺激CTLを接種したマウスの腫瘍サイズはコントロールHIVペプチド誘導CD8陽性T細胞またはPBSのみの接種と比較して有意に小さくなった(P < 0.001)。これらの結果より、NOD/SCIDマウスのCDH3陽性ヒト腫瘍に対する、CDH3応答性ヒトCTLの養子免疫治療の効果が認められた。

考察
本実験により、新規TAAとしてCadherin 3 (CDH3)/P-cadherinが膵癌のcDNAマイクロアレイ分析により同定された。CDH3は膵癌細胞において強く発現しているが、cDNAマイクロアレイ分析によると卵巣および乳腺に、ごく僅かに発現している以外は、他の重要な組織においてもほとんど検出されなかった。さらに、マイクロアレイならびにRT-PCRデータは、CDH3は、膵癌と同様に、胃癌、結直腸癌で発現しているが、対応する正常組織においてはほとんど発現していないことを示した。CDH3は、免疫組織染色により膵臓の正常管や腺房細胞ではほとんど発現が確認されていないが、膵癌組織の大部分で過剰発現していることは既に報告されている(Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005;65:3092-3099.)。これらの結果よりCDH3は、上記癌に対して自己免疫反応を誘導する危険性が少ない、新規免疫療法の標的であることが示唆されている。

カドヘリンファミリーは、その組織分布によってCadherin 1 (CDH1)/E-cadherin、Cadherin 2 (CDH2)/N-cadherinおよびCadherin 3 (CDH3)/P-cadherinを含む様々なサブファミリーに分類されている。CDH1は全ての上皮組織で発現している主要なカドヘリンファミリーである。CDH1は腫瘍細胞の浸潤や転移を抑制的に制御する癌抑制因子として働くと考えられている(Frixen U H, et al. J Cell Biol 1991;113:173-185., Berx G, et al. Genomics 1995;26:281-289., Oka H, et al. Cancer Res 1993;53:1696-1701.)。CDH2は浸潤癌で発現上昇しており、fibroblast growth factor (FGF)レセプターと相互作用や下流シグナルにより浸潤現象に関与している(Suyama K, et al. Cancer Cell 2002;2:301-314.)。癌におけるCDH3の発現と役割はほとんど解明されていない。これまでの研究により、TaniuchiらはCDH3の発現亢進はp120ctnとRhoファミリーGTPaseであるRac1やCdc42との相互作用により膵癌の浸潤性を強める因子となっていると示唆している(Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005;65:3092-3099.)。他の研究により、CDH3はまた、乳癌(Palacios J, et al. Am J Pathol 1995;146:605-612., Paredes J, et al. Clin Cancer Res 2005;11:5869-5877., Peralta Soler A, et al. Cancer 1999;86:1263-1272.)や子宮内膜癌(Stefansson I M, et al. J Clin Oncol 2004;22:1242-1252.)での浸潤性の増大と予後不良の因子であると示唆されている。

これまでの報告をまとめると、臨床研究における癌ワクチンの奏効率は２．６％と低い(Rosenberg S A, et al. Nat Med 2004;10:909-915.)。一つの可能性として、癌細胞の免疫逃避が免疫誘導治療の結果として引き起こされるTAAの欠損、変異、発現低下が原因として挙げられる。この点、癌細胞において腫瘍発生に必須な抗原を失うことはできないため、抗癌免疫治療の候補TAAとしてCDH3は有用であると考えられる。

本発明において、BIMASアルゴリズムにより選別された１８の候補ペプチドの中から、HLA-A2.1 (HHD)トランスジェニックマウスにおいてHLA-A2拘束性マウスCTLの誘導を確認できた２つのHLA-A2拘束性CDH3エピトープペプチドが同定された。さらに、健常人ドナーおよび癌患者のPBMCから本ペプチドを用いてCDH3応答性CTLの産生を確認した（図４）。これらのCTLは対応するペプチドを負荷するT2細胞だけでなくCDH3ならびにHLA-A2を発現する癌細胞株に対しても殺細胞効果を示した。以上より、本CDH3ペプチド(CDH3-4_655-663 and CDH3-7_757-765)は癌細胞のCDH3タンパク質から自然なプロセシングにより産生され、HLA-A2分子と共に細胞表面に提示された後に、CTLに認識されることが示唆された。

本発明のCDH3応答性CTLの細胞傷害性はin vitroでの ⁵¹Cr放出試験だけでなくin vivoでの CTL養子免疫療法でもその効果が確認された。図５に示すように、コントロールCD8陽性細胞等と比較して、本ペプチドで誘導されたCD8陽性細胞を静脈注射により接種することでNOD/SCIDマウスに移植された腫瘍の成長を有意に抑制した。

HLA- A2 (A*0201)はアジア、アフリカ、黒色人種、白色人種を含む様々な人種において、最も一般的なHLA対立遺伝子の一つである(Browning M. et al. Immunol Today 1996; 17:165-170.)。以上より、本発明により同定された、HLA-A2を介してキラーT細胞に提示されるペプチドを用いて、探索医療で癌免疫療法の安全性と有効性を示せれば、世界中で臨床応用できる可能性がある。また、日本人のみならず世界中に所有者の頻度が高いHLA-A2により、キラーT細胞に提示されるペプチドを同定することにより、世界中の膵癌患者の約30％に応用可能な、癌免疫療法薬が開発される可能性が高い。

HLA-A2は、日本人集団では約30%のヒトが所有するHLAクラスI対立遺伝子である。本発明の対象となるCDH3ペプチドは、ヒトHLA-A2を発現するトランスジェニックマウスにペプチドを免疫した際に、HLA-A2分子と結合したペプチドを認識して免疫応答を示す細胞傷害性T細胞を誘導できる。本ペプチドは、ヒトにおいても当該ペプチドとHLA-A2分子の複合体を発現する癌細胞を破壊する、ヒト細胞傷害性T細胞を誘導できる可能性が高い。したがって、本発明が対象とするペプチドは、HLA-A2を所有する、膵癌、胆管細胞癌、胃癌、大腸癌、および非小細胞肺癌の患者の免疫療法に応用することが可能であり、これらの癌の増殖や進展を抑制することにより、患者のQOLを改善できることが期待される。

Claims (18)

1. 配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
2. 配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンに置換されたアミノ酸配列からなり、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を有するペプチド。
3. （ａ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列または（ｂ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列においてＮ末端から２番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンに置換されたアミノ酸配列において、Ｃ末端アミノ酸がバリンまたはロイシンに置換されたアミノ酸配列からなり、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を有するペプチド。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドを有効成分として１種類以上含有する、ＣＤＨ３を発現する癌に対する免疫誘導剤。
5. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドを有効成分として１種類以上含有する、ＣＤＨ３を発現する癌の治療及び／または予防のための薬剤。
6. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドを有効成分として１種類以上含有する、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を示す抗原提示細胞を誘導するための薬剤。
7. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効成分として１種類以上含有する、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を示す抗原提示細胞を誘導するための薬剤。
8. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドを有効成分として１種類以上含有する、細胞傷害性（キラー）T細胞を誘導するための薬剤。
9. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドに対する抗体。
10. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドを用いて誘導される、細胞傷害性（キラー）Ｔ細胞、又はこれを含む免疫細胞集団。
11. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドおよびＨＬＡ抗原を含む複合体を提示する抗原提示細胞。
12. 請求項６または７に記載の薬剤によって誘導される、請求項１１に記載の抗原提示細胞。
13. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドおよびＨＬＡ抗原を含む複合体を提示するエキソソーム。
14. ＨＬＡ抗原がHLA-A2 (HLA-A*0201)である、請求項１３に記載のエキソソーム。
15. 抗原提示細胞を請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドとインビトロで接触させる工程を含む、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を示す抗原提示細胞を誘導する方法。
16. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをインビトロで抗原提示細胞へ導入する工程を含む、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を示す抗原提示細胞を誘導する方法。
17. Ｔ細胞を請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドとインビトロで接触させる工程を含む、細胞傷害性（キラー）T細胞を誘導する方法。
18. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドとインビトロで接触させた抗原提示細胞を、CD8⁺T細胞と共培養する工程を含む、細胞傷害性（キラー）T細胞を誘導する方法。

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