JP6055763B2 - ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ｇＢタンパク質に対する高親和性ヒト抗体 - Google Patents

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関連出願

本出願は、２０１０年６月１６日に出願された米国特許仮出願第６１／３５５，４９９号からの優先権を主張するものであり、当該出願に記載された内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ＥＦＳ−ＷＥＢに提出された配列表の参照
米国特許商標庁ＥＦＳ−ＷＥＢサーバーへ電子提出された以下の配列表の全内容は、ＭＰＥＰ §１７３０ ＩＩ．Ｂ．２（ａ）（Ｃ）において承認され、定められている通り、あらゆる目的において、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。配列表は、以下の電子出願テキストファイルにおいて確認される：

本発明は、妊娠中のＣＭＶ感染の胎児に対する影響を予防又は改善し、及び移植患者を含む免疫無防備状態の患者のＣＭＶ感染を治療するために治療的及び予防的に使用するための、ＣＭＶのｇＢタンパク質に対するヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に関する。

ＣＭＶは、移植患者、他の免疫無防備状態の患者及び新生児における主要な疾患誘起因子である。米国では、毎年、約４０，０００例の乳児がＣＭＶ排出を伴って生まれ、このうち、８，０００例が症状及び／又は重度の障害を持って生まれ、さらに８，０００例が、後に進行性の難聴を発症する。妊娠中の母親の約半数は、生まれつき充分な免疫を有している。したがって、ヒト血液中には有効なｍＡｂが存在していることがわかっている。また、このことは、静脈内投与γグロブリン（ＩＶＩＧ）による免疫の受動伝達によっても示され、胎児の保護に対して非常に高い有効性が示されている。これは、細胞性免疫が体液性免疫よりも明らかに重要であるため、移植状況においては、ＩＶＩＧでは限定的な有効性しか観察されないこととは対照的である。

ＣＭＶに対する自然な応答の大部分は、ｇＢタンパク質に対するものである（Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｗ．ら，Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（２０００）１５：１３３−１３８）。Ｔｏｗｎｅワクチンは、インビトロで大規模に継代培養された弱毒化ウイルス生ワクチンであり、これにより、線維芽細胞感染は中和するが内皮細胞感染を中和しない抗体が誘導される。このワクチンは安全であることが知られており、２０年間、研究されている（Ａｄｌｅｒ，Ｓ．Ｐ．ら，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．（１９９８）１７：２００−２０６）。後述するようにｇＢに対する抗体の単離に有用な血液ドナーとしては、以前にＣＭＶに曝露されたセロポジティブ個体、並びにＴｏｗｎｅワクチンでのワクチン接種前及び摂取後のセロネガティブ対象が挙げられる。

ＣＭＶのｇＢタンパク質に対する抗体が調製されている（Ｎｏｚａｗａ Ｎ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．（２００９）［出版前に電子公開］、Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｎ．ら（米国特許出願公開第２００９／０００４１９８号）、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，Ａら（米国特許出願公開第２００９／０００４１９８号）、Ｏｈｌｉｎ，Ｍ．ら（Ｊ Ｖｉｒｏｌ（１９９３）６７：７０３−７１０）。ｇＢのＡＤ−２ドメインであるＩＴＣ８８に対する中和抗体が報告されている（Ｌａｎｔｔｏ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００３）３０５：２０１−２０９）。しかしながら、ＣＭＶに対するヒト抗体のクローニングに対するこれまでの取り組みは、好成績ではあるが、範囲が限定的であり、高親和性（サブｎＭ）抗体は報告されていない。齧歯類では見られない病態の一態様であるが、実際にはＣＭＶに対する弱親和性抗体がヒトの経胎盤伝染を促進させるため（Ｎｏｚａｗａ，上掲）、高親和性は重要なパラメータである。ヒトＣＭＶは、およそ２３６ｋｂの二本鎖ＤＮＡゲノムを有し、β−ヘルペスウイルス科の原型構成員である。ゲノムの高い複雑性は、多くの潜在的な有用抗原が存在していることを意味する。中和抗体及びその関連エピトープの特性を評価する取り組みにより、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）に基づくサブユニットワクチンが得られた。このワクチンは、有効な中和応答を誘起するが、セロネガティブ女性のコホート試験では、５０％の有効性を示さない。これは、任意のＣＭＶワクチンの中で最も有効性が高いと考えられる。ワクチンは、典型的には、様々な親和性を有する抗体を誘導する。これまでに試験されたワクチンの有効性が期待はずれであることから、高親和性抗体が求められており、また、予防的ストラテジーとして高親和性ｍＡｂを直接供給することが求められていた。

また、特異的中和エピトープに対する免疫応答に着目されてこなかったことも、不充分な有効性の原因と考えられている（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｂ．Ｃ．ら，Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）１６：４９１−５００。抗ＣＭＶワクチンの開発において考えられる別の技術的問題点は、ウイルスによる病態の理解に他の細胞型の感染がますます着目されてきているのに、前記ワクチンは、線維芽細胞感染を中和する抗体の生成能についてしか評価されてこなかったことである。この偏りが、インビトロでのウイルス培養に関して技術的な障害として反映されている。線維芽細胞でのウイルスの継代を繰り返すことにより、多くの実験室株の内皮細胞及び上皮細胞に対する親和性の低下が引き起こされてきたと考えられる。ここ数年間では、この欠点は、ウイルス表面上のｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１３１−ＵＬ１２８糖タンパク質複合体の１種類以上の成分の欠落に関連づけられてきた。

より有効な抗ＣＭＶ予防ストラテジーが明らかに必要とされている。

ＣＭＶのｇＢタンパク質と特異的に免疫反応し、これまでの抗体（ヒト又はマウス）と比べて改善された親和性を有し、中和能を有するヒト抗体を調製した。体液性免疫機構により、何万種類もの充分に分化した結合能を有する何百万種類もの抗体構造物が生成され得るが、防御抗体であるのは、これらのうちごく僅かなサブセットにすぎない。本発明者らは、ＣｅｌｌＳｐｏｔ（商標）技術（Ｈａｒｒｉｍａｎ，Ｗ．Ｄ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００９）３４：１３５−１４５，Ｃｏｌｌａｒｉｎｉ，Ｅ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００９）１８３：６３３８−６３４５）及び米国特許第７，４１３，８６８号）（すべて、参照により本明細書に組み込まれる）を使用し、ＣＭＶに対して高い力価を有すことがと確認されたドナーの血液から一群のｍＡｂを作製した。

したがって、一態様において、本発明は、ｇＢタンパク質上のエピトープに結合するヒトモノクローナル抗体又はその免疫反応性断片に関し、好ましい実施形態は、ｇＢタンパク質上のエピトープの保存配列に結合するヒトモノクローナル抗体又はその免疫反応性断片である。これらの抗体は、ＣＭＶの中和についての標準的なプラーク形成アッセイにおいて中和能を示し、かかるアッセイにおいて５００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは２００ｎｇ／ｍｌ未満、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ_５０を示す。また、本発明の抗体は、ＣＭＶのＡＤ１６９株のｇＢタンパク質に対して１０ｎＭ未満又は５ｎＭ未満又は１ｎＭ未満の親和性を有する。

ＣＭＶ感染を治療するため、又はＣＭＶに対する抵抗性増強のために本発明の方法を使用する場合、本発明のモノクローナル抗体又は断片は、多様なＣＭＶ株と免疫反応性であってもよく、１種類のモノクローナル抗体が所望の効果を有すれば充分であり得る。あるいは、治療対象又は抵抗性を獲得させる対象に、同一又は異なるＣＭＶタンパク質に結合する１種類より多くのモノクローナル抗体を投与してもよい。

また、本発明は、有効成分としての１種類の本発明の抗体もしくは免疫反応性断片、又は２種類以下の本発明の抗体もしくは断片を含む、予防又は治療に有用な医薬組成物を含む。

本発明の他の態様は、ヒト対象のＣＭＶを処置（治療）するため、又は感染に対するヒトの抵抗性を誘導するための本発明の抗体の使用方法を含む。

本発明のモノクローナル抗体は組換え技術により製造されたものであってもよく、したがって、本発明はまた、このような製造のための組換え物質並びに当該抗体の製造のための細胞株又は不死化細胞及び非ヒト多細胞生物体もしくはその細胞又は微生物細胞も含む。一実施形態において、ヒトから採取した細胞を「不死化」形態とし、前記抗体を特性評価し、関連コード配列をクローニングするのに充分な期間、前記抗体を分泌することが可能となるように改変する。

ｇＢタンパク質及びその保存領域に対する４Ａ２の結合を示す。 ｇＢタンパク質及びその保存領域に対する１９Ｂ１０の結合を示す。 ＨＵＶＥＣ及びＨＦＦ細胞でのｍＡｂ ４Ａ２、３１０、３１３、３３８及び３４５によるＶＲ１８１４の中和を示す。 ＨＵＶＥＣにおけるｍＡｂ ４Ａ２、３１０、３１３、３３８及び３４５によるＶＲ１８１４の中和を示す。 ＨＦＦ細胞におけるｍＡｂ ４Ａ２、３１０、３１３、３３８及び３４５によるＶＲ１８１４の中和を示す。

本明細書で用いる場合、用語「治療」とは、既にＣＭＶに感染している対象におけるウイルス負荷を低減すること、又はかかる対象における該疾患の症状を改善することをいう。かかる症状としては、網膜炎及び肝炎を含む。

用語「抵抗性を付与する」とは、ＣＭＶによるウイルス感染において少なくとも重症度が低下する予防効果をいう。

「不死化細胞」は、改変されていない初代単離細胞よりも顕著に多数の継代を経ても生存し得る細胞をいう。本発明との関連において用いる場合、「不死化」は、必ずしも、当該細胞が非常に長い期間にわたって抗体を分泌し続けることを意味する必要はなく、初代細胞培養よりも長く生存し得ることのみを意味する。抗体が分泌される期間は、その同定及びコードヌクレオチド配列の回収に充分な期間であればよい。

本明細書において、ヒト細胞から単離した抗体などのヒト抗体は、強い免疫応答を誘起しない。ヒトから単離された抗体であっても、誘起される免疫応答に一定レベルのバックグラウンド「ノイズ」があるため、治療されたヒトの５〜１０％にヒト抗体による応答があることが知られている。免疫応答は体液性、細胞性又はその両方であり得る。特に、この割合の個体では高レベルのサイトカインが見られ得る。

ＣＭＶのｇＢタンパク質は、１３０ｋＤａの前駆タンパク質として合成され、共有結合を維持したまま１１６ｋＤａ（Ｎ末端）と５８ｋＤａ（Ｃ末端）の断片に切断される；観察される分子量はグリコシル化状態に応じて種々であり得る。ＡＤ−２抗原性決定基は、ｇｐ１１６の６７〜８２番目の残基をいう。ＣＭＶに対する自然免疫の大部分はＡＤ−２への結合によると説明されている（すなわち、この領域を包含するペプチドによってブロックされ得る）（Ｏｈｌｉｎ（上掲））。

本発明の抗体は、実施例１に記載するように、ＣＭＶ曝露ヒトドナーから、米国特許第７，４１３，８６８号、ＰＣＴ公報の国際公開第２００５／０４５３９６号及び国際公開第２００８／００８８５８号に記載され（すべて、参照により組み込まれる）、出願人らが権利を有するＣｅｌｌＳｐｏｔ（商標）法を用いて回収される。

本発明のヒト抗体又はヒト化抗体の製造は、慣用的な組換え手法によって、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞又は他の真核生物細胞株（昆虫細胞など）によって行われる。あるいは、植物及びトランスジェニック動物（例えば、ウシの乳汁中）、又は微生物、植物もしくは昆虫由来の単細胞系、あるいはかかる細胞の無細胞抽出物中において抗体を含む組換え物質を生成させる方法も知られている。

また、抗体をコードしているヌクレオチド配列が入手できることから、同じエピトープに結合する関連断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２又はＦ_ｖ断片を組換え技術により作製させてもよく（又は前記タンパク質自体のタンパク質分解的処理によって作製してもよい）、前記抗体を一本鎖形態で作製してもよい。組換え抗体の作製の操作に関するさまざまな手法が当該技術分野で知られている。

キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体は、すべて本発明の範囲に含まれ、フィブロネクチン、トランスフェリン又はリポカリンなどの他のタンパク質骨格を基礎とした抗体模倣物も本発明の範囲に含まれる。同様に、現在、２種類の別々の抗体に由来する抗原特異性ドメインが組み込まれた単一の抗体様分子（二重特異性抗体）を作製するための数多くの技術が存在している。好適な技術が、Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）及びＭｅｒｒｉｍａｃ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によって報告されている（例えば、Ｏｒｃｕｔｔ ＫＤ，Ａｃｋｅｒｍａｎ ＭＥ，Ｃｉｅｓｌｅｗｉｃｚ Ｍ，Ｑｕｉｒｏｚ Ｅ，Ｓｌｕｓａｒｃｚｙｋ ＡＬ，Ｆｒａｎｇｉｏｎｉ ＪＶ，Ｗｉｔｔｒｕｐ ＫＤ．Ａ ｍｏｄｕｌａｒ ＩｇＧ−ｓｃＦｖ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏｐｏｌｏｇｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．（２０１０）２３：２２１−２２８；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｊ，Ｌｕｇｏｖｓｋｏｙ Ａ．Ｒａｔｉｏｎａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｐａｔｈｗａｙｓ．ＭＡｂｓ．（２０１１）１；３（３）；Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＰＡ，Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ Ｃ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００９）６９：４９４１−４９４４を参照のこと）。

したがって、非常に広範な株に反応性を有する単一の抗体が、異なるＣＭＶエピトープに対する反応性を有する個々の抗体のＦａｂドメインを用いて構築することができ、例えば、ｇＢとｇＨ複合体の両方に対して活性を有する、あるいは、同一又は異なる株に由来するｇＢタンパク質に反応性を示す二重特異性抗体を構築することができる。高親和性ｇＨ抗体は、例えば、Ｍａｃａｇｎｏ Ａ，Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ ＮＬ，Ｖａｎｚｅｔｔａ Ｆ，Ｄａｎｄｅｒ Ｅ，Ｓａｒａｓｉｎｉ Ａ，Ｒｅｖｅｌｌｏ ＭＧ，Ｇｅｒｎａ Ｇ，Ｓａｌｌｕｓｔｏ Ｆ，Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ Ａ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８−１３１Ａ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（２０１０）８４：１００５−１０１３に報告されている。また、他の株に由来するｇＨタンパク質に対する高親和性抗体を作製し、使用してもよい。

治療で使用する場合、組換え技術により作製された抗体又は断片を、標準的な賦形剤を用いて医薬組成物に製剤化し、標準的なプロトコルに従って投与する。医薬組成物は、本発明のモノクローナル抗体又は断片、特に、あらゆるＣＭＶ株のｇＢタンパク質と交差反応性であるモノクローナル抗体又は断片を活性成分として有するものであってもよい。あるいは、ある株のｇＢタンパク質に対してより強く反応するモノクローナル抗体、別の株のｇＢタンパク質に対してより強く反応するモノクローナル抗体の２種類のモノクローナル抗体のみを活性成分としてもよい。全ての場合において、他のＣＭＶタンパク質に結合する薬剤を含む、追加の治療用薬剤を含んでいてもよい。また、当該組成物は抗体以外に、ビタミンなどの栄養物質、又は抗体以外の任意の他の有益な化合物を含んでいてもよい。

一実施形態において、投与する製剤を、感染に対する抵抗性を増大させるために使用する場合、完全抗体（相補領域含有Ｆｃ領域を含む）を使用する。典型的には、該抗体は、０．０１〜２０ｍｇ／ヒト対象ｋｇの投薬量レベル、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の量、又はこれらの範囲内の中間の量で投与される。一実施形態では、０．１〜１．０ｍｇ／ｋｇの範囲の量を使用する。数日間、数週間又は数ヶ月間を空けて反復投与することで効果を得ることができる。

別の実施形態では、ウイルス量を低減させるための治療効果を得るため、完全抗体（相補領域含有Ｆｃ領域を含む）を使用する。当該プロトコルにおける投与量は、０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ程度、又はこの範囲内の中間の値（０．０１、１もしくは１０ｍｇ／ｋｇなど）が採用される。また、反復投与を行ってもよい。治療的処置としては、感染の診断後できるだけ早く投与されるが、数日以内の投与も本発明の範囲に含まれる。また、反復投与を採用してもよい。肺における炎症応答を低減させる目的の場合、該抗体の免疫特異的断片のみを使用すれば十分である。投薬量レベルは完全抗体の場合と同様である。また、免疫特異的断片と完全抗体の混合物の投与も本発明の範囲に含まれる。

本発明の抗体組成物の投与は、典型的には注射、一般的には静脈内注射により行われる。したがって、非経口投与が好ましい。しかし、遺伝子療法（インビボでの組換え抗体の作製）を含む任意の奏効可能な投与方法が包含される。

製剤は、抗体組成物を投与するために当該技術分野で一般的に知られた方法で調製される。好適な製剤は、標準的な薬方書、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，最新版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（参照により本明細書に組み込まれる）において知得できる。製剤は、典型的には、等張性溶液（バッファーを含む）、酸化防止剤などを含む非経口投与に適したもの、並びに送達媒体（リポソーム、ミセル及びナノ粒子など）を含むエマルションである。

望ましいプロトコル及び製剤は、担当医師の判断並びに対象の具体的な病状に依存することができる。投薬量レベルは、適宜、対象の年齢、一般健康状態及び感染重症度に依存する。

以下の実施例は、本発明を例示するために示したものであり、本発明を限定するもののではない。

実施例１
ＣＭＶ ｇＢに対する抗体を分泌するヒトＢ細胞の単離
ＣＭＶに対する力価が確認された５０名の成人由来の末梢血単核細胞を用いて、抗ウイルス抗体を産生するヒトＢ細胞について調査した。ＣＭＶ ｇＢタンパク質に対する所望の抗体を有する対象を特異的ｍＡｂのクローニングに使用した。調査の結果、対象の約１０％が５０，０００個に１個より多い頻度で所望の細胞を有していた。

希少な好ましい細胞の調査及び回収を行うため、本発明者らは、既報のＣｅｌｌＳｐｏｔ（商標）技術（米国特許第７，４１３，８６８号、参照により本明細書に組み込まれる）を使用した。ＣｅｌｌＳｐｏｔ（商標）アッセイ法は、単一細胞から分泌されるＩｇＧを該細胞の近傍においてフットプリントとして捕捉することにより、ＥＬＩＳＡと同等のアッセイを、ほぼ単一細胞の寸法の仮想ウェルまで効果的に縮小するものであり、そのため、数百万個の細胞を容易に解析することができる。さらに、顕微鏡的多重化試薬（組み合せて着色された蛍光ラテックスミクロスフィア，米国特許第６，６４２，０６２号参照、参照により本明細書に組み込まれる）を使用することにより、各クローンの分泌抗体のフットプリントの特異性及び／又は親和性について、複数の生化学的プローブを用いて詳細に特性評価することができる。この定量的アッセイは、調査集団から極めて希少な好ましい細胞を抽出できるためには充分な忠実度であり、クローニングされた発現細胞は、元の同定アッセイと整合する表現型を示す。

スクリーニング基準は、精製ｇＢタンパク質並びにウイルス溶解物に対する結合とした。ｇＢタンパク質は、ＣＭＶのＡＤ１６９株に感染させた２９３細胞から精製した。クローンの親和性ランクの順序付けは、ビーズ上の抗原を血清アルブミンで希釈して行う。これにより、分泌ＩｇＧフットプリントに対する多価結合（「アビディティ」効果）の機会が低減され、より高い固有の親和性が選択される。

非Ｂ細胞を、ヒトドナーの血漿中のＰＢＭＣから標準的な磁気分離法を用いて枯渇させた。細胞をＩＭＤＭ／２０％ＨＩ−ＦＣＳに１ｅ６／ｍｌで再懸濁させ；ＥＢＶ（感染Ｂ９５−８細胞の上清から直接ペレット化）を用いて不死化させた。ＥＢＶは１：１００の希釈度で添加し、細胞を３７℃で２時間培養した。過剰のＥＢＶを洗浄し、細胞を以下のいずれかとした：
（１）ＩＭＤＭ、２０％ＨＩ−ＦＣＳ、２０％巨細胞腫馴化培地、２μｇ／ｍｌ ＣｐＧ（ＯＤＮ２００６）、及び１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１０中、２ｅ６／ｍｌで調査のみのために培養する、又は
（２）さらに、磁気陽性選択を用いて表面ＩｇＧについて選択する。

細胞を２００〜３００細胞／ウェルで、放射線照射ヒト肺細胞（ＭＲＣ−５、５，０００細胞／ウェル）上、ＩＭＤＭ、２０％ＨＩ−ＦＣＳ、２０％巨細胞腫馴化培地、２μｇ／ｍｌ ＣｐＧ（ＯＤＮ２００６）、及び１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１０中で培養した。培地は２〜３日毎に補給した。６日目に、ウェルの内容物の半分をＣｅｌｌＳｐｏｔ（商標）でアッセイした。次いで、調査アッセイで陽性の少数ウェル内の残りの細胞を、同じフィーダー細胞と培養条件で、１０、５、１、及び０．５細胞／ウェルに希釈した。４〜５日後、これらの限界希釈プレートをＥＬＩＳＡ又はＣｅｌｌＳｐｏｔ（商標）によって再度測定した。

ＣｅｌｌＳｐｏｔ（商標）ナノ粒子をウイルス溶解物又は精製ｇＢタンパク質とコンジュゲートさせ、所望の抗体についてスクリーニングした。ＣＭＶ ＡＤ１６９ウイルスに感染させた細胞から調製した溶解物は、Ｖｉｒｕｓｙｓ（カタログ番号ＣＶ０４６）から購入した（この溶解物は、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）細胞株において作製されたものである）。組換えＣＭＶ ｇＢ抗原をヒスチジンタグ融合タンパク質として２９３細胞内で産生させ、ニッケルキレート化カラムを用いて精製した。精製ｇＢタンパク質をＥＬＩＳＡ及びＣｅｌｌＳｐｏｔに使用した。ＡＤ１６９溶解物及びｇＢ精製タンパク質の調製物を、それぞれ、既報の方法であるＨａｒｒｉｍａｎら（上掲）及びＣｏｌｌａｒｉｎｉら（上掲）に従ってナノ粒子にコンジュゲートさせた。

次いで、限界希釈した陽性ウェルの内容物を、逆転写酵素−ＰＣＲを用いて処理し、該抗体の重鎖及び軽鎖をコードするｍＲＮＡを回収した。ＰＢＭＣの解凍からＲＴ−ＰＣＲによるコードｍＲＮＡ配列回収までの全期間は１０〜１２日間であった。

実施例２
ＣＭＶ ｇＢに対するヒト抗体のクローニング
陽性ＥＬＩＳＡウェルの再構成Ｉｇ重鎖遺伝子及びＩｇ軽鎖遺伝子の増幅を、セミネステッドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行った。それまで未知のＶ遺伝子再構成を増幅するため、ファミリーに特異的なＶ遺伝子プライマーの集合（ヒトＩｇ遺伝子座内のほぼすべてのＶ遺伝子セグメントを認識する）を構築した。５’プライマーを、Ｃγ、Ｃκ及びＣλ遺伝子セグメントに特異的なプライマーミックスと共に使用した。限界希釈ＣＭＶ−ｇＢ特異的Ｂ細胞のクローン性を、相違する子孫細胞のＶ遺伝子増幅物の配列を比較することにより明確に調べ、増幅させた完全長Ｖ遺伝子再構成をＩｇＧ発現ベクター内にクローニングした。

詳細には、単離Ｂ細胞から得た全ｍＲＮＡを、市販のＲＮＡ精製キット（ＲＮｅａｓｙ（商標）；Ｑｉａｇｅｎ（ドイツ））を用いて抽出した。全ＲＮＡ調製物及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用することにより、逆転写−ＰＣＲを行った。各試料について３回：軽鎖カッパ（κ）について１回、軽鎖ラムダ（λ）について１回、及びガンマ重鎖（γ）について１回のＰＣＲ反応を実施した。ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキットを増幅に使用した（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２１０２１２）。連結ＲＴ−ＰＣＲ反応においては、固有のＲＴ酵素ブレンド（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ（商標）及びＳｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ（商標））を使用して、Ｃ−κ、Ｃ−λ又はＣγ遺伝子のＣＨ１コンセンサス領域に対応するアンチセンス配列特異的プライマーを用いてｃＤＮＡを合成し、ＲＴを５０℃で１時間行った後、高い特異性と感度のためにＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによるｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を行う。各ＰＣＲ反応では、５’センスプライマーの混合物を使用した。プライマー配列は、ＶＨ、ＶＫ及びＶＬのリーダー配列に基づくものとした。ＰＣＲ反応を９５℃で１５分間実施し、初期高温開始反応の後、９５℃で３０秒間（変性）、６０℃で４５秒間（アニーリング）及び７２℃で１分間（伸長）を２０サイクル行った。

可変Ｉｇ断片の検出及び発現ベクター内へのクローニングのためのネステッドＰＣＲ．第２ラウンドでは、１回目の増幅反応物の５μｌのアリコートを使用した。使用したプライマーは５’ＢｇｌＩＩ及び３’ＸｂａＩ制限部位を有するものである。３０回のＰＣＲサイクルを行った。第１ラウンドと第２ラウンドの増幅には同一の条件を使用した。５マイクロリットルの各反応液を添加し、１％アガロースゲル上で分離し、次いで臭化エチジウムで染色した。Ｖ−Ｃ ＰＣＲ産物は、それぞれ、５００及び４５０ｂｐのＶＨ及びＶＬの再構成断片が増幅されたものと予測される。およそ５００ｂｐの分子サイズを有するＰＣＲバンドが陽性の結果を示した。ＰＣＲ産物を精製し（Ｑｉａｇｅｎゲル精製キットカタログ番号２８７０４）、抽出したＰＣＲ産物について、特異的定常領域プライマーを用いて直接配列を決定した。クローニングした断片の配列は、組換え体作製のために調製したプラスミドを用いて配列決定することにより確認した。

哺乳動物細胞でのインビトロ抗体作製のため、上述のＰＣＲ断片を消化し、ヒトγ１又はヒトκもしくはλの定常領域を有する個々の発現ベクター内にクローニングした。重鎖及び軽鎖をコードしている発現ベクターで２９３（ヒト腎臓）細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をコトランスフェクトした。発現プラスミドを、カチオン性脂質系トランスフェクション試薬（２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して導入した。各トランスフェクション反応では、２０μｇの精製プラスミドと４０μＬの２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）を１ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、室温で５分間インキュベートした後、結合させ、室温で２０分間複合体を形成させた。ＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎ複合体を、９０ｍｍペトリ皿に播種した３×１０^６個の細胞に添加し、３７℃、８％ＣＯ２でインキュベートした。最後に、トランスフェクションの７２時間後に遠心分離（３，０００ｇ，４℃で１５分間）を行い、上清を回収し、分泌された抗体を収集した。

約２００万個のリンパ球から、ＡＤ１６９溶解物に結合する４５個のクローンを単離した。このうち、大部分は組換えｇＢタンパク質にも結合した。

ＡＤ１６９とｇＢの両方に結合したｍＡｂのうち２種類（４Ａ２及び１９Ｂ１０）が中和能を有していた。これらのうち一方（４Ａ２）は、ｇＢタンパク質上の保存部位であるＡＤ−２ペプチドに結合する。他のｍＡｂ（５Ｃ５）は、ＡＤ−２に結合するが、ウイルスを中和しない。

４Ａ２及び１９Ｂ１０の可変領域、Ｄ／Ｊ接合領域、フレームワーク（ＦＲ）領域及び相補性決定（ＣＤＲ）領域を含む重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を以下に示す。重鎖上の分泌シグナル配列をイタリック体で示し、ＣＤＲ１〜３に下線を付している。

蛍光ビーズ上に高密度又は低密度のいずれかで完全長ｇＢタンパク質又はＡｄ−２ペプチドでコートしたＣｅｌｌＳｐｏｔプローブを調製することにより、高親和性抗体を作製した。理論に拘束されないが、低密度では多価配位の親和性効果が低減されるため、検索は、高い固有の親和性を有する抗体に有利となる。複数の高親和性抗体を単離し、配列決定した。ＣＭＶに反応性である他のモノクローナル抗体の配列を決定し、配列番号９〜３６、及び３８〜６６として示す。ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のヌクレオチド配列を配列番号３７に示す。

本発明の抗体において、重鎖は、ＧＦＴＦＮＲＨＧ（配列番号６７）もしくはＧＳＩＳＳＥＤＦＣ（配列番号６８）のＣＤＲ１；及び／又はＳＳＤＧＡＮＱ（配列番号６９）もしくはＩＣＹＴＧＤ（配列番号７０）のＣＤＲ２領域；及び／又はＡＲＤＧＲＣＥＧＥＲＣＹＳＧＶＴＤＦ（配列番号７１）もしくはＡＲＥＤＲＲＱＬＨＳＲＰＹＦＹＹＧＬＤＶ（配列番号７２）のＣＤＲ３領域を有するものであり得る。他の実施形態において、軽鎖は、ＱＮＩＧＧＹ（配列番号７３）もしくはＱＳＬＬＨＳＮＧＨＮＹ（配列番号７４）のＣＤＲ１領域；及び／又はＤＡＳ（配列番号７５）もしくはＬＧ（配列番号７６）のＣＤＲ２領域；及び／又はＱＱＲＮＳＷＰＰＬＴ（配列番号７７）もしくはＱＡＬＱＴＰＮＴ（配列番号７８）のＣＤＲ３領域を有するものである。

実施例３
親和性の測定
本発明の抗体の親和性を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）バイオセンサー解析によって測定した。この方法では、アミン反応性バイオセンサー上のカルボン酸基をＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化した。抗体（ｐＨ５のＭＥＳバッファー中で希釈）を、プローブの活性化された表面に結合させ、残りの活性カルボキシル基をエタノールアミンでブロックした。ｇＢタンパク質をＡｂコートプローブとともにインキュベートし、Ａｂコートプローブとの会合速度及び解離速度をＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）装置によって測定した。

１回の実験において、４Ａ２は１６８ｐＭの親和性を、１９Ｂ１０は６９７ｐＭの親和性を示した。これを、対応するＩＣ_５０（単位：μｇ／ｍｌ）として表１に示す。これらの親和性定数は、公開されているｇＢに対するモノクローナル抗体よりも明らかに良好である。

ｇＢのＡＤ−２エピトープに対するｍＡｂ ３１０、３１３、３４５及び４Ａ２の結合親和性を測定した。ｇＢ結合反応速度を表２に示す。ｍＡｂ ３１０、３１３及び３３８は、ｍＡｂ ４Ａ２よりも約１０倍高い結合力を有する。また、ｍＡｂ ３２３、３１６及び３３８も、ｍＡｂ ４Ａ２より高い結合力を有する（データ非図示）。残りのｍＡｂの結合親和性も試験され、同様に、公開されているｇＢに対するモノクローナル抗体よりも良好である。

実施例４
Ｅｌｉｓａ結合アッセイ及びエピトープマッピング
ｍＡｂ ４Ａ２及び１９Ｂ１０を、精製ｇＢタンパク質、及びＡＤ−２：ＮＥＴＩＹＮＴＴＬＫＹＧＤＶ（配列番号７９）で示される保存ペプチドに対する結合について評価した。図１に示されるように、４Ａ２は、完全長タンパク質とペプチドＡＤ−２のどちらにも良好に結合するが、１９Ｂ１０は該タンパク質にしか結合しない。

実施例５
ウイルス中和アッセイ
ｍＡｂ ４Ａ２及び１９Ｂ１０は、ＭＲＣ５一次線維芽細胞においてＣＭＶのＡＤ１６９株を中和した。前記抗体の連続希釈物を等容量のＡＤ１６９（１０^８／ｍｌのストックを希釈し、２０００感染細胞／ウェルとした）と混合し、室温で１時間インキュベートした後、９６ウェルマイクロプレート内の単層の標的細胞に添加した。２４時間後、細胞を固定し、透過性にし、ＨＲＰに結合させたＩＥ１（中間初期タンパク質１，ＵＬ１２３としても知られている，複製中のウイルスのマーカー）に対するモノクローナル抗体で染色した。感染細胞を、ＨＲＰ基質の沈着により検出した。感染細胞の数を抗体濃度に対してプロットした。

また、ウイルスの中和を、ＶＲ１８１４株（Ｒｅｖｅｌｌｏら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（２００１）８２：１４２９−１４３８）を用いて評価した。ｍＡｂ ４Ａ２、３１０、３１３、３３８及び３４５はＶＲ１８１４株を、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及びヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）の両方において中和した。図２Ａ及び２Ｂは、ｍＡｂ ４Ａ２、３１０、３１３、３３８及び３４５の各々のＩＣ５０とＩＣ９０の値を示す。図３及び４は、それぞれ、ｍＡｂ ４Ａ２、３１０、３１３、３３８及び３４５の各々によるＨＵＶＥＣ細胞及びＨＦＦ細胞における中和を示す。二重試験で行った結果を示す。

ＡＤ１６９及びＶＲ１８１４株を中和する他のｍＡｂも同様に試験される。

Claims (11)

1. モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又は該抗体と同じエピトープに結合する該抗体の断片であって、
   （ａ）重鎖可変領域がＭＡＢ４Ａ２（配列番号２）の重鎖可変領域を有し；又は
   （ｂ）重鎖可変領域がＭＡＢ１９Ｂ１０（配列番号６）の重鎖可変領域を有し；又は
   （ｃ）重鎖可変領域がＭＡＢ３１３（配列番号１３）の重鎖可変領域を有し；又は
   （ｄ）重鎖可変領域がＭＡＢ３３８（配列番号２０）の重鎖可変領域を有し；又は
   （ｅ）重鎖可変領域がＭＡＢ３４５（配列番号２２）の重鎖可変領域を有し；
   かつ、
   （ａ）の場合、軽鎖可変領域がＭＡＢ４Ａ２（配列番号４）の軽鎖可変領域を有し、
   （ｂ）の場合、軽鎖可変領域がＭＡＢ１９Ｂ１０（配列番号８）の軽鎖可変領域を有し、
   （ｃ）の場合、軽鎖可変領域がＭＡＢ３１３（配列番号２７）の軽鎖可変領域を有し、
   （ｄ）の場合、軽鎖可変領域がＭＡＢ３３８（配列番号３４）の軽鎖可変領域を有し、
   （ｅ）の場合、軽鎖可変領域がＭＡＢ３４５（配列番号３６）の軽鎖可変領域を有する抗体又は断片。
2. 重鎖可変領域がＭＡＢ３４５（配列番号２２）の重鎖可変領域を有し、かつ、軽鎖可変領域がＭＡＢ３４５（配列番号３６）の軽鎖可変領域を有する、請求項１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体と同じエピトープに結合するその断片。
3. 請求項１又は２に記載の抗体もしくは断片をコードしている１以上の第１のヌクレオチド配列を含む１以上の核酸分子、あるいは、その全長にわたり前記第１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含む１以上の核酸分子。
4. 請求項１又は２に記載の抗体又は断片を産生する発現系を含む組換え宿主細胞であって、哺乳動物細胞、微生物細胞、昆虫細胞又は植物細胞である、組換え宿主細胞。
5. 抗体又は該抗体と同じエピトープに結合するその断片の製造方法であって、請求項４に記載の細胞を培養すること、及び前記抗体又は断片を回収することを含む方法。
6. 請求項１又は２に記載の単離されたモノクローナル抗体又は断片を薬学的に許容され得る賦形剤とともに含む医薬組成物。
7. さらに、追加の医療用薬剤を薬学的に許容され得る賦形剤とともに含む、請求項６に記載の医薬組成物。
8. ＣＭＶに感染したヒトにおけるＣＭＶを治療する方法に使用するための、請求項１又は２に記載の抗体又は断片、あるいは、請求項６又は７に記載の医薬組成物。
9. ヒト対象においてＣＭＶの感染に対する抵抗性を増強する方法に使用するための、請求項１又は２に記載の抗体又は断片、あるいは、請求項６又は７に記載の医薬組成物。
10. 対象が免疫無防備状態である、請求項８又は９に記載の抗体又は断片、あるいは、医薬組成物。
11. 対象が妊娠女性である、請求項８又は９に記載の抗体又は断片、あるいは、医薬組成物。