ES2534437T3

ES2534437T3 - Anticuerpos anti-CDH3 marcados con etiqueta de radioisótopo y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2534437T3
Application number: ES09773163.2T
Authority: ES
Inventors: Akira Togashi; Masakazu Katsu; Megumi Takayanagi; Hiroki Yoshioka; Pohsing Ng; Yasuhiro Shiba; Yusuke Nakamura; Keigo Endo
Original assignee: Oncotherapy Science Inc
Current assignee: Oncotherapy Science Inc
Priority date: 2008-06-30
Filing date: 2009-06-30
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2029-06-30
Also published as: KR20110025215A; CN102137929A; WO2010001585A1; US20120128584A1; CN102137929B; BRPI0913656A2; EP2313504B1; US8435749B2; CA2729403A1; EP2313504A4; JP5593560B2; EP2313504A1; RU2011103199A; JP2011526583A

Abstract

Un anticuerpo o un fragmento del mismo, que reconoce específicamente un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 3, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo es (i) un anticuerpo que comprende regiones variables definidas por las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y 12, o un fragmento de unión del anticuerpo, en el que dicho fragmento de unión comprende regiones variables definidas por las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y 12; o (ii) un anticuerpo definido por CDR de VH que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, 14 y 15 y CDR de VL que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 17 y 18, o un fragmento de unión del anticuerpo, en el que dicho fragmento de unión comprende CDR de VH que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, 14 y 15 y CDR de VL que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 17 y 18.

Description

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Toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen cadena A de la difteria, fragmentos activos de no unión de toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado del 28 de octubre de 1993.

La invención contempla además anticuerpo conjugado con una variedad de isótopos radiactivos. Ejemplos incluyen 111In,211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P e isótopos radiactivos de Lu. En la presente invención, el anticuerpo de la presente invención puede marcarse con radionúclidos justo antes de uso, o proporcionarse como anticuerpo radiomarcado. El médico habitual se dará cuenta de que hay numerosos radionúclidos y agentes quimiocitotóxicos que pueden acoplarse a anticuerpos específicos de tumor por técnicas muy conocidas y administrarse a un sitio para dañar específicamente células tumorales y tejido (véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. nº 4.542.225 de W. A. Blattler y col., concedida el 17 de septiembre de 1985; y Pastan y col., 1986, Cell, 47:641-648). Por ejemplo, reactivos de obtención de imágenes y citotóxicos que son adecuados para su uso incluyen 125I, 123I, 111In (por ejemplo, Sumerdon y col., 1990, Nucl. Med. Biol., 17:247-254) y 99mTc; marcas fluorescentes tales como fluoresceína y rodamina; marcas quimioluminiscentes tales como luciferina, e iones paramagnéticos para su uso en imagen por resonancia magnética (Lauffer y col., 1991, Magnetic Resonance in Medicine, 22:339-342). Los anticuerpos pueden marcarse con tales reactivos usando protocolos y técnicas conocidos y puestos en práctica en la materia. Véanse, por ejemplo, Wenzel y Meares, Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, Nueva York, 1983; Colcer y col., 1986, Meth. Enzymol., 121:802-816; y Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Eds. Baldwin y col., Academic Press, 1985, pág. 303-316, para técnicas referentes al radiomarcado de anticuerpos. Se han descrito anticuerpos monoclonales marcados con itrio-90 (90Y) para maximizar la dosis administrada al tumor o células cancerosas y/o tejido, mientras que se limita la toxicidad a tejidos normales (por ejemplo, Goodwin y Meares, 1997, Cancer Supplement, 80:2675-2680). También pueden usarse otros radionúclidos citotóxicos que incluyen, pero no se limitan a, yodo-131 (131I) y renio-186 para marcar anticuerpos monoclonales de la presente invención. Entre los radionúclidos, el itrio-90 (90Y) puede ser adecuado para radioinmunoterapia, ya que el itrio-90 (90Y) proporciona ventajas con respecto al yodo-131 (131I) debido a que libera mayor energía beta (2,3 MeV frente a 0,61 MeV) al tumor y tiene una longitud de paso de 5 a 10 mm, produciendo la capacidad mejorada de destruir tanto células elegidas como diana como vecinas, una ventaja particularmente en tumor voluminoso o poco vascularizado. La marca detectable/de detección usada está seleccionada según la modalidad de obtención de imágenes que vaya a usarse. Por ejemplo, pueden usarse marcas radiactivas, tales como indio-111 (111In), tecnecio-99m (99m Tc) o yodo-131 (131I), para barridos planos o para tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT). Por tanto, pueden usarse marcas emisoras de positrones tales como flúor-19 en tomografía de emisión de positrones (PET). Pueden usarse iones paramagnéticos, tales como gadolinio (III) o manganeso (II), en imagen por resonancia magnética (IRM). Los anticuerpos monoclonales también pueden marcarse con marcas radiopacas para la visualización de células cancerosas después de la inyección, por ejemplo, por rayos X, CATscan o IRM. En particular, para enfermedad relacionada con CDH3 (por ejemplo, cánceres), la localización de la marca dentro de los cánceres permite la determinación de la diseminación de la enfermedad. La cantidad de marca que está presente y detectable dentro de los cánceres que expresan CDH3 permite, por ejemplo, la determinación de la presencia o ausencia de cáncer o tumor en el sujeto que va a diagnosticarse.

Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico pueden prepararse usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como 3-(2-piridilditiol)propionato de N-succinimidilo (SPDP), succinimidil-4-(Nmaleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo·HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6-diisocianato), compuestos de flúor bisactivos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta y col., Science 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminapentaacético marcado con carbono-14 (MX-DTPA) es un agente quelante a modo de ejemplo para la conjugación de radionucleótido con el anticuerpo (véase el documento WO94/11026). El conector puede ser un “conector escindible” que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede usarse un conector lábil de ácido, conector sensible de peptidasa, conector de dimetilo o conector que contiene disulfuro (Charm y col., Cancer Research 52: 127-131 (1992)).

Alternativamente, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y agente citotóxico puede prepararse, por ejemplo, por técnicas recombinantes o síntesis de péptidos.

En otra realización más, el anticuerpo puede conjugarse con un “receptor” (como estreptavidina) para la utilización en la elección previa como diana de tumores en el que el conjugado de anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de la eliminación del conjugado sin unir de la circulación usando un agente de limpieza y luego administración de un “ligando” (por ejemplo, avidina) que está conjugado con un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido).

Los anticuerpos de la invención también puede conjugarse con una enzima activadora de profármaco que convierte un

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profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico de peptidilo, véase el documento WO81/01145) en un fármaco antineoplásico activo (véase, por ejemplo, el documento WO 88/07378 y la patente de EE. UU. nº 4.975.278).

El componente de enzima de tales conjugados incluye cualquier enzima que pueda actuar sobre un profármaco de tal forma que lo convierta en su forma citotóxica más activa.

Enzimas que son útiles en el procedimiento de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa, útil para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa, útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco antineoplásico fluorouracilo; proteasas tales como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácido; enzimas que escinden hidratos de carbono tales como 13-galactosidasa y neuraminidasa, útiles para convertir profármacos glucosilados en fármacos libres; 13-lactamasa útil para convertir fármacos derivatizados con 13-lactamas en fármacos libres y penicilina amidasas tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, pueden usarse anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como “abzimas”, para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos libres (véase, por ejemplo, Massey, Nature 328: 457458 (1987)). Los conjugados anticuerpo-abzima pueden prepararse como se describen en el presente documento para administrar la abzima a una población de células tumorales.

Las enzimas de la presente invención pueden unirse covalentemente al anticuerpo por técnicas muy conocidas en la técnica tales como el uso de los reactivos de reticulación heterobifuncionales anteriormente tratados. Alternativamente, pueden construirse proteínas de fusión que comprenden al menos la región de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención ligada a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención usando técnicas de ADN recombinante muy conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Neuberger y col., Nature, 312: 604-608 (1984)).

Otras modificaciones del anticuerpo se contemplan en el presente documento. Por ejemplo, el anticuerpo puede ligarse a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos, o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol.

Los anticuerpos desvelados en el presente documento también pueden formularse como liposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, tal como se describen en Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); las patentes de EE. UU. nº 4.485.045 y 4.544.545; y el documento WO97/38731 publicado el 23 de octubre de 1997. Liposomas con tiempo de circulación potenciado se desvelan en la patente de EE. UU. nº 5.013.556.

Pueden generarse liposomas particularmente útiles por el procedimiento de evaporación en fase inversa con una composición de lípido que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido dando liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' de un anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con los liposomas como se describe en Martin y col., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) mediante una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico está opcionalmente contenido dentro del liposoma (véase Gabizon y col., J. National Cancer Inst. 81

(19) 1484 (1989).

Se contemplan modificaciones de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico que codifica el anticuerpo, o por síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se hace cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos postraduccionales del anticuerpo, tales como cambiar el número o posición de los sitios de glucosilación.

Un procedimiento útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son las localizaciones preferidas para mutagénesis se llama “mutagénesis por barrido de alanina” como se describe por Cunningham y Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Aquí se identifica un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen con un aminoácido neutro o negativamente cargado (lo más preferentemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Entonces, aquellas localizaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan introduciendo variantes adicionales u otras variantes en, o para, los sitios de sustitución. Así, mientras que el sitio para la introducción de una variación de la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación por sí misma no necesita predeterminarse. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se realiza barrido

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de ala o mutagénesis al azar en el codón o región diana y las variantes de anticuerpo expresadas se criban para la actividad deseada.

Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones de extremos amino y/o carboxilo que oscilan en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, además de inserciones intrasecuencia de un único residuo de aminoácido o múltiples residuos de aminoácidos. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo en el extremo N o el anticuerpo fusionado con un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión del extremo N o C del anticuerpo con una enzima o un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo sustituido con un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución del anticuerpo incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de FR.

Modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se llevan a cabo seleccionando sustituciones que se diferencian significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto de polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral.

Los residuos que se producen naturalmente pueden dividirse en grupos basándose en propiedades comunes de las cadenas laterales:

(1): hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2): hidrófilos neutros: cys, ser, thr;

(3): ácidos: asp, glu;

(4): básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5): residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6): aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservativas supondrán el intercambio de un miembro de una de estas clases con otra clase.

Cualquier residuo de cisteína que no participe en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo también puede estar sustituido, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir la reticulación anómala. En cambio, pueden añadirse enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente si el anticuerpo es un fragmento tal como un fragmento Fv).

Un tipo particularmente preferido de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, las variantes resultantes seleccionadas para el desarrollo posterior tendrán propiedades biológicas mejoradas con respecto al anticuerpo parental del que se generan. Una forma conveniente de generar tales variantes de sustitución es la maduración por afinidad usando expresión en fago. Brevemente, varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) se mutan para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas se expresan en un modo monovalente en partículas de fago filamentoso como fusiones con el producto del gen III de M13 encapsidado dentro de cada partícula. Entonces, las variantes expresadas en fago se criban para su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se ha desvelado en el presente documento. Con el fin de identificar sitios de la región hipervariable candidatos para la modificación puede realizarse mutagénesis por barrido de alanina para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión al antígeno. Alternativamente, o además, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Tales residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitución según las técnicas elaboradas en el presente documento. Una vez se generan tales variantes, el panel de variantes se somete a cribado como se describe en el presente documento y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden seleccionarse para el posterior desarrollo.

Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glucosilación original del anticuerpo. Por alterar se indica delecionar uno o más restos de hidrato de carbono encontrados en el anticuerpo, y/o añadir uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en el anticuerpo.

La glucosilación de polipéptidos está normalmente tanto ligada a N como ligada a O. Ligado a N se refiere a la unión del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X

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serina y asparagina-X-treonina en las que X es cualquier aminoácido, excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina.

Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un posible sitio de glucosilación. La glucosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, el más comúnmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glucosilación al anticuerpo se realiza convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de forma que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos anteriormente descritas (para sitios de glucosilación ligados a N). La alteración también puede hacerse mediante la adición de, o sustitución con, uno o más residuos de serina

: o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glucosilación ligados a O).

Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de la secuencia de aminoácidos que se producen naturalmente)

: o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR y mutagénesis en casete de una variante preparada anteriormente o una versión de no variante del anticuerpo.

Puede ser deseable modificar los anticuerpos usados en la invención para mejorar la función efectora, por ejemplo, de manera que se potencie la citotoxicidad mediada por células dependiente del antígeno (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede lograrse introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc de un anticuerpo. Alternativamente o además, puede(n) introducirse residuo(s) de cisteína en la región Fc, permitiendo así la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o elevada destrucción de células mediada por complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Véanse Caron y col., J. Exp Med.

176: 1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992).

También pueden prepararse anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral potenciada usando reticulantes heterobifuncionales como se describe en Wolff y col., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente puede manipularse un anticuerpo que tiene regiones Fc duales y así puede tener lisis del complemento potenciada y capacidades de ADCC (véase Stevenson y col., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)).

Para aumentar la semivida en suero del anticuerpo, puede incorporarse un epítope de unión al receptor de rescate en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU.

5.739.277. Como se usa en el presente documento, el término “epítope de unión al receptor de rescate” se refiere a un epítope de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de aumentar la semivida en suero in vivo de la molécula de IgG.

Diagnóstico de una enfermedad que está asociada a CDH3 o de una predisposición a desarrollar la enfermedad

Puede usarse un anticuerpo anti-CDH3 de la invención como marcador para el diagnóstico de una enfermedad que está asociada a CDH3.

Más específicamente, detectando la proteína CDH3 con un anticuerpo anti-CDH3 de la presente invención en una muestra, puede diagnosticarse una enfermedad que está asociada a CDH3. Así, la invención proporciona procedimientos para el diagnóstico de una enfermedad que está asociada a CDH3 o una predisposición a desarrollar una enfermedad que está asociada a CDH3 en un sujeto detectando la proteína CDH3 con un anticuerpo anti-CDH3 de la presente invención en el sujeto. Los procedimientos comprenden las etapas de:

(a): poner en contacto una muestra o un espécimen del sujeto con el anticuerpo o fragmento de la invención;

(b): detectar la proteína CDH3 en la muestra o espécimen; y

(c): juzgar si el sujeto padece o no o está en riesgo de desarrollar la enfermedad basándose en la abundancia relativa de la proteína CDH3 en comparación con un control.

En una realización típica, una enfermedad que está asociada a CDH3 es cáncer pancreático, de pulmón, colon, próstata, mama, gástrico o de hígado.

Alternativamente, en otras realizaciones, el anticuerpo anti-CDH3 de la invención puede usarse para detectar u obtener imágenes un cáncer en un cuerpo vivo. Más específicamente, la presente invención proporciona procedimientos para detectar u obtener imágenes de un cáncer que comprenden las etapas de:

(1) administrar a un sujeto un anticuerpo anti-CDH3 o fragmento de unión del mismo;

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LiC). Alternativamente, según la invención, puede proporcionarse un resultado intermedio para monitorizar el transcurso del tratamiento de PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC o LiC. Tales resultados intermedios pueden combinarse con información adicional para ayudar a un doctor, enfermera u otro médico a determinar si un sujeto padece cáncer pancreático, de pulmón, colon, próstata, mama, gástrico o de hígado. Por tanto, el gen o proteína CDH3 así codificado es un marcador de pronóstico útil para monitorizar el desenlace clínico de PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC o LiC. Alternativamente, la presente invención puede usarse para detectar células cancerosas en un tejido derivado de sujeto, y proporcionar a un doctor información útil para evaluar el transcurso del tratamiento de PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC o LiC. En este procedimiento, se proporciona una población de células de prueba de un sujeto que está recibiendo tratamiento para PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC o LiC. Si se desea, las poblaciones de células de prueba se obtienen del sujeto en diversos momentos de tiempo, antes, durante y/o después del tratamiento. Entonces, se determina la expresión del gen CDH3 en la población de células de prueba y se compara con la expresión de los mismos genes en una población de células de referencia que incluye células cuyo estado de PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC o LiC es conocido. En el contexto de la invención, las células de referencia no deben haberse expuesto al tratamiento de interés.

En el contexto de monitorizar y evaluar un transcurso particular del tratamiento para PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC o LiC, la muestra biológica debe derivarse de un sujeto que está recibiendo tratamiento para cáncer pancreático, de pulmón, colon, próstata, mama, gástrico o de hígado. Preferentemente, se obtienen múltiples muestras biológicas de prueba del sujeto en diversos momentos de tiempo antes, durante o después del tratamiento.

Si la población de células de referencia contiene células no de PaC, células no de LuC, células no de CC, células no de PrC, células no de BC, células no de GC o células no de LiC, una similitud en la expresión del gen CDH3 en la población de células de prueba y la población de células de referencia indica que el tratamiento de interés es eficaz. Sin embargo, una diferencia en la expresión del gen CDH3 en la población de células de prueba y una población de células de referencia de control normal indica un desenlace clínico o pronóstico menos favorable. Similarmente, si la población de células de referencia contiene células PaC, células LuC, células CC, células PrC, células BC, células GC o células LiC, una diferencia entre la expresión del gen CDH3 en la población de células de prueba y la población de células de referencia indica que el tratamiento de interés es eficaz, mientras que una similitud en la expresión del gen CDH3 en la población de prueba y una población de células de referencia de control de PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC o LiC indica un desenlace clínico o pronóstico menos favorable.

Adicionalmente, el nivel de expresión del gen CDH3 determinado en una muestra biológica de un sujeto obtenido después del tratamiento (es decir, niveles después del tratamiento) puede compararse con el nivel de expresión del gen CDH3 determinado en una muestra biológica de un sujeto obtenida antes de la aparición del tratamiento (es decir, niveles antes del tratamiento). Una disminución en el nivel de expresión en una muestra después del tratamiento indica que el tratamiento de interés es eficaz, mientras que un aumento o mantenimiento en el nivel de expresión en las muestra después del tratamiento indica un desenlace clínico o pronóstico menos favorable.

Como se usa en el presente documento, el término “eficaz” indica que el tratamiento conduce a una reducción en la expresión de gen CDH3 o una disminución en el tamaño, prevalencia o potencial metastásico de PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC o LiC en un sujeto. Cuando se aplica un tratamiento de interés profilácticamente, el término “eficaz” significa que el tratamiento retarda o previene que se forme un cáncer de pulmón y/o un tumor esofágico o retarda, previene o alivia un síntoma de PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC o LiC clínicas. La evaluación de tumores pancreáticos, de pulmón, colon, próstata, mama, gástricos o de hígado puede hacerse usando protocolos clínicos estándar.

Además, la eficacia puede determinarse en asociación con cualquier procedimiento conocido para el diagnóstico o tratamiento de PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC o LiC. Pueden diagnosticarse PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC o LiC, por ejemplo, histopatológicamente, o alternativamente identificando anomalías sintomáticas, por ejemplo, pérdida de peso, pérdida de apetito, dolor abdominal, dolor de espalda, anorexia, náuseas, vómitos y malestar general, debilidad e ictericia.

Evaluación del pronóstico de un sujeto con una enfermedad que está asociada a CDH3:

La invención también proporciona procedimientos para evaluar el pronóstico de un sujeto con una enfermedad que está asociada a CDH3, por ejemplo, PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC o LiC, incluyendo tales procedimientos la etapa de comparar la expresión del gen CDH3 en una población de células de prueba con la expresión del gen CDH3 en una población de células de referencia de pacientes con respecto a un espectro de etapas de enfermedad. Comparando la expresión génica del gen CDH3 en la población de células de prueba y la(s) población (poblaciones) de células de referencia, o comparando el patrón de expresión génica con el tiempo en poblaciones de células de prueba del sujeto, puede evaluarse el pronóstico del sujeto.

Alternativamente, según la invención, puede proporcionarse un resultado intermedio para evaluar el pronóstico de un sujeto con PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC o LiC. Tal resultado intermedio puede combinarse con información adicional para ayudar a un doctor, enfermera u otro médico a determinar si un sujeto padece cáncer de pulmón o cáncer esofágico. Alternativamente, la invención puede usarse para detectar células cancerosas en un tejido derivado de sujeto, y

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proporcionar a un doctor información útil para evaluar el pronóstico de un sujeto con PaC, LuC, CC, PrC, BC, GC o LiC.

Por ejemplo, un aumento en la expresión del gen CDH3 en una muestra de prueba en comparación con una muestra de control normal indica un pronóstico menos favorable. En cambio, una similitud en la expresión del gen CDH3, en una muestra de prueba en comparación con muestra de control normal, indica un pronóstico más favorable para el sujeto.

Kits y reactivos para el diagnóstico, pronóstico o tratamiento de una enfermedad asociada a CDH3:

La invención proporciona un kit para el diagnóstico o pronóstico de una enfermedad asociada a CDH3. Específicamente, el kit incluye un reactivo para detectar la proteína CDH3. Reactivos adecuados para detectar la proteína CDH3 incluyen un anticuerpo para la proteína CDH3. Preferentemente, con el fin de seguir el anticuerpo administrado en un cuerpo vivo, el anticuerpo puede marcarse con moléculas detectables. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con sustancia fluorescente, sustancia luminiscente o radioisótopo. Procedimientos para marcar anticuerpos y detectar los anticuerpos marcados son muy conocidos en la técnica y puede emplearse cualquier marca y procedimiento para la invención.

Además, el kit puede incluir reactivos de control positivo y negativo, y un anticuerpo secundario para detectar un anticuerpo contra la proteína CDH3. Por ejemplo, muestras de tejido obtenidas de sujetos con buen pronóstico o mal pronóstico pueden servir de reactivos de control útiles. Un kit de la invención puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, que incluyen tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos (por ejemplo, escritos, cinta, CD-ROM, etc.) con instrucciones para su uso. Estos reactivos y tales pueden ser retenidos en un recipiente con una etiqueta. Recipientes adecuados incluyen botellas, viales y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar formados de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico.

En otras realizaciones, la invención proporciona además un kit para su uso en detectar, obtener imágenes o tratar un cáncer dentro de un sujeto que va a diagnosticarse que comprende el anticuerpo contra la proteína CDH3. En realizaciones preferibles, el anticuerpo de la invención puede marcarse con un radioisótopo. Por ejemplo, el kit de la invención puede contener un anticuerpo que reconoce CDH3 modificado con agente quelante y sustancia radiactiva. MX-DOPA es un agente quelante preferible para modificar el anticuerpo. Mientras tanto, puede usarse indio-111 (111In) como trazador para la obtención de imágenes biológicas. Alternativamente, con el fin de radioinmunoterapia de un cáncer que expresa CDH3, el anticuerpo puede marcarse con beta-núclidos, por ejemplo, itrio-90 (90Y). En la presente invención, también pueden proporcionarse indio-111 (111In) o itrio-90 (90Y) como sal o disolución de la misma. Una sal adecuada de indio-111 (111In) o itrio-90 (90Y) es el cloruro.

En una realización preferible, una enfermedad asociada a CDH3 es cáncer pancreático, de pulmón, colon, próstata, mama, gástrico o de hígado.

Usos terapéuticos

A continuación se describen composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento y/o prevención de cáncer usando el anticuerpo de la invención. El cáncer incluye, pero no se limita a, una célula de cáncer pancreático, de pulmón, colon, próstata, mama, gástrico o de hígado.

El término “sujeto” en el presente documento se refiere a un sujeto que ha padecido cáncer que incluye, pero no se limita a, una célula de cáncer pancreático, de pulmón, colon, próstata, mama, gástrico o de hígado. El sujeto en el presente documento puede ser animales que incluyen mamíferos y animales aviares. Por ejemplo, los mamíferos pueden incluir seres humanos, ratones, ratas, monos, conejos y perros.

El anticuerpo o fragmento del mismo descrito en el presente documento puede unirse específicamente a la proteína CDH3, de manera que cuando el anticuerpo o fragmento del mismo vaya a administrarse a un sujeto, se una a la proteína CDH3 en el sujeto y pueda suprimirse el crecimiento de las células que expresan CDH3. Alternativamente, si el anticuerpo

o fragmento del mismo puede conjugarse con un resto terapéutico y administrarse a un sujeto, se administra a una región que expresa la proteína CDH3 (es decir, región sufrida) en un sujeto y el resto terapéutico puede administrarse selectivamente a la región sufrida y actuar sobre ella. Tal resto terapéutico puede ser cualquier terapéutico que sea conocido o se desarrolle por tener una eficacia terapéutica sobre el cáncer e incluye, pero no se limita a, una etiqueta de radioisótopo y agente quimioterapéutico. Una etiqueta de radioisótopo que puede usarse como terapéutico puede seleccionarse dependiendo de una variedad de elementos que incluyen energía de rayos beta y su eficiencia de emisión, la presencia o ausencia de rayo gamma emitido, su energía y eficiencia de emisión, semivida física y procedimiento de marcado. Generalmente, puede usarse la etiqueta de radioisótopo basado en itrio (tal como 90Y) y yodo (tal como 125I y131I). Un agente quimioterapéutico puede ser cualquier agente que sea conocido o se desarrollará para tratar el cáncer e incluye, pero no se limita a, metotrexato, taxol, mercaptopurina, tioguanina, cisplatino, carboplatino, mitomicina, bleomicina, doxorubicina, idarubicina, daunorubicina, dactinomicina, vinblastina, vincristina, vinorelbina, paclitaxel y docetaxel. El anticuerpo o fragmento del mismo descrito en el presente documento puede unirse selectivamente a la proteína CDH3 y no se une a una célula normal, de manera que el efecto secundario que se produce por el anticuerpo o fragmento del mismo, o radioisótopo o agente quimioterapéutico, puede evitarse eficazmente y, por tanto, la potencia

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En realizaciones particulares, las composiciones de la invención se usan para el tratamiento o prevención del cáncer junto con uno o una combinación de agentes quimioterapéuticos que incluyen, pero no se limitan a, metotrexato, taxol, mercaptopurina, tioguanina, cisplatino, carboplatino, mitomicina, bleomicina, doxorubicina, idarubicina, daunorubicina, dactinomicina, vinblastina, vincristina, vinorelbina, paclitaxel y docetaxel.

Con respecto a la radioterapia, puede usarse cualquier protocolo de radioterapia dependiendo del tipo del cáncer que vaya a tratarse. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, puede administrarse radiación de rayos X. También pueden administrarse radioisótopos emisores de rayos gamma, tales como isótopos radiactivos de radio, cobalto y otros elementos para exponer tejidos.

En otra realización, va a administrarse quimioterapia o radioterapia, preferentemente al menos una hora, cinco horas, 12 horas, un día, una semana, un mes, y más preferentemente varios meses (por ejemplo, hasta tres meses) tras usar los procedimientos y composiciones que contienen el anticuerpo de la presente invención. La quimioterapia o radioterapia va a administrarse antes de, simultáneamente con o tras el tratamiento usando las composiciones según la invención pueden administrarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica.

En otra realización, la invención también proporciona el uso del anticuerpo de la invención en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar o prevenir una enfermedad asociada a CDH3. En particular, la invención proporciona además un uso de anticuerpo radiomarcado de la invención para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar o prevenir un cáncer.

Alternativamente, la invención proporciona además el anticuerpo de la invención para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad asociada a CDH3. En particular, también se proporciona el anticuerpo radiomarcado de la presente invención para su uso en radioinmunoterapia para el cáncer.

Alternativamente, la invención proporciona además un procedimiento o proceso para la fabricación de una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad asociada a CDH3, en el que el procedimiento

: o proceso comprende la etapa de formular un vehículo farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable con el anticuerpo de la invención como principios activos. En particular, la invención proporciona además un procedimiento o proceso para la fabricación de una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de un cáncer, en el que el procedimiento o proceso comprende la etapa de formular un vehículo farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable con el anticuerpo radiomarcado de la presente invención como principios activos.

En otra realización, la invención también proporciona un procedimiento o proceso para la fabricación de una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad asociada a CDH3, en el que el procedimiento

: o proceso comprende la etapa de mezclar un principio activo con un vehículo farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable, en el que el principio activo es el anticuerpo de la invención. En particular, la invención proporciona además un procedimiento o proceso para la fabricación de una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de un cáncer, en el que el procedimiento o proceso comprende la etapa de mezclar el anticuerpo radiomarcado de la presente invención con un vehículo farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable.

En otra realización, la invención proporciona el anticuerpo de la invención para su uso en la obtención de imágenes biológicas o inmunoescintigrafía para el cáncer dentro de un sujeto que va a diagnosticarse. Alternativamente, la invención proporciona el uso del anticuerpo de la invención para la fabricación de un agente de diagnóstico para la obtención de imágenes biológicas o inmunoescintigrafía para el cáncer dentro de un sujeto. La invención proporciona además un procedimiento o proceso para la fabricación de un agente de diagnóstico para la obtención de imágenes biológicas o inmunoescintigrafía para el cáncer dentro de un sujeto, en el que el procedimiento o proceso comprende la etapa de mezclar el anticuerpo de la invención con un vehículo farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable.

Ejemplos

A continuación, la presente invención se explica adicionalmente basándose en ejemplos.

Materiales y procedimientos

Producción de anticuerpos.

Se amplificó el dominio extracelular codificado por el gen CDH3 (SEQ ID NO: 3) del conjunto de ADNc derivado de células cancerosas. El producto se clonó en pcDNA3.1 (Invitrogen, CA). Para producir anticuerpo específico para CDH3, los ratones se inmunizaron subcutáneamente con el vector de expresión del dominio (17,5 mcg/inyección) cada dos semanas durante un mes. Después de la confirmación del título de antisueros, se extrajeron esplenocitos de los ratones y se fusionaron con células de mieloma para preparar hibridomas. Los presentes inventores cribaron los hibridomas que pueden reconocer antígeno CDH3 nativo sobre la superficie de las células cancerosas. Mediante el cribado, se reveló que el clon nº 6 del hibridoma produjo anticuerpo específico de antígeno a alto nivel, por tanto se seleccionó este clon para

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que codifica SEQ ID NO: 21) e IgG1 humana (SEQ ID NO: 20 que codifica SEQ ID NO: 22), respectivamente, por PCR y se clonaron en un vector de expresión de anticuerpo pEE12.4 y pEE6.4, respectivamente, usando la enzima de restricción HindIII y EcoRI. Estos dos vectores de gen individual (SGV) se digirieron con la enzima de restricción NotI y PvuI. El ADN de SGV de la cadena pesada digerido contiene la unidad de transcripción hCMV-promotor MIE-cadena pesada-SV40 y el 5 ADN de SGV de la cadena ligera digerido contiene la unidad de transcripción de GS y el casete de expresión de hCMVpromotor MIE-cadena ligera. Ambos fragmentos purificados se ligaron para construir el vector de expresión de gen doble. Se transformaron células de E. coli con el vector y a continuación se preparó el vector. El vector que expresa tanto la cadena H con las cadenas L se transfectó en células 293T. El medio se intercambió con medio sin suero (DMEM; GIBCO, 11965-092), y el anticuerpo quimérico contenido en el sobrenadante de cultivo se purificó mediante columna de proteína

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[Tabla 1]

Conjunto de cebadores para la preparación de quim nº 6

SEC ID Nº: cebador secuencia

23: HindIIICDH3#6VH-f

24: CDH3#6VHCH-r

25: HindIIICDH3#6VL-f

26: CDH3#6VLkappa-r

27: CDH3#6VHCH-f

28: EcoRIIgG1-r

29: CDH3#6VLkappa-f

30: EcoRIKappa-r

31: HindIIIB72.3CDH3#6H-f

32: HindIIIB72.3CDH3#6L-f

Resultados.

15 Primero, para evaluar la especificidad de anticuerpos anti-CDH3, se determinó la expresión de CDH3 en varias líneas celulares. El antígeno CDH3 estaba presente sobre la superficie de H358 y KLM-1, pero no sobre MIAPaCa-2 (Figura 1). Los anticuerpos, que mostraron reactividad satisfactoria con H358 y KLM-1 pero no con MIAPaCa-2, se cribaron usando citómetro de flujo. Como se muestra en la Figura 1, todos los anticuerpos anti-CDH3 cribados reconocieron correcta y específicamente proteína CDH3 nativa.

20 Segundo, se comprobó la biodistribución de anticuerpos anti-CDH3 usando modelos de xenoinjerto. Los anticuerpos nº 4 y nº 6 marcados con Alexa647 se acumularon en tumores a nivel muy alto en comparación con otros clones y anticuerpo de control (Figura 2A). Se selección el nº 6 para radioterapia con 90Y debido a que el nº 6 marcado con 111In mostró eliminación de la sangre más rápida y alta elección de tumores como diana sin acumulación inesperada en órganos normales en comparación con los otros (Figura 2B-F). La captación pico del clon 6 en el tumor fue 32,0 +/-3,5 % de DI/g

25 (EBC-1), 21,4 +/-2,3 % de DI/g (SW948), 24,2 +/-1,2 % de DI/g (KLM-1), 23,8 +/-3,1 % de DI/g (H1373), respectivamente, 48 h después de la inyección (Figura 3A-D). De la misma forma, la captación pico del anticuerpo

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Claims

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