JP4679149B2 - ヒト膵癌に関連する遺伝子およびポリペプチド - Google Patents
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Description
本発明は生物科学の分野に関し、より具体的には癌研究の分野に関する。特に、本発明は、細胞の増殖機構に関与する新規遺伝子C1958V1およびC1958V2、ならびにこれらの遺伝子によってコードされるポリペプチドに関する。本発明の遺伝子およびポリペプチドは、例えば、細胞増殖性疾患の診断に、および、疾患に対する薬剤を開発するための標的分子として、用いることができる。
膵癌の患者の死亡率は他のいかなる種類の悪性腫瘍よりも高く、5年生存率は4%に過ぎない(Greenleeら、2001)。この悪性腫瘍の予後の悪さは、早期診断の困難さ、および現在の治療法に対する応答性の全般的な低さの両者を反映している(DiMagnoら、1999;Greenleeら、2001)。特に、この疾患を早期および治癒の可能性のある段階で発見するための腫瘍マーカーは臨床的に得られていない。外科的切除は現時点で唯一、治癒の可能性のある治療法であるが、診断時に外科的切除が可能な症例はこの癌の患者の20%未満である(DiMagnoら、1999;Klinkenbijlら、1999)。家族性膵癌のリスクのある個体のスクリーニングのためには超音波内視鏡検査(EUS)、内視鏡的逆行性胆管膵管造影(ERCP)、およびらせんCTを用いうるが(Brentnallら、1999)、このようなアプローチはあらゆる無症候性の個体をスクリーニングするには時間および費用対効果の点で現実的ではない。このため、膵癌に対する感度および特異性を有する腫瘍マーカーを発見する必要がある。
本発明の目的は、膵癌細胞の増殖機構に関与する新規タンパク質、これらのタンパク質をコードする遺伝子、さらにはこれらを産生して膵癌の診断および治療に用いるための方法を提供することである。
本明細書で用いる「1つの(a)」「1つの(an)」および「その(the)」という用語は、別に特記する場合を除き、「少なくとも1つの」を意味する。
1.目的の転写物のAUG開始コドンから開始して、AAジヌクレオチド配列に関して下流へとスキャンする。各AAおよび3'側に隣接した19ヌクレオチドの出現率をsiRNA標的の可能性がある部位として記録する。Tuschlらは、siRNAを5'および3'非翻訳領域(UTR)ならびに開始コドン付近(75塩基内)の領域に対しては設計しないように推奨しており、これは、これらの領域には調節タンパク質の結合部位が多く含まれる可能性があるためである。UTR結合タンパク質および/または翻訳開始複合体は、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨げる可能性がある。
2.標的の可能性がある部位をヒトゲノムデータベースと比較し、他のコード配列と明らかな相同性を有するどの標的領域も検討から除外する。相同性検索はBLASTを用いて行うことができ、これはNCBIのサーバー:www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上にある。
3.合成用の適格な標的配列を選択する。アンビオン社では、遺伝子の全長に沿っていくつかの標的配列を評価用に選択することができる。
a)候補化合物を、1つまたは複数のマーカー遺伝子の転写調節領域および転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階(この際、1つまたは複数のマーカー遺伝子はC1958V1またはC1958V2からなる群より選択される);
b)前記レポーター遺伝子の活性を測定する段階;および
c)前記レポーター遺伝子の発現レベルを対照と比較して低下させる化合物を選択する段階を含みうる。
a)候補化合物を、C1958V1またはC1958V2を発現する細胞と接触させる段階;および
b)C1958V1またはC1958V2の発現レベルを、被験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して低下させる化合物を選択する段階が含まれていてもよい。
‐腫瘍に対する細胞障害性リンパ球の誘導
‐腫瘍を認識する抗体の誘導、および
‐抗腫瘍サイトカイン産生の誘導。
本発明は以下の実施例によって詳細に例示されるが、これらの実施例には限定されない。
(1)細胞株および臨床材料
ヒト膵癌細胞株Capan-1、Capan-2、Panc-1、Aspc-1、ならびにMIApaca-2、KLM-1およびPK59は、Jae-Gahb Park博士(Korean Cell Line Bank, Cancer Research Institute, Seoul National University College of Medicine, Korea)より寄贈いただいた。細胞はすべて適切な培地中で培養した;すなわち、Capan-1、Capan-2およびAspc-1にはRPMI-1640(Sigma, St. Louis, MO);MIApaca-2、Panc-1、COS7にはダルベッコ変法イーグル培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)。それぞれの培地に10%ウシ胎仔血清(Cansera)および1%抗生物質/抗菌薬溶液(Sigma)を加えた。細胞は5%CO2を含む加湿空気の雰囲気下で37℃に保った。臨床試料(膵癌および正常膵管)は、すべての患者からインフォームドコンセントを得た上で外科標本から入手した。
cDNAマイクロアレイスライドの作製については別に記載されている(Onoら、2000)。それぞれの発現プロファイルの分析に関しては、実験的な変動を少なくするために、23,040個のcDNAスポットを含むスライドを2セットずつ用意した。簡潔に述べると、マイクロアレイ実験を行うのに十分なRNAを得るために、レーザーマイクロダイセクションを行った細胞の各試料から全RNAを精製し、T7に基づくRNA増幅を行った。膵癌細胞および正常膵管細胞に由来する増幅されたRNAのアリコートを、それぞれCy5-dCTPおよびCy3-dCTP(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)を用いる逆転写によって標識した。ハイブリダイゼーション、洗浄、および検出は以前の記載の通りに行った(Onoら、2000)。腫瘍細胞で上方制御されるように思われた遺伝子の中から、本発明者らは、発現比が情報の得られた膵癌症例の50%超で5.0を上回っていたとの理由から、施設内識別番号C1958に指定された遺伝子に着目した。
ヒト多組織ノーザンブロット(Clontech、Palo Alto、CA)を、RT-PCR(以下を参照)によって調製した、C1958の[α32P] -dCTP標識増幅産物とハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄は供給元の推奨に従って行った。ブロットのオートラジオグラフィーは増感スクリーンを-80℃で10日間用いて行った。C1958のエクソン4に対する特異的プローブは、以下の特異的プライマーのセットを用いるPCRによって調製した;5'-GTCCTGAAAGTCAAGCACCTG-3'(配列番号:5)および5'-GAAGTTCTTGTTGGTGCTTATGG-3'(配列番号:6)。
レーザーマイクロダイセクションを行った細胞の臨床試料から抽出した全RNAを350μlのRLT可溶化バッファー(QIAGEN, Hilden, Germany)中に入れ、抽出したRNAを、混入したいかなるゲノムDNAも除去するための1単位のRNase阻害薬(TOYOBO, Osaka, Japan)の存在下で、DNaseI(Roche, Basel, Switzerland)により処理した。DNaseI処理の後に、RNeasy Mini Kit(QIAGEN)により、製造者の推奨に従ってRNAを精製した。全てのDNaseIで処理したRNAをT7に基づいたRNA増幅にかけた。TRIzol試薬(Invitrogen)を製造者のプロトコールに従って用いて、全RNAを培養細胞から抽出した。抽出した各RNAをDNaseI(Roche)で処理した。
TUBA3に対しては、5'-CTTGGGTCTGTAACAAAGCATTC-3'(配列番号:7)および5'-AAGGATTATGAGGAGGTTGGTGT-3'(配列番号:8);
C1958に対しては、5'-GTCCTGAAAGTCAAGCACCTG-3'(配列番号:9)および5'-GAAGTTCTTGTTGGTGCTTATGG-3'(配列番号:10)。
反応はすべて、GeneAmp PCRシステム9700(PE Applied Biosystems)により、94℃ 2分間の初期変性の後に、94℃ 30秒間、58℃ 30秒間、および72℃ 1分間を22サイクル(TUBA3の場合)または28サイクル(C1958の場合)用いて行った。
C1958V1 cDNAの全コード配列を、C1958V1-順方向プライマー(5'-CCGGAATTCGACATGGGGCTTAAGATGTCC-3'(配列番号:11))およびC1958V1-逆方向プライマー(5'-CCGCTCGAGGGCTTCTGGGTCGATTTCTCC-3'(配列番号:12))というプライマーを用いるRT-PCRによって増幅した。その産物を、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターおよびネオマイシン耐性を付与する遺伝子を有するpcDNA3.1(+).myc.his(Invitrogen)のEcoRI部位およびXhoI部位に挿入した。構築物(pcDNA3.1(+)-C1958-myc-his)はDNAシークエンシングによって確認した。
FuGENE 6(Roche)を製造者の指示に従って用いて、COS7細胞にpcDNA3.1(+)-C1958V1-myc-hisを一時的にトランスフェクトし、続いて4%パラホルムアルデヒドを含むPBS中に15分間おいて固定し、さらにその後に、0.1%Triton X-100を含むPBS中に4℃で2.5分間おいて透過化処理を行った。次に、非特異的なハイブリダイゼーションをブロックするために細胞を3%BSA(PBS中)で覆って4℃で12時間おき、その後に1: 1000に希釈したマウス抗myc抗体(Sigma)とインキュベートした。PBSで洗浄した後に、細胞をFITC結合抗マウス二次抗体(Organon Teknika)によって染色した。核は4',6'-ジアミジン-2'-フェニルインドール二塩酸(DAPI)で対比染色した。蛍光画像はECLIPSE E800顕微鏡(Nikon、Tokyo、Japan)によって得た。
FuGENE 6(Roche)を製造者の指示に従って用いて、COS7細胞にpcDNA3.1(+)-C1958-myc-hisを一時的にトランスフェクトした後に、細胞をPBSで2回洗浄し、可溶化バッファー(150mM NaCl、1%Triton X-100、50mM Tris-HCl pH 7.4、1mM DTT、および1×完全プロテアーゼ阻害薬カクテル(Boehringer))中に収集した。細胞をホモジナイズして10,000×g、30分間の遠心処理を行った後に、Bradfordアッセイ(Bio-Rad)により、上清をタンパク質濃度に関して標準化した。タンパク質を12%SDS-PAGEによって分離させ、マウス抗myc(SANTA CRUZ)抗体によるイムノブロット法を行った。
snRNA U6遺伝子はRNAポリメラーゼIIIによって転写され、ウリジンが3'末端にある短い転写物を生じることが報告されているため、本発明者らは、そのプロモーター領域を含むsnRNA U6遺伝子のゲノム断片を、プライマーのセット、5'-GGGGATCAGCGTTTGAGTAA-3'(配列番号:13)および5'-TAGGCCCCACCTCCTTCTAT-3'(配列番号:14)、ならびにテンプレートとしてヒト胎盤DNAを用いるPCRによって増幅した。その産物を精製し、TAクローニングキット(Invitrogen)を供給元のプロトコールに従って用いて、pCRプラスミドベクター中にクローニングした。プライマーのセット、5'-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3'(配列番号:15)および5'-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3'(配列番号:16)を用いるPCRによって増幅したsnRNA U6遺伝子を含むBamHI、XhoI断片を精製し、pcDNA3.1(+)プラスミドのヌクレオチド1257から56までの断片中にクローニングした。連結したDNAを、プライマー5'-TTTAAGCTTGAAGACTATTTTTACATCAGGTTGTTTTTCT-3'(配列番号:17)および5'-TTTAAGCTTGAAGACACGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3'(配列番号:18)を用いるPCRのためのテンプレートとして用いた。この産物をHindIIIで消化し、その後に自己連結させてpsiU6BX3.0ベクタープラスミドを作製した。対照として、5'-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3'(配列番号:19)および5'-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3'(配列番号:20)の二本鎖オリゴヌクレオチドをpsiU6BX3.0ベクターのBbsI部位にクローニングすることにより、psiU6BX-EGFPを調製した。
siRNAを発現するプラスミドを、psiU6BX3.0ベクター中への二本鎖オリゴヌクレオチドのクローニングによって調製した。C1958に関する標的配列は、5'-CGACAAGCACCTGGACGTG-3'(配列番号:25)、5'-ATGTGTGTCAGCAGCAGCA-3'(配列番号:26)、5'-TCCAGCCTGTCCACTTCCA-3'(配列番号:27)、および5'-GTTGTTTTACAGATACGGA-3'(配列番号:28)である。細胞株KLM-1およびPK59由来のヒト膵臓細胞を10cm培養皿にプレーティングし(KLM-1;細胞2.5×105個/皿、PK59;細胞5×105個/皿)、FuGENE6試薬(Roche)を供給元の推奨に従って用いて、psiU6BX-EGFPまたはpsiU6BX-C1958V1をトランスフェクトした。トランスフェクションの7日後に全RNAを細胞から抽出し、続いてsiRNAのノックダウン作用を、C1958V1および内部対照としてのβ-アクチン(ACTB)に対する特異的プライマー;C1958に対しては5'-GTCCTGAAAGTCAAGCACCTG-3'(配列番号:21)および5'-GAAGTTCTTGTTGGTGCTTATGG-3'(配列番号:22)、ACTBに対しては5'-CATCCACGAAACTACCTTCAACT-3'(配列番号:23)および5'-TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG-3'(配列番号:24)、を用いる半定量的RT-PCRによって確認した。さらに、KLM-1およびPK59細胞株を用いたsiRNAを発現するトランスフェクト体を、0.6mg/mlネオマイシンを含む選択培地中で9日間増殖させた。4%パラホルムアルデヒドで固定した後に、コロニー形成を評価するためにトランスフェクト細胞をギムザ溶液で染色した。細胞の生存度の定量のためにMTTアッセイを行った。ネオマイシンを含む培地中で7日間培養した後に、MTT溶液(臭化3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-yl)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム)(Sigma)を0.5mg/mlの濃度として添加した。37℃で4時間インキュベートした後に、酸-SDS(0.01N HCl/10%SDS)を添加した;この懸濁液を激しく混合した後に37℃で一晩インキュベートし、濃青色の結晶を溶解させた。570nmでの吸光度をMicroplate Reader 550(BioRad)を用いて測定した。
(1)膵癌細胞で上方制御される遺伝子としてのC1958の同定
18例の膵癌患者から得た癌細胞の遺伝子発現プロファイルを、23,040種のヒト遺伝子を提示したcDNAマイクロアレイ(Nakamuraら、2003)を用いて分析したところ、膵癌細胞で共通して上方制御されていた265種の遺伝子が同定された。それらの中から、本発明者らは施設内コードC1958に指定された1つの遺伝子に対象を絞ったが、これはNCBIのUniGeneデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)中のEST Hs. 40530に対応していた。この遺伝子の発現は、シグナル強度がマイクロアレイ上のカットオフ値よりも大きかった9例の膵癌中7例で正常膵管と比較して高度であった(図1(a))。引き続いて行った半定量的RT-PCR分析では、12例の膵癌中10例および5つの膵癌細胞株中2つで正常膵管と比較して高度の発現が確認された(図1(b))。
C1958V1の増殖促進に対する役割をさらに評価するために、本発明者らは、哺乳動物ベクターに基づくRNA干渉(RNAi)法により、膵癌細胞株であるKLM-1細胞およびPK59細胞における内因性C1958の発現をノックダウンし、細胞増殖に対する影響を検討した(材料および方法の項を参照)。図5(a)に示されているように、psiU6BX-C1958V1(Si 8-5およびSi 11-3)の導入はKLM-1細胞株におけるC1958V1転写物の発現を明らかに低下させ、一方、対照プラスミド(psiU6BX-EGFP siRNA発現ベクター)をトランスフェクトした細胞には何ら影響は認められなかった。psiU6BX-C1958V1による遺伝子特異的な増殖抑制を確かめるために、本発明者らは、同じ2種類の細胞株でコロニー形成アッセイを行った ;図5(b)および5(d)に示されているように、psiU6BX-C1958V1(Si 8-5)の導入は、発現低下という上記の結果に一致して、KLM-1細胞およびPK59細胞の増殖を有意に抑制し、psiU6BX-C1958V1(Si 11-3)も両方の細胞株の増殖をある程度抑制し、psiU6BX-C1958V1(Si 1-8)もPK59細胞の増殖を抑制した。さらに、MTTアッセイでも、C1958V1の発現をpsiU6BX-C1958V1(Si 1-8、Si 8-5、およびSi 11-3)を用いて抑制した場合のKLM1細胞および/またはPL59細胞の増殖抑制が示された (図5(c)、5(e))。それぞれの結果は3回の独立した実験によって裏づけられた。
新規ヒト遺伝子C1958V1またはC1958V2の発現は、癌でない膵組織と比較して膵癌において顕著に上昇している。したがって、これらの遺伝子は癌の診断マーカーとして役立つ可能性があり、それらの遺伝子によってコードされるタンパク質は癌の診断アッセイに用られる可能性がある。
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Claims (11)
- 配列番号:2のアミノ酸配列を含む実質的に純粋なポリペプチド。
- 以下の段階を含む、請求項1記載のポリペプチドを産生するための方法:
(a)次の(i)、または(ii)を保有する宿主細胞を培養する段階;
(i)請求項1記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド、または
(ii)請求項1記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、
(b)宿主細胞にポリペプチドを発現させる段階;および
(c)発現したポリペプチドを収集する段階。 - 単離された配列番号:1または3のポリヌクレオチドに対する低分子干渉RNAであって、その標的配列が、配列番号:25、26、および28のヌクレオチド配列を含むヌクレオチドからなる群より選択される、低分子干渉RNA。
- 以下の段階を含む、膵癌の診断マーカーを検出する方法:
(a)標本の生物試料における、配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号: 1または3の塩基配列によってコードされるmRNAを膵癌の診断マーカーとして検出する段階;および
(b)配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号: 1または3の塩基配列によってコードされるmRNAの上昇を疾患と関連づける段階。 - 次の要素を含む膵癌の診断薬;
(a)配列番号1、3またはこれらの相補配列からなるポリヌクレオチドの部分断片であって、当該ポリヌクレオチドは配列番号1、3またはこれらの相補配列の少なくとも15ヌクレオチドの連続した配列を含み、配列番号: 1または3の塩基配列によってコードされるmRNAを特異的に検出するためのポリヌクレオチド;または
(b)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質に結合する抗体。 - 以下の段階を含む、膵癌を治療するための候補化合物のスクリーニング方法であって、
(a)被験化合物を、配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させる段階:
(b)ポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階;ならびに
(c)ポリペプチドと結合する化合物を選択する段階。 - 以下の段階を含む、膵癌を治療するための化合物のスクリーニング方法:
(a)候補化合物を、配列番号:1のヌクレオチド配列を含む1つまたは複数のポリヌクレオチドを発現する細胞と接触させる段階;および
(b)配列番号:1のヌクレオチド配列を含む1つまたは複数のポリヌクレオチドの発現レベルを、被験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して低下させる化合物を選択する段階。 - 細胞が膵癌細胞である、請求項7記載の方法。
- 以下の段階を含む、膵癌を治療するための化合物のスクリーニング方法:
(a)被験化合物を、配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドを組み換えタンパク質として発現させた宿主細胞と接触させる段階;
(b)段階(a)のポリペプチドの細胞増殖活性を検出する段階;ならびに
(c)被験化合物の非存在下で検出される細胞増殖活性と比較して、ポリペプチドの細胞増殖活性を抑制する化合物を選択する段階。 - 配列番号:1のポリヌクレオチドに対する低分子干渉RNAの薬学的有効量を有効成分として含み、かつ薬学的に許容される担体を含む、膵癌を治療するための組成物。
- 有効成分として低分子干渉RNAを含み、その標的配列が、配列番号:25、26、および28のヌクレオチド配列を含むヌクレオチドからなる群より選択される低分子干渉RNAを含む請求項10に記載の組成物。
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