KR20080105111A - 항 ＥｐｈＡ４ 항체의 효과기 기능을 이용한 세포 손상 방법 - Google Patents

항 ＥｐｈＡ４ 항체의 효과기 기능을 이용한 세포 손상 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20080105111A
KR20080105111A KR1020087023434A KR20087023434A KR20080105111A KR 20080105111 A KR20080105111 A KR 20080105111A KR 1020087023434 A KR1020087023434 A KR 1020087023434A KR 20087023434 A KR20087023434 A KR 20087023434A KR 20080105111 A KR20080105111 A KR 20080105111A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ser
antibody
human
val
seq
Prior art date
Application number
KR1020087023434A
Other languages
English (en)
Inventor
슈이치 나카츠루
메구미 요시카와
신이치 히로시마
Original Assignee
온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 온코세라피 사이언스 가부시키가이샤 filed Critical 온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
Publication of KR20080105111A publication Critical patent/KR20080105111A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Abstract

본 발명은 항 EphA4 항체의 효과기 기능(effector function)에 기반을 둔 세포독성의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 항 EphA4 항체를 유효성분으로 포함하는 항체 효과기 기능을 이용한 EphA4 발현 세포 손상용 약학적 조성물, 및 EphA4 발현 세포 손상 방법을 제공한다. EphA4는 췌장암 세포에서 강하게 발현되기 때문에, 본 발명은 췌장암 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항 ＥｐｈＡ４ 항체의 효과기 기능을 이용한 세포 손상 방법{METHODS FOR DAMAGING CELLS USING EFFECTOR FUNCTIONS OF ANTI-EphA4 ANTIBODIES}
본 발명은 항 EphA4 항체의 효과기 기능(effector fuction)을 이용한 세포 손상 방법 및 이를 이용한 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 2006년 2월 28일 제출된 미국 가출원 제 60/777,794호의 우선권을 주장하고, 이의 내용은 본 발명에서 참고문헌으로 인용된다.
췌장암(Pancreatic cancer)은 가장 사망률이 높은 악성 종양 중 하나이고, 환자 중 5년의 생존율이 약 4%이다. 약 28,000 환자가 매년 췌장암으로 진단받았으며, 거의 모든 환자가 그들의 질병으로 죽을 것이다(Greenlee, R. T., et al., (2001) CA Cancer J Clin, 51: 15-36). 이런 악성 종양의 약한 예후는 초기 진단의 어려움 및 현재의 치료 방법에 대한 약한 반응을 야기한다(Greenlee, R. T., et al. (2001) CA Cancer J Clin, 51: 15-36, Klinkenbijl, J. H., et al. (1999) Ann Surg, 230: 776-82; discussion 782-4). 특히, 현재 상기 질병의 잠재적 치료 단 계인 초기에 신뢰할만한 검출을 가능하게 하는 종양 마커가 확인되지 않았다.
발암 기작의 해명이 목적인 연구는 항종양제의 개발을 위한 많은 후보 표적 분자를 밝혀내었다. 예를 들어, 파르네실트랜스퍼라제 억제제(farnesyltransferase inhibitor; FTI)가 동물 모델에서 Ras 의존적 종양의 치료에 효과적임을 보였다(Sun J et al., (1998) Oncogene, 16:1467-73.). 이 약제는 전사 후 파르네실화(farnesylation)에 의존하는 Ras에 관련된 성장 신호 경로를 억제하기 위해 개발되었다. 원종양 유전자(proto-oncogene) HER2/neu를 대항하기 위해, 항종양제를 항 HER2 단일클론항체인 트라스투주맙(trastuzumab)과 조합하여 적용된 임상 시험은 임상 반응을 개선시키는데 성공하였고, 유방암 환자의 전체 생존율을 개선하였다. 티로신 키나제 억제제 STI-571은 bcr-ab1 융합 단백질을 특이적으로 비활성시키는 억제제이다. 이 약제는 bcr-ab1 티로신 키나제의 지속적인 활성이 백혈구의 변형에 중요한 역할을 하는 만수 골수성 백혈병의 치료를 위해 개발되었다. 상기 약제들은 특정 유전자 산물의 발암 활성을 억제하는 것으로 고안되었다(Molina MA, et al., (2000) Cancer Res, 16:4744-9). 따라서 암세포에 있어서, 촉진된 발현을 하는 유전자의 산물은 신규한 항종양제의 개발을 위한 일반적으로 잠재적인 표적이다.
또 다른 암 치료 전략은 암세포에 결합하는 항체의 이용과 관련있다. 다음은 항체 매개 암 치료법의 대표적인 기작이다:
미사일 요법(Missile therapy): 이 방법과 관련하여, 약제를 암세포에 특이적으로 결합하는 항체에 결합시켜, 상기 약제가 암세포에서 특이적으로 작용하게 하는 것이다. 이런 표적 분배는 강한 부작용을 가진 상기 약제가 암세포에서 강하게 작용하도록 만든다. 또한, 상기 약제 이외에 약제의 전구체 및 전구체를 활성 제형으로 대사시키는 효소 등을 상기 항체에 결합시키는 방법이 보고된바 있다.
기능성 분자를 표적화하는 항체의 이용: 이 방법은 예를 들어, 성장인자 수용체 또는 성장인자에 결합하는 항체 등을 이용하여 성장인자 및 암세포 사이 결합을 억제한다. 일부 암세포의 증식은 성장인자에 매우 의존적이다. 예를 들어, 일부 암세포는 세포 성장에 대해 상피 성장인자(epithelial growth factor; EGF) 또는 혈관 내피 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF)에 의존적인 것으로 알려져 있다. 상기 암에 대해서, 성장인자 및 암세포 사이의 결합을 억제하는 것은 치료적 효과를 기대할 수 있다.
항체 세포독성: 특정 종류의 항원에 결합하는 항체는 암세포에서 세포독성을 야기할 수 있다. 이런 유형의 항체는, 항체 분자 자체가 직접 항종양 효과를 가진다. 암세포에 대한 세포독성을 나타내는 항체는 종양에 대항하여 매우 효과적인 것으로 기대되는 항체 물질로서 주목을 받고 있다.
이전에 본 발명자들은 EphA4가 췌장암 세포에서 발현이 증가하는 췌장암 관련 유전자임을 밝혔다. 이는 본 발명에서 참고문헌으로 인용되는 WO2004/031412에 기재되어 있다. 또한, 본 발명자들은 EphA4에 대항하는 siRNA가 췌장암 세포의 증식을 억제하는 것을 밝혔다. 이는 본 발명에서 참고문헌으로 인용되는 WO2005/083086에 기재되어 있다. 본 발명에 있어서, 본 발명자들은 암세포에서 발현이 증가함을 보이는 EphA4 등의 유전자에 초점을 맞춰, 세포독성을 유발할 수 있는 항체들을 조사하였다. 그 결과가 EphA4 발현 세포들이 항 EphA4 항체와 접촉될 때, 상기 세포들에서 강한 세포독성이 유도될 수 있음을 나타냄으로써, 본 발명이 완성되었다.
구체적으로, 본 발명은 다음의 약학적 조성물 또는 방법에 관한 것이다:
[1] 항체 효과기 기능(effector fuction)을 가지는 항 EphA4 항체를 유효성분으로 포함하는 EphA4 발현세포 손상용 약학적 조성물;
[2] [1]의 약학적 조성물에 있어서, 상기 EphA4 발현세포는 췌장암 세포이다;
[3] [1]의 약학적 조성물에 있어서, 상기 항 EphA4 항체는 단일클론항체이다;
[4] [1]의 약학적 조성물에 있어서, 상기 항체 효과기 기능은 항체 의존적 세포독성 또는 보체 의존적 세포독성 중 어느 하나, 또는 둘 모두이다;
[5] [1]의 약학적 조성물에 있어서, 상기 항체는 VH 및 VL 사슬을 포함하고, 각 VH 및 VL 사슬은 프레임워크(framework) 아미노산 서열에 의해 분리되는 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지정된 CDR 아미노산 서열을 포함하며, 상기 각 VH 및 VL 사슬 내에 각 CDR의 아미노산 서열은 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 것이다:
인간 VH CDR1 : ELSMH(서열번호: 10),
인간 VH CDR2 : GFDPEDGETIYAQKFQG(서열번호: 11),
인간 VH CDR3 : AQPFHWGDDAFDI(서열번호: 12),
인간 VL CDR1 : SGSSSNIGSNTVN(서열번호: 15),
인간 VL CDR2 : SNNQRPS(서열번호: 16),
인간 VL CDR3 : AAWDDSLNGPV(서열번호: 17); 및
인간 VH CDR1 : SNSAAWN(서열번호: 20),
인간 VH CDR2 : RTYYRSKWYNDYAVSVKS(서열번호: 21),
인간 VH CDR3 : DSLRSFDY(서열번호: 22),
인간 VL CDR1 : SGSSSNIGNNYVS(서열번호: 24),
인간 VL CDR2 : DNNKRPS(서열번호: 25),
인간 VL CDR3 : GTWDSSLSAVV(서열번호: 26);
[6] [5]의 약학적 조성물에 있어서, 상기 인간 VH는 서열번호 27 또는 29의 아미노산 서열을 포함하고, 인간 VL은 서열번호 28 또는 30의 아미노산 서열을 포함한다;
[7] [5]의 약학적 조성물에 있어서, 상기 항체는 추가적으로 인간 IgG1의 Fc 도메인을 포함한다;
[8] 각 VH 및 VL 사슬이 프레임워크(framework) 아미노산 서열에 의해 분리되는 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지정된 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 상기 각 VH 및 VL 사슬 내에 각 CDR의 아미노산 서열이 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는, VH 및 VL 사슬을 포함하는 항체:
인간 VH CDR1 : ELSMH(서열번호: 10),
인간 VH CDR2 : GFDPEDGETIYAQKFQG(서열번호: 11),
인간 VH CDR3 : AQPFHWGDDAFDI(서열번호: 12),
인간 VL CDR1 : SGSSSNIGSNTVN(서열번호: 15),
인간 VL CDR2 : SNNQRPS(서열번호: 16),
인간 VL CDR3 : AAWDDSLNGPV(서열번호: 17); 및
인간 VH CDR1 : SNSAAWN(서열번호: 20),
인간 VH CDR2 : RTYYRSKWYNDYAVSVKS(서열번호: 21),
인간 VH CDR3 : DSLRSFDY(서열번호: 22),
인간 VL CDR1 : SGSSSNIGNNYVS(서열번호: 24),
인간 VL CDR2 : DNNKRPS(서열번호: 25),
인간 VL CDR3 : GTWDSSLSAVV(서열번호: 26);
[9] [8]의 약학적 조성물에 있어서, 상기 인간 VH는 서열번호 27 또는 29의 아미노산 서열을 포함하고, 인간 VL은 서열번호 28 또는 30의 아미노산 서열을 포함한다;
[10] [8]의 약학적 조성물에 있어서, 상기 항체는 추가적으로 인간 IgG1의 Fc 도메인을 포함한다;
[11] [8]의 항체를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드;
[12] [11]의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터;
[13] [12]의 벡터를 포함하는 분리된 숙주세포;
[14] 상기 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 [13]의 숙주세포를 배양한 후, 상기 숙주세포 배양으로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체 생산 방법;
[15] [11]의 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 EphA4 발현세포 손상용 약학적 조성물;
[16] 하기의 단계를 포함하는 EphA4 발현세포 손상방법:
a) EphA4 발현세포를 항 EphA4 항체와 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 세포에 결합된 항체의 효과기 기능으로 EphA4 발현세포를 손상시키는 단계;
[17] EphA4, 이의 면역학적 활성 단편, 또는 EphA4 또는 이의 면역학적 활성 단편을 발현할 수 있는 DNA를 유효성분으로 포함하는, EphA4 발현세포에 대한 효과기 기능을 가지는 항체 유도용 면역성 조성물;
[18] EphA4, 이의 면역학적 활성 단편, 또는 EphA4 또는 이의 면역학적 활성 단편을 발현할 수 있는 세포 또는 DNA를 투여하는 단계를 포함하는, EphA4 발현세포에 대한 효과기 기능을 가지는 항체를 유도하는 방법; 및
[19] 약학적으로 유효한 양의 항체 효과기 기능을 가지는 항 EphA4 항체, 또는 이의 면역학적 활성 단편을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 내 췌장암을 치료 또는 예방하는 방법.
본 발명은 항체 효과기 기능을 이용한 EphA4 발현 세포 손상용 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 항 EphA4 항체를 유효성분으로 포함한다. 또한, 본 발명은 항 EphA4 항체 효과기 기능을 이용한 EphA4 발현 세포 손상용 약학적 조성물의 제조를 위한 항 EphA4 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 항 EphA4 항체와 약학적으로 허용가능한 담체로 구성된다.
본 발명자들은 전립선암 및 췌장암 환자로부터 채취한 전립선암 또는 췌장암 세포, 및 정상 세포의 유전자 발현 분석을 위해 cDNA 마이크로어레이를 이용하였다. 그 결과로서 췌장암 세포에서 특히 발현이 증가하는 많은 유전자들을 확인하였다. 이런 췌장암 세포에서 발현의 변화를 가지는 유전자들 중 하나의 유전자인, 주요 기관에서 낮은 발현 수준을 가지는 세포질 막 단백질을 암호화하는 Eph 수용체 A4(본 발명에서 "EphA4"로 나타냄) 유전자를 췌장암 치료를 위한 후보 표적 유전자로 선별하였다(Nakamura T, et al. (2004) Oncogene. 2004 Mar 25;23(13):2385-400). 주요 기관에서 낮은 발현 수준을 가지는 유전자를 선별함으로써, 부작용의 위험을 피할 수 있음을 추정할 수 있다. 이런 방법으로 선별된 유전자들에 의해 암호화되는 단백질들 중, 항 EphA4 항체는 EphA4 발현 세포에 대한 효과기 기능을 가지는 것으로 확인되었다.
본 발명자들에 의해 획득된 이런 발견은 강제적인 발현 시스템에서 c-myc-His를 가지는 표적 EphA4가 세포질 막에 위치하고 있음을 제시하며, 이는 면역형광 현미경을 이용하여 확인되었다. EphA4 유전자는 그의 N-말단에서 신호 펩티드로서 기능할 것으로 기대되는 아미노산 서열을 암호화한다. 상기 기재된 바와 같이, 이런 단백질이 세포질 막에 주로 위치하고 있음을 관찰하여, 상기 단백질이 막통과 단백질(transmembrane protein)임이 추정되었다. 게다가, EphA4 유전자가 주요 기관에서는 발현 수준이 낮고 췌장암 세포에서는 발현 수준이 높은 것은, EphA4가 임상적 마커 및 치료적 표적으로서 유용한 것임을 확립하였다.
효과기 기능을 이용하여 암세포를 손상시키기 위해 요구되는 조건은 예를 들어 다음과 같다:
·암세포 막 표면에서 많은 항원성 분자의 발현,
·암 조직 내 항원의 균등한 분배,
·장기간 세포 표면에서 항체에 결합된 항원의 남아있음.
보다 구체적으로, 예를 들어 항체에 의해 인식되는 항원은 세포막의 표면에 발현되어야 한다. 게다가, 항원 양성 세포(antigen-positive cell)의 비율이 암 조직을 형성하는 세포에서 가능한 높은 것이 바람직하다. 이상적인 조건에서, 모든 암세포는 항원 양성이다. 항원 양성 및 음성 세포들이 암 세포군에서 혼합되었을 때, 이에 특이적인 항체의 임상적 치료 효과는 대체로 감소할 것이다.
일반적으로, 최대의 가능한 수의 분자가 세포 표면에서 발현되었을 때, 강한 효과기 기능이 기대될 수 있다. 또한, 항원이 세포 내로 흡수되지 않게 하기 위해 상기 항원에 항체가 결합하는 것은 중요하다. 일부 수용체들은 리간드에 결합한 후 세포 내로 흡수된다[엔도시토시스(endocytosis)]. 동등하게, 세포 표면 항원에 결합된 항체 역시 세포 내로 흡수될 수 있다. 항체가 세포 내로 흡수되는 현상을 내재화(internalization)라 한다. 내재화가 일어날 때, 항체 불변 부위(constant region; Fc)는 세포 내로 흡수된다. 그러나, 효과기 기능에 필수적인 세포 또는 분자들은 항원 발현 세포 밖에 남는다. 따라서, 내재화는 항체 효과기 기능을 억제한다. 그러므로, 항체 효과기 기능이 요구될 때, 제한된 항체 내재화를 야기하는 항원을 선별하는 것이 중요하다. 본 발명자들은 EphA4가 상기 특성을 가지는 항원인 것을 최초로 밝혔다.
본 발명에 사용된 용어에 있어서, 명사는 다른 특별한 표시가 없으면 "적어도 하나 이상"을 의미한다.
"분리된" 또는 "정제된" 폴리펩티드는 단백질이 파생되는 세포 또는 조직 원천으로부터 유래된 탄수화물, 지질 또는 다른 오염 단백질 등의 세포 물질이 상당히 없는, 및/또는 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 상당히 없는 폴리펩티드이다. 용어 "세포 물질이 상당히 없는"는 분리 또는 재조합으로 제조된 세포의 성분으로부터 분리된 폴리펩티드의 제조를 포함한다. 따라서, 세포 물질이 상당히 없는 폴리펩티드는 이종기원의 단백질(heterologous protein)(또는 "오염 단백질")을 약 30%, 20%, 10% 또는 5%(건조 중량에 대한) 보다 적은 양을 가지는 폴리펩티드의 제조를 포함한다. 또한, 폴리펩티드가 재조합으로 제조될 때는 배양 배지가 상당히 없는 것이 바람직하고, 이는 제조 단백질 부피의 약 20%, 10% 또는 5% 보다 적은 양을 가지는 폴리펩티드의 제조를 포함한다. 폴리펩티드가 화학적으로 합성에 의해 제조될 때는 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질이 거의 없는 것이 바람직하고, 이는 제조 단백질 부피의 약 30%, 20%, 10%, 5%(건조 중량에 대한) 보다 적은 단백질의 합성과 관련된 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질을 가지는 폴리펩티드의 제조를 포함한다. 특정 제조 단백질이 분리 또는 정제된 폴리펩티드를 포함하는 것은, 예를 들어 제조 단백질의 SDS-폴리아크릴아마이드 겔[(sodium dodecyl sulfate)-polyacrylamide gel] 전기영동 및 겔의 Coomassie Brilliant Blue 염색 후 단일 밴드가 나타나는 것으로 보여질 수 있다. 바람직한 실시예에서는 본 발명의 항체 또는 이의 단편이 분리 또는 정제되었다.
"분리된" 또는 "정제된" 핵산 분자는 자연 원천의 핵산 분자에서 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. "분리된" 또는 "정제된" 핵산 분자, 예를 들어 cDNA 분자는 다른 세포 물질이 상당히 없거나, 또는 재조합 기술에 의해 제조될 때 배양 배지가 상당히 없거나, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질이 상당히 없을 수 있다. 바람직한 실시예에서는 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자 또는 이의 단편을 분리 또는 정제하였다.
"항체" 및 "면역글로불린"은 동일한 구조적 특성을 가지는 당단백질이다. 항체가 특정 항원에 대해 결합 특이성을 보이는 반면에, 면역글로불린은 항원 특이성이 특정되지 않는 항체 및 다른 항체 유사 분자를 모두 포함한다. 후자의 폴리펩티드는 예를 들어 림프계를 통해 낮은 수준으로 생산되고, 골수종(myeloma)을 통해 증가된 수준으로 생산된다.
"기존 항체 및 면역글로불린"은 전형적으로 두 개의 동일한 경쇄[light(L) chain] 및 두 개의 동일한 중쇄[heavy(H) chain]로 구성된 약 150,000 Da의 헤테로테트라머(heterotetramer)의 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 중쇄에 연결되는 반면에, 다른 면역글로불린 아형들의 중쇄 사이 이황화 결합의 수는 다양할 수 있다. 또한, 각 중쇄 및 경쇄는 규칙적으로 위치하는 사슬간 이황화 브릿지(intrachain disulfide bridge)를 가지고 있다. 각 중쇄는 한쪽 말단에 하나의 가변 도메인(variable domain; VH)과, 그에 이어서 많은 불변 도메인(constant domain; CH)을 가진다. 각 경쇄는 한쪽 말단에 하나의 가변 도메인(VL)과, 그의 다른 말단에 불변 도메인(CL)을 가진다; 상기 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 첫 번째 불변 도메인과 함께 정렬되어 있고, 상기 경쇄의 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 함께 정렬되어 있다. 특정 아미노산 잔기들이 경쇄와 중쇄의 가변 도메인들 사이에 경계면을 형성한다고 고려되어 진다(Chothia et al., (1985) J Mol Biol.;186:651-63; Novotny and Haber, (1985) Proc Natl Acad Sci USA.;82:4592-6).
용어 "가변"은 항체들 사이에서 가변 도메인 중 특정 위치의 서열이 상당히 차이가 있다는 사실을 의미하고, 이는 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성과 관련된다는 것이 추정된다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 동등하게 분배되지 않는다. 오히려, 상기 가변성은 일반적으로 "상보성 결정 부위(complementarity-determining region; CDR)", 또는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 초가변성 부위(hypervariable region)로 불리는 세 개의 단편에 집중된다. 가변 도메인 중 고도로 보존되는 부위를 프레임워크(framework; FR)라고 불린다. 기존의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 대체로 β-판 배열(β-sheet configuration)을 취하고, 3개의 CDR에 의해 연결되는 4개의 프레임워크 부위를 포함하며, 상기 CDR들은 고리(loop)를 형성하고, 일부 경우에는 β-판 구조의 부분을 형성한다. 각 사슬 내에서 CDR들은 프레임워크 부위에 의해 밀접한 접근 상태로 결합되어 있고, 나머지 사슬 유래 CDR들과 함께 항체의 3차원적 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md.). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적인 관련은 없으나, 예를 들어 항체 의존적 세포독성에서 항체의 참여와 같은 다양한 효과기 기능을 나타낸다.
항체의 파파인 침지(Papain digestion)는 단일 항원 결합 부위를 각각 포함하는, "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편(antigen-binding fragment), 및 잔여 "Fc" 단편을 야기한다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 가지는 F(ab')2 단편을 야기한다. "Fv"는 완전한 항원 인식 부위 및 항원 결합 부위를 포함하는 최소한의 항체 단편이다. 상기 부위는 일반적으로 하나의 중쇄 및 경쇄 가변 부위가 비-공유 결합에 의해 연결된 이합체(dimer)로 구성된다. 상기 각 가변 부위의 3개의 CDR은 VH-VL 이합체의 표면에 항원 결합 부위를 명확히 하기 위해 상호작용하는 것으로 구성되어 있다. 공통적으로, 상기 6개의 CDR은 항체에 대한 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 대한 특이적인 3개의 CDR만으로 구성된 Fv의 절반) 조차도 전체 결합 부위 보다 더 낮은 친화성에도 불구하고, 항원을 인식 및 결합한다.
또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 첫 번째 불변 도메인(CH-1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체 경첩 부위(hinge region)로부터 유래된 하나 이상의 시스테인(cysteine)을 포함하는 중쇄 CH-1의 카르복시 말단에서 몇 개의 잔기의 추가에 의해 Fab 단편과는 차이가 있다. Fab'-SH는 불변 부위의 시스테인 잔기가 자유 티올기(free thiol group)를 가져오는 Fab'를 의미하는 것이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 한 쌍의 Fab' 단편이 그들 사이 경첩 시스테인을 가짐으로써 생성되었다. 항체 단편들의 다른 화학적 결합(coupling)들은 당업자에게 잘 알려져 있다.
척추동물 종 유래 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열을 근거로 각각 카파(kappa; κ) 및 람다(lambda; λ)로 나타내는 분명히 다른 두 개의 유형 중 하나로 지정할 수 있다.
중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린을 다양한 유형으로 지정할 수 있다. 5개의 주요 종류의 면역글로불린이 있고: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 이들 중 일부는 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2와 같이 하위 분류(아형)로 분류할 수 있다. 면역글로불린의 다양한 종류에 상응하는 상기 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 다양한 종류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원적 구성은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "단일클론 항체"는 예를 들어 군 내에 각각의 항체가 적은 양으로 존재할 수 있는 자연 발생 돌연변이의 가능성을 제외하고 동일한 것과 같이, 실질적으로 동종의 항체 군으로부터 획득된 항체를 의미한다. 단일클론 항체는 단일 항원성 부위에 대하여 직접적이고 고도로 특이적이다. 게다가, 전형적으로 별개의 결정기(에피토프)에 의하여 결정되는 별개의 항체들을 포함하는 보편적인(다클론성) 항체와 다르게, 각 단일클론 항체는 항원에 대하여 하나의 단일 결정기에 의하여 결정된다. 상기 단일클론 항체는 특이성 이외에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도머 배양(hybridoma culture)에 의해 합성될 수 있다는 이점이 있다. 따라서 변형된 "단일클론성"은 실질적으로 동종의 항체 군으로부터 획득되는 항체의 특성을 나타내고, 이는 특정 방법에 의한 항체의 제조를 요구하는 것으로 해석되는 것이 아니다. 예를 들어, 본 발명의 단일클론 항체는 Kohler 및 Milstein, (1975) Nature.;256:495-7에 의해 처음으로 보고된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법(Cabilly et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA.;81:3273-7)에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 기재된 단일클론 항체들은 실질적으로 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나, 특정 항체류 또는 이의 아형에 속하는 항체에서 대응하는 서열이 동일하거나 상동인 반면에, 사슬의 나머지가 다른 종으로부터 유래되거나, 다른 항체류 또는 이의 아형에 속하는 항체, 또는 상기 항체의 단편에서 대응하는 서열이 동일하거나 상동인, "키메릭(chimeric)" 항체 또는 면역글로불린을 포함한다(Cabilly et al., supra; Morrison et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA.;81:6851-5). 가장 일반적인 키메릭 항체 또는 면역글로불린은 일반적으로 인간 불변 부위 및 마우스 가변 부위와 같은 인간 및 쥐 항체 단편으로 구성된다.
비-인간(예를 들어, 쥐) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 포함하는 특이적인 키메릭 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편이다. 또한, 상기 단편은 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 및 항체의 다른 항원-결합 서열을 포함한다. 대부분, 인간화된 항체는 수령자의 상보성 결정 부위가 원하는 특이성, 친화성 및 수용성을 가지는 예를 들어 마우스, 랫트 또는 토끼 등의 비-인간 종(공여자 항체)의 CDR로부터 유래된 잔기에 의해 치환될 수 있다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기가 대응하는 비-인간 잔기에 의해 치환될 수 있다. 본 발명에 있어서, 인간화된 항체 내 단지 몇 개, 2개, 바람직하게 1개의 프레임워크가 비-인간 잔기에 의해 치환되었다. 게다가, 인간화된 항체는 수령자 항체 내 또는 내포된 CDR 또는 프레임워크 서열 내 어디에도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이런 변형들은 일반적으로 항체 작용이 추가적으로 개선 및 능률적이 되도록 야기한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 모든 또는 대체로 모든 CDR 부위가 비-인간 면역글로불린의 CDR 부위에 대응하고, 모든 또는 대체로 모든 프레임워크 부위가 인간 면역글로불린 공통 서열의 프레임워크 부위인, 가변 부위를 대체로 적어도 1개, 및 전형적으로 2개 모두를 포함한다. 또한, 인간화된 항체는 적어도 면역글로불린 불변 부위(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 부위의 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 것은 Jones et al., (1986) Nature.;321:522-5; Riechmann et al., (1988) Nature.;332:323-7; Presta, (1992) Curr Opin Struct Biol. 2:593-6에서 보여준다.
"단일 사슬 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인으로 구성되고, 상기 도메인들은 하나의 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 바람직하게, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위해 요구되는 원하는 3차원 구조를 형성하게 하는, VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커(linker)를 추가적으로 포함한다. 항체 가변 부위로부터 화학적으로 분리되는 것이 아닌 자연적으로 결집된 경쇄 및 중쇄를 항원 결합 부위의 구조와 상당히 유사한 3차원적 구조로 접히는 sFv 분자로 변환하기 위한 화학적 구조를 식별하기 위한 많은 방법이 보고된바 있다(U.S. Pat. Nos. 5,091,513, 5,132,405, 및 4,946,778; Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenberg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)).
상기 기재된 Fc 부위(Fragment, crystallizable)는 항체의 "Y" 줄기로부터 유래되고, 2 내지 3개의 불변 부위(항체의 종류에 의존하는)를 각각 제공하는 두 개의 중쇄로 구성된다. Fc 부위는 다양한 세포 수용체 및 보체 단백질에 결합한다. 이런 방식으로, 이는 항체의 다른 물리학적 효과(옵소닌화, 세포융해, 비만세포, 호염구 및 호산구의 탈과립화, 및 기타 과정)를 매개한다.
일부 세포들(예를 들어, 비만세포 및 식세포)은 이들의 세포 표면에 항체에 결합하기 위한 특정 수용체들을 가진다. 이런 수용체들은 일부 항체들(예를 들어, IgA, IgG, IgE)의 Fc 부위와 상호작용하기 때문에 Fc 부위라 불려진다. 특정 항체와 특정 세포에 Fc 수용체의 연계는 결과적으로 미생물 침입의 손상을 야기하는 세포의 효과기 기능(예를 들어, 식세포가 식세포작용을 하거나, 비만세포가 탈과립화 작용을 한다)을 유도할 것이다. Fc 수용체는 동종형 특이적이고, 별개의 조건이 항원에 반응하는 특정 면역기작만 요구하기 때문에 면역체계에 매우 유연성을 제공한다. 따라서, 본 발명에 있어서, 용어 "효과기 기능"은 항체의 Fc 부위와 관련된 세포독성을 의미한다. 또한, 효과기 기능은 항체의 항원 인식에 의해 유도되는 생물학적 활성을 결정하는 역할로써 설명될 수 있다. 또한, 예를 들어 항원을 발현하는 항원 손상 세포에 결합되는 항체의 Fc 부위에 의하여 효과를 조절하는 기능이 항체 효과기 기능으로 언급될 수 있다. 여기서, 바람직한 표적 세포는 암 세포이다.
항원에 대한 항체의 결합은 종종 직접적인 생물학적 활성을 가지지 않는다. 오히려, 상당한 생물학적 효과는 항체의 이차적인 "효과기 기능"의 결과이다. 면역글로불린은 이런 다양한 효과기 기능을 매개한다. 일반적으로, 특정 효과기 기능을 수행하는 능력은 항체가 항원에 결합하는 것을 요구한다. 그러나, 모든 면역글로불린이 모든 효과기 기능을 매개하지는 않는다. 예시적으로, 알려진 항체 효과기 기능은 항체 의존 세포-매개 세포독성(Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity; ADCC), 보체 의존 세포독성(Complement dependent cytotoxicity; CDC), 및 중화 활성(neutralizing activity)을 포함한다. 각 기능은 하기로 설명된다.
항체 의존 세포 매개 세포독성(ADCC):
효과기 세포 기능은 항체 종류에 매우 의존하는 다양한 항체의 Fc 부위에 의해 수행된다. 세포는 면역글로불린 종류인 IgG, IgE 또는 IgA의 Fc부위에 특이적인 Fc 수용체를 포함하는 것으로 존재한다. IgG, IgE 및 IgA 종류 항체의 Fc 부위는 특이적인 Fc 수용체에 각각 결합하고, 대응하는 Fc 수용체를 발현하는 세포가 세포막 또는 그 외에 것에 결합되는 항체를 인지 및 결합한다. 그 결과, 예를 들어 Fc 수용체를 가지는 세포는 활성화되고 세포 내 항체 운송으로써 기능한다.
예를 들어, IgG 종류 항체는 T 세포, NK 세포, 중립구 및 대식세포에 의해 인지된다. 이런 세포들은 IgG 종류 항체의 Fc 부위에 결합하고, 상기 Fc 부위에 의해 활성화되며, 상기 항체가 결합하는 세포에 대한 세포독성을 나타낸다. 항체 효과기 기능에 의하여 세포독성을 요구하는 T 세포, NK 세포, 중립구 및 대식세포 등의 세포들은 효과기 세포로 불린다. 특히, IgG 종류 항체들은 효과기 세포들의 Fc 수용체에 의하여 상기 세포들을 활성화시킨 다음, 상기 항체들의 가변 부위가 결합되는 표적 세포를 사멸시킨다. 이는 항체 의존 세포-매개 세포독성(ADCC)으로 불린다. ADCC는 다음과 같이 효과기 세포의 종류를 기초로 분류된다:
ADMC: IgG 의존 대식세포-매개 세포독성, 및
ADCC: IgG 의존 NK 세포-매개 세포독성.
본 발명의 ADCC에 있어서 효과기 세포의 종류는 한정되지 않는다. 다시 말해서, 본 발명의 ADCC는 대식세포가 효과기 세포인 ADMC를 포함한다.
항체 ADCC는 항종양 효과와 관련된, 특히 항체를 이용하는 암 치료 등의 중요한 기작이 되는 것으로 알려져 있다(Clynes RA, et al., (2000) Nature Med., 6: 443-6.). 예를 들어, 항 CD20 항체 키메라 항체의 치료적 효과 및 ADCC 사이 밀접한 관계는 보고된바 있다(Cartron G, et al., (2002) Blood, 99: 754-8.). 따라서, 본 발명에 있어서 ADCC는 항체 효과기 기능들 중에서 특히 중요하다.
ADCC는 단일클론 항체의 임상적 효능, 특히 암 치료 분야에 있어서 핵심 효과기 기능이다. 예를 들어, ADCC는 임상적 적용이 이미 시작된 리툭산(Rituxan), 허셉틴(Herceptin) 및 그 외의 것들에 있어서 중요한 기작이 될 것으로 생각된다. 리툭산 및 허셉틴은 각각 비-호지킨병의 림프종 및 전이 유방암 치료용 치료제로 알려져 있다.
본 발명에서, ADCC 매개 세포독성 기작은 간략히 다음과 같이 설명된다: 세포 표면에 결합되는 항체에 의해 표적 세포에 연결되는 효과기 세포가 표적 세포에 손상적인 신호의 종류를 전달함으로써 세포자살을 유도하는 것으로 생각된다. 보다 구체적으로, ADCC는 우선 활성 및 억제 활성을 모두 가지는 일련의 밀접하게 관련된 Fcγ 수용체를 통해 매개된다. 일부 경우에서, 효과기 세포에 의한 세포독성을 유도하는 항체는 본 발명에 있어서 효과기 기능을 가지는 항체에 포함된다.
원하는 분자의 ADCC 활성을 접근하기 위해, 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5, 821,337에 기재된 바와 같이 시험관 내(in vitro) ADCC 분석이 수행될 수 있다. 대안적 또는 추가적으로, 원하는 분자의 ADCC 활성은 예를 들어, Clynes et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA.;95:652-56 등의 동물모델과 같은 생체 내(in vivo)로 접근될 수 있다.
보체 의존 세포독성(CDC)
항원에 결합되는 면역글로불린의 Fc 부위는 보체 경로를 활성화하는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 활성 경로는 면역글로불린의 종류에 의존하여 다를 수 있는 것이 밝혀졌다. 예를 들어, 인간 항체 중에서 IgM 및 IgG는 전형적인 경로를 활성화한다. 반면에, IgA, IgD 및 IgE는 상기 경로를 활성화하지 않는다. 즉, 활성화하는 보체의 기능은 IgM 및 IgG 종류 항체에 한정된다. 특히, 항체 가변 부위가 결합되는 세포를 융해시키는 기능은 보체 의존 세포독성(CDC)로 불린다.
활성화된 보체는 다양한 반응을 통해 세포막 손상 활성을 가지는 C5b-9 막 공격 복합체(C5b-9 membrane attack complex; MAC)를 생산한다. 이런 방법으로 생산된 MAC는 효과기 세포와 관계없이, 바이러스 입자 및 세포막을 손상하는 것으로 생각된다. MAC 매개 세포독성에 대한 기작은 하기에 기초를 둔다. MAC는 세포막에 대한 강한 결합 친화성을 가진다. 세포막에 결합된 MAC는 물이 세포 내외 흐르는 것을 쉽게 하기 위해 세포막에 구멍을 야기한다. 그 결과, 세포막은 불안정해지거나 삼투압이 변화되어, 세포가 손상된다. 활성화된 보체에 의한 세포독성은 항원에 결합되는 항체에 밀접한 막에만 확장한다. 이는 MAC 매개 세포독성이 항체 특이성에 의존적이기 때문이다. ADCC 및 CDC는 서로 독립적인 세포독성을 나타낼 수 있으나, 실제로 이들 세포독성들은 생체 내에서 합성으로 기능할 수 있다.
원하는 분자의 CDC 활성을 접근하기 위해, 예를 들어 Gazzano-Santoro et al., (1997) J Immunol Methods.;202:163-71에서 기재된 바와 같은 CDC 분석이 수행될 수 있다.
중화 활성:
병원균의 감염 및 독소의 활성을 제거할 수 있는 항체들이 당업계에 알려져 있다. 항체 매개 중화는 항원에 대한 항원성 가변 부위의 결합을 통해 획득될 수 있거나, 또는 보체 매개를 요구할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에서 항바이러스 항체는 바이러스의 감염성을 제거하기 위하여 보체 매개를 요구한다. Fc 부위는 보체의 참여에 필수적이다. 따라서, 각 항체는 바이러스 및 세포를 중화하기 위해 Fc를 요구하는 효과기 기능을 가진다.
이들 중, 본 발명의 바람직한 효과기 기능은 ADCC 또는 CDC 중 어느 하나, 또는 둘 모두이다. 본 발명은 특정 항 EphA4 항체가 EphA4 발현 세포에 결합한 다음, 효과기 기능을 나타냄을 발견한 것을 기초로 한다.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 EphA4 발현 세포를 손상시키는 방법에 관한 것이다:
1) EphA4 발현 세포와 항 EphA4 항체를 접촉시키기; 및
2) 상기 세포에 결합된 항체의 효과기 기능을 이용하여 EphA4 발현 세포를 손상시키기.
본 발명의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, EphA4 발현 세포는 손상 또는 사멸될 수 있다. 예를 들어, 췌장암 세포는 본 발명의 EphA4 발현 세포인 것이 바람직하다. 이들 중, 췌장암 종 세포가 바람직하다.
세포 및 항체는 생체 내 또는 생체 외에서 접촉될 수 있다. 생체 내 암 세포를 EphA4 발현 세포로서 표적화할 때, 본 발명의 방법은 실제로 암에 대한 치료 방법 또는 예방 방법이다. 특히, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 암에 대한 치료 방법을 제공한다:
1) EphA4에 결합하는 항체를 암 환자에게 투여하기; 및
2) 암세포들에게 결합되는 항체의 효과기 기능을 이용하여 암 세포를 손상시키기.
본 발명은 EphA4를 결합하는 항체가 효과기 기능을 수단으로 EphA4 발현 세포, 특히 췌장암 세포를 효과적으로 손상시키는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명은 EphA4가 췌장암 세포에서 고도로 발현되는 것이 높은 가능성이 있음을 확인하였다. 게다가, 정상 조직에서 EphA4 발현 수준은 낮다. 상기 정보들이 함께 어우러져, 항 EphA4 항체를 투여하는 췌장암 치료 방법이 효과적일 수 있고 부작용이 거의 없다는 것을 제시한다.
IgA, IgE 또는 IgG의 Fc 부위를 포함하는 항체는 ADCC를 발현하기 위해 필수적이다. 동등하게, IgM 또는 IgG의 항체 Fc 부위는 CDC를 발현하기 위해 바람직하다.
그러나, 본 발명의 항체는 원하는 효과기 기능을 가지는 한, 특별히 한정되지 않는다. Fc 부위의 변이체, 동족체 또는 유도체는 예를 들어, 잔기 또는 서열의 다양한 치환에 의해 제조될 수 있다. 특히, 본 발명은 결과인 효과기 기능을 증진시키기 위해 Fcγ 수용체 친화성 및 특이성을 활용하는 것으로 공정된 Fc 변이체로 구성된 항체를 고려한다.
변이체(또는 동족체) 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 잔기가 Fc 아미노산 서열을 추가하는 삽입 변이체를 포함한다. 삽입은 상기 단백질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 위치할 수 있거나, 또는 Fc 아미노산 서열의 내부 부위 내에 위치할 수 있다. 한쪽 또는 양쪽 말단에 추가적인 잔기를 가지는 삽입 변이체는 예를 들어, 융합 단백질 및 아미노산 태그(tag) 또는 라벨(label)을 포함하는 단백질 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, Fc 분자는 특히 상기 분자가 대장균(E. coli) 등과 같은 박테리아 세포 내에 재조합으로 발현될 때, N-말단 Met를 선택적으로 포함할 수 있다.
Fc 결핍 변이체에서, Fc 부위 내 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거된다. 결핍은 Fc 폴리펩티드의 한쪽 또는 양쪽 말단에, 또는 Fc 아미노산 서열 내로 하나 이상의 잔기의 제거로 나타날 수 있다. 그러므로 결핍 변이체는 Fc 폴리펩티드 서열의 모든 단편을 포함한다.
본 발명의 Fc 치환 변이체에 있어서, Fc 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기는 제거되고 대체의 잔기로 대체된다. 당업자는 각각의 첨가, 결핍, 삽입 또는 치환이 하나의 아미노산 또는 아미노산 중 일부 퍼센트를 변화시킨 아미노산 서열이 기존의 아미노산 측쇄의 특성을 보존하는 것으로 인지할 것이다. 이들은 단백질의 변화가 유사한 기능을 가지는 단백질을 야기하는 것을 "보존적 치환" 또는 "보존적 변형"으로 언급한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에 잘 알려져 있다. 아미노산 사슬 특성의 예로는 공통적으로 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 및 뒤에 작용기를 가지거나 공통적인 특성을 가지는 측쇄: 지방성 측쇄(G, A, V, L, I, P); 수산기 포함 측쇄(S, T, Y); 황(sulfur) 원자 포함 측쇄(C, M); 카르복실산 및 아마이드 포함 측쇄(D, N, E, Q); 염기 포함 측쇄(R, K, H); 및 방향족 포함 측쇄(H, F, Y, W)가 있다. 게다가, 하기 8개의 군은 각각 서로 보존적인 치환을 하는 아미노산을 포함한다:
1) 알라닌(A), 글리신(G);
2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 라이신(K);
5) 이소루신(I), 루신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);
7) 세린(S), 트레오닌(T); 및
8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예를 들어, Creighton, Proteins(1984) 참조).
한가지 측면에 있어서, 치환은 자연에서 보존된다. 그러나 본 발명은 이에 한정하지 않고 폴리펩티드가 필수적인 항체 효과기 기능을 유지하는 한, 비-보존적인 치환도 포함한다.
바람직하게, 모체 폴리펩리트 Fc 부위는 인간 Fc 부위, 예를 들어 기존 서열인 인간 Fc 부위, 인간 IgG1(A 및 비-A 알로타이프) 또는 인간 IgG3 Fc 부위이다. 한 개의 실시예에서, 향상된 ADCC를 가지는 변이체는 기존 서열 IgG1 또는 IgG3 Fc 부위, 및 변이체의 항원-결합 부위를 가지는 항체 보다 상당히 더 효과적으로 ADCC를 매개한다. 바람직하게, 변이체는 Fc 부위의 298, 333 및 334번 위치에 2 내지 3개의 잔기의 치환을 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성된다. 면역글로불린 중쇄에서 잔기의 번호는 본 발명의 참고문헌으로 특별히 포함된 Kabat et al., (supra) 내 EU 지표의 것이다. 더 바람직하게, 298, 333 및 334번 위치에서 잔기는 치환된다(예를 들어, 알라닌 잔기로). 게다가, 향상된 ADCC 활성을 가지는 Fc 부위 변이체를 제조하기 위해서, ADCC 매개를 위해 FcR이 중요한 것으로 생각되는 FcγRⅢ에 대한 향상된 결합 친화성을 가지는 Fc 부위 변이체를 일반적으로 조작할 것이다. 예를 들어, 상기 변이체를 제조하기 위해 모체 Fc 부위 내 256, 290, 298, 312, 326, 330, 333, 334, 360, 378 또는 430번 위치의 아미노산 중 하나 이상에서 아미노산 변형(예를 들어, 삽입, 결핍 또는 치환)을 도입할 수 있다. FcγRⅢ에 대한 향상된 결합 친화성을 가지는 상기 변이체는 FcγRⅡ에 대한 결합 특이성, 특히 FcγRⅡ 수용체를 억제하기 위한 친화성을 추가적으로 감소시킬 수 있다.
필수적인 항체 효과기 기능을 유지하기 위해, 아미노산 중 작은 수 또는 작은 퍼센트만을 변형(첨가, 결핍, 삽입 또는 치환)시키는 것이 바람직하다. 그럼에도 불구하고, 많은 다양한 아미노산의 삽입, 결핍 및/또는 치환(예를 들어, 1 내지 50개의 아미노산 유래, 바람직하게 1 내지 25개의 아미노산 유래, 더욱 바람직하게 1 내지 10개의 아미노산 유래)이 고려되고, 본 발명의 범위 내에 있다. 또한, 변형된 아미노산의 퍼센트는 20% 이하가 바람직하고, 15% 이하가 더욱 바람직하며, 10% 이하가 더욱 바람직하며, 1 내지 5%가 가장 바람직하다. 보존적인 아미노산 치환은 일반적으로 바람직하나 본 발명이 이에 한정되지 않는다. 게다가, 변화는 펩티도미테틱스(peptidomimetics) 또는 D-아미노산 등의 변형된 아미노산의 형태로 될 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 ADCC 활성은 Fc 부위에 첨가된 글리코(glyco) 사슬 등과 같이, 아미노산 서열과는 다른 생화학적 특성을 변형함으로써 증진될 수 있다. 예를 들어, IgG의 푸코오스 잔기의 결핍은 ADCC 활성을 증진시킬 수 있음이 보고되었다(Shinkawa et al., (2003) J. Biol. Chem.: 278(5): 3466-73.). 그러므로, Fc 부위의 푸코오스 잔기가 결핍된 항체는 본 발명에 있어서 바람직하다. 보다 구체적으로, ADCC 활성을 증진하기 위해서, Fc 부위의 CH2 도메인에 접합되는 프코오스 잔기는 제거될 수 있다. CHO를 제외한 세포들은 Fc 부위의 푸코오스 잔기가 결핍된 항체의 발현을 위해 숙주세포로 이용될 수 있다. 여기서, 푸코오스 잔기는 CHO에서 고도로 발현되는 알파 1,6-푸코실트랜스퍼라제(alpha 1,6-fucosyltransferase; FUT8)에 의해 항체에 첨가될 수 있다.
그러므로, 이런 종류에 속하는 인간 유래 항체는 본 발명에 있어서 바람직하다. 인간 항체는 인간으로부터 채취된 항체 생산 세포, 또는 인간 항체 유전자로 이식된 키메라 동물을 이용하여 획득될 수 있다(Ishida I, et al., (2002) Cloning and Stem Cells., 4: 91-102.).
게다가, 항체 Fc 부위는 임의적인 가변 부위로 연결할 수 있다. 구체적으로, 별개의 동물종의 가변 부위가 인간 보존 부위에 결합된 키메라 항체는 당업계에 잘 알려져 있다. 또한, 인간-인간 키메라 항체는 인간 유래 가변 부위가 임의적인 보존 부위에 결합함으로써 획득될 수 있다. 게다가, 인간 항체 가변 부위에 대응하는 상보성 결정 부위(CDR)가 이종 항체의 CDR로 대체되는 CDR 융합 기술이 알려져 있다("Immunoglobulin genes" Academic Press (London), pp260-274, 1989; Roguska MA, et al., (1994) Proc . Natl . Acad . Sci . USA., 91: 969-73.). CDR의 대체에 의해, 항체 결합 특이성은 대체된다. 즉, 인간 EphA4는 인간 EphA4 결합 항체의 CDR이 이동된 인간화된 항체에 의해 인지될 것이다. 또한, 이동된 항체는 인간화된 항체로 불린다. 이와 같이, 효과기 기능에 필수적인 Fc 부위를 획득하여 이를 포함하는 항체는 본 발명의 항체로 이용될 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG Fc를 포함하는 항체는, 비록 이의 가변 부위가 다른 종류 또는 다른 종의 면역글로불린으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함함에도 불구하고 본 발명에 있어서 바람직하다.
본 발명의 항체의 VH 및 VL 도메인은 각각 프레임워크에 의해 분리되는 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지정된 3개의 CDR을 포함한다. CDR의 아미노산 서열은 항체가 EphA4에 특이적으로 결합할 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 바람직한 CDR 아미노산의 예는 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다:
인간 VH CDR1 : ELSMH(서열번호: 10),
인간 VH CDR2 : GFDPEDGETIYAQKFQG(서열번호: 11),
인간 VH CDR3 : AQPFHWGDDAFDI(서열번호: 12),
인간 VL CDR1 : SGSSSNIGSNTVN(서열번호: 15),
인간 VL CDR2 : SNNQRPS(서열번호: 16),
인간 VL CDR3 : AAWDDSLNGPV(서열번호: 17); 및
인간 VH CDR1 : SNSAAWN(서열번호: 20),
인간 VH CDR2 : RTYYRSKWYNDYAVSVKS(서열번호: 21),
인간 VH CDR3 : DSLRSFDY(서열번호: 22),
인간 VL CDR1 : SGSSSNIGNNYVS(서열번호: 24),
인간 VL CDR2 : DNNKRPS(서열번호: 25),
인간 VL CDR3 : GTWDSSLSAVV(서열번호: 26).
보다 바람직한 실시예에 있어서, VH는 서열번호: 27 또는 29의 아미노산 서열에 상응하고, VL은 서열번호: 28 또는 30의 아미노산 서열에 상응한다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체는 단일클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다. 인간에게 투여할 때조차, 인간 다클론 항체는 상기 기재된 인간 항체 유전자로 이식된 동물을 이용하여 파생될 수 있다. 또한, 인간화된 항체, 인간-비인간 키메라 항체, 및 인간-인간 키메라 항체 등의 유전공학 기술을 이용하여 제조된 면역글로불린이 이용될 수 있다. 게다가, 인간 항체 생산 세포를 클로닝함에 의해 인간 단일클론 항체를 획득하는 방법은 알려져 있다.
EphA4 또는 이의 부분적인 펩티드를 포함하는 단편은 본 발명의 항체를 획득하기 위해 면역원으로 이용될 수 있다. 본 발명의 EphA4는 특정 종으로부터, 바람직하게 인간, 마우스 또는 랫트 등의 포유류로부터, 더욱 바람직하게 인간으로부터 파생될 수 있다. 인간 EphA4 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 당업계에 알려져 있다. 그래서, EphA4의 cDNA 뉴클레오티드 서열(GenBank Accession No. NM_004438)은 서열번호: 1로 기재되고, 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열(GenBank Accession No. NP_004429)은 서열번호: 2로 기재된다. 당업자는 원하는 서열의 단편을 제조하는 제공된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자를 일상적으로 분리할 수 있고, 표적 아미노산 서열에 상응하는 단백질을 획득할 수 있다.
예를 들어, EphA4 단백질을 암호화하는 유전자 또는 이의 단편은 알려진 발현 벡터 내로 삽입될 수 있고, 숙주 세포를 전환시키기 위해 이용될 수 있다. 원하는 단백질 또는 이의 단편은 임의적인 및 표준 방법을 이용하여 숙주 세포 내 또는 외로부터 획득될 수 있고, 또한 항원으로서 이용될 수 있다. 게다가, 단백질, 이의 용해물, 및 화학적으로 합성된 단백질은 항원으로 사용될 수 있다. 더불어, EphA4 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 세포는 그 자체가 면역원으로서 이용될 수 있다.
EphA4 면역원으로서 펩티드 단편을 사용할 때, 이는 특히 세포 외 도메인이 될 부위를 포함하는 아미노산 서열을 선택하는 것이 바람직하다. 신호 펩티드는 1 내지 19번 위치로부터 확장되는 EphA4의 N-말단에 존재하는 것으로 추정된다. 따라서, 예를 들어 N-말단 신호 펩티드를 제외한 부위(초기 19개의 아미노산 잔기)는 본 발명의 항체를 획득하기 위한 면역원으로서 바람직하다. 즉, EphA4 세포 외 도메인에 결합하는 항체는 본 발명의 항체로서 바람직하다.
따라서, 본 발명의 바람직한 항체는 효과기 기능에 필수적인 Fc, 및 세포 외 EphA4 도메인에 결합할 수 있는 가변 부위를 가진다. 인간에 투여하기 위한 목적일 때, 항체는 IgG Fc를 가지는 것이 바람직하다.
특정 포유류는 항원 등으로 면역이 될 수 있다. 그러나, 세포 융합에 이용되는 모체 세포와 호환성을 고려하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 설치류, 토끼류 또는 영장류가 바람직하다.
설치류는 예를 들어, 마우스, 랫트 및 햄스터를 포함한다. 토끼류는 예를 들어, 토끼를 포함한다. 영장류는 예를 들어, 게잡이원숭이(Macaca fascicularis), 붉은털원숭이(Macaca mulatta), 망토개코원숭이(Sacred baboon), 및 침팬지 등의 협비류(catarrhine) 원숭이를 포함한다.
항원으로 동물을 면역화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 복부 내 또는 피하 항원 주사는 동물을 면역화하는 표준 방법이다. 구체적으로, 항원은 적절한 양의 인산완충식염수(PBS), 생리식염수 또는 기타 등으로 희석 및 현탁될 수 있다. 원하는 바와 같이, 항원 현탁액은 적절한 양의 프로인드 보조제(Freund's complete adjuvant; CFA) 등의 표준 보조제로 혼합될 수 있고, 에멀션화 후 포유류에게 투여될 수 있다. 다음으로, 적절한 양의 프로인드 보조제와 혼합된 항원을 21일까지 매 4일마다 다중 투약량으로 투여된다. 또한, 적절한 담체가 면역화를 위해 이용될 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 면역화를 수행한 후, 표준 방법은 원하는 항체 수준으로의 증가를 위해 혈청을 검사하는데 이용될 수 있다.
EphA4 단백질에 대한 다클론 항체는 혈청이 원하는 항체를 증가한 것으로 조사된 면역화된 포유류로부터 제조될 수 있다. 이는 상기 동물로부터 혈액을 채취함으로써, 또는 상기 동물의 혈액으로부터 혈청을 분리하는 임의적이고 일반적인 방법을 이용함으로써 획득할 수 있다. 본 발명에 있어서, 다클론 항체는 다클론 항체를 포함하는 혈청, 및 혈청으로부터 분리된 다클론 항체를 포함하는 분획을 포함한다. IgG 및 IgM은 예를 들어, EphA4 단백질에 결합되는 친화성 컬럼을 이용하여 EphA4 단백질을 인지하는 분획을 제조한 다음, 추가적으로 단백질 A 또는 단백질 G를 이용하여 상기 분획을 정제함으로써 제조될 수 있다. 본 발명에 있어서, 항혈청은 다클론 항체로 이용될 수 있다.
단일클론 항체를 제조하기 위해서, 혈청 내 항체가 원하는 수준으로 증가된 것으로 조사되고 세포 융합에 적용되는, 항원으로 면역화된 동물로부터 면역세포가 채취할 수 있다(상기 보는 바와 같이). 세포 융합에 이용되는 면역세포는 비장으로부터 유래하는 것이 바람직하다. 상기 면역원을 가지는 융합을 위한 다른 모체 세포는 포유류의 골수종 세포를 포함하는 것이 바람직하고, 약제에 의해 융합 세포의 선별을 위한 특성을 획득한 골수종을 포함하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 면역세포 및 골수종 세포는 예를 들어, Milstein et al. (Galfre, G. and Milstein, C., (1981) Methods . Enzymol . : 73, 3-46.)의 방법 등의 알려진 방법을 이용하여 융합될 수 있다.
세포 융합에 의해 생산된 융합 세포(Hybridoma)는 HAT 배지[히포키산틴(hypoxanthine), 아미노텝린(aminopterin), 및 티미딘(thymidine)] 등의 표준 선택적 배지에서 배양함으로써 선별될 수 있다. HAT 배지에서 세포 배양은 일반적으로 원하는 융합 세포을 제외한 모든 세포(융합되지 않은 세포)를 사멸시키기에 충분한 기간인 며칠 내지 몇 주 동안 지속한다. 표준 제한적 희석을 수행한 후, 원하는 항체를 생산하는 융합 세포를 스크린 및 클론한다.
비인간 동물은 상기 방법에서 융합 세포를 제조하기 위해 항원으로 면역화될 수 있다. 게다가, EB 바이러스 등으로 감염된 세포로부터 유래된 인간 림프구는 단백질, 단백질을 발현하는 세포, 또는 상기 단백질의 현탁액을 이용하여 생체 외에서 면역화될 수 있다. 상기 면역화된 림프구는 무제한으로 분리할 수 있는 인간 유래 골수종 세포(U266 등)로 융합될 수 있으며, 따라서 단백질을 결합할 수 있는 원하는 인간 항체를 생산하는 융합 세포를 획득될 수 있다(심사 없이 공개된 일본 출원번호(JP-A) Sho 63-17688).
상기 획득된 융합 세포를 마우스 복강에 이식한 후, 복수(ascite)를 추출한다. 상기 획득한 단일클론 항체는 예를 들어, 황산 암모늄 침전, 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼, DEAE 이온 교환 크로마토그래피 또는 본 발명의 단백질에 결합되는 친화성 컬럼 등을 이용하여 정제할 수 있다. 본 발명의 항체는 본 발명의 단백질을 정제 및 검출하는데 뿐만 아니라 본 발명의 단백질의 작용제(agonist) 및 길항제(antagonist)의 후보 물질을 정제 및 검출하는데 이용될 수 있다. 또한, 이런 항체는 본 발명의 단백질과 관련된 질병에 대한 항체 치료에 적용될 수 있다. 상기 획득된 항체가 인간 체내에 투여될 때(항체 치료), 인간 항체 또는 인간화된 항체는 이들의 낮은 면역원성 때문에 바람직하다.
예를 들어, 인간 항체 유전자의 레퍼토리를 가지는 형질전환 동물은 단백질, 단백질 발현 세포 또는 상기 단백질의 현탁액으로부터 선별된 항원으로 면역화될 수 있다. 항체 생산 세포는 융합 세포를 야기하기 위해 골수종 세포로 융합된 동물로부터 회복될 수 있고, 항 단백질 인간 항체는 이런 융합 세포로부터 제조될 수 있다(국제공개번호 92-03918, 94-02602, 94-25585, 96-33735, 및 96-34096 참조).
또한, 항체를 생산하는 면역화된 림프구 등의 면역 세포는 암 유전자를 이용하여 불멸화될(immortalize) 수 있으며, 단일클론 항체를 제조하기 위해 이용될 수 있다.
이런 방법으로 획득된 단일클론 항체는 유전 공학 방법을 이용하여 제조될 수 있다(예를 들어, Borrebaeck, C.A.K. 및 Larrick, J.W., (1990) Therapeutic Monoclonal Antibodies, MacMillan Publishers, UK 참조). 예를 들어, 재조합 항체는 항체를 생산하는 융합 세포 또는 면역화된 림프구 등의 면역세포로부터 유래된 항체를 암호화하는 DNA를 클로닝하고; 상기 DNA를 적합한 벡터 내로 삽입하고; 및 상기 벡터를 숙주 세포 내로 형질전환함으로써 제조될 수 있다. 또한, 본 발명에서는 상기와 같이 제조된 재조합 항체를 고려할 수 있다.
항체는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 다양한 분자와 결합함으로써 변형될 수 있다. 이런 방법으로 변형된 항체는 본 발명에 이용될 수 있다. 변형된 항체는 화학적으로 변형시킨 항체에 의해 획득될 수 있다. 이런 변형 방법의 종류는 당업자에게 일반적인 것이다. 또한, 상기 항체는 다른 단백질에 의해 변형될 수 있다. 단백질 분자에 의해 변형된 항체는 유전 공학을 이용하여 제조될 수 있다. 즉, 표적 단백질은 항체 유전자와 변형된 단백질을 암호화하는 유전자를 융합함으로써 발현될 수 있다. 예를 들어, 항체 효과기 기능은 사이토카인 또는 케모카인과의 결합이 증진될 수 있다. 실제로, IL-2, GM-CSF 및 기타 등으로 융합된 단백질에 대한 항체 효과기 기능의 증진이 확인된바 있다(Penichet ML, et al., (2001) Human Antibodies , 10: 43-9.). IL-2, IL-12, GM-CSF, TNF, 호산구, 주화성 펩티드(chemotactic substance; RANTES) 및 기타 등은 효과기 기능을 증진하는 사이토카인(cytokine) 또는 케모카인(chemokine)에 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 비인간 항체 유래 가변 부위 및 인간 항체 유래 불변 부위를 포함하는 키메라 항체, 또는 비인간 유래 상보성 결정 부위(CDR), 인간 항체 유래 프레임워크(FR) 및 불변 부위를 포함하는 인간화된 항체로서 획득될 수 있다. 각 항체는 알려진 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
분자 생물학의 표준 기술은 키메라 및 CDR 융합 산물을 암호화하는 DNA 서열을 제조하기 위해 이용될 수 있다. 원하는 항체의 CDR을 암호화하는 유전자는 예를 들어, 항체 생산 세포의 RNA 유래 가변 부위를 합성하기 위해 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR) 등을 이용함으로써 제조될 수 있다[예를 들어, Larrick et al., "Methods: a Companion to Methods in Enzymology", vol.2: page 106(1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies" in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application; Ritteretal.(eds.), page 166(Cambridge University Press, 1995), andWardetal., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies" in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications; Birch et al.(eds.), page 137(Wiley-Liss, Inc., 1995) 참조]. 키메라 및 CDR 융합 산물을 암호화하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 이용하여 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 특정 부위 돌연변이 유발(Site-directed mutagenesis) 및 PCR 기술이 적절하게 이용될 수 있다. 예를 들어, Jonesetal., (1986) Nature.; 321:522-5에 기재된 바와 같은 합성으로 유발된 올리고뉴클레오티드가 이용될 수 있다. 또한, 예를 들어 Verhoeyen et al.,(1988) Science.; 239:1534-6 또는 Riechmann et al.,(supra)에 기재된 바와 같은 기존 가변 부위의 돌연변이로 유발된 올리고뉴클레오티드가 이용될 수 있다. 또한, 예를 들어 Queen et al.,(1989) Proc Natl Acad Sci USA.; 86:10029-33; PCT 공개 WO 90/07861에 기재된 바와 같은 T4 DNA 폴리머라제(polymerase)를 이용한 효소에 의해 채워진 융합된 올리고뉴클레오티드가 이용될 수 있다.
적합한 숙주 세포/벡터 시스템은 CDR-융합 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA 서열의 발현을 위해 이용될 수 있다. 대장균(E. coli) 등의 박테리아 및 다른 미생물 시스템은 FAb 및 (Fab')2 단편, 및 특히 Fv 단편 및 단일 사슬 Fv 등의 단일 사슬 항체 단편 등의 항체 단편의 발현을 위해 이용될 수 있다. 포유류 등의 진핵세포생물의 숙주 세포 발현 시스템은 완전한 항체 분자를 포함하는 큰 CDR-융합 gkdcp 산물의 생산을 위해 이용될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포는 CHO 세포, 및 골수종 또는 융합 세포주를 포함한다.
상기와 같이 획득된 항체는 균등할 때까지 정제될 수 있다. 예를 들어, 항체는 단백질을 정제 및 분리하기 위해 사용되는 일반적인 방법에 따라 정제 또는 분리될 수 있다. 예를 들어, 항체는 친화성 크로마토그래피를 포함하나 이에 한정되지 않는 컬럼 크로마토그래피, 여과, 한외여과막(Ultrafiltration, UF), 투석, SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 등전점 전기영동(isoelectric focusing) 및 기타 등등의 적절하게 선별된 조합을 이용하여 분류 및 분리될 수 있다(Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow 및 David, Lane (edit.), Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
단백질 A 컬럼 및 단백질 G 컬럼은 친화성 컬럼으로 이용될 수 있다. 사용에 있어서 예시적인 단백질 A 컬럼은 Hyper D, POROS 및 Sepharose FF(Pharmacia)를 포함한다.
예시적인 크로마토그래피(친화성 크로마토그래피를 제외한)는 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피 및 흡착 크로마토그래피를 포함한다("Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual" Daniel R. Marshak et al., (1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press.). 상기 크로마토그래피는 HPLC 또는 FPLC 등의 액상 크로마토그래피의 절차에 따라 수행될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 항체의 항원 결합 활성은 흡광도 측정, 효소결합 면역흡착분석법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay; ELISA), 효소면역검사법(enzyme immunoassays; EIA), 방사면역측정법(radioimmunoassays; RIA) 및/또는 면역형광법(immunofluorescence method)을 이용하여 측정될 수 있다. ELISA에 있어서, 본 발명의 항체는 전형적으로 플레이트에 고정되고, 본 발명의 단백질이 상기 플레이트에 첨가된 다음, 항체를 생산하는 세포의 배양 상청액 또는 정제된 항체 등의 원하는 항체를 포함하는 시료가 첨가된다. 이때 1차 항체를 인지하고 알카리 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등의 효소로 태그된 2차 항체가 첨가된 후, 상기 플레이트는 배양되었다. 세척 후, p-니트로페닐 인산(p-nitrophenyl phosphate) 등의 효소 기질이 플레이트에 첨가되고, 흡광도가 측정된 다음, 시료의 항원 결합 활성이 평가된다. 단백질 단편(C-말단 또는 N-말단 단편 등)은 단백질과 같은 방법으로 이용될 수 있다. 본 발명의 항체의 결합 활성은 BIAcore(Pharmacia)을 이용하여 측정될 수 있다.
게다가, 예시로 요약된 방법들에 의해 항체 효과기 기능이 평가될 수 있다. 예를 들어, 표적 EphA4 발현 세포는 효과기 기능이 평가되는 항체의 존재 하에서 효과기 세포와 함께 배양될 수 있다. 만약 표적 세포 손상이 검출된다면, 항체는 ADCC를 유도하는 효과기 기능을 가지는 것으로 확인될 수 있다. 항체 또는 효과기 세포 중 어느 하나의 부재하에서, 관찰되는 표적 세포 손상의 수준은 효과기 기능의 수준으로 대조군과 비교될 수 있다. EphA4를 명백히 발현하는 세포는 표적 세포로 이용될 수 있다. 구체적으로, 실시예에서 EphA4를 발현하는 것으로 확인된 다양한 세포주는 표적 세포로 이용될 수 있다. 이런 세포주들은 세포 은행으로부터 획득될 수 있다. 게다가, 보다 강한 효과기 기능을 가지는 단일클론 항체가 선별될 수 있다.
본 발명에 있어서, 항 EphA4 항체는 약제로 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다. 본 발명에 있어서, 항체가 투여될 수 있는 인간을 제외한 동물은 마우스(mouse), 랫트(rat), 기니아피그(guinea pig), 토끼, 닭, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 원숭이, 개코원숭이 및 침팬지 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 항체는 개체에 직접 투여될 수 있고, 알려져 있는 약학적 제형을 이용한 투약 형태로 제형될 수 있다. 예를 들어, 필요에 따라 상기 항체는 멸균 용액, 또는 물 또는 약학적으로 허용가능한 액체를 포함하는 현탁액 등의 주사 제형으로 비경구로 투여될 수 있다. 예를 들어, 다양한 화합물들은 멸균수, 생리식염수, 식물성 유지, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 첨가제, 용매, 보존제, 결합제 및 이들의 유사물 등의 허용가능한 담체 또는 용매가 약제로 이용하기 위해 필수적인 일반적으로 허용가능한 단위 투약량으로 혼합될 수 있다.
생리 식염수, 글루코즈 및 보조제(D-소르비톨, D-만니톨 및 염화 나트륨 등)을 포함하는 등장액은 주사용 수용액으로 이용될 수 있다. 또한, 이들은 알코올, 특히 에탄올 및 폴리알코올(예를 들어, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜), 및 비-이온 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트 80TM 또는 HCO-50) 등의 적절한 가용화제로 이용될 수 있다.
참기름 또는 두유는 유성 용액으로 이용될 수 있고, 벤조산 벤질 또는 벤질 알코올은 가용화제로 포함될 수 있다. 완충 용액(인산 완충용액, 아세트산 나트륨 완충용액, 또는 기타), 마취제(염산 프로카인 또는 기타), 안정제(벤질 알코올, 페놀, 또는 기타), 및 항산화제는 상기 제형에 포함될 수 있다. 상기 제조된 주사제는 적절한 앰풀로 포장될 수 있다.
본 발명에 있어서, 항 EphA4 항체는 환자에게 예를 들어, 동맥 내로, 정맥 내로, 경피적으로, 비강 내로, 경기관지로, 국소적으로 또는 근육 내로 투여될 수 있다. 점적약 또는 주사제로 혈관 내(정맥 내) 투여는 췌장암 환자에게 항체를 조직적으로 투여하는 일반적인 방법의 예시이다. 폐에서 초기 병소 또는 전이 병소에 항체제를 국소적으로 응축하는 방법은 기관지경(기관지경 검사)을 이용한 국소적 주사, 및 CT 안내 또는 흉강경 검사 하에서 국소적 주사를 포함한다. 간에서 초기 병소 또는 전이 병소에 항체제를 국소적으로 응축하는 방법은 간문맥 주사 또는 동맥 주입을 이용한 국소적 주사를 포함한다. 게다가, 항체제 등의 항암제를 국소적으로 주사하기 위해, 동맥 내 카테터를 암세포에 영양분을 공급하는 정맥 근처에 주입하는 방법은 췌장암의 초기 병소뿐만 아니라 전이 병소에 대한 국소적인 조절 치료법으로써 효과적이다.
투약량 및 투약 방법은 환자 체중 및 나이, 및 투약 방법에 따라 다양함에도 불구하고, 이런 매개변수들은 당업자에 의해 일상적으로 결정될 수 있다. 게다가, 항체를 암호화하는 DNA는 유전자 치료를 위해 벡터로 삽입될 수 있고, 상기 벡터는 치료를 위해 투여될 수 있다. 투약량 및 투약 방법은 환자 체중, 나이 및 상태에 따라 다양하고, 당업자는 이를 적절하게 선별할 수 있다.
항 EphA4 항체는 EphA4 발현 세포에 대한 효과기 기능을 기초로 하는 세포독성이 확인되는 만큼의 양으로 생체 내로 투여될 수 있다. 예를 들어, 증상에 의존적으로 양의 차이가 있음에도 불구하고, 항 EphA4 항체의 일반적인 투약량은 하루에 0.1 mg 내지 250 mg/kg의 범위이다. 보통, 성인(체중 60 kg)에 대한 투약량은 5 mg 내지 17.5 g/day, 바람직하게 5 mg 내지 10 g/day, 및 더욱 바람직하게 100 mg 내지 3 g/day이다. 투약량 계획은 2 내지 10일 간격에 걸쳐 1 내지 10회이고, 예를 들어 경과는 3 내지 6회 투여 후 관찰된다.
본 발명의 항체가 효과기 기능을 유지함에도 불구하고 일부 경우에 있어서, 세포 독성제는 잘 알려진 기술을 이용하여 상기 항체에 결합될 수 있다. 세포 독성제는 많고 다양하며, 세포독성 약제 또는 독소, 또는 상기 독소의 활성 단편을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 적절한 독소 및 이에 대응하는 단편은 디프테리아 A 사슬(diphtheria A chain), 엑소톡신 A 사슬(exotoxin A chain), 리신 A 사슬(ricin A chain), 아브린 A 사슬(abrin A chain), 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin) 및 아우리스타틴(auristatin) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 세포 독성제는 본 발명의 항체에 방사성 동위원소를 결합시키거나, 항체에 공유적으로 접합된 킬레이트제(chelating agent)에 방사성 핵종(radionuclide)의 결합에 의해 제조된 방사화학물(radiochemical)을 포함한다. 접합체(conjugate)를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
또한, 항체 또는 이의 기능적 유도체를 암호화하는 핵산 서열은 유전자 치료 방법에 의해 췌장암 등의 EphA4 발현 세포와 관련된 질병을 치료 또는 예방하기 위해 투여될 수 있다. 유전자 치료는 발현되는 또는 발현될 수 있는 핵산을 개체에 투여함으로써 형성되는 치료를 의미한다. 본 발명의 실시예에 있어서, 핵산은 그가 암호화하는 항체 또는 항체 단편을 생산하고, 그 결과 예방적 또는 치료적 효과를 조정한다.
당업계에서 이용가능한 유전자 치료 방법 중 어느 하나가 본 발명에 이용될 수 있다. 예시적인 방법은 다음에 기재되는 바와 같다.
유전자 치료 방법의 일반적인 검토를 위해, Goldspiel et al., (1993) Clin. Pharm .;12:488-505; Wu and Wu, (1991) Biotherapy .;3:87-95; Tolstoshev, (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol.;32:573-96; Mulligan, (1993) Science.;260:926-32; Morgan and Anderson, (1993) Ann Rev Biochem .;62:191-217; Clare Robinson Trends Biotechnol.;11(5):155-215을 참조한다. 이용될 수 있는 재조합 DNA 기술의 당업계에 일반적으로 알려진 방법은 Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)에 기재되어 있다.
바람직하게, 본 발명의 조성물은 항체를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 핵산은 적합한 숙주 내에서 항체 또는 이의 단편, 또는 키메라 단백질, 또는 이들의 중쇄 또는 경괘를 발현하는 발현 벡터의 부분이 되는 핵산을 의미한다. 특히, 상기 핵산은 프로모터, 바람직하게 이종 기원의 프로모터를 가지며, 상기 프로모터는 암호화 부위를 항체에 작동가능하게 연결하고, 유도성 있거나 구조성이 있으며, 선택적으로 조직 특이적인 프로모터를 의미한다. 또 다른 특정 실시예에 있어서, 핵산 분자는 서열 및 다른 원하는 서열을 암호화하는 항체가 지놈 내 원하는 부위에서 상동 재조합을 촉진시키는 부위의 측면에 놓여서, 항체를 암호화하는 핵산의 염색체 내 발현을 제공하는데 이용된다(Koller 및 Smithies, (1989) Proc Natl Acad Sci USA.;86:8932-5; Zijlstra et al., (1989) Nature.;342:435-8). 특정 실시예에 있어서, 상기 발현되는 항체 분자는 단일 사슬 항체이나; 대안으로 상기 핵산 서열이 항체의 중쇄 및 경쇄, 또는 이들의 단편을 모두 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
개체 내로 핵산의 전달은 개체가 핵산 또는 핵산 전달 벡터에 직접적으로 노출되는 직접적인 경우, 또는 세포가 생체 외에서 핵산으로 형질전환된 후 개체 내로 이식되는 간접적인 경우 중 어느 하나일 수 있다. 이런 2개의 접근은 각각 생체 내 또는 생체 외 유전자 치료로서 알려져 있다.
한 개의 실시예에 있어서, 상기 핵산 서열은 생체 내에 직접 투여될 수 있고, 상기 핵산 서열은 생체 내에서 암호화되는 산물을 생산하기 위해 발현된다. 이는 예를 들어, 상기 핵산 서열이 적합한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구성하고, 상기 벡터를 예를 들어, 결점이 있거나 약한 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터를 이용한 감염에 의해(미국 특허번호 4,980,286 참조), 또는 네이키드 DNA(naked DNA)의 직접적인 주사에 의해, 또는 마이크로입자 총(microparticle bombardment)(예를 들어, 유전자 총; Biolistic, Dupont)의 이용에 의해, 또는 지질로의 코팅, 또는 세포 표면 수용체, 또는 형질전환제, 또는 리포좀(liposome), 마이크로입자(microparticle) 또는 마이크로캡슐(microcapsule)로의 캡슐화 등에 의해 세포 내에 있도록 투여하거나, 상기 항체를 핵 내에 들어가는 것으로 알려진 펩티드에 연결된 상태로 투여하거나, 또는 상기 항체를 수용체 매개 엔도시토시스(예를 들어, Wu 및 Wu, (1987) J Biol Chem .; 262:4429-32 참조)(수용체를 특이적으로 발현하는 표적 세포 형태에 사용될 수 있는)에 대상인 리간드를 연결한 상태로 투여하는 등의 당업계에 알려진 다양한 방법 중 어느 하나에 의해 성취될 수 있다. 또 다른 실시예에 있어어서, 핵산-리간드 복합체는 리간드가 엔도좀(endosome)을 손상시키기 위해 융합 유전자의 바이러스 펩티드를 포함한 상태로 형성될 수 있고, 이는 상기 핵산이 라이소좀 분해를 피할 수 있게 한다. 그러나 또 다른 실시예에 있어서, 상기 핵산은 특이적인 수용체를 표적화에 의해 세포 특이적인 흡수 및 발현을 위한 생체 내 표적이 될 수 있다(예를 들어, PCT Publications WO 92/06180, WO 92/22635, WO92/20316, WO93/14188 또는 WO 93/20221 참조). 또한, 상기 핵산은 상동 재조합에 의해 세포 내로 삽입되고 발현을 위한 숙주 세포 DNA 내로 융합될 수 있다(Koller and Smithies, (1989) Proc Natl Acad Sci USA.;86:8932-5; Zijlstra et al., (1989) Nature .;342:435-8).
한 개의 실시예에 있어서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터가 사용된다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터(retroviral vector)가 사용될 수 있다(Miller et al., (1993) Methods Enzymol.;217:581-99 참조). 이런 레트로바이러스 벡터는 바이러스 지놈의 정확한 포장 및 숙주 세포 DNA 내로 융합되기 위해 필수적인 성분들을 포함한다. 유전자 치료에 사용되는 항체를 암호화하는 핵산 서열은 개체 내로 유전자의 전달을 용이하게 하는 하나 이상의 벡터 내로 클론된다. 레트로 바이러스에 대해 보다 상세한 설명은 Boesen et al., (1994) Biotherapy.;6:291-302에서 찾을 수 있고, 상기 문헌은 줄기세포가 화학요법에 보다 높은 저항성을 가지게 하기 위해 다약제 내성의 1개의 유전자를 조혈모세포로 전달하는 레트로바이러스의 용도를 기재하고 있다. 유전자 치료에 있어서 레트로바이러스의 용도를 설명하는 다른 문헌들은 다음과 같다: Clowes et al., (1994) J Clin Invest.;93:644-51; Kiem et al., (1994) Blood .;83:1467-73; Salmons and Gunzberg, (1993) Hum Gene Ther .;4:129-41; Grossman and Wilson, (1993) Curr Opin Genet Dev .;3:110-4.
유전자 치료에 이용되는 바이러스 벡터의 또 다른 예로는 아데노바이러스(adenovirus)가 있다. 아데노바이러스는 특히 유전자를 호흡 점막으로 전달하기 위한 매력적인 매개체이다. 아데노바이러스는 온화한 질병을 야기하는 호흡 점막을 자연적으로 감염한다. 아데노바이러스 기초 전달 시스템에 대한 다른 표적은 간, 중추신경계, 내피 세포 및 근육이다. 아데노바이러스는 분열하지 않는 세포를 감염시킬 수 있는 이점을 가진다. Kozarsky 및 Wilson, (1993) Curr Opin Genet Dev.;3:499-503는 아데노바이러스 기초 유전자 치료의 검토를 제시한다. Bout et al., (1994) Hum Gene Ther.;5:3-10는 유전자를 붉은털 원숭이의 호흡 점막에 전달하는 아데노바이러스 벡터의 용도를 설명한다. 유전자 치료에 있어서 아데노바이러스 용도의 다른 예로는 Rosenfeld et al., (1991) Science.;252:431-4; Rosenfeld et al., (1992) Cell .;68:143-55; Mastrangeli et al., (1993) J Clin Invest .;91:225-34; PCT 공개 WO 94/12649; Wang et al., (1995) Gene Ther .;2:775-83에서 찾을 수 있다. 바람직한 실시예에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 이용되었다.
또한, 아데노 관련 바이러스(AAV)가 유전자 치료에 이용되는 것이 보고된바 있다(Walsh et al., (1993) Proc Soc Exp Biol Med .;204:289-300; 미국 특허번호: 5,436,146).
유전자 치료에 대한 또 다른 접근은 전기천공(electroporation), 리포펙션(lipofection), 인산 칼슘 매개 형질감염 또는 바이러스 감염 등과 같은 방법에 의해 유전자를 조직 배양 내 세포에 전달하는 것에 관련된다. 일반적으로, 상기 전달 방법은 세포에 선별가능한 마커의 전달을 포함한다. 그때에 상기 세포는 전달된 유전자가 흡수되고 발현하는 세포를 분리하기 위해 선별된다. 그런 다음 이런 세포들은 개체 내로 전달될 수 있다.
한 개의 실시예에 있어서, 상기 핵산은 재조합 세포를 야기하는 생체 내 투여 이전에 세포 내로 삽입된다. 이런 삽입은 당업계에 알려진 방법에 의해 수행될 수 있고, 상기 방법에는 형질감염, 전기천공, 미세주입, 핵산 서열을 포함하는 바이러스 또는 박테리아파지 벡터로의 감염, 세포 융합, 염색체 매개 유전자 전달, 미세세포 매개 유전자 전달, 및 스페로플라스트 융합 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다양한 기술들은 세포 내로 외래 유전자의 삽입에 관한 분야에서 알려져 있으며(예를 들어, Loeffler and Behr, (1993) Methods Enzymol .;217:599-618; Cotton et al., 1993, Methods Enzymol.;217:618-44; Cline MJ. Pharmacol Ther . 1985;29(1):69-92. 참조), 상기 기술들은 수령 세포의 필수적인 발생적 및 생리학적 기능이 손상되지 않는 것을 제공하는 한, 본 발명에 따라서 이용될 수 있다. 상기 기술은 세포 내에 핵산의 적절한 전달을 위해 제공될 수 있고, 그 결과 핵산이 세포에 의해 발현가능하고, 바람직하게 핵산이 상기 세포의 자손에 의해 상속가능하고 발현가능하게 된다.
상기 결과인 재조합 세포는 당업계에 알려진 다양한 방법들에 의해 개체 내로 전달될 수 있다. 재조합 혈구(예를 들어, 조혈모세포 또는 전구체세포)는 바람직하게 정맥 내로 투여된다. 사용에 관해 계획된 세포의 양은 원하는 효과 및 환자의 상태 등에 의존하고, 이는 당업자에 의해 결정될 수 있다.
핵산이 유전자 치료의 목적을 위해 삽입될 수 있는 세포는 원하는 이용가능한 세포 형태를 포함하고, 상기 세포 형태는 상피세포, 내피세포, 케라티노사이트, 섬유아세포, 근육세포, 간세포; T 림프구, B 림프구, 단핵백혈구, 대식세포, 호중구, 호산구, 거핵세포, 과립구 등의 혈구; 다양한 줄기세포 또는 전구체세포, 특히 예를 들어, 골수, 제대혈, 말초혈액, 태아 간 등으로부터 획득된 조혈모세포 또는 전구체세포 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 실시예에 있어서, 유전자 치료용으로 이용되는 세포는 개체에 대한 자가조직이다.
재조합 세포가 유전자 치료에 이용되는 실시예에 있어서, 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 서열은 세포 또는 그의 자손에 의해 발현 가능하도록 세포 내로 삽입될 수 있고, 그런 다음 상기 재조합 세포는 치료 효과를 위해 생체 내로 투여된다. 구체적인 실시예에 있어서, 줄기세포 또는 전구체세포가 이용된다. 생체 외에서 분리 및 유지될 수 있는 특정 줄기세포 및/또는 전구체세포는 본 발명의 실시예에 따라서 잠재적으로 이용될 수 있다(예를 들어, PCT 공개 WO 94/08598; Stemple 및 Anderson, (1992) Cell .;71:973-85; Rheinwald, (1980) Methods Cell Biol.;21A:229-54; Pittelkow 및 Scott, (1986) Mayo Clin Proc .;61:771-7 참조).
한 개의 바람직한 실시예에 있어서, 유전자 치료의 목적을 위해 삽입된 핵산은 암호화 부위에 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함하며, 이는 상기 핵산이 발현이 전사의 적절한 유도자의 유무를 조절함으로써 조절가능하기 때문이다.
게다가, 본 발명은 EphA4 발현 세포에 대한 효과기 기능을 가지는 항체를 유도하는 면역성 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 EphA 또는 면역학적 활성 EphA4 단편, 또는 이들을 발현하는 DNA 또는 세포를 유효성분으로 포함한다. 또한, 본 발명은 EphA4 발현 세포에 대한 효과기 기능을 가지는 항체 유도용 면역성 조성물의 제조에 있어서, EphA4 또는 면역학적 활성 EphA4 단편, 또는 이들을 발현하는 DNA 또는 세포의 용도에 관한 것이다.
항 EphA4 항체의 투여는 상기 항체의 효과기 기능을 통해 암세포를 손상시킨다. 따라서, 만약 EphA4 항체가 생체 내에 유도될 수 있다면, 상기 항체 투여와 동등한 치료적 효과를 달성할 수 있다. 항원으로 구성된 면역성 조성물을 투여할 때, 표적 항체는 생체 내에서 유도될 수 있다. 따라서 본 발명의 면역성 조성물은 EphA4 발현 세포에 대한 백신 치료에 특히 유용하다. 그러므로, 본 발명의 면역성 조성물은 예를 들어, 췌장암 치료용 백신 조성물로서 효과적이다.
본 발명의 면역성 조성물은 EphA4 또는 면역학적 활성 EphA4 단편을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 면역학적 활성 EphA4 단편은 EphA4를 인지하고 효과기 기능을 가지는 항 EphA4 항체를 유도할 수 있는 단편을 의미한다. 하기에, EphA4 및 면역학적 활성 EphA4 단편은 면역성 단백질로 기재된다. 제공되는 단편이 표적 항체를 유도하는 지는 실제로 동물을 면역시킨 후, 유도된 항체의 활성을 확인함으로써 결정될 수 있다. 항체 유도 및 이의 활성의 확인은 예를 들어, 실시예에 기재된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 면역성 조성물은 유효성분으로 면역성 단백질뿐만 아니라 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 만약 필요하다면, 상기 조성물은 보조제와 함께 혼합될 수 있다. 불활성화시킨 튜버쿨로시스 박테리아(Killed tuberculosis bacteria), 디프테리아 톡소이드(diphtheria toxoid), 사포닌(saponin) 및 기타 등이 상기 보조제로서 이용될 수 있다.
또한, 면역성 단백질을 암호화하는 DNA, 또는 발현가능한 상태에서 상기 DNA를 보유하는 세포는 면역성 조성물로서 이용될 수 있다. 소위 말하는 DNA 백신인 면역원으로서 표적 항원을 발현하는 DNA를 이용한 방법은 잘 알려져 있다. DNA 백신은 EphA4를 암호화하는 DNA 또는 이의 단편을 적합한 발현 벡터 내로 삽입함으로써 획득될 수 있다.
레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 또는 센다이 바이러스 벡터 등이 적합한 벡터의 예들이다. 게다가, 프로모터의 다운스트림에 기능적으로 연결된 면역성 단백질 단백질을 암호화하는 DNA는 네이키드 DNA로서 세포 내로 삽입된 다음, 발현될 수 있다. 네이키드 DNA는 리보좀 또는 바이러스 막 벡터에서 캡슐화되고, 세포 내로 삽입될 수 있다.
또한, 본 발명의 EphA4 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 EphA4 발현 세포에 대한 특이적인 항체 및 세포독성 T 림프구(CTL)의 생산을 포함하는, 생체 내 면역반응의 유도를 위해 이용될 수 있다. 상기 방법에 있어서, 원하는 펩티드에 의한 CTL 유도는 생체 내 또는 생체 외 중 어느 하나에서 항원제시세포(APC)를 통해 T 세포에 상기 펩티드를 제시함으로써 달성될 수 있다.
예를 들어, 말초혈액 단핵세포(PBMC) 등의 환자 혈구는 채취되고, 면역성 단백질을 발현하는 벡터를 이용하여 형질전환된 후, 환자에게 되돌려질 수 있다. 그때, 형질전환된 혈구는 환자의 체내에서 면역성 단백질을 생산하고, 표적 항체를 유도한다. 또한, 환자의 PBMC는 채취되고, 생체 외 폴리펩티드와 접촉된 후, APC 또는 CTL의 유도가 이어질 수 있으며, 상기 세포가 개체에 투여될 수 있다. 생체 외에서 유도된 APC 또는 CTL은 투여 이전에 클론될 수 있다. 높은 표적 세포 손상 활성을 가지는 세포를 클로닝 및 성장시킴으로써, 세포성 면역치료는 보다 효과적으로 수행될 수 있다. 더불어, 이런 방법에서 분리된 APC 및 CTL은 상기 세포가 파생되는 각 개체뿐만 아니라 별개의 개체로부터 유래된 유사한 종류의 종양에 대한 세포성 면역치료에 이용될 수 있다.
일반적으로, 세포성 면역치료용 폴리펩티드를 이용할 때, CTL-유도의 효능은 다른 구조를 가지는 다수의 폴리펩티드들을 결합시키고, 상기 폴리펩티드들을 APC 특히, 수지상세포와 접합시킴으로써 증가되는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 외래 단편으로 APC를 자극시킬 때, 다수 형태의 단편들의 혼합물을 이용하는 것이 이점이 있다.
폴리펩티드에 의한 항종양 면역성의 유도는 종양에 대한 항체 생산의 유도를 관찰함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드에 대한 항체가 폴리펩티드로 면역화된 실험 동물에서 유도된 후, 종양 세포의 성장이 상기 항체에 의해 감소되었을 때, 상기 폴리펩티드는 항종양 면역성을 유도하는 능력이 있다고 간주된다.
면역성 단백질을 암호화하는 DNA, 또는 상기 DNA로 형질전환된 세포가 본 발명의 면역성 조성물로 이용될 때, 상기 조성물은 면역성 단백질뿐만 아니라 이들의 면역성 특성을 증진시키는 담체 단백질과 함께 결합될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명은 EphA4 발현 세포에 대한 효과기 기능을 가지는 항체를 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 EphA4, 면역학적 활성 EphA4 단편, 이들을 발현하는 DNA 또는 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 췌장암 등의 EphA4 발현 세포를 손상시키는 효과기 기능을 가지는 항체를 유도한다. 그 결과, 췌장암 및 기타 등에 대한 치료적 효과가 획득될 수 있다.
매일, 0.1 mg 내지 250 mg/㎏의 본 발명의 면역성 조성물이 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 피하 주사 및 정맥 주사를 포함한다. 1인 성인에 대한 투여량은 일반적으로 5 mg 내지 17.5 g/day, 바람직하게 5 mg 내지 10 g/day, 및 더욱 바람직하게 100 mg 내지 3 g/day이다.
또한, 본 발명은 개체 내 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에 있어서, 약학적으로 유효한 양의 항 EphA4 항체, 또는 이의 면역학적 활성 단편을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 항체는 항체 효과기 기능을 가진다.
본 발명에서 인용된 모든 참고문헌은 이들 전체가 본 발명의 참고문헌으로 통합된다.
도 1은 췌장암 세포주에서 EphA4 유전자에 대한 준정량적(Semiquantitative) RT-PCR 분석의 결과를 나타내는 그림이다.
도 2는 EphA4 과발현 및 저발현 췌장암 세포주인 MIAPaca-2 및 PK-45P에 대하여 허셉틴(Herceptin), 및 항 EphA4 인간 항체 65 및 336를 이용한 ADCC 분석의 결과를 나타내는 그림이다.
이하, 본 발명은 실시예에 관련하여 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예에 기재된 시료, 방법 및 기타 등은 본 발명의 측면을 예시할 뿐이고, 결코 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도하는 것은 아니다. 그러한 것으로서, 본 발명에 기재된 시료, 방법 및 기타 등과 유사하거나 동등한 것은 본 발명의 시행 또는 테스트하는데 이용될 수 있다.
세포주:
본 발명자들은 인간 대장암 또는 췌장암 세포주를 10% 우태혈청(fetal bovine serum; FBS)을 포함한 적절한 배지에서 단일층으로 증식시켰다. 실험예 사용된 세포주는 표 1에서 보여준다.
췌장암 세포주
세포주 배지 획득된 장소
PK-45P RPMI+10% FBS TKG*1; TKG 0493
PK-59 RPMI+10% FBS TKG*1; TKG 0492
KLM-1 RPMI+10% FBS TKG*1; TKG 0490
Capan-1 RPMI+10% FBS ATCC; HTB-79
Capan-2 McCoy*3+10% FBS ATCC; HTB-80
Miapaca-2 E-MEM*2 +10% FBS HSRRB; JCRB0070
PK-1 RPMI+10% FBS TKG*1; TKG 0239
PK-9 RPMI+10% FBS TKG*1; TKG 0240
*1 토호쿠 대학, 노화와 종양, 개발연구원
*2 Eagle's MEM(Minimal Essential medium)
*3 변형된 McCoy's 5A 배지
또한, 다음의 세포주는 항 EphA4 항체를 이용한 ADCC 분석에 이용하였다: 췌장암종: MIAPaca-2.
인간 항체:
배양 세포을 이용한 파지 발현 라이브러리의 스크리닝
본 발명자들은 EphA4에 대한 인간 scFV 항체를 스크리닝하기 위해, 인간 scFV 항체를 코딩하는 파지 라이브러리 AIMS4(WO01/62907)이 이용하였다. 상기 스크리닝 방법은 P2005-185281A에 기재되어 있다.
첫 번째 스크리닝을 위해, 우선 EphA4를 고발현하는 MIAPaca-2 세포를 15 ㎝ 디쉬에서 배양하고, 2 ㎎/㎖ 콜라게나제 I(Gibco BRL)/세포 해리 완충용액(Gibco BRL)으로 채취한 후, 냉각된 PBS로 세척하였다. 인간 항체 파지 라이브러리의 용액(2 x 1013 cfu)을 4 × 107의 세포, BSA 및 NaN3/MEM와 혼합하였다. 최종 농도가 1.6 ㎖의 총 농도에서 1% BSA-0.1% NaN3/MEM로 조절하였고, 상기 혼합물을 4℃에서 4시간 동안 천천히 흔들었다. 그런 다음, 반응 용액의 절반을 2개의 튜브에 각각 분배한 후, 2분 동안 유기용제[디부틸 프탈레이트(dibutyl phtalate):사이클로헥산(cyclohexane) = 9:1)에서 3000 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 제거한 후, 세포를 0.7 ㎖의 1% BSA/MEM에 재현탁한 다음, 동등한 부피의 낮은 극성 용매에서 원심분리하였다. 상기 단계를 두 번 반복하였다. 상청액을 제거한 후, 세포를 0.3 ㎖ PBS에 재현탁하였고, 액체질소로 얼린 다음, 37℃에서 용해시켰다.
상기 파지로 1시간 동안 20 ㎖의 E.coli DH12S(OD 0.5)를 감염시킨 후, 상기 감염된 세포를 600 ㎖의 2 × YTGA 배지(2 × YT, 200 ㎍/㎖ 앰피실린 황산염, 1% 글루코즈)로 이동시킨 다음, 30℃에서 밤새 배양하였다. 10 ㎖의 상기 배양물에 200 ㎖의 2 × YTA 배지(2 × YT, 200 ㎍/㎖ 앰피실린 황산염)를 첨가한 후, 다시 37℃에서 1.5시간 동안 배양하였다. 추가적인 배양 후, 1 × 1011의 헬퍼 파지 KO7을 첨가한 다음, 37℃에서 다시 배양하였다. 상기와 같이 1시간 배양 후, 800 ㎖의 2 × YTGAK(2 × YT, 200 ㎍/㎖ 앰피실린 황산염, 0.05% 글루코즈, 50 ㎍/㎖ 카나마이신)를 첨가한 다음, 30℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양물을 10분 동안 8000 rpm에서 원심분리하였다. 상청액에 200 ㎖의 PEG 액체(20% 폴리에틸렌글리콜 6000, 2.5 M NaCl)을 첨가한 후, 파지를 작은 알로 만들기 위해 10분 동안 8000 rpm에서 원심분리하였다. 상기 작은 알을 10 ㎖의 PBS로 현탁한 후, 일부 현탁액을 파지에 의해 감염된 E.coli의 수를 검사하기 위해 이용하였다.
두 번째 스크리닝을 위해, 0.8 ㎖의 반응용액(1% BSA-0.1% NaN3/MEM), 배양세포(2 × 107) 및 첫 번째 스크링된 파지(1 × 1010)를 이용하였다. 반응용액의 총 부피는 첫 번째 스크리닝에 이용된 부피의 절반이었다. 세 번째 스크리닝은 EphA4로 감염된 2 × 107의 293T 세포, 및 1 × 109의 두 번째 스크리닝 파지를 이용하는 것을 제외하고 두 번째 스크리닝의 절차와 유사하게 하였다.
DNA 서열화, 발현 확인, 및 항체 클론의 세포 ELISA
본 발명자들은 상기 기재된 바와 같이 스크리닝 및 희석된 E.coli를 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 포함하는 영양 아가에 배양하였다. 획득된 콜로니를 분리한 후, 2 × YTGA 배지로 30℃에서 밤새 배양하였다. DNA를 PI-50(Kurabo)에 의한 배양물로부터 획득한 후, 상기 DNA 서열을 디디옥시(dideoxy) 방법에 의해 결정하였다.
게다가, 0.05 ㎖의 배양물을 30℃에서 1.2 ㎖의 2 × YTAI(2 × YT, 200 ㎍/㎖ 앰피실린 황산염, 0.5 mM IPTG)로 배양한 다음, 5분 동안 15000 rpm에서 원심분리함으로써 상청액을 채취하였다.
항체의 발현을 cp3 융합 단백질로 검출하였다. 보다 상세하게, 상기 상청액을 37℃에서 2시간 동안 MaxisorpTM(NUNC)와 반응시킨 후, 반응된 용액을 빨아내었다. 항체를 포함하는 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 5% BSA로 블라킹시킨 후, 블라킹 용액을 제거하였다. 0.05% Tween/PBS로 1:2000으로 희석된 토끼 항-cp3 항체(MBL)를 상기 플레이트에 첨가한 후, 1시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, PBS로 세척하였다. 0.05% Tween/PBS로 1:2000으로 희석된, HRP로 태그된 염소 항-토끼 IgG 항체(MBL)를 상기 플레이트에 첨가한 후, 1시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, PBS로 세척하였다. 100 ㎕의 OPD 용액을 상기 플레이트에 첨가한 후, 15분 동안 실온에서 반응시킨 다음, 2M 황산 암모늄을 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다. SPECTRAmax 340PC(Molecular Devices)에 의해 492 nm에서 흡광도를 측정함으로써 상기 융합 단백질을 검출하였다.
세포 ELISA 실시는 다음과 같다. 우선, 1 × 105의 세포를 96 웰 플레이트에서 밤새 배양한 후, 상기 배지를 200 ㎕의 5% 탈지분유/PBS으로 대체하였다. 얼음에서 3시간 동안 방치한 후, 100 ㎕의 상청액 및 100 ㎕의 10% 탈지분유를 혼합한 다음, 밤새 얼음에 방치하였다. 얼음에 보관한 PBS로 5번 세척한 후, 상기 세포를 4℃에서 2시간 동안 100 ㎕의 5 ㎍/㎕ 마우스 항-cp3 단일클론 항체, 5% 탈지분유/PBS로 반응시켰다. 얼음에 보관한 PBS로 5번 세척한 후, 25 ㎕의 퍼록시다제로 태그된 ENVISION + 중합체 시약 및 75 ㎕의 l5% 탈지분유/PBS로 구성된 용액을 4℃에서 2시간 동안 상기 세포에 반응시켰다. 얼음에 보관한 PBS로 5번 세척한 후, 2M 황산 암모늄을 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다. 상기 반응 혼합물의 흡광도를 SPECTRAmax 340PC(Molecular Devices)에 의해 492 nm에서 측정하였다.
유세포 분석에 의해 확인한 바와 같이, 항원에 대해 명백히 반응하는 인간 scFV 항체들은 IFA에서 완전한 IgG 형태로 전환시켰다.
이런 2개의 클론은 다음의 아미노산 서열을 가졌다.
65: 서열번호: 9(VH) 및 서열번호: 14(VL)
336: 서열번호: 19(VH) 및 서열번호: 23(VL)
이런 인간 scFV 항체들을 IFA에서 완전한 IgG 형태로 전환시켰다. 다음의 아미노산 서열들은 보존 부위(constant region)의 중쇄(CH) 및 경쇄(CL)로 이용하였다.
CH (CH1, CH2, and CH3): ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAPHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호: 13)
CL: QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(서열번호: 18)
EphA4 에 대한 준정량적 RT - PCR :
총 RNA를 Rneasy®키트 (QIAGEN)를 이용하여 세포주로부터 추출하였다. 게다가, mRNA를 올리고(dT)-셀룰로즈 컬럼(Amersham Biosciences)에 의해 총 RNA로부터 정제한 후, SuperScript First-Strand Synthesis System(Invitrogen)을 이용한 역전사(RT)에 의해 첫 번째 가닥 cDNA로 합성하였다. 정량적 대조군으로서 GAPDH 및 β-액틴에 의해 연속적인 PCR 증폭을 위한 각 첫 번째 가닥 cDNA의 적절한 희석물을 제조하였다. 이용한 프라이머 서열은 다음과 같다:
EphA4 용으로 5'-GAAGGCGTGGTCACTAAATGTAA-3'(서열번호: 3) 및
5'-TTTAATTTCAGAGGGCGAAGAC-3'(서열번호: 4),
GAPDH 용으로 5'-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3'(서열번호: 5) 및
5'-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3'(서열번호: 6),
β-액틴 용으로 5'-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3'(서열번호: 7) 및
5'-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3'(서열번호: 8).
모든 PCR 반응은 GeneAmp PCR system 9700(PE Applied Biosystems)에서 94℃에서 2분 동안 초기 변성시킨 후, 94℃에서 30초 동안, 58℃에서 30초 동안, 및 72℃에서 1분 동안으로 구성된 조건을 GAPDH를 위해 21 사이클(cycle), β-액틴을 위해 20 사이클 또는 EphA4를 위해 28 내지 32 사이클을 수행하였다.
EphA4의 과발현은 체장암 세포주 Miapaca-2에서 발견되었다(도 1). 추가적으로, 다양한 암에 대한 항 EphA4 항체의 효능을 밝히기 위해, EphA4의 발현을 확인하였다.
유세포 분석( Flow cytometry analysis ):
암세포(5 × 106)를 정제된 다클론 항체(pAb), 단일클론 항체(mAb), 토끼 IgG(pAb에 대한 대조군) 또는 마우스 IgG(mAb에 대한 대조군)으로 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 인산 완충용액(PBS)으로 세척한 다음, FITC-labeled Alexa Fluor 488에서 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 상기 세포를 PBS로 다시 세척한 후, 유세포 분석기(FACSCalibur® Becton Dickinson)로 분석한 다음, BD CellQuestTMPro 소프트웨어(Becton Dickinson)에 의해 분석하였다. 평균 형광강도(Mean fluorescence intensity; MFI)는 유세포 분석의 비율로써 정의하였다(각 단백질 특이적 항체에 의한 강도/토끼 IgG에 의한 강도).
EphA4 과발현 세포를 이용하여, 세포 표면에 대한 항 EphA4의 결합 비율을 조사하였다. 그 결과, MIAPaca-2 세포에 결합된 항 EphA4 인간 항체 65 및 336의 비율(MFI: 각각 12.64 및 15.54) 이 인간 IgG(대조군)의 비율보다 더 높았다.
ADCC 분석:
표적 세포를 37℃에서 30분 동안 0.8 uM의 칼세인 아세톡시메틸 에스테르(calcein acetoxymethyl ester)(칼세인-AM, DOJINDO)에 노출시켰다. 칼세인-AM은 형광성 유도체 칼세인을 생산하는 세포성 에스테라아제에 의해 칼세인-AM의 분열 후, 형광을 띄게 된다. 표적 암세포를 분석 전에 2번 세척한 후, 상기 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트에 평판 배양시켰다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PMBC)를 건강한 사람으로부터 채취한 후, Ficoll-Paque(Amersham Biosciences) 농도 구배 원심분리를 이용하여 분리한 다음, 효과기 세포로 이용하였다. 표적 암세포(T) 및 효과기 세포(E)를 다양한 농도(0, 0.01, 0.1, 1, 10, 100 mg/well)에서 항 EphA4 인간 항체, 또는 대조군 항체인 허셉틴(Roche)과 함께 E:T = 100:1의 비율로 96-웰 플레이트 내 250 ㎕의 AIM-V에서 공동 배양하였다. 이런 배양을 37℃에서 6시간 동안 250 ㎖의 AIM-V 배지(Life Technologies, Inc)에서 3번 수행하였다. 대조군 분석은 항 EphA4 인간 항체만을 포함하는 표적 세포 또는 효과기 세포의 배양을 포함시켰다. 일부 실시예에서 허섭틴을 대조군으로 이용하였다.
시각화할 수 있는 세포의 형광 이미지를 기초로 평가되는, 상기 세포들에 대한 항 EphA4 인간 항체(65 및 336)의 ADCC 효과를 IN Cell Analyzer 1000(Amersham Bioscience)를 이용하여 빠르게 획득하였다. 상기 이미지는 eveloper tool ver.5.21 소프트웨어(Amersham Bioscience)를 이용하여 형광 물체 또는 소낭을 계산함으로써 시각화할 수 있는 세포의 수(표적 세포에 대한 세포 범위)를 수치로 변환하였다.
일부 실시예에서 허섭틴을 대조군으로 이용하였다. 65 및 336 항 EphA4 인간 항체 자체에 의한 MIAPaca-2 세포의 직접적인 세포 손상은 관찰되지 않는다. 그러나, 65 및 336 항 EphA4 인간 항체는 EphA4가 과발현되는 MIAPaca-2 세포에서 ADCC를 유도한 반면에(도 2), EphA4가 저발현되는 PK-45P 세포에 대해서는 어떠한 효과도 나타내지 않았다(도 2).
본 발명은 EphA4 발현 세포가 항체 세포독성에 의해 손상될 수 있다는 것의 발견, 또는 적어도 이의 일부를 근거로 한다. EphA4는 췌장암에서 유전자가 강하게 발현되는 것을 본 발명자들에 의해 확인되었다. 따라서, 예를 들어 췌장암 등의 EphA4 발현 세포와 관련된 질병의 치료는 EphA4에 결합하는 항체를 이용하여 편리하게 수행된다. 본 발명자들에 의해 실제로 확인된 결과는 EphA4의 존재 하에서, 췌장암 세포주에서 ADCC의 효과에 의한 세포독성을 보여준다.
본 발명은 상세하고 관련된 특정 실시예로 기재하고 있는 동시에, 본 발명의 사상과 범위로부터 벗어남 없이 만들어진 다양한 변화 및 변형은 당업자에게 자명할 것이며, 본 발명의 범위 및 영역은 청구항에 의해 제시한다.
<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> METHODS FOR DAMAGING CELLS USING EFFECTOR FUNCTIONS OF ANTI-EphA4 ANTIBODIES <130> 8fpi-08-06 <150> US 60/777,794 <151> 2006-02-28 <150> PCT/JP2007/053858 <151> 2007-02-22 <160> 30 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6364 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (43)..(3000) <400> 1 ctgggataga agcggcagga gcagcgttgg caccggcgaa cc atg gct ggg 51 Met Ala Gly 1 att ttc tat ttc gcc cta ttt tcg tgt ctc ttc ggg att tgc gac gct 99 Ile Phe Tyr Phe Ala Leu Phe Ser Cys Leu Phe Gly Ile Cys Asp Ala 5 10 15 gtc aca ggt tcc agg gta tac ccc gcg aat gaa gtt acc tta ttg gat 147 Val Thr Gly Ser Arg Val Tyr Pro Ala Asn Glu Val Thr Leu Leu Asp 20 25 30 35 tcc aga tct gtt cag gga gaa ctt ggg tgg ata gca agc cct ctg gaa 195 Ser Arg Ser Val Gln Gly Glu Leu Gly Trp Ile Ala Ser Pro Leu Glu 40 45 50 gga ggg tgg gag gaa gtg agt atc atg gat gaa aaa aat aca cca atc 243 Gly Gly Trp Glu Glu Val Ser Ile Met Asp Glu Lys Asn Thr Pro Ile 55 60 65 cga acc tac caa gtg tgc aat gtg atg gaa ccc agc cag aat aac tgg 291 Arg Thr Tyr Gln Val Cys Asn Val Met Glu Pro Ser Gln Asn Asn Trp 70 75 80 cta cga act gat tgg atc acc cga gaa ggg gct cag agg gtg tat att 339 Leu Arg Thr Asp Trp Ile Thr Arg Glu Gly Ala Gln Arg Val Tyr Ile 85 90 95 gag att aaa ttc acc ttg agg gac tgc aat agt ctt ccg ggc gtc atg 387 Glu Ile Lys Phe Thr Leu Arg Asp Cys Asn Ser Leu Pro Gly Val Met 100 105 110 115 ggg act tgc aag gag acg ttt aac ctg tac tac tat gaa tca gac aac 435 Gly Thr Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Tyr Glu Ser Asp Asn 120 125 130 gac aaa gag cgt ttc atc aga gag aac cag ttt gtc aaa att gac acc 483 Asp Lys Glu Arg Phe Ile Arg Glu Asn Gln Phe Val Lys Ile Asp Thr 135 140 145 att gct gct gat gag agc ttc acc caa gtg gac att ggt gac aga atc 531 Ile Ala Ala Asp Glu Ser Phe Thr Gln Val Asp Ile Gly Asp Arg Ile 150 155 160 atg aag ctg aac acc gag atc cgg gat gta ggg cca tta agc aaa aag 579 Met Lys Leu Asn Thr Glu Ile Arg Asp Val Gly Pro Leu Ser Lys Lys 165 170 175 ggg ttt tac ctg gct ttt cag gat gtg ggg gcc tgc atc gcc ctg gta 627 Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp Val Gly Ala Cys Ile Ala Leu Val 180 185 190 195 tca gtc cgt gtg ttc tat aaa aag tgt cca ctc aca gtc cgc aat ctg 675 Ser Val Arg Val Phe Tyr Lys Lys Cys Pro Leu Thr Val Arg Asn Leu 200 205 210 gcc cag ttt cct gac acc atc aca ggg gct gat acg tct tcc ctg gtg 723 Ala Gln Phe Pro Asp Thr Ile Thr Gly Ala Asp Thr Ser Ser Leu Val 215 220 225 gaa gtt cga ggc tcc tgt gtc aac aac tca gaa gag aaa gat gtg cca 771 Glu Val Arg Gly Ser Cys Val Asn Asn Ser Glu Glu Lys Asp Val Pro 230 235 240 aaa atg tac tgt ggg gca gat ggt gaa tgg ctg gta ccc att ggc aac 819 Lys Met Tyr Cys Gly Ala Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro Ile Gly Asn 245 250 255 tgc cta tgc aac gct ggg cat gag gag cgg agc gga gaa tgc caa gct 867 Cys Leu Cys Asn Ala Gly His Glu Glu Arg Ser Gly Glu Cys Gln Ala 260 265 270 275 tgc aaa att gga tat tac aag gct ctc tcc acg gat gcc acc tgt gcc 915 Cys Lys Ile Gly Tyr Tyr Lys Ala Leu Ser Thr Asp Ala Thr Cys Ala 280 285 290 aag tgc cca ccc cac agc tac tct gtc tgg gaa gga gcc acc tcg tgc 963 Lys Cys Pro Pro His Ser Tyr Ser Val Trp Glu Gly Ala Thr Ser Cys 295 300 305 acc tgt gac cga ggc ttt ttc aga gct gac aac gat gct gcc tct atg 1011 Thr Cys Asp Arg Gly Phe Phe Arg Ala Asp Asn Asp Ala Ala Ser Met 310 315 320 ccc tgc acc cgt cca cca tct gct ccc ctg aac ttg att tca aat gtc 1059 Pro Cys Thr Arg Pro Pro Ser Ala Pro Leu Asn Leu Ile Ser Asn Val 325 330 335 aac gag aca tct gtg aac ttg gaa tgg agt agc cct cag aat aca ggt 1107 Asn Glu Thr Ser Val Asn Leu Glu Trp Ser Ser Pro Gln Asn Thr Gly 340 345 350 355 ggc cgc cag gac att tcc tat aat gtg gta tgc aag aaa tgt gga gct 1155 Gly Arg Gln Asp Ile Ser Tyr Asn Val Val Cys Lys Lys Cys Gly Ala 360 365 370 ggt gac ccc agc aag tgc cga ccc tgt gga agt ggg gtc cac tac acc 1203 Gly Asp Pro Ser Lys Cys Arg Pro Cys Gly Ser Gly Val His Tyr Thr 375 380 385 cca cag cag aat ggc ttg aag acc acc aaa gtc tcc atc act gac ctc 1251 Pro Gln Gln Asn Gly Leu Lys Thr Thr Lys Val Ser Ile Thr Asp Leu 390 395 400 cta gct cat acc aat tac acc ttt gaa atc tgg gct gtg aat gga gtg 1299 Leu Ala His Thr Asn Tyr Thr Phe Glu Ile Trp Ala Val Asn Gly Val 405 410 415 tcc aaa tat aac cct aac cca gac caa tca gtt tct gtc act gtg acc 1347 Ser Lys Tyr Asn Pro Asn Pro Asp Gln Ser Val Ser Val Thr Val Thr 420 425 430 435 acc aac caa gca gca cca tca tcc att gct ttg gtc cag gct aaa gaa 1395 Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Ser Ile Ala Leu Val Gln Ala Lys Glu 440 445 450 gtc aca aga tac agt gtg gca ctg gct tgg ctg gaa cca gat cgg ccc 1443 Val Thr Arg Tyr Ser Val Ala Leu Ala Trp Leu Glu Pro Asp Arg Pro 455 460 465 aat ggg gta atc ctg gaa tat gaa gtc aag tat tat gag aag gat cag 1491 Asn Gly Val Ile Leu Glu Tyr Glu Val Lys Tyr Tyr Glu Lys Asp Gln 470 475 480 aat gag cga agc tat cgt ata gtt cgg aca gct gcc agg aac aca gat 1539 Asn Glu Arg Ser Tyr Arg Ile Val Arg Thr Ala Ala Arg Asn Thr Asp 485 490 495 atc aaa ggc ctg aac cct ctc act tcc tat gtt ttc cac gtg cga gcc 1587 Ile Lys Gly Leu Asn Pro Leu Thr Ser Tyr Val Phe His Val Arg Ala 500 505 510 515 agg aca gca gct ggc tat gga gac ttc agt gag ccc ttg gag gtt aca 1635 Arg Thr Ala Ala Gly Tyr Gly Asp Phe Ser Glu Pro Leu Glu Val Thr 520 525 530 acc aac aca gtg cct tcc cgg atc att gga gat ggg gct aac tcc aca 1683 Thr Asn Thr Val Pro Ser Arg Ile Ile Gly Asp Gly Ala Asn Ser Thr 535 540 545 gtc ctt ctg gtc tct gtc tcg ggc agt gtg gtg ctg gtg gta att ctc 1731 Val Leu Leu Val Ser Val Ser Gly Ser Val Val Leu Val Val Ile Leu 550 555 560 att gca gct ttt gtc atc agc cgg aga cgg agt aaa tac agt aaa gcc 1779 Ile Ala Ala Phe Val Ile Ser Arg Arg Arg Ser Lys Tyr Ser Lys Ala 565 570 575 aaa caa gaa gcg gat gaa gag aaa cat ttg aat caa ggt gta aga aca 1827 Lys Gln Glu Ala Asp Glu Glu Lys His Leu Asn Gln Gly Val Arg Thr 580 585 590 595 tat gtg gac ccc ttt acg tac gaa gat ccc aac caa gca gtg cga gag 1875 Tyr Val Asp Pro Phe Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Gln Ala Val Arg Glu 600 605 610 ttt gcc aaa gaa att gac gca tcc tgc att aag att gaa aaa gtt ata 1923 Phe Ala Lys Glu Ile Asp Ala Ser Cys Ile Lys Ile Glu Lys Val Ile 615 620 625 gga gtt ggt gaa ttt ggt gag gta tgc agt ggg cgt ctc aaa gtg cct 1971 Gly Val Gly Glu Phe Gly Glu Val Cys Ser Gly Arg Leu Lys Val Pro 630 635 640 ggc aag aga gag atc tgt gtg gct atc aag act ctg aaa gct ggt tat 2019 Gly Lys Arg Glu Ile Cys Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Ala Gly Tyr 645 650 655 aca gac aaa cag agg aga gac ttc ctg agt gag gcc agc atc atg gga 2067 Thr Asp Lys Gln Arg Arg Asp Phe Leu Ser Glu Ala Ser Ile Met Gly 660 665 670 675 cag ttt gac cat ccg aac atc att cac ttg gaa ggc gtg gtc act aaa 2115 Gln Phe Asp His Pro Asn Ile Ile His Leu Glu Gly Val Val Thr Lys 680 685 690 tgt aaa cca gta atg atc ata aca gag tac atg gag aat ggc tcc ttg 2163 Cys Lys Pro Val Met Ile Ile Thr Glu Tyr Met Glu Asn Gly Ser Leu 695 700 705 gat gca ttc ctc agg aaa aat gat ggc aga ttt aca gtc att cag ctg 2211 Asp Ala Phe Leu Arg Lys Asn Asp Gly Arg Phe Thr Val Ile Gln Leu 710 715 720 gtg ggc atg ctt cgt ggc att ggg tct ggg atg aag tat tta tct gat 2259 Val Gly Met Leu Arg Gly Ile Gly Ser Gly Met Lys Tyr Leu Ser Asp 725 730 735 atg agc tat gtg cat cgt gat ctg gcc gca cgg aac atc ctg gtg aac 2307 Met Ser Tyr Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Asn 740 745 750 755 agc aac ttg gtc tgc aaa gtg tct gat ttt ggc atg tcc cga gtg ctt 2355 Ser Asn Leu Val Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Met Ser Arg Val Leu 760 765 770 gag gat gat ccg gaa gca gct tac acc acc agg ggt ggc aag att cct 2403 Glu Asp Asp Pro Glu Ala Ala Tyr Thr Thr Arg Gly Gly Lys Ile Pro 775 780 785 atc cgg tgg act gcg cca gaa gca att gcc tat cgt aaa ttc aca tca 2451 Ile Arg Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ile Ala Tyr Arg Lys Phe Thr Ser 790 795 800 gca agt gat gta tgg agc tat gga atc gtt atg tgg gaa gtg atg tcg 2499 Ala Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Val Met Trp Glu Val Met Ser 805 810 815 tac ggg gag agg ccc tat tgg gat atg tcc aat caa gat gtg att aaa 2547 Tyr Gly Glu Arg Pro Tyr Trp Asp Met Ser Asn Gln Asp Val Ile Lys 820 825 830 835 gcc att gag gaa ggc tat cgg tta ccc cct cca atg gac tgc ccc att 2595 Ala Ile Glu Glu Gly Tyr Arg Leu Pro Pro Pro Met Asp Cys Pro Ile 840 845 850 gcg ctc cac cag ctg atg cta gac tgc tgg cag aag gag agg agc gac 2643 Ala Leu His Gln Leu Met Leu Asp Cys Trp Gln Lys Glu Arg Ser Asp 855 860 865 agg cct aaa ttt ggg cag att gtc aac atg ttg gac aaa ctc atc cgc 2691 Arg Pro Lys Phe Gly Gln Ile Val Asn Met Leu Asp Lys Leu Ile Arg 870 875 880 aac ccc aac agc ttg aag agg aca ggg acg gag agc tcc aga cct aac 2739 Asn Pro Asn Ser Leu Lys Arg Thr Gly Thr Glu Ser Ser Arg Pro Asn 885 890 895 act gcc ttg ttg gat cca agc tcc cct gaa ttc tct gct gtg gta tca 2787 Thr Ala Leu Leu Asp Pro Ser Ser Pro Glu Phe Ser Ala Val Val Ser 900 905 910 915 gtg ggc gat tgg ctc cag gcc att aaa atg gac cgg tat aag gat aac 2835 Val Gly Asp Trp Leu Gln Ala Ile Lys Met Asp Arg Tyr Lys Asp Asn 920 925 930 ttc aca gct gct ggt tat acc aca cta gag gct gtg gtg cac gtg aac 2883 Phe Thr Ala Ala Gly Tyr Thr Thr Leu Glu Ala Val Val His Val Asn 935 940 945 cag gag gac ctg gca aga att ggt atc aca gcc atc acg cac cag aat 2931 Gln Glu Asp Leu Ala Arg Ile Gly Ile Thr Ala Ile Thr His Gln Asn 950 955 960 aag att ttg agc agt gtc cag gca atg cga acc caa atg cag cag atg 2979 Lys Ile Leu Ser Ser Val Gln Ala Met Arg Thr Gln Met Gln Gln Met 965 970 975 cac ggc aga atg gtt ccc gtc tgagccagta ctgaataaac tcaaaactct 3030 His Gly Arg Met Val Pro Val 980 985 tgaaattagt ttacctcatc catgcacttt aattgaagaa ctgcactttt tttacttcgt 3090 cttcgccctc tgaaattaaa gaaatgaaaa aaaaaaacaa tatctgcagc gttgcttggt 3150 gcacagattg ctgaaactgt ggggcttaca gaaatgactg ccggtcattt gaatgagacc 3210 tggaacaaat cgtttctcag aagtactttt ctgttcatca ccagtctgta aaatacatgt 3270 acctatagaa atagaacact gcctctgagt tttgatgctg tatttgctgc cagacactga 3330 gcttctgaga catccctgat tctctctcca tttggaatta caaccattgt attttgtttg 3390 tggcataaat tacagtcatc tgtctttcac tggaatgaag accatgccta ggaacatttt 3450 ttaaggactc agctgtggct tttagggctt ggttcatacc atgggggaaa aaaaagtcct 3510 aggagaaagc gacgtggctc attagtgttg cctcttcagt gctcaagccg cctggtggat 3570 tcctatgaca cagggggcct ggaaagaaag ggaaagtgga tttaaaatat atatatacgt 3630 aacccaagcc ccataacccc taactggaca aatgaggtct gtttctttgg gcctgaggct 3690 gtgccatata aagtcttatt ttgggacttt acaaacttgt cctaactatc ttgtggatag 3750 tgggctgtga caatctggaa tagagaacgt tcacacttcg ctcctttaaa gaagcgaccc 3810 cagatctgca agggagtaga ttctgctatc ttggcctcac agcccttcct gttgattaca 3870 aagcccgtgg aagaaaacag aacacaccct cctcagttcc gtctaaatgt gtttcttctg 3930 cttcaattac accagttctg gggcaaagac actgatgaaa caacacccat acctgaaaag 3990 aataaatgtg tgactttcaa atcccctttc gcagtgaaag aaacagcaaa cacttaagat 4050 tcagcatctg ttctccagtt gcactgagga atgcactgtc tcgcagcacc agctctgcag 4110 agcccttgcc ccagactctt tgcggtttta tttatatgta tttccatatt tcattcctgt 4170 gtgtcactgc tgcattggtg tggcagcaag tgaccaaatg ctacaggtct tactatggac 4230 accaggtcag gtgcaaccac acaaaacaaa gccagttcca tgagctgcct atgatatgca 4290 ttgcggaagt aacattttac ccagggtgtg ccattgcagt gatataaata tatttttttc 4350 ttagactaaa tatgagctga ctatctcttt tgatgtgtgt acataggtgt gagtgtgtgt 4410 gtatgcgtgc ctgtctgtgt gcgggtgtgt gtatgtgcat agcctcatgc ttaggactac 4470 ccatgaatgt tgtggaatgc tacacctgga gagttctggt tttccaccag tttcaagatg 4530 aagaactaca tgatacagtg gacctggaga ccatcccctt ggaaagacaa cccagagatg 4590 ttcagcatcc tgtatctaca cgcatcctgt atctacacgt gtattttgta gctgtcacac 4650 taaccttaat aagaattcta cagctttgga cagaggcatt ttcaccttaa tggtgaagta 4710 atttaaaata taaatccatt caggtgacaa cccatcatca aaattacaaa ttttctgatt 4770 gaactcatct gaatcatcag ttccttgatg gagagagaga aggagatgga atgtgtctgg 4830 taaccccaaa tggagtacaa gtagcctttg ttttcctgca taaatggact tgttgaatgc 4890 gaacgaatat atgcaattca tatacttttg gagatgaacg tagatatgtg tgtcagcttt 4950 gagatggtgt gtcctggatt aatactttgt ctcccaatat cacagaaaaa tacatgccag 5010 tgactcttga ggttaaggta gttgggatga aatggcctca ggcaatttca cattccctaa 5070 ttacctggaa agttctacag taattaatat gcagctaact cctgttgccc tcacaagagc 5130 atcagccttc tagaatcgga gctccggagt gtgaagattc agtattgata tgatatgtat 5190 accaaactcc agccaactta ctgccatttt tcataatctg agtggctgcc ttgcttatcc 5250 taagctgtgg ttgcagaaac cgtggccatt tatataagct ataacatcaa atcagggaaa 5310 aatgaggaaa aaaaatagat tctgaaccat ttattgttga ataagtagag aaaatcatca 5370 ataaatattt attacattct gacagggtgt gtggcattgt gttctatgcc agagtgacaa 5430 agttgattca cccctttttg gggaccttaa tatatttttt aagggatgtg cctatgcatt 5490 gatgcctgaa aaatatgtat aaagaaatga ggttgactct tctgagcagt tcatcttttc 5550 cagaggtaag ggtaggaggc caacttcagg gtctgggtct gagcccgtgg gcaagccctg 5610 gccgagtgag ctccaatgct aactcatgtg ccgatctcta gagcagtggg aaactacccc 5670 gctgcaccaa atcaagtagc ttcaccttgt gtatgcaggc cccaagttat tttttagcaa 5730 tcttacgagt gaaatgttct ggtgggttga aaaacgttct tattttaaag aaaggttgtg 5790 ctcgctacac tgctggtgtg tgcattctga gacctcttgt attcaatctg tgaaggatat 5850 gtgtattaat ccgtacaccc gtatagcctc aatatttgtc tgaagacact taaattctga 5910 cccataaagg aaagttctag aagcaatatt ttcacttatt taacattctc caaacaacat 5970 caagcattga tacacactga agagtgcgtt tattttttgt atcactctaa gtatgttgga 6030 atatgcaagg actgtggttc aaattagaat gtataaggca tattataatt tagttcatac 6090 tgaataagaa attaacagaa cattgttcgg ttcacacgtt ccaaactttg agtgatttct 6150 ggagttagac atagattttc tattttgttt taatttgtca aggtattttt cttcccttca 6210 tgaactttag gtacacataa cttatgtcat ttatttatgg tcttttatac ctagtttgta 6270 aaattgtaaa atagcaaact aaatgcaaag agtttgcatt tgaaaataat aaagtagttg 6330 ccgtatacaa ccctgcaaaa aaaaaaaaaa aaaa 6364 <210> 2 <211> 986 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Gly Ile Phe Tyr Phe Ala Leu Phe Ser Cys Leu Phe Gly Ile 1 5 10 15 Cys Asp Ala Val Thr Gly Ser Arg Val Tyr Pro Ala Asn Glu Val Thr 20 25 30 Leu Leu Asp Ser Arg Ser Val Gln Gly Glu Leu Gly Trp Ile Ala Ser 35 40 45 Pro Leu Glu Gly Gly Trp Glu Glu Val Ser Ile Met Asp Glu Lys Asn 50 55 60 Thr Pro Ile Arg Thr Tyr Gln Val Cys Asn Val Met Glu Pro Ser Gln 65 70 75 80 Asn Asn Trp Leu Arg Thr Asp Trp Ile Thr Arg Glu Gly Ala Gln Arg 85 90 95 Val Tyr Ile Glu Ile Lys Phe Thr Leu Arg Asp Cys Asn Ser Leu Pro 100 105 110 Gly Val Met Gly Thr Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Tyr Glu 115 120 125 Ser Asp Asn Asp Lys Glu Arg Phe Ile Arg Glu Asn Gln Phe Val Lys 130 135 140 Ile Asp Thr Ile Ala Ala Asp Glu Ser Phe Thr Gln Val Asp Ile Gly 145 150 155 160 Asp Arg Ile Met Lys Leu Asn Thr Glu Ile Arg Asp Val Gly Pro Leu 165 170 175 Ser Lys Lys Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp Val Gly Ala Cys Ile 180 185 190 Ala Leu Val Ser Val Arg Val Phe Tyr Lys Lys Cys Pro Leu Thr Val 195 200 205 Arg Asn Leu Ala Gln Phe Pro Asp Thr Ile Thr Gly Ala Asp Thr Ser 210 215 220 Ser Leu Val Glu Val Arg Gly Ser Cys Val Asn Asn Ser Glu Glu Lys 225 230 235 240 Asp Val Pro Lys Met Tyr Cys Gly Ala Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro 245 250 255 Ile Gly Asn Cys Leu Cys Asn Ala Gly His Glu Glu Arg Ser Gly Glu 260 265 270 Cys Gln Ala Cys Lys Ile Gly Tyr Tyr Lys Ala Leu Ser Thr Asp Ala 275 280 285 Thr Cys Ala Lys Cys Pro Pro His Ser Tyr Ser Val Trp Glu Gly Ala 290 295 300 Thr Ser Cys Thr Cys Asp Arg Gly Phe Phe Arg Ala Asp Asn Asp Ala 305 310 315 320 Ala Ser Met Pro Cys Thr Arg Pro Pro Ser Ala Pro Leu Asn Leu Ile 325 330 335 Ser Asn Val Asn Glu Thr Ser Val Asn Leu Glu Trp Ser Ser Pro Gln 340 345 350 Asn Thr Gly Gly Arg Gln Asp Ile Ser Tyr Asn Val Val Cys Lys Lys 355 360 365 Cys Gly Ala Gly Asp Pro Ser Lys Cys Arg Pro Cys Gly Ser Gly Val 370 375 380 His Tyr Thr Pro Gln Gln Asn Gly Leu Lys Thr Thr Lys Val Ser Ile 385 390 395 400 Thr Asp Leu Leu Ala His Thr Asn Tyr Thr Phe Glu Ile Trp Ala Val 405 410 415 Asn Gly Val Ser Lys Tyr Asn Pro Asn Pro Asp Gln Ser Val Ser Val 420 425 430 Thr Val Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Ser Ile Ala Leu Val Gln 435 440 445 Ala Lys Glu Val Thr Arg Tyr Ser Val Ala Leu Ala Trp Leu Glu Pro 450 455 460 Asp Arg Pro Asn Gly Val Ile Leu Glu Tyr Glu Val Lys Tyr Tyr Glu 465 470 475 480 Lys Asp Gln Asn Glu Arg Ser Tyr Arg Ile Val Arg Thr Ala Ala Arg 485 490 495 Asn Thr Asp Ile Lys Gly Leu Asn Pro Leu Thr Ser Tyr Val Phe His 500 505 510 Val Arg Ala Arg Thr Ala Ala Gly Tyr Gly Asp Phe Ser Glu Pro Leu 515 520 525 Glu Val Thr Thr Asn Thr Val Pro Ser Arg Ile Ile Gly Asp Gly Ala 530 535 540 Asn Ser Thr Val Leu Leu Val Ser Val Ser Gly Ser Val Val Leu Val 545 550 555 560 Val Ile Leu Ile Ala Ala Phe Val Ile Ser Arg Arg Arg Ser Lys Tyr 565 570 575 Ser Lys Ala Lys Gln Glu Ala Asp Glu Glu Lys His Leu Asn Gln Gly 580 585 590 Val Arg Thr Tyr Val Asp Pro Phe Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Gln Ala 595 600 605 Val Arg Glu Phe Ala Lys Glu Ile Asp Ala Ser Cys Ile Lys Ile Glu 610 615 620 Lys Val Ile Gly Val Gly Glu Phe Gly Glu Val Cys Ser Gly Arg Leu 625 630 635 640 Lys Val Pro Gly Lys Arg Glu Ile Cys Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys 645 650 655 Ala Gly Tyr Thr Asp Lys Gln Arg Arg Asp Phe Leu Ser Glu Ala Ser 660 665 670 Ile Met Gly Gln Phe Asp His Pro Asn Ile Ile His Leu Glu Gly Val 675 680 685 Val Thr Lys Cys Lys Pro Val Met Ile Ile Thr Glu Tyr Met Glu Asn 690 695 700 Gly Ser Leu Asp Ala Phe Leu Arg Lys Asn Asp Gly Arg Phe Thr Val 705 710 715 720 Ile Gln Leu Val Gly Met Leu Arg Gly Ile Gly Ser Gly Met Lys Tyr 725 730 735 Leu Ser Asp Met Ser Tyr Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile 740 745 750 Leu Val Asn Ser Asn Leu Val Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Met Ser 755 760 765 Arg Val Leu Glu Asp Asp Pro Glu Ala Ala Tyr Thr Thr Arg Gly Gly 770 775 780 Lys Ile Pro Ile Arg Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ile Ala Tyr Arg Lys 785 790 795 800 Phe Thr Ser Ala Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Val Met Trp Glu 805 810 815 Val Met Ser Tyr Gly Glu Arg Pro Tyr Trp Asp Met Ser Asn Gln Asp 820 825 830 Val Ile Lys Ala Ile Glu Glu Gly Tyr Arg Leu Pro Pro Pro Met Asp 835 840 845 Cys Pro Ile Ala Leu His Gln Leu Met Leu Asp Cys Trp Gln Lys Glu 850 855 860 Arg Ser Asp Arg Pro Lys Phe Gly Gln Ile Val Asn Met Leu Asp Lys 865 870 875 880 Leu Ile Arg Asn Pro Asn Ser Leu Lys Arg Thr Gly Thr Glu Ser Ser 885 890 895 Arg Pro Asn Thr Ala Leu Leu Asp Pro Ser Ser Pro Glu Phe Ser Ala 900 905 910 Val Val Ser Val Gly Asp Trp Leu Gln Ala Ile Lys Met Asp Arg Tyr 915 920 925 Lys Asp Asn Phe Thr Ala Ala Gly Tyr Thr Thr Leu Glu Ala Val Val 930 935 940 His Val Asn Gln Glu Asp Leu Ala Arg Ile Gly Ile Thr Ala Ile Thr 945 950 955 960 His Gln Asn Lys Ile Leu Ser Ser Val Gln Ala Met Arg Thr Gln Met 965 970 975 Gln Gln Met His Gly Arg Met Val Pro Val 980 985 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR. <400> 3 gaaggcgtgg tcactaaatg taa 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR. <400> 4 tttaatttca gagggcgaag ac 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR. <400> 5 gtcagtggtg gacctgacct 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR. <400> 6 ggttgagcac agggtacttt att 23 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR. <400> 7 gaggtgatag cattgctttc g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR. <400> 8 caagtcagtg tacaggtaag c 21 <210> 9 <211> 452 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Ala Gln Pro Phe His Trp Gly Asp Asp Ala Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Pro His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Glu Leu Ser Met His 1 5 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ala Gln Pro Phe His Trp Gly Asp Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 13 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Pro His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 14 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn 1 5 10 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val 1 5 10 <210> 18 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 19 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Leu Arg Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Pro His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn 1 5 <210> 21 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val 1 5 10 15 Lys Ser <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Asp Ser Leu Arg Ser Phe Asp Tyr 1 5 <210> 23 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Val Val 1 5 10 <210> 27 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Ala Gln Pro Phe His Trp Gly Asp Asp Ala Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 28 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 29 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Leu Arg Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 30 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110

Claims (19)

  1. 항체 효과기 기능(effector fuction)을 가지는 항 EphA4 항체를 유효성분으로 포함하는 EphA4 발현세포 손상용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 EphA4 발현세포는 췌장암 세포인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 항 EphA4 항체는 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 항체 효과기 기능은 항체 의존적 세포독성 또는 보체 의존적 세포독성 중 어느 하나, 또는 둘 모두인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 VH 및 VL 사슬을 포함하고, 각 VH 및 VL 사슬 은 프레임워크(framework) 아미노산 서열에 의해 분리되는 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지정된 CDR 아미노산 서열을 포함하며, 상기 각 VH 및 VL 사슬 내에 각 CDR의 아미노산 서열은 하기:
    인간 VH CDR1 : ELSMH(서열번호: 10),
    인간 VH CDR2 : GFDPEDGETIYAQKFQG(서열번호: 11),
    인간 VH CDR3 : AQPFHWGDDAFDI(서열번호: 12),
    인간 VL CDR1 : SGSSSNIGSNTVN(서열번호: 15),
    인간 VL CDR2 : SNNQRPS(서열번호: 16),
    인간 VL CDR3 : AAWDDSLNGPV(서열번호: 17); 및
    인간 VH CDR1 : SNSAAWN(서열번호: 20),
    인간 VH CDR2 : RTYYRSKWYNDYAVSVKS(서열번호: 21),
    인간 VH CDR3 : DSLRSFDY(서열번호: 22),
    인간 VL CDR1 : SGSSSNIGNNYVS(서열번호: 24),
    인간 VL CDR2 : DNNKRPS(서열번호: 25),
    인간 VL CDR3 : GTWDSSLSAVV(서열번호: 26)와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 인간 VH는 서열번호 27 또는 29의 아미노산 서열을 포함하고, 인간 VL은 서열번호 28 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징 으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 항체는 추가적으로 인간 IgG1의 Fc 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 각 VH 및 VL 사슬이 프레임워크(framework) 아미노산 서열에 의해 분리되는 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지정된 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 상기 각 VH 및 VL 사슬 내에 각 CDR의 아미노산 서열이 하기:
    인간 VH CDR1 : ELSMH(서열번호: 10),
    인간 VH CDR2 : GFDPEDGETIYAQKFQG(서열번호: 11),
    인간 VH CDR3 : AQPFHWGDDAFDI(서열번호: 12),
    인간 VL CDR1 : SGSSSNIGSNTVN(서열번호: 15),
    인간 VL CDR2 : SNNQRPS(서열번호: 16),
    인간 VL CDR3 : AAWDDSLNGPV(서열번호: 17); 및
    인간 VH CDR1 : SNSAAWN(서열번호: 20),
    인간 VH CDR2 : RTYYRSKWYNDYAVSVKS(서열번호: 21),
    인간 VH CDR3 : DSLRSFDY(서열번호: 22),
    인간 VL CDR1 : SGSSSNIGNNYVS(서열번호: 24),
    인간 VL CDR2 : DNNKRPS(서열번호: 25),
    인간 VL CDR3 : GTWDSSLSAVV(서열번호: 26)와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 VH 및 VL 사슬을 포함하는 항체.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 인간 VH는 서열번호 27 또는 29의 아미노산 서열을 포함하고, 인간 VL은 서열번호 28 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 항체는 추가적으로 인간 IgG1의 Fc 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  11. 제 8항의 항체를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  12. 제 11항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  13. 제 12항의 벡터를 포함하는 분리된 숙주세포.
  14. 제 11항의 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 제 13항의 숙주세포를 배양한 후, 상기 숙주세포 배양으로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체 생산 방법.
  15. 제 11항의 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 EphA4 발현세포 손상용 약학적 조성물.
  16. a) EphA4 발현세포를 항 EphA4 항체와 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 세포에 결합된 항체의 효과기 기능으로 EphA4 발현세포를 손상시키는 단계를 포함하는 EphA4 발현세포 손상방법.
  17. EphA4, 이의 면역학적 활성 단편, 또는 EphA4 또는 이의 면역학적 활성 단편을 발현할 수 있는 DNA를 유효성분으로 포함하는, EphA4 발현세포에 대한 효과기 기능을 가지는 항체 유도용 면역성 조성물.
  18. EphA4, 이의 면역학적 활성 단편, 또는 EphA4 또는 이의 면역학적 활성 단편을 발현할 수 있는 세포 또는 DNA를 투여하는 단계를 포함하는, EphA4 발현세포에 대한 효과기 기능을 가지는 항체를 유도하는 방법.
  19. 약학적으로 유효한 양의 항체 효과기 기능을 가지는 항 EphA4 항체, 또는 이의 면역학적 활성 단편을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체(대상) 내 췌장암을 치료 또는 예방하는 방법.
KR1020087023434A 2006-02-28 2007-02-22 항 ＥｐｈＡ４ 항체의 효과기 기능을 이용한 세포 손상 방법 KR20080105111A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77779406P 2006-02-28 2006-02-28
US60/777,794 2006-02-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20080105111A true KR20080105111A (ko) 2008-12-03

Family

ID=38099200

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087023434A KR20080105111A (ko) 2006-02-28 2007-02-22 항 ＥｐｈＡ４ 항체의 효과기 기능을 이용한 세포 손상 방법

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8003098B2 (ko)
EP (1) EP2004228A1 (ko)
JP (1) JP2009531273A (ko)
KR (1) KR20080105111A (ko)
CN (1) CN101432022A (ko)
BR (1) BRPI0708311A2 (ko)
CA (1) CA2643790A1 (ko)
RU (1) RU2429246C2 (ko)
WO (1) WO2007102383A1 (ko)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201008574A (en) 2008-08-19 2010-03-01 Oncotherapy Science Inc INHBB epitope peptides and vaccines containing the same
TW201627003A (zh) * 2010-04-02 2016-08-01 腫瘤療法 科學股份有限公司 Ｅｃｔ２胜肽及含此胜肽之疫苗
JP6055763B2 (ja) * 2010-06-16 2016-12-27 トレリス バイオサイエンス リミテッド ライアビリティー カンパニー ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ｇＢタンパク質に対する高親和性ヒト抗体
EP2648748A1 (en) 2010-12-08 2013-10-16 Stem Centrx, Inc. Novel modulators and methods of use
BR112016010051A2 (pt) 2013-11-04 2017-12-05 Pfizer ?conjugados de anticorpo-fármaco anti-efna4?
US10934550B2 (en) 2013-12-02 2021-03-02 Phio Pharmaceuticals Corp. Immunotherapy of cancer
CA2943857C (en) 2014-03-31 2023-07-11 Universitetet I Tromso - Norges Arktiske Universitet Antibodies against hpa-1a
ES2848857T3 (es) * 2014-07-31 2021-08-12 Us Gov Health & Human Services Anticuerpos monoclonales humanos contra EphA4 y su uso
BR112017023261A2 (pt) * 2015-04-29 2018-08-07 Sanford Burnham Med Res Inst novos inibidores de epha4 que têm como alvo seus domínios de ligação ao ligante
TW201716442A (zh) 2015-09-08 2017-05-16 衛材Ｒ＆Ｄ企管股份有限公司 抗EphA4抗體
CA3139398A1 (en) 2019-07-01 2021-01-07 Eisai R&D Management Co., Ltd. Anti-epha4 antibody

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09512167A (ja) 1994-04-15 1997-12-09 アムジエン・インコーポレーテツド Ｈｅｋ５、ｈｅｋ７、ｈｅｋ８、ｈｅｋ１１、新規なｅｐｈ様受容体タンパク質チロシンキナーゼ
CN101333516A (zh) * 1995-08-29 2008-12-31 麒麟医药株式会社 嵌合体动物及其制备方法
WO2001062907A1 (en) * 2000-02-22 2001-08-30 Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. Antibody library
US20030108963A1 (en) 2001-07-25 2003-06-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel genes, compositions, kit, and methods for identification, assessment, prevention and therapy of prostate cancer
US20050260639A1 (en) * 2002-09-30 2005-11-24 Oncotherapy Science, Inc. Method for diagnosing pancreatic cancer
WO2004031411A2 (en) 2002-09-30 2004-04-15 Oncotherapy Science, Inc. Genes and polypeptides relating to human pancreatic cancers
EP1638514A4 (en) 2003-06-06 2009-11-18 Medimmune Inc USE OF EPHA4 AND MODULATOR OR EPHA4 FOR THE DIAGNOSIS, TREATMENT AND PREVENTION OF CANCER
US20070253954A1 (en) * 2004-02-27 2007-11-01 Oncotherapy Science, Inc. Epha4 As Therapeutic Target Of Prc And Pdaca
AU2005277567A1 (en) * 2004-08-16 2006-03-02 Medimmune, Llc Integrin antagonists with enhanced antibody dependent cell-mediated cytotoxicity activity
CA2585717A1 (en) * 2004-10-27 2006-05-04 Medimmune Inc. Modulation of antibody specificity by tailoring the affinity to cognate antigens
TW201008574A (en) * 2008-08-19 2010-03-01 Oncotherapy Science Inc INHBB epitope peptides and vaccines containing the same

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0708311A2 (pt) 2011-05-24
RU2429246C2 (ru) 2011-09-20
US20090191211A1 (en) 2009-07-30
JP2009531273A (ja) 2009-09-03
WO2007102383A1 (en) 2007-09-13
CA2643790A1 (en) 2007-09-13
EP2004228A1 (en) 2008-12-24
RU2008138541A (ru) 2010-04-10
CN101432022A (zh) 2009-05-13
US8003098B2 (en) 2011-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2739610C1 (ru) Антитело против PD-1 и его применение
JP6345832B2 (ja) 担体免疫グロブリンおよびその使用
RU2693661C2 (ru) Антитело против pdl-1, его фармацевтическая композиция и применение
JP6224759B2 (ja) 抗ｂ７−ｈ３抗体
KR20080105111A (ko) 항 ＥｐｈＡ４ 항체의 효과기 기능을 이용한 세포 손상 방법
JP2022130393A (ja) 抗ｃｔｌａ４－抗ｐｄ－１二機能性抗体、その医薬組成物および使用
KR101754433B1 (ko) 항-ｃｄ100 항체 및 이의 사용 방법
KR20200029618A (ko) 항-인간 4-1bb 항체 및 그의 용도
JP2020510432A (ja) Ｎｅｃｔｉｎ−４への特異性を有する抗体及びその使用
TWI801862B (zh) 抗ｔｉｇｉｔ的抗體、其製備方法和應用
MX2014003156A (es) Anticuerpos anti-cd134 (ox40) y usos de los mismos.
JP2007306933A (ja) 特異的結合タンパク質およびその使用
JP2009528257A (ja) 抗ｃｄｈ３抗体のエフェクター機能を用いて細胞を障害する方法
KR20210142638A (ko) Cd3 항원 결합 단편 및 이의 응용
KR20240046224A (ko) 이중특이성 항체 및 그 용도
CN114981301A (zh) Pd1和vegfr2双结合剂
US20230330257A1 (en) Development of drug therapeutic agent containing adaptor and use thereof
US20240043568A1 (en) Development of new tumor engager therapeutic drug and use thereof
EP4257607A1 (en) Development and application of t-cell engager therapeutic agent
JP2024508048A (ja) Ｓｉｇｌｅｃ－１５結合タンパク質の調製およびその使用
WO2024006961A1 (en) Neo-2/15 variants and uses thereof for preferentially stimulating t-regulatory cells
CN116410326A (zh) 抗cd40×cldn18.2双特异性抗体及其用途
JP2021523688A (ja) 抗ｃｄ２７抗体およびその使用
EA042365B1 (ru) Бифункциональное антитело против ctla4 и против pd-1, его фармацевтическая композиция и их применение

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid