WO2007094423A1 - ヒトサイトメガロウイルスに結合するヒトのモノクローナル抗体並びにその抗原結合部分 - Google Patents
ヒトサイトメガロウイルスに結合するヒトのモノクローナル抗体並びにその抗原結合部分 Download PDFInfo
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Definitions
- Human monoclonal antibody that binds to human cytomegalovirus and its antigen-binding portion.
- the present invention relates to a human monoclonal antibody that binds to human cytomegalovirus (hereinafter sometimes referred to as “HCMV”), and an antigen-binding portion thereof.
- HCMV human cytomegalovirus
- Human cytomegalovirus belongs to the same herpesvirus family 13 herpesvirus subfamily as human herpesvirus 6 (HHV-6) and human herpesvirus 7 (HHV-7). It is a 230 kb double-stranded DNA virus that encodes more than 200 genes with a diameter of about 180 nm, and is the largest in the Herpesviridae family.
- HCMV is highly species-specific and does not infect non-human animals, but is widely infectious in humans and has an affinity for a wide range of tissues in the human body.
- HCMV Once infected, HCMV is latent throughout life, and more than 90% of adults are already infected and possess the virus, and it is a harmless virus for healthy individuals.
- HCMV HCMV reactivation of HCMV occurs, resulting in lethality such as interstitial pneumonia, retinitis, gastroenteritis, encephalitis, etc. Illness develops.
- Non-Patent Document 1 As a preventive or therapeutic agent that can suppress or alleviate the development of a lethal disease state caused by HCMV, the antiviral drug “ganciclobi” that suppresses the growth of HCMV can be used. Le ”has been developed! (Non-Patent Document 1).
- Ganciclovir is an antiviral drug that interferes with the synthesis of viral DNA by inhibiting DNA polymerase, mainly treating cytomegalovirus retinitis in immunocompromised states such as AIDS, and advanced HIV with a CD4 lymphocyte count of lOOZmm 3 or less. It has been used and approved for the control of cytomegalovirus retinitis in infectious diseases.
- ganciclovir has various side effects such as inhibition of hematopoiesis, and its usage is limited as described above.
- ganciclovir that requires attention is a blood disorder associated with bone marrow suppression.
- Leukocytes, red blood cells, and platelets are abnormally decreased, and early symptoms include fever, sore throat, abnormal dullness, and bleeding tendency such as subcutaneous bleeding.
- abnormalities are found in the neuropsychiatric system, causing headaches, dizziness, insomnia, abnormal thoughts, and anxiety.
- Non-Patent Document 2 Non-Patent Document 2
- an antibody that can bind to HCMV and neutralize its infectivity (hereinafter sometimes referred to as “anti-HCMV antibody”) is lethal by HCMV. Since it can be expected as a prophylactic or therapeutic drug for a disease state, it is useful in a preventive or therapeutic strategy for various diseases caused by HCMV, for example, in an immunodeficient state.
- HCMV inhibitory antibodies for example, Patent Documents 1 and 2 reported to date have not been sufficient in terms of affinity and neutralizing ability for HCMV. It was a powerful force that could be expected to sufficiently block the natural biological activity of HCMV and prevent or alleviate various disease symptoms caused by HCMV.
- Non-Patent Document 1 AIDS / HIV Treatment Directory Vol.5, No.2 (Fall), 1991, pp 43-45. American Foundation for AIDS Research (AmFAR)
- Non-Patent Document 2 Whitley RJ, et al. Ganciclovir treatment of symptomatic congenital cy tomegalovirus infection: results of a phase II study.National Institute of Allergy and Infectious Diseases Collaborative Antiviral Study Group.J Infect Dis. 1997; 175: 1080- 6.
- Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 8-502403
- Patent Document 2 Japanese Patent Publication No. 8-506325
- the present invention relates to HC that causes various disease states, for example, in an immunodeficiency state.
- An object of the present invention is to provide a human monoclonal antibody excellent in affinity and neutralizing ability for MV and an antigen-binding portion thereof.
- the present inventors have found a human monoclonal antibody excellent in affinity and neutralizing ability for HCMV by ingenuity, and have completed the present invention.
- the invention according to claim 1 is a human monoclonal antibody that can bind to HCMV and neutralize its biological activity, and comprises a light chain (L chain) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. And an anti-HCMV monoclonal antibody having a heavy chain (H chain) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
- the invention according to claim 2 has an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the light chain (L chain) and Z or heavy chain (H chain).
- the present invention relates to the anti-HCMV monoclonal antibody according to claim 1.
- the invention according to claim 3 is a human monoclonal antibody that can bind to HCMV and neutralize its biological activity, or an antigen-binding portion thereof, wherein the light chain variable region shown in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 ( LCVR) and a heavy chain variable region (HCVR) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, or an anti-HCMV monoclonal antibody or an antigen-binding portion thereof.
- LCVR light chain variable region shown in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
- HCVR heavy chain variable region
- the invention according to claim 4 is an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the light chain variable region (LCVR) and Z or the heavy chain variable region (HCVR).
- LCVR light chain variable region
- HCVR heavy chain variable region
- the invention according to claim 5 is a human monoclonal antibody or antigen-binding portion thereof that binds to HCMV and can neutralize its biological activity, and is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5 to 10
- the invention according to claim 6 relating to an anti-HCMV monoclonal antibody or an antigen-binding portion thereof having a complementarity determining region (CDR) represented by one or more amino acid sequences, binds to HCMV, and A human monoclonal antibody capable of neutralizing activity, a light chain (L chain) CDR1 domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a light chain (L chain) CDR2 domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 And a CDR domain selected from the group consisting of a light chain (L chain) CDR3 domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and an anti-HCMV monoclonal antibody or an antigen-binding portion thereof .
- CDR complementarity determining region
- the invention according to claim 7 is a human monoclonal antibody capable of binding to HCMV and neutralizing its biological activity, comprising a heavy chain (H chain) CDR1 domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and a sequence A group consisting of a heavy chain (H chain) CDR2 domain having the amino acid sequence of No. 9 and a heavy chain (H chain) CDR3 domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 also includes a selected CDR domain Anti-HCMV monoclonal antibody or its antigen binding About the part.
- the invention according to claim 8 has an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the complementarity determining region (CDR). Or an antigen-binding portion thereof.
- the present invention relates to an anti-HCMV monoclonal antibody or an antigen-binding portion thereof according to any one of claims 1 to 8, wherein the anti-HCMV monoclonal antibody or the antigen-binding portion thereof is 0 X 10 " 11 (M) to 1.3 X 10" 11 (M).
- the invention according to claim 10 has an anti-HCMV monoclonal antibody or antigen binding thereof according to any one of claims 1 to 9, wherein the anti-HCMV monoclonal antibody according to any one of claims 1 to 9 exhibits an HCMV infection inhibition rate of about 1 ⁇ gZmL and 80% or more. About the part.
- the invention according to claim 11 relates to the anti-HCMV monoclonal antibody or the antigen-binding portion thereof according to any one of claims 1 to 10, wherein the antibody class (subclass) is IgG ( ⁇ ).
- An invention according to claim 12 relates to a prophylactic or therapeutic agent for a disease caused by HCMV, comprising the human monoclonal antibody according to any one of claims 1 to 11 or an antigen-binding portion thereof.
- the invention according to claim 13 is characterized in that the disease caused by HCMV is (a) interstitial pneumonia, retinitis, gastroenteritis, encephalitis due to reactivation of HCMV in an immunodeficient state, (b) maternal power fetus To giant cell inclusion body disease caused by the spread of HCMV infection, (c) miscarriage, stillbirth, short-term death caused by the giant cell inclusion body disease, (d) in the case of no death due to the giant cell inclusion body disease 13.
- the invention according to claim 14 is a DNA encoding an anti-HCMV monoclonal antibody or antigen-binding portion thereof capable of binding to HCMV and neutralizing its biological activity, wherein SEQ ID NO: 1 to: L0 force is also selected.
- the present invention relates to isolated DNA encoding amino acid sequences.
- the invention according to claim 15 is a stringent form of the DNA according to claim 14.
- the present invention relates to isolated DNA that is hybridized under conditions.
- the invention according to claim 16 relates to a vector (excluding a plant expression vector) incorporating the isolated DNA according to claim 14 or 15.
- the invention according to claim 17 relates to a host cell (excluding plant cells) into which the recombinant expression vector according to claim 16 has been introduced.
- the anti-HCMV antibody or antigen-binding portion thereof according to the present invention specifically binds to HCMV that causes various diseases in an immunodeficient state, and loses (neutralizes) its biological activity. , Can exhibit excellent affinity and neutralizing ability (for HCMV). Moreover, since it is a human monoclonal antibody, it has no immunogenicity and no rejection reaction is observed.
- the anti-HCMV antibody or antigen-binding portion thereof according to the present invention has strong affinity and neutralizing ability for HCM V, and no rejection reaction is observed.
- HCMV Various diseases caused by HCMV such as (a) AIDS, cancer, interstitial pneumonia due to reactivation of HCMV in immune deficient state such as after AIDS, cancer, organ transplantation, bone marrow transplantation, and hemodialysis, retina Fatal diseases such as inflammation, gastroenteritis, encephalitis, (b) giant cell inclusion disease caused by the spread of HCMV infection from pregnant women to the fetus, (c) miscarriage, stillbirth caused by the giant cell inclusion disease, It is considered useful as a preventive or therapeutic drug for death after birth, (d) microcephaly, mental developmental disorder, delayed intellectual development, hearing impairment, etc. in the case of death due to giant cell inclusion disease.
- anti-HCMV monoclonal antibody or antigen-binding portion thereof will be described below.
- antibody refers to four polypeptide chains, two heavy (H) chains and two light (L) chains interconnected by disulfide bonds.
- An immunoglobulin molecule consisting of two polypeptide chains, one heavy (H) chain and one light (L) chain interconnected by disulfide bonds Shall also refer to.
- antigen-binding portion refers to an antigen (eg, HCM V) refers to one or more antibody fragments that have the ability to specifically bind to.
- an “antibody capable of neutralizing HCMV activity” is intended to refer to an antibody that inhibits the biological activity of HCMV by binding to HCMV.
- the source refers to an antibody that reduces the observed biological activity of natural HCMV by about 5 to: LOO%.
- the observed reduction in biological activity of HCMV is in the range of about 50-100%.
- One aspect of the present invention is a human monoclonal antibody or antigen-binding portion thereof that specifically binds to HCMV and can neutralize its biological activity, comprising a light chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 And an anti-HCMV monoclonal antibody having a heavy chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
- the present invention also includes an anti-HCMV monoclonal antibody having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted or added from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the light chain (L chain), or an antigen-binding portion thereof.
- An anti-HCMV monoclonal antibody having an amino acid sequence in which one or more amino acids in SEQ ID NO: 2 are deleted, substituted, inserted or added in the heavy chain (H chain) is also included in the present invention.
- Each H chain has an H chain variable region (sometimes referred to as "HCVR” or "V”) and an H chain invariant.
- Region H chain invariant region also has three domain forces, “C 1”, “C 2”, “C 3” respectively.
- Each L chain consists of the L chain variable region (sometimes referred to as “LCVR” or “V”) and the L chain constant region.
- L chain constant region is also a domain force and may be referred to as “C”).
- HCVR and LCVR are important in that they are involved in antibody binding specificity.
- another embodiment of the present invention is a human monoclonal antibody or antigen-binding portion thereof that specifically binds to HCMV and can neutralize its biological activity, and is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
- Light chain variable region (LCVR) and amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 The present invention relates to an anti-HCMV monoclonal antibody or an antigen-binding portion thereof characterized by having a heavy chain variable region (HCVR).
- LCVR light chain variable region region
- HCVR heavy chain variable region region
- amino acids are present as long as they can specifically bind to HCMV and neutralize its biological activity.
- An anti-HCCM V monoclonal antibody characterized by having a deleted, substituted, inserted or added amino acid sequence or an antigen-binding portion thereof is also included in the present invention, and one or more of the above-mentioned LCVR and HCVR are included.
- the present invention also includes an anti-HCMV monoclonal antibody or an antigen-binding portion thereof characterized by having an amino acid sequence deleted, substituted, inserted or added.
- variable region sequence derived from a specific naturally occurring antibody is different from the antibody having different properties.
- a human monoclonal antibody capable of binding to HCMV and neutralizing its biological activity, or an antigen-binding portion thereof has a variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 4.
- An anti-HCMV monoclonal antibody or an antigen-binding portion thereof is included in the invention of the present application, and has an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the variable region.
- Monoclonal antibodies or antigen-binding portions thereof are also included in the present invention.
- HCVR and LCVR can be further subdivided into hypervariable regions called complementarity determining regions (CDRs) interspersed with regions called framework regions (FRs) that are kept more constant.
- CDRs complementarity determining regions
- FRs framework regions
- HCVR and LCVR each consist of 3 CDRs and 4 FRs, which are arranged in the order FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 from the amino terminal to the carboxy terminal.
- a human monoclonal antibody or antigen-binding portion thereof that binds to HCMV and can neutralize its biological activity comprising the group consisting of SEQ ID NOs: 5 to 10
- the present invention relates to an anti-HCMV monoclonal antibody or an antigen-binding portion thereof, which has a complementarity determining region (CDR) represented by any one or more amino acid sequences selected from
- an anti-HCMV monoclonal antibody or an antigen-binding portion thereof characterized by having an added amino acid sequence is also included in the present invention.
- a human monoclonal antibody capable of binding to HCMV and neutralizing its biological activity comprising a light chain (L chain) CDR1 domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, A light chain (L chain) CDR2 domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a light chain (L chain) CDR3 domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7
- An anti-HCMV monoclonal antibody or an antigen-binding portion thereof comprising a light chain (L chain) CDR1 domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
- a light chain (L chain) CDR2 domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
- a light chain (L chain) CDR3 domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7
- One or more amino acids are deleted in the light chain complementarity determining region (CDR) of a human monoclonal antibody or antigen-binding portion thereof that can specifically bind to HCMV and neutralize its biological activity.
- CDR light chain complementarity determining region
- an anti-HCMV monoclonal antibody characterized by having a substituted, inserted or added amino acid sequence or an antigen-binding portion thereof is also included in the present invention.
- a human monoclonal antibody capable of binding to HCMV and neutralizing its biological activity comprising a heavy chain (H chain) CDR1 domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, A group consisting of a heavy chain (H chain) CDR2 domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a heavy chain (H chain) CDR3 domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 also includes a selected CDR domain Anti-HCMV monoclonal antibody or antigen thereof Concerning the binding part.
- One or more amino acids are deleted in the complementarity determining region (CDR) of the heavy chain if it is a human monoclonal antibody or antigen-binding portion thereof that can specifically bind to HCMV and neutralize its biological activity.
- CDR complementarity determining region
- an anti-HCMV monoclonal antibody characterized by having a substituted, inserted or added amino acid sequence or an antigen-binding portion thereof is also included in the present invention.
- the anti-HCMV monoclonal antibody or antigen-binding portion thereof that is effective in the present invention is capable of specifically binding to a specific antigenic determinant (epitorp) present on HCMV and neutralizing its biological activity. is there.
- the antibody of the present invention is based on the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 to 10, which show a variable region or a complementarity determining region (CDR) that may be a full-length antibody or an antigen-binding portion thereof. Then, a recombinant human monoclonal antibody or an antigen-binding portion thereof capable of specifically binding to HCMV and neutralizing its biological activity can be obtained by a well-known technique in the technical field. It belongs to the technical scope of
- heavy and light chain leader sequences are cleaved during protein maturation and do not contribute to the properties of the final antibody, but to add missing sequences, cloned cDNA sequences Can be combined with synthetic oligonucleotides by ligation or PCR amplification.
- variable region can be synthesized as a set of short, overlapping oligonucleotides and combined by PCR amplification to create a fully artificial variable region clone.
- another embodiment of the present invention is an anti-HCMV monoclonal antibody that can bind to HCMV and neutralize its biological activity, or a DNA that encodes an antigen-binding portion thereof, comprising SEQ ID NOs: 1 to LO
- Vectors incorporating the above-described isolated DNA, and host cells into which the recombinant expression vector has been introduced are also included in the present invention.
- the recombinant expression vector and the host cell used herein are for expressing the recombinant human antibody of the present invention, an animal cell, particularly a plant cell that is desired to be a mammalian cell, Plant cells are excluded.
- variable region antibodies can be expressed as phage fusion proteins to obtain specific antibodies.
- the above-described anti-HCMV antibody or antigen-binding portion thereof according to the present invention specifically binds to HCMV causing various diseases and neutralizes its biological activity in an immunodeficient state, for example. Yes, but with a particularly high affinity and neutralizing ability.
- binding refers to binding of an antibody to a predetermined antigen.
- the antibody binds with an affinity of at least about 1 ⁇ 10 _7 (M) and for a given antigen, a non-specific antigen other than the given antigen or a closely related antigen (e.g. BSA It binds with an affinity at least 2 times higher than its binding affinity for casein).
- high affinity for certain IgG antibodies at least about 1 X 10 "7 (M) , preferably at least about 1 X 10 _8 (M), more preferably at least about 1 X 10 _9 (M) , And even more preferably, refers to a binding affinity of at least about 1 ⁇ 10 _1C) (M)
- “high affinity” binding can vary for other antibody isotypes, eg, for IgM isotypes.
- “High affinity” binding refers to a binding affinity of at least about 1 ⁇ 10 _7 (M).
- the anti-HCMV antibody or antigen-binding portion thereof according to the present invention usually has an anti-infection rate of 80% or more at about 1 ⁇ gZ mL, and thus can be said to have effective neutralizing ability.
- the class (subclass) of a strong anti-HCMV monoclonal antibody is IgG ( ⁇ ).
- IgG is stable as a substance and has high affinity.
- IgM aggregates immediately and is known to have low affinity.
- the anti-HCMV antibody or antigen-binding portion thereof according to the present invention has strong affinity and neutralizing ability for HCMV, various diseases caused by HCMV are caused. For example, (a) lethality of interstitial pneumonia, retinitis, gastroenteritis, encephalitis, etc.
- HCMV disease caused by HCMV
- diseases and other illnesses that have been shown or suspected to be a contributing factor to the disease.
- a disease in which HCMV activity is detrimental is a disease in which inhibition of HCMV activity is expected to alleviate the symptoms and Z or progression of the disease.
- Such a disease can be detected using, for example, the above-described anti-HCMV antibody, and increases the concentration of HCMV in the biological fluid of the subject who is struggling with the disease (eg, serum of the subject) And increase the concentration of HCMV in plasma and synovial fluid.
- the anti-HCMV monoclonal antibody or the antigen-binding portion thereof according to the present invention comprises serum. Isolated from human blood cells positive for anti-HCMV antibody, removed T cells from the mononuclear cells, then infected with EBV and obtained from proliferating antibody-producing cells As such, it is a fully human monoclonal antibody.
- FIG. 1 is a flowchart up to the isolation of antibody-producing cell clones.
- Mononuclear cells were also separated by human blood force with high serum anti-HCMV antibodies. T cells were removed from the mononuclear cells, and then cells that had been infected by EBV and proliferated were used as antibody-producing cell libraries.
- the antibody-producing cell library was seeded in a 96-well plate, and after 1 to 4 weeks of culture, 1st screening of anti-HCMV antibody in the culture supernatant was performed.
- Screening was performed by the ELI SA method using a 96-well plate coated with GST-fused HCMV-AD1 targeting an antibody against AD1, which is one of the major neutralization epitopes of HCMV.
- the resulting antibody-positive cell population is seeded in a new 96-well plate at a low cell concentration.
- a feeder cell was added to aid cell growth.
- the obtained antibody-positive cell population was seeded at a limiting dilution in a new 96-well plate, and a feeder cell was added to this stage to aid cell growth.
- the obtained antibody-positive cell population was cultured and screened by limiting dilution, and antibody-positive cells were obtained from a single plate per well.
- Purification of the anti-HCMV antibody was performed by affinity purification using ProteinA.
- the column used was a HiTrap rProtein A FF (Amersham) pre-packed column, and the purification conditions were those recommended by the column manufacturer.
- FIG. 3 shows the SDS-PAGE results.
- the purified antibody was confirmed to retain HCMV antibody activity by ELISA.
- HCMV—AD1 forms gB (glycoprotein B) together with HCMV—AD2, and is the main envelope protein of HCMV.
- HCMV-infected cells Since gB is present on the cell membrane in HCMV-infected cells, we decided to prepare HCMV-infected cells as samples.
- the cells were human fetal lung fibroblasts (HEL), infected with HCMV (AD169 strain) and cultured for 2 days.
- HEL human fetal lung fibroblasts
- FIG. 4 shows the results of confirming the antigen specificity of the anti-HCMV antibody by Western blot. Force that no band was detected in uninfected HEL cells HCMV infected HEL cells In HCMV-ADl, a specific band was detected at a molecular weight of 55 kDa.
- the anti-HCMV antibody (G3D No. 9) has specificity for HCMV-AD1.
- an antigen is immobilized on a sensor chip, and an antibody is added to the surface of the antigen immobilization surface to measure the interaction.
- the antigen used was GST-fused HCMV-AD 1, and GST was used as a control.
- the utility was 1. 16 X 10 _ 11 (M) as a dissociation constant.
- Neutralization activity was confirmed as an efficacy evaluation of anti-HCMV antibody (G3D No. 9). Neutralizing activity was evaluated based on the inhibition rate of HCMV (AD169 strain) infection by antibodies against HEL (human fetal lung fibroblasts). In the method, complement (5%) was added to virus solution and purified antibody (G3D No. 9), and the mixture was placed at 37 ° C for 1 hour, and then inoculated into HEL cells (37 ° C, 1 hour).
- the cells were cultured for 2 days after washing, and pp65, an early expression protein of HCMV, was detected by cell immunostaining.
- FIG. 5 shows the results of evaluating the neutralizing activity of anti-HCMV antibody.
- the G3D No. 9 antibody showed an infection inhibition rate of 80% or more at 1 ⁇ g Zml, and was confirmed to have effective neutralizing activity.
- Antibody gene cloning was performed by PCR. TotaHRNA was extracted from anti-HCMV antibody-producing cell clones. CDNA synthesis was performed from the extracted totaHRNA using Oligo-dT Primer and Reverse Transcriptase.
- the antibody gene encodes a variable region at both the H chain and L chain, and the sequence varies depending on the antibody. 3, the terminal side is a constant region and is well conserved among antibody genes.
- the primers shown in Table 1 are designed so that the 5 'end contains the transcription start point and the 3' end contains the transcription termination point.
- the antibody gene was amplified as follows.
- the nucleotide sequence of the antibody gene was determined using an ABI sequencer.
- the amino acid sequences of anti-HCMV antibodies based on the obtained nucleotide sequence are shown in SEQ ID NOs: 1 to 10.
- the obtained antibody gene (H chain and L chain) cDNA clones were respectively inserted into plasmid vector pSG5. Both plasmids were introduced into 293T cells to confirm transient antibody expression.
- a method using ribofactoramine (Invitrogen Corporation) and a plus reagent (Invitrogen Corporation) was adopted.
- pEGFP was transduced, and the efficiency of transduction was confirmed by observing GFP-expressing cells under a fluorescence microscope. Efficiency was 50% -60%.
- Fig. 6 shows the results of Western blotting in which human antibodies were detected using 293T cell lysates two days after transduction.
- peroxidase-labeled anti-human IgG H + L (Amersham Bioscience Co., Ltd.) was used for detection in one step.
- human antibody H chain (50 kDa) and L chain (25 kDa) were confirmed in the transduced cells (Fig. 6).
- FIG. 7 shows the results of confirming anti-HCMV antibody production by introduction of the anti-HCMV antibody gene into 293T cells by ELISA.
- a dilution series of purified antibody was used as an ELISA control.
- the culture supernatant of cells transduced with pEGFP was used as described above.
- the culture supernatant of cells expressing the antibody gene transiently is human Ig G was confirmed.
- anti-HCMV antibody or antigen-binding portion thereof specifically binds to HCMV causing various diseases and loses (neutralizes) its biological activity (with respect to HCMV). And) can exhibit excellent affinity and neutralizing ability. Moreover, since it is a human monoclonal antibody, it has no immunogenicity and no rejection reaction is observed.
- the anti-HCMV antibody or antigen-binding portion thereof is used in various diseases caused by HCM V, such as (a) AIDS, cancer, after organ transplantation, after bone marrow transplantation, blood Fatal illnesses such as interstitial pneumonia, retinitis, gastroenteritis, encephalitis due to reactivation of HCMV in immunocompromised state such as after dialysis, and (b) giant disease caused by HCMV infection spreading from pregnant women to fetus Cell inclusion body disease, (c) miscarriage, stillbirth, short-term death caused by giant cell inclusion body disease, (d) microcephaly, mental development in the case of no death due to giant cell inclusion body disease It is thought to be useful as a preventive or therapeutic drug for disability, intellectual development delay, and hearing impairment.
- HCM V diseases caused by HCM V
- diseases caused by HCM V such as (a) AIDS, cancer, after organ transplantation, after bone marrow transplantation, blood Fatal illnesses such as interstitial pneumonia, retinitis,
- FIG. 1 is a flowchart showing a procedure for separating an antibody-producing cell clone that produces an anti-HCMV antibody that is effective in the present invention.
- FIG. 2 shows the result of confirming the isotype of an anti-HCMV antibody useful for the present invention by ELISA.
- FIG. 3 is a result of confirming anti-HCMV antibody which is effective in the present invention by SDS-PAGE.
- FIG. 4 shows the results of confirming the antigen specificity of the anti-HCMV antibody according to the present invention by Western plotting.
- FIG. 5 shows the results of evaluating the neutralizing activity of anti-HCMV antibodies related to the present invention.
- FIG. 6 shows the results of confirmation of anti-HCMV antibody production by introduction of anti-HCMV antibody gene into 293T cells using West Lot lot.
- FIG. 7 shows the results of confirming anti-HCMV antibody production by introduction of anti-HCMV antibody gene into 293T cells by ELI SA method.
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Abstract
（課題）本発明は、例えば免疫不全状態において、様々な疾病状態を導く原因となるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）に対し、親和性および中和能に優れたヒトのモノクローナル抗体並びにその抗原結合部分の提供を目的とする。
（解決手段）ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）に結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノクローナル抗体であって、配列番号１のアミノ酸配列で示される軽鎖（Ｌ鎖）と、配列番号２のアミノ酸配列で示される重鎖（Ｈ鎖）を有することを特徴とする抗ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）モノクローナル抗体とする。
Description
明 細 書
ヒトサイトメガロウィルスに結合するヒトのモノクローナル抗体並びにその抗 原結合部分
技術分野
[0001] 本発明はヒトサイトメガロウィルス (human Cytomegalovirus) (以下「HCMV」と称す 場合がある）に結合するヒトのモノクローナル抗体、並びにその抗原結合部分に関す る。
背景技術
[0002] ヒトサイトメガロウィルス (HCMV)は、ヒトヘルぺスウィルス 6 (HHV-6)ゃヒトヘル ぺスウィルス 7 (HHV- 7)と同じへルぺスウィルス科 13ヘルぺスウィルス亜科に属し 、直径約 180nm、 200以上の遺伝子をコードする 230kbpからなる 2本鎖 DNAウイ ルスで、ヘルぺスウィルス科の中では最大である。
HCMVは、種特異性が強いのでヒト以外の動物には感染しないが、ヒトには広く感 染し、ヒトの体内においては広汎な組織に親和性がある。
しかも一度感染すると宿主の免疫が確立した後も排除されることなく終生維持され ることとなる。
[0003] 一度感染すると生涯にわたって潜状する HCMVは、成人の 9割以上が既に感染し てウィルスを保有して 、る力 健常人には無害なウィルスである。
しかしながら、免疫不全状態にある血液透析者、癌患者、免疫抑制剤使用者、 HI
V感染者、骨髄移植や臓器移植を受けた患者などの免疫不全者が、この HCMVに 感染すると、 HCMVの再活性化が起こり、間質性肺炎、網膜炎、胃腸炎、脳炎など の致死的な病気が発症する。
又、妊婦力 胎児へ HCMV感染が波及することによる巨細胞封入体症によって、 流産、死産、生後間もない死亡を引き起こし、死亡しない場合も小頭症、精神発育障 害、知能発達遅延や聴覚障害などを引き起こす。
[0004] 上記 HCMVによる致死的な病態の発症を抑制、若しくはその病態を緩和すること ができる予防乃至治療薬として、 HCMVの増殖を抑える抗ウィルス薬『ガンシクロビ
ル』が開発されて!ヽる (非特許文献 1)。
ガンシクロビルは DNAポリメラーゼを阻害することでウィルス DNAの合成を妨害す る抗ウィルス薬で、主にエイズなど免疫不全状態におけるサイトメガロウィルス網膜炎 の治療や、 CD4リンパ球数 lOOZmm3以下の進行した HIV感染症におけるサイトメ ガロウィルス網膜炎の発症抑制に使用されており、認可も受けている。
し力しながら、ガンシクロビルには造血阻害など種々の副作用があることが報告され ており、その使用態様は上記の如ぐ極限られたものとなる。
[0005] ガンシクロビルの副作用として、最も頻度が高ぐ注意を要するのは、骨髄抑制に伴 う血液障害である。白血球や赤血球、血小板が異常に減少し、その初期症状として、 発熱や喉の痛み、異常なだるさ、皮下出血等の出血傾向が認められる。場合によつ ては、精神神経系に異常が見られ、頭痛、目眩、不眠、思考の異常、不安感等を生 じる。
又、動物実験では催奇形作用が報告されており、妊娠中は使用することができない その他、先天性 HCMV感染症の重症例にガンシクロビルを使用することで、神経 学的後遺症発現の減少や難聴の進行改善等の効果があるとされて 、るが (非特許 文献 2)、やはりガンシクロビルの副作用である骨髄抑制、不妊症の問題については 十分かつ慎重な検討が必要となる。
[0006] 以上より、上述した HCMVによる致死的な疾病症状を予防、若しくは緩和すること ができ、且つ副作用のない予防乃至治療薬の開発が強く望まれていた。
そこで、 HCMVに結合し、その感染性を中和すること (その生物学的活性を喪失さ せること）のできる抗体 (以下「抗 HCMV抗体」と称す場合がある）は、 HCMVによる 致死的な病態の予防乃至治療薬として期待できるので、例えば、免疫不全状態にお いて、 HCMVが原因となって引き起こされる様々な疾病に対する予防乃至治療戦略 上、有用である。
即ち、 HCMVの活性を喪失させて疾病症状を予防、若しくは緩和するのに、 HCM Vに対して強 、親和性及び中和能をもち、且つ拒絶反応を示さな ヽ抗 HCMV抗体 を、所謂「抗体医薬」として投与するのが有効であると考えられた。
[0007] し力しながら、現在までに報告されて!、る HCMV阻害抗体 (例えば、特許文献 1、 2 )では、 HCMVに対して親和性及び中和能の点において十分ではなかったので、天 然の HCMVの生物活性を充分に阻止し、 HCMVによって引き起こされる様々な疾 病症状を予防、若しくは緩和することを期待できるには至らな力つた。
その為、異物認識応答を起こさないヒトのモノクローナル抗体であって、 HCMVに 対する親和性、特異性及び中和能に優れ、予防乃至治療薬としてもその活用を期待 することのできる抗 HCMV抗体、並びにその抗原結合部分の開発が強く望まれてい た。
[0008] 非特許文献 1： AIDS/HIV Treatment Directory Vol.5, No.2 (Fall), 1991, pp 43-45. A merican Foundation for AIDS Research (AmFAR)
非特許文献 2 : Whitley RJ, et al. Ganciclovir treatment of symptomatic congenital cy tomegalovirus infection:results of a phase II study. National Institute of Allergy and I nfectious Diseases Collaborative Antiviral Study Group. J Infect Dis. 1997;175:1080 - 6.
特許文献 1：特表平 8 - 502403号公報
特許文献 2：特表平 8 - 506325号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明は、例えば免疫不全状態において、様々な疾病状態を導く原因となる HC
MVに対し、親和性および中和能に優れたヒトのモノクローナル抗体並びにその抗原 結合部分の提供を目的とする。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者らは、 HCMVに対して、親和性および中和能に優れるヒトのモノクローナ ル抗体を創意工夫により見出し、本発明を完成するに至った。
[0011] 即ち、請求項 1に係る発明は、 HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトの モノクローナル抗体であって、配列番号 1のアミノ酸配列で示される軽鎖 (L鎖）と、配 列番号 2のアミノ酸配列で示される重鎖 (H鎖）を有することを特徴とする抗 HCMVモ ノクローナル抗体に関する。
請求項 2に係る発明は、前記軽鎖 (L鎖)及び Z又は重鎖 (H鎖）において、一個以 上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴 とする請求の範囲第 1項に記載の抗 HCMVモノクローナル抗体に関する。
請求項 3に係る発明は、 HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノク ローナル抗体またはその抗原結合部分であって、配列番号 3のアミノ酸配列で示さ れる軽鎖可変部領域 (LCVR)と、配列番号 4のアミノ酸配列で示される重鎖可変部 領域 (HCVR)を有することを特徴とする抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗 原結合部分に関する。
請求項 4に係る発明は、前記軽鎖可変部領域 (LCVR)及び Z又は重鎖可変部領 域 (HCVR)において、一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたァ ミノ酸配列を有することを特徴とする請求の範囲第 3項に記載の抗 HCMVモノクロ一 ナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
請求項 5に係る発明は、 HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノク ローナル抗体またはその抗原結合部分であって、配列番号 5〜 10からなる群より選 択される何れか一つ以上のアミノ酸配列で示される相補性決定領域 (CDR)を有す ることを特徴とする抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する 請求項 6に係る発明は、 HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノク ローナル抗体であって、配列番号 5のアミノ酸配列を有する軽鎖 (L鎖） CDR1ドメイ ンと、配列番号 6のアミノ酸配列を有する軽鎖 (L鎖） CDR2ドメインと、配列番号 7の アミノ酸配列を有する軽鎖 (L鎖) CDR3ドメインとからなる群カゝら選択された CDRドメ インを含むことを特徴とする、抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部 分に関する。
請求項 7に係る発明は、 HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノク ローナル抗体であって、配列番号 8のアミノ酸配列を有する重鎖 (H鎖） CDR1ドメイ ンと、配列番号 9のアミノ酸配列を有する重鎖 (H鎖） CDR2ドメインと、配列番号 10 のアミノ酸配列を有する重鎖 (H鎖) CDR3ドメインとからなる群力も選択された CDR ドメインを含むことを特徴とする、抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合
部分に関する。
請求項 8に係る発明は、前記相補性決定領域 (CDR)において、一個以上のァミノ 酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求 の範囲第 5〜7項いずれか記載の抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結 合部分に関する。
請求項 9に係る発明は、 HCMVに対する親和性 (ァフィ-ティー（M) )力 K = 1.
d
0 X 10"11 (M)〜1. 3 X 10"11 (M)であることを特徴とする請求の範囲第 1〜8項 ヽ ずれか記載の抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。 請求項 10に係る発明は、約 1 μ gZmLで、 80%以上の HCMV感染阻止率を示 すことを特徴とする請求の範囲第 1〜9項いずれか記載の抗 HCMVモノクローナル 抗体またはその抗原結合部分に関する。
請求項 11に係る発明は、抗体のクラス (サブクラス）が IgG ( κ )であることを特徴と する請求の範囲第 1〜10項いずれか記載の抗 HCMVモノクローナル抗体またはそ の抗原結合部分に関する。
請求項 12に係る発明は、請求の範囲第 1〜11項いずれか記載のヒトモノクローナ ル抗体またはその抗原結合部分を含む、 HCMVにより弓 Iき起こされる疾病に対する 予防乃至治療薬に関する。
請求項 13に係る発明は、前記 HCMVにより引き起こされる疾病が、（a)免疫不全 状態における HCMVの再活性ィ匕による間質性肺炎、網膜炎、胃腸炎、脳炎、（b)妊 婦力 胎児へ HCMV感染が波及することによる巨細胞封入体症、（c)前記巨細胞 封入体症により引き起こされる流産、死産、生後間もない死亡、（d)前記巨細胞封入 体症により死亡しない場合における小頭症、精神発育障害、知能発達遅延や聴覚 障害力もなる群より選択される何れか一つである請求の範囲第 12項に記載の予防 乃至治療薬に関する。
請求項 14に係る発明は、 HCMVに結合し、その生物活性を中和し得る抗 HCMV モノクローナル抗体又はその抗原結合部分をコードする DNAであって、配列番号 1 〜： L0力もなる群力も選択されたァミノ配列をコードする単離された DNAに関する。 請求項 15に係る発明は、請求の範囲第 14項に記載の DNAと、ストリンジヱントな
条件下でノ、イブリダィズする単離された DNAに関する。
請求項 16に係る発明は、請求の範囲第 14項又は第 15項に記載の単離 DNAを組 込んだベクター (植物発現ベクターを除く）に関する。
請求項 17に係る発明は、内部に請求の範囲第 16項の組換え発現ベクターが導入 された、宿主細胞 (植物細胞を除く）に関する。
発明の効果
[0012] 本発明に係る抗 HCMV抗体またはその抗原結合部分は、例えば免疫不全状態に おいて、様々な疾病の原因となる HCMVに特異的に結合し、その生物活性を喪失（ 中和）させ、（HCMVに対して)優れた親和性および中和能を発揮することができる。 又、ヒトのモノクローナル抗体である為、免疫原性を有さず、拒絶反応も見られない。
[0013] 以上の性質より、本発明に係る抗 HCMV抗体またはその抗原結合部分は、 HCM Vに対して強い親和性及び中和能をもつ上、拒絶反応も見られないので、
HCMVが原因となって引き起こされる様々な疾病、例えば、（a)エイズ、癌、臓器 移植後、骨髄移植後、血液透析後などの免疫不全状態における HCMVの再活性 化による間質性肺炎、網膜炎、胃腸炎、脳炎などの致死的な病気や、（b)妊婦から 胎児へ HCMV感染が波及することによる巨細胞封入体症、 (c)前記巨細胞封入体 症により引き起こされる流産、死産、生後間もない死亡、（d)前記巨細胞封入体症に より死亡しない場合における小頭症、精神発育障害、知能発達遅延や聴覚障害など の予防乃至治療薬として有用であると考えられる。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 以下に本願発明に係る抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に ついて説明する。
[0015] 本明細書で使用される「抗体」という用語は、 4本のポリペプチド鎖、 2本の重 (H)鎖 および 2本の軽 (L)鎖であってジスルフイド結合によって相互接続されたものからなる 免疫グロブリン分子の他、 2本のポリペプチド鎖、 1本の重 (H)鎖および 1本の軽 (L) 鎖であってジスルフイド結合によって相互接続されたものからなる免疫グロブリン分子 も指すものとする。
抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）という用語は、抗原 (例えば HCM
V)に特異的に結合する能力を持つ 1つ又は複数の抗体のフラグメントを指す。
「HCMV活性を中和し得る抗体」とは、 HCMVに結合することによって HCMVの 生物学的活性を阻害する抗体を指すものとする。
[0016] 本明細書で使用される、例えば「阻害効果」、「阻害」、「阻害し得る」等々の用語は
、源が何であれ、天然の HCMVの観察される生物活性を約 5〜： LOO%低減させる抗 体を称する。好ましくは、治療投与の為には、 HCMVの観察される生物活性の低減 は、約 50〜 100%の範囲にある。
[0017] 本願発明の一態様は、 HCMVに特異的に結合し、その生物活性を中和し得るヒト モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、配列番号 1のアミノ酸配列で 示される軽鎖と、配列番号 2のアミノ酸配列で示される重鎖を有することを特徴とする 抗 HCMVモノクローナル抗体に関する。
HCMVに特異的に結合し、その生物活性を中和し得るヒトモノクローナル抗体また はその抗原結合部分であれば、
軽鎖 (L鎖）において、配列番号 1のアミノ酸配列から一個以上のアミノ酸が欠失、 置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有する抗 HCMVモノクローナル抗体ま たはその抗原結合部分も本願発明に含まれるし、
重鎖 (H鎖）において、配列番号 2のアミノ酸配列力 一個以上のアミノ酸が欠失、 置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有する抗 HCMVモノクローナル抗体も 本願発明に含まれる。
[0018] 各 H鎖は、 H鎖可変部領域（「HCVR」または「V」と称す場合がある）と H鎖不変
H
部領域 (H鎖不変部領域は 3つのドメイン力もなり、それぞれ「C 1」、 「C 2」、 「C 3」
H H H
と称す場合がある)からなる。
各 L鎖は、 L鎖可変部領域（「LCVR」または「V」と称す場合がある）と L鎖不変部
し
領域 (L鎖不変部領域は 1つのドメイン力もなり、「C」と称す場合がある）からなる。
し
特に HCVRおよび LCVRは、抗体の結合特異性に関与する点で重要である。
[0019] そこで本願発明の別の態様としては、 HCMVに特異的に結合し、その生物活性を 中和し得るヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、配列番号 3の アミノ酸配列で示される軽鎖可変部領域 (LCVR)と、配列番号 4のアミノ酸配列で示
される重鎖可変部領域 (HCVR)を有することを特徴とする抗 HCMVモノクローナル 抗体またはその抗原結合部分に関する。
[0020] HCMVに特異的に結合し、その生物活性を中和し得るものであれば、前記軽鎖可 変部領域 (LCVR)及び重鎖可変部領域 (HCVR)において、一個以上のアミノ酸が 欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする抗 HCM Vモノクローナル抗体またはその抗原結合部分も本願発明に含まれるし、前記 LCV R、 HCVRのどちらか一方において、一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しく は付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする抗 HCMVモノクローナル抗体ま たはその抗原結合部分も本願発明に含まれる。
[0021] ここで可変部領域のアミノ酸配列は、大半の抗体 抗原相互作用を担っているた め、特定の天然発生型の抗体を由来とする可変部領域配列を、異なる性質を持った 異なる抗体由来のフレームワーク配列に移植した状態で含有するような発現ベクター を構築すると、特定の天然発生型抗体の性質を模倣する組換え抗体を発現させるこ とがでさる。
そのために、もとの抗体のものと同様な結合特性を有するインタタト組換え抗体を作 り直す際に、特定の抗体の配列全体を得る必要はない。通常、可変部領域にわたる 部分的重鎖及び軽鎖配列があれば、この目的にとって充分である。
[0022] HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノクローナル抗体またはその 抗原結合部分であれば、配列番号 3又は 4のアミノ酸配列で示される可変部領域を 有することを特徴とする抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は本 願発明に含まれるし、前記可変部領域において、一個以上のアミノ酸が欠失、置換、 挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする抗 HCMVモノクロ一 ナル抗体またはその抗原結合部分も本願発明に含まれる。
[0023] 抗体は LCVR及び HCVRのアミノ酸残基を主に通じて標的抗原と相互作用するの で、可変部領域内のアミノ酸配列は可変部領域の外にある配列よりも個々の抗体間 の違いが大きい。 HCVR及び LCVRは、より一定に保たれたフレームワーク領域（F R)と呼ばれる領域が散在する相補性決定領域 (CDR)と呼ばれる超可変性の領域 にさらに細分することができる。
HCVR及び LCVRは、それぞれ 3つの CDRおよび 4つの FRからなり、これらは FR 1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 FR4の順序でァミノ末端からカルボキシ末 端まで配列される。
[0024] そこで、本願発明の更なる別の態様としては、 HCMVに結合し、その生物活性を 中和し得るヒトのモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、配列番号 5 〜10からなる群から選択される何れか一つ以上のアミノ酸配列で示される相補性決 定領域 (CDR)を有することを特徴とする抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗 原結合部分に関する。
HCMVに特異的に結合し、その生物活性を中和し得るヒトモノクローナル抗体また はその抗原結合部分であれば、前記相補性決定領域 (CDR)において、一個以上 のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴と する抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分も本願発明に含まれる。
[0025] 本願発明の更なる態様として、 HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトの モノクローナル抗体であって、配列番号 5のアミノ酸配列を有する軽鎖 (L鎖） CDR1 ドメインと、配列番号 6のアミノ酸配列を有する軽鎖 (L鎖) CDR2ドメインと、配列番号 7のアミノ酸配列を有する軽鎖 (L鎖) CDR3ドメインとからなる群力 選択された CDR ドメインを含むことを特徴とする、抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合 部分に関する。
HCMVに特異的に結合し、その生物活性を中和し得るヒトモノクローナル抗体また はその抗原結合部分であれば、前記軽鎖の相補性決定領域 (CDR)において、一 個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを 特徴とする抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分も本願発明に含 まれる。
[0026] 本願発明の更なる態様として、 HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトの モノクローナル抗体であって、配列番号 8のアミノ酸配列を有する重鎖 (H鎖） CDR1 ドメインと、配列番号 9のアミノ酸配列を有する重鎖 (H鎖) CDR2ドメインと、配列番 号 10のアミノ酸配列を有する重鎖 (H鎖) CDR3ドメインとからなる群力も選択された CDRドメインを含むことを特徴とする、抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗原
結合部分に関する。
HCMVに特異的に結合し、その生物活性を中和し得るヒトモノクローナル抗体また はその抗原結合部分であれば、前記重鎖の相補性決定領域 (CDR)において、一 個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを 特徴とする抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分も本願発明に含 まれる。
[0027] 本発明に力かる抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、 HCM V上に存在する特定の抗原決定基 (ェピトープ)と特異的に結合し、その生物活性を 中和し得るものである。
[0028] 以上のとおり、本発明に係る抗 HCMVモノクローナル抗体又はその抗原結合部分 の特定態様について特記したが、変化、変形をなし得るものであり、これらは本願発 明の技術的範囲内に属するものである。
即ち、本願発明の抗体は、完全長の抗体又はその抗原結合部分であってもよぐ 可変部領域や、相補性決定領域 (CDR)を示す、配列番号 3〜 10のアミノ酸配列を もとにすれば、当該技術分野における周知の技術によって、 HCMVに特異的に結 合し、その生物活性を中和し得る組換えヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合 部分を得ることができるが、これらは本願発明の技術的範囲内に属するものである。
[0029] 例えば、重鎖及び軽鎖リーダ配列はタンパク質成熟の過程で切断され、最終的な 抗体の特性には寄与しないが、欠けている配列を追加するためには、クローンィ匕され た cDNA配列を、ライゲーシヨン又は PCR増幅法により、合成オリゴヌクレオチドに組 み合わせることができる。
代替的には、可変領域全体を一組の短い、重複のあるオリゴヌクレオチドとして合 成し、 PCR増幅法で組み合わせて、完全に人工的な可変領域クローンを作製するこ とちでさる。
[0030] そこで本願発明の別の態様としては、 HCMVに結合し、その生物活性を中和し得 る抗 HCMVモノクローナル抗体又はその抗原結合部分をコードする DNAであって 、配列番号 1〜： LOからなる群から選択されたァミノ配列をコードする単離された DNA に関する。
HCMVに結合し、その生物活性を中和し得る抗 HCMVモノクローナル抗体又は その抗原結合部分をコードする DNAであれば、前記 DNAと、ストリンジェントな条件 下でノ、イブリダィズする単離された DNAも本願発明に含まれる。
[0031] 上記した単離 DNAを組込んだベクター、並びに、該組換え発現ベクターが導入さ れた、宿主細胞も本願発明に含まれる。
但し、ここでいう組換え発現ベクターおよび宿主細胞は、本願発明の組換えヒト抗 体を発現する為のものなので、動物細胞、特に哺乳動物細胞であるのが望ましぐ植 物発現ベクターや、植物細胞は除かれる。
[0032] その他、近年開発された、遺伝子工学技術を活用して組み換え抗体 (リコンビナン ト抗体)をファージ表面に発現させる、ファージディスプレイ抗体技術により、人工的 に V 、 V遺伝子をシャッフリングさせ多様化した scFv (single chain Fragment of
H L
variable region)抗体をファージ融合タンパクとして発現させ、特異抗体を得ることも できる。
該技術は、免疫を回避でき、さらに細胞融合法に変わるヒト化抗体作製技術として 高く評価されているが、本願明細書における配列番号 1〜10のアミノ酸配列を参考 に作製した特異抗体又はその抗原結合部分であれば、本願発明の技術的範囲内に 属する。
[0033] 上述した本発明に係る抗 HCMV抗体またはその抗原結合部分は、例えば、免疫 不全状態において、様々な疾病の原因となる HCMVに特異的に結合し、その生物 活性を中和することができるが、とくに高い親和性と中和能を特徴とする。
[0034] ここで「特異的結合」とは、所定の抗原への抗体の結合を言う。典型的には、抗体 は少なくとも約 1 X 10_7 (M)の親和性で結合し、所定の抗原に対しては、前記所定 の抗原又は関係の近い抗原以外の非特異的な抗原 (例えば BSA、カゼイン）に対す るその結合親和性よりも少なくとも 2倍高い親和性で結合する。
ここで、或 IgG抗体に対する「高親和性」とは、少なくとも約 1 X 10"7 (M)、好ましく は少なくとも約 1 X 10_8 (M)、より好ましくは少なくとも約 1 X 10_9 (M)、そしてさらに より好ましくは少なくとも約 1 X 10_1C) (M)の結合親和性を言う。しかしながら、「高親 和性」結合は他の抗体アイソタイプでは様々であり、例えば IgMアイソタイプにとって
の「高親和性」結合とは、少なくとも約 1 X 10_7 (M)の結合親和性を言う。
[0035] 本発明に係る抗 HCMV抗体またはその抗原結合部分の親和性は、解離定数とし て、通常、 K = 1. Ο Χ 10_ 11 (Μ)〜1. 3 X 10_ 11 (M)の性質を有する。
d
また、本発明に係る抗 HCMV抗体またはその抗原結合部分は、通常、約 1 μ gZ mLで、 80%以上の感染阻止率を示すので、有効な中和能を有するといえる。
[0036] その他、本願発明の一態様として、力かる抗 HCMVモノクローナル抗体のクラス ( サブクラス）が IgG ( κ )であることを特徴とする。
IgGは物質として安定で、親和性が高 、ことが知られて 、る。
一方、 IgMはすぐに凝集しまい、親和性も低いことが知られている。
[0037] 上述した性質、即ち、本発明に係る抗 HCMV抗体又はその抗原結合部分は、 HC MVに対して強い親和性及び中和能をもつので、 HCMVが原因となって引き起こさ れる様々な疾病、例えば、（a)エイズ、癌、臓器移植後、骨髄移植後、血液透析後な どの免疫不全状態における HCMVの再活性ィ匕による間質性肺炎、網膜炎、胃腸炎 、脳炎などの致死的な病気や、（b)妊婦力 胎児へ HCMV感染が波及することによ る巨細胞封入体症、（c)前記巨細胞封入体症により引き起こされる流産、死産、生後 間もない死亡、（d)前記巨細胞封入体症により死亡しない場合における小頭症、精 神発育障害、知能発達遅延や聴覚障害などの予防乃至治療薬としても期待できる。
[0038] 本明細書で使用される「HCMVにより引き起こされる疾病」という用語は、その疾患 にかかって 、る被験対象が HCMVを持って 、ることがその疾患の病態生理の原因 でありまたはその疾患を悪ィ匕させる一因である、ということが示されまたはそうであると 考えられる疾病およびその他の疾患を含むものとする。
従って、 HCMV活性が害となる疾患は、 HCMV活性の阻害によってその疾患の 症状および Zまたは進行が緩和されることが予測される疾患である。
このような疾患は、例えば上述の抗 HCMV抗体を使用して検出することが可能な、 その疾患に力かっている被験対象の生物学的流体中の HCMV濃度を高める（例え ば、被験対象の血清や血漿、滑液中の HCMVの濃度を高める）ことによって証明す ることがでさる。
[0039] さらに本発明に係る抗 HCMVモノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、血清
中の抗 HCMV抗体が陽性であるヒトの血液力ゝら単核球を分離し、その単核球から T 細胞を除去し、その後に EBVに感染させ、増殖してきた抗体産生細胞から得られた ものであるので、完全なヒトのモノクローナル抗体である。
その為、 HCMVによる致死的な病態の発症を抑制、若しくは HCMVによる病態を 緩和する為の抗体医薬として人体に投与したとしても、免疫原性を有さず、拒絶反応 は見られないものと考えられる。
実施例
[0040] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例 により何ら制限されるものではない。
[0041] 1. HCMV抗体産生細胞クローンの分離
図 1は、抗体産生細胞クローンの分離までのフローチャートである。
血清中の抗 HCMV抗体が高値であるヒトの血液力も単核球を分離した。 単核球から T細胞を除去し、その後 EBVに感染させ増殖してきた細胞を抗体産生 細胞ライブラリとした。
[0042] 抗体産生細胞ライブラリは 96wellプレートに播種し、およそ 3〜4週間の培養後、培 養上清中の抗 HCMV抗体の 1stスクリーニングを行った。
スクリーニングは HCMVの主要な中和ェピトープの 1つである AD1に対する抗体を ターゲットにし、 GST融合 HCMV— AD1をコートした 96wellプレートを用いて、 ELI SA法により行った。
得られた抗体陽性細胞集団は新たな 96wellプレートに細胞濃度を薄くして播種し
、細胞増殖の助けとなるようにフィーダ一セルを添加した。
3〜4週間培養した後に抗 HCMV抗体の 2ndスクリーニングを行った。
得られた抗体陽性細胞集団は新たな 96wellプレートに限界希釈で播種し、この段 階にも細胞増殖の助けとなるようにフィーダ一セルを添加した。
3〜5週間培養した後に、抗 HCMV抗体の 3rdスクリーニングを行った。 得られた抗体陽性細胞集団は限界希釈による培養とスクリーニングを行 ヽ、 well当 たり 1個まきのプレートから抗体陽性細胞が得られた。
[0043] 2.抗体アイソタイプの確認
分離した抗体産生細胞クローンについて産生する抗体のアイソタイプを確認した。 確認の方法はスクリーニングと同様の ELISAシステムを利用し、 2次抗体としてそれ ぞれのアイソタイプに特異的な抗体を使用した。サンプルはクローン分離後の細胞培 養上清を用いた。その結果、得られた抗 HCMV抗体は IgG、 κであった（図 2)。
[0044] 3.抗体精製
抗 HCMV抗体の精製は ProteinAを用いたァフィユティー精製で行った。カラムは H iTrap rProtein A FF (Amersham)のプレパックカラム使用し、精製条件はカラムメーカ 一の推奨条件とした。
図 3は SDS— PAGE結果である。
精製後、 50kDaの抗体 H鎖と 25kDaの抗体 L鎖が確認できた。
精製後の抗体は ELISAで HCMV抗体活性が保持されていることを確認した。
[0045] 4.抗 HCMV抗体の抗原特異性の確認
抗 HCMV抗体のスクリーニングにおいては対象抗原のェピトープ部分のみを GST に融合させた GST融合タンパク質を抗原として使用して 、ることから、完全な HCM V抗原に対する特異性を確認する必要がある。
そこで、精製した抗 HCMV抗体が HCMV— AD1に特異的に結合するかどうかを 、ウェスタンブロット法による HCMV— AD1の検出により確認した。
HCMV— AD1は HCMV— AD2とともに gB (糖タンパク質 B)を形成し、 HCMV の主要なエンベロープタンパク質である。
HCMV感染細胞において、 gBは細胞膜上に存在していることから、サンプルとし て HCMV感染細胞を用意することにした。細胞はヒト胎児肺線維芽細胞 (HEL)を 用い、 HCMV (AD169株）を感染させ 2日間培養した。
この HCMV感染細胞のライセートを SDS— PAGEにかけ、ニトロセルロースメンブ レンにプロットした。 1次抗体として精製 HCMV抗体を 2次抗体としてペルォキシダー ゼ標識された Anti-human IgG抗体 (株式会社医学生物学研究所)を使用した。 検出には ECL試薬 (アマシャム'バイオサイエンス株式会社)を用いた。 図 4は、抗 HCMV抗体の抗原特異性をウェスタンブロットで確認した結果である。 未感染 HEL細胞では全くバンドが検出されなかった力 HCMV感染 HEL細胞で
は HCMV—ADlの分子量 55kDaのところに特異的なバンドが検出された。
この結果から抗 HCMV抗体（G3D No.9)は HCMV— AD1に対する特異性を持つ ていることが確認できた。
[0046] 5.抗 HCMV抗体のァフィ-ティー解析
抗 HCMV抗体のァフィユティー解析はビアコア株式会社に依頼した。
解析方法は抗原をセンサーチップに固定ィ匕し、抗原固定ィ匕表面に抗体を添加して 相互作用を測定するものである。
抗原は GST融合 HCMV— AD 1を、コントロールとしては GSTを使用した。 その結果、ァフィユティーは解離定数として、 1. 16 X 10_ 11 (M)であった。
[0047] 6.抗 HCMV抗体の中和活性評価
抗 HCMV抗体 (G3D No.9)の有効性評価として中和活性を確認した。中和活性は HEL (ヒト胎児肺線維芽細胞）に対する HCMV (AD169株)感染の抗体による阻止 率で評価した。方法はウィルス液と精製抗体 (G3D No.9)に補体（5%)を加え 37°C で 1時間置き、その後、 HEL細胞に接種（37°C、 1時間）した。
細胞は洗浄後 2日間培養し、 HCMVの感染早期発現タンパク質である pp65を細 胞免疫染色により検出するものとした。
図 5は、抗 HCMV抗体の中和活性を評価した結果である。 G3D No.9抗体は 1 μ g Zmlで 80%以上の感染阻止率を示し、有効な中和活性を有することが確認できた。
[0048] 7.抗体産生細胞からの抗体遺伝子のクローニング
抗体遺伝子のクローユングは PCR法により行った。抗 HCMV抗体産生細胞クロー ンから totaHRNAを抽出した。抽出した totaHRNAから Oligo- dT Primerと Reverse Tr anscriptaseを用い cDNA合成を行った。
抗体遺伝子は H鎖、 L鎖の何れも^末端側に可変領域をコードし、抗体によりシー クエンスは多様である。 3,末端側は定常領域であり、抗体遺伝子間でよく保存されて いる。抗体遺伝子シークェンスのデータベースをもとに、 5'末端側は転写開始点を 含むように、 3,末端側は転写終結点を含むように以下、表 1の primerを設計し、合成 した cDNAをテンプレートとして抗体遺伝子の増幅を行った。
[0049] [表 1]
* light chain；
Light kappa FW primer (δ' CACCTTCTCACAATGAGGCTCC 3')
Light— loppa RV primer (o― -ACTTClし OC1し fAA CT - I'Gし—3 )
■ heavy chain ：
¾avv^mma FW p隱 r (δ' GAACACAQAG CTCAOCATGQA 3')
hfeavy - amma RV primer (5 - GCCGTCGCACTOATTTACCCGGA -3
[0050] 8.抗体遺伝子の塩基配列に基づく抗体のアミノ酸配列の決定
抗体遺伝子の塩基配列は ABIのシークェンサ一を用いて行った。得られた塩基配 列に基づく抗 HCMV抗体のアミノ酸配列を配列番号 1乃至 10に示す。
[0051] 9.得られた抗体遺伝子が抗 HCMV抗体をコードしていることの確認
得られた抗体遺伝子 (H鎖 'L鎖）の cDNAクローンをそれぞれプラスミドベクター p SG5に挿入した。両プラスミドを 293T細胞に導入し、一過性での抗体発現の確認を 行った。形質導入はリボフヱクタミン (インビトロジェン株式会社)とプラス試薬 (インビト ロジェン株式会社）による方法を採用した。コントロールとして pEGFPを形質導入し、 GFP発現細胞を蛍光顕微鏡下で観察することで形質導入の効率を確認した。効率 は 50%〜60%であった。
図 6は、形質導入から 2日後の 293T細胞のライセートを使用し、ヒト抗体を検出した ウェスタンブロットの結果である。
検出にはペルォキシダーゼ標識抗ヒト IgG H+L (アマシャム'バイオサイエンス株 式会社)を使用し、 1ステップで検出した。その結果、形質導入した細胞においてヒト 抗体の H鎖（50kDa)と L鎖（25kDa)を確認することができた（図 6)。
[0052] 次に同様の形質導入試験による抗体の分泌および抗原特異性の保持を確認した 形質導入から 24時間後および 48時間後の細胞培養上清を採取し、 ELISAによる ヒト IgG抗体の検出および HCMV特異的抗体の検出を行った。
図 7は、 293T細胞への抗 HCMV抗体遺伝子の導入による抗 HCMV抗体産生を ELISA法で確認した結果である。
ELISAのコントロールとして精製抗体の希釈系列を使用した。
形質導入のコントロールは上記と同様 pEGFPを形質導入した細胞の培養上清を 使用した。抗体遺伝子を一過性に発現させた細胞の培養上清力 はいずれもヒト Ig
Gが確認できた。また、分泌された抗体はいずれも HCMVに対する特異性を保持し ていることが確認できた（図 7)。
[0053] このようにして得られた抗 HCMV抗体またはその抗原結合部分は、様々な疾病の 原因となる HCMVに特異的に結合し、その生物活性を喪失（中和）させ、（HCMV に対して)優れた親和性および中和能を発揮することができる。又、ヒトのモノクロ一 ナル抗体である為、免疫原性を有さず、拒絶反応も見られない。
以上の性質より、本発明に係る抗 HCMV抗体またはその抗原結合部分は、 HCM Vが原因となって引き起こされる様々な疾病、例えば (a)エイズ、癌、臓器移植後、骨 髄移植後、血液透析後などの免疫不全状態における HCMVの再活性ィ匕による間質 性肺炎、網膜炎、胃腸炎、脳炎などの致死的な病気や、（b)妊婦から胎児へ HCMV 感染が波及することによる巨細胞封入体症、（c)前記巨細胞封入体症により引き起こ される流産、死産、生後間もない死亡、（d)前記巨細胞封入体症により死亡しない場 合における小頭症、精神発育障害、知能発達遅延や聴覚障害などの予防ないし治 療薬として有用であると考えられる。
図面の簡単な説明
[0054] [図 1]本発明に力かる抗 HCMV抗体を産生する抗体産生細胞クローン分離の手順 をフローチャートで表した図である。
[図 2]本発明に力かる抗 HCMV抗体につ!、て、そのアイソタイプを ELISA法で確認 した結果である。
[図 3]本発明に力かる抗 HCMV抗体を SDS— PAGEで確認した結果である。
[図 4]本発明にカゝかる抗 HCMV抗体の抗原特異性をウェスタンプロットで確認した結 果である。
[図 5]本発明にカゝかる抗 HCMV抗体の中和活性を評価した結果である。
[図 6]293T細胞への抗 HCMV抗体遺伝子の導入による抗 HCMV抗体産生をゥェ スタンプロットで確認した結果である。
[図 7]293T細胞への抗 HCMV抗体遺伝子の導入による抗 HCMV抗体産生を ELI SA法で確認した結果である。
Claims
[1] HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノクローナル抗体であって、配 列番号 1のアミノ酸配列で示される軽鎖 (L鎖）と、配列番号 2のアミノ酸配列で示され る重鎖 (H鎖）を有することを特徴とする抗 HCMVモノクローナル抗体。
[2] 前記軽鎖 (L鎖)及び Z又は重鎖 (H鎖）にお 、て、一個以上のアミノ酸が欠失、置換 、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求の範囲第 1項に 記載の抗 HCMVモノクローナル抗体。
[3] HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノクローナル抗体またはその抗 原結合部分であって、配列番号 3のアミノ酸配列で示される軽鎖可変部領域 (LCVR )と、配列番号 4のアミノ酸配列で示される重鎖可変部領域 (HCVR)を有することを 特徴とする抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[4] 前記軽鎖可変部領域 (LCVR)及び Z又は重鎖可変部領域 (HCVR)にお 、て、一 個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを 特徴とする請求の範囲第 3項に記載の抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗 原結合部分。
[5] HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノクローナル抗体またはその抗 原結合部分であって、配列番号 5〜 10からなる群より選択される何れか一つ以上の アミノ酸配列で示される相補性決定領域 (CDR)を有することを特徴とする抗 HCMV モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[6] HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノクローナル抗体であって、配 列番号 5のアミノ酸配列を有する軽鎖 (L鎖） CDR1ドメインと、配列番号 6のアミノ酸 配列を有する軽鎖 (L鎖) CDR2ドメインと、配列番号 7のアミノ酸配列を有する軽鎖（ L鎖) CDR3ドメインとからなる群カゝら選択された CDRドメインを含むことを特徴とする 、抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[7] HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノクローナル抗体であって、配 列番号 8のアミノ酸配列を有する重鎖 (H鎖) CDR1ドメインと、配列番号 9のアミノ酸 配列を有する重鎖 (H鎖) CDR2ドメインと、配列番号 10のアミノ酸配列を有する重鎖 (H鎖) CDR3ドメインとからなる群カゝら選択された CDRドメインを含むことを特徴とす
る、抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[8] 前記相補性決定領域 (CDR)にお 、て、一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若 しくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求の範囲第 5〜7項 、ずれ か記載の抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[9] HCMVに対する親和性（ァフィ-ティー（M) )力 K = 1. 0 X 10_ 11 (M)〜1. 3 X 1
d
0_ 11 (M)であることを特徴とする請求の範囲第 1〜8項いずれか記載の抗 HCMVモ ノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[10] 約: L gZmLで、 80%以上の HCMV感染阻止率を示すことを特徴とする請求の範 囲第 1〜9項いずれか記載の抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部 分。
[11] 抗体のクラス (サブクラス）が IgG ( κ )であることを特徴とする請求の範囲第 1〜10項 いずれか記載の抗 HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[12] 請求の範囲第 1〜11項いずれか記載のヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合 部分を含む、 HCMVにより弓 Iき起こされる疾病に対する予防乃至治療薬。
[13] 前記 HCMVにより引き起こされる疾病が、（a)免疫不全状態における HCMVの再 活性ィ匕による間質性肺炎、網膜炎、胃腸炎、脳炎、（b)妊婦から胎児へ HCMV感染 が波及することによる巨細胞封入体症、（c)前記巨細胞封入体症により引き起こされ る流産、死産、生後間もない死亡、（d)前記巨細胞封入体症により死亡しない場合に おける小頭症、精神発育障害、知能発達遅延や聴覚障害からなる群より選択される 何れか一つである請求の範囲第 12項に記載の予防乃至治療薬。
[14] HCMVに結合し、その生物活性を中和し得る抗 HCMVモノクローナル抗体又はそ の抗原結合部分をコードする DNAであって、配列番号 1〜10からなる群力も選択さ れたァミノ配列をコードする単離された DNA。
[15] 請求の範囲第 14項に記載の DNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする 単離された DNA。
[16] 請求の範囲第 14項又は第 15項に記載の単離 DNAを組込んだベクター (植物発現 ベクターを除く）。
[17] 内部に請求の範囲第 16項の組換え発現ベクターが導入された、宿主細胞 (植物細
胞を除く)。
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